ES2471379T3 - Método para detectar el cáncer - Google Patents

Abstract

Un método para detectar un cáncer, que comprende medir la expresión de un polipéptido que tiene una reactividad de unión mediante un reacción antígeno-anticuerpo a un anticuerpo contra una proteína CAPRIN-1 que tiene una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nº 2 - 30 con numeración par en la lista de secuencias, en una muestra de suero, plasma sanguíneo, fluido ascítico o efusión pleural separada de un organismo vivo, en el que la expresión del polipéptido se mide por inmunoensayo de un anticuerpo que puede estar contenido en la muestra de suero, plasma sanguíneo, fluido ascítico o efusión pleural y se induce in vivo contra el polipéptido a medir

Description

M�todo para detectar el cáncer.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para detectar el cáncer usando CAPRIN-1 como marcador tumoral.

T�cnica antecedente

El cáncer es la causa principal de muerte. El tratamiento actualmente realizado para el cáncer es principalmente terapia sintom�tica que en la mayoría de los casos consta de terapia quirúrgica con una combinación de radioterapia y quimioterapia. Debido a los avances en la tecnología m�dica, ahora el cáncer es una enfermedad casi curable si puede detectarse pronto. Por tanto, ahora se requiere un método para detectar el cáncer, mediante el cual pueda realizarse convenientemente la detección usando suero, orina, o similares sin imponer cargas físicas o económicas a los pacientes de cáncer.

Como método de diagnóstico del cáncer usando sangre u orina, ha llegado a ser popular recientemente un método para medir un producto tumoral tal como un marcador tumoral. La expresión "producto tumoral" se refiere a un ant�geno asociado a tumor, una enzima, una proteína específica, un metabolito, un gen tumoral, un producto g�nico tumoral, un gen supresor tumoral y similares. El ant�geno carcinoembrionario CEA, la glucoprote�na CA19-9, CA125, el ant�geno específico de pr�stata PSA, la calcitonina, que son hormonas pept�dicas producidas en la tiroides y similares se usan como marcadores tumorales para el diagnóstico de algunos tipos de cáncer. Sin embargo, los marcadores tumorales útiles para el diagnóstico del cáncer est�n ausentes de muchos tipos de cáncer. Además, la mayoría de los marcadores tumorales actualmente conocidos est�n presentes en cantidades solamente traza (del orden de alrededor de un pg/ml) en fluidos corporales. Por lo tanto, se requieren métodos de medición altamente sensibles o técnicas especiales para detectar dichos marcadores tumorales. En las circunstancias actuales, se espera que proporcionar un nuevo medio de ensayo del cáncer capaz de detectar diversos tipos de cáncer con alta sensibilidad que implique un procedimiento conveniente cree aplicaciones de diagnóstico para diversos tipos de cáncer.

Adem�s, dichos medios de ensayo de cáncer son muy útiles si son capaces no solamente de detectar el cáncer sino también de diagnosticar el cáncer que se est� desarrollando en una localización invisible a simple vista, la extensión del cáncer, la malignidad o la evolución postoperatoria del cáncer, recidiva, metástasis y similares.

Espec�ficamente, si llega a ser posible el diagnóstico de cáncer que se ha desarrollado en una localización invisible a simple vista, dicho medio de ensayo de cáncer sería útil para la detección temprana del cáncer en una localización tal como una parte intraperitoneal que es difícil de reconocer. Además, puede ser detectable un tumor que no tiene un tamaño visible a simple vista tal como cáncer que es indetectable incluso por ultrasonograf�a, TC (tomografía computarizada), o RM (formación de imágenes por resonancia magnética nuclear).

Adicionalmente, la extensión del cáncer se clasifica basándose en el grado al cual un tumor se propaga en el sitio primario y la presencia o ausencia de metástasis a ganglios linfáticos regionales u órganos distantes. En general, existen cinco fases de la enfermedad (cada una mencionada como "fase"), y números superiores de fase indican fases más avanzadas de la enfermedad. Estrictamente, la definición de fase difiere dependiendo de los órganos. Sin embargo, por ejemplo, un cáncer en fase 0 es cáncer que permanece intraepitelial o cáncer en fase IV es cáncer que ha metastatizado a una localización distante. Si se halla dicha extensión del cáncer, llegan a ser posibles las decisiones acerca de los ciclos de tratamiento apropiados as� como el diagnóstico de los efectos terapéuticos de un agente antineopl�sico. Como ejemplos específicos de decisiones acerca de los ciclos de tratamiento, en el caso de cáncer de pr�stata y similares, existe un tipo que no requiere tratamiento porque tiene malignidad muy baja y casi nunca progresar�. En contraste, existe un tipo que requiere tratamiento porque es progresivo y metastatiza al hueso

o similares y causa que los pacientes mueran de forma dolorosa. Terapias tales como terapia hormonal y cirugía de extirpaci�n se asocian cada una con una reacción adversa. Por tanto, las terapias deben determinarse apropiadamente y decidirse sobre ello. Además, si puede hacerse una evaluación referente a la selección del agente antineopl�sico de forma apropiada o si la cronología y similares para la terminación de la administración de un agente antineopl�sico puede determinarse apropiadamente, también puede reducirse las cargas físicas y económicas de los pacientes. Por lo tanto, es importante ser capaces de diagnosticar la extensión del cáncer.

Una de las características de las células cancerosas es que experimentan blastog�nesis; es decir, desdiferenciaci�n. Excepto para algunos tipos de cáncer, las células cancerosas mal diferenciadas o no diferenciadas con un bajo grado de diferenciación crecen rápidamente tras la metástasis y provocan un mal pronóstico después de la terapia. Se dice que dicho cáncer tiene elevada malignidad. A la inversa, las células cancerosas altamente diferenciadas con un elevado grado de diferenciación retienen las características estructurales y funcionales de los órganos afectados. Puede decirse que dicho cáncer tiene malignidad relativamente baja. Si puede determinarse la malignidad del cáncer, pueden tomarse las siguientes medidas. Incluso si el tumor es pequeño, puede fijarse un amplio margen quirúrgico tras la retirada del tumor, cuando la malignidad es elevada. Además, es posible un seguimiento poniendo atención a un amplio intervalo de tejido periférico.

Si es posible el diagnóstico de los ciclos postoperatorios incluyendo recidiva y metástasis, llega a ser posible el diagnóstico de si un tumor puede eliminarse completamente o no por cirugía. La eliminación tumoral incompleta probablemente provoca recidiva. Por tanto, dicho diagnóstico puede proporcionar criterios para determinar una realización más cuidadosa de seguimiento a cortos intervalos o una realización de re-operación temprana si fuera necesaria. Además, si tiene lugar recidiva, existe una elevada posibilidad de detección temprana. La detección a menudo es retardada cuando tiene lugar metástasis distante. Sin embargo, si llega a ser posible es diagnóstico de metástasis, llega a ser posible proporcionar criterios mediante los cuales pueda ampliarse el intervalo de ensayos para incluir áreas diferentes al sitio de eliminación y la periferia del mismo.

Se sabe que los perros crecen 7 veces más rápido que los seres humanos. Recientemente, los animales de compa��a han surgido como miembros familiares y a menudo tienen hábitos de estilo de vida similares a los de sus propietarios. Por lo tanto, es predecible que un propio riesgo de desarrollar cáncer sea mayor cuando su animal de compa��a desarrolla cáncer. Si llega a ser posible un diagnóstico conveniente y preciso del cáncer para los animales de compa��a, se esperaría proporcionar pistas para prevenir el cáncer de los propietarios.

Actualmente, la cantidad de perros domésticos en Japón se dice que es de aproximadamente 6.700.000, y la misma cifra para los Estados Unidos se dice que es de aproximadamente 17.640.000. Han llegado a estar de moda vacunas combinadas qu�ntuples, s�ptuples u �ctuples y similares, además de refuerzos para la rabia, y de este modo han disminuido las enfermedades infecciosas altamente letales, tales como infección por parvovirus canino, infección por virus del moquillo canino, parainfluenza canina (tos de las perreras), infección por adenovirus-2 canino (tos de las perreras), hepatitis canina infecciosa, infección por coronavirus canino, y leptospirosis. Por lo tanto, la vida promedio de los perros ha aumentado. Los perros más viejos, que son de siete años de edad o mayores, representan el 35,5 % de todos los perros domésticos. Las causas de muerte de animales domésticos también son similares a las de seres humanos, tales como cáncer, hipertensión, y enfermedad cardiaca, que est�n aumentando. En los Estados Unidos, se diagnostica a aproximadamente 4.000.000 de perros con cáncer anualmente. También en Japón, se dice que aproximadamente 1.600.000 perros est�n potencialmente afectados con tumores.

Sin embargo, han estado ausentes agentes convenientes de diagnóstico del cáncer para animales. Además, en la asistencia m�dica animal, no han estado de moda métodos de ensayo que impliquen fotografías o películas de rayos X, exploraciones TC, exploraciones RM, o similares. Después de realizar palpaci�n, un simple ensayo de sangre, y un ensayo usando fotografía de rayos X, el diagnóstico actualmente depende de forma significativa de la experiencia de los veterinarios. Los métodos de ensayo usando suero acaban de comenzar parcialmente, pero los métodos usan marcadores tumorales humanos ya que no se han descubierto marcadores tumorales caninos.

El diagnóstico preciso del cáncer requiere cirugía abdominal que impone cargas físicas significativas a los perros y cargas económicas a los propietarios. Si puede hacerse convenientemente un diagnóstico del cáncer para los animales de compa��a tales como perros y gatos, esto conduciría a una detección temprana o diagnóstico preciso del cáncer y se esperaría que fuera útil para la terapia contra el cáncer para los animales de compa��a. Además, si llega a ser posible dicho diagnóstico conveniente del cáncer usando suero, se esperaría no solamente posibilitar el diagnóstico del cáncer sino también contribuir significativamente a exámenes periódicos de salud, diagnósticos preoperatorios, y decisiones acerca de la estrategia terapéutica.

El examen de salud para animales de compa��a, a diferencia del caso de los seres humanos, no es frecuente. Por tanto, la detección del cáncer a menudo ocurre demasiado tarde, de modo que un propietario encuentra la enfermada y después llega a un hospital solo después de que el tumor haya llegado a ser demasiado grande en muchos casos. Si dicho tumor que ha aumentado en tamaño es maligno, a menudo resultar� que el tratamiento es demasiado tardío, incluso cuando se realiza terapia quirúrgica tal como cirugía o medicaci�n usando un agente antineopl�sico o similar. Por tanto, cuando un veterinario determina que el tumor es maligno, el tratamiento con agente antineopl�sico generalmente se realiza sin cirugía. Si se realiza cirugía, las medidas durante la cirugía, tales como la determinación del tamaño del margen a fijar, la determinación de la cantidad de sangre requerida durante la cirugía, y medidas contra la dispersi�n de células también deben tomarse de forma estricta. Se desea que el tratamiento con agente antineopl�sico se inicie inmediatamente después de la cirugía y que se realice un seguimiento a cortos intervalos. La incorporación del anterior diagnóstico del cáncer en las revisiones de salud de los perros que recientemente est� llegando a ser más frecuente y se mencionan como revisiones m�dicas completas para perros se espera que conduzcan a una detección temprana del cáncer.

Por otro lado, en el caso de un tumor benigno, puede recomendarse cirugía incluso si un tumor es grande. Después de la cirugía, solo las áreas extirpadas necesitan cuidados sin necesidad de ningún tratamiento caro con agentes neopl�sicos y sin ninguna necesidad de desasosiego referente a los seguimientos.

En la actual situación, proporcionar un medio conveniente para detectar el cáncer con alta sensibilidad, que sea aplicable al diagnóstico del cáncer para animales, posibilita un tratamiento preciso y eficaz y produce varias ventajas tanto para propietarios como para veterinarios.

La proteína 1 asociada a citoplasma y proliferaci�n (CAPRIN-1) es una proteína intracelular que se expresa cuando las células normales en fase de reposo se activan o experimentan división celular. También se sabe que CAPRIN-1 est� implicada en el transporte del ARNm a través de la formación intracelular de granos de estr�s intracelular con ARN y control de la traducción, por ejemplo. Por ahora, CAPRIN-1 tiene muchos nombres diferentes. Ejemplos de dichos nombres incluyen proteína 1 de membrana anclada a GPI y proteína de marcador superficial 1 del componente de membrana (M11S1), como si la proteína fuera conocida por ser una proteína de membrana. Estos diferentes nombres se obtienen de un informe (J Biol Chem. 270: 20717-20723 (1995)) de que la secuencia g�nica de CAPRIN-1 originalmente tiene una región de unión a GPI y CAPRIN-1 es una proteína de membrana expresada en líneas celulares derivadas de intestino grueso. Posteriormente se ha informado de que: la secuencia g�nica de CAPRIN-1 en este informe es un error; tienen lugar desplazamientos de fase por deleci�n de un único nucleótido de la secuencia del gen CAPRIN-1 actualmente registrada en GenBank o similares, de modo que se delecionan 80aminoaciods del extremo C-terminal y el artefacto resultante (74 amino�cidos) corresponde a la parte de unión a GPI del informe previo; y también est� presente un error en el extremo 5' de la secuencia g�nica y se ha demostrado la deleci�n de 53 amino�cidos del extremo N-terminal (J Immunol. 172: 2389-2400 (2004)). Además, se ha informado de que una proteína codificada por la secuencia g�nica de CAPRIN-1 actualmente registrada en GenBank

o similares no es una proteína de membrana celular (J Immunol. 172: 2389-2400 (2004)).

Adem�s, basándose en el informe de J Biol Chem. 270: 20717-20723 (1995), de que CAPRIN-1 es una proteína de membrana celular, el documento US2008/0075722 el documento W02005/100998 describen que CAPRIN-1 bajo el nombre de M11S1 puede ser una diana para terapia contra el cáncer como proteína de membrana celular (no mencionado en los ejemplos). Sin embargo, como se inform� en J Immunol. 172: 2389-2400 (2004), se ha aceptado desde el momento de la presentación del documento US2008/0075722 y el documento WO2005/100998 hasta ahora que CAPRIN-1 no se expresa en superficies celulares. Es obvio que el contenido del documento US2008/0075722 y el documento WO2005/100998 basados solamente en la desinformaci�n del hecho de que CAPRIN-1 es una proteína de membrana celular no debe entenderse como sentido común técnico de los especialistas en la técnica. Además, nunca se ha informado de que CAPRIN-1 se exprese a niveles mayores en células cancerosas de mama o similares que en células normales.

El documento WO 2004/076682 describe que una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 est� implicada en la supresión de apoptosis y un método para el diagnóstico de un tumor que incluye determinar el nivel de esa proteína como biomarcador en una muestra de paciente, siendo el nivel del biomarcador indicativo de la presencia de células tumorales.

El documento US 2008/107668 describe p�ptidos inmunog�nicos derivados de proteínas expresadas en células cancerosas, incluyendo una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1, y composiciones relacionadas y métodos para el tratamiento y diagnóstico del cáncer.

El documento US 2003/190640 describe que una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 se expresa de forma diferencial en cáncer de pr�stata y métodos para diagnosticar y tratar el cáncer de pr�stata.

El documento US 2003/118599 describe la expresión de una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 en cáncer pulmonar y el uso de polip�ptidos correspondientes en vacunas y métodos de diagnóstico.

El documento WO 2004/097051 describe que un gen para una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 se expresa de forma diferencial en células de médula ósea en pacientes que tienen síndromes mielodispl�sicos (MDS)

o leucemia miel�gena aguda (AML) en comparación con seres humanos sin enfermad y el uso de ese gen como marcador molecular para detectar la presencia o ausencia de AML o MDS.

El documento US 2007/154931 describe la expresión de un gen para una proteína que tiene una secuencia de CAPRIN-1 como marcador para leucemia mieloide crónica y métodos y sistemas inform�ticos para controlar el progreso de CML en un paciente basándose en mediciones de este marcador molecular.

El documento US 2006/019256 describe la expresión regulada de forma positiva de un gen para una proteína que tiene una secuencia de CAPRIN-1 en células madre de tumor sólido y su uso como marcador para el diagnóstico, caracterización, y tratamiento de células madre de tumor sólido.

El documento US 2006/069054 describe la expresión de una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 en cáncer de mama y el uso de polip�ptidos correspondientes en terapia y métodos de diagnóstico.

El documento WO 02/092001 describe una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 como polip�ptido tumoral de pulmón y composiciones relacionadas para su uso en el diagnóstico y tratamiento de cáncer pulmonar.

El documento WO 2008/031041 describe métodos y composiciones para evaluar la expresión g�nica en muestras de melanoma, incluyendo la expresión de un gen para una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1.

El documento WO 2006/002378 describe la presencia de un gen para una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 en una región cromos�mica que se amplifica en células cancerosas y el uso de genes y esta región cromos�mica como dianas de fármacos.

El documento US 6.335.170 describe métodos para analizar células tumorales, particularmente células tumorales de vejiga, midiendo la expresión g�nica, incluyendo el gen para una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1, y métodos relacionados de diagnóstico y herramientas de pronóstico.

El documento WO 2005/007830 describe métodos y composiciones para el diagnóstico, clasificación, pronóstico y tratamiento de cáncer de pr�stata, basados en marcadores gen�micos para metilaci�n de ADN gen�mico y/o expresión g�nica, incluyendo silenciamiento transcripcional, y/o basados en marcadores proteicos, incluyendo una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1.

El documento US 2004/029114 describe la expresión regulada de forma positiva o negativa de una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 en cáncer de mama y métodos relacionados y composiciones que pueden usarse para el diagnóstico y el tratamiento de cáncer de mama.

El documento WO 01/72295 describe que una proteína que tiene una secuencia tipo CAPRIN-1 es una proteína tumoral de pulmón y composiciones farmacéuticas relacionadas para el diagnóstico y tratamiento de cáncer pulmonar.

Sumario de la invención

Problema a resolver por la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un medio para detectar cáncer que sea útil para el diagnóstico del cáncer.

Medio para resolver el problema

Como resultado de estudios intensivos, los presentes inventores han obtenido ADNc que codifica una proteína que se une a un anticuerpo existente en suero derivado de un organismo vivo que alberga cáncer por un método SEREX usando una biblioteca de ADNc derivada de testículo canino y el suero de un perro que alberga cáncer, y de este modo han preparado proteínas CAPRIN caninas que tienen las secuencias de amino�cidos mostradas en las SEC ID N� 6, 8, 10, 12, y 14 basándose en el ADNc. Además, los presentes inventores han preparado proteínas CAPRIN1 humanas que tienen las secuencias de amino�cidos mostradas en las SEC ID N� 2 y 4 basadas en genes humanos homólogos a los genes obtenidos. Los presentes inventores han descubierto adicionalmente que: genes que codifican estas proteínas se expresan específicamente en testículos caninos y humanos y células cancerosas malignas (véase el Ejemplo 1 descrito posteriormente); polip�ptidos recombinantes preparados basándose en las secuencias de amino�cidos de estas proteínas reaccionan específicamente solo con sueros de organismos vivos que albergan cáncer; y CAPRIN-1 puede detectarse específicamente a partir de un organismo vivo que alberga cáncer usando anticuerpos preparados usando los polip�ptidos recombinantes. Por tanto, los presentes inventores han completado la presente invención.

