ES2718226T3

ES2718226T3 - Accionador telescópico lineal

Info

Publication number: ES2718226T3
Application number: ES16185031T
Authority: ES
Inventors: Gary Ataman
Original assignee: Safran Landing Systems Canada Inc
Current assignee: Safran Landing Systems Canada Inc
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2016-08-19
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2036-08-19
Also published as: US9976542B2; FR3040455B1; FR3040455A1; EP3135951A1; US20170058872A1; EP3135951B1

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-MCAM y métodos de uso asociados

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de EE. UU. Número 61/698.916, presentada el 10 de septiembre de 2012, de la Solicitud Provisional de EE. UU. Número 61/797.179, presentada el 30 de noviembre de 2012, y de la Solicitud Provisional de EE. UU. Número 61/797.356, presentada el 15 de diciembre de 2012.

Campo de la invención

La presente invención se dirige a anticuerpos que se unen a la molécula de adhesión a células de melanoma (MCAM) que son capaces de bloquear la interacción entre MCAM y su ligando, la cadena alfa-4 de laminina. La presente invención también se dirige a métodos de uso de los nuevos anticuerpos anti-MCAM descritos en la presente memoria.

Referencia a un "Listado de Secuencias",

Una tabla o un listado de programas informáticos

El Listado de Secuencias escrito en el archivo 436599SEQLIST.txt, se creó el 16 de septiembre de 2013 para "ANTICUERPOS ANTI-MCAM Y MÉTODOS DE USO ASOCIADOS" y es de 144.190 bytes.

Antecedentes

Un nuevo subconjunto de células T CD4+, denominadas células TH17 (células T auxiliares 17), se ha implicado en la patogénesis de varias enfermedades autoinmunitarias, en particular las afecciones neuroinflamatorias que involucran la infiltración en el SNC de células T, como la esclerosis múltiple y el modelo animal, encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). Véase, por ejemplo, Cua et al., Nature 421: 744-748 (2003); véase también Ivonov et al., Cell 126: 1121-1133 (2006). Gran parte de la atención sobre la patogenicidad mejorada de las células TH17 se ha centrado en su capacidad para segregar varias citoquinas seleccionadas, incluidas la IL-17 y la IL-22. Sin embargo, el papel de estas citoquinas de TH17 en sí mismo ha sido cuestionado, ya que una inactivación condicional de IL-17 es insuficiente para afectar a la progresión de la EAE. Véase, por ejemplo, Haak et al., J. Clin. Invest. 119: 61-69 (2009); véase también Kreymborg et al., J. Immunol. 179: 8098-8104 (2007). Aunque la IL-17 afecta a aspectos tan vitales de la EAE como la permeabilidad de las células endoteliales, las células TH17 parecen hacer más que producir únicamente una citoquina. Los determinantes moleculares de la función patógena de las células TH17 siguen siendo esquivos.

La patogenicidad de las células TH17 puede explicarse parcialmente por su patrón de migración único como lo demuestra su expresión de receptores de quimioquinas. Véase, por ejemplo, Kim, Inflamm. Allergy Drug Targets 8: 221-228 (2009). Se ha establecido que las células productoras de IL-17 están enriquecidas dentro de la población CCR6+ de células T CD4+, lo que probablemente confiere un patrón de migración único a lo largo de la vasculatura. Véase, por ejemplo, Acosta-Rodriguez et al., Nat. Immunol. 8:639-646 (2007). De hecho, la expresión de CCR6 en las células T es necesaria para la migración de las células T al SNC y la progresión de la EAE. Reboldi et al., Nat. Immunol. 10: 514-523 (2009). Surgió una hipótesis de dos olas de células T, la primera es una pequeña población de células TH17 que expresan CCR6 que acumula y recluta una segunda ola más amplia de células T con un repertorio de receptores de quimioquinas más diverso. Se ha sugerido que el sitio anatómico de esta infiltración es el plexo coroideo debido a la expresión constitutiva de CCL20, un ligando conocido de CCR6. Ransohoffet al., Nat. Rev. Immunol. 3: 569-581 (2003). Se ha hecho la implicación de que la verdadera función patógena de las células TH17 reside en su reclutamiento e infiltración de tejido específicos. El documento WO 2012/170071, Yun et al., Anticancer Research, 27(6B): 4219-4224, (2007), Flanagan et al., PLOS ONE, 7(7): e40443, (2012), Mcgary et al., Clinical Cancer Research, 9: 6560-6566, (2003), el documento WO 03/05783, Zhang et al. Hybridoma, 27(5): 345 352, (2008) y el documento WO 03/057006 describen anticuerpos anti-MCAM.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad en la técnica de identificar moléculas que estén involucradas en la infiltración de células TH17 en el SNC y contribuyan a su patogenicidad. Estas moléculas pueden ser dianas para diseñar agentes terapéuticos para afecciones neuroinflamatorias, como la esclerosis múltiple (EM) y la enfermedad de Parkinson, así como otras afecciones inflamatorias mediadas por TH17 no asociadas con el sistema nervioso central. También existe la necesidad de identificar nuevos anticuerpos que puedan unirse y sean capaces de reducir, interferir o, por otra parte, bloquear la interacción entre MCAM expresada en la superficie de t H17 y su ligando identificado.

Compendio de la invención

Las células TH17 desempeñan un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades autoinmunitarias, particularmente aquellas que presentan afecciones neuroinflamatorias que involucran la infiltración de células T en el SNC. Se ha descubierto recientemente que (1) la MCAM está enriquecida selectivamente en células TH17; y (2) la MCAM interactúa con una cadena a4 de laminina, tal como, por ejemplo, la cadena a4 de la laminina 411, presente en la membrana basal endotelial. Un antagonista de MCAM, p.ej., un anticuerpo monoclonal, capaz de inhibir la unión de MCAM a una molécula que contiene una cadena a4 de laminina, tal como, por ejemplo, una molécula de laminina 411, puede inhibir la migración de células TH17 al SNC, y por lo tanto puede usarse como agente terapéutico para prevenir o tratar enfermedades que presentan afecciones neuroinflamatorias mediadas por TH17. Los antagonistas de MCAM, como un anticuerpo monoclonal de MCAM o un fragmento de unión a antígeno del mismo, también pueden ser útiles para prevenir o tratar una enfermedad mediada por TH17, que incluye, por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria, por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis y artritis reumatoide.

La presente invención se dirige a nuevos anticuerpos que son capaces de unirse a la proteína MCAM en la superficie de las células y, a su vez, que son capaces de interferir con la interacción de la MCAM con su ligando, una proteína que comprende una cadena a-4 de laminina. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo que inhibe de manera competitiva la unión de un anticuerpo anti-MCAM a su epítopo antigénico respectivo. La presente invención proporciona un anticuerpo anti-MCAM aislado, una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo, un artículo de fabricación que comprende dichos usos farmacéuticos y médicos del anticuerpo, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La descripción describe vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria y células hospedadoras que comprenden dichos vectores, en donde dichas células hospedadoras pueden ser células CHO, células de E. coli o células de levadura. Se describe adicionalmente, un proceso para producir cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria y comprende las etapas de cultivar células hospedadoras en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo deseado, y recuperar el anticuerpo deseado del cultivo celular.

En una realización, la presente invención se dirige a un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres regiones hipervariables de cadena ligera (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3) y tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3), y en donde:

La HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:73, la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74, la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:75, la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:78, la HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79, y la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:80. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-MCAM puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. En otra realización, el anticuerpo anti-MCAM puede ser un anticuerpo IgG1 que puede producirse opcionalmente en bacterias o células CHO.

En otra realización más, la presente invención se dirige a un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en donde:

(e) la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO:70, 71 o 72 y la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:77.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-MCAM puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. En otra realización, el anticuerpo anti-MCAM puede ser un anticuerpo IgG1 que puede producirse opcionalmente en bacterias o células CHO.

La presente descripción se dirige a un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une sustancialmente al mismo epítopo que, o compite por unirse a, cualquiera de los anticuerpos anti-MCAM descritos en la presente memoria.

La presente descripción se dirige a un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que bloquea la interacción entre una proteína MCAM que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22 y una proteína que comprende una cadena a-4 de laminina. La presente descripción se dirige a un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que bloquea la interacción entre una proteína MCAM que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:22 y 23 y una proteína que comprende una cadena a-4 de laminina. La presente descripción se dirige a un anticuerpo anti-MCAM aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que no bloquea la interacción entre una proteína MCAM que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22 y una proteína que comprende una cadena a-4 de laminina. La presente descripción se dirige a un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que bloquea la interacción entre una proteína MCAM que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:22, 23 y 24 y una proteína que comprende una cadena a-4 de laminina. La presente descripción se dirige a anticuerpos anti-MCAM aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a epítopos antigénicos definidos por los dominios 1 y 2, o dominio 3 de la proteína MCAM humana. El anticuerpo anti-MCAM o fragmento del mismo no se une a una proteína que consiste en los aminoácidos 19-129 de la proteína MCAM humana.

Otras realizaciones adicionales de la presente invención se dirigen a composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria, o fragmento de unión a antígeno de los mismos, y artículos de fabricación que comprenden los mismos.

La presente descripción se dirige al uso de un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio caracterizado por infiltración de células que expresan MCAM en un sitio de inflamación en el cuerpo. El trastorno inflamatorio puede ser un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) caracterizado por la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC.

La invención también proporciona un anticuerpo anti-MCAM, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple o la enfermedad de Parkinson. La invención también proporciona un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso en el tratamiento de la dermatitis de contacto alérgica. La invención también proporciona un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso en el tratamiento de psoriasis. La invención también proporciona un anticuerpo anti-MCAM, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso en el tratamiento de artritis psoriásica. La descripción también describe el uso de un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, por ejemplo, un tumor sólido, tal como un melanoma. La descripción también describe el uso de un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la sarcoidosis.

La presente descripción se dirige a un método para el tratamiento de un trastorno inflamatorio caracterizado por infiltración de células que expresan MCAM en un sitio de inflamación, comprendiendo el método administrar a un sujeto mamífero que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-MCAM o fragmento de unión a antígeno del mismo que inhibe la unión de MCAM a una proteína que comprende una cadena a-4 de laminina. El sujeto mamífero puede ser un ser humano y las células que expresan MCAM pueden ser células TH17.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-MCAM h2120 aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres regiones hipervariables de cadena ligera (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3) y tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 ), en donde la HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:73, la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74, la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:75, la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:141, la HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79 y la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:80. En otra realización, el anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región marco 2 (FR2) de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:134 y/o una región marco 3 (FR3) de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:135. En otra realización, el anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende además una región marco 1 (FR1) de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:147; una región marco 2 (FR2) de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:148; una región marco 3 (FR3) de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:149; o cualquier combinación de las mismas.

Breve descripción de los dibujos

FIGS. 1A-C. Las FIGS. 1A y 1B representan la presencia de MCAM en células CD4+ humanas productoras de IL-17. La FIG. 1A representa el análisis de micromatrices que muestra que MCAM es un gen regulado al alza en células TH17 tanto circulantes como activadas. La FIG. 1B representa los resultados de la clasificación de células que muestran que MCAM existe casi exclusivamente en una pequeña población de células T de memoria (células T CD45RO+). La FIG. 1C representa los resultados de la clasificación celular que muestran que MCAM está enriquecida en células T CD4+ humanas productoras de IL-17.

Las FIGS. 2A, B representan los marcadores de superficie de las células T que expresan MCAM. La FIG. 2A representa células T que expresan MCAM como células T de memoria efectoras (CCR6+ si bien CCR7-). La FIG.

2B representa el patrón de expresión de integrina de células T que expresan MCAM. La mayoría de las células T que expresan MCAM son positivas para la integrina a4, pero en su mayoría son negativas para la integrina p7 y positivas para p1.

Las FIGS. 3A-F representan los efectos de diversas citoquinas en las células T de memoria CD4+/CD45RO+. La FIG. 3A representa los efectos de diversas citoquinas sobre la producción de IL-17 en células T MCAM positivas. La FIG. 3B representa el porcentaje de células que expresan MCAM después de la estimulación por varias citoquinas. Las FIGS. 3C, 3D y 3E representan los niveles de IL-17 (FIG. 3C), IL-22 (FIG. 3D) y CCL20 (FIG. 3E) en células tanto MCAM positivas como MCAM negativas después de estimulaciones con diversas citoquinas. La FIG. 3F representa los niveles intracelulares de FOXP3 en células tanto MCAM positivas como MCAM negativas después de estimulaciones con diversas citoquinas.

Las FIGS. 4A-H representan la identificación de la laminina 411 como el ligando de MCAM. La FIG. 4A representa la colocalización del ligando de MCAM y la laminina en el plexo coroideo de ratones sanos. La FIG.

4B representa la ausencia de tinción de MCAM en el plexo coroideo de ratones sanos (se usó 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) como colorante de contraste). La FIG. 4C representa la presencia de MCAM en células endoteliales vasculares dentro del cerebro de ratones sanos (se usó DAPI como colorante de contraste). La FIG.

4D representa el patrón de expresión del ligando de MCAM tiñendo secciones de médula espinal de ratones sanos con proteína MCAM-Fc. La FIG. 4E representa la colocalización del ligando de MCAM y la laminina en la médula espinal de ratones sanos. La FIG. 4F representa la localización en la matriz extracelular (MEC) del ligando de MCAM. La tinción con CD31 se usó para mostrar que la tinción de MCAM es externa a la capa de células endoteliales dentro de la vasculatura. La FIG. 4G representa la localización del ligando de MCAM dentro de las lesiones de EAE. Se ha demostrado que MCAM-Fc se colocaliza con laminina dentro de la membrana basal de células endoteliales, pero no dentro de la membrana basal parenquimatosa. La FIG. 4H representa la colocalización del ligando de MCAM y la laminina 411 (o cadena a-4 de laminina).

FIGS. 5A-C. La FIG 5A representa la unión específica de anticuerpos MCAM a MCAM humana y de ratón. La FIG 5B representa el bloqueo de la unión de MCAM-Fc a los tejidos por los anticuerpos MCAM. La FIG 5C representa la inhibición de la interacción entre la MCAM humana y su ligando laminina 411 por un anticuerpo monoclonal.

FIGS. 6A, B. La FIG. 6A representa la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal clon 17. La FIG 6A describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:2), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRL1 (SeQ ID NO:3), CDRL2 (SEQ ID NO:4) y CDRL3 (SEQ ID ⁿO:5). B. La FIG. 6A representa la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal clon 17. La FIG 6B describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:6) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:7), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRH1 (SEQ ID NO:8), CDRH2 (SEQ ID NO:9) y CDRH3 (SEQ ID NO:10).

FIGS. 7A, B. La FIG. 7A representa la ausencia de MCAM en células T de un ratón no tratado previamente. La FIG 7B representa los niveles de expresión de MCAM entre esplenocitos en presencia de diversas citoquinas. Los esplenocitos se obtuvieron de ratones SJL inmunizados con PLP y se reestimularon in vitro con PLP.

Las FIGS. 8A, B representan los efectos del bloqueo de MCAM sobre la progresión de la enfermedad en un modelo terapéutico de EAE. Después de que aparecieran los síntomas de EAE, los ratones inmunizados con PLP se trataron por vía intraperitoneal con (1) anticuerpo anti-MCAM (clon 15) a 10 mg/kg de peso corporal, (2) el control de isotipo (Bioxcell) a 10 mg/kg de peso corporal y (3) PBS todos los días a partir de entonces. La progresión de la enfermedad (Figura 8A) y los pesos corporales (Figura 8B) se controlaron cada 2-3 días. Los datos representan la media de 15 ratones ± sem (error estándar de la media).

FIGS. 9A, B. La FIG. 9A representa la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal clon 15. La FIG 9A divulga la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:12) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:13), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRL1 (SEQ ID NO:14), c Dr L2 (SEQ ID No :15) y CDRL3 (SEQ ID NO:16). La FIG. 9B representa la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal clon 15. La FIG 9B divulga la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:17) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:18), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRH1 (SEQ ID NO:19), CDRH2 (SEQ ID NO:20) y CDRH3 (SEQ ID NO:21).

Las FIGS. 10A, B representan los resultados de una prueba de unión de dominio para anticuerpos MCAM.

Las FIGS. 11A, B representan la secuencia de aminoácidos (A) (SEQ ID NO:11 - N.° de Acceso CAA48332) y la estructura (B) para MCAM humana. En la Fig. 11A, las posiciones de los restos de aminoácidos correspondientes a los cinco dominios de inmunoglobulina de la MCAM humana son las siguientes - 1: restos de aminoácidos 19 -129; 2: restos de aminoácidos 139 -242; 3: restos de aminoácidos 244 -321; 4: restos de aminoácidos 335 -424; y 5: restos de aminoácidos 430-510) (SEQ ID N:O 22-26), que también se representan esquemáticamente en la FIG. 11B.

Las FIG. 12A, B muestran las secuencias de aminoácidos de dos isoformas de cadena a4 de la laminina 411 humana. La FIG 12A muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente al Número de Acceso de GenBank NP001098676 (SEQ ID NO:27) y la FIG. 12B muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente al Número de Acceso de GenBank NP001098677 (SEQ ID NO:28).

La FIG. 13 representa la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal clon 1174.1.3. La FIG 13 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:29) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:30), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRL1 (SEQ iD NO:31), CDRL2 (SEQ ID NO:32) y CDRL3 (SEQ ID NO:33).

La FIG. 14 representa la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal clon 1174.1.3. La FIG 14 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:34) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:35), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRH1 (SEQ ID NO:36), c Dr H2 (SEQ ID No :37) y CDRH3 (SEQ ID NO:38).

La FIG. 15 representa la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal clon 1414.1.2. La FIG 15 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:39) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:40), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRL1 (SEQ iD NO:41), CDRL2 (SEQ ID NO:42) y CDRL3 (SEQ ID NO:43).

La FIG. 16 representa la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal clon 1414.1.2. La FIG 16 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:44) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:45), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRH1 (SEQ ID NO:46), c Dr H2 (SEQ ID No :47) y CDRH3 (SEQ ID NO:48).

La FIG. 17 representa la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal clon 1415.1.1. La FIG 17 divulga la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:49) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:50), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRL1 (SEQ iD NO:51), CDRL2 (SEQ ID NO:52) y CDRL3 (SEQ ID NO:53).

La FIG. 18 representa la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal clon 1415.1.1. La FIG 18 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:54) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:55), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRH1 (SEQ ID NO:56), c Dr H2 (SEQ ID No :57) y CDRH3 (SEQ ID NO:58).

La FIG. 19 representa la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal clon 1749.1.3. La FIG 19 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:59) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:60), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRL1 (SEQ iD NO:61), CDRL2 (SEQ ID NO:62) y CDRL3 (SEQ ID NO:63).

La FIG. 20 representa la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal clon 1749.1.3. La FIG 20 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:64) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:65), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRH1 (SEQ ID NO:66), c Dr H2 (SEQ ID No :67) y CDRH3 (SEQ ID NO:68).

Las FIGS. 21A, B representan diferentes versiones de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal clon 2120.4.19. La FIG 21A-B describe una versión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:69), la secuencia de aminoácidos de la versión 1 de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:70), la secuencia de aminoácidos de la versión 2 de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:71), y la secuencia de aminoácidos de la versión 3 de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:72). Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRL1 (SEQ ID NO:73), CDRL2 (SEQ ID NO:74) y CDRL3 (SEQ ID NO:75).

La FIG. 22 representa la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal clon 2120.4.19. La FIG 22 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:76) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:77), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRH1 (SEQ ID NO:78), c Dr H2 (SEQ ID No :79) y CDRH3 (SEQ ID NO:80).

Las FIGS. 23A, B representan diferentes versiones de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal clon 2107.4.10. La FIG. 23A-B describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la versión 1 de una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:81), la secuencia de ácido nucleico que codifica la versión 2 de una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:83), la secuencia de aminoácidos de la versión 1 de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:82), y la secuencia de aminoácidos de la versión 2 de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO:84). Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRL1 (SEQ ID NO:85), CDRL2 (SEQ ID NO:86) y CDRL3 (SEQ ID NO:87).

La FIG. 24 representa la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal clon 2107.4.10. La FIG 24 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:88) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:89), en orden de aparición. Las tres regiones hipervariables también se indican como CDRH1 (SEQ ID NO:90), c Dr H2 (SEQ ID No :91) y CDRH3 (SEQ ID NO:92).

La FIG 25A muestra la alineación de secuencias de las cadenas pesadas variables para los siguientes: anticuerpo anti-MCAM murino 1749.1.3 (1749.1.3_VH_pro; SEQ ID NO:93); anticuerpo anti-MCAM humanizado 1749 VH1 (h1749VH1; SEQ ID NO:94); anticuerpo anti-MCAM humanizado 1749 VH2 (h1749VH2; SEQ ID NO:95); y la secuencia variable humana IGHV3-7*02 de cadena pesada utilizada como donante de marco (U96282_VH; SEQ ID NO:96). Se utiliza la numeración de Kabat y se encierran en un recuadro las regiones hipervariables (HVR) injertadas del anticuerpo 1749.1.3 murino al marco de IGHV3-7*02 variable de cadena pesada variable. Los restos de aminoácidos en negrita en las secuencias de anticuerpos humanizados difieren de los restos correspondientes en la secuencia de anticuerpos murinos. La posición de los restos de aminoácidos canónicos y de la interfaz que pueden afectar el contacto de la CDR o la estructura de la CDR se indica con un asterisco.

La FIG 25B muestra la alineación de secuencias de las cadenas ligeras variables para los siguientes: anticuerpo anti-MCAM murino 1749.1.3 (1749.1.3_VL_pro; SEQ ID NO:97); anticuerpo anti-MCAM humanizado 1749 VL1 (h1749VL1 SEQ ID NO:98); anticuerpo anti-MCAM humanizado 1749 VL2 (h1749VL2 SEQ ID NO:99); y la secuencia variable humana X02990 IGKV4-1*01 de cadena ligera utilizada como donante de marco (X02990_VL SEQ ID NO:100). Se utiliza la numeración de Kabat y se encierran en un recuadro las regiones hipervariables (HVR) injertadas del anticuerpo 1749.1.3 murino al marco de X02990 IGKV4-1*01 variable de cadena ligera variable. Los restos de aminoácidos en negrita en las secuencias de anticuerpos humanizados difieren de los restos correspondientes en la secuencia de anticuerpos murinos. La posición de los restos de aminoácidos canónicos y de la interfaz que pueden afectar el contacto de la CDR o la estructura de la CDR se indica con un asterisco.

