ES2711498T3 - Células para inmunoterapia diseñadas mediante ingeniería genética para dirigir un antígeno presente en células inmunitarias y células patológicas - Google Patents

Células para inmunoterapia diseñadas mediante ingeniería genética para dirigir un antígeno presente en células inmunitarias y células patológicas Download PDF

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Abstract

Un método ex vivo para preparar linfocitos T para inmunoterapia contra células patológicas que comprende la etapa de: (a) Inactivar genéticamente un gen en un linfocito T, que está implicado en la expresión o presentación de un marcador antigénico, estando presente dicho marcador antigénico sobre la superficie de dicho linfocito T y la célula patológica; (b) Expresar en dicho linfocitos T un transgén que codifica un receptor de antígeno quimérico dirigido contra dicho marcador antigénico presente en la superficie de dicha célula patológica.

Description

DESCRIPCION
Celulas para inmunoterapia disenadas mediante ingeniena genetica para dirigir un antigeno presente en celulas inmunitarias y celulas patologicas
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos para desarrollar mediante ingeniena genetica linfocitos T, preferentemente no alorreactivos, para inmunoterapia, que estan provistos con receptores de antfgenos quimericos que se dirigen un marcador antigenico que es comun a las celulas patologicas y a las celulas inmunitarias (por ejemplo: CD38).
El metodo comprende expresar un CAR dirigido contra dicho marcador antigenico e inactivar los genes en los linfocitos T que contribuyen a la presencia de dicho marcador antigenico sobre la superficie de dichos linfocitos T. Esta inactivacion se lleva a cabo normalmente utilizando transgenes que codifican las endonucleasas guiadas por ARN (por ejemplo: Cas9/CRISPR), meganucleasas, nucleasas de dedo de cinc o nucleasas TAL. Los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica dirigen su actividad inmunitaria hacia celulas infectadas malignas o celulas inmunitarias defectivas, evitando a la vez su destruccion mutua, la autoestimulacion o la agregacion. La invencion abre el camino a estrategias de inmunoterapia convencionales y adoptivas asequibles utilizando celulas inmunitarias para el tratamiento del cancer, infecciones y enfermedades autoinmunitarias.
Antecedentes de la invencion
La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de celulas inmunitarias espedficas de antfgenos autologas generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar las infecciones vmcas y el cancer. Los linfocitos T utilizados para la inmunoterapia adoptiva, por ejemplo, se pueden generar tanto mediante expansion de linfocitos T espedficos de antfgenos como por redireccion de los linfocitos T mediante ingeniena genetica (Park, Rosenberg et al.
2011).
Se han generado satisfactoriamente novedosas especificidades en los linfocitos T mediante la transferencia genetica de receptores de linfocitos T transgenicos o receptores de antfgenos quimericos (CAR) (Jena, Dotti et al. 2010). Los CAR son receptores sinteticos que consisten en un resto de direccionamiento que esta asociado con uno o mas dominios de senalizacion en una unica molecula de fusion. En general, el resto de union de un CAR consiste en un dominio de union a antfgeno de un anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos mediante un enlazador flexible. Los restos de union basados en los dominios del receptor o el ligando se han usado tambien satisfactoriamente. Los dominios de senalizacion para los CAR de primera generacion se derivan de la region citoplasmica de CD3zeta o de las cadenas gamma del receptor Fc. Los CAR de primera generacion se ha mostrado que redirigen satisfactoriamente la citotoxicidad de los linfocitos T, sin embargo, fracasaron en proporcionar una expansion prolongada y una actividad antitumoral in vivo. Los dominios de senalizacion procedentes de moleculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134), y 4-1BB (CD137) se han anadido solos (segunda generacion) o en combinacion (tercera generacion) para potenciar la supervivencia y aumentar la proliferacion de linfocitos T modificados por CAR. Los CAR han permitido de forma satisfactoria redirigir los linfocitos T contra antfgenos expresados en la superficie de celulas tumorales procedentes de diversas neoplasias malignas, incluyendo linfomas y tumores solidos (Jena, Dotti et al. 2010).
El protocolo actual para el tratamiento de pacientes utilizando inmunoterapia adoptiva se basa en la transferencia de celulas autologas. En este enfoque, los linfocitos T se recuperan de pacientes, modificados geneticamente o seleccionados ex vivo, cultivados in vitro a fin de amplificar el numero de celulas si es necesario y finalmente infundirse en el paciente. Ademas de la infusion de linfocitos, el hospedador puede manipularse de otras maneras que soporten el injerto de los linfocitos T o su participacion en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, el preacondicionamiento (con radiacion o quimioterapia) y la administracion de factores de crecimiento de linfocitos (tales como IL-2). Cada paciente recibe un tratamiento fabricado individualmente, utilizando los propios linfocitos del paciente (es decir, una terapia autologa). Las terapias autologas se enfrentan a sustanciales obstaculos tecnicos y logfsticos para la aplicacion practica, su generacion requiere caras instalaciones espedficas y personal experto, deben generarse en un tiempo corto tras el diagnostico de un paciente, y en muchos casos, el pretratamiento del paciente ha dado como resultado una funcion inmunitaria degradada, de tal manera que los linfocitos del paciente pueden ser poco funcionales y estan presentes en cantidades muy bajas. Debido a estos obstaculos, la preparacion de celulas autologas de cada paciente es efectivamente un nuevo producto, dando como resultado variaciones sustanciales en la eficacia y la seguridad.