Espec�ficamente, la presente invención proporciona un método definido en las reivindicaciones para detectar cáncer que comprende medir la expresión de CAPRIN-1, que se realiza para muestras separadas de organismos vivos. Además, se describe un reactivo para detectar cáncer que comprende un anticuerpo que se induce in vivo contra CAPRIN-1 y un polip�ptido que experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo, y un reactivo para detectar cáncer que comprende un anticuerpo que experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo con CAPRIN-1 o un fragmento de unión a ant�geno del mismo, y un reactivo para detectar cáncer que comprende un polinucle�tido que hibrida específicamente con una secuencia parcial de 15 o más nucleótidos, preferiblemente de 20 a 25 o más nucleótidos, y más preferiblemente 30 o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N� 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, o similares en la lista de secuencias.

Ventaja de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un nuevo método para detectar un cáncer. Como se describe específicamente en los Ejemplos dados más adelante, un polip�ptido recombinante preparado basándose en la secuencia de amino�cidos de CAPRIN-1 (o también mencionada como Caprin-1) reacciona con un anticuerpo que existe específicamente en el suero de un paciente con cáncer. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, el cáncer que existe en un organismo vivo puede detectarse midiendo el anticuerpo en una muestra por el método de la presente invención. Además (pero del alcance de las reivindicaciones), el cáncer que existe en un organismo vivo puede detectarse midiendo la propia CAPRIN-1. De acuerdo con el método de la presente invención, puede detectarse in vivo cáncer de pequeño tamaño invisible a simple vista o cáncer en una parte profunda. Por tanto, el método de la presente invención es útil para la detección temprana de cáncer en el momento de un examen de salud o similares. Además, puede detectarse cáncer recurrente de forma precoz mediante el uso del método de la presente invención para el seguimiento de un paciente después de tratamiento del cáncer. Además, de acuerdo con el método de la presente invención, la extensión del cáncer también puede diagnosticarse, tal como aumento del tumor, infiltración al tejido periférico, y metástasis cancerosa a un ganglio linfático y un órgano distante. Además, el nivel s�rico de anticuerpos es mayor en un paciente con cáncer altamente maligno que en un paciente con cáncer de baja malignidad. De acuerdo con el método de la presente invención, la malignidad del cáncer también puede diagnosticarse. Además, como se describe en los siguientes Ejemplos, el ARNm que codifica CAPRIN-1 se expresa específicamente a elevados niveles en testículos y células cancerosas. Por lo tanto, también pueden detectarse los c�nceres (pero fuera del alcance de las reivindicaciones) midiendo el ARNm.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra los patrones de expresión del gen que codifica una proteína CAPRIN-1 en tejidos normales y líneas de células tumorales. La Referencia N� 1 indica los patrones de expresión del gen que codifica la proteína CAPRIN-1. La Referencia N� 2 indica los patrones de expresión del gen de GAPDH. La Fig. 2 muestra los resultados de detectar por tinción de Coomassie el polip�ptido derivado de CAPRIN-1 canino que es un ejemplo de polip�ptidos a usar en la presente invención, que se produjeron y purificaron usando Escherichia coli en los Ejemplos. La Referencia N� 3 indica la banda de un polip�ptido derivado de CAPRIN-1 canino. La Fig. 3 muestra algunos de los resultados de diagnóstico de cáncer para perros que albergan cáncer usando los polip�ptidos derivados de CAPRIN-1 canino preparados en los Ejemplos. La Fig. 4 muestra algunos de los resultados de diagnóstico de cáncer detallado para perros que albergan cáncer usando los polip�ptidos derivados de CAPRIN-1 canino preparados en los Ejemplos.

Mejor modo de realizar la invención

De acuerdo con el método de la presente invención, la expresión de CAPRIN-1 se mide usando una muestra separada de un organismo vivo. Los ejemplos de un método para medir la expresión de CAPRIN-1 incluyen un método (1er método de acuerdo con la invención) que implica inmunoensayo para un anticuerpo contra CAPRIN-1 contenido en una muestra, un método (2� método fuera del alcance de las reivindicaciones) que implica inmunoensayo para la propia CAPRIN-1 contenida en una muestra, y un método (3er método fuera del alcance de las reivindicaciones) que implica la medición de ARNm que codifica CAPRIN-1 contenida en una muestra. En el método de la presente invención, la expresión de CAPRIN-1 puede medirse como se expone en las reivindicaciones. En la presente invención, el término "medición" se refiere a cualquier tipo de detección, determinación cualitativa, determinación cuantitativa, y determinación semi-cuantitativa.

La secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14 es la secuencia de amino�cidos de CAPRIN-1 canina. CAPRIN-1 canina que tiene la secuencia de amino�cidos se identificó como un polip�ptido que se une a un anticuerpo que existe específicamente en el suero derivado de perros que albergan cáncer por el método SEREX usando una biblioteca de ADNc derivada de testículo canino y el suero de un perro que alberga cáncer (véase el Ejemplo 1). Específicamente, un anticuerpo contra CAPRIN-1 que tiene la secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14 se induce específicamente in vivo en un perro que alberga cáncer. Por lo tanto, el cáncer canino puede detectarse midiendo el anticuerpo anterior contra CAPRIN-1 que tiene la secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14 usando el 1er método anterior (véanse los Ejemplos 3 y 4). El cáncer canino también puede detectarse midiendo la propia CAPRIN-1 como un ant�geno mostrado en la SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14 usando el 2� método anterior (véanse los Ejemplos 5 y 6). Además, el cáncer canino puede detectarse, como se describe en los siguientes Ejemplos, midiendo el ARNm que codifica CAPRIN-1 ya que el ARNm se expresa a niveles significativamente elevados en testículos y células cancerosas (véase el Ejemplo 1).

La expresión "que tiene una secuencia de amino�cidos" como se usa en este documento se refiere a restos aminoac�dicos que se alinean en el orden relevante. Por lo tanto, por ejemplo, la expresión "polip�ptido que tiene la secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 2" se refiere a un polip�ptido que tiene 709 restos aminoac�dicos, que constan de la secuencia de amino�cidos de Met Pro Ser Ala���(abreviado)��Gln Gln Val Asn mostrada en la SEC ID N� 2. Además, por ejemplo, la expresión "polip�ptido que tiene la secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 2" también puede abreviarse como "el polip�ptido de la SEC ID N� 2". Lo mismo se aplica a la expresión "que tiene una/la secuencia de nucleótidos". En este caso, la expresión "que tiene" puede sustituirse con la expresión "que consta de".

Adem�s, el término "polip�ptido" como se usa en este documento se refiere a una molécula que se forma mediante enlace pept�dico de una pluralidad de amino�cidos. Ejemplos de dicha molécula incluyen no solamente moléculas polipept�dicas con una gran cantidad de amino�cidos constituyentes, sino también moléculas de bajo peso molecular (oligop�ptidos) con pequeña cantidad de amino�cidos y proteínas de longitud completa. La presente invención abarca adicionalmente proteínas CAPRIN-1 de longitud completa que tienen cada una secuencia de amino�cidos mostrada en una ID de secuencia de numeración par entre las SEC ID N� 2-30.

En el método de la presente invención, no solamente CAPRIN-1 canina de las SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14, sino también CAPRIN-1 de otros mamíferos (a partir de ahora en este documento, también pueden mencionarse como "homólogo" para CAPRIN-1 canina. Cuando simplemente se menciona como "CAPRIN-1", CAPRIN-1 no solo de un perro sino también de otro mamífero también queda incluido en este documento) también se someten a medición. Como se describe específicamente en los siguientes Ejemplos, se expresa significativamente un ARNm que codifica CAPRIN-1 humana a un elevado nivel en testículo humano y células cancerosas, como en el caso de CAPRIN-1 canina de la SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14. Sin embargo, no se detecta ningún anticuerpo contra CAPRIN-1 humana en un organismo humano sano. Además, no se detecta ningún anticuerpo contra CAPRIN-1 felina en un organismo sano de un gato, pero solamente se detecta en un gato que alberga cáncer. Por lo tanto, el cáncer de un mamífero diferente a un perro puede detectarse midiendo la expresión de CAPRIN-1 en el mamífero. Ejemplos de CAPRIN-1 de mamíferos diferentes a perros, que son objeto de medición en el método de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, CAPRIN-1 humana y CAPRIN-1 felina. Una secuencia de nucleótidos que codifica CAPRIN-1 humana y la secuencia de amino�cidos de la misma son como se muestran por separado en las SEC ID N� 1 y 3, y 2 y 4, respectivamente, en la lista de secuencias. La identidad de secuencia con CAPRIN-1 canina es del 94 % en términos de secuencia de nucleótidos y es del 98 % en términos de secuencia de amino�cidos. Incluso los perros y los seres humanos que son mamíferos genéticamente distantes comparten tanto como un 98 % de identidad de secuencia en términos de secuencia de amino�cidos de CAPRIN-1. Por lo tanto, se cree que un perro y un mamífero diferente a un ser humano, es decir, CAPRIN-1 canina y homólogo de la misma, comparten identidad de secuencia tan elevada como de aproximadamente el 85 % o más. Por lo tanto, CAPRIN-1, cuya expresión se mide en el método de la presente invención, tiene preferiblemente un 85 % o más y más preferiblemente un 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de amino�cidos de CAPRIN-1 canina mostrada en las SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14. Sin embargo, dichos ejemplos no est�n particularmente limitados a ellas.

En el 1er método anterior, el anticuerpo previo que puede estar presente en una muestra puede medirse fácilmente por inmunoensayo usando una sustancia antig�nica que experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo con el anticuerpo. El propio inmunoensayo es un método convencional conocido como se describe específicamente a continuación. Como sustancia antig�nica para el inmunoensayo, puede usarse CAPRIN-1 canina de la SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14 que causa la inducción del anticuerpo dentro de un organismo de un perro que alberga cáncer. Además, un anticuerpo tiene reactividad cruzada. Por tanto, incluso una molécula diferente a una sustancia antig�nica que haya servido realmente como inmun�geno puede unirse a un anticuerpo inducido contra el inmun�geno mediante una reacción ant�geno-anticuerpo, siempre que est� presente una estructura análoga al ep�topo del inmun�geno en la molécula. En particular, una proteína de un mamífero y homólogo de la misma de otro mamífero comparten elevada identidad de secuencia de amino�cidos y a menudo tienen estructuras epit�picas análogas entre s�. Como se describe específicamente en los siguientes Ejemplos, CAPRIN-1 canina de las SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14 experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo no solamente con un anticuerpo inducido contra CAPRIN-1 canina dentro de un organismo de un perro que alberga cáncer, sino también con un anticuerpo inducido contra CAPRIN-1 felina dentro de un organismo de un gato que alberga cáncer. Además, CAPRIN-1 humana experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo con el anticuerpo anterior inducido dentro de los organismos de perros que albergan cáncer o gatos que albergan cáncer. Por consiguiente, en el 1er método de la presente invención, puede usarse CAPRIN-1 de cualquier mamífero como ant�geno para inmunoensayo.

En general, cuando una sustancia antig�nica es una proteína o similar, que tiene una estructura complicada y elevado peso molecular, est�n presentes una pluralidad de sitios que tienen diferentes estructuras en la molécula. Por lo tanto, se produce una pluralidad de tipos de anticuerpos capaces de reconocer y unirse a diferentes sitios de dichas sustancias antig�nicas in vivo. Específicamente, un anticuerpo que se produce in vivo contra una sustancia antig�nica tal como una proteína es un anticuerpo policlonal que es una mezcla de una pluralidad de tipos de anticuerpo. Un anticuerpo descubierto por los presentes inventores también es un anticuerpo policlonal. Est� específicamente presente en suero derivado de un organismo vivo que alberga cáncer y específicamente se une a una proteína CAPRIN-1 recombinante mediante una reacción ant�geno-anticuerpo. La expresión "anticuerpo policlonal" usada en la presente invención se refiere a un anticuerpo que existe en suero de un organismo vivo que contiene una sustancia antig�nica en el mismo y se induce in vivo contra la sustancia antig�nica.

En Ejemplos descritos posteriormente, se prepararon polip�ptidos de la SEC ID N� 6 y la SEC ID N� 8 (CAPRIN-1 canina) y el polip�ptido de la SEC ID N� 2 (CAPRIN-1 humana) como ant�genos para inmunoensayo de anticuerpos específicos en los animales vivos que albergan cáncer. Después se confirm� la reactividad entre estos polip�ptidos y el anticuerpo anterior en suero de un organismo vivo que alberga cáncer. Sin embargo, el anticuerpo anterior es un anticuerpo policlonal, de modo que se une de forma natural a un polip�ptido que consta del homólogo de la SEC ID N� 6, 8, o 2. Incluso en el caso de un fragmento de dichos polip�ptidos, puede unirse al anticuerpo anterior contenido en el suero de un organismo vivo que alberga cáncer, ya que el anticuerpo policlonal puede contener un anticuerpo capaz de reconocer la estructura del fragmento relevante. Es decir, un polip�ptido (es decir, proteína CAPRIN-1 de longitud completa) del homólogo de la SEC ID N� 6, 8 o 2 o un fragmento del mismo puede usarse de forma similar para la medición del anticuerpo policlonal anterior contenido específicamente en suero de un organismo vivo que alberga cáncer y es útil para la detección del cáncer. Por lo tanto, ejemplos de un polip�ptido a usar como ant�geno para inmunoensayo en el 1er método de la presente invención incluyen, no solamente un polip�ptido que consta de la región de longitud completa de CAPRIN-1 (por ejemplo, SEC ID N� 6, 8, o 2), sino también un fragmento polipept�dico que consta de 7 amino�cidos continuos o más, preferiblemente 8 continuos o más, 9 o más, o 10 o más amino�cidos en la secuencia de amino�cidos de CAPRIN-1 y experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo con un anticuerpo policlonal contra CAPRIN-1 (a partir de ahora en este documento, puede mencionarse convenientemente como "un polip�ptido parcial específicamente reactivo"). Se sabe en la técnica que un polip�ptido de aproximadamente 7 o más restos aminoac�dicos ejerce antigenicidad. Sin embargo, si la cantidad de restos aminoac�dicos que constituye un polip�ptido es demasiado baja, dicho polip�ptido con mucha probabilidad reacciona de forma cruzada con anticuerpos, que existen en la muestra, contra proteínas diferentes a CAPRIN-1. Por consiguiente, en aras de aumentar la precisión del inmunoensayo, la cantidad deseable de restos aminoac�dicos de un fragmento polipept�dico puede ser preferiblemente de 30 o más o 50 o más, más preferiblemente de 100 o más o 150 o más, más preferiblemente de 300 o más, incluso más preferiblemente de 600 o más, y más preferiblemente de 1000 o más y de 1500 o más.

Ejemplos preferibles específicos de los polip�ptidos a usar como ant�genos son los polip�ptidos de las SEC ID N� 230 con numeración par o fragmentos de los mismos.

Las secuencias de nucleótidos de polinucle�tidos que codifican proteínas que constan de las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 2-30 con numeración par (es decir, SEC ID N� 2, 4, 6���28, 30) se muestran en las SEC ID N� 1-29 con numeración impar (es decir, SEC ID N� 1, 3, 5��27, 29).

En general, es ampliamente conocido por los especialistas en la técnica referente a ant�genos proteicos que incluso cuando se han sustituido, delecionado, añadido o insertado unos pocos restos aminoac�dicos en la secuencia de amino�cidos de la proteína, la resultante puede retener antigenicidad casi equivalente a de la proteína original. Por lo tanto, un polip�ptido: que tiene una secuencia que tiene una sustitución, una deleci�n, y/o una inserción de unos pocos (preferiblemente uno o varios) restos aminoac�dicos con respecto a la secuencia de amino�cidos de CAPRIN1 y tiene un 80 % o más, un 85 % o más, preferiblemente un 90 % o más, más preferiblemente un 95 % o más, y más preferiblemente un 98 % o más de identidad de secuencia con la secuencia original; y que se une específicamente a un anticuerpo policlonal contra CAPRIN-1 mediante una reacción ant�geno-anticuerpo (a partir de ahora en este documento, puede mencionarse convenientemente como "polip�ptido modificado específicamente reactivo") puede usarse para la detección del cáncer de un modo similar que para los polip�ptidos anteriores. Preferiblemente, el polip�ptido modificado específicamente reactivo tiene una secuencia de amino�cidos que tiene una sustitución, una deleci�n, una adición, y/o una inserción de uno o varios restos aminoac�dicos con respecto a la secuencia de amino�cidos de CAPRIN-1. El término "varios" como se usa en este documento se refiere a un número entero de 2-10, preferiblemente un número entero de 2-6, y más preferiblemente un número entero de 2-4.

La expresión "identidad de secuencia (de secuencias de amino�cidos)" como se usa en este documento se obtiene alineando dos secuencias de amino�cidos a comparar de modo que los restos aminoac�dicos coincidan lo más posible, sustrayendo la cantidad de restos aminoac�dicos que han coincidido del número total de restos aminoac�dicos, y después expresando el resultado en forma porcentual. Sobre la alineación anterior, si fuera necesario, se insertan apropiadamente huecos en una de o ambas secuencias a comparar. Dicha alineación de secuencia puede realizarse usando un programa conocido tal como BLAST, FASTA, o CLUSTAL W (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 2264-2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997).

Pueden agruparse veinte tipos de amino�cidos que constituyen las proteínas naturales en amino�cidos neutros que tienen cadenas laterales de baja polaridad (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, y Pro), amino�cidos neutros que tienen cadenas laterales hidrófilas (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, y Cys), amino�cidos ácidos (Asp y Glu), amino�cidos básicos (Arg, Lys, e His), y amino�cidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp, e His) en que los miembros de cada grupo tienen propiedades análogas entre s�. Se sabe que la sustitución entre estos amino�cidos (es decir, sustitución conservativa) raramente altera las propiedades del polip�ptido resultante. Por lo tanto, cuando se sustituyen restos aminoac�dicos de CAPRIN-1, la sustitución se realiza entre miembros del mismo grupo de modo que la posibilidad de mantener la unión con el anticuerpo correspondiente llegue a ser mayor. Sin embargo, en la presente invención, la anterior variante puede implicar sustitución no conservativa, siempre que se confiera actividad inmunoinductora equivalente a o casi equivalente a la de una no variante.

Un polip�ptido (a partir de ahora en este documento, puede mencionarse convenientemente como "polip�ptido de adición específicamente reactivo") que contiene como secuencia parcial el polip�ptido anterior a usar en la presente invención (es decir, preparado por adición de otro (poli)p�ptido a un extremo o ambos extremos de un polip�ptido a usar en la presente invención) y que se une específicamente a un anticuerpo policlonal contra CAPRIN-1 mediante una reacción ant�geno-anticuerpo también puede usarse para la detección del cáncer de un modo similar al de los polip�ptidos anteriores.