La FIG 26A muestra la alineación de secuencias de las cadenas pesadas variables para los siguientes: anticuerpo anti-MCAM murino 2107.4.10,18 (2107.4.10.18_VH_topo_pro; SEQ ID NO:101); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VH1 (h2107VH1; SEQ ID NO:102); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VH2 (h2107VH2; SEQ ID NO:103); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VH3 (h2107VH3; SEQ ID NO:104); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VH4 (h2107VH4; SEQ ID NO:105); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VH5 (h2107VH5; SEQ ID NO:106); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VH6 (h2107VH6; SEQ ID NO:107); y la secuencia variable humana AF062133 IGHV2-26*01 de cadena pesada utilizada como donante de marco (AF062133_VH; SEQ ID NO:108). Se utiliza la numeración de Kabat y se encierran en un recuadro las regiones hipervariables (HVR) injertadas del anticuerpo 2107.4.10.18 murino al marco de AF062133 IGHV2-26*01 variable de cadena pesada variable en ambas FIG.26A. Las mutaciones S30T, 137V, L48I y K71R combinadas con (i) mutaciones de los restos N/D encerrados en un recuadro entre CDR-H2 y CDR-H3 (D78N) restablecen la N-glicosilación murina; o una mutación en una secuencia NG en CDR-H1, por ejemplo, N32S (VH4); N32Q (VH5); o G33A (VH6)), proporciona un mutante por desamidación de N. Los restos de aminoácidos en negrita en las secuencias de anticuerpos humanizados difieren de los restos correspondientes en la secuencia de anticuerpos murinos. La posición de los restos de aminoácidos canónicos y de la interfaz que pueden afectar el contacto de la CDR o la estructura de la CDR se indica con un asterisco.

La FIG 26B muestra la alineación de secuencias de las cadenas ligeras variables para los siguientes: anticuerpo anti-MCAM murino 2107_L7-6 (2107_L7-6_pro; SEQ ID NO:109); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VL1 (h2107VL1; SEQ ID NO:110); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VL2 (h2107VL2; SEQ ID NO:111); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2107 VL3 (h2107VL3 SEQ ID NO:112); y la secuencia variable humana U86803 IGKV1-27*01 de cadena ligera utilizada como donante de marco (U86803_VL SEQ ID NO:113). Se utiliza la numeración de Kabat y se encierran en un recuadro las regiones hipervariables (HVR) injertadas del anticuerpo 2107_L7-6 murino al marco de U86803 IGKV1-27*01 variable de cadena ligera variable. Los restos de aminoácidos en negrita en las secuencias de anticuerpos humanizados difieren de los restos correspondientes en la secuencia de anticuerpos murinos. La posición de los restos de aminoácidos canónicos y de la interfaz que pueden afectar el contacto de la CDR o la estructura de la CDR se indica con un asterisco.

La FIG 27A muestra la alineación de secuencias de las cadenas pesadas variables para los siguientes: anticuerpo anti-MCAM murino 2120.4.19,6 (2120.4.19.6_VH_topo_pro; SEQ ID NO:114); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2120 VH1 (h2120VH1; SEQ ID NO:115); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2120 VH2 (h2120VH2; SEQ ID NO:116); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2120 VH3 (h2120VH3; SEQ ID NO:117); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2120 VH4 (h2120VH4; SEQ ID NO: 118); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2120 VH5 (h2120VH5; SEQ ID NO: 119); y la secuencia variable humana AF062133 IGHV2-26*01 de cadena pesada utilizada como donante de marco (AF062133_VH; SEQ ID NO: 108). Se utiliza la numeración de Kabat y se encierran en un recuadro las regiones hipervariables (HVR) injertadas del anticuerpo 2120.4.19,6 murino al marco de AF062133 IGHV2-26*01 variable de cadena pesada variable. Las mutaciones S30T, I37V, L48I y K71R combinadas con (i) mutaciones de los restos N/D encerrados en un recuadro entre CDR-H1, p.ej., N32S (VH3); N32Q (VH4); o G33A (VH5)), proporciona un mutante por desamidación de N. Los restos de aminoácidos en negrita en las secuencias de anticuerpos humanizados difieren de los restos correspondientes en la secuencia de anticuerpos murinos. La posición de los restos de aminoácidos canónicos y de la interfaz que pueden afectar el contacto de la CDR o la estructura de la CDR se indica con un asterisco. Los restos donde se dirigen las mutaciones debido a la presencia de sitios de N-desaminación o sitios de /V-glicosilación se muestran en el recuadro entre corchetes.

La FIG 27B muestra la alineación de secuencias de las cadenas ligeras variables para los siguientes: anticuerpo anti-MCAM murino 2120.4.19,6 (2120.4.19.6_VL_topo_pro; SEQ ID NO:120); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2120 VL1 (h2120VL1 SEQ ID NO:121); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2120 VL2 (h2120VL2 SEQ ID NO:122); anticuerpo anti-MCAM humanizado 2120 VL3 (h2120VL3; SEQ ID NO: 123); y la secuencia variable humana X84343 IGKV2-26*01 de cadena ligera utilizada como donante de marco (X84343_VL SEQ ID NO:124). Se utiliza la numeración de Kabat y se encierran en un recuadro las regiones hipervariables (HVR) injertadas del anticuerpo 2120.4.19,6 murino al marco de X84343 IGKV2-26*01 variable de cadena ligera variable. Los restos de aminoácidos en negrita en las secuencias de anticuerpos humanizados difieren de los restos correspondientes en la secuencia de anticuerpos murinos. La posición de los restos de aminoácidos canónicos y de la interfaz que pueden afectar el contacto de la CDR o la estructura de la CDR se indica con un asterisco. Las FIGS. 28A-C comparan el bloqueo de varios anticuerpos 1749, 2120 y 2107 de la unión de MCAM a la laminina 411.

Las FIGS. 29A, B muestran el % de inhibición para ciertos anticuerpos anti-MCAM humanizados en comparación con anticuerpos anti-MCAM quiméricos.

FIG. 30: El tratamiento con un anticuerpo anti-MCAM reduce la inflamación en el modelo de inflamación de la piel.

FIGS. 31A, B: Los anticuerpos anti-MCAM inhiben el crecimiento de melanoma en volumen (A) y peso (B) en un modelo de xenoinjerto.

Descripción detallada

1. Definiciones y abreviaturas

1,1. Definiciones

Un "individuo" o "sujeto" como se emplea en esta memoria puede ser cualquiera de los animales mamíferos (por ejemplo, animales domesticados), incluyendo ser humano, perro, gato, vaca, caballo, cabra, cerdo, oveja, mono, cobaya, rata y ratón. En una realización el individuo o sujeto puede ser un ser humano.

"MCAM" (molécula de adhesión a células de melanoma, también conocida como CD146 y MUC18) se refiere a una glicoproteína de la superficie celular que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas involucrada en la adhesión celular, y en la cohesión de la monocapa endotelial en las uniones intercelulares en el tejido vascular. También promueve la progresión tumoral de muchos cánceres, como los tumores sólidos, incluyendo melanoma y cáncer de próstata. Se sabe que interactúa de manera homotípica/homófila y también puede unirse a otros ligandos. La MCAM humana tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 (Figura 11A), que incluye cinco dominios de inmunoglobulina (1: restos de aminoácidos 19-129; 2: restos de aminoácidos 139-242; 3: restos de aminoácidos 244-321; 4: restos de aminoácidos 335-424; y 5: restos de aminoácidos 430-510) mostrados como SEQ ID NO: 22 26, que también se representan esquemáticamente en la FIG. 11B.

Una "cadena a4 de laminina " se refiere a una de las cadenas polipeptídicas encontradas en las moléculas de laminina, que se expresan en la lámina basal (de la membrana basal), una base de red de proteínas para la mayoría de las células y órganos. Se sabe que las lamininas se unen a las membranas celulares a través de las moléculas de la membrana plasmática y contribuyen a la unión celular. La cadena a4 de laminina forma generalmente un complejo con una cadena p de laminina, y una cadena y de laminina. La cadena a4 de laminina se encuentra en numerosas moléculas de laminina que incluyen, sin limitación, laminina 411 (laminina 8 o a4p1Y1); laminina 421 (laminina 9 o a4p2Y1) y laminina 423 (laminina 14 o a4p2Y3). Existen dos isoformas principales de la cadena a4 de laminina humana: los números de Acceso de GenBank NP001098676 y NP001098677 como se muestra en las Figuras. 12A-B (secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:27-28). "Laminina 411" se refiere a un complejo polipeptídico trimérico formado por tres subunidades o cadenas polipeptídicas: una cadena a4, una cadena p1 y una cadena y1.

El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquee, inhiba o neutralice parcial o totalmente una actividad biológica cualitativa de un polipéptido MCAM. Para los fines de la presente invención, la actividad biológica es preferiblemente la capacidad de inhibir la capacidad de MCAM (i) para unirse específicamente a su ligando: una cadena a4 de laminina, por ejemplo, la cadena a4 de la laminina 411; y/o (ii) para facilitar que una célula que expresa MCAM, por ejemplo, una célula TH17, se infiltre o migre al tejido de un sujeto. Los antagonistas de MCAM pueden identificarse, por ejemplo, en función de su capacidad para inhibir o bloquear la unión específica de MCAM a su ligando: una cadena a4 de laminina, por ejemplo, la cadena a4 de la laminina 411. Los antagonistas de MCAM incluyen específicamente, sin limitación, anticuerpos (por ejemplo, antagonistas o anticuerpos neutralizantes), incluyendo anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos y sus fragmentos funcionales, moléculas pequeñas, ribozimas, aptámeros, péptidos y ácidos nucleicos que codifican antagonistas de polipéptidos o anticuerpos antagonistas.

La expresión "anticuerpo antagonista de MCAM" se refiere a un anticuerpo que inhibe o neutraliza la actividad de MCAM. Dicho anticuerpo se une específicamente a una diana polipeptídica involucrada en la infiltración de una célula que expresa MCAM en el SNC, por ejemplo, MCAM o una cadena a4 de laminina (por ejemplo, la cadena a4 de la laminina 411).

Un anticuerpo "bloqueante", un anticuerpo "neutralizante" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce una actividad biológica del antígeno al que se une. Tales anticuerpos pueden inhibir sustancialmente o completamente la actividad biológica del antígeno.

Las expresiones "se une específicamente" o "específicamente se une" ,como se emplean en esta memoria, significan que un elemento de un par de unión específico no mostrará ninguna unión estadísticamente significativa a moléculas que no sean su compañero de unión específico. Un compañero de unión puede mostrar al menos 1000 veces la afinidad de unión (medida como una constante de asociación aparente) por su compañero del par de unión específico que un compañero de unión no específico. Por ejemplo, se dice que los anticuerpos que se unen a MCAM con una afinidad de unión de 107 mol/l o más, generalmente 108 mol/l o más, se unen específicamente a MCAM.

Las expresiones "actividad biológica" y "biológicamente activo" con respecto a MCAM se refieren a su capacidad para unirse específicamente a su ligando (una cadena a4 de laminina, por ejemplo, la cadena a4 de la laminina 411) y/o para facilitar la infiltración de células que expresan MCAM, por ejemplo, células TH17, en el SNC.

La expresión una "célula que expresa MCAM" se refiere a una célula del sistema inmunitario que expresa MCAM. Por ejemplo, la expresión de MCA^mse enriquece en linfocitos T de memoria, por ejemplo, células TH17.

La expresión "molécula de unión", como se emplea en esta memoria, se refiere a una molécula que se une específicamente a una diana. La expresión incluye específicamente, pero sin limitación, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, aquellos que comprenden una o más de las CDR descritas en la presente memoria), y moléculas pequeñas peptídicas y no peptídicas.

"Anticuerpos" (Ab) e "inmunoglobulinas" (Ig) son glucoproteínas que tienen algunas características estructurales comunes. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de este último tipo pueden producirse, por ejemplo, a niveles bajos en el el sistema linfático y a niveles altos en mielomas.

El término "anticuerpo" como se emplea en la presente memoria, puede abarcar anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada. La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a una porción de la molécula de inmunoglobulina de longitud completa que se une específicamente al antígeno. Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluye, de este modo, un dímero de cadena pesada, cadena ligera, cadena ligera-cadena de unión a antígeno, fragmento Fab, fragmento F (ab')2, fragmento Fv, Fv de cadena sencilla (scFv), diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se emplea en esta memoria, se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son sustancialmente similares y se unen al (a los) mismo(s) epítopo(s), excepto por las posibles variantes que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente están presentes en cantidades menores. Dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una región variable que se une a una diana, en donde el anticuerpo se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección del anticuerpo de una pluralidad de anticuerpos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, como un conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que el anticuerpo seleccionado puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar el anticuerpo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de la región variable alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas porque típicamente no están contaminadas con otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que la naturaleza del anticuerpo se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán según la presente invención se pueden producir mediante una variedad de técnicas, que incluyen el método del hibridoma (por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981), métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Immunol. Methods 284( 1-2):119-132 (2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a los humanos de animales que tienen parte o la totalidad de los loci o genes de inmunoglobulinas humanas que codifican secuencias de inmunoglobulinas humanas (véanse, por ejemplo, los documentos WO98/24893, WO/9634096, WO/9633735 y WO/91 10741, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immune, 7:33 (1993); las patentes de Estados Unidos N.° 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; el documento WO 97/17852, las patentes de Estados Unidos n.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016, y Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en esta memoria incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Patente de EE. UU. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.) y secuencias de región constante humanas, así como anticuerpos “humanizados”.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana están sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Un "anticuerpo intacto" en la presente memoria, es uno que comprende dos regiones de unión a antígeno, y una región Fc. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una región Fc funcional.

Un "anticuerpo (o cualquier otra molécula de unión) que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia (o cualquier otra molécula de unión) se refiere a un anticuerpo (o cualquier otra molécula de unión) que bloquea la unión del anticuerpo de referencia (o cualquier otra molécula de unión) a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia (o cualquier otra molécula de unión) bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables del mismo, que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee esas alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad preferentes tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por la redistribución de dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o restos de marcos se describe por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados k y A, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes “clases”. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse en “subclases” (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 5, £, y, y M, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo concreto a su antígeno concreto. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables (HVR), tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan “regiones marco” (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales incluyen, cada uno, cuatro regiones FR, que adoptan principalmente una configuración de lámina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas y próximas a las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan varias funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

“Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie Fv de cadena sencilla, un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera se puede unir covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

“Región hipervariable” o “HVR” se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable generalmente comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos restos de un “bucle hipervariable” (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).

La expresión "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" cuando se usan en la presente memoria, se refiere a partes de receptores inmunitarios que hacen contacto con un ligando específico y determinan su especificidad. Las CDR de los receptores inmunitarios son la parte más variable de la proteína receptora, dando a los receptores su diversidad, y se llevan en seis bucles en el extremo distal de los dominios variables del receptor, procediento tres bucles de cada uno de los dos dominios variables del receptor.

El término "epítopo" se usa para referirse a sitios de unión para anticuerpos (monoclonales o policlonales) en antígenos de proteínas. Típicamente, un epítopo se refiere a una unidad de estructura unida convencionalmente por un par VH-VL de inmunoglobulina. Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para un anticuerpo y, por lo tanto, representan la diana de especificidad de un anticuerpo. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales, y pueden ser tan pequeños como tres aminoácidos.

En la presente memoria, una "molécula pequeña" se define como que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 600, preferiblemente inferior a aproximadamente 1000 daltons. En general, una molécula pequeña es una molécula orgánica pequeña no peptídica.

“Aislado”, cuando se usa para describir los diversos polipéptidos, proteínas y anticuerpos descritos en la presente memoria, significa un polipéptido, proteína o anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir típicamente con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, proteína o anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido, proteína o anticuerpo se purificará (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna utilizando un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. Un polipéptido, proteína o anticuerpo aislado incluye el polipéptido, proteína o anticuerpo in situ con células recombinantes, ya que no estará presente al menos un componente del entorno natural asociado. Sin embargo, normalmente, el polipéptido, proteína o anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Los términos "afinidad", "afinidad de unión" y "K^d" se refieren a la constante de disociación de equilibrio (expresada en unidades de concentración) asociada con cada complejo molécula de unión a MCAM-diana, tal como entre un anticuerpo anti-MCAM y MCAM. La afinidad de unión está directamente relacionada con la proporción de la constante de disociación (generalmente indicada en unidades de tiempo inverso, por ejemplo, segundos^-1) con la constante de asociación (generalmente indicada en unidades de concentración por unidad de tiempo, por ejemplo, molar/segundo). La afinidad de unión puede determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo ELISA, un ensayo de exclusión cinética o resonancia de plasmón superficial. Se observa que ciertos epítopos pueden aparecer repetitivamente (multivalentes) en una superficie celular y que la constante de disociación (koff) para la unión de un anticuerpo a un epítopo repetitivo puede disminuir considerablemente con respecto a la constante de disociación para la reacción del mismo anticuerpo con el ligando correspondiente en forma univalente. La constante de disociación disminuida surge porque cuando un enlace anticuerpo-ligando se disocia, otros enlaces mantienen el anticuerpo bivalente (o multivalente) con el ligando multivalente, permitiendo que se forme nuevamente el enlace disociado. La constante de disociación de la reacción entre el Ab bivalente (o multivalente) y el ligando multivalente se ha denominado afinidad funcional para contrastarla con la afinidad intrínseca, que es la constante de asociación para un sitio individual representativo de anticuerpos.

Las expresiones "disociación", "tasa de disociación" y "k^off", como se emplean en esta memoria, pretenden referirse a la constante de disociación para una disociación de una molécula de unión, tal como un anticuerpo, de la molécula/diana de unión, p. ej., complejo anticuerpo/antígeno.

Las expresiones "asociación", "tasa de asociación" y "k^on", como se emplean en esta memoria, pretenden referirse a la constante de asociación de una molécula de unión con una diana, tal como un anticuerpo con un antígeno, para formar un complejo.

Las expresiones "concentración eficaz" y "EC⁵⁰", como se emplean en esta memoria, pretenden referirse a la concentración de una molécula de unión (e/g/anticuerpo) capaz de interactuar con cantidades suficientes de moléculas diana para producir un efecto en aproximadamente el 50% de las células tratadas.

Como se emplea en esta memoria, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica con el objetivo de alterar el transcurso natural del individuo que se esté tratando y puede efectuarse tanto para profilaxis/prevención como durante el transcurso de la patología. El término se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o disminuir (reducir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado de la enfermedad estabilizado (es decir, sin empeoramiento), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejoría o paliación del estado de la enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la afección o trastorno así como aquellos propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que se quiera prevenir la afección o trastorno.

La administración "crónica" se refiere a la administración del (de los) agente (s) en un modo continuo en lugar de en un modo agudo, para mantener el efecto deseado durante un período de tiempo prolongado.

La administración "intermitente" es un tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino más bien es de naturaleza cíclica.

Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y por períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico o terapéutico deseado. Una cantidad eficaz se refiere a la cantidad de compuesto activo o agente farmacéutico que provoca la respuesta biológica o médica en un tejido, sistema, animal, individuo o ser humano que un investigador, veterinario, médico u otro clínico está buscando, que incluye uno o más de lo siguiente: (A) prevenir la enfermedad; por ejemplo, prevenir una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad, afección o trastorno neuroinflamatorio en un individuo que puede estar predispuesto a la enfermedad, afección o trastorno pero que aún no experimenta o muestra la patología o los síntomas de la enfermedad,

(B) inhibir la enfermedad; por ejemplo, inhibir una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad, afección o trastorno neuroinflamatorio en un individuo que está experimentando o mostrando la patología o los síntomas de la enfermedad, afección o trastorno (es decir, detener el desarrollo adicional de la patología y/o los síntomas) y (C) mejorar la enfermedad; por ejemplo, mejorar una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad, afección o trastorno neuroinflamatorio en un individuo que está experimentando o mostrando la patología o los síntomas de la enfermedad, afección o trastorno (es decir, revertir la patología y/o los síntomas).

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente memoria tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la técnica. En algunos casos, los términos con significados comúnmente comprendidos se definen en la presente memoria con fines de claridad y/o para tener una referencia inmediata, y la inclusión de dichas definiciones en la presente memoria no se ha de considerar necesariamente como representativa de una diferencia sustancial frente a lo que se comprende generalmente en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en la presente memoria generalmente se entienden bien y se emplean comúnmente utilizando una metodología convencional por aquellos expertos en la técnica, como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Según corresponda, los procedimientos que involucran el uso de kits y reactivos disponibles comercialmente se llevan a cabo según los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario. Antes de que se describan los presentes métodos, kits y usos, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, construcciones y que los reactivos descritos como tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología empleada en la presente memoria tiene la finalidad de describir únicamente realizaciones particulares, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cabe señalar que como se emplea en esta memoria, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia al término "un anticuerpo" incluye una pluralidad de dichos anticuerpos y la referencia al término "la dosificación" incluye la referencia a una o más dosificaciones conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprender" o las variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implican la inclusión de un número entero o un número de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de enteros.

1.2. Abreviaturas

2. MCAM

MCAM (molécula de adhesión a células de melanoma) es una glicoproteína de la superficie celular originalmente identificada como un antígeno del melanoma, cuya expresión está asociada con la progresión tumoral y el desarrollo de potencial metastásico. MCAM es una glicoproteína de membrana integral de superficie celular de 113 kDa compuesta por un péptido señal, cinco dominios similares a inmunoglobulinas (1, 2, 3, 4 y 5; o V-V-C2-C2-C2), una región transmembrana y una cola citoplasmática corta. Véase, por ejemplo, Lehmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 9891-9895 (1989) y la FIG. 11B. MCAM es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y tiene una homología de secuencia significativa con varias moléculas de adhesión celular de la superfamilia de Ig, incluida la BEN (Pourquie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 5261-5265 (1992)), molécula de adhesión de células neuronales(N-CAM) (Owens et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 294-298 (1987)) glicoproteína asociada a mielina (MAG) (Lai et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 4337-4341 (1987)), eliminada en la proteína del cáncer colorrectal (DCC) (Hedrick et al., Genes Devel. 8: 1174-1183 (1994)), y gicerina (Taira et al., Neuron 12: 861-872 (1994)). La expresión de MCAM se ha detectado en un espectro relativamente limitado de tejidos humanos normales y en una variedad de neoplasias malignas. En tejidos adultos normales, MCAM se expresa en células endoteliales, células del músculo liso (Shih et al., Lab. Invest. 75: 377-388 (1996); Sers et al., Cáncer Res. 54: 5689-5694 (1994)), una subpoblación de linfocitos T activados (Pickl et al., J. Immunol. 158: 2107-2115 (1997)), y trofoblastos intermedios (Shih et al., supra). La MCAM también se expresa en una variedad de neoplasias malignas que incluyen neoplasias de músculo liso (leiomiomas y leiomiosarcomas), tumores de origen vascular (angiosarcomas y sarcomas de Kaposi), tumores trofoblásticos del sitio placentario, coriocarcinomas y melanomas (Shih et al., Res. De cáncer clínico. 2: 569-575 (1996); Holzmann et al., Int. J. Cancer 39: 466-471 (1987)). La expresión de MUC18 se correlaciona directamente con el potencial metastásico de las células de melanoma humano (Bar-Eli, Cancer Metastasis, 18: 377-385 (1999)).