Idealmente, se deseana usar una terapia normalizada en la que las celulas terapeuticas alogenicas podna prefabricarse, caracterizarse en detalle, y estar disponible para la administracion inmediata a pacientes. Por alogenico se entiende que las celulas se obtienen a partir de individuos que pertenecen a la misma especie pero que son geneticamente diferentes. Sin embargo, el uso de celulas alogenicas actualmente tiene muchos inconvenientes. En hospedadores inmunocompetentes, las celulas alogenicas se rechazan rapidamente, un proceso denominado rechazo de injerto contra el hospedador (HvG), y este limita sustancialmente la eficacia de las celulas transferidas. En hospedadores inmunocompetentes, las celulas alogenicas son capaces de injertarse, pero sus especificidades por los receptores endogenos de los linfocitos T (TCR) pueden reconocer el tejido hospedador como extrano, dando como resultado la enfermedad del hospedador contra el injerto (GvHD), que puede conducir a un dano grave del tejido y a la muerte.
Con el fin de proporcionar linfocitos T alogenicos, los inventores divulgaron anteriormente un metodo para disenar geneticamente linfocitos T, en el que diferentes genes efectores, en particular aquellos que codifican receptores de los linfocitos T, se inactivaron utilizando nucleasas TAL espedficas, conocidas mejor bajo la marca comercial TALEN™ (Cellectis, 8, rue de la Croix Jarry, 75013 PARfS). Este metodo ha demostrado ser muy eficaz en celulas primarias que utilizan la transfeccion de ARN como parte de una plataforma que permite la produccion en masa de linfocitos T alogenicos (documento WO 2013/176915; Torikai et al. Blood, 2012, 119(24):5697-705).
CD38 (agrupacion de diferenciacion 38), conocida tambien como ADP ribosa hidrolasa dclica es una glicoprotema que se encuentra sobre la superficie de muchas celulas inmunitarias (globulos blancos), en particular linfocitos T, incluyendo CD4+, CD8+, linfocitos B y linfocitos citolfticos naturales. CD38 funciona tambien en la adhesion celular, la transduccion de la senal y la senalizacion del calcio. La informacion estructural acerca de esta protema se puede encontrar en una base de datos UniProtKB/Swiss-Prot con la referencia P28907. En seres humanos, la protema CD38 esta codificada por el gen CD38 que esta localizado en el cromosoma 4. CD38 es una ectoenzima multifuncional que cataliza la smtesis y la hidrolisis de la ADP-ribosa dclica (cADPR) procedentes de NAD+ a ADP-ribosa. Estos productos de reaccion se consideran esenciales para la regulacion del Ca2+ intracelular. Ademas, la perdida de la funcion de CD38 se asocio con respuestas inmunitarias alteradas y trastornos metabolicos (Malavasi F., et al. (2008). "Evolution and function of the ADP ribosyl cyclase/CD38 gene family in physiology and pathology". Physiol. Rev. 88(3): 841-86).
Mihara et al. (J limmunother, 2009, 32(7):737-743) divulgan inmunoterapia mediadora de los linfocitos T activados con un receptor quimerico contra CD38 en linfoma no de Hodgkin de linfocitos B.
Mihara et al. (Leukemia, 2012, 26(2):365-7) divulga inmunoterapia de linfocitos T con un receptor quimerico contra CD38 que es eficaz en la eliminacion de las celulas de mieloma.
Por otra parte, la protema CD38 es un marcador de la infeccion por VIH, leucemias, mielomas, tumores solidos, diabetes mellitus de tipo II y metabolismo oseo, asf como algunas otras dolencias determinadas geneticamente. En particular, se ha utilizado un marcador de pronostico en la leucemia (Ibrahim, S. et al. (2001) CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 98:181-186).
Aunque, las celulas que expresan CD38, asf como muchos otros marcadores antigenicos referidos en la Tabla 4, tales como CD70 y CS1 podnan considerarse como dianas atractivas para los CAS, el hecho de que dichos marcadores antigenicos se expresen tambien en la superficie de la mayona de linfocitos T, ha impedido significativamente la seleccion de estos marcadores para llevar a cabo la inmunoterapia.
Los inventores aqrn proporcionas estrategias para la inmunoterapia que implican celulas patologicas que expresan marcadores antigenicos espedficos presentes tambien en la superficie de los linfocitos T, al igual, por ejemplo, que los linfocitos B positivos para CD38 malignos que producen leucemia, CD70 y CS1.
Sumario de la invencion
La presente invencion divulga metodos para disenar mediante ingeniena genetica linfocitos T previstos para dirigirse a celulas patologicas, mientras que dichas celulas patologicas expresan uno o varios marcadores antigenicos que estan tambien presentes sobre la superficie de los linfocitos T. Los Ejemplos de dichos marcadores antigenicos se encuentran en la Tabla 4. Un ejemplo de dicho marcador antigenico es c D38. Otros ejemplos son CD70 y CS1. Por marcador antigenico se entiende la protema completa o un fragmento inmunorreactivo de la misma.
De acuerdo con la invencion, los linfocitos T se disenan mediante ingeniena genetica a fin de inactivar la expresion de los genes que codifican dichos marcadores antigenicos, o que estan implicados en la presentacion de dicho marcador antigenico sobre la superficie de la celula.
Esta inactivacion se lleva a cabo preferentemente mediante una modificacion del genoma, mas concretamente mediante la expresion en el linfocito T de una endonucleasa espedfica de corte raro capaz de dirigirse a un locus genetico directa o indirectamente implicado en la produccion o presentacion de dicho marcador antigenico en la superficie del linfocito T. Se pueden usar diferentes tipos de endonucleasas de corte raro, tales como meganucleasas, nucleasas TAL, nucleasas de dedos de cinc (ZFN), o endonucleasas guiadas por ARN/ADN analogas a Cas9/CRISPR o Argonauta.
Los linfocitos T estan dotados con al menos un receptor de antfgeno quimerico (CAR) que permite una union espedfica de dichas celulas que transportan dicho marcador antigenico dirigido.