Los polip�ptidos anteriores a usar en la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con un método de síntesis química tal como un método de Fmoc (método de fluorenilmetiloxicarbonilo) y un método de tBoc (método de t-butiloxi-carbonilo) (Ed., The Japanese Biochemical Society, Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, TOKYO KAGAKU DOZIN CO., LTD (Japón), 1981). Además, los polip�ptidos también pueden sintetizarse mediante un método convencional usando diversos sintetizadores pept�dicos disponibles en el mercado. Como alternativa, los polip�ptidos pueden prepararse fácilmente usando técnicas conocidas de ingeniería genética (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2� Edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3� Edición, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, y similares). Por ejemplo, para ARN extraído de un tejido que expresa un gen que codifica CAPRIN-1 humana de la SEC ID N� 2 o un homólogo de la misma, se prepara el ADNc del gen por RT-PCR. Se incorpora la secuencia completa o una secuencia parcial deseada del ADNc en un vector de expresión y después el vector se introduce en células hospedadoras, de modo que puede obtenerse un polip�ptido de interés. Las secuencias de nucleótidos de ADNc que codifican CAPRIN-1 canina de las SEC ID N� 6, 8, 10, 12, y 14 se muestran en las SEC ID N� 5, 7, 9, 11, y 13, respectivamente. Los factores homólogos humanos de los mismos; es decir, las secuencias de nucleótidos de ADNc que codifican CAPRIN-1 humana de las SEC ID N� 2 y 4 se muestran en las SEC ID N� 1 y 3, respectivamente. Por tanto, los cebadores a usar para RT-PCR pueden diseñarse fácilmente en referencia a estas secuencias de nucleótidos. Además, como se describe posteriormente, puede amplificarse un gen que codifica CAPRIN-1 de un mamífero no humano usando cebadores diseñados en referencia a las secuencias de nucleótidos de las SEC ID N� 1-29 con numeración impar. Por ejemplo, el ADNc que codifica CAPRIN-1 felina puede prepararse fácilmente por técnicas similares a las técnicas anteriores. La extracción de ARN, RT-PCR, incorporación de ADNc en un vector, e introducción de un vector en células hospedadoras puede realizarse por métodos conocidos como se describe a continuación, por ejemplo. Además, los vectores y células hospedadoras a usar en este documento también son conocidos y diversos vectores y células hospedadoras est�n disponibles en el mercado.

Las células hospedadoras anteriores pueden ser cualquier célula, siempre que puedan expresar los polip�ptidos anteriores. Ejemplos de células hospedadoras procariotas incluyen Escherichia coli y similares. Ejemplos de células hospedadoras eucariotas incluyen células de mamífero cultivadas tales como células renales de mono (COS1), células de ovario de h�mster chino (CHO), la línea celular de ri��n embrionario humano (HEK293), y la línea celular de piel embrionaria de ratón (NIH3T3), levaduras de gemaci�n, levaduras de fisión, células de gusanos de seda, y ovocitos de Xenopus.

Cuando se usan células procariotas como células hospedadoras, se usa un vector de expresión que tiene un origen de replicaci�n en células procariotas, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de clonaci�n múltiple, un terminador, un gen de resistencia a fármaco, un gen complementario auxotr�fico y similares. Como vectores de expresión para Escherichia coli, pueden ejemplificarse vectores pUC, pBluescriptII, sistemas de expresión pET, sistema de expresión pGEX y similares. Un ADN que codifica el polip�ptido anterior se incorpora en dicho vector de expresión, se transforman las células hospedadoras procariotas con el vector, y después el transformante obtenido de este modo se cultiva, de modo que el polip�ptido codificado por el ADN pueda expresarse en las células hospedadoras procariotas. En este momento, el polip�ptido también puede expresarse como una proteína de fusión con otra proteína. Un ADN que codifica el polip�ptido anterior puede obtenerse preparando un ADNc por RT-PCR como se ha descrito anteriormente, por ejemplo. Además, dicho ADN que codifica el polip�ptido anterior también puede sintetizarse por un método convencional usando un sintetizador de ácido nucleico disponible en el mercado como se describe a continuación. Las secuencias de nucleótidos de ADNc de los genes que codifican CAPRIN-1 de las SEC ID N� 2 y 4 se muestran en las SEC ID N� 1 y 3, respectivamente, en la lista de secuencias.

Cuando se usan células eucariotas como células hospedadoras, se usan vectores de expresión para células eucariotas que tienen un promotor, una región de corte y ayuste, un sitio adicional de poli(A) y similares. Ejemplos de dichos vectores de expresión incluyen pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS, pcDNA3, y pYES2. De forma similar a lo anterior, un ADN que codifica un polip�ptido a usar en la presente invención se incorpora en dicho vector de expresión, las células hospedadoras eucariotas se transforman con el vector, y después el transformante obtenido de este modo se cultiva, de modo que el polip�ptido codificado por el ADN anterior pueda expresarse en células hospedadoras eucariotas. Cuando se usa pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, o similares como vector de expresión, el polip�ptido anterior puede expresarse como una proteína de fusión con diversas marcas, tales como una marca His (por ejemplo, (His)6 a (His)10), una marca FLAG, una marca myc, una marca HA, y GFP.

Para la introducción de un vector de expresión en una célula hospedadora, pueden emplearse métodos conocidos tales como electroporaci�n, un método con fosfato cálcico, un método de liposoma, un método con DEAE dextrano, microinyecci�n, infección v�rica, lipofecci�n, y unión con un p�ptido permeable a membrana celular.

El aislamiento y purificación de un polip�ptido de interés a partir de células hospedadoras puede realizarse usando técnicas conocidas de aislamiento en combinación. Ejemplos de dichas técnicas conocidas incluyen tratamiento usando un agente desnaturalizante tal como urea o un tensioactivo, ultrasonicaci�n, digestión enzim�tica, desalaci�n, fraccionamiento con disolvente y precipitación, di�lisis, centrifugaci�n, ultrafiltraci�n, filtración en gel, SDS-PAGE, enfoque isoel�ctrico, cromatograf�a de intercambio iónico, cromatograf�a hidrófoba, cromatograf�a de afinidad, y cromatograf�a en fase inversa.

Los polip�ptidos obtenidos por los métodos anteriores incluyen polip�ptidos en forma de proteínas de fusión con cualquier otra proteína. Un ejemplo de dicha proteína de fusión incluye una proteína de fusión con glutati�n-Stransferasa (GST), una marca His, o similares. Los polip�ptidos en forma de dichas proteínas de fusión también son ejemplos de los polip�ptidos de adición específicamente reactivos descritos anteriormente y pueden usarse para el primer método de detección de la presente invención. Además, un polip�ptido expresado en células transformadas puede someterse a diversos tipos de modificación dentro de las células después de su traducción. Dicho polip�ptido que se modifica después de la traducción puede usarse en el primer método de detección de la presente invención, siempre que sea capaz de unirse a un anticuerpo policlonal contra CAPRIN-1. Ejemplos de dichas modificaciones post-traduccionales incluyen la eliminación de la metionina N-terminal, acetilaci�n N-terminal, glucosilaci�n, prote�lisis limitada por proteasa intracelular, miristoilaci�n, isoprenilaci�n, y fosforilaci�n.

Un anticuerpo en una muestra puede medirse fácilmente por inmunoensayo usando el polip�ptido anterior como ant�geno. El propio inmunoensayo es conocido en la técnica. El inmunoensayo se clasifica en un método tipo s�ndwich, un método de competición, un método de aglutinación, un método de transferencia de Western y similares basándose en los tipos de reacción. Además, el inmunoensayo se clasifica basándose en los marcadores en radioinmunoensayo, inmunoensayo de fluorescencia, inmunoensayo enzim�tico, e inmunoensayo con biotina, por ejemplo. El inmunoensayo del anticuerpo anterior puede realizarse usando cualquiera de estos métodos. El ELISA tipo s�ndwich o el método de aglutinación son preferiblemente aplicables como técnica de inmunoensayo para el anticuerpo anterior en el método de la presente invención, ya que los procedimientos de estos métodos son convenientes y no requieren aparatos caros y similares. Pero las técnicas no est�n limitadas a ellos. Cuando se usa una enzima como marcador para un anticuerpo, dicha enzima no est� particularmente limitada, siempre que satisfaga condiciones tales que: el número de intercambio sea elevado; permanezca estable incluso si se une a un anticuerpo, cause específicamente el desarrollo del color del sustrato y similares. Ejemplos de enzimas que pueden usarse para inmunoensayo enzim�tico general incluyen peroxidasa, 1-galactosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, acetilcolina esterasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y ácido m�lico deshidrogenasa. Además, pueden usarse sustancias inhibidoras de enzimas, coenzimas y similares. La unión de estas enzimas con anticuerpos puede realizarse por métodos conocidos usando un agente de reticulación tal como un compuesto de maleimida. Como sustrato, puede usarse una sustancia conocida dependiendo del tipo de enzima a usar. Por ejemplo, cuando se usa peroxidasa como enzima, puede usarse 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina. También cuando se usa fosfatasa alcalina como enzima, puede usarse paranitrofenol o similares. Como radiois�topo, puede usarse un radiois�topo que se usa generalmente para radioinmunoensayo, tal como 125I y 3H. Como colorante fluorescente, puede usarse un colorante fluorescente que se use para técnicas generales de anticuerpos fluorescentes, tal como isotiocianato fluorescente (FITC) y tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC).

No existe necesidad de explicar las técnicas anteriores de inmunoensayo en la descripción, ya que son bien conocidas. Sin embargo, cuando se describen brevemente estas técnicas de inmunoensayo, el método tipo s�ndwich implica inmovilizar el polip�ptido anterior a usar como ant�geno en una fase sólida, hacerlo reaccionar con una muestra tal como suero, lavarlo, hacerlo reaccionar con un anticuerpo secundario apropiado, lavarlo, y después medir el anticuerpo secundario unido a la fase sólida, por ejemplo. Un anticuerpo secundario no unido puede eliminarse fácilmente por inmovilización de un polip�ptido antig�nico a una fase sólida. Por tanto, esto es preferible como realización del método para detectar el cáncer de la presente invención. Como anticuerpo secundario, puede usarse un anticuerpo anti-IgG canina si una muestra se obtiene de un perro. Un anticuerpo secundario se marca por anticipado con una sustancia de marcaje ejemplificada anteriormente, de modo pueda medirse el anticuerpo secundario que se une a una fase sólida. La cantidad medida de este modo del anticuerpo secundario corresponde a la cantidad del anticuerpo anterior en la muestra de suero. Cuando se usa una enzima como sustancia de marcaje, la cantidad del anticuerpo puede medirse añadiendo un sustrato que se digiere para desarrollar color por acción enzim�tica y después midiendo �pticamente la cantidad de sustrato degradado. Cuando se usa un radiois�topo como sustancia de marcaje, la cantidad de radiación del radiois�topo puede medirse usando un contador de centelleo o similar.

En el 2� método de la presente descripción, se mide CAPRIN-1 que puede estar contenida en una muestra de un organismo vivo. Como se ha descrito anteriormente, entre los pacientes con cáncer, la cantidad de un anticuerpo que experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo con CAPRIN-1 de un perro, un ser humano, o similar es significativamente elevada. Esto indica que la cantidad de CAPRIN-1 acumulada como ant�geno es significativamente elevada en células cancerosas. El cáncer también puede detectarse midiendo directamente CAPRIN-1, como se ejemplifica específicamente en los siguientes ejemplos. Por lo tanto, el cáncer puede detectarse in vivo midiendo la propia CAPRIN-1 de forma similar al 1er método anterior.

Un polip�ptido en una muestra puede medirse fácilmente por técnicas bien conocidas de inmunoensayo. Específicamente, por ejemplo, se prepara un anticuerpo o un fragmento de unión a ant�geno del mismo, que experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo con CAPRIN-1, se realiza inmunoensayo usando el anticuerpo o su fragmento de unión a ant�geno del mismo, y después puede medirse CAPRIN-1 que puede estar presente en la muestra. Como se ha descrito anteriormente, un anticuerpo tiene reactividad cruzada. Por tanto, por ejemplo, a través del uso de un anticuerpo o el fragmento de unión a ant�geno del mismo, que experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo con CAPRIN-1 canica de la SEC ID N� 6, puede medirse no solamente CAPRIN-1 canina de la SEC ID N� 6, sino también su homólogo en otros mamíferos (por ejemplo, CAPRIN-1 humana de la SEC ID N� 2 o 4 y CAPRIN-1 felina). Una técnica de inmunoensayo en s� misma es una técnica convencional conocida como se ha descrito anteriormente.

Este examen revel� que CAPRIN-1 es una proteína de membrana celular que se expresa sobre las superficies de células cancerosas. Un organismo vivo con cáncer contiene muchos tipos de proteasas. Específicamente, en un organismo vivo con cáncer, se separa una parte expresada de forma extracelular de la secuencia de CAPRIN-1 de las células cancerosas por degradación, de modo que dicha parte existe a un nivel mayor que una parte expresada de forma intracelular de la secuencia de CAPRIN-1. Por lo tanto, cuando se usa un anticuerpo contra CAPRIN-1 o un fragmento de unión a ant�geno del mismo a usar en esta medición, que se une a la superficie de la célula cancerosa, CAPRIN-1 puede detectarse a niveles mayores y puede diagnosticarse el cáncer con mayor sensibilidad. Por lo tanto, se usan preferiblemente los anticuerpos que se unen a una parte de la proteína CAPRIN-1 que existe sobre las superficies de células cancerosas. Un ejemplo de un p�ptido parcial de la proteína CAPRIN-1 que existe sobre las superficies de células cancerosas, es un polip�ptido que comprende una secuencia de 7 restos aminoac�dicos continuos o más dentro de la región de los restos aminoac�dicos N� (aa) 50-98 o los restos aminoac�dicos N� (aa) 233-305 en la secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 2-30 con numeración par en la lista de secuencia excluyendo la SEC ID N� 6 y la SEC ID N� 18. Un ejemplo específico de las mismas es la secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 43 o la SEC ID N� 61 (en la secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 61, se prefiere una región de la secuencia de amino�cidos mostrada en la SEC ID N� 62 o SEC ID N� 63) o una secuencia de amino�cidos que tiene un 80 % o más, preferiblemente un 85 % o más, más preferiblemente un 90 % o más, más preferiblemente un 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de amino�cidos relevante. Ejemplos de un anticuerpo a usar incluyen todos los anticuerpos que se unen a estos p�ptidos. Ejemplos específicos del anticuerpo incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a ant�geno del mismo que se une a la SEC ID N� 43, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 44 y 45, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 44 y 46, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 44 y 47, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 44 y 48, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 49 y 50, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 51 y 52, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 53 y 54, un anticuerpo monoclonal

o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 55 y 56, un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N� 57 y 58, o un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a ant�geno del mismo que tiene las secuencias de amino�cidos de las SEC ID N�59 y 60.

La expresión "fragmento de unión a ant�geno" como se usa en este documento se refiere a un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a un ant�geno tal como un fragmento Fab y un fragmento F(ab')2 contenido en la molécula de anticuerpo. Un anticuerpo a usar en este documento puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Para inmunoensayo y similares, es preferible un anticuerpo monoclonal con elevada reproducibilidad. Un método para preparar un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal usando un polip�ptido como inmun�geno es conocido y puede realizarse fácilmente por un método convencional. Por ejemplo, CAPRIN-1 se une a una proteína vehículo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), caseína, o albumina s�rica y después se inmuniza un animal con el resultante como inmun�geno junto con un adyuvante, y de este modo puede inducirse un anticuerpo contra CAPRIN-1. Las células que producen anticuerpos tales como esplenocitos o linfocitos recogidos del animal inmunizado se fusionan con células de mieloma para preparar hibridomas, y después se seleccionan los hibridomas que producen un anticuerpo que se une a CAPRIN-1 y después se cultivan, de modo que pueda obtenerse un anticuerpo monoclonal, cuyo ant�geno correspondiente sea CAPRIN-1, del sobrenadante cultivado. El método anterior es un método convencional conocido.

En el 3er método de la presente descripción, se mide al ARNm que codifica CAPRIN-1 que puede estar contenido en una muestra obtenida de un organismo vivo. Como se describe específicamente en los siguientes ejemplos, el ARNm que codifica CAPRIN-1 canina de las SEC ID N� 6, 8, 10, 12, o 14 o CAPRIN-1 humana de las SEC ID N� 2 o 4 se expresa a un nivel significativamente elevado en células cancerosas. Por lo tanto, el cáncer puede detectarse in vivo midiendo dicho ARNm en una muestra.

El ARNm en una muestra puede determinarse cuantitativamente por un método convencional tal como detección a tiempo real por RT-PCR usando el ARNm como molde, por ejemplo. Dicho ARNm puede determinarse generalmente de forma cuantitativa basándose en intensidad de tinción o similares en transferencia de Northern que es un método convencional. Las secuencias de ADNc que codifican polip�ptidos CAPRIN-1 de las SEC ID N� 2-30 con numeración par se muestran en las SEC ID N� 1-29 con numeración impar, respectivamente. Por tanto, basándose en estas secuencias, se prepara un polinucle�tido que hibrida específicamente con una región parcial en la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N� 1-29 con numeración impar (a partir de ahora en este documento, mencionado como "polinucle�tido para detección del cáncer") y después puede medirse la cantidad del ARNm en una muestra usando el polinucle�tido como sonda o un cebador para un método de amplificación de ácido nucleico. Como se describe posteriormente, si es un polinucle�tido que hibride específicamente con una región parcial en la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N� 129 con numeración impar, también puede determinarse un ARNm que codifica CAPRIN-1 en mamíferos diferentes de perros y seres humanos. Además, un polinucle�tido puede ser ARN o ADN.

La expresión "que hibrida específicamente con" como se usa en este documento se refiere a que en condiciones generales de hibridación, un sujeto hibrida con solamente una región parcial diana, pero no hibrida sustancialmente con las otras regiones.

La expresión "(en) condiciones generales de hibridación" como se usa en este documento se refiere a condiciones empleadas para hibridar en PCR general o detección usando una sonda. Por ejemplo, en el caso de PCR usando polimerasa Taq, la expresión se refiere a condiciones en las que se realiza una reacción a una temperatura de hibridación apropiada que varía de aproximadamente 54 �C a 60 �C usando un tampón general tal como KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3-9,0), y MgCl2 1,5 mM. Además, en el caso de hibridación de Northern, por ejemplo, la expresión se refiere a condiciones en las cuales se realiza una reacción usando una solución de hibridación general tal como SSPE 5 x, formamida al 50 %, solución de Denhardt 5 x, y SDS al 0,1 %-SDS al 0,5 %, o SSC 0,1-5 x y SDS al 0,1-0,5 % a una temperatura de hibridación apropiada que varía de aproximadamente 42�C a 65�C. Además, después de la hibridación, se realiza lavado con SSC 0,1-0,2 x y SDS al 0.1 %, por ejemplo. Sin embargo, las temperaturas apropiadas de atemperaci�n o las temperaturas de hibridación no est�n limitadas a los ejemplos anteriores, y se determinan basándose en el valor de Tm para un polinucle�tido para la detección del cáncer, que se usa como cebador o sonda, y la norma empírica de los experimentadores. Los especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente dicho intervalo de temperatura.