Varios estudios han identificado la MCAM como un marcador de la progresión tumoral y la metástasis en melanomas. La expresión de MCAM está ausente en los melanocitos normales y en los nevos benignos, pero es prominente en muchos melanomas primarios y en la mayoría de las lesiones metastásicas (Lehmann et al., supra; Shih et al., supra). La expresión de MCAM se correlaciona bien con el grosor vertical del tumor y la formación de metástasis, y más del 80% de las lesiones metastásicas expresan MCAM (Lehmann et al., supra; Xie et al., Cancer Res. 57: 2295-2303 (1997); y Shih et al., supra). Se han generado moduladores de MCAM para tratar melanomas. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Número 7.067.131. Recientemente, se ha sugerido la modulación de MCAM para identificar y seleccionar las células T secretoras de citoquinas inflamatorias o sus precursores para tratar diversas afecciones inflamatorias. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Publicada de EE.UU. N° 2011/0014183.

3. Afecciones neuroinflamatorias, esclerosis múltiple y enfermedad de Parkinson

Una afección neuroinflamatoria se refiere a una afección asociada con la inflamación del sistema nervioso, como el sistema nervioso central (SNC), y que está asociada con el daño celular/tisular. Por lo general, se caracteriza, por ejemplo, por un aumento de la activación glial, aumento de los niveles de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias (por ejemplo, TNFa, INFy, IL-1 p), aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y/o aumento de células inmunitarias (por ejemplo, reclutamiento/invasión de leucocitos al SNC. Puede referirse, por ejemplo, a una neuroinflamación crónica, como una inflamación asociada con la activación crónica de células del sistema inmunitario (es decir, neuroinflamación autoinmunitaria asociada). Dicha neuroinflamación crónica se puede observar, por ejemplo, en la esclerosis múltiple (EM). Además, la enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa que presenta neuroinflamación, por ejemplo, microglía activada y células T infiltrantes.

La esclerosis múltiple, como enfermedad autoinmunitaria neurológica progresiva, es el resultado de una inflamación crónica patológica (Yednock et al., Nature 356: 63-66 (1992); Baron et al., J. Exp. Med. 177: 57-68 (1993)). La EM afecta a un estimado de 250.000 a 350.000 personas en los Estados Unidos. Se cree que la esclerosis múltiple es el resultado de una reacción autoinmunitaria específica en la que determinados leucocitos atacan e inician la destrucción de la mielina, la vaina aislante que cubre las fibras nerviosas. El inicio de la EM puede ser dramático o tan leve como para no causar que un paciente busque atención médica. Los síntomas más comunes incluyen debilidad en una o más extremidades, visión borrosa debido a neuritis óptica, trastornos sensoriales, diplopía y ataxia. La evolución de la enfermedad puede clasificarse en tres categorías generales: (1) EM recurrente, (2) EM crónica progresiva y (3) EM inactiva.

La EM recurrente se caracteriza generalmente por brotes recurrentes de disfunción neurológica. Los brotes de EM evolucionan generalmente de días a semanas y pueden ir seguidos de una recuperación completa o parcial, o ninguna recuperación. La recuperación de los brotes generalmente se produce dentro de semanas a varios meses desde el pico de los síntomas, aunque rara vez la recuperación puede continuar durante 2 o más años.

La EM crónica progresiva da como resultado un empeoramiento gradual progresivo sin períodos de estabilización o remisión. Esta forma se desarrolla en pacientes con antecedentes de EM recurrente, aunque en el 20% de los pacientes no se pueden recordar las recaídas. Las recaídas agudas también se pueden producir durante la evolución progresiva de la EM.

Una tercera forma es la EM inactiva. La EM inactiva se caracteriza por deficiencias neurológicas fijas de magnitud variable. La mayoría de los pacientes con EM inactiva tienen antecedentes de EM con recaídas. La evolución de la EM también depende de la edad del paciente. Por ejemplo, los factores pronósticos favorables incluyen inicio temprano (excluyendo la infancia), un curso recurrente y poca discapacidad residual 5 años después del inicio. Por el contrario, un mal pronóstico está asociado con una edad tardía del inicio (es decir, edad de 40 años o mayor) y una evolución progresiva. Estas variables son interdependientes, ya que la EM crónica progresiva tiende a comenzar a una edad más tardía que la EM recurrente. La discapacidad derivada de la EM crónica progresiva se debe normalmente a la paraplejia o tetraplejia progresiva de un paciente individual.

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que presenta características clínicas primarias de anomalías motoras, p.ej., temblor en reposo, bradicinesia y rigidez. La EP se caracteriza por la pérdida de células neuronales (DN) que contienen dopamina en la parte compacta de la sustancia negra (Forno, J. Neurophthol. Exp. Neurol. 55: 259-272 (1996)). Una de las características de la EP es la neuroinflamación caracterizada por microglía activada y células T infiltrantes. Aunque los estudios han sugerido varios mecanismos para la EP, como la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo y el deterioro de la maquinaria de degradación de proteínas, la causa de la EP sigue siendo difícil de alcanzar (Dauer et al., Neuron 39: 889-909 (2003)). Los hallazgos recientes han indicado que tanto la inmunidad innata como la adaptativa pueden desempeñar un papel importante en la patogénesis de la EP (Stone et al., Antioxid. Redox. Signal. 11: 2151-2166 (2009)). Particularmente, se ha demostrado en el modelo animal de la EP que tanto la microglía activada como los linfocitos T contribuyen significativamente a la neurodegeneración. Véase, por ejemplo, Brochard et al., J. Clin. Invest. 119: 182-192 (2009). Se ha planteado la hipótesis de que las células T positivas para CD4 (p.ej., las células T17 proinflamatorias) median la citotoxicidad al activar la microglía en la EP y/o ejercen un efecto tóxico directo en las DN de la sustancia negra (Appel, J. Clin. Invest. 119: 13-15 (2009)).

4. Enfermedades autoinmunitarias

En la presente memoria, una "enfermedad autoinmunitaria" es una enfermedad o trastorno que procede y se dirige contra los propios tejidos de un individuo o un segregado simultáneo o manifestación del mismo o dolencia resultante del anterior. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, entre otros, artritis (artritis reumatoide como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, gota o artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inmunológica aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis inducida por colágeno tipo II, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, enfermedad de Still, artritis vertebral y artritis reumatoide de inicio juvenil, osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante), enfermedades inflamatorias hiperproliferativas de la piel, psoriasis como la psoriasis en placas, psoriasis gutatta, psoriasis pustular y psoriasis en las uñas, atopia que incluye enfermedades atópicas como la fiebre del heno y el síndrome de Job, dermatitis que incluye dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis exfoliativa, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiforme, dermatitis numular, dermatitis seborreica, dermatitis inespecífica, dermatitis de contacto de irritación primaria y dermatitis atópica, síndrome de hiper IgM ligado a X, enfermedades inflamatorias intraoculares alérgicas, urticaria como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluida urticaria autoinmunitaria crónica, miositis, polimiositis / dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia (incluida la esclerodermia sistémica), esclerosis como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (EM) como EM espinoóptica, EM progresiva primaria (EMP) y EM remitente recurrente , esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis diseminada, esclerosis atáxica, neuromielitis óptica (NMO), enfermedad inflamatoria del intestino (EII) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas por mecanismos autoinmunitarios, colitis como colitis ulcerosa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa) , enterocolitis necrotizante y colitis transmural y enfermedad inflamatoria intestinal autoinmunitaria), inflamación intestinal, pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, síndrome de dificultad respiratoria, incluido el síndrome de dificultad respiratoria adulta o aguda (SDRA), meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico autoinmunitario, espondilitis reumatoide, sinovitis reumatoide, angioedema hereditaria, daño del nervio craneal como en la meningitis, herpes gestacional, penfigoide gestacional, prurito del escroto, insuficiencia ovárica prematura autoinmunitaria, pérdida repentina de la audición debido a una afección autoinmunitaria, enfermedades mediadas por IgE como anafilaxia y rinitis alérgica y atópica, encefalitis como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y / o cerebral, uveítis, como uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior o uveítis autoinmunitaria, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico, como glomerulonefritis aguda o crónica, como GN primaria, GN inmunomediada, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN idiopática membranosa o nefropatía idiopática membranosa, o GN membranoproliferativa o membranosa proliferativa (MPGN), incluyendo Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva, nefritis proliferativa, insuficiencia endocrina poliglandular autoinmunitaria, balanitis que incluye balanitis circunscripta plasmacelularis, balanopostitis, eritema anular centrífugo, eritema discromico perstans, eritema multiforme, granuloma anular, liquen nitidus, liquen escleroso y atrófico, liquen simple crónico, liquen espinuloso, liquen plano, ictiosis lamelar, hiperqueratosis epidermolítica, queratosis premaligna, pioderma gangrenoso, afecciones y respuestas alérgicas, reacción alérgica, eccema, incluso eccema alérgico o atópico, eccema asteatótico, eccema dishidrótico y eccema palmoplantar vesicular, asma, tal como, como asma bronquial, y asma autoinmunitaria, afecciones que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunitarias contra antígenos extraños como los grupos sanguíneos fetales A-BO durante el embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus, que incluye lupus nefritis, lupus cerebritis, lupus pediátrico, lupus no renal, lupus extra-renal, lupus discoide y lupus eritematoso discoide, alopecia lupus, lupus eritematoso sistémico (LES), como LES cutáneo o LES cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (LES) y lupus eritematoso diseminado, diabetes mellitus de aparición juvenil (Tipo I), incluida la diabetes mellitus pediátrica dependiente de insulina (DMID), diabetes mellitus de aparición en adultos (diabetes Tipo II), diabetes autoinmunitaria, diabetes insípida idiopática, retinopatía diabética, nefropatía diabética, trastorno diabético de la arteria grande, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis, incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis, vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (incluida la enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa / periarteritis nodosa), poliarteritis microscópica, inmunovasculitis, vasculitis del SNC, vasculitis cutánea, vasculitis por hipersensibilidad, vasculitis necrotizante, como vasculitis necrotizante sistémica, y vasculitis asociada a ANCA, como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS) y vasculitis de vasos pequeños asociada a ANCA, arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmunitaria, anemia positiva de Coombs, Anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmunitaria, incluida anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), enfermedad de Addison, anemia pura de glóbulos rojos o aplasia (PRCA), deficiencia del factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión multiorgánica como las secundarias a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome del anticuerpo antifosfolípido, neuritis alérgica, Enfermedad síndrome de Behpet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide, como penfigoide ampolloso y penfigoide de la piel, pénfigo (incluido pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide de pénfigo mucus-membrana, y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunitarias, enfermedad o síndrome de Reiter, lesión térmica, preeclampsia, un trastorno de complejo inmunitario como nefritis por complejos inmunitarios, nefritis mediada por anticuerpos, polineuropatías, neuropatía crónica como polineuropatías IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (desarrollada por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluida la púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura postransfusional (PTP), trombocitopenia inducida por heparina, y trombocitopenia autoinmunitaria o mediada por el sistema inmunitario, como la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), que incluye PTI crónica o aguda, escleritis como la cerato-escleritis idiopática, episcleritis, enfermedad autoinmunitaria de testículos y ovarios que incluye orquitis autoinmunitaria y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunitarias que incluyen tiroiditis como tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares como los síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluidos los síndromes paraneoplásicos neurológicos como el síndrome miasténico de Lambert-Eaton o el síndrome de Eaton-Lambert, el síndrome del hombre rígido o persona rígida, la encefalomielitis como la encefalomielitis alérgica o la encefalomielitis alérgica y la encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave, como la miastenia grave asociada a timoma, degeneración cerebelosa, neuromiotonía, síndrome opsoclono o mioclono opsoclono (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis crónica activa o hepatitis crónica activa autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barré, Enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), nefropatía por IgA idiopática, dermatosis por IgA lineal, dermatosis febril neutrofílica febril, dermatosis pustular subcorneal, dermatosis acantolítica transitoria, cirrosis, como cirrosis biliar primaria y neumocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmunitaria, enfermedad celíaca o celiaquía, celiaquía (enteropatía por gluten), enfermedad refractaria, enfermedad idiopática, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA); enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad autoinmunitaria del oído tal como enfermedad autoinmunitaria del oído interno (AIED), pérdida de la audición autoinmunitaria, policondritis tal como policondritis refractaria o recidivante o recurrente, proteinosis alveolar pulmonar, síndrome de Cogan/queratitis intersticial no sifilítica, Parálisis de Bell, enfermedad/síndrome de Sweet, rosácea autoinmunitaria, dolor asociado con zoster, amiloidosis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis monoclonal de células B (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de importancia indeterminada, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis focal o segmentaria o focal segmentaria (FSGS), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno hepático autoinmunitario, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, suprarrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, Síndrome de Dressler, alopecia areata, alopecia total, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmunitaria masculina y femenina, por ejemplo, debido a los anticuerpos anti-espermatozoides, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome postcardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de avicultor, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como la alveolitis alérgica y alveolitis fibrosa, enfermedad pulmonar intersticial, reacción de transfusión, lepra, malaria, enfermedades parasitarias como la leishmaniosis, tripanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, Síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica) o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), SCID, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), infección por ecovirus, septicemia, endotoxemia, pancreatitis, tiroxicosis, infección por parvovirus, infección por el virus de la rubeola, síndromes postvacunación, infección congénita de la rubeola, infección por el virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmunitaria, corea de Sydenham, nefritis postestreptocócica, tromboangitis obliterante, tirotoxicosis, tabes dorsal, coroiditis, polimialgia de células gigantes, neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía por cambios mínimos, lesión benigna familiar y lesión por isquemia-reperfusión, reperfusión por trasplante de órganos, autoinmunidad retiniana, inflamación articular, bronquitis, enfermedad obstructiva crónica de vías respiratorias/pulmonar, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos, espermiogénesis, hemólisis autoinmunitaria, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, hipoacusia neurosensorial, hemoglobinuria paroxística, hipogonadismo, ileitis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmia simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tiroiditis de Quervain, atrofia espénica adquirida, timoma no maligno, vitíligo, síndrome de shock tóxico, intoxicación alimentaria, afecciones que implican la infiltración de células T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, síndrome de lesión multiorgánica, enfermedades mediadas por complejos antígenoanticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunitarias, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmunitaria, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, síndrome poliglandular autoinmunitario tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio adulto (AOIH), cardiomiopatía, como miocardiopatía dilatada, epidermolisis ampollosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoidal, frontal, maxilar o esfenoidal, un trastorno relacionado con los eosinófilos, como la eosinofilia, eosinofilia de infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, el síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmunitaria poliendocrina, colangitis esclerosante, esclera, episclera, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia telangiectasia, angiectasia, trastornos autoinmunitarios asociados con enfermedad del colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, linfadenitis, reducción de la respuesta de la presión arterial, disfunción vascular, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral y enfermedad que acompaña a la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, trastorno de reperfusión isquémica, lesión por reperfusión del miocardio u otros tejidos, traqueobronquitis linfomatosa, dermatosis inflamatoria, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, insuficiencia orgánica múltiple, enfermedades ampollosas, necrosis cortical renal, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitarios, síndromes asociados a transfusiones de granulocitos, toxicidad inducida por citoquinas, narcolepsia, inflamación aguda grave, inflamación crónica intratable, pielitis, hiperplasia endometrial, úlcera péptica, valvulitis y endometriosis.

5. Cáncer

El cáncer o una afección cancerosa es la afección fisiológica en los mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento/proliferación celular no regulado. En esta definición se incluyen los cánceres benignos y malignos, así como los cánceres metastásicos. También se incluyen tumores sólidos y neoplasias hematopoyéticas. El cáncer metastásico se refiere a un cáncer que se ha propagado desde el lugar donde comenzó a otro lugar en el cuerpo. Los tumores formados por células cancerosas metastásicas se denominan un tumor metastásico o metástasis (que también se usa para referirse al proceso mediante el cual las células cancerosas se propagan a otras partes del cuerpo). En general, el cáncer metastásico tiene el mismo nombre y el mismo tipo de células cancerosas que el cáncer original o primario. El cáncer metastásico incluye cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer de páncreas. Por cáncer de próstata o afecciones relacionadas con el cáncer de próstata se entiende el crecimiento maligno de células anormales en la glándula prostática, capaces de invadir y destruir otras células de la próstata y propagarse (hacer metástasis) a otras partes del cuerpo, incluidos los huesos, los pulmones, el hígado y los ganglios linfáticos. Por cáncer de pulmón o afecciones relacionadas con el cáncer de pulmón se entiende el crecimiento maligno de células anormales en los pulmones, capaces de invadir y destruir otras células pulmonares y de propagarse (hacer metástasis) a otras partes del cuerpo, incluidas la glándula suprarrenal y el hígado. Por cáncer de páncreas o afecciones relacionadas con el cáncer de páncreas se entiende el crecimiento maligno de células anormales en el páncreas, capaces de invadir y destruir otras células del páncreas, y de propagarse (hacer metástasis) a otras partes del cuerpo, incluyendo el hígado, los pulmones y el peritoneo.

6. Antagonistas de MCAM

La presente invención proporciona antagonistas de MCAM. Dichos antagonistas abarcan aquellos que actúan directamente sobre MCAM (p.ej., un anticuerpo anti-MCAM) y aquellos que afectan indirectamente a la actividad de MCAM (p.ej., un anticuerpo anti cadena a4 de laminina). Tales antagonistas son útiles, por ejemplo, para tratar un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) caracterizado por infiltración de células que expresan MCAM en el SNC. Una composición que comprende un antagonista de MCAM puede ser útil para reducir la inflamación en un sujeto mamífero. Dicha composición puede ser útil para inhibir parcial o totalmente la infiltración del SNC de células que expresan MCAM. Ejemplos de antagonistas de MCAM incluyen, sin limitación, anticuerpos antagonistas o neutralizantes o fragmentos de anticuerpos contra uno o más dominios, por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina de un polipéptido MCAM de secuencia natural o un dominio de un polipéptido de cadena a4 de laminina de secuencia natural (por ejemplo, la cadena a4 de laminina 411), moléculas pequeñas, ribozimas, aptámeros, péptidos y ácidos nucleicos que codifican antagonistas de polipéptido o anticuerpos antagonistas. La referencia a "un" antagonista abarca un único antagonista. Los antagonistas de MCAM pueden ser anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos y sus fragmentos funcionales.

En una realización preferida, la cadena a4 de laminina es una cadena a4 de la laminina 411. En otra realización preferida, el antagonista de MCAM bloquea la interacción de un dominio de MCAM que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22 y/o la SEQ ID NO:23 con una cadena a4 de laminina.

6.1 Ensayos de selección para identificar antagonistas de MCAM

La presente descripción describe ensayos de selección para identificar antagonistas de MCAM, que encuentran utilidad en el tratamiento de afecciones inflamatorias caracterizadas por infiltración de células que expresan MCAM en el sistema nervioso central (SNC).

La divulgación describe un método para identificar un inhibidor de la infiltración del SNC por células que expresan MCAM que comprende las etapas de: (a) incubar una población de células que expresan una cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411, con MCAM, en presencia o ausencia de una molécula candidata; (b) controlar el nivel de unión de MCAM a las células; y (c) identificar dicha molécula candidata como un inhibidor de la infiltración del SNC por células que expresan MCAM si el nivel de unión de MCAM es menor en presencia que en ausencia de dicha molécula candidata. La molécula candidata puede seleccionarse del grupo que consiste en una molécula pequeña, un péptido, un polipéptido y un anticuerpo. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que pueden ser adecuados otros tipos de moléculas candidatas. El nivel de unión de MCAM puede controlarse mediante técnicas conocidas que incluyen, sin limitación, microscopía fluorescente, FACS y ELISA. Las células que expresan una cadena a4 de laminina pueden ser células endoteliales. La cadena a4 de laminina puede ser una cadena a4 de la laminina 411.

Los ensayos de selección para candidatos a fármacos antagonistas pueden diseñarse para identificar compuestos que se unen o forman complejos con MCAM (incluida una subunidad u otro fragmento de la misma) o con un ligando de MCAM, tal como una cadena a4 de laminina (por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411), o interfieren de otro modo con la interacción de MCAM con otras proteínas celulares, interfiriendo, de este modo, con la interacción de MCAM con su ligando, por ejemplo, una cadena a4 de laminina. Los ensayos de selección proporcionados en la presente memoria incluyen ensayos susceptibles de selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, lo que los hace particularmente adecuados para identificar fármacos candidatos de moléculas pequeñas. Generalmente, se proporcionan ensayos de unión y ensayos de actividad.

Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, que incluyen, sin limitación, ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de selección bioquímicos, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

Todos los ensayos para antagonistas y agonistas son comunes porque requieren el contacto del fármaco candidato con un polipéptido MCAM, o un polipéptido ligando de MCAM, p. ej., una cadena a4 de laminina, o un fragmento de dichos polipéptidos (incluyendo específicamente MCAM y cadenas a4 de laminina) en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen.

Por ejemplo, MCAM humana es un polipéptido de 646 aminoácidos, cuya secuencia está disponible en la base de datos GenBank con el Número de Acceso AAA20922.1 (CAA48332) (SEQ ID NO:11; Figura 11A). Las secuencias de aminoácidos para la cadena a4 de laminina humana están disponibles en la base de datos GenBank con los Números de Acceso NP001098676 y NP001098677 (las SEQ ID NO: 27-28; FIG. 12A-B). La producción de anticuerpos o pequeñas moléculas que se unen a dichos polipéptidos está dentro de la experiencia del experto en la técnica.

En los ensayos de unión, la interacción es la unión, y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. El polipéptido ligando de MCAM o MCAM o el fármaco candidato pueden inmovilizarse en una fase sólida, por ejemplo, en una placa de microtitulación, mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente generalmente se logra recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido ligando de MCAM o MCAM y secando. Alternativamente, se puede usar un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido ligando de MCAM o MCAM a inmovilizar para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza agregando el componente no inmovilizado, que puede estar marcado por un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, los componentes que no reaccionan se eliminan, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados a la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado lleva un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se ha producido la formación de complejos. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no lleva un marcador, puede detectarse la formación del complejo, por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato es un polipéptido que interactúa pero no se une a MCAM o al polipéptido ligando de MCAM, su interacción con el polipéptido respectivo puede analizarse mediante métodos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo, entrecruzamiento, co-inmunoprecipitación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden controlarse utilizando un sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y sus colaboradores (Fields y Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como el descrito por Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991).