De acuerdo con una realizacion, los linfocitos T se pueden disenar mediante ingeniena genetica para hacerlos alogenicos, especialmente, eliminando los genes implicados en el autoreconocimiento, tales como aquellos, por ejemplo, que codifican los componentes de los receptores de los linfocitos T (TCR) o el complejo HLA.
La presente invencion abarca las celulas o lmeas de celulas aisladas que comprenden las modificaciones geneticas que se muestran en la descripcion detallada, los ejemplos y las figuras, asf como cualquiera de las protemas, polipeptidos o vectores utiles para disenar mediante ingeniena genetica dichos linfocitos T.
Como resultado de la invencion, los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica pueden usarse como productos terapeuticos, idealmente como un producto "disponible en existencias", en metodos para tratar o prevenir el cancer, las infecciones o una enfermedad autoinmunitaria.
Los linfocitos T preferidos de acuerdo con la presente invencion son aquellos que dan como resultado fenotipos:
• [CAR dirigiendose a un marcador antigenico de la Tabla 4]+[marcador antigenico de la tabla 4]- tal como los siguientes:
• [CAR CD38]+[CD38]-, preferentemente tambien [TCR] negativo;
• [CAR CD70]+[CD70]-, preferentemente tambien [TCR] negativo;
• [CAR CS1]+[CS1]-, preferentemente tambien [TCR] negativo; para su uso como productos terapeuticos, preferentemente alogenicos.
Breve descripcion de las figuras y tablas
Figura 1: Representacion esquematica de un linfocito T disenado mediante ingeniena genetica de acuerdo con la presente invencion alterado para CD38 y provisto con un receptor de antfgeno quimerico (representado como un CAR monocatenario) que se dirige a una celula maligna que transporta el marcador antigenico CD38.
Figura 2: Representacion esquematica de un receptor de antfgeno multisubunidad.
Figura 3: Representacion esquematica de una estrategia terapeutica de acuerdo con la invencion que combina linfocitos T provistos con un CAR multisubunidad y un anticuerpo biespedfico en circulacion. En este aspecto concreto, el receptor presente en la cadena extracelular del CAR multisubunidad esta compuesto de un epftopo que es reconocido por un anticuerpo biespedfico. Se pretende que el anticuerpo biespedfico se una a dicho epftopo por una parte y el marcador antigenico por la otra para facilitar la union del linfocito T a la celula patologica.
Figura 4: Representacion esquematica de una estrategia terapeutica de acuerdo con la invencion que combina linfocitos T provistos con un CAR multisubunidad y un anticuerpo monoclonal en circulacion. En este aspecto concreto, el receptor presente en la cadena extracelular del CAR multisubunidad esta compuesto, por ejemplo, de un receptor de Fc previsto para unirse a un anticuerpo monoclonal que se dirige contra el marcador antigenico. El anticuerpo monoclonal aumenta la oportunidad de union de los linfocitos T a las celulas patologicas.
Figura 5: Representacion esquematica de una estrategia terapeutica de acuerdo con la invencion que combina linfocitos T provistos con un CAR multisubunidad que comprende dos dominios celulares extracelulares y un anticuerpo biespedfico en circulacion. En este aspecto concreto, los dominios celulares extracelulares se localizan en distintas subunidades. Estos dominios estan respectivamente compuestos de un epftopo que es reconocido por un anticuerpo biespedfico y por un receptor que se dirige a un antfgeno. El receptor se dirige contra un primer marcador antigenico, mientras que el anticuerpo biespedfico se pretende que se una al epftopo y un segundo marcador antigenico. Este presenta como objetivo dirigirse selectivamente a celulas patologicas que transportan en su superficie el primer y el segundo marcadores antigenicos.
Figura 6: la exposicion es similar a la Figura 5, pero los dominios de estimulacion y coestimulacion (respectivamente, los dominios de protemas 4-1BB y CD3zeta) se han intercambiado para modular la intensidad de la activacion del linfocito T resultante de la union del receptor del antfgeno quimerico con la celula patologica.
Figura 7: la exposicion es similar a la Figura 5, pero los dominios de estimulacion y coestimulacion (respectivamente, los dominios de protemas 4-1BB y CD3zeta) se han intercambiado, y un dominio CD3zeta se ha anadido para aumentar la intensidad de la activacion del linfocito T resultante de la union del receptor del antfgeno quimerico con la celula patologica.
Figura 8: Representacion esquematica de una estrategia terapeutica de acuerdo con la invencion que combina linfocitos T provistos con un CAR multisubunidad que comprende dos dominios celulares extracelulares y un anticuerpo monoclonal en circulacion. En este aspecto concreto, los dominios celulares extracelulares se localizan en distintas subunidades. Estos dominios estan respectivamente compuestos de un dominio de union a antfgeno que se dirige a un marcador antigenico y un receptor de Fc previsto para unirse a un anticuerpo monoclonal que se dirige contra un segundo marcador antigenico. Este presenta como objetivo dirigirse selectivamente a celulas patologicas que transportan en su superficie el primer y el segundo marcadores antigenicos.
Figura 9: expresion de CD38 por linfocitos T activados. A. Expresion de CD38 por linfocitos T en el dfa 6 tras la activacion de perlas revestidas con CD3/CD28 IL2. B. Analisis longitudinal de la expresion de CD38 por linfocitos T durante 17 dfas tras la activacion.
Figura 10 Inactivacion genica (KO) en el gen CD38: A. en el exon de CD38 de la secuencia 1 de 3 diferentes TALEN (T2, T4 y T5) disenados para inactivar genicamente Cd38 en los linfocitos T. B. Expresion de CD38 en los linfocitos T tras la transfeccion con el TALEN CD38ex1_T2. C. Tincion de CD38 para controlar la purificacion de los linfocitos T CD38 KO.