La expresión "no hibrida sustancialmente con" como se usa en este documento se refiere a que un sujeto realmente no hibrida con una región parcial diana o un sujeto hibrida con una región parcial diana en una cantidad significativamente baja; es decir, en una cantidad relativamente pequeña casi indetectable, incluso cuando hibrida con la región parcial diana. Un ejemplo de un polinucle�tido que hibrida específicamente en dichas condiciones es un polinucle�tido que tiene una identidad de secuencia a un nivel o más con la secuencia de nucleótidos de una región parcial diana. Un ejemplo especifico de dicho polinucle�tido tiene un 70 % o más, preferiblemente un 80 % o más, 85 % o más, más preferiblemente un 90 % o más, más preferiblemente un 93 % o más, más preferiblemente un 95 % o más, y aún más preferiblemente un 98 % o más de identidad de secuencia. Más preferiblemente, el polinucle�tido tiene una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia de nucleótidos de una región parcial diana. La identidad de secuencia se define del mismo modo que para la identidad de secuencia de la secuencia de amino�cidos anterior. Incluso si un extremo de un polinucle�tido para la detección del cáncer contiene una región que no hibrida con un sujeto, en el caso de una sonda, puede usarse para detección siempre que la región de hibridación ocupe como mucho aproximadamente la mitad o más de la sonda completa. Además, en el caso de un cebador, puede usarse para la detección siempre que la región de hibridación ocupe como mucho aproximadamente una mitad o más del cebador completo y est� localizado en el lado 3' terminal, ya que la reacción normal de hibridación y extensión puede tener lugar. Como se ha descrito anteriormente, cuando un extremo de un polinucle�tido para la detección del cáncer contiene una región que no hibrida, la identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos diana se calcula centr�ndose solamente en una región de hibridación sin tener en consideración la región que no hibrida.

La expresión "secuencia parcial" en la presente invención se refiere a una secuencia parcial en las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID N� 1-29 con numeración impar, específicamente la secuencia parcial que tiene una secuencia de 15 nucleótidos continuos o más, preferiblemente 18 nucleótidos continuos o más, más preferiblemente 20 nucleótidos continuos o más o 25 nucleótidos continuos o más, y más preferiblemente 30, 40, ´0 50 nucleótidos continuos o más. La expresión "la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N� 5" como se usa en este documento se refiere a, además de la secuencia de nucleótidos realmente mostrada en la SEC ID N� 5, una secuencia complementaria a la secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, la expresión "un polinucle�tido que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N� 5" se refiere a un polinucle�tido monocatenario que tiene la secuencia de nucleótidos realmente mostrada en la SEC ID N� 5, un polinucle�tido monocatenario que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la mostrada en la SEC ID N� 5, y un polinucle�tido bicatenario que comprende los mismos. Cuando se prepara un polinucle�tido que codifica un polip�ptido a usar en la presente invención, se selecciona apropiadamente una secuencia cualquiera de nucleótidos y esta selección puede realizarse fácilmente por los especialistas en la técnica.

La cantidad de nucleótidos en un polinucle�tido para la detección del cáncer es de preferiblemente 18 nucleótidos o más en aras de asegurar la especificidad. Cuando se usa como sonda, el tamaño del polinucle�tido es preferiblemente de 18 nucleótidos o más, es más preferiblemente de 20 nucleótidos o más y la longitud completa o menos de la región codificante. Cuando se usa como cebador, el tamaño del polinucle�tido es preferiblemente de 18 nucleótidos o más y 50 nucleótidos o menos. Un ejemplo preferido del polinucle�tido para la detección del cáncer es un polinucle�tido que comprende 18 nucleótidos continuos o más en una secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N� 1-29 con numeración impar.

Es obvio para los especialistas en la técnica a los que se refiere esta descripción que: un polinucle�tido que hibrida específicamente con una región parcial de la SEC ID N� 5, 7, 9, 11, o 13 se usa para la medición de la cantidad de ARNm que codifica CAPRIN-1 canina de la SEC ID N� 6, 8, 10, 12 o 14, respectivamente; y un polinucle�tido que hibrida específicamente con una región parcial de la SEC ID N� 1 o 3 se usa para la medición de la cantidad de ARNm que codifica CAPRIN-1 humana de la SEC ID N� 2 o 4, respectivamente. Sin embargo, una proteína de un mamífero y un homólogo de la misma de otro mamífero generalmente comparten elevada identidad de secuencia incluso a nivel de secuencia de nucleótidos. Por tanto, la identidad de secuencia entre las secuencias de las SEC ID N� 1-13 con numeración impar también es tan elevada como del 94 % al 100 %. Por consiguiente, un polinucle�tido que hibrida específicamente con una región parcial de la secuencia de la SEC ID N� 5 también hibrida específicamente con una región parcial correspondiente a la región parcial relevante de cualquiera de las SEC ID N� 1-29 con numeración impar.

Realmente como se describe en los siguientes Ejemplos, un par de cebadores que tiene las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID N� 33 y 34, respectivamente, hibrida específicamente tanto con una región parcial de cualquiera de las secuencias de las SEC ID N� 1-29 con numeración impar como con una región parcial de la secuencia de la SEC ID N� 5, de modo que puede medirse tanto el ARNm que codifica CAPRIN-1 canina de la SEC ID N� 6 como el ARNm que codifica un homólogo de la misma, por ejemplo. Por consiguiente, por ejemplo, con el uso de un polinucle�tido que hibrida específicamente con una región parcial de la secuencia de la SEC ID N� 5, no solamente puede medirse el ARNm que codifica CAPRIN-1 canina de la SEC ID N� 6, sino también el ARNm que codifica CAPRIN-1 humana de la SEC ID N� 2 o 4. As� mismo, también puede medirse un ARNm que codifica CAPRIN-1 de otro mamífero tal como un gato. Cuando se diseña un polinucle�tido para la detección del cáncer, es deseable seleccionar regiones parciales que tengan una identidad de secuencia específicamente elevada entre los números de identidad de secuencia (SEC ID N� 1-29 con numeración impar) (preferiblemente, las secuencias de nucleótidos son las mismas). Si est� presente una región parcial que tiene identidad de secuencia particularmente elevada entre un perro y un ser humano, se espera que una región que tenga una identidad de secuencia muy elevada con la región est� presente en un gen homólogo de otra especie animal. A través de la selección de dichas regiones parciales, puede aumentarse la precisión para la medición del ARNm que codifica CAPRIN-1 de una especie animal diferente a perros y seres humanos.

Un método en s� mismo para medir un ácido nucleico de ensayo usando un polinucle�tido que hibrida específicamente con una región parcial del ácido nucleico de ensayo como cebador o sonda para un método de amplificación de ácido nucleico tal como PCR es bien conocido. Ejemplos de dicho método incluyen, además de RT-PCR que se describe específicamente en los siguientes ejemplos, transferencia de Northern e hibridación in situ. Cuando se mide la cantidad de ARNm, pueden emplearse todos estos métodos conocidos de medición.

Un método de amplificación de ácido nucleico en s� mismo tal como PCR es bien conocido en la técnica y por tanto est�n disponibles en el mercado kits de reactivos y aparatos para los mismos, de modo que el método pueda realizarse fácilmente. Específicamente, por ejemplo, las etapas de desnaturalización, hibridación, y extensión se realizan cada una usando un ácido nucleico de ensayo (por ejemplo, el ADNc de un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia de amino�cidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N� 2-30 con numeración par) como molde y un par de polinucle�tidos (cebadores) para la detección del cáncer en un tampón conocido en presencia de ADN polimerasa termoestable tal como polimerasa Taq o polimerasa Pfu y dNTP (aquí, N = A, T, C, o G) variando la temperatura de la solución de reacción. En general, la etapa de desnaturalización se realiza a 90 �C-95 �C, la etapa de hibridación se realiza a o cerca de la Tm del molde y los cebadores (preferiblemente en �4 �C), y la etapa de extensión se realiza a 72 �C que es una temperatura óptima para la ADN polimerasa termoestable tal como polimerasa Taq o polimerasa Pfu o una temperatura cercana a la temperatura óptima. Cada etapa se realiza durante aproximadamente 30 segundos a 2 minutos, según se selecciona apropiadamente. Este ciclo de calentamiento se repite aproximadamente 25 a 40 veces, por ejemplo, de modo que se amplifique la región de ácido nucleico molde flanqueada por un par de cebadores. Un método de amplificación de ácido nucleico no se limita a PCR y puede emplearse en este documento cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico conocido en la técnica. Como se ha descrito anteriormente, cuando se realiza un método de amplificación de ácido nucleico usando un par de polinucle�tidos de detección del cáncer como cebadores y un ácido nucleico de ensayo como molde, se amplifica el ácido nucleico de ensayo. Sin embargo, si no hay ácido nucleico de ensayo contenido en una muestra, la amplificación no tiene lugar. Por tanto, a través de la detección de los productos de amplificación, puede confirmarse la presencia o ausencia del ácido nucleico de ensayo en una muestra. Puede detectarse un producto de amplificación por un método que implica someter una solución de reacción después de amplificación a electroforesis, y después tiñendo la banda con bromuro de etidio o similares o un método que implica inmovilizar un producto de amplificación después de dicha electroforesis en una fase sólida tal como una membrana de nylon, realizando hibridación con una sonda de marcaje que hibrida específicamente con un ácido nucleico de ensayo, lavando, y después detectando el marcador. Además, se realiza concretamente PCR de detección a tiempo real usando un colorante fluorescente inactivador y un colorante fluorescente indicador, y de este modo puede determinarse cuantitativamente la cantidad de un ácido nucleico de ensayo en una muestra. Como est�n disponibles en el mercado kits para PCR de detección a tiempo real, la PCR de detección a tiempo real puede realizarse fácilmente. Además, también es posible la determinación semi-cuantitativa de un ácido nucleico de ensayo basándose en la intensidad de la banda de electroforesis. Un ácido nucleico de ensayo puede ser ARNm o ADNc resultante de ARNm mediante transcripción inversa. Cuando se amplifica ARNm como ácido nucleico de ensayo, también puede emplearse un método NASBA (método 3SR o método TMA) usando el par de cebadores anterior. El método NASBA en s� mismo es bien conocido y est�n disponibles en el mercado kits para el método, de modo que el método puede realizarse fácilmente usando el par de cebadores anterior.

Como sonda, puede usarse una sonda marcada que se prepara marcando un polinucle�tido para la detección del cáncer con un marcador fluorescente, un radiomarcador, un marcador de biotina, o similares. Un método para el marcaje de polinucle�tidos en s� mismo es bien conocido. La presencia o ausencia de un ácido nucleico de ensayo en una muestra puede examinarse inmovilizando un ácido nucleico de ensayo o un producto de amplificación del mismo, realizando hibridación con una sonda marcada, lavando, y después midiendo el marcador unido a la fase sólida. Como alternativa, se inmoviliza un polinucle�tido para la detección del cáncer, se hibrida un ácido nucleico de ensayo al mismo, y después puede detectarse el ácido nucleico de ensayo unido a la fase sólida usando la sonda marcada o similares. En dicho caso, un polinucle�tido para la detección del cáncer unido a una fase solida también se menciona como sonda. También se conoce en la técnica un método para medir un ácido nucleico de ensayo usando una sonda polinucleot�dica. El método puede realizarse causando que, en un tampón, una sonda polinucleot�dica entre en contacto con un ácido nucleico de ensayo a Tm o cerca de Tm (preferiblemente, en �4 �C) para la hibridación, lavando, y después midiendo la sonda marcada que ha hibridado o el ácido nucleico molde unido a la sonda en fase sólida. Ejemplos de dicho método incluyen métodos bien conocidos tales como transferencia de Northern, hibridación in situ, y métodos de transferencia de Southern. Cualquier método bien conocido es aplicable.

Se determina por el método de detección de la presente invención si un sujeto animal tiene cáncer o no basándose en el nivel de expresión de CAPRIN-1 medido como se ha descrito anteriormente. El cáncer puede detectarse solamente midiendo la expresión de CAPRIN-1 en un sujeto animal. Sin embargo, es preferible en aras de potenciación de la precisión de detección examinar los niveles de expresión (nivel de anticuerpos), de CAPRIN-1 en una o una pluralidad de muestras de sujetos sanos para obtener un valor patrón de sujetos sanos y entonces comparar el valor medido de un sujeto animal con el valor patrón obtenido de sujetos sanos. Para potenciar adicionalmente la precisión de detección, se examinan los niveles de expresión de CAPRIN-1 para muestras obtenidas de muchos pacientes que se ha descubierto que tienen cáncer para obtener un valor patrón de pacientes con cáncer y entonces el valor medido de un sujeto animal puede compararse tanto con el valor patrón de sujetos sanos como con el valor patrón de pacientes con cáncer. Los valores patrón anteriores pueden determinarse cuantificando el nivel de expresión de CAPRIN-1 en cada muestra y después calculando el calor medio de los mismos, por ejemplo. Un valor patrón de sujetos sanos y el mismo de pacientes con cáncer pueden determinarse por anticipado examinado los niveles de expresión de CAPRIN-1 en muchos sujetos sanos y pacientes con cáncer. Por lo tanto, cuando se realiza la comparación con un valor patrón en el método de la presente invención, puede usarse un valor patrón determinado por anticipado.

En el método de detección de la presente invención, puede usarse en combinación el diagnóstico basado en otros ant�genos de cáncer o marcadores de cáncer. Por consiguiente, puede aumentarse adicionalmente la precisión de la detección del cáncer. Por ejemplo, cuando se mide un anticuerpo que existe específicamente en pacientes con cáncer por el método de la presente invención, puede usarse otro polip�ptido que se expresa a menudo en un tejido canceroso en combinación con un ant�geno de un modo similar al de los polip�ptidos anteriores. Además, el método de la presente invención y el diagnóstico usando un marcador de cáncer previamente conocido pueden realizarse en combinación.

El cáncer puede detectar in vivo de acuerdo con el método de detección de la presente invención. Particularmente, como se describe en los siguientes Ejemplos, incluso un tumor de pequeño tamaño, que es invisible a simple vista, o un tumor en una parte profunda in vivo pueden detectarse de acuerdo con el método de la presente invención. Por tanto, el método de la presente invención es útil para una detección precoz del cáncer. Además, a través de la aplicación del método de detección de la presente invención para un paciente durante el seguimiento después de tratamiento contra el cáncer, puede detectarse cáncer de forma precoz si ha tenido lugar una recidiva del cáncer.

Adem�s, en un organismo vivo que alberga cáncer, como aumenta la cantidad de células cancerosas que expresan CAPRIN-1 medido en la presente invención, aumentan las cantidades de la proteína y su ARNm acumulado en el organismo vivo y aumenta la cantidad de producción del anticuerpo contra CAPRIN-1 en suero. Por lo pronto, como la cantidad de células cancerosas disminuye, las cantidades de la proteína y su ARNm acumulado in vivo disminuyen y la cantidad del anticuerpo contra CAPRIN-1 en suero disminuye. Por lo tanto, cuando el nivel de expresión de CAPRIN-1 es mayor que el de un control, puede determinarse que est� sucediendo un aumento de tumor o una metástasis cancerosa; es decir, la extensión del cáncer est� avanzada. Realmente, como se describe específicamente en los siguientes ejemplos, se observ� un aumento en el nivel s�rico anterior de anticuerpos en un organismo vivo que alberga cáncer en asociación con progresión del cáncer (maligno) tal como aumento del tumor y metástasis. Como se ha descrito anteriormente, la extensión del cáncer también puede detectarse por el método de la presente invención.

Adem�s, como se describe en los siguientes Ejemplos, entre tumores del mismo tipo, los niveles de anticuerpo anteriores en tumores de tipo maligno eran significativamente mayores que aquellos en tumores de tipo benigno. Por consiguiente, cuando el nivel de expresión de CAPRIN-1 es elevado, puede determinarse que la malignidad del cáncer es superior. Específicamente, la malignidad del cáncer también puede detectarse por el método de la presente invención.

El cáncer a someter al método para detectar cáncer de la presente invención es cáncer que expresa CAPRIN-1. Ejemplos de dicho cáncer incluyen, aunque sin limitación, tumor cerebral, carcinoma de células escamosas de la cabeza, cuello, pulmón, útero o esófago, melanoma, adenocarcinoma del pulmón o útero, cáncer renal, tumor mixto maligno, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células basales, tumor gingival tipo acantoma, tumor de la cavidad oral, adenocarcinoma perianal, tumor del saco anal, adenocarcinoma apocrino del saco anal, carcinoma de células de Sertoli, cáncer del vestíbulo vaginal, adenocarcinoma sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, carcinoma de glándulas sudor�paras, adenocarcinoma intranasal, adenocarcinoma nasal, cáncer de tiroides, cáncer de intestino grueso, adenocarcinoma bronquial, adenocarcinoma, carcinoma ductal, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama de tipo compuesto, tumor mixto mamario maligno, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de tejido blando, sarcoma histioc�tico, mixosarcoma, sarcoma indiferenciado, cáncer pulmonar, mastocitoma, leiomioma cut�neo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, leucemia linfoc�tica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células pequeñas a células medianas, tumor adrenomedular, tumor de células de la granulosa, y feocromocitoma. Además, un organismo vivo a someter al método de la presente invención es un mamífero y es preferiblemente un ser humano, un perro, o un gato.

Ejemplos de una muestra a someter al método de la presente invención incluyen fluidos corporales tales como sangre, suero, plasma sanguíneo, fluido ascético, y efusión pleural, tejidos, y células. En particular, en el 1er método y el 2� método anteriores, pueden usarse preferiblemente suero, plasma sanguíneo, fluido ascético, y efusión pleural y en el 3er método anterior para la medición del ARN, son preferibles muestras tisulares y muestras celulares.

Los polip�ptidos anteriores a usar como ant�genos para inmunoensayo en el 1er método (es decir, CAPRIN-1 canina de la SEC ID N� 2 y un homólogo de la misma, un polip�ptido parcial específicamente reactivo, un polip�ptido modificado específicamente reactivo, y un polip�ptido de adición específicamente reactivo) pueden proporcionarse como reactivos para la detección del cáncer. El reactivo pueden constar de solamente el polip�ptido anterior o puede contener diversos aditivos o similares, por ejemplo, útiles para la estabilizaci�n del polip�ptido. Además, el reactivo puede proporcionarse en una forma inmovilizada en una fase sólida tal como una placa o una membrana. Ejemplos preferibles del polip�ptido son los descritos anteriormente.

Un anticuerpo que experimenta una reacción ant�geno-anticuerpo con CAPRIN-1 o un fragmento de unión a ant�geno del mismo, que se usa para inmunoensayo de CAPRIN-1 en s� mismo en el 2� método, también puede proporcionarse como reactivo para detección del cáncer. El reactivo para la detección del cáncer en este caso también puede constar de solamente el anticuerpo o un fragmento de unión a ant�geno del mismo pude contener diversos aditivos o similares útiles para la estabilizaci�n y similares del anticuerpo o un fragmento de unión a ant�geno del mismo. Además, el anticuerpo o fragmento de unión a ant�geno del mismo puede estar en una forma de unión a metal tal como manganeso o hierro. Cuando dicho anticuerpo o fragmento de unión a ant�geno del mismo unido a metal se administra al cuerpo de un organismo vivo, el anticuerpo o fragmento de unión a ant�geno del mismo unido a metal se acumula a un nivel aumentado en el sitio donde est� presente la proteína antig�nica a un nivel superior. Por lo tanto, el metal se mide por RM o similares, y de este modo puede detectarse la presencia de células cancerosas que producen la proteína antig�nica.