Pueden analizarse los compuestos que interfieren con la interacción de MCAM y otros componentes extracelulares, en particular un polipéptido ligando de MCAM, de la siguiente manera. Por lo general, se prepara una mezcla de reacción que contiene MCAM y el componente extracelular (por ejemplo, un ligando de MCAM tal como una cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411) en condiciones y durante un tiempo que permita la interacción de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la interacción de MCAM y su ligando, la reacción se ejecuta en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, se puede agregar un placebo a una tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. Debido a que se ha demostrado que MCAM se une específicamente a su ligando, por ejemplo, una cadena a4 de laminina, la capacidad del compuesto de prueba para inhibir la interacción de MCAM/ligando de MCAM se puede probar, por ejemplo, midiendo el grado de unión entre MCAM y su ligando en ausencia y presencia del compuesto de prueba. Si el grado de unión de MCAM a su ligando es menor en ausencia del compuesto candidato que en su presencia, el compuesto candidato es un antagonista de MCAM según la definición de la presente invención.

Un protocolo de selección alternativo implica el uso de una población de células que expresan una cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de la laminina 411, que puede incubarse con MCAM, en presencia y ausencia de un compuesto de prueba, y controlar la unión de MCAM a la población celular, por ejemplo por microscopía de fluorescencia (ejemplificada en el Ejemplo 5). Los expertos en la técnica apreciarán otros métodos de control, incluyendo separación de células activadas por fluorescencia (FACS) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Si la unión de MCAM a la población celular en presencia del compuesto de prueba es menor que en su ausencia, el compuesto de prueba es un antagonista de MCAM.

Los antagonistas de MCAM identificados en función de su capacidad para inhibir la unión de MCAM a su ligando, por ejemplo, una cadena a4 de laminina, son fármacos candidatos para el tratamiento de afecciones neuroinflamatorias caracterizadas por la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC.

Se enfatiza que los ensayos de selección específicamente analizados en la presente memoria, son solo para ilustración. Una variedad de otros ensayos, que pueden seleccionarse dependiendo del tipo de antagonistas candidatos explorados (por ejemplo, polipéptidos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas no peptídicas, aptámeros, ribozimas, ácido nucleico, etc.) son bien conocidos por los expertos en la técnica y son igualmente adecuados para los fines de la presente invención.

6.2 Anticuerpos

En un aspecto, un antagonista de MCAM es un anticuerpo anti-MCAM o un anticuerpo anti cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MCAM es un anticuerpo bloqueante que bloquea total o parcialmente la interacción de MCAM con su ligando, una cadena a4 de laminina. En otras realizaciones, un anticuerpo anti cadena a4 de laminina es un anticuerpo bloqueante que bloquea total o parcialmente la interacción de una cadena a4 de laminina con MCAM. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-MCAM se une al dominio extracelular de MCAM que interactúa con su ligando, una cadena a4 de laminina. En una realización preferida, la cadena a4 de laminina es una cadena a4 de laminina 411.

Un anticuerpo anti-MCAM puede unirse específicamente o selectivamente a un fragmento de MCAM que comprende o tiene la secuencia de aminoácidos de la posición 19 a la posición 129 de la SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO:22). Un anticuerpo anti-MCAM puede unirse específicamente o selectivamente a un fragmento de MCAM que comprende o tiene la secuencia de aminoácidos de la posición 139 a la posición 242 de la SEQ ID NO: 11 (SEQ ID ⁿO:23). Un anticuerpo anti-MCAM puede unirse específicamente o selectivamente a un fragmento de MCAM que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:22 y 23.

El anticuerpo antagonista puede bloquear la interacción de un dominio de MCAM que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22 y/o la SEQ ID NO:23 con una cadena a4 de laminina.

En otras realizaciones, el anticuerpo anti-MCAM o fragmento de anticuerpo comprende las siguientes regiones hipervariables (las HVR):

a) HVR-L1 mostrada como la SEQ ID NO:73;

b) HVR-L2 mostrada como la SEQ ID NO:74;

c) HVR-L3 mostrada como la SEQ ID NO:75;

d) HVR-H1 mostrada como la SEQ ID NO:78;

e) HVR-H2 mostrada como la SEQ ID NO:79; y/o

f) HVR-H3 mostrada como la SEQ ID NO:80.

En otra realización, el anticuerpo anti-MCAM o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera mostrado como una cualquiera de las SEQ ID NO:70, 71 o 72 y/o un dominio variable de cadena pesada mostrado como la SEQ ID NO:77.

a) HVR-L1 mostrada como la SEQ ID NO:73;

b) HVR-L2 mostrada como la SEQ ID NO:74;

c) HVR-L3 mostrada como la SEQ ID NO:75;

d) HVR-H1 mostrada como la SEQ ID NO:141;

e) HVR-H2 mostrada como la SEQ ID NO:79; y/o

f) HVR-H3 mostrada como la SEQ ID NO:80.

En otra realización, el anticuerpo anti-MCAM o fragmento de anticuerpo comprende además (a) una región marco 2 (FR2) de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134; (b) una región marco 3 (FR3) de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:135; (c) una región marco 1 (FR1) de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:147; (d) una región marco 2 (FR2) de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:148; y/o (e) una región marco 3 (FR3) de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:149.

En otra realización, el antagonista de MCAM se une a sustancialmente el mismo epítopo que, o compite por unirse con, un anticuerpo anti-MCAM que comprende las siguientes HVR:

a) HVR-L1 mostrada como la SEQ ID NO:73;

b) HVR-L2 mostrada como la SEQ ID NO:74;

c) HVR-L3 mostrada como la SEQ ID NO:75;

d) HVR-H1 mostrada como la SEQ ID NO:78;

e) HVR-H2 mostrada como la SEQ ID NO:79; y/o

f) HVR-H3 mostrada como la SEQ ID NO:80.

En otra realización, el antagonista de MCAM se une a sustancialmente el mismo epítopo que, o compite por unirse con, un anticuerpo anti-MCAM que comprende un dominio variable de cadena ligera mostrado como una cualquiera de las SEQ ID NO:70, 71 o 72 y/o un dominio variable de cadena pesada mostrado como la SEQ ID NO:77.

La descripción proporciona un anticuerpo que se une a MCAM, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NO: 119. El anticuerpo anti-MCAM puede comprender un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 123. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NO: 119 y el anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 123. La descripción describe un anticuerpo que es una variante de cualquiera de los anticuerpos anteriores que tiene una o más sustituciones, deleciones, inserciones o modificaciones de aminoácidos, y que retiene una función biológica del anticuerpo. La invención proporciona un anticuerpo que se une a MCAM expresada en la superficie celular e inhibe la unión de MCAM a laminina 411. El anticuerpo anti-MCAM se une a MCAM expresada en la superficie celular e inhibe la progresión de la enfermedad. En algunas realizaciones, se inhibe la progresión de una enfermedad autoinmunitaria. En una realización, se inhibe la progresión de la esclerosis múltiple. La descripción describe un anticuerpo que es una variante de uno cualquiera de los anticuerpos anteriores que tiene mejoras en una o más de una propiedad tal como afinidad de unión, especificidad, termoestabilidad, nivel de expresión, función efectora, glicosilación, inmunogenicidad reducida o solubilidad en comparación con el anticuerpo no modificado.

En otras realizaciones, el anticuerpo anti-MCAM se une a MCAM expresada en la superficie celular e inhibe la progresión de un cáncer metastásico. En una realización, el cáncer metastásico se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer de páncreas.

La descripción, en la presente memoria, incluye la producción y el uso de anticuerpos antagonistas de MCAM. Se describen con más detalle en la presente memoria, métodos ejemplares para generar anticuerpos. Los anticuerpos de MCAM pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de las presentes realizaciones), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. Los fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno humano incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')², Fd, los Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos a disulfuro (sdFv), y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, incluidos los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la región o regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una porción de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen los fragmentos de unión a antígeno que pueden comprender cualquier combinación de la región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal, incluidas aves y mamíferos. Típicamente, los anticuerpos son de seres humanos u otros primates, murinos (por ejemplo, de ratón y rata), de burro, oveja, mono, conejo, cabra, cobaya, cerdo, camello, caballo o pollo (u otras aves). Como se usa en la presente memoria, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, e incluyen anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe, por ejemplo en la Patente de Estados Unidos Número 5.939.598.

En otra realización, el anticuerpo de MCAM puede ser un anticuerpo monoclonal. En otra realización adicional, el anticuerpo puede modificarse químicamente, por ejemplo, mediante pegilación. Adicionalmente, otros anticuerpos pueden identificarse utilizando técnicas disponibles en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos capaces de unirse específicamente a MCAM pueden producirse usando tecnología de presentación en fagos. Después, pueden aislarse los fragmentos de anticuerpos que se unen selectivamente a MCAM. Se describen métodos ejemplares para producir tales anticuerpos a través de presentación en fagos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6.225.447, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir usando los métodos de hibridoma convencionales. Estos métodos se han aplicado ampliamente para producir líneas celulares híbridas que secretan elevados niveles de anticuerpos monoclonales dirigidos contra muchos antígenos específicos, y también se pueden usar para producir anticuerpos monoclonales capaces de unirse específicamente a MCAM. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones (por ejemplo, ratones Balb/c) con un epítopo de MCAM antigénico mediante inyección intraperitoneal. Después de que haya pasado suficiente tiempo para permitir una respuesta inmunitaria, los ratones se sacrifican y las células de bazo se obtienen y fusionan con células de mieloma, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Las células fusionadas resultantes, hibridomas, se hacen crecer a continuación en medio selectivo, y las células que sobreviven se cultivan en dicho medio usando condiciones de dilución limitantes. Después de la clonación y la reclonación, se pueden aislar hibridomas para anticuerpos secretores (por ejemplo, de la clase IgG o IgM o subclase IgG1) que se unen selectivamente a MCAM. Para producir agentes específicos para uso humano, el monoclonal aislado se puede usar, a continuación, para producir anticuerpos quiméricos y humanizados.

Los anticuerpos antagonistas de MCAM se seleccionan usando un antígeno derivado de una especie de mamífero. Preferiblemente, el antígeno es MCAM humana o una cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411. Sin embargo, también se pueden usar polipéptidos de otras especies tal como MCAM murino o cadena a4 de laminina como el antígeno diana. Los antígenos de varias especies de mamíferos pueden aislarse de fuentes naturales. En otras realizaciones, el antígeno se produce de forma recombinante o se fabrica utilizando otros métodos sintéticos conocidos en la técnica. El anticuerpo seleccionado normalmente tendrá una afinidad de unión suficientemente fuerte para el antígeno. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a MCAM humana o a una cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411 con un valor K^dde no más de aproximadamente 5 nM, preferiblemente no más de aproximadamente 2 nM, y más preferiblemente no más de aproximadamente 500 pM. Las afinidades del anticuerpo pueden determinarse mediante un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (tal como el ensayo BIAcore como se describe en los Ejemplos); ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA); y los ensayos de competencia (por ejemplo, los RIA), por ejemplo.

Además, el anticuerpo puede someterse a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como un agente terapéutico. Tales ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y del uso previsto para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) (como se describe en el Ejemplo 7 a continuación), y los ensayos in vitro e in vivo descritos en la presente memoria para identificar antagonistas de MCAM.

Para detectar anticuerpos que se unen a un epítopo particular en el antígeno de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el que se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar el mapeo de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

Los anticuerpos antagonistas pueden seleccionarse utilizando un enfoque de presentación en fagos exclusivo. El enfoque implica la generación de bibliotecas de fagos de anticuerpos sintéticos basadas en una plantilla de marco único, el diseño de diversidades suficientes dentro de los dominios variables, la presentación de polipéptidos que tienen los dominios variables diversificados, la selección de anticuerpos candidatos con alta afinidad para antígeno diana y el aislamiento de los anticuerpos seleccionados. Los detalles de los métodos de presentación en fagos se pueden encontrar, por ejemplo, en el documento WO03/102157 publicado el 11 de diciembre de 2003. El anticuerpo generado a partir de bibliotecas de fagos puede modificarse adicionalmente para generar mutantes del anticuerpo con propiedades físicas, químicas y o biológicas mejoradas sobre el anticuerpo precursor. Cuando el ensayo utilizado es un ensayo de actividad biológica, el mutante del anticuerpo tiene preferiblemente una actividad biológica en el ensayo de elección que es al menos aproximadamente 10 veces mejor, preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces mejor, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces mejor, y a veces al menos aproximadamente 100 veces o 200 veces mejor que la actividad biológica del anticuerpo precursor en ese ensayo. Por ejemplo, un mutante de anticuerpo anti-MCAM tiene preferiblemente una afinidad de unión por MCAM que es al menos aproximadamente 10 veces más fuerte, preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces más fuerte, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces más fuerte, y algunas veces al menos aproximadamente 100 veces o 200 veces más fuerte que la afinidad de unión de los anticuerpos anti-MCAM precursores, tal como los anticuerpos clon 15 o 17.

Los anticuerpos quiméricos y humanizados se pueden producir a partir de anticuerpos no humanos, y pueden tener una afinidad de unión igual o similar a la del anticuerpo a partir del cual se producen. Las técnicas ejemplares para producir anticuerpos quiméricos incluyen el corte y empalme de los genes de, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad por el antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Véase, por ejemplo, Morrison et al., 1984 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81: 6851; Neuberger et al., 1984 Nature 312: 604; y Takeda et al., 1985 Nature 314: 452. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una región variable (V) de un anticuerpo monoclonal de ratón se puede unir a un ácido nucleico que codifica una región constante (C) humana, por ejemplo, IgG1 o IgG4. El anticuerpo resultante es, por lo tanto, un híbrido de especies, generalmente con el dominio de unión a antígeno del anticuerpo no humano y el dominio C o efector de un anticuerpo humano o de primate.

Los anticuerpos humanizados son anticuerpos con regiones variables que son principalmente de un anticuerpo humano (es decir, el anticuerpo aceptor), pero que tienen regiones determinantes de complementariedad sustancialmente de un anticuerpo no humano (el anticuerpo donante). Véase, por ejemplo, Queen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 86: 10029-10033 (1989); el documento ^wO 90/07861, las patentes de Estados Unidos n.° 7.435.802, 6.054.297; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; y 5.224.539. La región o regiones constantes de estos anticuerpos también proceden, por lo general, de un anticuerpo humano. Los dominios variables humanos se seleccionan, típicamente, de anticuerpos humanos que tienen secuencias que presentan una homología elevada con los dominios de unión a la región variable no humana deseados. Los restos variables de las cadenas pesada y ligera pueden derivar del mismo anticuerpo, o de un anticuerpo humano diferente. Además, las secuencias se pueden elegir como un consenso de varios anticuerpos humanos, tal como se describe en el documento WO 92/22653.

Un "anticuerpo Primatized™" es un anticuerpo recombinante que contiene secuencias variables o porciones de unión a antígeno de primates, y secuencias de dominio constante humano. Véase por ejemplo, Newman, Bio/Technology, 1992, 10: 1455-60. La primatización de los anticuerpos da como resultado la generación de anticuerpos que contienen dominios variables de primates (por ejemplo, mono) y secuencias constantes humanas. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 6.113.898. Esta técnica modifica los anticuerpos de forma que no se rechacen cuando se administren a seres humanos, puesto que son antigénicos. Esta técnica se basa en la inmunización de monos cinomolgus con antígenos o receptores humanos. Esta técnica se desarrolló para crear anticuerpos monoclonales de elevada afinidad dirigidos a los antígenos de la superficie celular humanos.

En otro aspecto, los aminoácidos específicos dentro de la región variable humana se pueden seleccionar para sustitución basándose en la conformación predicha y en las propiedades de unión a antígeno. Esto se puede determinar utilizando técnicas tales como el modelado por ordenador, la predicción del comportamiento y las propiedades de unión de los aminoácidos en ciertas ubicaciones dentro de la región variable, y la observación de los efectos de la sustitución. Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre una región variable no humana y una región variable humana, la región variable humana puede alterarse para reflejar la composición de aminoácidos de la región variable no humana. Los anticuerpos utilizados en el régimen de dosificación crónico pueden ser anticuerpos humanizados tal como se divulga en la patente de Estados Unidos n.° 5.840.299. Los ratones transgénicos que contienen genes de anticuerpos humanos se pueden inmunizar con una estructura antigénica de MCAM y se puede utilizar tecnología de hibridomas para generar anticuerpos humanos que se unen selectivamente a MCAM.

Se pueden producir anticuerpos quiméricos, humanos y/o humanizados utilizando la expresión recombinante, por ejemplo, la expresión en hibridomas humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985)), en células de mieloma o en células de ovario de hámster chino (CHO). Como alternativa, las secuencias codificantes de anticuerpos se pueden incorporar a transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico y su posterior expresión en la leche del animal transgénico. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.197.946. Los transgenes adecuados ejemplares incluyen, pero no se limitan a, transgenes que tienen un promotor y/o potenciador de un gen específico de la glándula mamaria, por ejemplo caseína o plactoglobulina.

6.3 Variantes de Anticuerpos

Además de los anticuerpos antagonistas de MCAM descritos en la presente memoria, se contempla que pueden prepararse variantes de dichos anticuerpos. Pueden prepararse las variantes de anticuerpos antagonistas anti-MCAM introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN codificante, y/o mediante síntesis del anticuerpo deseado. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos posteriores a la traducción del anticuerpo anti-MCAM, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.

Las variaciones en los anticuerpos antagonistas de MCAM descritas en la presente memoria se pueden hacer, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo, que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo de secuencia natural. Opcionalmente, la variación se realiza mediante la sustitución de al menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo antagonista de MCAM. Se puede encontrar una guía para determinar qué resto de aminoácido se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar negativamente a la actividad deseada comparando la secuencia del anticuerpo antagonista de MCAM con la de moléculas de proteínas conocidas homólogas y minimizando el número de cambios de secuencias de aminoácidos realizados en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina por una serina, es decir, reemplazos de aminoácidos conservativos. Opcionalmente, las inserciones o las deleciones pueden estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar haciendo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando las variantes resultantes para la actividad mostrada por la secuencia natural de longitud completa o madura.

Las modificaciones covalentes de los anticuerpos anti-MCAM están incluidas dentro del alcance de la presente invención. Las modificaciones covalentes incluyen la reacción de restos de aminoácidos que se tienen como objetivo de un anticuerpo anti-MCAM con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los restos N o C-terminal del anticuerpo anti-MCAM. Otras modificaciones incluyen la desamidación de los restos glutaminilo y asparaginilo a los restos correspondientes glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

En un aspecto, los anticuerpos antagonistas de MCAM de la presente descripción comprenden una o más mutaciones de desamidación en la secuencia de aminoácidos. La desamidación de los restos de aminoácidos es una modificación estructural común en los polipéptidos recombinantes, que puede conducir a la formación de ácido isoaspártico que produce una estabilidad disminuida. La desamidación se puede asociar con las secuencias de glicina (G)-asparginina (N), incluidas las secuencias de G-N y N-G. El anticuerpo puede comprender una mutación por desamidación. La mutación por desamidación puede ser la sustitución de un resto de aminoácido N o un resto de aminoácido G. La sustitución se puede seleccionar del grupo que consiste en N ^ S, N ^ A y G ^ Q. La mutación por desamidación se puede ubicar en el resto N32 o g 33 de Kabat.

Otros tipos de modificación covalente del anticuerpo anti-MCAM incluidos en la descripción incluyen alterar el patrón de glicosilación natural del anticuerpo o polipéptido (Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9: 482-501, 2008; Walsh, Drug Discov. Today 15: 773-780, 2010), y unir el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las Patentes de EE.UU. n.° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Los anticuerpos antagonistas de MCAM de la descripción comprenden una o más mutaciones por glicosilación en la secuencia de aminoácidos. La mutación puede eliminar o restablecer/introducir un sitio de glicosilación. En general, la mutación por glicosilación se asocia con un resto de asparginina (N). El anticuerpo puede comprender una mutación por glicosilación. La mutación por glicosilación puede ser la introducción de un resto de aminoácido N. La introducción puede ser el reemplazo de un resto de ácido aspártico (D) por un resto de N (D ^ N). La mutación puede localizarse en el resto 72 de Kabat.

En la presente memoria, se proporcionan los fragmentos de anticuerpos antagonistas de MCAM. Dichos fragmentos pueden truncarse en el extremo N o en el extremo C, o pueden carecer de restos internos, por ejemplo, cuando se comparan con un anticuerpo natural de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de restos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo antagonista de MCAM.

Los fragmentos de anticuerpos antagonistas de MCAM pueden prepararse mediante cualquiera de una serie de técnicas convencionales. Los fragmentos peptídicos deseados pueden sintetizarse químicamente. Un enfoque alternativo implica generar fragmentos de anticuerpos o polipéptidos mediante digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima que se sabe que escinde proteínas en sitios definidos en restos de aminoácidos particulares, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Otra técnica más adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpos antagonistas anti-MCAM comparten al menos una actividad biológica y/o inmunitaria con un anticuerpo antagonista de MCAM natural descrito en la presente memoria.

Las sustituciones conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 a continuación bajo, el encabezado de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, como se describe adicionalmente más adelante haciendo referencia a las clases de aminoácidos, y se detectan los productos.

Las modificaciones sustanciales en la función o la identidad inmunológica del anticuerpo antagonista de MCAM se realizan seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos restos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).

Tabla 1

Las variaciones pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), barrido de alanina y mutagénesis por PCR. Se puede realizar mutagénesis dirigida al sitio [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis en casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN de la variante del anticuerpo antagonista de MCAM.

También puede emplearse análisis de aminoácidos de barrido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos se encuentran aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es normalmente un aminoácido de barrido preferido dentro de este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y tiene menos probabilidades de alterar la conformación de cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. También se prefiere típicamente la alanina debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra con frecuencia tanto en posiciones internas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico.

Cualquier resto de cisteína que no esté involucrado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo antagonista de MCAM también puede sustituirse, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir el entrecruzamiento aberrante. A la inversa, puede añadirse un enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo antagonista de MCAM para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo un anticuerpo humano o humanizado). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo precursor a partir del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes de sustitución implica la maduración por afinidad usando presentación en fagos. Brevemente, varios sitios en la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) están mutados para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpos generadas de esta manera se presentan de manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III del M13 empaquetado en cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se seleccionan a continuación para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en la presente memoria. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de barrido de alanina para identificar los restos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígenoanticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y MCAM humana o el polipéptido de laminina 411. Dichos restos de contacto y restos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente memoria. Una vez generadas tales variantes, el panel de variantes se somete a selección como se describe en la presente memoria y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo adicional.

Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tienen una afinidad que es cinco veces, más preferiblemente 10 veces, incluso más preferiblemente 20 o 30 veces mayor que el anticuerpo de partida (generalmente murino, humanizado o humano) a partir del cual se prepara el anticuerpo madurado.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo antagonista de MCAM se preparan mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo antagonista de MCAM.

También se incluyen en la descripción los anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, los anticuerpos de la descripción se unen específicamente a un epítopo que incluye uno o más restos de aminoácidos en la MCAM humana (N.° de acceso AAA20922.1/CAA48332). Los anticuerpos de la descripción se unen específicamente a MCAM, en donde el anticuerpo se une a un epítopo en la MCAM humana (por ejemplo, N.° de acceso AAA20922.1/CAA48332).