Figura 11: CD38 CAR: A. Representacion de las 3 versiones de los CAR disenadas. B. Nivel de expresion de CD38 por las lmeas de celulas diana.
Figura 12: Experimento de sincronizacion para el diseno mediante ingeniena genetica de los linfocitos T CAR CS1 y KO CS1 y su posterior ensayo;
Figura 13: Construcciones de T01, T02 y T03 con las repeticiones TAL utilizadas para el gen KO de CS1;
Figura 14: Localizacion diana para los TAL T01, T02 y T03 en el gen CS1 (SLAMF7). T01 y T02 se dirigen al exon 1 (Figura 14A), mientras que T03 se dirige al exon 2 (Figura 14B).
Figura 15A: La medicion del porcentaje de viabilidad de las celulas diana para TALEn transfectado o TALEn no transfectado combinado con CAR+ o celulas no transducidas: muestra una viabilidad celular reducida de las celulas CS1(+) cuando se cultivaron simultaneamente con linfocitos T CAR+, aunque no se observo impacto sobre la viabilidad de las celulas CS1(-).
Figura 15B: Medicion del porcentaje de lisis espedfica de celulas (CS1 ) calculado usando los datos de citometna de flujo. Se muestra que la lisis espedfica de celulas es 2 veces mayor cuando los linfocitos T se han transfectado con TALEn que se dirige al gen CS1 antes de la transduccion de CAR.
Figura 16: Resultados del analisis FACS del experimento de actividad citotoxica, que muestra que las eficacias de transduccion son mayores en celulas transfectadas simuladas que en celulas que se han transfectado con TALEn que se dirige CS1 (NTD: no transducido).
Figura 17: Resultados del analisis FACS cuando las diferentes muestras se reactivaron con perlas CD3/CD28 en DII tras la transduccion, mostrando las eficacias de transduccion y los niveles de expresion de CD8/CS1 en cada muestra. Se observo un aumento en los niveles de CS1 tras la reactivacion en celulas transfectadas simuladas, mientras que una baja cantidad de celulas son capaces de expresar CS1 en las poblaciones transfectadas con TALEn.
Tabla 1: Programas de citopulsos diferentes utilizados para la electroporacion de linfocitos T.
Tabla 2: Secuencias diana adecuadas para el ARN grna utilizando Cas9 en linfocitos T
Tabla 3: Lista de genes que codifican protemas checkpoint inmunitarias
Tabla 4: Agrupacion de marcadores antigenicos de diferenciacion (CD) que se encuentra que se expresan sobre la superficie de los linfocitos T, siendo caractenstico de diferentes tipos de tumores.
Tabla 5 a 13: Principales marcadores antigenicos superficiales expresados en linfocitos T, expresandose en exceso en celulas de tumores solidos de diversos tipos de canceres. Los marcadores antigenicos superficiales se identificaron como explicados en el Ejemplo 1.
Tabla 5: celulas tumorales de colon;
Tabla 6: celulas tumorales de mama;
Tabla 7: celulas tumorales del tracto digestivo;
Tabla 8: celulas tumorales renales;
Tabla 9: celulas tumorales hepaticas;
Tabla 10: celulas tumorales de pulmon;
Tabla 11: celulas tumorales de ovario;
Tabla 12: celulas tumorales de pancreas;
Tabla 13: celulas tumorales de prostata;
Tabla 14: Principales marcadores antigenicos superficiales expresados en linfocitos T, expresandose en exceso en celulas tumorales de fluidos de diversos tipos de canceres (LLA, LMA, LMC, SMD, LLC, CTRL). Los marcadores antigenicos superficiales se identificaron como explicados en el Ejemplo 1.
Tabla 15: Secuencias de las dianas de CD38 y TALEN ensayadas para la inactivacion de CD38;
Tabla 16: Secuencias de las dos dianas diferentes de CD38 y de las TALEN correspondientes para su inactivacion;
Tabla 17: Secuencias de las cadenas VH y VL de los anticuerpos scFv dirigidos contra CD38 daratumumab y MOR202 y de los CDR espedficos para las cadenas VH y VL
Tabla 18: Secuencia polipeptfdica de 3 estructuras diferentes de CAR dirigidos contra CD38 basados en el scFv daratumumab y de los componentes individuales utilizados;
Tabla 19: Secuencias de VH y VL de los anticuerpos scFv dirigidos contra CS1;
Tabla 20: Secuencia polipeptfdica de CAR dirigidos contra CS1 basados en las versiones V1, V2 y V3 en la Figura 11A;
Tabla 21: Secuencias de la diana CS1 y las TALEN para su inactivacion;
Tabla 22: Secuencias de la diana CD70 y las TALEN para su inactivacion;
Tabla 23: Secuencias de polinucleotidos y acidos nucleicos de las cadenas de VH y VL de los scFV de los anticuerpos Ab4, Ab8, y 1F6 dirigidos contra CD70;
Tabla 24: Secuencia polipeptfdica de CAR dirigidos contra CD70 basados en las versiones V1, V2 y V3 en la Figura 11A
Descripcion detallada de la invencion
Salvo que se defina espedficamente en el presente documento, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia en el campo de la terapia genica, bioqmmica, genetica, y biologfa molecular.
Todos los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la practica o el ensayo de la presente invencion, con los metodos y materiales adecuados que se describen en el presente documento. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique lo contrario.
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologfa celular, cultivo celular, biologfa molecular, biologfa transgenica, microbiologfa, ADN recombinante e inmunologfa, que estan comprendidas en los conocimientos del experto en la materia. Tales tecnicas se explican por completo en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, EE. UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente de EE.UU. n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds.