Adem�s, el polinucle�tido anterior para la detección del cáncer a usar para la medición del ARNm en el 3er método también puede proporcionarse como reactivo para la detección del cáncer. El reactivo para la detección del cáncer en este caso también puede constar de solamente el polinucle�tido o puede contener diversos aditivos y similares útiles para estabilizaci�n y similares del polinucle�tido. El polinucle�tido para la detección del cáncer contenido en el reactivo es preferiblemente un cebador o una sonda. Las condiciones y ejemplos preferibles del polinucle�tido para la detección del cáncer son como se han descrito anteriormente.

Ejemplos

La presente invención se describir� en más detalle con referencia a los ejemplos expuestos a continuación; sin embargo, el alcance técnico de la presente invención no se limita a los ejemplos.

Ejemplo 1: Obtención de nueva proteína antig�nica de cáncer por el Método SEREX

(1) Construcción de biblioteca ADNc

Se extrajo el ARN total de un tejido de testículo de un perro sano mediante un método ácido de guanidinio-fenolcloroformo y después se purificó un ARN poliA usando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (Takara Shuzo Co., Ltd.) de acuerdo con protocolos incluidos con el kit.

Se sintetizó una biblioteca de fagos de ADNc de testículo canino usando el ARNm obtenido de este modo (5 !g). La biblioteca de fagos de ADNc se construy�9 usando un kit de síntesis de ADNc, un kit de síntesis de ZAP-ADNc, y un kit de clonaci�n de ZAP-ADNc GigapackIII Gold (STRATAGENE) de acuerdo con protocolos incluidos con los kit. El tamaño de la biblioteca de fagos de ADNc construida de este modo fue de 7,73 � 105 pfu/ml.

(2) Exploración de la biblioteca de ADNc usando suero

Se realizó inmunoexploraci�n usando la biblioteca de fagos de ADNc de testículo canino construida anteriormente. Específicamente, se infect� Escherichia coli hospedadora (XL1-Blue MRF') con el fago en una placa de agarosa NZY (Φ 90 � 15 mm) para obtener 2210 clonares. Las células de E. coli se cultivaron a 42 �C durante 3 a 4 horas para formar placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-1-D-tiogalact�sido) a 37 �C durante 4 horas, de modo que se indujo la proteína, se expres�, y después se transfirió a la membrana. Posteriormente, la membrana se recogió y después se sumergió en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, y pH 7,5) que contenía leche desnatada en polvo al 0,5 %, seguido de agitaci�n durante una noche a 4 �C, suprimiendo de este modo la reacción no específica. El filtro se hizo reaccionar con un suero diluido a factor 500 de un paciente canino a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

Como suero anterior de un paciente canino, se us� un suero recogido de un paciente canino con cáncer de mama. Estos sueros se almacenaron a -80 �C y después se sometieron a pretratamiento inmediatamente antes de usarlos. Un método para el pretratamiento del suero es el siguiente. Específicamente, se infect� Escherichia coli hospedadora (XL1-Blue MRF') se infect� con un fago A ZAP Express en que no se había insertado gen foráneo y después se cultiv� durante una noche en una medio de placa NZY a 37 �C. Posteriormente, se a�adi� tampón (NaHCO3 0,2 M y pH 8,3) que contenía NaCl 0,5 M a la placa, la placa se dej� reposar a 4 �C durante 15 horas, y después se recogió un sobrenadante como un extracto de Escherichia coli/fago. A continuación, el extracto de Escherichia coli/fago recogido de este modo se aplicó a una columna NHS (GE Healthcare Bio-Science), de modo que se inmovilizara una proteína derivada de Escherichia coli/fago. Se aplicó el suero de un paciente canino a la columna de proteína inmovilizada para su reacción y después se retiraron del suero Escherichia coli y un anticuerpo adsorbido al fago. La fracción de suero que había pasado a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contenía leche desnatada en polvo al 0,5 %. El resultante se us� como material de inmunoexploraci�n.

Se lav� una membrana sobre la que se había transferido el suero tratado y la proteína de fusión anterior 4 veces con TBS-T (Tween20 al 0,05 %/TBS) y después se hizo reaccionar con anticuerpo de cabra anti-IgG canina (anticuerpo de cabra anti-IgG-h+I de perro conjugado con HRP (BETIL Laboratories)) diluido 5000 veces con TBS que contenía leche desnatada en polvo al 0,5 % como anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. La detección se realizó mediante una reacción de coloración enzim�tica usando una solución de reacción NBT/BCIP (Roche). Colonias que coincidían en sitios positivos para una reacción de coloración se recogieron de la placa de agarosa NZY (Φ 90 � 15 mm) y después se suspendieron en 500 !l de un tampón SM (NaCl 100 mM, MgClSO4 10 mM, Tris-HCl 50 mM, gelatina al 0,01 %, y pH 7,5). Hasta que las colonias positivas para reacción de coloración se unificaron, se repitieron exploraciones secundarias y exploraciones terciarias por un método similar al anterior, de modo que se exploraron 30.940 clones de fago que reaccionaban con IgG s�rica. Por tanto, as aislaron 5 clonares positivos.

(3) Búsqueda de homología para el gen aislado de ant�geno

Para el análisis de secuencia de nucleótido de los 5 clones positivos aislados por el método anterior, se realizó un procedimiento para la conversión de vectores f�gicos en vectores plasm�dicos. Específicamente, se prepararon 200 !l de una solución para que contuviera Escherichia coli hospedadora (XL1-Blue MRF') de modo que la absorbancia DO600 fuera 1,0. La solución se mezcl� con 250 !l de una solución purificada de fago y después con 1 !l de un fago auxiliar ExAssist (STRATAGENE), seguido por 15 minutos de reacción a 37 �C. Se añadieron tres mililitros de medio LB y después se realizó el cultivo a 37 �C durante 2,5 a 3 horas. Inmediatamente después del cultivo, la temperatura de la solución se mantuvo a 70 �C mediante un baño de agua durante 20 minutos, se realizó centrifugaci�n a 4 �C y 1000 � g durante 15 minutos, y después se recogió el sobrenadante como una solución de fag�mido. Posteriormente, se prepararon 200 !l de una solución para que contuviera Escherichia coli hospedadora de fag�mido (SOLR) de modo que la absorbancia DO600 fuera 1,0. La solución se mezcl� con 10 !l de una solución purificada de fago, seguido por 15 minutos de reacción a 37 �C. La solución (50 !l) se sembr� en medio de agar LB que contenía de ampicilina (a una concentración final de 50 !g/ml) y después se cultiv� durante una noche a 37 �C. Se recogieron las colonias SOLR transformadas individuales y después se cultivaron en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 !g/ml) a 37 �C. Se purificó un ADN plasm�dico que contenía un inserto de interés usando un kit QIAGEN plasmid Miniprep (QIAGEN).

El pl�smido purificado se sometió a análisis de la secuencia de longitud completa mediante un método de paseo con cebador usando el cebador T3 de acuerdo con la SEC ID N� 31 y el cebador T7 de acuerdo con la SEC ID N� 32. Como resultado del análisis de secuencia, se obtuvieron las secuencias g�nicas de acuerdo con las SEC ID N� 5, 7, 9, 11, y 13. Se realizó una búsqueda de homología con el programa BLAST (http://www.ncbi.Nlm.Nih.gov/BLAST/), usando las secuencias de nucleótidos de los genes y secuencias de amino�cidos (SEC ID N� 6, 8, 10, 12, y 14) de las proteínas codificadas por los genes. Como resultado de esta búsqueda de homología con genes conocidos, se revel� que los 5 genes obtenidos codificaban CAPRIN-1. Respecto a las regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los 5 genes fue del 100 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 99 % en términos de secuencia de amino�cidos. También, con respecto a regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes y los genes que codifican homólogos humanos de los mismos fue del 94 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 98 % en términos de secuencia de amino�cidos. Las secuencias de nucleótidos del homólogo humano se muestran en las SEC ID N� 1 y 3 y las secuencias de amino�cidos de las mismas se muestran en las SEC ID N� 2 y 4. También, con respecto a regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y un gen que codifica un homólogo de ganado vacuno fue del 94 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 97 % en términos de secuencia de amino�cidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo de ganado vacuno se muestra en la SEC ID N� 15 y la secuencia de amino�cidos de la misma se muestra en la SEC ID N� 16. Respecto a regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican el homólogo humano y el gen que codifica el homólogo de ganado vacuno fue del 94 % en términos de secuencia de nucleótidos y vari� del 93 % al 97 % en términos de secuencia de amino�cidos. También, con respecto a regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y un gen que codifica un homólogo equino fue del 93 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 97 % en términos de secuencia de amino�cidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo equino se muestra en la SEC ID N� 17 y la secuencia de amino�cidos de la misma se muestra en la SEC ID N� 18. Respecto regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican el homólogo humano y el gen que codifica el homólogo equino fue del 93 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 96 % en términos de secuencia de amino�cidos. También, con respecto a regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y los genes que codifican un homólogo de ratón vari� del 87 % al 89 % en términos de secuencia de nucleótidos y vari� del 95 % al 97 % en términos de secuencia de amino�cidos. Las secuencias de nucleótidos del homólogo de ratón se muestran en las SEC ID N� 19, 21, 23, 25, y 27 y las secuencias de amino�cidos de las mismas se muestran en las SEC ID N� 20, 22, 24, 26, y 28. Respecto a regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican el homólogo humano y los genes que codifican el homólogo de ratón vari� del 89 % al 91 % en términos de secuencia de nucleótidos y vari� del 95 % al 96 % en términos de secuencia de amino�cidos. También, con respecto a regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y un gen que codifica un homólogo de pollo fue del 82 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 87 % en términos de secuencia de amino�cidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo de pollo se muestra en la SEC ID N� 29 y la secuencia de amino�cidos de la misma se muestra en la SEC ID N� 30. Respecto a regiones a traducir en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican el homólogo humano y el gen que codifica el homólogo de pollo vari� del 81 % al 82 % en términos de secuencia de nucleótidos y fue del 86 % en términos de secuencia de amino�cidos.

(4) Análisis de la expresión g�nica en cada tejido

Se examin� la expresión de los genes obtenidos por el método anterior en tejidos caninos y humanos normales y diversas líneas celulares por un método de RT-PCR (PCR de transcripción inversa). Se realizó una reacción de transcripción inversa del siguiente modo. Específicamente, se extrajo el ARN total de cada tejido (de 50 mg a 100 mg) y cada línea celular (5 a 10 � 106 células) usando un reactivo TRIZOL (Invitrogen Corporation) de acuerdo con protocolos incluidos con el mismo. Se sintetizó el ADNc usando el ARN total y el Superscript First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen Corporation) de acuerdo con protocolos incluidos con el mismo. La PCR se realizó del siguiente modo usando cebadores específicos para los genes obtenidos (de acuerdo con las SEC ID N� 33 y 34). Específicamente, la PCR se realizó preparando una solución de reacción ajustada a una cantidad total de 25 !l a través de la adición de cada reactivo y un tampón incluido (0,25 !l de una muestra preparada por reacción de transcripción inversa, los cebadores anteriores (2 !M cada uno), dNTP (0,2 mM cada uno), y 0,65 U de polimerasa ExTaq (Takara-baio Co., Ltd.)) y después haciendo reaccionar la solución a través de la repetición 30 veces de un ciclo de 94 �C/30 segundos, 60 �C/30 segundos, y 72 �C/30 segundos usando un termociclador (BIO RAD). Los cebadores de específicos de gen mencionados anteriormente se usaron para amplificar la región entre el nucleótido 206 y el nucleótido 632 en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N� 5 (gen de CAPRIN-1 canina) y la región entre el nucleótido 698 y el nucleótido 1124 en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N� 1 (gen de CAPRIN-1 humana). Para el control, se usaron cebadores específicos de GAPDH (de acuerdo con las SEC ID N� 35 y 36) al mismo tiempo. Como resultado, como se muestra en la Fig. 1, se observ� una fuerte expresión en testículo en el caso de tejidos caninos sanos, aunque que se observ� expresión en tejidos caninos de cáncer de mama y adenocarcinoma. Además, también se confirm� la expresión del homólogo humano de los genes obtenidos. Como un resultado, de manera similar al caso de los genes de CAPRIN-1 canina, la expresión se pudo confirmar solamente en el testículo en el caso de tejidos normales. Sin embargo, en el caso de células cancerosas, se detect� expresión en muchos tipos de líneas celulares cancerosas, tales como líneas celulares de cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, cáncer de pulmón, y cáncer de esófago. La expresión se confirm� en una cantidad particularmente grande de líneas celulares de cáncer de mama. Basándose en los resultados, se confirm� que no se observ� expresión de CAPRIN-1 en tejidos normales diferentes a que aquellos de testículo, aunque CAPRIN-1 se expresaba en muchas células cancerosas y particularmente en líneas celulares de cáncer de mama.

Adem�s, en la Fig. 1, la Referencia N� 1 a lo largo del eje longitudinal indica el patrón de expresión de cada uno de los genes identificados anteriormente y la Referencia N� 2 a lo largo del mismo indica el patrón de expresión del gen de GAPDH para el control.

(5) Tinción inmunohistoqu�mica

(5)-1 Expresión de CAPRIN-1 en tejidos normales de ratón y caninos

Se exanguin� a ratones (Balb/c, hembra) y perros (perros beagle, hembra) con anestesia por éter y anestesia por ketamina/isoflurano. Después de laparotom�a, los órganos (estómago, hígado, globo ocular, glándula del timo, músculo, médula ósea, útero, intestino delgado, esófago, corazón, ri��n, glándula salivar, intestino grueso, glándula mamaria, cerebro, pulmón, piel, glándula suprarrenal, ovario, páncreas, bazo, y vejiga) se transfirieron cada uno a una placa de 10 cm que contenía PBS. Cada órgano se abrió en PBS y después se fij� por perfusi�n durante una noche con tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) que contenía paraformaldeh�do al 4 % (PFA). El material perfundido se descart�, la superficie de tejido de cada órgano se aclar� con PBS, y después se a�adi� una solución de PBS que contenía de sacarosa al 10 % a un tubo de centrifugaci�n de 50 ml. Cada tejido se colocó después en cada tubo y después se agit� usando un rotor a 4 �C durante 2 horas. Cada solución se sustituyó con una solución de PBS que contenía sacarosa al 20 % y después se dej� reposar a 4 �C hasta que precipitaron los tejidos. Cada solución se sustituyó con una solución de PBS que contenía sacarosa al 30 % y después se dej� reposar a 4 �C hasta que precipitaron los tejidos. Se retir� cada tejido y se escindi� una parte necesaria con un escalpelo quirúrgico. A continuación, se aplicó un compuesto OCT (Tissue Tek) y se extendió sobre cada superficie tisular, y después los tejidos se colocaron en Cryomold. Se colocó Cryomold en hielo seco para una rápida congelación. Los tejidos se cortaron en trozos de 10 a 20 !m de longitud usando un criostato (LEICA) y después los trozos de tejido cortado se secaron al aire sobre portaobjetos de vidrio durante 30 minutos usando un secador de pelo, de modo que se prepararon portaobjetos de vidrio sobre los cuales se había aplicado trozos de tejido cortados. A continuación, cada portaobjetos de vidrio se colocó en un frasco de tinción llenado con PBS-T (solución salina que contenía Tween20 al 0,05 %), de modo que se realizó 3 veces un procedimiento que implicaba intercambio con PBS-T cada 5 minutos. Se retir� el exceso de agua alrededor de cada muestra usando paños Kimwipes y después cada sección se rode� usando DAKOPEN (DAKO). Como soluciones de bloqueo, se aplicó reactivo de bloqueo de Ig de ratón MOM (VECTASTAIN) sobre tejido de ratón y se aplicó solución de PBS-T que contenía suero de ternera fetal al 10 % sobre tejido canino. Los resultantes se dejaron reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se aplicó una solución preparada con la solución de bloqueo a 10 !g/ml de anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 (anticuerpo monoclonal, n� 8) que tenía la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 55 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 56, que reacciona con las superficies de las célula cancerosas preparadas en el Ejemplo 3, sobre cada portaobjetos de vidrio y después se dej� reposar en una cámara húmeda a 4 �C durante una noche. Tras lavar 3 veces durante 10 minutos con PBS-T, se aplicó un anticuerpo anti-IgG marcado con biotina MOM (VECTASTAIN) diluido 250 veces con la solución de bloqueo sobre cada portaobjetos de vidrio y después se dej� reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar 3 veces durante 10 minutos con PBS-T, se aplicó un reactivo ABC de avidina-biotina (VECTASTAIN) y después se dej� reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de lavar 3 veces durante 10 minutos con PBS-T, se aplicó una solución de tinción DAB (DAB 10 mg + H2O2 al 30 % 10 !l/Tris-HCl 0,05 M (pH 7,6) 50 ml) y después los portaobjetos de vidrio se dejaron reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los portaobjetos de vidrio se aclararon con agua destilada y después se aplicó un reactivo de hematoxilina (DAKO). Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto, los portaobjetos de vidrio se aclararon con agua destilada. Los portaobjetos de vidrio se sumergieron en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, y 100 % en ese orden durante 1 minuto cada uno y después se dejaron reposar en xileno durante una noche. Los portaobjetos de vidrio retiraron, se cubrieron con medio de montaje Glycergel (DAKO), y después se observaron. Como resultado, se observ� expresión de CAPRIN-1 en poca medida dentro de células de tejidos de glándula salivar, ri��n, colon, y estómago, pero nunca se observ� expresión de CAPRIN-1 sobre superficies celulares. Además, no se observ� absolutamente nada de expresión de CAPRIN-1 en tejidos de otros órganos.

(5)-2 Expresión de CAPRIN-1 en tejido canino de cáncer de mama

Con el uso de 108 muestras congeladas de tejido canino de de cáncer de mama de perros diagnosticados por diagnóstico patológico como que tienen cáncer de mama maligno, se prepararon portaobjetos de secciones congeladas mediante un método similar al anterior y se realizó tinción inmunohistoqu�mica usando el anticuerpo monoclonal n� 8 preparado en el Ejemplo 3. Como resultado, se confirm� la expresión de CAPRIN-1 en 100 de las 108 muestras (92,5 %). CAPRIN-1 se expres� de forma especialmente potente sobre las superficies de células cancerosas muy at�picas.