Los expertos en la materia reconocerán que es posible determinar, sin excesiva experimentación, si un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal completamente humano) tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal de la descripción al determinar si el primero impide que este último se una a MCAM. Si el anticuerpo monoclonal que se está probando compite con el anticuerpo monoclonal de la descripción, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal de la descripción, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo epítopo, o epítopo estrechamente relacionado.

Un método alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad del anticuerpo monoclonal de la descripción es incubar previamente el anticuerpo monoclonal de la descripción con MCAM (por ejemplo, una molécula de MCAM-Fc ejemplificada en los Ejemplos) y a continuación, agregar el anticuerpo monoclonal que se está probando para determinar si el anticuerpo monoclonal que se está probando está inhibido en su capacidad para unirse a MCAM. Si se inhibe el anticuerpo monoclonal que se está probando, entonces, con toda probabilidad, tiene la misma, o funcionalmente equivalente especificidad epitópica, que el anticuerpo monoclonal de la descripción. Cuando se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibitorio más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, en función de las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que conservan la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).

La descripción comprende un agente de unión que se une esencialmente al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria. El agente de unión es capaz de unirse a la proteína MCAM en la superficie de las células. El agente de unión puede inhibir la interacción de MCAM (por ejemplo, MCAM de superficie celular) con su ligando, una proteína que comprende una cadena alfa-4 de laminina. El agente de unión puede ser un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

La descripción proporciona un agente de unión capaz de unirse a MCAM, en donde uno cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente desplaza al agente de unión en un ensayo de unión competitivo. El agente de unión puede ser un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. La descripción proporciona un agente de unión capaz de unirse a MCAM, en donde el agente de unión desplaza a uno cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente en un ensayo de unión competitivo. El agente de unión puede ser un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

El agente de unión puede ser un agente de unión alternativo. Estos agentes de unión alternativos pueden incluir, por ejemplo, cualquiera de los armazones de proteínas diseñados conocidos en la técnica. Tales armazones incluyen, por ejemplo, anticalinas, que se basan en el armazón de lipocalina, una estructura proteica caracterizada por un barril beta rígido que soporta cuatro bucles hipervariables que forman el sitio de unión del ligando. Las nuevas especificidades de unión están diseñadas por mutagénesis aleatoria dirigida en las regiones de bucle, en combinación con la presentación funcional y la selección guiada (Skerra (2008) FEBS J. 275: 2677-2683). Otros armazones adecuados pueden incluir, por ejemplo, adnectinas o monocuerpos, basados en el décimo dominio extracelular de la fibronectina III humana (Koide y Koide (2007) Methods Mol. Biol. 352: 95-109); afficuerpos, basados en el dominio Z de la proteína A estafilocócica (Nygren et al. (2008) FEBS J. 275: 2668-2676)); DARpins, basadas en proteínas de repetición de anquirina (Stumpp et al. (2008) Drug. Discov. Today 13: 695-701); finómeros, basados en el dominio SH3 de la proteína quinasa Fyn humana (Grabulovski et al. (2007) J. Biol. Chem. 282: 3196 3204); afitinas, basadas en Sac7d de Sulfolobus acidolarius (Krehenbrink et al. (2008) J. Mol. Biol. 383: 1058-1068); afilinas, basadas en cristalina y-B humana (Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372: 172-185); avímeros, basados en los dominios A de las proteínas receptoras de membrana (Silverman et al. (2005) Biotechnol. 23: 1556-1561); péptidos de knottina ricos en cisteína (Kolmar (2008) FEBS J. 275: 2684-2690); y los inhibidores de tipo Kunitz diseñados (Nixon y Wood (2006) Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9: 261-268). Para revisión, véase Gebauer y Skerra (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13: 245-255. El agente de unión puede ser una anticalina, una adnectina, un afficuerpo, una DARPin, un finómero, una afitina, una afilina, un avímero, un péptido de knottina rico en cisteína, o un inhibidor de tipo Kunitz diseñado.

7. Métodos de uso

La presente invención proporciona antagonistas de MCAM para uso como agentes terapéuticos en el tratamiento de afecciones neuroinflamatorias, cáncer y enfermedades autoinmunitarias. Para la prevención, el tratamiento o la reducción de la gravedad de una enfermedad o afección dada, la dosificación adecuada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de enfermedad o afección a tratar, como se definió anteriormente, la gravedad y la evolución de la enfermedad o afección, si el agente se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al compuesto, y el criterio del médico tratante. El compuesto se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Preferiblemente, es deseable determinar la curva de dosis-respuesta y la composición farmacéutica de la invención primero in vitro, y, a continuación, en modelos animales útiles antes del ensayo en seres humanos.

La presente descripción proporciona un método para inhibir o bloquear la interacción de MCAM expresada en células T y la cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411, que comprende tratar las células T con un antagonista de MCAM (como se describe en la presente memoria), inhibiendo, de este modo, la interacción de MCAM con la cadena a4 de laminina. La cadena a4 de laminina se puede expresar en la superficie de una célula, por ejemplo, una célula endotelial. El antagonista de MCAM puede ser un anticuerpo anti-MCAM. Las células T pueden ser células TH17. El tratamiento con un antagonista de MCAM puede realizarse in vivo. El tratamiento puede realizarse en un sujeto mamífero. El sujeto mamífero puede ser un ser humano.

La presente descripción proporciona un método para inhibir o prevenir la extravasación de células T que expresan MCAM en el sistema nervioso central (SNC) que comprende tratar las células T con un antagonista de MCAM (como se describe en la presente memoria), inhibiendo o previniendo, de este modo, la extravasación de células T que expresan MCAM en el SNC. El antagonista de MCAM puede bloquear la interacción de MCAM con la cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de la laminina 411. El antagonista de MCAM puede ser un anticuerpo anti-MCAM. La cadena a4 de laminina se puede expresar en la superficie de una célula, por ejemplo, una célula endotelial. Las células T pueden ser células TH17. El tratamiento con un antagonista de MCAM puede realizarse in vivo. El tratamiento puede realizarse en un sujeto mamífero. El sujeto mamífero puede ser un ser humano.

La presente descripción describe métodos de tratamiento para una afección neuroinflamatoria, una afección cancerosa o una enfermedad autoinmunitaria. El método comprende administrar a un sujeto mamífero que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de MCAM. La descripción describe un método para retrasar o ralentizar la progresión de una afección neuroinflamatoria, una afección cancerosa o una enfermedad autoinmunitaria. El método comprende administrar al sujeto diagnosticado con la afección o enfermedad, una cantidad eficaz de un antagonista de MCAM. La descripción describe un método para prevenir los indicios de una afección neuroinflamatoria, una afección cancerosa o una enfermedad autoinmunitaria. El método comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista de MCAM a un sujeto en riesgo de la afección o enfermedad, en donde el antagonista de MCAM es eficaz contra el desarrollo de indicios de la afección o enfermedad. La presente descripción describe métodos de tratamiento de un cáncer metastásico.

La presente descripción describe un antagonista de MCAM para su uso como un medicamento para, o para el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno descrito en la presente memoria. La presente descripción describe el uso de un antagonista de MCAM para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad, afección o trastorno descrito en la presente memoria. La presente descripción describe el uso de un antagonista de MCAM descrito en la presente memoria, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) caracterizado por infiltración de células que expresan MCAM en el SNC.

7.1 Afecciones Neuroinflamatorias

En un aspecto, los antagonistas de MCAM proporcionan un efecto preventivo o profiláctico contra el desarrollo o la progresión de los indicios clínicos y/o histológicos y/o bioquímicos y/o patológicos (incluyendo tanto síntomas como signos) de afecciones neuroinflamatorias en un sujeto. En una realización, la afección neuroinflamatoria se caracteriza por inflamación del SNC y/o daño celular/tisular. En una realización, los indicios incluyen aumento de la activación glial, aumento de los niveles de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias (por ejemplo, TNFa, INFy, IL-1p), aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y/o aumento del reclutamiento/invasión de células inmunitarias (por ejemplo, leucocitos) al SNC. En otra realización, la neuroinflamación es una neuroinflamación crónica o progresiva asociada con la activación crónica de células del sistema inmunitario (es decir, neuroinflamación asociada a autoinmunidad). Las afecciones de neuroinflamación crónica incluyen, sin limitación, esclerosis múltiple (EM) recurrente, EM progresiva crónica, EM inactiva y enfermedad de Parkinson (EP). En otra realización, el sujeto está en riesgo de una afección neuroinflamatoria. En general, un sujeto en riesgo habrá tenido previamente una afección neuroinflamatoria como se describe en la presente memoria, o tendrá una predisposición genética para la afección neuroinflamatoria.

La eficacia del tratamiento de las afecciones neuroinflamatorias se puede medir mediante diversas evaluaciones que se usan comúnmente para evaluar afecciones inflamatorias. Por ejemplo, la salud del SNC se puede evaluar mediante la prueba de los síntomas de la EM que incluyen, pero no se limitan a, visión deficiente (por ejemplo, visión borrosa o doble, distorsión del color rojo-verde o ceguera); debilidad muscular en las extremidades; coordinación y equilibrio alterados; parálisis parcial o completa, parestesias, sensaciones sensoriales anormales transitorias (por ejemplo, sensaciones de entumecimiento, picazón, o "pinchazos y agujas"); dolor; impedimentos del habla; temblores; mareos; pérdida de audición; deficiencias cognitivas (por ejemplo, dificultades con la concentración, la atención, la memoria y la capacidad de discernir); y depresión. La prueba de EM también puede incluir una punción lumbar (punción raquídea) para pruebas de líquido cefalorraquídeo (LCR) (por ejemplo, bandas oligoclonales de LCR que sugieren inflamación del SNC); una exploración de imágenes de resonancia magnética (IRM) de la cabeza o columna vertebral; y una prueba de la función nerviosa (por ejemplo, prueba de potenciales evocados).

La salud del SNC también se puede evaluar mediante pruebas de los síntomas de la EP que incluyen, pero no se limitan a, temblor (por ejemplo, temblor en las manos, brazos, piernas, mandíbula y cara); rigidez o agarrotamiento de las extremidades y el tronco; bradicinesia o lentitud de movimientos; inestabilidad postural o alteración del equilibrio y la coordinación; depresión y otros cambios emocionales; dificultad para tragar, masticar y hablar; problemas urinarios o estreñimiento; problemas de la piel; trastornos del sueño; y escáneres cerebrales u otras pruebas para descartar otras enfermedades.

7.2 Enfermedades autoinmunitarias

Para las enfermedades autoinmunitarias, el término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas para una enfermedad autoinmunitaria, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico que se tiene como objetivo. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen una enfermedad autoinmunitaria, así como aquellos propensos a tener una enfermedad autoinmunitaria o aquellos en quienes se debe prevenir la enfermedad autoinmunitaria.

En un aspecto, los antagonistas de MCAM proporcionan un efecto preventivo o profiláctico contra el desarrollo o la progresión de los indicios clínicos y/o histológicos, y/o bioquímicos y/o patológicos (incluyendo tanto síntomas como signos) de enfermedades autoinmunitarias en un sujeto. En otra realización, el sujeto está en riesgo de enfermedad autoinmunitaria o de un brote de enfermedad autoinmunitaria. En general, un sujeto en riesgo habrá tenido previamente una enfermedad autoinmunitaria y/o uno o más brotes de enfermedad autoinmunitaria, o tendrá una predisposición genética para una enfermedad autoinmunitaria.

7.3 Cánceres Metastásicos

Para cáncer metastásico, el término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas para un cáncer metastásico, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico que se tiene como objetivo. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen un cáncer metastásico, así como aquellos propensos a tener un cáncer metastásico o aquellos en quienes se debe prevenir el cáncer metastásico.

En un aspecto, los antagonistas de MCAM proporcionan un efecto preventivo o profiláctico contra el desarrollo de o la progresión de los indicios clínicos y/o histológicos y/o bioquímicos y/o patológicos (incluyendo tanto síntomas como signos) de un cáncer metastásico en un sujeto. En una realización, el cáncer metastásico se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer de páncreas.

7.4 Terapia de Combinación

Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o en combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede administrarse conjuntamente con al menos un agente terapéutico adicional. En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional es uno o más de los siguientes agentes modificadores de la enfermedad: teriflunomida, interferón beta-1a, interferón beta-lb, acetato de glatirámero, fingolimod y mitoxantrona. En otra realización, un agente terapéutico adicional es un agente que trata una exacerbación aguda de una enfermedad. En una realización, el agente terapéutico adicional para la exacerbación aguda es uno o más corticosteroides. En otra realización, el uno o más corticosteroides se seleccionan del grupo que consiste en prednisona, metilprednisolona y dexametasona. En otra realización, la enfermedad es esclerosis múltiple y la exacerbación aguda es una recaída o brote (por ejemplo, inflamación del SNC).

Dichas terapias de combinación mencionadas anteriormente abarcan la administración combinada (cuando se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración por separado, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede producirse antes de, simultáneamente y/o a continuación de la administración del agente terapéutico adicional.

8. Composiciones Farmacéuticas

Los anticuerpos antagonistas de MCAM que se unen específicamente a MCAM o una cadena a4 de laminina, por ejemplo, una cadena a4 de laminina 411, así como otras moléculas antagonistas de MCAM identificadas por los ensayos de selección descritos anteriormente en la presente memoria, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos, en particular enfermedades neuroinflamatorias o enfermedades que se benefician de la inhibición de la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC, en forma de composiciones farmacéuticas. En un aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en la presente memoria. Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden comprender

(i) un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un dominio de inmunoglobulina de MCAM que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO:22; (ii) un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un dominio de inmunoglobulina de MCAM que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO:23; o (iii) un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un dominio de MCAM que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas como las SEQ ID NO: 22 y 23.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-MCAM aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende las siguientes regiones hipervariables (HVR):

(i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:73;

(ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74;

(iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:75;

(iv) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:78;

(v) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79; y/o

(vi) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:80.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-MCAM aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende

un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como una cualquiera de las SEQ ID NO:70, 71 o 72 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO:77.

La composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-MCAM aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une sustancialmente al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la presente memoria. La composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite por la unión a MCAM humana con un anticuerpo descrito en la presente memoria. La presente descripción describe el uso de un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en la presente memoria, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) caracterizado por la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC.

Los compuestos de la descripción para la prevención o el tratamiento de una afección neuroinflamatoria o enfermedad autoinmunitaria se administran típicamente mediante inyección intravenosa. También se pueden usar otros métodos de administración, que incluyen, pero no se limitan a, administración tópica, parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal, ocular, intraocular, intravítrea, intralesional, intracerobrospinal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, los compuestos descritos en la presente memoria se administran a un sujeto humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo.

La presente descripción describe dosificaciones para los agentes terapéuticos basados en antagonistas de MCAM. Por ejemplo, dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de polipéptido es una dosificación inicial candidata para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar desde aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Las composiciones de antagonista de MCAM (incluido el anticuerpo antagonista de MCAM) en la presente memoria se formularán, dosificarán y administrarán de manera compatible con una buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la pauta de administración, y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del antagonista que se va a administrar estará gobernada por tales consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad o afección dadas.

En algunas realizaciones, la composición se usa para prevenir la aparición o reincidencia de la enfermedad o estado de la enfermedad en el sujeto. En una realización, la presente invención puede usarse para aumentar la duración de la supervivencia de un paciente humano susceptible de o diagnosticado con la enfermedad o estado de la enfermedad. La duración de la supervivencia se define como el tiempo desde la primera administración del fármaco hasta la muerte.

Las formulaciones terapéuticas se preparan utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica al mezclar el principio activo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (véase, por ejemplo, Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, anteriormente Remington's Pharmaceutical Sciences 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2003). Los portadores aceptables incluyen solución salina o tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como la albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como el manitol o el sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o PEG.

Opcionalmente, pero preferiblemente, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferiblemente cloruro de sodio, y preferiblemente en concentraciones aproximadamente fisiológicas.

Opcionalmente, las formulaciones de la descripción pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. La concentración de conservante puede variar del 0,1 al 2,0 %, típicamente v/v. Los conservantes adecuados incluyen aquellos conocidos en las técnicas farmacéuticas. El alcohol bencílico, el fenol, el m-cresol, el metilparabeno y el propilparabeno son conservantes preferidos. Opcionalmente, las formulaciones de la descripción pueden incluir un tensioactivo farmacéuticamente aceptable a una concentración del 0,005 al 0,02 %.

Los principios activos también pueden estar encerrados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se encuentran en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroximetil metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de ^eE.UU. N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etilenvinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización según el mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es una formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio tiodisulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los restos de sulfhidrilo, liofilizándose de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

9. Artículos de Fabricación y Kits

La presente descripción describe adicionalmente, kits que comprenden los antagonistas de MCAM de la descripción y materiales relacionados, tales como instrucciones de uso. Las instrucciones de uso pueden contener, por ejemplo, instrucciones para la administración de los antagonistas de MCAM y opcionalmente uno o más agentes adicionales. La descripción también describe kits para el tratamiento de un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) caracterizado por la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC. Los trastornos incluyen, sin limitación, afecciones neuroinflamatorias, tales como, por ejemplo, esclerosis múltiple y enfermedad de Parkinson y enfermedad autoinmunitaria. Los kits de la descripción comprenden uno o más envases de al menos un antagonista de MCAM, preferiblemente un anticuerpo, en combinación con un conjunto de instrucciones, generalmente instrucciones escritas, relacionadas con el uso y la dosificación del antagonista de MCAM para el tratamiento del trastorno. Las instrucciones incluidas con el kit generalmente incluyen información sobre la dosificación, el calendario de dosificación y la vía de administración para el tratamiento del trastorno objetivo, tal como una afección neuroinflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria. Los envases de antagonista(s) de MCAM pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes de dosis múltiples) o dosis de subunidades.

La presente descripción describe un kit que comprende un antagonista de MCAM como se describe en la presente memoria e instrucciones para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) caracterizado por la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC. La presente descripción describe un kit para el tratamiento de un trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC) caracterizado por la infiltración de células que expresan MCAM en el SNC, comprendiendo dicho kit: (a) un envase que comprende un anticuerpo antagonista de MCAM; y (b) una etiqueta o instrucciones para administrar dicho anticuerpo para tratar dicho trastorno inflamatorio del SNC. Preferiblemente, el trastorno inflamatorio del SNC es una afección neuroinflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria. El trastorno inflamatorio del SNC puede ser esclerosis múltiple o enfermedad de Parkinson.

También se proporciona un artículo de fabricación para uso terapéutico, que comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los envases pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase incluye una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un principio activo en la composición es un antagonista de MCAM de la descripción. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la dolencia particular. La etiqueta o el prospecto comprenderán además instrucciones para administrar la composición del anticuerpo al paciente. También se contemplan artículos de fabricación y kits que comprenden terapias combinatorias descritas en la presente memoria.

El prospecto se refiere a las instrucciones que habitualmente se incluyen en los paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, las contraindicaciones y/o las advertencias relacionadas sobre el uso de dichos productos terapéuticos.

Además, el artículo de fabricación puede comprender adicionalmente un segundo envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (ABPI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitantes, sino que son medios ejemplares de uso de los métodos divulgados.

Materiales y métodos

Animales y manipulación de las células

Se inmunizaron ratones SJL (Jackson), de 8-16 semanas de edad, con péptido PLP 139-151 emulsionado en CFA. Se utilizó el kit comercial, EK-0122 (Hooke Laboratories) para este experimento de inmunización. Para algunos experimentos, los bazos se extrajeron 11 días después y se procesaron en una suspensión de células individuales. Para algunos experimentos, los esplenocitos se procesaron para análisis in vitro como se describe a continuación. Para los estudios de EAE, los ratones se inyectaron en los días 5, 9, 13 y 17 después de la inmunización con PLP con PBS, anticuerpo de control de isotipo (BioXcell) o clon anti-MCAM 17. La progresión de la enfermedad se controló diariamente y se calificó con un diseño ciego mediante técnicas convencionales. Los ratones se sacrificaron 35 días después de la inmunización con PLP, y se analizó la infiltración de células inmunitarias en el cerebro y la médula espinal.

Para el análisis de la unión de MCAM-Fc a tejidos con EAE, se inmunizaron ratones C57BL6 de 8-16 semanas de edad con glicoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG) 35-55 emulsionada en CFA. Se utilizó el kit comercial, EK-0111 (Hooke Laboratories) para este experimento de inmunización. Los animales inmunizados se sacrificaron en el punto máximo de la enfermedad. Los cerebros y las médulas espinales se congelaron instantáneamente en OCT (en medios de temperatura óptima de corte) y se analizaron mediante microscopía fluorescente como se describe a continuación.

Citometría de flujo I tinción y detección de marcadores I protocolos FACS

Las capas leucocitarias se obtuvieron de donantes humanos sanos (Stanford Blood Center, Palo Alto, CA) y las células T CD4 se enriquecieron negativamente utilizando RosetteSep (Stem Cell Technologies). En los casos indicados, las células T de memoria CD4+/CD45RO+ se purificaron negativamente mediante el uso de perlas magnéticas (Miltenyi Biotec). Las células T se sembraron (2 x 10⁵células/pocillo) en placas de 96 pocilios con fondo en U con recubrimiento de anti-CD3 (5 pg/ml, BD Pharmingen) en RPMI que contenía FCS inactivado por calor al 10% (HyClone Laboratories), penicilina, estreptomicina, L-glutamina, anti-IFNy (5 pg/ml; R&D Systems), anti-IL4 (0,5 pg/ml, R&D Systems) y anti-CD28 (2 pg/ml; BD Pharmingen) durante cinco días. En los casos indicados, se agregaron TGFp (2 ng/ml, a menos que se indique lo contrario), IL12, IL1 β y/o IL-23 (todos a 20 ng/ml). Todas las citoquinas se obtuvieron de R&D Systems. El análisis de las citoquinas intracelulares se realizó después de cinco horas en presencia de PMA (50 ng/ml) e ionomicina (500 ng/ml; ambas de Sigma-Aldrich) y GolgiStop (BD Pharmingen). La tinción superficial con anti-MCAM (Pharmingen) estuvo seguida de fijación, permeabilización y tinción con anti-IL-17A (Ebioscience), IL-22 (R&D Systems), CCL20 (R&D Systems) y/o FOXP3 usando un kit de tinción FOXP3 (Biolegend). En algunos experimentos, la sangre completa no manipulada se tiñó para la expresión en superficie con anti-CCR7, anti-CCR6, anti-integrina alfa 4, anti-integrina beta 7 o anti-integrina beta 1 (todas de BD Pharmingen).