1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds. principales, Academic Press, Inc., Nueva York), espedficamente, Vols.154 y 155 (Wu et al. eds.) y Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, ed., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumenes l-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
En un aspecto general, la presente invencion se refiere a metodos para nuevas estrategias de inmunoterapia adoptivas en el tratamiento de enfermedades vinculadas con el desarrollo de celulas patologicas, tales como cancer, infecciones y enfermedades autoinmunitarias.
Como principal objetivo de la invencion esta la posibilidad de dirigir celulas patologicas que trasportan marcadores antigenicos espedficos en comun con linfocitos T. Por celula patologica se entiende cualesquiera tipos de celulas presentes en un paciente, las cuales se consideran causantes del deterioro de la salud.
En general, las celulas patologicas son celulas malignas o infectadas que necesitan reducirse o eliminarse para obtener la remision de un paciente.
En una primera realizacion, el metodo de la invencion se refiere a un metodo ex vivo de preparar linfocitos T adecuados para inmunoterapia que comprende la etapa de:
(a) Inactivar geneticamente un gen en un linfocito T, que esta implicado en la expresion o presentacion de un marcador antigenico, sabiendose que dicho marcador antigenico esta presente sobre la superficie de dicho linfocito T y la celula patologica;
(b) Expresar en dicho linfocitos T un transgen que codifica un receptor de antfgeno quimerico dirigido contra dicho marcador antigenico presente en la superficie de dicha celula patologica.
Los linfocitos T de acuerdo con la invencion estan provistos con un receptor de antfgeno quimerico dirigido a un marcador antigenico que se expresa comunmente por las celulas patologicas y las celulas inmunitarias, o conocido por estar presentes sobre la superficie de dichos linfocitos T. La expresion "conocido por estar presente" significa que se notifica que el marcador antigenico se encuentra sobre la superficie de los linfocitos T que crecen en condiciones naturales in vivo, especialmente en la sangre, pero no necesariamente cuando se cultivan in vitro. En cualquier caso, el metodo de la invencion da como resultado la ausencia del marcador antigenico sobre la superficie del linfocito T, evitando por tanto que el receptor del antfgeno quimerico reaccione con la superficie del linfocito T disenado mediante ingeniena genetica. A este respecto, el metodo puede incluir una etapa adicional de purificar los linfocitos T resultantes excluyendo las celulas que presentan dicho marcador antigenico sobre su superficie.
Como se muestra en la tabla 4, la presente invencion se refiere a un numero importante de candidatos de marcadores antigenicos indicados para expresarse por las celulas tumorales, pero tambien por los linfocitos T. Algunos de ellos, tales como CD38, se han usado como marcadores espedficos en metodos diagnosticos durante un tiempo, especialmente con respecto a las celulas patologicas de la leucemia, pero no en terapia. De hecho, aunque se identificaron estos marcadores en la tecnica como marcadores muy espedficos, podnan no utilizarse como dianas para la inmunoterapia debido a que los anticuerpos dirigidos contra estos marcadores habnan destruido o interferido los linfocitos T del paciente. Los presentes inventores han establecido que CS1 y CD70 estan tambien presentes sobre la superficie de los linfocitos T y que expresan que los CAR que se dirigen a CS1 y CD70 en dichos linfocitos T dan lugar a su agotamiento (vease el ejemplo 2).
De acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, la inactivacion genica de la etapa a) del metodo anterior se lleva a cabo utilizando una endonucleasa de corte raro.
Inactivando un gen, se pretende que el gen de interes no se exprese en forma de protema funcional. En realizaciones concreta, la modificacion genetica del metodo se basa en la expresion, en celulas proporcionadas para disenar mediante ingeniena genetica, de una endonucleasa de corte raro de tal manera que la misma cataliza la escision en un gen dirigido inactivando por tanto dicho gen dirigido. La rotura de la hebra de acido nucleico provocada por endonucleasa se repara habitualmente a traves de mecanismos distintos de recombinacion homologa o por union de extremos no homologa (NHEJ). Sin embargo, la NHEJ es un proceso de reparacion imperfecto que a menudo da como resultado cambios en la secuencia de ADN en el sitio de la escision. Los mecanismos implican la reunion de lo que queda de los dos extremos de ADN a traves de religadura directa (Critchlow y Jackson 1998) o a traves de la denominada union de extremos mediada por microhomologfa (Ma, Kim et al., 2003; Ma, Kim et al. 2003). la reparacion a traves de la union de extremos no homologa (NHEJ) a menudo da como resultado pequenas inserciones o deleciones, y se puede utilizar para la creacion de inactivaciones genicas espedficas. Dicha modificacion puede ser una sustitucion, delecion, o adicion de al menos un nucleotido. Las celulas en las que se ha producido un evento de mutagenesis inducida por escision, es decir, un evento de mutagenesis consecutivo a un evento NHEJ, se pueden identificar y/o seleccionar por metodos bien conocidos en la materia.
La expresion "endonucleasa de corte raro" se refiere a una enzima natural o variante capaz de catalizar la hidrolisis (escision) de enlaces entre acidos nucleico en una molecula de ADN o ARN, preferentemente una molecula de ADN. Particularmente, dicha nucleasa puede ser una endonucleasa, mas preferentemente una nucleasa de corte raro que es muy espedfica, reconociendo sitios diana de acido nucleico que vanan de 10 a 45 pares de bases (pb) de longitud, variando usualmente de 10 a 35 pares de bases de longitud, mas normalmente de 12 a 20 pares de bases. La endonucleasa de acuerdo con la presente invencion reconoce a secuencias de polinucleotidos espedficas, denominadas adicionalmente "secuencias diana" y escinde el acido nucleico en el interior de estas secuencias diana o en secuencias adyacentes a las mismas, dependiendo de la estructura molecular de dicha endonucleasa. La endonucleasa de corte raro puede reconocer y generar una rotura monocatenaria o bicatenaria en secuencias de polinucleotidos espedficas.