(5)-3 Expresión de CAPRIN-1 en tejido humano de cáncer de mama

Se realizó tinción inmunohistoqu�mica utilizando 188 muestras de tejido de cáncer de mama de una serie de tejido humano de cáncer de mama incluido en parafina (BIOMAX). Después de 3 horas de tratamiento a 60 �C, la serie de tejido humano de cáncer de mama se sumergió en un frasco de tinción llenado con xileno y después se realizó remplazo de xileno cada 5 minutos 3 veces. A continuación, se realizó un procedimiento similar usando etanol y PBS-T en lugar de xileno. La serie de tejido humano de cáncer de mama se sumergió en un frasco de tinción llenado con tampón citrato 10 mM (pH 6,0) que contenía Tween20 al 0,05 %, se trat� durante 5 minutos a 125 �C, y después se dej� reposar a temperatura ambiente durante 40 minutos o más. El exceso de agua alrededor de cada muestra se elimin� de la serie utilizando paños Kimwipes, cada sección se rode� utilizando DAKOPEN (DAKO), y después se a�adi� gota a gota una cantidad adecuada de bloqueo de peroxidasa (DAKO) sobre la serie. La serie se dej� reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y después se sumergió en un frasco de tinción llenado con PBS-

T. El remplazo de PBS-T cada 5 minutos se realizó 3 veces. Como solución de bloqueo, se aplicó una solución de PBS-T que contenía FBS al 10 % sobre la serie y después la serie se dej� reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se aplicó el anticuerpo monoclonal n� 8 preparado en el Ejemplo 3 ajustado a 10 !g/ml usando una solución de PBS-T que contenía FBS al 5 % y después la serie se dej� reposar durante una noche en una cámara húmeda a 4 �C. Después de lavar 3 veces durante 10 minutos con PBS-T, se a�adi� gota a gota una cantidad adecuada de pol�mero conjugado marcado con peroxidasa (DAKO) sobre la serie, y después la serie se dej� reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar 3 veces durante 10 minutos con PBS-T, se aplicó una solución de tinción DAB (DAKO) sobre la serie y después la serie se dej� reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solución de tinción DAB se descart� de la serie y después se realizaron 10 minutos de lavado con PBS-T 3 veces. La serie se aclar� con agua destilada y después se sumergió en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, y 100 % en ese orden durante 1 minuto cada una y después se dej� reposar en xileno durante una noche. La serie se retir�, se cubrió con medio de montaje de Glycergel (DAKO), y después se observ�. Como resultado, se observ� fuerte expresión de CAPRIN-1 para 138 (73 %) de las 188 muestras de tejido de cáncer de mama totales.

(5)-4 Expresión de CAPRIN-1 en tumor cerebral maligno humano.

Con el uso de 247 muestras de tejido de tumor cerebral maligno de serie de tejido de tumor cerebral maligno humano incluido en parafina (BIOMAX), se realizó tinción inmunohistoqu�mica por un método similar al de (5)-3 anterior usando el anticuerpo monoclonal n� 8 preparado en Ejemplo 3. Como resultado, se observ� una fuerte expresión de CAPRIN-1 en 227 (92 %) de las 247 muestras de tejido de tumor cerebral maligno totales.

(5)-5 Expresión de CAPRIN-1 en ganglio linfático metast�sico de cáncer de mama humano

Con el uso de 150 muestras de tejido de ganglio linfático metast�sico de cáncer de mama humano de series de tejido de ganglio linfático metast�sico de cáncer de mama humano incluido en parafina (BIOMAX), se realizó tinción inmunohistoqu�mica por un método similar al de (5)-3 anterior usando el anticuerpo monoclonal n� 8 preparado en el Ejemplo 3. Como resultado, se observ� una fuerte expresión de CAPRIN-1 en 136 (90 %) de las 150 muestras de tejido de ganglio linfático metast�sico de cáncer de mama humano totales. Específicamente, se revel� que CAPRIN1 también se expresa de forma potente en un tejido canceroso que ha metastatizado desde cáncer de mama.

Ejemplo 2: Preparación de nuevas proteínas antig�nicas de cáncer canino y humano

(1) Preparación de proteína recombinante

Se prepar� una proteína recombinante por el siguiente método basado en el gen de la SEC ID N� 5 obtenido en el Ejemplo 1. Se realizó PCR preparando una solución de reacción ajustada a una cantidad total de 50 !l a través de la adición de cada reactivo y un tampón incluido (1 !l de un vector preparado a partir de la solución de fag�mido obtenida en el Ejemplo 1 y después sometido a análisis de secuencia, 2 tipos de cebador (0,4 !M cada uno; de acuerdo con las SEC ID N� 37 y 38) que contenía las secuencias de escisión con enzimas de restricción Nde I y Kpn I, dNTP 0,2 mM, 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (Takara-baio Co., Ltd.)) y después haciendo reaccionar la solución a través de la repetición 30 veces de un ciclo de 98 �C/10 segundos y 68 �C/1,5 minutos usando un termociclador (BIO RAD). Los 2 tipos anteriores de cebador se usaron para amplifican la región que codifica la secuencia de longitud completa de amino�cidos de la SEC ID N� 6 (P47). Después de PCR, el ADN amplificado de este modo se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 % y después se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,4 kpb del gel usando un kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó a un vector de clonaci�n pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). El vector se introdujo por transformación en Escherichia coli y después se recogió el pl�smido. Basándose en la secuencia se confirm� que el fragmento del gen amplificado coincidía con la secuencia diana. El pl�smido que coincidía con la secuencia de interés se trat� con las enzimas de restricción Nde I y Kpn I y después el resultante se purificó utilizando un kit de extracción de gel QIAquick. Después se insert� la secuencia g�nica de interés en un vector de expresión pET30b (Novagen) para Escherichia coli tratado con las enzimas de restricción Nde I y Kpn I. Puede producirse una proteína recombinante fusionada con el marcador Hse usando el vector. El pl�smido se introdujo por transformación en Escherichia coli BL21 (DE3) para su expresión y después se realizó la inducción de la expresión usando IPTG 1 mM, de modo que se expres� la proteína diana en Escherichia coli.

Adem�s, se prepar� la proteína recombinante de un gen homólogo canino por el siguiente método basado en el gen de la SEC ID N� 7. Se realizó PCR preparando una solución de reacción ajustada a una cantidad total de 50 !l a través de la adición de cada reactivo y un tampón incluido (1 !l de ADNc entre los ADNc de diversos tejidos y/o células construidos en el Ejemplo 1, para el cual se pudo confirmar la expresión por un método de RT-PCR, 2 tipos de cebador (0,4 !M cada uno; de acuerdo con la SEC ID N� 39 y 40) que contenía secuencias de escisión con enzimas de restricción Nde I y Kpn I, dNTP 0,2 mM, 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (Takara-baio Co., Ltd.)) y después haciendo reaccionar la solución a través de la repetición 30 veces de un ciclo de 98 �C/10 segundos y 68 �C/2,5 minutos usando un termociclador (BIO RAD). Los 2 tipos de cebador anteriores se usaron para amplifican la región que codifica la secuencia de longitud completa de amino�cidos de la SEC ID N� 8. Después de PCR, el ADN amplificado de este modo se fraccion� con electroforesis en gel de agarosa al 1 % y después se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,2 kpb usando un kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó a un vector de clonaci�n pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). El vector se introdujo por transformación en Escherichia coli, y después se recogió el pl�smido. Basándose en la secuencia después se confirm� que el fragmento del gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El pl�smido que coincidía con la secuencia de interés se trat� con las enzimas de restricción Nde I y Kpn I y después el resultante se purificó usando un kit de extracción de gel QIAquick. Después se insert� la secuencia g�nica de interés en un vector de expresión pET30b (Novagen) para Escherichia coli tratado con las enzimas de restricción Nde I y Kpn I. Puede producirse una proteína recombinante fusionada a un marcador Hse usando el vector. El pl�smido se introdujo por transformación en Escherichia coli BL21 (DE3) para su expresión y después se realizó la inducción de la expresión usando IPTG 1 mM, de modo que se expres� la proteína de interés en Escherichia coli.

Adem�s, se prepar� la proteína recombinante de un gen homólogo humano por el siguiente método basado en el gen de la SEC ID N� 1. Se realizó PCR preparando una solución de reacción ajustada a una cantidad total de 50 !l a través de la adición de cada reactivo y un tampón incluido (ADNc (1 !l) entre los ADNc de diversos tejidos y/o células construidos en el Ejemplo 1, para el cual se pudo confirmar la expresión por un método de RT-PCR, 2 tipos de cebador (0,4 !M cada uno; de acuerdo con las SEC ID N� 41 y 42) que contenía secuencias de escisión con enzimas de restricción Sac I y Xho I, dNTP 0,2 mM, 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (Takara-baio Co., Ltd.)) y después haciendo reaccionar la solución a través de la repetición 30 veces de un ciclo de 98 �C/10 segundos y 68 �C/2,5 minutos usando un termociclador (BIO RAD). Los 2 tipos de cebador anteriores se usaron para amplifican la región que codifica la secuencia de longitud completa de amino�cidos de la SEC ID N� 2. Después de PCR, el ADN amplificado de este modo se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 % y después se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,1 kpb usando un kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó a un vector de clonaci�n pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). El vector introdujo por transformación en Escherichia coli, y después se recogió el pl�smido. Basándose en la secuencia después se confirm� que el fragmento del gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El pl�smido que coincidía con la secuencia de interés se trat� con las enzimas de restricción Sac I y Xho I y después el resultante se purificó usando un kit de extracción de gel QIAquick. Después se insert� la secuencia g�nica de interés en un vector de expresión pET30a (Novagen) para Escherichia coli tratado con las enzimas de restricción Sac I y Xho I. Se puede producir una proteína recombinante fusionada a un marcador Hse usando el vector. El pl�smido se introdujo por transformación Escherichia coli BL21 (DE3) para su expresión y después se realizó la inducción de la expresión usando IPTG 1 mM, de modo que se expres� la proteína de interés en Escherichia coli.

(2) Purificación de proteína recombinante

La Escherichia coli recombinante obtenida anteriormente que expresan las SEC ID N� 1, 5, o 7 se cultiv� a 37 �C en medio LB que contenía 30 !g/ml de kanamicina hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzara aproximadamente 0,7. Después se a�adi� isopropil-1-D-1-tiogalactopiran�sido a una concentración final de 1 mM, seguido por 4 horas de cultivo a 37 �C. Después, las células se recogieron por 10 minutos de centrifugaci�n a 4800 rpm. El sedimento celular se suspendió en solución salina tamponada con fosfato y después se centrifug� a 4800 rpm durante 10 minutos para lavar las células.

Las células se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato y después se sometieron a ultrasonicaci�n en hielo. La solución de Escherichia coli ultrasonicada de este modo se centrifug� a 6000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante obtenido de este modo se us� como fracción soluble y el precipitado obtenido de este modo se us� como fracción insoluble.

La fracción soluble se a�adi� a una columna quelante de níquel (vehículo: Sepharose quelante (TradeMark) Fast Flow (GE Healthcare), capacidad de columna: 5 ml, tampón de ácido clorhídrico 50 mM (pH 8,0) como tampón de equilibrado)) preparada de acuerdo con un método convencional. La fracción no unida se lav� con tampón de ácido clorhídrico 50 mM (pH 8,0) en una cantidad 10 veces la capacidad de la columna y tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía imidazol 20 mM. Inmediatamente después del lavado, se eluyeron 6 lechos con tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía imidazol 100 mM. Después de haber confirmado la eluci�n de la proteína de interés por tinción con Coomassie, se a�adi� una fracción de eluci�n de tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía imidazol 100 mM a una columna de intercambio ani�nico potente (vehículo: Q Sepharose (TradeMark) Fast Flow (GE Healthcare), capacidad de columna: 5 ml, y tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) como tampón de equilibrado). La fracción no unida se lav� con tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) en una cantidad 10 veces la capacidad de la columna y tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía cloruro sádico 200 mM. Inmediatamente después del lavado, se eluyeron 5 lechos usando tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía cloruro sádico 400 mM. Por tanto, se obtuvieron fracciones purificadas de proteínas cada una de las cuales tenía la secuencia de amino�cidos mostrada en las SEC ID N� 2, 6, o 8. Estas fracciones purificadas se usaron después como materiales para un ensayo de administración. La Fig. 2 muestra el resultado de la proteína de la SEC ID N� 2 fraccionada por electroforesis y detectada por tinción con Coomassie.

Se distribuyeron 200 !l de cada preparación purificada obtenida por el método anterior en 1 ml de tampón de reacción (Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 2 mM pH 7,4) y después se añadieron 2 !l de enteroquinasa (Novagen). La preparación se dej� reposar a temperatura ambiente durante una noche para su reacción, se escindi� la marca His, y después se realizó la purificación de acuerdo con protocolos incluidos usando un kit de captura de escisión con enteroquinasa (Novagen). A continuación, se sustituyeron 1,2 ml de cada preparación purificada obtenida por el método anterior con tampón fosfato fisiológico (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) usando ultrafiltraci�n NANOSEP 10K OMEGA (PALL). Se realizó filtración a esterilidad usando HT Tuffryn Acrodisc de 0,22 !m (PALL) y después los resultantes se usaron para los siguientes experimentos.

Ejemplo 3: Preparación de anticuerpo contra CAPRIN-1

(1) Preparación de anticuerpo policlonal contra p�ptido derivado de CAPRIN-1

Para obtener un anticuerpo de unión a CAPRIN-1, se sintetizó p�ptido derivado de CAPRIN-1 (Arg-Asn-Leu-Glu-Lys-Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln (SEC ID N� 43)). Se mezcl� un miligramo del p�ptido como ant�geno con una solución de adyuvante incompleto de Freund (IFA) en una cantidad equivalente al p�ptido. La mezcla se administr� por vía subcutánea a un conejo 4 veces cada 2 semanas. Después, se recogió sangre, de modo que se obtuvo un antisuero que contenía un anticuerpo policlonal. Además, el antisuero se purificó usando un vehículo de proteína G (GE Healthcare Bio-Sciences) y después se obtuvo un anticuerpo policlonal contra el p�ptido derivado de CAPRIN

1. A continuación, se examin� la reactividad del anticuerpo policlonal obtenido contra la superficie de las células cancerosas de mama. Específicamente, 106 células de la línea celular de cáncer de mama humana MDA-MB-231V se sometieron a centrifugaci�n en un tubo de microcentr�fuga de 1,5 ml. Se a�adi� al tubo una solución de PBS suplementada con suero de ternera fetal al 0,1 % (FBS) que contenía el anticuerpo policlonal. La solución se dej� reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se a�adi� a la solución un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con FITC (Invitrogen Corporation) diluido 500 veces con PBS que contenía FBS al 0,1 %, y después la solución se dej� reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando un FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). Mientras tanto, se realizó un procedimiento similar al anterior de modo que se prepar� un control añadiendo PBS que contenía FBS al 0,1 % en lugar del anticuerpo policlonal. Como resultado, se revel� que la intensidad de fluorescencia encontrada era más potente en células tratadas con el anticuerpo policlonal que el de las células de control. Por lo tanto, se demostr� que el anticuerpo policlonal obtenido se une a la superficie de células cancerosas de mama.

(2) Preparación de anticuerpo monoclonal contra la proteína CAPRIN-1

La proteína antig�nica (CAPRIN-1 humana) (100 !g) mostrada en la SEC ID N� 2 preparada en el Ejemplo 2 se mezcl� con un adyuvante MPL+TDM (Sigma) en una cantidad equivalente a la de la proteína antig�nica. La mezcla se us� como solución de ant�geno por ratón. La solución de ant�geno se administr� por vía intraperitoneal a un ratón Balb/c de 6 semanas de edad (Japan SLC Inc.) y después se les administr� adicionalmente 3 veces cada semana. Se retir� el bajo el día 3 después de la inmunizaci�n final y después se molió entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. El resultante se lav� con PBS (-) (Nissui) y después se centrifug� a 1500 rpm durante 10 minutos, de modo que se repitió 3 veces un procedimiento para retirar los sobrenadantes. De este modo, se obtuvieron células espl�nicas. Las células espl�nicas obtenidas de este modo se mezclaron con células de mieloma de ratón SP2/0 (adquiridas de la ATCC) a una proporción de 10:1. La solución de PEG preparada mezclando 200 !l de medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 % calentada a 37 �C y 800 !l de PEG1500 (Boehringer) se a�adi� a las células. La solución se dej� reposar durante 5 minutos para la fusión celular. Se realizó centrifugaci�n a 1700 rpm durante 5 minutos para retirar los sobrenadantes. Las células se suspendieron en 150 ml de medio RPMI1640 (medio selectivo HAT) que contenía FBS al 15 %, al cual se había añadido un 2 % equivalente de solución HAT (Gibco) y después se sembraron en quince placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 !l por pocillo. Las células se cultivaron durante 7 días en condiciones de 37 �C y CO2 al 5 %, de modo que se obtuvieron hibridomas resultares de la fusión de células espl�nicas a células de mieloma.

Los hibridomas se seleccionaron usando como índice la afinidad de unión del anticuerpo producido por los hibridomas preparados de este modo para la proteína CAPRIN-1. La solución de proteína CAPRIN-1 (1 !g/ml) preparada en el Ejemplo 2 se a�adi� a 100 !l por pocillo de placas de 96 pocillos y después se dej� reposar a 4 �C durante 18 horas. Cada pocillo se lav� 3 veces con PBS-T, y después se a�adi� solución de albúmina s�rica bovina (BSA) al 0,5 % (Sigma) a 400 !l por pocillo, y después las placas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se retir� y después cada pocillo se lav� 3 veces con 400 !l de PBS-T. Cada sobrenadante de cultivo de las hibridomas obtenidos anteriormente se a�adi� a 100 !l por pocillo y después se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lav� 3 veces con PBS-T, se a�adi� un anticuerpo anti-IgG (H+L) de ratón marcado con HRP (Invitrogen Corporation) diluido 5000 veces con PBS a 100 !l por pocillo y después se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lav� 3 veces con PBS-T. Se a�adi� una solución de sustrato TMB (Thermo) a 100 !l por pocillo y después se dejaron reposar durante 15 - 30 minutos, de modo que se realizó una reacción de color. Después del desarrollo del color, se a�adi� ácido sulfúrico 1 N a 100 !l por pocillo para detener la reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccion� una pluralidad de hibridomas que producían anticuerpos con elevadas absorbancias.

Los hibridomas seleccionados de este modo se añadieron a 0,5 hibridomas por pocillo de placas de 96 pocillos y después se cultivaron. Después de 1 semana, se observaron hibridomas que formaban colonias individuales en los pocillos. Las células en estos pocillos se cultivaron adicionalmente. Los hibridomas se seleccionaron usando como índice la afinidad de unión del anticuerpo producido por los hibridomas clonado para la proteína CAPRIN-1. La solución de proteína CAPRIN-1 (1 !g/ml) preparada en el Ejemplo 2 se a�adi� a 100 !l por pocillo de placas de 96 pocillos y después se dejaron reposar a 4 �C durante 18 horas. Cada pocillo se lav� 3 veces con PBS-T. Se a�adi� una solución de BSA al 0,5 % a 400 !l por pocillo, y después se dej� reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se retir� y después cada pocillo se lav� 3 veces con 400 !l de PBS-T. Cada sobrenadante de cultivo de las hibridomas obtenidos anteriormente se a�adi� a 100 !l por pocillo y después se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lav� 3 veces con PBS-T. Se a�adi� un anticuerpo anti-IgG (H+L) de ratón marcado con HRP (Invitrogen Corporation) diluido 5000 veces con PBS a 100 !l por pocillo y después se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lav� 3 veces con PBS-T, se a�adi� una solución de sustrato TMB (Thermo) a 100 !l por pocillo y después se dejaron reposar durante 15 - 30 minutos, de modo que se realizó una reacción de color. Después del desarrollo del color, se a�adi� ácido sulfúrico 1 N a 100 !l por pocillo para detener la reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvo una pluralidad de línea celulares de hibridoma que producían anticuerpos monoclonales que ejercen reactividad contra la proteína CAPRIN-1. Los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas se purificaron usando un vehículo de proteína G, de modo que se obtuvieron 150 anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína CAPRIN-1.