G eneración / caracterización de anticuerpos

Para la generación de anticuerpos capaces de unirse a MCAM murina, se generó MCAM-Fc fusionando el dominio extracelular de MCAM murina a IgG humana y se produjo en células CHO usando técnicas convencionales. Se inmunizaron ratas Lou/M con 100 pg de proteína MCAM-Fc en CFA (volumen 1:1). Las ratas se reforzaron dos veces a intervalos de dos semanas con proteína MCAM-Fc en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (volumen 1:1). Se generaron hibridomas a partir de ratas inmunizadas utilizando protocolos convencionales y los clones fueron seleccionados por Clonepix. Se transfectaron células CHO con el gen MCAM murino de longitud completa y se seleccionaron para la expresión estable utilizando neomicina y técnicas convencionales. Las células CHO precursoras (MCAM negativas) se marcaron de manera fluorescente con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) usando técnicas convencionales y se mezclaron en una relación 1:1 con células CHO transfectadas con MCAM sin marcar. Los sobrenadantes de hibridoma se incubaron con esta mezcla de células durante 30 minutos y se detectó la unión de los anticuerpos específicos de MCAM potenciales con un anticuerpo secundario anti-rata marcado con fluorescencia (Jackson Immuno) mediante citometría de flujo.

Los sobrenadantes de hibridomas que se reconocieron positivos para anticuerpos específicos de MCAM se incubaron previamente con proteína MCAM-Fc de ratón marcada con fluorescencia (5 pg/ml) durante 30 minutos antes de la adición a la línea celular WM2664 que expresa laminina a4 y se determinó por citometría de flujo la neutralización de la unión de la proteína MCAM-Fc a la línea celular.

Para la generación de anticuerpos de rata capaces de unirse a MCAM humana, se generó hMCAM-Fc fusionando el dominio extracelular de MCAM humana a IgG humana y se produjo en células CHO usando técnicas convencionales. Se inmunizaron ratas Lou/M con 250 pg de proteína hMCAM-Fc en CFA (volumen 1:1). Las ratas se reforzaron dos veces a intervalos de dos semanas con proteína hMCAM-Fc en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (volumen 1:1). Se generaron hibridomas a partir de ratas inmunizadas utilizando protocolos convencionales y los clones fueron seleccionados por Clonepix. Las células CHO se transfectaron con el gen MCAM humano de longitud completa y se seleccionaron para la expresión estable utilizando neomicina y técnicas convencionales. Las células CHO precursoras (MCAM negativas) se marcaron de manera fluorescente con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) usando técnicas convencionales y se mezclaron en una relación 1:1 con células CHO transfectadas con MCAM humana sin marcar. Los sobrenadantes de hibridoma se incubaron con esta mezcla de células durante 30 minutos y se detectó la unión de los anticuerpos específicos de MCAM humana potenciales con un anticuerpo secundario anti-rata marcado con fluorescencia (Jackson Immuno) mediante citometría de flujo.

Para la generación de anticuerpos de ratón capaces de unirse a MCAM humana, se generó hMCAM-Fc fusionando el dominio extracelular de MCAM humana a IgG humana y se produjo en células CHO usando técnicas convencionales. Se inmunizaron ratones Balb/c con 50 pg de proteína hMCAM-Fc en CFA (volumen 1:1). Los ratones se reforzaron dos veces a intervalos de dos semanas con proteína hMCAM-Fc en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (volumen 1:1). Se generaron hibridomas a partir de ratones inmunizados utilizando protocolos convencionales y los clones fueron seleccionados por Clonepix. Las células CHO se transfectaron con el gen MCAM humano de longitud completa y se seleccionaron para la expresión estable utilizando neomicina y técnicas convencionales. Las células CHO precursoras (MCAM negativas) se marcaron de manera fluorescente con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) usando técnicas convencionales y se mezclaron en una relación 1:1 con células CHO transfectadas con MCAM humana sin marcar. Los sobrenadantes de hibridoma se incubaron con esta mezcla de células durante 30 minutos y se detectó la unión de los anticuerpos específicos de MCAM humana potenciales con un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con fluorescencia (Jackson Immuno) mediante citometría de flujo.

Los sobrenadantes de hibridomas que se reconocieron positivos para anticuerpos específicos de MCAM humana se incubaron previamente con proteína hMCAM-Fc de ratón marcada con fluorescencia (5 pg/ml) durante 30 minutos antes de la adición a la línea celular WM2664 que expresa laminina a4 y se determinó por citometría de flujo la neutralización de la unión de la proteína hMCAM-Fc a la línea celular.

M anipulación de ácido nucleico y proteínas

Para experimentos de micromatrices, se aislaron células T CD4+ humanas como se describe anteriormente, se tiñeron para CD161 y CCR6 (ambas de BD Pharmingen) y se clasificaron en células CD4+/CD161-/CCR6- (no-TH17) y CD4+/CD161+/CCR6+ (TH17) de tres donantes independientes sanos. El ARN se aisló de la mitad de las células de cada donante inmediatamente (circulantes) y la otra mitad se estimuló con un anti-CD3 unido a la placa y un anti-CD28 soluble como se describe anteriormente, en ausencia de citoquinas exógenas durante cuatro días (activado) antes del aislamiento del ARN. El ARN se amplificó (Nugen) y se hibridó en matriz Human U133 Plus 2.0 (Affymetrix). Todos los experimentos de micromatrices se realizaron en Expression Analysis, Inc. (Durham, NC). Para la determinación de las CDR, se aisló el ARN total de células de hibridoma usando el kit RNAquous-4PCR (Ambion), y se usó para la síntesis de ADNc. La primera y segunda cadena de ADNc se sintetizaron utilizando métodos modificados de la amplificación de ADNc de Marathón (Clontech) con el adaptador de ADNc ligado al extremo 5 'del ADNcdc obtenido. El cebador específico inverso se diseñó en función de la secuencia de la región constante del isotipo del anticuerpo específico para cadenas tanto pesadas como ligeras, y se usó junto con el cebador adaptador en la amplificación por PCR de los fragmentos tanto VL como VH utilizando la ADN polimerasa Pfu Ultra (Stratagene). El producto de PCR amplificado se clonó en pCR-Blunt-TOPO (Invitrogen) y se determinó la secuencia de nucleótidos. Se identificaron secuencias VL y VH idénticas (las del clon 17) a partir de al menos 3 de cada 5 clones individuales para cadenas tanto ligeras como pesadas.

Para la determinación de las concentraciones de IL-17 en el sobrenadante, se realizó ELISA utilizando un kit comercial (R&D Systems).

M icroscopía de fluorescencia / m étodos de inm unofluorescencia convencionales

Se congelaron instantáneamente tejidos de ratones en los que se indujo EAE en OCT y se seccionaron a 10 pM. Las secciones se fijaron en acetona fría y se tiñeron con anti-pan-laminina directamente conjugada (Novus Biologicals), MCAM-Fc, anti-CD31 (BD Pharmingen) o anti-laminina a4 (Novus biological). En algunos experimentos, MCAM-Fc se incubó previamente con anticuerpos anti-MCAM antes de la adición a los tejidos para establecer la neutralización de la unión de MCAM a su ligando en los tejidos.

Experim ento de polarización en ratón

Se aislaron esplenocitos de ratones inmunizados con PLP en CFA durante 11 días y se cultivaron en presencia de PLP (5 pg/ml, Hooke Laboratories). En los casos indicados, se agregaron TGFp humano (5 ng/ml) y/o IL-23 murina (20 ng/ml), e IL-1 p murina (20 ng/ml) durante cinco días en RPMI que contenía FCS inactivado por calor al 10% (HyClone Laboratories), penicilina, estreptomicina, L-glutamina, anti-IFNY (5 pg/ml; R&D Systems), anti-IL4 (0,5 pg/ml, R&D Systems) y p-ME (50 pM). Todas las citoquinas eran de R&D Systems. Las células se tiñeron con anti-CD4, anti-NK1.1 (ambos de BD Pharmingen) y se generó anti-MCAM como se describe anteriormente.

Ejemplo 1. MCAM es un gen regulado al alza en células T CD4+ humanas productoras de IL-17

Para identificar nuevas moléculas dirigibles asociadas con la infiltración de células TH17 del SNC, se enriquecieron células T CD4+ humanas de tres donantes sanos mediante selección negativa magnética como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. Después de teñir las células T CD4+ humanas enriquecidas para la expresión superficial de CD161 y CCR6, las células se clasificaron por FACS en dos poblaciones: CCR6-/CD161- (que representan células no TH17 circulantes) y CCR6+/CD161+ (que representan células TH17 circulantes) como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. El ARN se aisló inmediatamente de la mitad de las células en cada población como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. La otra mitad se puso en cultivo con anti-CD3 unido a la placa y anti-CD28 soluble, sin citoquinas exógenas, durante cuatro días para obtener células no TH17 activadas y células TH17 activadas, respectivamente. De manera similar, se aisló ARN a partir de estos dos tipos de células activadas. El ARN se sometió a un análisis de micromatrices como se describe en Materiales y métodos anteriormente para identificar genes expresados específicamente en células TH17.

Como se muestra en la FIG. 1A, RORYt, un conocido factor de transcripción de TH17, se encontraba regulado al alza tanto en células TH17 circulantes como activadas, mientras que IL-17, como marcador de TH17 activadas, se expresaba casi exclusivamente en la población TH17 activada. Estos resultados indican que fueron exitosos los procedimientos anteriores de separación y activación. El análisis de micromatrices identificó MCAM como un gen regulado al alza en células TH17 tanto circulantes como activadas, un perfil similar al de RORYt (FIG. 1A).

Las células T que expresan MCAM se han descrito previamente como células que tienen una expresión enriquecida entre los clones de células T generados a partir de pacientes con esclerosis múltiple, y son particularmente predominantes en los sitios de inflamación. Véase, por ejemplo, Brucklacher-Waldert et al., Brian 132: 3329-3341 (2009); véase también Pickl et al., J. Immunol. 158: 2107-2115 (1997). En el presente documento, se encontró que la proteína MCAM estaba presente en la superficie de una pequeña población de células T CD4+ (típicamente 3-5% de donantes sanos). También se encontró que la proteína MCAM existe casi completamente dentro de la población de células T de memoria CD45RO+ (Figura 1B). Las células T CD4+ humanas se aislaron como se describe anteriormente, y se estimularon durante cuatro horas con acetato de miristato forbol (PMA)/ionomicina. Las células T CD4+ estimuladas se analizaron para determinar los niveles intracelulares de IL-17 y MCAM de superficie como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. Como se muestra en la FIG. 1C, aunque la mayoría de las células T que producen IL-17 en estas condiciones eran MCAM negativas, la proteína MCAM se enriqueció en células productoras de IL-17. Solo el 2,3% de las células MCAM negativas (2,18%/(2,18% 92,62%)) se tiñeron de forma positiva para IL-17; mientras que el 11,9% de las células que expresaban MCAM (0,62%/(0,62% 4,58%) eran positivas para IL-17. Dados estos datos, la MCAM está enriquecida en células T CD4+ humanas productoras de IL-17. Además, cuando las células T de memoria CD4+/CD45RO+ se separaron en poblaciones purificadas de células MCAM positivas y MCAM negativas y se estimularon in vitro con anti-CD3 y anti-CD28, la población MCAM positiva produjo casi diez veces más IL-17 (datos no mostrados). La mayor parte de la producción potencial de IL-17 se encontró que era de la pequeña población de células T que expresan MCAM. En un donante, solo la población MCAM positiva produjo niveles detectables de IL-17. Por lo tanto, la mayoría de la producción potencial de IL-17 es de la pequeña población de células T que expresan MCAM.

Ejemplo 2. Las células T que expresan MCAM son células T de memoria efectoras que tienen un perfil de expresión de integrina único

La población de memoria CD45RO+ de las células T CD4 humanas se puede dividir en (1) células de memoria efectoras con tropismo tisular y (2) células de memoria centrales con localización tisular linfoide basada en la expresión de CCR7. Véase, por ejemplo, Sallusto et al., Nature 401: 708-712 (1999).

Para determinar qué subpoblación incluye las células T que expresan MCAM, la expresión de MCAM en las células T se caracterizó adicionalmente por la tinción de células T humanas periféricas con varios marcadores (CCR6 , CCR7, subunidades alfa 4, beta 1 y beta 7 de integrina) como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. Las células T CD4+ que expresaban MCAM eran en gran medida CCR7 negativas, lo que indica que la mayoría son células T de memoria efectoras, y sería más probable que se alojaran en tejidos (FIG. 2A). El protocolo de enriquecimiento TH17 sugirió que las células T que expresan MCAM obtenidas serían desproporcionadamente CCR6+. Como se muestra en la FIG. 2A, aproximadamente el 64% de las células MCAM+ (2,8%/(2,8% 1,6%)) expresan CCR6 , mientras que solo el 16,1% de las células MCAM negativas (15,4%/(15,4% 80%) expresan CCr6 (FIG. 2A). Estos datos sugieren que las células MCAM positivas serían en gran parte trópicas para áreas donde el ligando para CCR6 , CCL20, es alto. Véase, por ejemplo, Liao et al., J. Immunol. 162: 186-194 (1999).

Se caracterizó adicionalmente el patrón de expresión de integrina de células T que expresan MCAM. La mayoría de las células T que expresan MCAM son positivas para la integrina a4, pero en su mayoría son negativas para la integrina p7 y positivas para p1 (FIG. 2B), que es un fenotipo asociado con las células T involucradas en la patogénesis de la EAE (encefalomielitis autoinmunitaria experimental). Véase, por ejemplo, Bauer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 106: 1920-1925 (2009).

Ejemplo 3. Las células T que expresan MCAM se incrementan por IL1p y producen la mayoría tanto de IL-17 como de IL-22 en afecciones por TH17

Las células T CD4+ que expresan MCAM, en solo el 3-5% de las células, es una pequeña minoría de la población de células T. Es de interés determinar las condiciones en las que esta población se incrementa y ejerce la función efectora de TH17. Para esto, se purificaron células T CD4+/CD45RO+ humanas como se describe en Materiales y Métodos anteriormente y se estimularon in vitro con anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de varias condiciones de citoquinas (TGFp, IL-12, IL-1 p, IL-23, y varias combinaciones), y se determinó mediante citometría de flujo el porcentaje de células que expresan MCAm , así como células que expresan IL-17 (FIG. 3A). La expresión de MCAM se incrementó tras la estimulación con IL-1 p sola (16,4% en ausencia de IL-1 p frente al 38,1% en presencia de IL-1p, FIG. 3B). Además, aunque el TGFp solo no incrementó la población MCAM positiva en gran medida, funcionó de manera sinérgica con IL-1 p, ya que la combinación de ambas citoquinas dio como resultado que más de la mitad de la población de células T de memoria se volviera MCAM positiva. En las mismas condiciones que incrementaron la población de células que expresaban MCAM, la población de células productoras de IL-17 aumentó de forma concomitante, con un enriquecimiento considerable dentro de la población MCAM+ en todas las condiciones de citoquinas analizadas (FIG. 3C). De hecho, en presencia de TGFp e IL-1 p, más del 80% de las células productoras de IL-17 (20,2%/(20,2% 4,4%)) fueron MCAM positivas.

Además de IL-17, la citoquina IL-22 asociada a TH17 conocida (Liang et al., J. Exp. Med. 203: 2271-2279 (2006)) también se elevó en las células T que expresan MCAM. El receptor de IL-22 se expresa en gran parte en células no inmunitarias tales como las células epiteliales y funciona en las respuestas antimicrobianas, así como en la remodelación de tejidos. Véase, por ejemplo, Dumoutier et al., J. Immunol. 167: 3545-3549 (2001); véase también Zenewicz et al., Int. Immunol. 23: 159-163 (2011). Aunque se ha demostrado que la IL-22 está involucrada en la función de la barrera hematoencefálica, no es absolutamente necesaria para la inducción o progresión de EAE. Véase, por ejemplo, Kreymborg et al., J. Immunol. 179: 8098-8104 (2007); véase también Kebir et al., Nat. Med. 13: 1173-1175 (2007). De manera similar a la IL-17, un porcentaje significativamente mayor de células MCAM+ expresaron IL-22 (FIG. 3D).

También se ha indicado que las células TH17 expresan CCL20. Véase, por ejemplo, Hirota et al., J. Exp. Med. 204: 2803-2812 (2007). De forma similar a IL-17 e IL-22, hubo una población considerablemente mayor de células T que expresan MCAM que fueron positivas para CCL20 (FIG. 3E), sugiriendo un posible bucle de retroalimentación positiva en la migración de células T CCR6+.

Si bien los datos anteriores sugieren una población de células T con un fenotipo particularmente patógeno, fue inesperado observar que la expresión de MCAM no era mutuamente exclusiva con FOXP3 intracelular y, de hecho, un porcentaje ligeramente mayor de células T MCAM+ eran FOXP3 positivas (FIG. 3F). En presencia de dosis crecientes de TGFp, el porcentaje de células MCAM+ que eran FOXP3+ aumentó, mientras que el porcentaje de células que expresan FOXP3 en la población de MCAM- se mantuvo prácticamente sin cambios. Estos resultados sugieren que las células que expresan MCAM tienen el potencial de funcionar en un papel inmunorregulador en presencia de TGFp.

Ejemplo 4. MCAM se une a la MEC en sitios conocidos de infiltración de células T del SNC, y el ligando de MCAM es laminina 411

La función de MCAM se ha dilucidado en modelos de tumores, lo que demuestra que la expresión de MCAM confiere un fenotipo adhesivo, infiltrante y, en última instancia, metastásico a las células tumorales. Véase, por ejemplo, Xie et al., Cancer Res. 57: 2295-2303 (1997). Sin embargo, queda por identificar el ligando que se une a MCAM. Aunque los datos anteriores indican que la MCAM está enriquecida en células TH17, no se sabe si la MCAM está involucrada funcionalmente en la infiltración de células T del SNC. Por lo tanto, fue de gran interés determinar (1) dónde se une la MCAM, es decir, la identidad del ligando de MCAM, (2) si la MCAM es crítica para la infiltración inicial de células TH17 en el cerebro no inflamado y (3) si la expresión del ligando de MCAM se requiere en los puntos de entrada del SNC establecidos.

Se generó una proteína de fusión MCAM-Fc (como se describe en Materiales y Métodos anteriormente) para detectar la unión de MCAM en tejido de ratón sano, particularmente aquellas regiones que se sabe están involucradas en la infiltración de células T. Como se ha sugerido el plexo coroideo como una ruta de entrada para las células TH17 en el cerebro no inflamado, se tiñó el tejido del plexo coroideo sano con MCAM-Fc y anti-laminina. Como se muestra en las FIG. 4A y 4B, el plexo coroideo expresa ampliamente el ligando de MCAM, pero es negativo para MCAM. Estos resultados sugieren fuertemente que (1) hay poca probabilidad de que MCAM medie la adhesión al tejido del plexo coroideo a través de una interacción homotípica MCAM/MCAM; y (2) hay un ligando de MCAM adicional con una expresión considerablemente más extendida que la MCAM, cuya expresión se limitó al endotelio vascular en tejidos sanos (FIG. 4C). Fue inesperado que MCAM-Fc se uniera de forma casi ubicua a la médula espinal del ratón sano (FIG. 4D) en un patrón que sugería una proteína de matriz extracelular (MEC), y específicamente laminina. MCAM-Fc y anti-laminina se localizan conjuntamente en la médula espinal del ratón sano (FIG. 4E), sugiriendo que el ligando para MCAM podría ser una forma de laminina. Se confirmó que el ligando de MCAM estaba en la MEC, ya que era exterior a la capa de células endoteliales dentro del sistema vascular, según se determinó mediante tinción conjunta con CD31 (FIG. 4F).

Mientras que MCAM se localiza conjuntamente con laminina en tejidos de ratones sanos, la identidad del ligando de MCAM se confirmó adicionalmente mediante la tinción conjunta de tejidos de EAE con laminina y MCAM-Fc. En regiones de infiltración de linfocitos, se ha encontrado que la membrana basal se separa en dos membranas distintas, la membrana basal endotelial y la membrana basal parenquimatosa con importantes distinciones en la composición de isoformas de laminina. Véase, por ejemplo, Sixt et al., J. Cell Biol. 153: 933-945 (2001). Cuando se usó MCAM-Fc para teñir el ligando de MCAM dentro de estas regiones, se encontró que MCAM-Fc tiñó solo la membrana basal endotelial, mientras que la pan-laminina tiñó tanto la membrana basal endotelial como la membrana basal parenquimatosa (FIG. 4G). Este mismo patrón de expresión se ha observado para la laminina 411 (laminina 8 (a4p1Y1)). La localización conjunta de la proteína MCAM-Fc y la laminina alfa 4 se observó utilizando un anticuerpo específico para la laminina alfa 4 (FIG. 4H), sugiriendo que la laminina 411 es un ligando para MCAM. La confirmación de que una molécula de laminina que comprende una cadena alfa 4 es el ligando para MCAM y que puede contribuir a la capacidad migratoria única de las células TH17 se describe por Flanagan et al., PLoS ONE 7(7): e40443. doi:10.1371/journal.pone.0040443 (2012).

Ejemplo 5. Los anticuerpos anti-MCAM bloquean la unión de MCAM a la laminina 411

Se generaron anticuerpos monoclonales contra MCAM de ratón como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. La unión específica entre el anticuerpo monoclonal y la MCAM se confirmó evaluando la capacidad del anticuerpo monoclonal para unirse a las células transfectadas con MCAM tanto de ratón como humana. Para esto, las células no transfectadas se marcaron con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) y se mezclaron con células transfectadas con MCAM sin marcar. Por lo tanto, podrían diferenciarse las células no transfectadas (en azul). Como se muestra en la FIG. 5A, los clones 15 y 17 mostraron una unión específica a MCAM de ratón (superior, naranja), mientras que solo el clon 17 se unió a MCAM humana (inferior, naranja).

A continuación, los anticuerpos monoclonales se usaron para probar su capacidad para bloquear la unión de MCAM a su ligando. Se incubó proteína MCAM-Fc murina o humana (5 pg/ml), previamente, con un anticuerpo de control de isotipo, clon 15 o clon 17 (10 pg/ml) durante 30 minutos en PBS. La mezcla se añadió a secciones de tejido de la médula espinal sanas y posteriormente se caracterizó por microscopía de fluorescencia como se describe en Materiales y Métodos anteriormente.

Como se muestra en la FIG. 5B, ambos clones 15 y 17 podrían bloquear la unión de la proteína MCAM-Fc murina al tejido, mientras que solo el clon 17 podría bloquear la unión de la proteína MCAM-Fc humana al tejido. Las CDR del clon 17 se han secuenciado y se presentan en las Fig. 6A (SEQ ID NO:2, cadena ligera) y 6B (SEQ ID NO:7, cadena pesada). El análisis de transferencia Western no desnaturalizante utilizando el clon 17 en dominios Fc individuales de MCAM confirmó que el clon 17 se une específicamente a un dominio que comprende los restos de aminoácidos 19 a 129 de MCAM. Esta unión se confirmó por análisis ForteBio.