En una realizacion concreta, dicha endonucleasa de corte raro de acuerdo con la presente invencion es una endonucleasa guiada por ARN tal como el complejo Cas9/CRISPR. Las endonucleasas guiadas por ARN constituyen una nueva generacion de la herramienta de diseno mediante ingeniena genetica del genoma donde una endonucleasa se asocia con una molecula de ARN. En este sistema, la secuencia nucleotfdica de la molecula de ARN determina la especificidad de la diana y activa la endonucleasa (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013).
Cas 9
Cas9, denominada tambien Csn1 (COG3513), es una protema grande que participa tanto en la biogenesis de ARNcr como en la destruccion del ADN invasor. Se ha descrito Cas9 en diferentes especies bacterianas tales como S. thermophilus, Listeria innocua (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012) y S. Pyogenes (Deltcheva, Chylinski et al. 2011). la protema Cas9 (>1200 aminoacidos) contiene dos dominios de nucleasa previstos, concretamente el dominio de la nucleasa HNH (analogo a McrA) que esta localizado en la parte intermedia de la protema y un dominio de la nucleasa analogo a RuvC dividido (pliegue H de la ARNasa) (Makarova, Grishin et al. (2006).
Por "Cas9" se entiende una endonucleasa disenada mediante ingeniena genetica o un homologo de Cas9 que es capaz de procesar una secuencia de acido nucleico diana. En una realizacion concreta, Cas9 puede inducir una escision en la secuencia diana de acido nucleico que puede corresponder tanto a una rotura bicatenaria como a una rotura monocatenaria. La variante de Cas9 puede ser una endonucleasa Cas9 que no existe naturalmente en la naturaleza y que se obtiene por diseno mediante ingeniena genetica de protemas o mediante mutagenesis aleatoria. Las variantes de Cas9 de acuerdo con la invencion pueden obtenerse, por ejemplo, mediante mutaciones, es decir, deleciones de, o inserciones o sustituciones de al menos un resto en la secuencia de aminoacidos de una endonucleasa Cas9 de S. pyogenes (COG3513). En los aspectos del marco de la presente invencion, dichas variantes de Cas9 siguen siendo funcionales, es decir, retienen la capacidad de procesar una secuencia de acido nucleico diana. Las variantes de Cas9 pueden ser tambien homologas de Cas9 de S. pyogenes que comprenden deleciones de, o inserciones o sustituciones de, al menos un resto en la secuencia de aminoacidos de Cas9 de S. pyogenes. Se puede realizar cualquier combinacion de delecion, insercion y sustitucion para llegar a la construccion final, con la condicion que la construccion final posea la actividad deseada, en particular, la capacidad de unirse a un ARN grna o secuencia de acido nucleico diana.
El motivo RuvC/ARNasaH incluye protemas que muestran un amplio espectro de funciones nucleolfticas, actuando tanto en ARN como en ADN (ARNasaH, RuvC, transposasas de ADN e integrasas retrovmcas, y el dominio PIWI de las protemas Argonauta). En la presente invencion, el dominio catalttico RuvC de la protema Cas9 puede caracterizarse por el motivo de secuencia: D-[l/L]-G-X-X-S-X-G-W-A, en el que X representa uno cualquiera de los 20 aminoacidos naturales e [I/L] representa isoleucina o leucina. En otros terminos, la presente invencion se refiere a la variante Cas9 que comprende al menos la secuencia D-[l/L]-G-X-X-S-X-G-W-A, en el que X representa uno cualquiera de los 20 aminoacidos naturales e [I/L] representa isoleucina o leucina.
El motivo HNH es caractenstico de muchas nucleasas que actuan sobre el ADN bicatenario, incluidas las colicinas, las enzimas de restriccion y las endonucleasas de asentamiento. El dominio HNH (SMART ID: SM00507, nomenclatura SCOP: familia HNH) esta asociado con una serie de protemas de union al ADN, que realizan una diversidad de funciones de union y corte. Las que tienen una funcion conocida estan implicadas en una serie de procesos celulares que incluyen la toxicidad bacteriana, funciones de asentamiento en intrones de los grupos I y II e intemas, recombinacion, reordenamiento de ADN controlado por desarrollo, empaquetamiento de fagos y actividad de endonucleasa de restriccion (Dalgaard, Klar et al. 1997). Estas protemas se encuentran en virus, arqueobacterias, eubacterias y eucariotas. Curiosamente, como con los motivos LAGLI-DADG y los GIY-YIG, el motivo HNH a menudo se asocia con dominios de endonucleasa de elementos autopropagantes como intemas, intrones de Grupo I y Grupo II (Dalgaard, Klar et al. 1997). El dominio HNH se puede caracterizar por la presencia de un resto Asp/His conservado flanqueado por restos His (amino terminales) e His/Asp/Glu (carboxilo terminales) conservados a cierta distancia. Un numero considerable de estas protemas tambien puede tener un motivo CX2C en cualquier lado del resto Asp/His central. Estructuralmente, el motivo HNH aparece como una horquilla central de hojas plegadas p torsionadas, que estan flanqueadas en cada lado por una helice a (Kleanthous, Kuhlmann et al. 1999). El dominio HNH grande de Cas9 esta representado por la SEQ ID NO.5. En la presente invencion, el motivo HNH puede caracterizarse por el motivo de secuencia: Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S, en el que X representa uno cualquiera de los 20 aminoacidos naturales. La presente invencion se refiere a una variante de Cas9 que comprende al menos la secuencia Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S en la que X representa uno cualquiera de los 20 aminoacidos naturales.