A continuación, entre estos anticuerpos monoclonales, se seleccionaron anticuerpos monoclonales que ejercían reactividad contra las superficies de células cancerosas de mama que expresan CAPRIN-1. Específicamente, se sometieron 106 células de la línea celular de cáncer de mama humana MDA-MB-231V a centrifugaci�n con un tubo de microcentr�fuga de 1,5 ml. Se a�adi� el sobrenadante (100 !l) de cada hibridoma anterior y después se dej� reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se a�adi� un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con FITC (Invitrogen Corporation) diluido 500 veces con PBS que contenía suero de ternera fetal al 0,1 % y después se dej� reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). Mientras tanto, se realizó un procedimiento similar al anterior de modo que se prepar� un control suplementado con medio en lugar del anticuerpo. Como resultado, se seleccionaron 10 anticuerpos monoclonales (n� 1-n� 10) que tenían intensidad de fluorescencia más potente que la del control; es decir, que reaccionaban con las superficies de células cancerosas de mama. Las regiones variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera de estos anticuerpos monoclonales se mostraron en las SEC ID N� 44 - 60. El anticuerpo monoclonal n� 1 anterior comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 44 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 45, el anticuerpo monoclonal n� 2 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 44 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 46, el anticuerpo monoclonal n� 3 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 44 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 47, el anticuerpo monoclonal n� 4 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 44 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 48, el anticuerpo monoclonal n� 5 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 49 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 50, el anticuerpo monoclonal n� 6 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 51 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 52, el anticuerpo monoclonal n� 7 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 53 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 54, el anticuerpo monoclonal n� 8 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 55 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 56, el anticuerpo monoclonal n� 9 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 57 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 58, y el anticuerpo monoclonal n� 10 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID N� 59 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N� 60.

(3) Identificación de un p�ptido en la proteína CAPRIN-1, al cual se une un anticuerpo contra CAPRIN-1 que reacciona contra la superficie de células cancerosas

Con el uso de los anticuerpos monoclonales n� 1-n� 10 contra CAPRIN-1, que reaccionan con las superficies de células cancerosas obtenidas anteriormente, se identificaron secuencias parciales en la proteína CAPRIN-1 a reconocer por estos anticuerpos monoclonales.

En primer lugar, se a�adi� DTT (Fluka) a 100 !l de una solución de proteína recombinante CAPRIN-1 ajustada para contener la proteína a una concentración de 1 !g/!l con PBS a una concentración final de 10 mM, seguido por 5 minutos de reacción a 95 �C, de modo que se realizó una reducción de los enlaces disulfuro dentro de la proteína CAPRIN-1. A continuación, se a�adi� yodoacetamida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) con una concentración final de 20 mM y después se realizó una reacción de alquilaci�n para los grupos tiol a 37 �C durante 30 minutos en condiciones de oscuridad. Se añadieron cincuenta microgramos de cada uno de los anticuerpos monoclonales n� 1n� 10 contra CAPRIN-1 a 40 !g de la proteína CAPRIN-1 reducida-alquilada obtenida de este modo. El volumen de la mezcla se ajust� a 1 ml de tampón fosfato 20 mM (pH 7,0), y después la mezcla se dej� reaccionar durante una noche a 4 �C con agitaci�n y mezcla de cada mezcla.

A continuación, se a�adi� tripsina (Promega) a una concentración final de 0,2 !g. Después de 1 hora, 2 horas, 4 horas, y después 12 horas de reacción a 37 �C, los resultantes se mezclaron con perlas de vidrio de proteína A (GE) sometidas por adelantado a bloqueo con PBS que contenía BSA al 1 % (Sigma) y lavado con PBS en carbonato de calcio 1 mM y tampón NP-40 (tampón fosfato 20 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, y NP-40 al 1 %), seguido por 30 minutos de reacción. Las soluciones de reacción se lavaron cada una con tampón carbonato de amonio 25 mM (pH 8,0) y después se eluyeron los complejos ant�geno-anticuerpo usando 100 !l de ácido f�rmico al 0,1 %. Se realizó análisis LC-MS para los productos eluidos usando Q-TOF Premier (Waters-MicroMas) de acuerdo con protocolos incluidos con el instrumento.

Como resultado, se identificó el polip�ptido de la SEC ID N� 61 como una secuencia parcial de CAPRIN-1, que se reconoció por todos los anticuerpos monoclonales n� 1-n� 10 contra CAPRIN-1. Además, se identificó el p�ptido de la SEC ID N� 62 como una secuencia parcial en el polip�ptido de la SEC ID N� 61 anterior, que se reconoció por los anticuerpos monoclonales n� 1-n� 4, n� 5-n� 7, y n� 9. Se revel� adicionalmente que los anticuerpos monoclonales n� 1-n� 4 reconocían el p�ptido de la SEC ID N� 63 que era un p�ptido de secuencia parcial del mismo.

Ejemplo 4: Diagnóstico del cáncer usando polip�ptido CAPRIN-1

(1) Diagnóstico de cáncer canino

Se recogió sangre de 342 pacientes caninos con tumores malignos o benignos confirmados y 6 perros sanos, y se separ� el suero. Con el uso del polip�ptido CAPRIN-1 canino (SEC ID N� 8) y el anticuerpo anti-IgG canina preparada en el Ejemplo 2, se midió el título del anticuerpo IgG en suero que reaccionaba específicamente con el polip�ptido por un método ELISA.

La inmovilización del polip�ptido preparado de este modo se realizó añadiendo una solución de proteína recombinante diluida a 5 !g/ml con solución salina tamponada con fosfato a placas de inmovilización amino de 96 pocillos (Nunc) a 100 !l/pocillo y después dejando las placas reposar a 4 �C durante una noche. El bloqueo se realizó añadiendo una solución de tampón bicarbonato sádico 50 mM (pH 8,4) (a partir de ahora en este documento, solución de bloqueo) que contenía BSA (albúmina s�rica bovina) al 0,5 % (Sigma Aldrich Japan) a 100 !l/pocillo y después agitando la solución a temperatura ambiente durante 1 hora. Se a�adi� suero diluido 1000 veces con la solución de bloqueo a 100 !l/pocillo y después la mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 3 horas para su reacción. Las soluciones de reacción se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (a partir de ahora en este documento, PBS-T) que contenía Tween20 al 0,05 % (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Se a�adi� un anticuerpo contra IgG canina modificado con HRP (anticuerpo de cabra anti-IgG-h+I de perro conjugado con HRP: BETIL Laboratorys) diluido 3000 veces con la solución de bloqueo a 100 !l/pocillo, seguido por 1 hora de reacción a temperatura ambiente con agitaci�n de la solución. Después de lavar 3 veces con PBS-T, se a�adi� el sustrato HRP TMB (1-Step Turbo TMB (tetrametilbencidina), PIERCE) a 100 !l/pocillo y después se realizó una reacción de enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, se a�adi� una solución de ácido sulfúrico 0,5 M (Sigma Aldrich Japan) a 100 !l/pocillo para detener la reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplaca. Como controles, una muestra en relación con la cual no se había inmovilizado proteína recombinante preparada y una muestra en relación con la cual no se había realizado una reacción con el suero de un perro que albergaba cáncer se sometieron de forma similar al tratamiento y comparación anteriores.

Como resultado del diagnóstico patológico usando tejido tumoral escindido, el diagnóstico definitivo se hizo indicando que 215 de las 342 muestras totales usadas para el diagnóstico del cáncer eran malignas.

Espec�ficamente, se diagnosticó que las muestras tenían cáncer tal como melanoma maligno, tumor mixto maligno, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células basales, tumor gingival de tipo acantoma, tumor de la cavidad oral, adenocarcinoma perianal, tumor del saco anal, adenocarcinoma apocrino del saco anal, carcinoma de células de Sertoli, cáncer del vestíbulo vaginal, adenocarcinoma sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, carcinoma de glándulas sudor�paras, adenocarcinoma intranasal, adenocarcinoma nasal, cáncer de tiroides, cáncer del intestino grueso, adenocarcinoma bronquial, adenocarcinoma, carcinoma ductal, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama de tipo compuesto, tumor mixto mamario maligno, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de tejido blando, sarcoma histioc�tico, mixosarcoma, sarcoma indiferenciado, cáncer pulmonar, mastocitoma, leiomioma cut�neo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, carcinoma de células escamosas, leucemia linfoc�tica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células pequeñas a células medianas, tumor adrenomedular, tumor de células de la granulosa, y feocromocitoma.

Se descubrió que los sueros de los cuerpos vivos de estos perros que albergaban cáncer tenían títulos de anticuerpos significativamente elevados contra la proteína recombinante como se muestra en la Fig. 3. Cuando el valor de referencia como cáncer maligno con respecto al método de diagnóstico se determinaba en dos veces o más el valor promedio para perros sanos, se demostraba que la malignidad podía diagnosticarse para 108 muestras, que representaban el 50,2 % de todas las muestras. Los tipos de cáncer de estas 108 muestras son los siguientes. Aunque se había indicado el desarrollo de una pluralidad de tipos de cáncer para algunas muestras, los siguientes valores numéricos son valores totales cumulativos para cada tipo de cáncer:

6 casos de melanoma maligno, 11 casos de linfoma, 1 caso de inflamación supurante, 1 caso de tumor de células de la granulosa, 4 casos de carcinoma hepatocelular, 3 casos de tumor testicular maligno, 3 casos de tumor de la cavidad oral, 7 casos de adenocarcinoma perianal, 12 casos de sarcoma, 35 casos de adenocarcinoma de mama, 1 caso de cáncer pulmonar, 6 casos de carcinoma ductal, 2 casos de adenocarcinoma sebáceo, 5 casos de mastocitoma, 1 caso de sarcoma de músculo liso, 3 casos de carcinoma de células escamosas, 2 casos de tumor mixto maligno, 1 caso de hemangiopericitoma, 1 caso de cáncer epitelial transicional, 1 caso de hemangiopericitoma, 1 caso de hemangiopericitoma, y 1 caso de epitelioma sebáceo.

Como resultado de un diagnóstico similar usando efusiones pleurales y fluidos ascéticos recogidos de pacientes caninos con cáncer terminal, pudieron detectarse valores similar a los resultados obtenidos por el método de diagnóstico usando suero y pudo hacerse el diagnóstico del cáncer.

Adem�s, se demostr� que el uso del método de diagnóstico posibilita el diagnóstico del cáncer en una ubicación invisible a simple vista, la extensión del cáncer, la malignidad o evolución postoperatoria del cáncer, recidiva, metástasis y similares. Varios ejemplos específicos de diagnóstico detallado mostrados en la Fig. 4 son como se describen a continuación.

(2)-1 Diagnóstico de cáncer para tumor invisible a simple vista

El 7 de junio de 2007, se confirm� ausencia de masa tumoral para el paciente canino 1 (perdiguero de pelo liso). Sin embargo, aproximadamente 20 días más tarde, el 24 de junio de 2007, se encontr� una masa tumoral peduncular con un diámetro de 2 mm en la encía en la raíz del colmillo izquierdo maxilar del paciente canino 1. En el día en que se encontr� la masa, se ligó y se escindi� la parte peduncular. Se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,06 antes de que se pudiera confirmar visualmente la masa tumoral, y esta cifra era casi igual a 0,04, que se determin� cuando se encontr� el tumor. Se demostr� también por el resultado que el diagnóstico de cáncer en una ubicación invisible a simple vista, tal como cáncer intraperitoneal, es posible con el uso de esta técnica.

Adem�s, se puede decir que se detect� con éxito un signo de alerta de desarrollo de tumor, ya que se pudo confirmar un aumento en el nivel mencionado anteriormente antes de poder confirmar el tumor a simple vista. Por lo tanto, se confirm� que la técnica es también útil para exámenes de salud tales como revisiones rutinarias de salud.

(2)-2 Diagnóstico de la extensión del cáncer

La extensión del cáncer se determina basándose en el tamaño del tumor, la profundidad del tumor, el modo en que el tumor afecta al tejido periférico, y la presencia o ausencia de metástasis. Se revel� que se detectaba un valor más elevado cuando había aparecido metástasis o había progresado el cáncer.

(2)-3 Diagnóstico de la malignidad del cáncer

Los tumores de células basales incluyen tumores malignos de células basales y tumores benignos de células basales. En los últimos años, se ha tendido a clasificar los tumores malignos de células basales como ejemplos de carcinoma de células basales y se ha tendido a clasificar los tumores benignos de células basales como ejemplos de tricoblastoma de acuerdo con la nueva OMS.

El paciente canino 2 (Beagle) diagnosticado con carcinoma de células basales (maligno) se sometió a serodiagn�stico tras cirugía, de modo que se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,04. Mientras tanto, el paciente canino 3 (mestizo) diagnosticado con tricoblastoma (benigno) se sometió a serodiagn�stico tras cirugía, de modo que se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0, lo que indica ausencia de detección. Por lo tanto, se demostr� que pueden diagnosticarse diferentes tipos de tumor de células basales, es decir, carcinoma maligno de células basales y tricoblastoma benigno, incluso s se clasifican como tumores de células basales.

A continuación, hay ejemplos de tumores de glándula mamaria. Los tumores de glándula mamaria se clasifican como tumores malignos tales como adenocarcinoma de mama y tumor mixto mamario maligno y tumores benignos de glándula mamaria que no muestran hallazgos malignos.

El paciente canino 4 (pastor de Shetland) experiment� cirugía de extirpaci�n el 17 de julio de 2007, para adenocarcinoma de mama. El paciente canino 4 tenía 3 tumores. El diagnóstico patológico usando tejido aislado produjo el mismo diagnóstico. El tejido fuertemente at�pico e invasivo de glándula mamaria experiment� crecimiento papilar-adenoide algo extendido, y también se confirm� invasión vascular para los muestras. Por tanto, el paciente canino 4 se diagnosticó con cáncer de mama altamente maligno. Como resultado del serodiagn�stico usando sangre recogida tras la cirugía, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,41.

Mientras tanto, el paciente canino 5 (caniche miniatura) experiment� cirugía de extirpaci�n el 9 de octubre de 2007, para un tumor de glándula mamaria. El diagnóstico patológico usando tejidos aislados en ese momento revel� que: mientras se formaban tumores en que las células epiteliales de la glándula mamaria y las células mioepiteliales crecían, los componentes de las célula mioepiteliales eran células ahusadas uniformes y no se detect� malignidad; y el componente de células epiteliales de la glándula mamaria mostr� una ligera diferencia en el tamaño y la discariosis observada. Por tanto, el paciente canino 5 se diagnosticó con un tumor benigno de glándula mamaria para que el cual no se detect� malignidad. Como resultado de la recogida de sangre y el serodiagn�stico tras la cirugía del mismo, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0.

Los resultados anteriores para las 2 muestras revelaron que la malignidad de un tumor altamente maligno es mayor que el de un tumor benigno de baja malignidad.

Adem�s, se examin� la distribución de los diagnósticos para 54 muestras de tumor maligno (cáncer de mama), tales como muestras de adenocarcinoma de mama o tumor mixto mamario maligno y 21 muestras de tumor benigno de glándula mamaria que no muestran malignidad. Mientras las muestras de tumor benigno de glándula mamaria mostraron una distribución similar a la del caso de perros sanos, las muestras de cáncer de mama mostraron una distribución de valores elevados.

(2)-4 Diagnóstico de evolución postoperatoria

El paciente canino 6 (mestizo) visit� el hospital a causa de mastocitoma y experiment� cirugía de extirpaci�n el 23 de mayo de 2005. Como resultado del serodiagn�stico hecho en ese momento, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,10. El mastocitoma es un tumor que experimenta repetidamente recidiva o metástasis cuando se reseca de forma incompleta. Por lo tanto, es importante si puede o no conseguirse la resecci�n del tumor completo por cirugía. En el seguimiento el 19 de diciembre 2006, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,05, de modo que se confirm� un título de anticuerpo disminuido. En ese momento, no se confirm� recidiva. Por tanto, en el caso del paciente canino 6, se puede decir que como el tumor pudo resecarse completamente, los resultados del serodiagn�stico fueron inferiores a aquellos tras la cirugía.

El paciente canino 7 (Beagle) experiment� cirugía de extirpaci�n el 14 de febrero de 2008, para mastocitoma. Como resultado del serodiagn�stico realizado en ese momento, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,17. Como resultado del diagnóstico histopatol�gico usando tejidos escindidos, se observ� hiperplasia invasiva y el paciente canino 7 se diagnosticó con mastocitoma correspondiente al tipo moderadamente diferenciado (tipo Patnaik II). El paciente canino 7 acudió de nuevo a una visita de seguimiento el 10 de marzo de 2008 y se sometió a serodiagn�stico otra vez. Como resultado, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,07. En ese momento, no se confirm� metástasis ni recidiva. Por tanto, en el caso del paciente canino 7, se puede decir que los resultados del serodiagn�stico fueron inferiores que aquellos tras cirugía ya que el tumor pudo resecarse completamente.

(2)-5 Diagnóstico de recidiva

El paciente canino 8 (Husky) experiment� cirugía de extirpaci�n el 8 de mayo de 2007, para adenocarcinoma de mama. Como resultado del serodiagn�stico realizado en ese momento, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,05. Como resultado del diagnóstico patológico usando tejido escindido, crecían células epiteliales fuertemente at�picas formando principalmente una estructura tubular. Por tanto, el paciente canino 8 se diagnosticó con adenocarcinoma a partir de la glándula mamaria primaria. En ese momento, ya se había confirmado la presencia de muchas células cancerosas en los conductos linfáticos, lo que indica un riesgo elevado de metástasis o recidiva en los ganglios linfáticos o sitios distantes. El 28 de junio de 2007 (aproximadamente 1 mes y medio después de cirugía), se confirm� recidiva en el mismo sitio. El resultado del serodiagn�stico en ese momento fue de 0,09, y por tanto se confirm� un valor aumentado. En el caso del paciente canino 8, se revel� que a causa de la resecci�n incompleta del tumor o recidiva del mismo, los resultados diagnósticos fueron superiores a finales de junio que a principio de mayo.

(2)-6 Diagnóstico de metástasis

El paciente canino 9 (terrier escocés) experiment� múltiples metástasis y recidivas, incluyendo un tumor de glándula mamaria en febrero de 2003, melanoma maligno intraoral en agosto de 2003, melanoma maligno labial en enero de 2005, y melanoma intraoral el 13 de abril de 2005. Todos estos tumores se habían resecado por cirugía. El paciente canino 9 volvió a visitar el hospital el 17 de diciembre de 2006, para el seguimiento tras la recidiva de melanoma intraoral en abril de 2005 y se sometió a serodiagn�stico. Como resultado, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,09. Medio año más tarde, el paciente canino 9 volvió a visitar el hospital el 20 de junio de 2007 a causa de hiperplasia linfoide cervical y linfoide popliteal. En el caso del linfoma, los ganglios linfáticos se hincharon sist�micamente. El paciente canino 9 tenía hinchamiento de los ganglios linfáticos en solamente dos sitios. Por tanto, el paciente canino 9 se diagnosticó cl�nicamente con probable linfoma debido a metástasis. El diagnóstico hecho por esta técnica también revel� que la absorbancia a 450 nm estaba aumentada hasta 0,10, lo que indica que el linfoma estaba causado por metástasis desde el tumor previo.