Además, se demostró que los anticuerpos monoclonales de MCAM inhiben la interacción entre MCAM y su ligando, laminina 411. Las células CHO precursoras (CHOK1) o las células CHO transfectadas con el gen MCAM de ratón se incubaron previamente con medios de cultivo CHO (DMEM), laminina 411 recombinante (10 pg/ml) o laminina 511 recombinante (es decir, laminina 10 (a5p1Y1)) (10 |jg/ml) a 37 °C durante 45 minutos. Las células se lavaron y se detectó la unión específica de la laminina 411, pero no de la laminina 511, a MCAM con un anticuerpo pan-laminina por citometría de flujo (FIG. 5C, panel superior derecho). La preincubación de células CHO transfectadas con MCAM de ratón con el anticuerpo anti-MCAM (clon 15 o clon 17, cada uno a 20 jg/ml), antes de la incubación con laminina, suprimió la unión de MCAM a laminina 411 (FIG. 5C, paneles inferiores).

Los datos presentados anteriormente sugieren que el clon 17, que es capaz de bloquear específicamente la unión de MCAM humana a su ligando, podría ser útil para prevenir o tratar diversas enfermedades mediadas por TH17 mediante la inhibición de la adhesión mediada por MCAM de células TH17 al sistema vascular y el bloqueo de la migración de células TH17 al sistema nervioso central.

Ejemplo 6. MCAM no se expresa en células T de ratón circulantes, pero se induce después de la polarización de TH17

Usando los anticuerpos anteriores, se tiñó sangre periférica de ratón para detectar células T que expresan MCAM en ratones como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. Como se describió anteriormente, las células T de ratón carecen de expresión de MCAM, mientras que se observa la expresión en una población de células NK (FIG.

7A). La expresión de MCAM únicamente en células T de memoria en seres humanos sugiere que los ratones, si viven en un ambiente limpio con una activación de células T previa limitada, tendrían que estar polarizados para generar una población de células T que expresen MCAM. Considerando el vínculo entre las células MCAM y TH17 en seres humanos, se realizaron experimentos para determinar si era posible inducir una población de células T que expresaran MCAM en ratones. Se generaron células T específicas de la proteína proteolipídica de la mielina (PLP) inmunizando ratones de tipo silvestre con PLP en presencia de adyuvante completo de Freund (CFA) como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. Los esplenocitos se reestimularon in vitro con 5 jg/ml de PLP en presencia de las citoquinas indicadas y se analizaron cinco días después para determinar la expresión de MCAM (FIG. 7B). En ausencia de citoquinas exógenas, la reestimulación no indujo una expresión de MCAM estadísticamente significativa en las células CD4+ (en comparación con isotipos control). En presencia de IL-23, fue detectable una pequeña población de células T CD4+ que expresaban MCAM. Aunque el TGFp solo no indujo una población considerable de células T que expresan MCAM, la combinación de TGFp e IL-23 generó sinérgicamente la expresión de MCAM entre las células T CD4+. Estas dos citoquinas tienen un papel importante en la función de polarización y efectora de las células TH17 de ratón. Cabe destacar que MCAM se expresó en una población de células T de alta expresión de CD4 que se ha descrito que contienen exclusivamente las células T patógenas en EAE. Véase, por ejemplo, Li et al., J. Neuroimmunol. 192: 57-67 (2007). Por lo tanto, a diferencia de los seres humanos, los ratones no poseen una población de células T CD4+MCAM+ circulantes, pero la polarización en condiciones de TH17 con TGFp e IL-23 es suficiente para generar dicha población. Los ratones siguen siendo un modelo viable para estudiar el papel de la MCAM en la infiltración del SNC por las células T patógenas.

Ejemplo 7. El bloqueo de MCAM por un anticuerpo anti-MCAM inhibe la progresión de la enfermedad EAE La EAE es una enfermedad que se genera en animales de laboratorio para producir síntomas similares a los de la esclerosis múltiple (EM) en seres humanos. La EAE generalmente se produce inyectando a los animales diferentes proteínas del sistema nervioso central de otros animales, por ejemplo, extractos de proteína básica de mielina y tejido completo de la médula espinal o cerebro, o células T que reaccionan específicamente a la mielina. La EAE se usa comúnmente para seguir la evolución de las formas de EM recurrente o progresiva. La EAE ha servido como un modelo animal adecuado tanto para desarrollar agentes terapéuticos para la EM como para estudiar los procesos de la enfermedad específicos de la EM. Véase, por ejemplo, Gold et al., Brain 129: 1953-1971 (2006); véase también Steinman et al., Ann. Neurol. 60: 12-21 (2006).

Los efectos del bloqueo de MCAM sobre la progresión de la enfermedad se examinaron adicionalmente en un modelo terapéutico de EAE, en el que la polarización de TH17 se produce in vivo (véase el Ejemplo 6). Los ratones se inmunizaron con péptido PLP 139-151 como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. Los ratones inmunizados se asignaron al azar en grupos según las puntuaciones clínicas y el día de inicio. El segundo día después del inicio de la enfermedad (los síntomas de la EAE aparecieron entre 12 y 14 días después de la inmunización), los ratones se trataron (N = 15 por grupo) por vía intraperitoneal con anticuerpo anti-MCAM (clon 15) o control de isotipo (Bioxcell) a 10 mg/kg de peso corporal, y todos los días a partir de entonces. Los ratones se controlaron diariamente y se puntuaron con un diseño ciego (FIG. 8A), y se obtuvieron los pesos corporales cada 2-3 días (FIG. 8B). Si bien el bloqueo de MCAM no parece afectar a la gravedad o la duración de la fase aguda en curso de la enfermedad, la recaída se retrasó y fue significativamente menos grave en ratones tratados con anticuerpo anti-MCAM (clon 15). Estos resultados son consistentes con la idea de que MCAM puede no ser esencial para la infiltración de células inmunitarias durante un proceso inflamatorio existente, pero puede estar involucrada en el reclutamiento posterior de células T pioneras experimentadas con antígeno para iniciar nuevos sitios inflamatorios.

Ejemplo 8. Prueba de unión de dominio para anticuerpos anti-MCAM murinos

Se utilizó el siguiente protocolo: Protocolo de mapeo de dominios ForteBio. Se utilizaron biosensores ForteBio de Fc anti-IgG humana para inmovilizar varios dominios MCAMhFc de ratón, incluida la proteína MCAMhFc de ratón de longitud completa, sobre la superficie del biosensor. Estos sensores se sumergieron en el anticuerpo específico de MCAM clon 15 o 17 para la detección de la unión a estos dominios o proteína de longitud completa. Después de cargar estas muestras en una placa negra de 96 pocillos, la Octet Red se programó de la siguiente manera: 60 segundos para el valor inicial número 1; 180 segundos para cargar varios dominios; 60 segundos para el valor inicial número 2; 180 segundos para la asociación del anticuerpo al dominio; y 240 segundos para la disociación del anticuerpo del dominio.

Reactivos y suministros utilizados:

1. MCAMhFc de ratón a una concentración final de 5 ug/ml

2. clon 15 o 17 del anticuerpo a 5 ug/ml

3. Biosensores de captura de Fc anti-IgG humana (AHC) de ForteBio para experimentos cinéticos, n.° de cat. 18 5060

4. Bloque de placa de 96 pocillos de Greiner Bio-one, n.° de cat. 655209

5. Máquina Octet Red de ForteBio

6. Medio de cultivo de tejido fresco, DMEM con FCS al 20%, utilizado como tampón de dilución

La Fig. 10A demuestra que el clon 15 se une específicamente a los dominios Fc 1 y 2 de MCAM, pero no al dominio Fc 1 solo. La Fig. 10B demuestra que el clon 17 se une específicamente a los dominios Fc 1 y 2 de MCAM, o al dominio Fc 1 solo. Para las FIG. 10A-B, los clones 15 y 17 se probaron contra las siguientes muestras de proteínas (todas tienen etiqueta para Fc de IgG humana):

MCAM murina; proteína Fc humana de longitud completa; dominio 1 de MCAM murina (Ig1); dominio 2 de MCAM murina (Ig2); y dominio 1 y 2 de MCAM murina (Ig1-2A).

Ejemplo 9. Los dominios MCAM se unen a la cadena A4 (a4) de laminina

La afinidad de unión de la laminina a4 humana a IgG1-2A de MCAM humana se midió por Resonancia de Plasmón de Superficie en una máquina Biacore T200. Se inmovilizó IgG de F (ab')²específica de Fc humana (Jackson Laboratories) en un chip CM5 utilizando acoplamiento de amina. Las cuatro celdas de flujo de la superficie de dextrano de chips CM5 se activan mediante una inyección de 7 minutos de NHS:DEC 1:150 mM recién preparado a una velocidad de flujo de 5 pl/min. Se inyectaron 70 pl de solución de IgG (pH 4,5) durante 3 minutos a una densidad de hasta 3000 UR. A continuación, el acoplamiento se bloquea mediante una inyección de etanolamina 1 M durante 7 minutos para desactivar los sitios reactivos residuales. La IgG1-2A de MCAM etiquetada con Fc humana recombinante en tampón HBS-P desgasificado y filtrado que contiene 12 mg/ml de BSA y 12 mg/ml de sal sódica de dextrano carboximetilada se capturó mediante IgG anti-Fc a un nivel de captura de 1560 UR. La IgG1-2A de MCAM etiquetada con Fc humana recombinante se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 min a 4 °C antes de la inyección durante 20 min a caudal de 5 pl/min sobre la superficie que contiene IgG anti-Fc. La celda de flujo 1 se dejó libre de IgG para servir como superficie de control. Se usó una celda de flujo para capturar Fc de IgG1 (I&D Systems) humana recombinante para servir como control negativo. La laminina a4 humana recombinante (R&D Systems) o la laminina 411 humana recombinante (Biolamina) o la laminina 511 humana recombinante (Biolamina) (control negativo) se diluyó en tampón de HBS-P desgasificado y filtrado que contenía 12 mg/ml de BSA y 12 mg/ml de sal sódica de dextrano carboximetilada a concentraciones que abarcan de 5 a 175 nM e inyectó (asociación de 1 min, disociación de 3 min) sobre las superficies de IgG1-2A de MCAM y sobre las superficies de control a un caudal de 10 pl/min. Las inyecciones de tampón sirvieron como control negativo. Evaluación de los datos: los datos de las inyecciones de tampón y la superficie de control se restaron para eliminar los artefactos. Los datos se ajustaron globalmente a un modelo de interacción 1:1 utilizando el software Biaevaluation o Scrubber.

Se encontró que la cadena a-4 de laminina se unía específicamente a los dominios Fc 1 y 2 de MCAM, pero no al dominio Fc 1 solo (datos no mostrados). Los controles negativos incluyeron: una falta de unión de la laminina 511 a cualquiera de los dominios y una falta de unión de la laminina 411 a hIgG1-Fc. La laminina-a4 recombinante humana (R&D Systems) se une a la IgG1-2A de MCAM humana etiquetada con Fc (datos no mostrados) a una afinidad de 60 nM, pero no a Fc de IgG1 humana recombinante (R&D Systems) (datos no mostrados). La laminina 411 humana recombinante (Biolamina) se une a IgG1-2A de MCAM humana etiquetada con Fc a una afinidad de 66 nM según lo medido por cinética de estado estacionario (datos no mostrados) pero no a Fc de IgG1 humana recombinante (R&D Systems) (datos no mostrados). El control negativo, la laminina 511 humana recombinante (Biolamina) no se une a IgG1-2A de MCAM humana etiquetada con Fc (datos no mostrados).

Ejemplo 10. Generación de nuevos anticuerpos monoclonales anti-MCAM.

Se generaron anticuerpos monoclonales de ratón y rata dirigidos contra la proteína MCAM humana como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. La unión específica entre el anticuerpo monoclonal y MCAM humana se confirmó evaluando la capacidad del anticuerpo monoclonal para unirse a las células transfectadas con MCAM humana. Para esto, las células no transfectadas se marcaron con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) y se mezclaron con células transfectadas con MCAM humana sin marcar. Por lo tanto, podrían diferenciarse las células no transfectadas.

Usando estas técnicas, se aislaron 823 clones de fusiones de ratón independientes y se mostró que expresaban un anticuerpo capaz de unirse a MCAM humana. Además, se aislaron 152 clones de fusiones de rata independientes y se demostró que expresaban un anticuerpo capaz de unirse a MCAM humana.

A continuación, los anticuerpos monoclonales anti-MCAM humana se usaron para probar su capacidad para bloquear la unión de MCAM humana a su ligando. Se incubó proteína MCAM-Fc humana (5 pg/ml), previamente, con un anticuerpo de control de isotipo, o 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal de prueba durante 30 minutos en PBS. La mezcla se añadió a secciones de tejido de la médula espinal sanas y posteriormente se caracterizó por microscopía de fluorescencia como se describe en Materiales y Métodos anteriormente. Además, las células CHO precursoras (CHOK1) o las células CHO transfectadas con un gen MCAM humano se incubaron previamente con medios de cultivo CHO (DMEM), laminina 411 recombinante (10 pg/ml) o laminina 511 recombinante (es decir, laminina 10 (a5p1Y1)) (10 pg/ml) a 37 °C durante 45 minutos. Las células se lavaron y se detectó la unión específica de la laminina 411, pero no de la laminina 511, a MCAM con un anticuerpo pan-laminina por citometría de flujo. La preincubación de células CHO transfectadas con MCAM humana con el anticuerpo anti-MCAM (a 20 pg/ml), antes de la incubación con laminina, suprimió la unión de MCAM humana a laminina 411.

Utilizando esta técnica, se demostró que 87 de los 823 clones de fusión de ratón independientes y 26 de los 152 clones de fusión de rata independientes descritos anteriormente expresaban un anticuerpo que era capaz de bloquear la interacción entre la proteína MCAM humana y su ligando, cadena a-4 de laminina.

Ejemplo 11. Caracterización adicional de nuevos anticuerpos monoclonales anti-MCAM.

Los 87 clones de fusión de ratón independientes y los 26 clones de fusión de rata independientes descritos en el Ejemplo 10 anterior como capaces de (i) unirse a MCAM humana, y (ii) bloquear la interacción entre MCAM humana y la cadena a-4 de laminina se caracterizaron adicionalmente como sigue. En primer lugar, la cuantificación de la CI50 de la capacidad del anticuerpo monoclonal para bloquear la unión de MCAM humana a la cadena a-4 de laminina se determinó de la siguiente manera. Se incubaron células CHO que expresan MCAM humana con un anticuerpo anti-MCAM humana (a diversas concentraciones) durante 30 minutos a 4 grados centígrados. El anticuerpo no unido se eliminó por lavado y las células se incubaron con laminina 411 humana recombinante a 20 ug/ml durante 45 minutos a 37 grados centígrados. La laminina no unida se eliminó por lavado y la laminina unida a la superficie de las células se detectó con anticuerpos anti-laminina marcados con fluorescencia. Después del lavado, la cantidad de laminina unida a la superficie se detectó mediante citometría de flujo, y las IC50 se calcularon en función de la intensidad fluorescente media.

Usando el ensayo descrito anteriormente, se identificaron seis clones de anticuerpos monoclonales anti-MCAM humana que se unen a MCAM humana y que tienen la mayor capacidad para bloquear la interacción entre MCAM humana expresada en la superficie de las células y su ligando de unión, la laminina 411 humana. Estos seis clones de anticuerpos monoclonales anti-MCAM se denominan en el presente documento (i) los clones de anticuerpos monoclonales anti-MCAM humana de ratón 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1 y 1749.1.3, y (ii) los clones de anticuerpos monoclonales anti-MCAM humana de rata 2120.4.19 y 2107.4.10. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de las cadenas pesada y ligera de estos anticuerpos se proporcionan en las Fig. 13-24. Más específicamente, en el ensayo anterior, se determinó que las CI50 para los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 1749.1.3, 2120.4.19 y 2107.4.10 eran 0,469 ug/ml, 0,431 ug/ml, 0,307 ug/ml, 0,545 ug/ml, 0,888 ug/ml y 0,290 ug/ml, respectivamente. Además, los experimentos realizados para determinar la afinidad de unión específica de cada anticuerpo monoclonal demostraron que cada uno era capaz de unirse a la proteína MCAM humana con alta afinidad (datos no mostrados). Como tal, cada uno de estos anticuerpos monoclonales específicos fue muy capaz de unirse a MCAM humana e inhibir la interacción de la MCAM humana expresada en células con su ligando de unión de laminina a-4. En contraste, dos anticuerpos control, un anticuerpo IgG1 humano no específico y un anticuerpo anti-MCAM completamente humano descrito previamente denominado ABX-MA1 (por ejemplo, véase Mills et al., Cancer Res. 62:5106 (2002), y las patentes de Estados Unidos Números 6.924.360, 7.067.131 y 7.090.844) fueron incapaces de bloquear la interacción de unión entre MCAM humana y su homólogo laminina 411. Como tal, los seis anticuerpos monoclonales específicos identificados anteriormente poseen la capacidad novedosa de (i) unirse con alta afinidad a MCAM humana en la superficie de las células vivas, y (ii) bloquear la interacción de MCAM humana expresada en células con una proteína laminina que comprende una cadena polipeptídica de a-4 de laminina.

Ejemplo 12. Análisis de unión de dominio para nuevos anticuerpos monoclonales anti-MCAM.

La técnica descrita en el Ejemplo 8 anterior se empleó para determinar la ubicación del epítopo del antígeno en la proteína MCAM humana que se reconoce y se une por clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 1749.1.3, 2120.4.19 y 2107.4.10. Los resultados de estos análisis son los siguientes.

Se mostró que todos los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1 y 1749.1.3 se unen a un epítopo antigénico encontrado en el dominio 3 de la proteína MCAM humana, definido específicamente por los aminoácidos 244-321 (SEQ ID NO:24) de la proteína MCAM humana. Estos anticuerpos monoclonales no fueron capaces de unirse al dominio 1 de MCAM humana (concretamente, los aminoácidos 19-129, SEQ ID NO:22), el dominio 2 (concretamente, los aminoácidos 139-242, SEQ ID NO:23), o la combinación de dominios 1 y 2 (concretamente, los aminoácidos 19-242). Por lo tanto, los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1 y 1749.1.3 definen un nuevo epítopo antigénico localizado dentro del dominio 3 de la proteína MCAM humana.

Los clones de anticuerpos monoclonales 2120.4.19 y 2107.4.10 mostraron que cada uno se unía a un epítopo antigénico definido por la combinación de dominios 1 de MCAM humana (concretamente, los aminoácidos 19-129, SEQ ID NO:22) y dominio 2 (concretamente, aminoácidos 139-242, SEQ ID NO:23). Ninguno de estos dos anticuerpos monoclonales se unió al dominio 1 de MCAM humana por sí mismo. Por lo tanto, los clones de anticuerpos monoclonales 2120.4.19 y 2107.4.10 definen un nuevo epítopo antigénico determinado por la presencia de ambos dominios 1 y 2 de proteína MCAM humana.

En contraste con lo anterior, el anticuerpo ABX-MA1 anti-MCAM completamente humano descrito previamente se une a un epítopo antigénico diferente de los descritos anteriormente, concretamente, un epítopo antigénico que está completamente definido y abarcado solo dentro del dominio 1 de MCAM humana.

Dados estos resultados, como cada uno de los clones de anticuerpos monoclonales 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 1749.1.3, 2120.4.19 y 2107.4.10 son capaces de tanto (i) unirse a la MCAM humana, como (ii) bloquear la interacción entre la MCAM humana y una proteína que contiene laminina a-4, mientras que el anticuerpo ABX-MA1 es capaz de unirse solo a la MCAM humana, pero no bloquea la interacción entre la MCAM humana y una proteína que contiene laminina a-4, estos resultados demuestran que el dominio 2 de MCAM humana, el dominio 3 de MCAM humana y la combinación de los mismos desempeñan un papel en la interacción de unión con la cadena a-4 de laminina. Dado esto, está claro que los anticuerpos que se unen al dominio 2 de MCAM humana, dominio 3 de MCAM humana y/o la combinación de los mismos encontrarían utilidad como agentes capaces de bloquear la interacción entre la MCAM humana y la laminina a-4 y, por lo tanto, encontrarían utilidad para inhibir las diversas consecuencias descritas en el presente documento como resultado de esa interacción. En contraste, los anticuerpos que se unen a un epítopo antigénico definido únicamente por el dominio 1 de MCAM humana (tal como el anticuerpo ABX-MA1 descrito en el presente documento) no son útiles para bloquear la interacción MCAM/laminina a-4 y sus diversas consecuencias biológicas posteriores.

Ejemplo 13. Generación de anticuerpos anti-MCAM humanizados.

Se generaron varios anticuerpos anti-MCAM humanizados según el siguiente protocolo. Primero, se construyó un modelo molecular tridimensional de las regiones variables usando el algoritmo patentado de JN Biosciences. En segundo lugar, se identificaron los restos de aminoácidos del marco importantes para la formación de la estructura de CDR o necesarios para la unión al antígeno utilizando el modelo molecular. En paralelo, se seleccionaron secuencias de aminoácidos de VH y VL humanas derivadas de ADNc con alta homología con las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente. Finalmente, las secuencias CDR junto con los restos de aminoácidos del marco importantes para la estructura de CDR o la unión al antígeno se injertaron de VH y VL en las correspondientes secuencias marco humanas seleccionadas.

Las Fig. 25-27 representan la alineación de varias secuencias de cadenas pesadas y ligeras de 1749, 2107 y 2120. La numeración de los restos está de acuerdo con la numeración de Kabat. Se identificaron diferentes mutaciones de los restos de aminoácidos del marco (FR) implicados en la formación de CDR y en la unión al antígeno, dependiendo de la versión del anticuerpo. Por ejemplo, las mutaciones ejemplares de los anticuerpos 1749 se representan en la Fig. 25A (el resto encerrado en un recuadro entre CDR-H2 y CDR-H3 (A93T) afecta al contacto con la CDR; la mutación A93T combinada con las mutaciones del resto encerrado en un recuadro entre CDR-H1 y CDR H2 (G44R) afecta a la interfaz VH/VL y la conformación de CDR) y la Fig. 25B (Las mutaciones del resto encerrado en un recuadro entre CDR-L2 y CDR-L3 (S63T) afectan a c DR2 y al contacto con el antígeno). Las mutaciones ejemplares de los anticuerpos 2107 se representan en la Fig. 26A (los restos encerrados en un recuadro antes de CDR-H1 (S30T), entre CDR-H1 y CDR-H2 (I37V y L48I) y entre CDR-H2 y CDR-H3 (K71R) afectan a los contactos con las CDR; y las mutaciones S30T, I37V, L48I y K71R combinadas con una mutación del resto encerrado en un recuadro inmediatamente después de CDR-H2 (T68S) afectan a las interacciones antígeno/anticuerpo); y en la Fig. 26B (los restos encerrados en un recuadro entre CDR-L1 y CDR-L2 (Y36F), y entre CDR-L2 y CDR-L3 (V58I) afectan al contacto con las CDR; y las mutaciones de Y36F y V58ⁱcombinadas con (i) una mutación adicional del resto encerrado en un recuadro entre CDR-L1 y CDR-L2 (Q38L) afectan a la estructura de las CDR; o (ii) una mutación adicional antes de CDR-L1 (T22N) afecta a la interacción del anticuerpo con el antígeno). Las mutaciones ejemplares de los anticuerpos 2120 se representan en la Fig. 27A (los restos encerrados en un recuadro en CDR-H1 (S30T), entre CDR-H1 y CDR-H2 (I37V y L48I), y entre CDR-H2 y CDR-H3 (K71R) afectan al contacto con las CDR; y las mutaciones S30T, I37V, L48I y ^k71R combinadas con una mutación adicional después de CDR-H2 (T68S) afectan al contacto con las CDR); y en la Fig. 27B (los restos encerrados en un recuadro entre CDR-L1 y CDR-L2 (L46V e Y49F) y entre CDR-L2 y CDR-L3 (V58I) afectan al contacto con las CDR; los restos encerrados en un recuadro entre CDR-L1 y CDR-L2 (L46V e Y49F) afectan el contacto con las CDR; y las mutaciones L46V, Y49F y V58I combinadas con una mutación adicional después de CDR-L1 (T22N) afectan a la interacción anticuerpo/antígeno).