La presente invencion puede ser de particular interes para facilitar modificaciones en el gen multiplexado dirigido y crear un sistema de nucleasa inducible mediante la introduccion del ARN grna en las celulas Cas9. Para el fin de la presente invencion, los inventores han establecido que la protema Cas9 puede dividirse en dos dominios RuvC y HNH de Cas9 divididos separados que pueden procesar la secuencia de acido nucleico diana juntos o por separado con el ARN grna.
Tambien, los dominios RuvC y HNH de diferentes endonucleasas guiadas por ARN u homologos de Cas pueden ensamblarse para mejorar la eficacia o la especificidad de la nucleasa. Los dominios de diferentes especies pueden estar tanto divididos en dos protemas como fusionados entre sf para formar una variante de la protema Cas. El sistema Cas9 dividido se considera particularmente adecuado para un metodo inducible de direccionamiento del genoma y para evitar el efecto toxico potencial de la expresion en exceso de Cas9 en la celula. De hecho, se puede introducir un primer dominio de Cas9 en la celula, preferentemente transformando de madera estable dicha celula con un transgen que codifica dicho dominio dividido. A continuacion, la parte dividida complementaria de Cas9 puede introducirse en la celula, de tal manera que las dos partes divididas se reensamblan en la celula para reconstituir una protema Cas9 funcional en el tiempo deseado.
La reduccion del tamano del Cas9 dividido en comparacion con el Cas9 natural facilita la vectorizacion y la administracion en la celula, por ejemplo, utilizando peptidos de penetracion en celulas. La reordenacion de dominios de diferentes protemas Cas, permite modular la especificidad y la actividad de la nucleasa, por ejemplo, dirigiendo motivos PAM, que son ligeramente diferentes de Cas9 de S. pyogenes.
Sistema Cas9 dividido
La caracterizacion previa de los dominios RuvC and HNH ha incitado a los inventores a disenas mediante ingeniena genetica la protema Cas9 para crear la protema Cas9 dividida. Sorprendentemente, los inventores mostraron que estas dos Cas9 divididas podnan procesar juntas o por separado el acido nucleico diana. Esta observacion permite el desarrollo de un nuevo sistema Cas9 que utiliza la protema Cas9 dividida. Cada uno de los dominios Cas9 divididos puede prepararse y usarse por separado. Por lo tanto, este sistema dividido presenta varias ventajas para la vectorizacion y la administracion de la endonucleasa guiada por ARN en linfocitos T, permitiendo la administracion de una protema mas corta y/o inactiva, y es particularmente adecuado para inducir el diseno mediante ingeniena genetica en linfocitos T en el tiempo deseado y limitando por tanto la potencial toxicidad de una nucleasa Cas9 integrada.
Por "Cas9 dividido" se entiende aqu una forma reducida o truncada de una protema Cas9 o variante de Cas9, que comprende tanto un dominio RuvC como un dominio HNH, pero no ambos de estos dominios. Dicho "Cas9 dividido" puede utilizarse independientemente con el ARN grna o de una manera complementaria, al igual por ejemplo que, un Cas9 dividido que proporciona un dominio RuvC y otro que proporciona el dominio HNH. Se pueden usar diferentes endonucleasas guiadas por ARN dividido junto con cualquier dominio RuvC y/o NHN.
Cada dominio de Cas9 dividido puede derivarse del mismo o de diferentes homologos de Cas9. Se han identificado muchos homologos de Cas9 en las bases de datos genomicas.
Dichos dominios de Cas9 divididos (dominios RuvC y HNH) pueden introducirse de forma simultanea o secuencial en la celula de tal manera que dicho(s) dominio(s) de Cas9 dividido(s) procesa(n) la secuencia de acido nucleico en la celula. Dichos dominios de Cas9 divididos y el ARNgma pueden introducirse en la celula utilizando peptidos de penetracion celular u otros metodos de transfeccion como se describe en otra parte en el presente documento.
En otro aspecto de la invencion, solo un dominio de Cas9 dividido, denominado Cas9 compacto se introduce en dicha celula. De hecho, de forma sorprendente, los inventores mostraron que el dominio de Cas9 dividido que comprende el motivo RuvC como se ha descrito anteriormente es capaz de escindir una secuencia de acido nucleico diana, independientemente del dominio dividido que comprende el motivo HNH. Por lo tanto, se podna establecer que el ARN grna no necesita la presencia del dominio HNH para unirse a la secuencia de acido nucleico diana y es suficientemente estable para unirse mediante el dominio RuvC dividido. En una realizacion preferida, dicho dominio de Cas9 dividido solo es capaz de capturar dicha secuencia de acido nucleico diana.
Cada dominio dividido puede fusionarse con al menos un dominio activo en el extremo N y/ el extremo C, dicho dominio activo se puede seleccionar entre el grupo que consiste en: nucleasa (por ejemplo, endonucleasa o exonucleasa), polimerasa, quinasa, fosfatasa, metilasa, desmetilasa, acetilasa, desacetilasa, topoisomerasa, integrasa, transposasa, ligasa, helicasa, recombinasa, activador de la transcripcion (por ejemplo, VP64, VP16), inhibidor de la transcripcion (por ejemplo; KRAB), enzima procesadora del extremo de ADN (por ejemplo, Trex2, Tdt), molecula indicadora (por ejemplo, protemas fluorescentes, lacZ, luciferasa).
El dominio HNH es responsable de la captura de una hebra del ADN bicatenario diana y el dominio de pliegue de ARNasaH analogo a RuvC esta implicado en la captura de la otra hebra (que comprende el motivo PAM) del acido nucleico diana bicatenario (Jinek, Chylinski et al. 2012). Sin embargo, en Cas9 natural, estos dos dominios dan como resultado una escision roma del ADN invasor dentro de la misma secuencia diana (protoespaciador) en las inmediaciones de la PAM (Jinek, Chylinski et al. 2012). Cas 9 puede ser una nickasa e induce un evento de captura en diferentes secuencias diana.