El paciente canino 10 (Shiba inu) experiment� tumorectom�a el 11 de marzo de 2006, a causa de melanoma maligno intraoral del labio derecho. El paciente canino 10 tenía un historial de tratamiento con agente antineopl�sico (ciclofosfamida) desde el 10 de junio de 2006, hasta el 26 de septiembre de 2006, y estaba con medicaci�n con BIREMO S que tiene germanio orgánico como un ingrediente principal desde el 23 de mayo de 2006. El serodiagn�stico se hizo el 20 de marzo de 2007, tras la eliminación de un tumor que se creía provocado por metástasis del tumor previo, de modo que se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de casi 0,03, lo que indica casi ausencia de detección. Se hizo el diagnóstico patológico para el tejido escindido en ese momento de modo que la enfermedad se diagnosticó como melanoma maligno metast�sico. Sin embargo, sucedido metástasis de nuevo el 27 de junio 2007, 3 meses después de cirugía para melanoma metast�sico. Se desarroll� un tumor en la parte derecha de la cerviz el 20 de marzo de 2007, y apareció un desarrollo tumoral adicional en el lado opuesto a dicha parte el 27 de junio de 2007. Los tumores formaron masas negras análogas a aquellas de los hallazgos previos. El tamaño del tumor fue de 3,1 � 3,2 � 0,8 cm, y los tumores se diagnosticaron cl�nicamente como tumores metast�sicos. Como resultado del serodiagn�stico en ese momento, se confirm� que la absorbancia a 450 nm había aumentado hasta 0,23, lo que sugiere que los tumores resultaron de metástasis de tumores previos.

(2)-7 Diagnóstico de cáncer usando polip�ptido derivado de CAPRIN-1 humana

Con el uso del polip�ptido (SEC ID N� 2) de CAPRIN-1 humana preparado en el Ejemplo 2, se midió el título de anticuerpo IgG de suero canino que reaccionaba con el polip�ptido de una manera similar a la usada anteriormente. Como resultado del examen usando suero de un perro sano, casi no se detect� absorbancia a 450 nm, de manera similar al caso anterior.

Mientras tanto, el paciente canino 11 (Shih tzu) experiment� cirugía de extirpaci�n para adenocarcinoma de mama el 21 de junio de 2007. Como resultado del diagnóstico patológico usando tejidos escindidos, el paciente canino 11 se diagnosticó con adenocarcinoma de mama de malignidad moderada, donde los tejidos fuertemente at�picos e invasivos de glándula mamarias experimentaron crecimiento adenoide-tubular-papilar para formar masas grandes y pequeñas, además de la presencia de hiperplasia algo difusa de tejidos conectivos fibrilares. Se descubrió que la absorbancia a 450 nm para el paciente canino 11 era de 0,26.

(3) Diagnóstico de cáncer felino

A continuación, se diagnosticaron gatos que albergaban cáncer y gatos sanos. Con el uso del polip�ptido de CAPRIN-1 canina (usado anteriormente) y un anticuerpo anti-IgG felina, se midió el título de anticuerpo IgG en suero felino que reaccionaba específicamente con el polip�ptido, en una manera similar a la anterior. Como anticuerpo secundario, se diluyó un anticuerpo anti-IgG felina modificado con HRP (FRACCIÓN DE IgG DE CABRA CONJUGADA CON PEROXIDADA CONTRA IgG DE GATO (MOLÉCULA COMPLETA): CAPPEL RESERCH REAGENTS) 8000 veces con una solución de bloqueo y después se us�.

El paciente felino 1 (mestizo) experiment� cirugía de extirpaci�n de tumor para adenocarcinoma de mama el 8 de mayo de 2007. Se descubrió que la absorbancia a 450 nm para el paciente felino 1 era de 0,21. También, en el caso del paciente felino 2 (himalayo) que experiment� cirugía de extirpaci�n para carcinoma ductal el 17 de octubre de 2006, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,18. Por otro lado, no se detect� absorbancia en el caso de gatos sanos.

Adem�s, con el uso del polip�ptido (SEC ID N� 2) de CAPRIN-1 humana preparado en el Ejemplo 2, se midió el título de anticuerpo IgG en suero felino que reaccionaba con el polip�ptido en una manera similar a la anterior. Como resultado, en el caso de gatos sanos, casi no se detect� absorbancia a 450 nm cuando el polip�ptido se había inmovilizado. Mientras tanto, el paciente felino 3 (americano de pelo corto) experiment� cirugía de extirpaci�n para adenocarcinoma de mama el 15 de abril de 2008. Como resultado del diagnóstico patológico usando tejidos escindidos, el paciente felino 3 se diagnosticó con adenocarcinoma de mama altamente maligno asociado con tejidos muertos grandes y pequeños, donde los tejidos fuertemente at�picos e invasivos de glándula mamaria experimentaron crecimiento de tipo lámina en masas grandes y pequeñas. Además en el caso del paciente felino 3, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era de 0,12.

Por lo tanto, se demostr� que el diagnóstico del cáncer es también posible para gatos mediante esta técnica, de manera similar a los perros, ya que se detectaron valores para muestras de gatos con cáncer, pero no se detect� ninguno para muestras de gatos sanos.

(4) Diagnóstico de cáncer humano

Con el uso del polip�ptido (SEC ID N� 2) de CAPRIN-1 humana preparado en el Ejemplo 2 y un anticuerpo anti-IgG humana, se midió el título de un anticuerpo IgG en suero humano sano que reaccionaba específicamente con el polip�ptido. La inmovilización del polip�ptido preparado se realizó añadiendo una solución de proteína recombinante diluida a 100 !g/ml con solución salina tamponada con fosfato a placas de inmovilización amino de 96 pocillos (Nunc) a 100 !l/pocillo y después dejando las placas reposar durante una noche a 4 �C. El bloqueo se realizó del siguiente modo. Se disolvieron cuatro gramos de polvo Block Ace (DS PHARMA BIOMEDICAL Co., Ltd.) en 100 ml de agua purificada y después la solución se diluyó 4 veces con agua purificada. Después la solución (a partir de ahora en este documento, solución de bloqueo) se a�adi� a 100 !l/pocillo y después se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Se a�adi� suero diluido 1000 veces con la solución de bloqueo a 100 !l/pocillo y después se agit� a temperatura ambiente durante 3 horas para la reacción. Después de lavar 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (a partir de ahora en este documento, PBS-T) que contenía Tween20 al 0,05 % (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), se a�adi� un anticuerpo anti-IgG humana modificado con HRP (conjugado HRPanticuerpo de cabra anti-IgG (H+L) humana: Zymed Laboratories) diluido 10000 veces con la solución de bloqueo a 100 !l/pocillo y después se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora para la reacción. Después de lavar 3 veces con PBS-T, se a�adi� sustrato HRP TMB (1-Step Turbo TMB (tetrametilbencidina), PIERCE) a 100 !l/pocillo y después se realizó un reacción de enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, se a�adi� una solución de ácido sulfúrico 0,5 M (Sigma Aldrich Japan) a 100 !l/pocillo para detener la reacción y después se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplaca. Se inmoviliz� un ant�geno de ovoalb�mina ajustado a 50 !g/ml con solución salina tamponada con fosfato y después se us� como control positivo. Como resultado, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era tan elevada como de 0,45 de promedio sobre los resultados para 7 sujetos sanos en el caso del ant�geno de ovoalb�mina, pero no se detect� absorbancia (0) en el caso del polip�ptido anterior.

De una manera similar a la anterior, 17 muestras de suero (adquiridas de ProMedDx) de pacientes con cáncer maligno de mama se sometieron adicionalmente a medición del título de anticuerpo IgG en suero que reaccionaba específicamente con la proteína antig�nica de cáncer obtenida de seres humanos (la secuencia de amino�cidos de la SEC ID N� 3). Como resultado, se descubrió que la absorbancia a 450 nm era tan elevada como de 0,48 en el caso del polip�ptido anterior, de promedio sobre los resultados para 17 pacientes con cáncer de mama.

Adem�s, con el uso del polip�ptido (SEC ID N� 8) de CAPRIN-1 canina preparado en el Ejemplo 2 y un anti-IgG humana anticuerpo, se midió el título de anticuerpo IgG humano en suero que reaccionaba específicamente con el polip�ptido de una manera similar a la anterior. Como resultado, mientras el promedio de los resultados para 7 sujetos sanos fue de 0,04, el promedio de los resultados para 17 pacientes con cáncer de mama fue tan elevado como de 0,55.

Bas�ndose en los resultados anteriores, se demostr� que el cáncer en seres humanos puede detectarse también mediante esta técnica.

Ejemplo 5: Diagnóstico de cáncer a través de la medición de polip�ptido antig�nico

Con el uso del anticuerpo policlonal contra el p�ptido derivado de CAPRIN-1 (SEC ID N� 43) obtenido en el Ejemplo 3 (1) y cada anticuerpo monoclonal contra la proteína CAPRIN-1 obtenida en el Ejemplo 3 (2) en combinación, se detect� el propio polip�ptido antig�nico contenido en muestras (suero derivado de organismo vivo que alberga cáncer) de reacción positiva tras el diagnóstico de cáncer usando el polip�ptido de CAPRIN-1 en el Ejemplo 4 (1)-(3) por ELISA tipo s�ndwich. El anticuerpo policlonal se us� como anticuerpo primario y cada anticuerpo monoclonal se us� como anticuerpo secundario. Se midió el nivel s�rico de proteína de la proteína que reaccionaba específicamente con cada uno de los anticuerpos anteriores.

El anticuerpo primario se inmoviliz� añadiendo el anticuerpo policlonal diluido a una concentración de 5 !g/ml con solución salina tamponada con fosfato a placas de inmovilización amino de 96 pocillos (Nunc) a 100 !l/pocillo y después agitando las placas a temperatura ambiente durante 2 horas. El bloqueo se realizó añadiendo una solución 50 mM de tampón bicarbonato sádico (pH 8,4) (a partir de ahora en este documento, solución de bloqueo) que contenía BSA al 0,5 % (albúmina s�rica bovina, Sigma Aldrich Japan) a 100 !l/pocillo y después agitando a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, se a�adi� un suero derivado de organismo que albergaba cáncer diluido usando la solución de bloqueo a 100 !l/pocillo y después los resultantes se agitaron a temperatura ambiente durante 3 horas para la reacción. La velocidad de dilución en ese momento se ajust� con serie de dilución de factor 10 (factor 10 - 1000). Después de lavar 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (a partir de ahora en este documento, PBS-T) que contenía Tween20 al 0,05 % (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), se a�adi� cada anticuerpo monoclonal como anticuerpo secundario diluido a una concentración de 1 !g/ml con la solución de bloqueo a 100 !l/pocillo y después los resultantes se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora para la reacción. Después de lavar 3 veces con PBS-T, se a�adi� un anticuerpo anti-IgG (H+L) de ratón marcado con HRP (Invitrogen Corporation) como anticuerpo terciario diluido 5000 veces con la solución de bloqueo a 100 !l por pocillo y después se dej� reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se a�adi� una solución de sustrato TMB (Thermo) a 100 !l por pocillo y después se dej� reposar durante 15 - 30 minutos para la reacción de color. Después del desarrollo del color, se a�adi� ácido sulfúrico 1 N a 100 !l por pocillo para detener la reacción y después se midió la absorbancia a 450 nm usando un espectrómetro de absorción.

Como resultado, cuando se usaron los anticuerpos monoclonales n� 1-n� 10 que reaccionaban con las superficies de células cancerosas como anticuerpos secundarios, se detectaron valores de absorbancia (niveles de polip�ptido) de 0,3 o mayores para todas las muestras de perros que albergaban cáncer y gatos que albergaban cáncer con cáncer de mama, melanoma maligno y similares, pero no se detectaba absorbancia para perros sanos y gatos sanos. Por otro lado, cuando se usaron anticuerpos monoclonales que reaccionaban con la propia proteína CAPRIN-1 pero que no reaccionaban con las superficies de células cancerosas como anticuerpos secundarios, se detectaron niveles de polip�ptido para todas las muestras, pero los valores de absorbancia fueron todos de 0,05 o menores, que eran inferiores que los resultados para combinaciones de anticuerpos que reaccionaban con las superficies de células cancerosas. Por lo tanto, el cáncer se puede diagnosticar también mediante esta técnica que implica la detección de polip�ptidos antig�nicos usando anticuerpos contra CAPRIN-1.

Aplicabilidad industrial

La presente invención es industrialmente útil para el diagnóstico o detección del cáncer. TEXTO LIBRE DE LISTA DE SECUENCIAS SEC ID N� 31 - 42: cebadores LISTADO DE SECUENCIAS

<110> TORAY INDUSTRIES, INC.

<120> Polip�ptidos y Métodos para Diagnosticar C�nceres

<130> PH-4052-PCT

<150> JP 2008-202320

<151>

<160> 63

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 5562

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (190)..(2319)

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 709

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 3553 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (190)..(2274)

<223>

<400> 3

<210> 4

<211> 694

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 1605 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (46)..(1392)

<223>

<400> 5

<210> 6

<211> 448

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 6

<210> 7

<211> 4154 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (2154)

<223>

<400> 7

<210> 8

<211> 717

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 8

<210> 9

<211> 4939 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (2109)

<223>

<400> 9

<210> 10

<211> 702

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 10

<210> 11

<211> 3306 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2040)

<223>

<400> 11

<210> 12

<211> 679

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 12

<210> 13

<211> 2281 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2154)

<223>

<400> 13

<210> 14

<211> 717

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 14

<210> 15

<211> 3386 5 <212> ADN

<213> Bos taurus

<220>

<221> CDS 10 <222> (82)..(2208)

<223>

<400> 15

<210> 16

<211> 708

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 16

<210> 17

<211> 3150

<212> ADN

<213> Equus caballus

5 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1917)

<223> 10

<400> 17

<210> 18

<211> 638

<212> PRT

<213> Equus caballus

<400> 18

<210> 19

<211> 6181

<212> ADN

<213> Mus musculus 5

<220>

<221> CDS

<222> (179) .. (2302)

<223> 10

<400> 19

<210> 20

<211> 707

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

<210> 21

<211> 6141 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS 10 <222> (139)..(2262)

<223>

<400> 21

<210> 22

<211> 707

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 22

<210> 23

<211> 6114 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS 10 <222> (139) .. (2235)

<223>

<400> 23

<210> 24

<211> 698

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

<210> 25

<211> 3548 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS 10 <222> (179)..(2257)

<223>

<400> 25

<210> 26

<211> 692

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 26

<210> 27

<211> 3508

<212> ADN

<213> Mus musculus

5 <220>

<221> CDS

<222> (139)..(2217)

<223>

10 <400> 27

<210> 28

<211> 692

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

<210> 29

<211> 2109 5 <212> ADN

<213> Gallus gallus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2109)

<223>

<400> 29

<210> 30

<211> 702

<212> PRT

<213> Gallus gallus

<400> 30

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador T3

<400> 31 aattaaccct cactaaaggg 20

<210> 32 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador T7

<400> 32 taatacgact cactatagg

19

<210> 33 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 33 aaggtttgaa tggagtgc

18

<210> 34 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 34 tgctcctttt caccactg

18

<210> 35 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador de GAPDH

<400> 35 gggctgcttt taactctg

18

<210> 36 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador de GAPDH

<400> 36 ccaggaaatg agcttgac

18

<210> 37 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 37 catatggcat taagtcaaga tattcag

<210> 38

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 38 ggtacctttg cggcatccct ctg

<210> 39

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 39 catatgccgt cggccaccag c

<210> 40

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 40 ggtaccattc acttgctgag tg

<210> 41

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 41 gagctcatgc cctcggccac cag

<210> 42

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 42 ctcgagttaa ttcacttgct gag

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

23 <210> 44

<211> 148

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 44

<210> 45

<211> 132

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 45 <210> 46

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 46 <210> 47

<211> 94

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 47

<210> 48

<211> 105

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 48 <210> 49

<211> 100

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 49 <210> 50

<211> 90

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 50

10 <210> 51

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus musculus

15 <400> 51

<210> 52

<211> 100

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 52 <210> 53

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 53 <210> 54

<211> 104

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 54

10 <210> 55

<211> 109

<212> PRT

<213> Mus musculus

15 <400> 55

<210> 56

<211> 94

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 56

<210> 57

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 57

<210> 58

<211> 102

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 58 <210> 59

<211> 101

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 59

<210> 60

<211> 99 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 60

<210> 61

<211> 58

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62 <210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para detectar un cáncer, que comprende medir la expresión de un polip�ptido que tiene una reactividad de unión mediante un reacción ant�geno-anticuerpo a un anticuerpo contra una proteína CAPRIN-1 que tiene una cualquiera de las secuencias de amino�cidos mostradas en las SEC ID N� 2 - 30 con numeración par en la lista de secuencias, en una muestra de suero, plasma sanguíneo, fluido ascético o efusión pleural separada de un organismo vivo, en el que la expresión del polip�ptido se mide por inmunoensayo de un anticuerpo que puede estar contenido en la muestra de suero, plasma sanguíneo, fluido ascético o efusión pleural y se induce in vivo contra el polip�ptido a medir.

2. 2.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polip�ptido a medir es una proteína CAPRIN-1 que tiene una cualquiera de las secuencias de amino�cidos mostradas en las SEC ID N� 2 - 30 con numeración par o un polip�ptido que tiene un 85 % o más de identidad de secuencia con la proteína CAPRIN-1.

3. 3.

   El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que el organismo vivo es un ser humano, un perro o un gato.

4. 4.

   El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el organismo vivo es un perro y el polip�ptido a medir tiene una secuencia de amino�cidos mostrada en una cualquiera de las SEC ID N� 2 - 30 con numeración par.

5. 5.

   El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el organismo vivo es un perro y el polip�ptido a medir tiene la secuencia de amino�cidos mostrada en las SEC ID N� 6, 8, 10, 12 o 14.

6. 6.

   El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el organismo vivo es un ser humano y el polip�ptido a medir tiene la secuencia de amino�cidos mostrada en las SEC ID N� 2 o 4.

7. 7.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el cáncer es al menos un tipo de cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en tumor cerebral, carcinoma de células escamosas de la cabeza, el cuello, el pulmón, el útero o el esófago, melanoma, adenocarcinoma del pulmón o del útero, cáncer renal, tumor mixto maligno, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células basales, tumor gingival de tipo acantoma, tumor de la cavidad oral, adenocarcinoma perianal, tumor del saco anal, adenocarcinoma apocrino del saco anal, carcinoma de células de Sertoli, cáncer del vestíbulo vaginal, adenocarcinoma sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, carcinoma de glándulas sudor�paras, adenocarcinoma intranasal, adenocarcinoma nasal, cáncer de tiroides, cáncer del intestino grueso, adenocarcinoma bronquial, adenocarcinoma, carcinoma ductal, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama de tipo compuesto, tumor mixto mamario maligno, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de tejido blando, sarcoma histioc�tico, mixosarcoma, sarcoma indiferenciado, cáncer pulmonar, mastocitoma, leiomioma cut�neo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, leucemia linfoc�tica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células pequeñas a células medianas, tumor adrenomedular, tumor de células de la granulosa y feocromocitoma.

8. 8.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende adicionalmente detectar la malignidad de un cáncer basándose en el hecho de que la malignidad del cáncer es elevada cuando el nivel de expresión del polip�ptido es mayor que el de un control.

9. 9.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente detectar la progresión del cáncer basándose en el indicador de que la extensión del cáncer es avanzada cuando el nivel de expresión del polip�ptido es mayor que el de un control.