Se diseñaron varias versiones de cada cadena (natural frente a agresiva o conservativa). Para aquellos anticuerpos que contenían motivos de N-desamidación (NG), se introdujeron mutaciones en las asparaginas o glicina en la versión natural. Las diversas regiones V humanizadas se sintetizaron con una secuencia señal heteróloga y se clonaron en vectores de expresión que contenían CK humana (VL) o IgG1 humana (VH).

Los plásmidos de cadena pesada y ligera se cotransfectaron en células 293F con el reactivo de transfección FreeStyle™ MAX (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El anticuerpo expresado se purificó con columnas PhyTip de proteína A (Phynexus) y se cuantificó mediante DO280.

Las afinidades aparentes de los anticuerpos humanizados se compararon con el anticuerpo precursor de roedor o quimérico en un ELISA competitivo según el siguiente protocolo.

Las placas de ELISA se recubrieron con hMCAM-His recombinante y se bloquearon con tampón de caseína para evitar la unión no específica. Se añadió anticuerpo de roedor o quimérico biotinilado en una concentración subsaturante, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes 3x de competidor no marcado (anticuerpo humanizado, de roedor o quimérico). Después de lavar para eliminar el anticuerpo no unido, se añadió estreptavidina HRP para permitir la detección del anticuerpo biotinilado. El ELISA se desarrolló con el sustrato TMB y se midió la DO450. El CI50 del competidor sin etiquetar se determinó utilizando el software GraphPad Prism5. La Tabla 2 resume el diseño de secuencias humanizadas (véanse también las Fig. 25-27 y 30-32).

Tabla 2

Los plásmidos de cadena pesada y ligera se cotransfectaron en células 293F con el reactivo de transfección FreeStyle™ MAX (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. El anticuerpo expresado se purificó con columnas PhyTip de proteína A (Phynexus) y se cuantificó mediante DO280.

Las afinidades aparentes de los anticuerpos humanizados se compararon con el anticuerpo precursor de roedor o quimérico en un ELISA competitivo según el siguiente protocolo:

Las placas de ELISA se recubrieron con hMCAM-His recombinante y se bloquearon con tampón de caseína para evitar la unión no específica. Se añadió anticuerpo de roedor o quimérico biotinilado en una concentración subsaturante, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes 3x de competidor no marcado (anticuerpo humanizado, de roedor o quimérico). Después de lavar para eliminar el anticuerpo no unido, se añadió estreptavidina HRP para permitir la detección del anticuerpo biotinilado. El ELISA se desarrolló con el sustrato TMB y se midió la DO450. El CI50 del competidor no marcado se determinó utilizando el software GraphPad Prism5. Las afinidades se midieron utilizando el Octet Red de ForteBio. Se utilizaron sensores anti-Fc humana para capturar los anticuerpos humanizados, y se utilizaron varias concentraciones de analito hMCAMHis para determinar la afinidad utilizando un modelo de ajuste 1:1.

Las potencias de los anticuerpos se midieron en el ensayo de laminina/FACS según el siguiente protocolo: se agregó laminina 411 recombinante (Biolaminate) a células CHO que expresan hMCAM en presencia o ausencia de concentraciones variables de los anticuerpos humanizados, de roedores o quiméricos. Después de la incubación durante 30-45 minutos, las células se lavaron y se añadió anti-laminina conjugada a AF650 (NovusBio) para detectar la laminina unida. Las células se procesaron en un citómetro de flujo para medir la señal de unión a la laminina. La Tabla 3 proporciona las construcciones utilizadas para la transfección.

Tabla 3

La Tabla 4 describe los experimentos de transfección específicos.

Tabla 4

La Tabla 5 muestra las afinidades relativas de los anticuerpos humanizados en comparación con el precursor de roedor medido por ForteBio y ELISA competitivo, así como los niveles de expresión para la primera ronda de transfecciones. La Fig. 28A-C compara el bloqueo de varios anticuerpos 1749, 2120 y 2107 de la unión de MCAM a laminina de la primera ronda de transfecciones.

Tabla 5

La Tabla 6 muestra la afinidad medida por ForteBio, ELISA competitivo y los datos de bloqueo funcional (ensayo de laminina/FACS) en comparación con el precursor de roedor, así como los niveles de expresión, de la segunda ronda de transfecciones.

Tabla 6

En general, los datos demuestran que los diversos anticuerpos humanizados 1749 tienen <2x reducción en la potencia y afinidad en comparación con el roedor. Los diversos anticuerpos humanizados 2120 tienen una reducción >5x en la afinidad medida por ForteBio, y la mayoría tienen una reducción >2-3x en la afinidad aparente y potencia medida por el ELISA competitivo y el ensayo de bloqueo de laminina, con la excepción de VH5VL3 (mutante VH con G-A N-desamidación/VL conservativa), que tuvo una reducción <2x en la afinidad y la potencia. Muchos de los anticuerpos 2107 humanizados tienen una pérdida significativa de afinidad y potencia, con la excepción de VH1VL2, VH2VL2 y VH3VL2 (cadena ligera conservativa con cadenas pesadas naturales, conservativas y el sitio de N-glicosilación D72N restablecido); en general, estos tuvieron una reducción <3x y afinidad y potencia mientras retienen el sitio de N-desamidación.

Ciertos anticuerpos candidatos se reexpresaron y probaron para su afinidad por ForteBio y su CI⁵⁰. Los resultados se proporcionan en la Tabla 7 a continuación y en la Fig. 29.

Tabla 7

Ejemplo 14. Análisis del bloqueo de MCAM por un anticuerpo anti-MCAM humanizado e

inhibición de la progresión de la enfermedad EAE

Los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento, por ejemplo, el Ejemplo 13, se analizan para determinar su efecto sobre la progresión de la enfermedad EAE según el protocolo proporcionado en el Ejemplo 7.

Ejemplo 15. Uso de anticuerpos humanizados para analizar la expresión de MCAM después de la polarización de TH17

L o s a n t i c u e r p o s h u m a n i z a d o s d e s c r i t o s e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o , p o r e je m p lo , e l E je m p lo 13 , s e u t i l i z a n p a r a a n a l i z a r la e x p r e s ió n d e M C A M d e s p u é s d e la p o la r iz a c ió n d e T H 17 s e g ú n e l p r o t o c o lo p r o p o r c io n a d o e n e l E je m p lo 6.

Ejemplo 16. Inflamación cutánea inducida por DNFB en ratones

S e d i lu y ó D N F B ( 2 , 4 - d i n i t r o f l u o r o b e z e n o , S i g m a ) e n a c e t o n a y a c e i t e d e o l i v a ( 4 / 1 ) . S e a f e i t ó e l a b d o m e n d e r a t o n e s B A L B / c ( 6 - 10 s e m a n a s d e e d a d ) y s e s e n s i b i l i z ó c o n 25 p l d e s o l u c ió n d e D N F B a l 0 , 5 % e n lo s d í a s 0 y 1 c o m o m o d e l o d e d e r m a t i t i s d e c o n t a c t o a l é r g ic a y p s o r ia s is . L o s a n i m a le s r e c ib i e r o n t r a t a m ie n t o i n t r a p e r i t o n e a l d e a n t i c u e r p o s ( A n t i - M C A M C l o n e 15 e I s o t i p o , 10 m g / k g ) e n lo s d í a s 6 y 7. L a o r e ja d e r e c h a d e l r a t ó n s e e x p u s o a 5 u l d e D N F B a l 0 , 2 % y la o r e ja i z q u ie r d a r e c ib ió e l v e h í c u l o ( a c e t o n a / a c e i t e d e o l i v a ) e l d í a 7 ( N a k a e e t a l . , I m m u n i t y .

2002 S e p ; 17 ( 3 ) : 375 - 871 ) . L o s r a t o n e s s e s o m e t ie r o n a e u t a n a s i a e l d í a 8 y s e m o n i t o r i z ó e l g r o s o r o la h i n c h a z ó n d e la o r e ja u s a n d o u n m ic r ó m e t r o ( M i t u t o y o , E s t a d o s U n id o s ) . L a h i n c h a z ó n d e la o r e ja s e c a l c u ló c o m o [ ( T 1 T 2 T 3 T 4 ) / 4 o r e ja iz q u ie r d a ] - [ ( T 1 T 2 T 3 T 4 ) / 4 o r e ja d e r e c h a ] , d o n d e T r e p r e s e n t a c u a t r o v a l o r e s d i f e r e n t e s d e l g r o s o r d e la o r e ja . L a f i g u r a 30 m u e s t r a q u e e l a n t i c u e r p o in h ib e s ig n i f i c a t i v a m e n t e la in f l a m a c ió n .

Ejemplo 17. Inhibición del crecimiento tumoral en ratones SCID atímicos

S e in y e c t a r o n 5 x 105 c é l u la s d e m e la n o m a q u e e x p r e s a n M C A M h u m a n a ( W M 2664 ) p o r v í a s u b c u t á n e a e n r a t o n e s m a c h o a t í m ic o s c o n i n m u n o d e f i c i e n c ia c o m b in a d a g r a v e ( S C I D ) . L o s r a t o n e s s e t r a t a r o n s e m a n a l m e n t e c o n 1 m g d e a n t i c u e r p o t o t a l ( 0 , 5 m g d e c a d a a n t i c u e r p o e n e l g r u p o d e c o m b in a c ió n ) s e m a n a l m e n t e c o m e n z a n d o e l d í a 4 d e s p u é s d e la im p l a n t a c ió n d e l t u m o r . L o s a n t i c u e r p o s u t i l i z a d o s f u e r o n e l c lo n 15 d e a n t i - M C A M d e r a t ó n o e l c lo n 2120.4.19 d e a n t i - M C A M h u m a n a o u n a c o m b in a c ió n d e lo s m is m o s . S e m id i e r o n lo s t u m o r e s c o n u n d i s e ñ o c ie g o c o n c a l i b r a d o r e s 2 X p o r s e m a n a y s e d e t e r m i n ó e l v o l u m e n t u m o r a l m e d ia n t e u n a f ó r m u l a c o n v e n c io n a l ( V o l u m e n = ( a n c h o ) 2 x lo n g i t u d / 2 ) ( F ig . 31 A ) . E l d í a 40 d e s p u é s d e la i m p l a n t a c ió n d e l t u m o r , lo s r a t o n e s s e s o m e t ie r o n a e u t a n a s i a y lo s t u m o r e s s e e x t r a je r o n in t a c t o s y s e p e s a r o n ( F ig . 31 B ) . C a d a a n t i c u e r p o in h ib i ó e l c r e c im ie n t o d e l t u m o r y la i n h ib i c ió n f u e m á s n o t a b l e e n e l t r a t a m ie n t o d e c o m b in a c ió n . S e c r e e q u e e l t r a t a m ie n t o d e c o m b in a c ió n e s m á s e f i c a z e n r a t o n e s q u e c o n t ie n e n c é l u la s c a n c e r o s a s h u m a n a s . L a s c é l u la s c a n c e r o s a s h u m a n a s e x p r e s a n M C A M h u m a n a y l a m i n in a h u m a n a , y lo s r a t o n e s e x p r e s a n M C A M d e r a t ó n y la m i n in a d e r a t ó n . D e b id o a q u e M C A M / la m in i n a d e r a t ó n y h u m a n a s s e u n e n e n t r e s í , lo s a n t i c u e r p o s c o n e s p e c i f i c i d a d p a r a M C A M h u m a n a y d e r a t ó n a c t ú a n d e f o r m a s in é r g i c a p a r a in h ib i r e l c r e c im ie n t o d e l t u m o r . E n u n s e r h u m a n o , d o n d e t o d a s la s M C A M y l a m i n in a s s o n h u m a n a s , s e e s p e r a q u e e l c lo n 2120.4 .19 a n t i - M C A M h u m a n o ( o u n a n t i c u e r p o s im i l a r ) s e a i g u a lm e n t e e f i c a z c o m o e l t r a t a m ie n t o d e c o m b in a c ió n e n r a t o n e s .

Listado de secuencias

< 110 > F L A N A G A N , K e n n e t h B A K E R , J e a n n e Y E D N O C K , T h e o d o r e A .

< 120 > A N T I C U E R P O S A N T I - M C A M Y M É T O D O S D E U S O A S O C I A D O S

< 130 > 057450 / 436599

< 150 > 61 / 797 , 179

< 151 > 30 - 11 - 2012

< 150 > 61 / 797 , 356

< 151 > 12 - 05 - 2012

< 150 > 61 / 698 , 916

< 151 > 10 - 0 - 9 - 2012

< 160 > 155

< 170 > F a s t S E Q p a r a W in d o w s V e r s i ó n 4.0

< 210 > 1

< 211 > 428

< 212 > A D N

< 213 > S e c u e n c i a A r t i f i c ia l

< 220 >

< 223 > P o l i n u c le ó t i d o s in t é t i c o

< 220 >

< 221 > C D S

< 222 > ( 1 ) ... ( 426 )

< 400 > 1

<210>2

<211> 142

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400>2

<210>3

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400>3

<210>4

<211>5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400>4

<210>5

<211>9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400>5

<210>6

<211> 483

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(483)

<400>6

<210>7

<211> 161

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400>7

<210>8

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400>8

<210>9

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400>9

<210> 10 <211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 10

<210> 11

<211> 646

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 474

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(474)

<400> 12

<210> 13

<211> 158

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 14

<210> 15

<211>7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 16

<210> 17

<211> 469

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(468)

<400> 17

<210> 18

<211> 156

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 18

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 20

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 21

<210> 22

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 104

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 78

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 90

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 81

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 1823

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 1816

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

u Ang Val Leu

n Thr Glu Gly

<210> 29

<211>334

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 1174.1.3 - Cadena Ligera variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(333)

<400> 29

<210> 30 <211> 111

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 30

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1174.1.3 - CDR-L1

<400> 31

<210> 32

<211>6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1174.1.3 - CDR-L2

<400> 32

<210> 33

<211>9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1174.1.3 - CDR-L3

<400> 33

<210> 34

<211> 363

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 1174.1.3 - Cadena Pesada variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(363)

<400> 34

<210> 35 <211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 35

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1174.1.3 - CDR-H1

<400> 36

<210> 37

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1174.1.3 - CDR-H2

<400> 37

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1174.1.3 - CDR-H3

<400> 38

<210> 39

<211>338

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 1414.1.2 - Cadena Ligera variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(336)

<400> 39

<210> 40

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 40

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1414.1.2 - CDR-L1

<400> 41

<210> 42

<211>7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1414.1.2 - CDR-L2

<400> 42

<210> 43

<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1414.1.2 - CDR-L3

<400> 43

<210> 44

<211>351

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 1414.1.2 - Cadena Pesada variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1 )...(351)

<400> 44

<210> 45

<211> 117

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 45

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1414.1.2 - CDR-H1

<400> 46

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1414.1.2 - CDR-H2

<400> 47

<210> 48

<211>7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1414.1.2 - CDR-H3

<400> 48

<210> 49

<211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 1415.1.1 - Cadena Ligera variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(321)

<400> 49

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 50

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1415.1.1 - CDR-L1

<400> 51

<210> 52 <211>7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1415.1.1 - CDR-L2

<400> 52

<210> 53

<211>9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1415.1.1 - CDR-L3

<400> 53

<210> 54

<211> 366

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 1415.1.1 - Cadena Pesada variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(366)

<400> 54

<210> 55

<211> 122

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 55

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1415.1.1 - CDR-H1

<400> 56

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1415.1.1 - CDR-H2

<400> 57

<210> 58

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1415.1.1 - CDR-H3

<400> 58

<210> 59

<211>337

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 1749.1.3 - Cadena Ligera variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(336)

<400> 59

<210> 60

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 60

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1749.1.3 - CDR-L1

<400> 61

<210> 62

<211>7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1749.1.3 - CDR-L2

<400> 62

<210> 63

<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1749.1.3 - CDR-L3

<400> 63

<210> 64

<211> 360

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 1749.1.3 - Cadena Pesada variable <220>

<221 > CDS

<222> (1)...(360)

<400> 64

<210> 65

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 65

<210> 66 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1749.1.3 - CDR-H1

<400> 66

<210> 67

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1749.1.3 - CDR-H2

<400> 67

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 1749.1.3 - CDR-H3

<400> 68

<210> 69

<211> 319

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - Cadena Ligera variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(318)

<400> 69

<210> 70

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 70

<210> 71

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - Cadena Ligera variable

<400> 71

<210> 72

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - Cadena Ligera variable

<400> 72

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - CDR-L1

<400> 73

<210> 74

<211>7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - CDR-L2

<400> 74

<210> 75

<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - CDR-L3

<400> 75

<210> 76

<211>354

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - Cadena Pesada variable <220>

<221 > CDS

<222> (1)...(354)

<400> 76

<210> 77

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 77

<210> 78

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - CDR-H1

<400> 78

<210> 79

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - CDR-H2

<400> 79

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2120.4.19 - CDR-H3

<400> 80

<210> 81

<211> 318

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - Cadena Ligera variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(318)

<400> 81

<210> 82

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 82

<210> 83

<211> 318

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - Cadena Ligera variable

<220>

<221 > CDS

<222> (1)...(318)

<400> 83

<210> 84

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 84

<210> 85

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - CDR-L1

<400> 85

<210> 86

<211>7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - CDR-L2

<400> 86

<210> 87

<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - CDR-L3

<400> 87

<210> 88

<211> 348

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - Cadena Pesada variable <220>

<221 > CDS

<222> (1)...(348)

<400> 88

<210> 89

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 89

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - CDR-H1

<400> 90

<210> 91

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - CDR-H2

<400> 91

<210> 92

<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<220>

<223> Clon 2107.4.10 - CDR-H3

<400> 92

<210> 93

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 93

<210> 94

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 94

<210> 95

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 95

<210> 96

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 96

<210> 97

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 97

<210> 98

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 98

<210> 99

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 99

<210> 100

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 100

<210> 101

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 101

<210> 102

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 102

<210> 103

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 103

<210> 104

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 104

<210> 105

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 105

<210> 106

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 106

<210> 107

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 107

<210> 108

<211> 131

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 108

<210> 109

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 109

<210> 110

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 110

<210> 111

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 111

<210> 112

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 112

<210> 113

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 113

<210> 114

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 114

<210> 115

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 115

<210> 116

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 116

<210> 117

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 117

<210> 118

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 118

<210> 119

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 119

<210> 120

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 120

G l l G

<210> 121

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 121

<210> 122

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 122

<210> 123

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 123

<210> 124

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 124

<210> 125

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 125

<210> 126

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 126

<210> 127

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 127

<210> 128

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 128

<210> 129

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 129

<210> 130

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 130

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 131

<210> 132

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 132

<210> 133

<211> 25

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 133

<210> 134

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 134

<210> 135

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 135

<210> 136

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 136

<210> 137

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 137

<210> 138

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 138

<210> 139

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 139

<210> 140

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 140

<210> 141

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 141

<210> 142

<211> 23

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 142

<210> 143

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 143

<210> 144

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 144

<210> 145

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 145

<210> 146

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 146

<210> 147

<211> 23

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 147

<210> 148

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 148

G G G l l Ph

<210> 149

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 149

<210> 150

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 150

<210> 151

<211>5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 151

<210> 152

<211>5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 152

<210> 153

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<

400> 153

<210> 154

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 154

<210> 155

<211> 25

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 155

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tres regiones hipervariables de cadena ligera (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3) y tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3), en donde HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:73, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74, HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:75, HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:78 o 141, HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79 y HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:80.

2. El anticuerpo anti-MCAM aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:73, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74, HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:75, HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:78, HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79 y HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:80.

3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que es un anticuerpo quimérico o humanizado.

4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que es un anticuerpo IgGI.

5. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que se produce en bacterias o células CHO.

6. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquier de las SEQ ID NO:70, 71 o 72 y la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:77.

7. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tres regiones hipervariables de cadena ligera (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3) y tres regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3), en donde HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:73, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74, HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:75, HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:141, HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79 y HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:80.

8. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a anticuerpo del mismo, de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende adicionalmente una región marco 2 de cadena pesada (FR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:134.

9. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a anticuerpo del mismo, de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende adicionalmente una región marco 3 de cadena pesada (FR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:135.

10. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a anticuerpo del mismo, de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo comprende adicionalmente una región marco 1 de cadena ligera (FR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:147.

11. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a anticuerpo del mismo, de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo comprende adicionalmente una región marco 2 de cadena ligera (FR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:148.

12. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a anticuerpo del mismo, de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo comprende adicionalmente una región marco 3 de cadena ligera (FR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:149.

13. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a anticuerpo del mismo, de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:119 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:123.

14. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a anticuerpo del mismo, de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:119 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:123.

15. El anticuerpo anti-MCAM aislado, o fragmento de unión a anticuerpo del mismo, de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:119 y una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO:123.

16. El anticuerpo aislado de la reivindicación 7, que es un anticuerpo quimérico o humanizado.

17. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-15, que es un anticuerpo IgGI.

18. El anticuerpo aislado de la reivindicación 17, que se produce en bacterias o células CHO.

19. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquier reivindicación precedente.

20. Un artículo de fabricación que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 19.

21. Un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquier reivindicación precedente para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple.

22. Un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquier reivindicación precedente para uso en el tratamiento de psoriasis.

23. Un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquier reivindicación precedente para uso en el tratamiento de un tumor sólido, tal como melanoma.

24. Un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquier reivindicación precedente para su uso en el tratamiento de sarcoidosis.

25. Un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquier reivindicación precedente para uso en el tratamiento de artritis psoriásica.

26. Un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquier reivindicación precedente para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson.

27. Un anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquier reivindicación precedente para su uso en el tratamiento de dermatitis de contacto alérgica.

28. El anticuerpo anti-MCAM, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21-27, en donde el tratamiento es el tratamiento de un ser humano.