Como ejemplo no limitante, Cas9 o Cas9 dividido puede comprender una mutacion (o mutaciones) en los restos catalfticos de los dominios HNH o analogos a RuvC, para inducir un evento de captura en diferentes secuencias diana. Como ejemplo no limitante, los restos catalfticos de la protema Cas9 son aquellos correspondientes a los aminoacidos D10, D3l, H840, H868, N882 y N891 o las posiciones alineadas utilizando el metodo CLUSTALW en homologos de miembros de la familia Cas. Cualquiera de estos restos puede reemplazarse por cualquier otro aminoacido, preferentemente por un resto de alanina. La mutacion en los restos catalfticos significa la sustitucion por otros aminoacidos, o la delecion o adicion de aminoacidos que inducen la inactivacion de al menos un dominio catalftico de cas9. (cf. En una realizacion concreta, Cas9 o Cas9 dividido puede comprender una o varias de las mutaciones anteriores. En otra realizacion concreta, Cas9 dividido comprende solo uno de los dos dominios catalfticos RuvC y HNH. En la presente invencion, se puede utilizar Cas9 de diferentes especies, homologos de Cas9, Cas9 disenada mediante ingeniena genetica y las variantes funcionales de la misma. La invencion preve el uso de las endonucleasas guiadas por ARN o de las variantes de endonucleasas guiadas por ARN dividido para realizar la escision del acido nucleico en una secuencia genetica de interes.
Preferentemente, las variantes de Cas9 de acuerdo con la invencion tienen una secuencia de aminoacidos que comparte al menos el 70 %, preferentemente al menos un 80 %, mas preferente al menos un 90%, e incluso mas preferentemente un 95% de identidad con Cas9 de S. Pyogenes (COG3513).
Meganucleasas
La endonucleasa de corte raro puede ser tambien una endonucleasa de rastreo, conocida tambien con el nombre de meganucleasa. Dichas endonucleasas de rastreo son bien conocidas en la tecnica (Stoddard 2005). Las endonucleasas de rastreo son muy especfticas, reconociendo sitios diana de ADN que vanan de 12 a 45 pares de bases (pb) de longitud, variando usualmente de 14 a 40 pares de bases de longitud. La endonucleasa de rastreo de acuerdo con la invencion puede corresponder, por ejemplo, a una endonucleasa LAGLIDADG, a una endonucleasa HNH, o a una endonucleasa GIY-YIG. La endonucleasa de rastreo preferida de acuerdo con la presente invencion puede ser una variante I-Crel. Una "variante" de endonucleasa, es decir, una endonucleasa que no existe naturalmente en la naturaleza y se obtiene por diseno mediante ingeniena genetica o por mutagenesis aleatoria puede unir secuencias de a Dn diferentes procedentes de las reconocidas por endonucleasas naturales (vease la solicitud internacional W02006/097854).
Dicha endonucleasa de corte raro puede ser una endonucleasa de union a ADN modular. Por nucleasa de union a ADN modular se entiende cualquier protema de fusion que comprende al menos un dominio catalftico de una endonucleasa y al menos un dominio o protema que especifica una secuencia de acido nucleico diana. El dominio de union a ADN es generalmente un dominio de union a ARN o ADN formado polipeptido plegado de forma independiente o un dominio de protema que contiene al menos un motivo que reconoce polinucleotidos bicatenarios o monocatenarios. Se han descrito en la tecnica muchos de dichos polipeptidos que tienen la capacidad de unirse a secuencias de acido nucleico especfticas. Dichos dominios de union comprenden a menudo, a modo de ejemplos no limitantes, dominios de helice a helice, dominios de cremallera de leucina, dominios de helice alados, dominios de helice-bucle-helice, dominios de secuencia HMG, dominios de la inmunoglobulina, dominio B3 o dominio de dedo de cinc disenado mediante ingeniena genetica.
Nucleasas de dedo de cinc
Se desarrollo inicialmente para escindir el ADN in vitro, Las "nucleasas de dedo de cinc" (ZFN son una fusion entre el dominio de escision de la enzima de restriccion de tipo IIS, Fokl, y un dominio de reconocimiento del ADN que contiene 3 o mas motivos C2H2 de dedo de cinc. La heterodimerizacion en una posicion concreta en el ADN de los dos ZFN individuales en orientacion precisa y la separacion produce una rotura bicatenaria (DSB) en el ADN. Se ha notificado extensamente en la tecnica el uso de dichas endonucleasas quimericas como se ha revisado por Urnov et al. (Genome editing with engineered zinc finger nucleases (2010) Nature reviews Genetics 11:636-646).
Las ZFN convencionales se fusionan al dominio de escision en el extremo C de cada dominio de dedo de cinc. A fin de permitir que los dos dominios de escision dimericen y escindan el ADN, las dos ZFN individuales se unen a hebras opuestas de ADN con sus extremos C alejados entre sf una determinada distancia. Las secuencias enlazadoras mas comunmente utilizadas entre el dominio de dedo de cinc y el dominio de escision requieren que el borde 5' de cada sitio de union este separado por 5 a 7 pb.
El metodo mas directo para generar nuevas matrices de dedos de cinc es combinar modulos de dedos de cinc mas pequenos de especificidad conocida. El proceso de ensamblaje modular mas comun implica combinar tres dedos de cinc separados que pueden reconocer una secuencia de ADN de 3 pares de bases para generar una matriz de 3 dedos que puede reconocer un sitio diana de 9 pares de bases. Se han usado numerosos metodos de seleccion para generar matrices de dedos de cinc capaces de dirigir secuencias deseadas. Los esfuerzos de seleccion iniciales utilizaron la expresion en fagos para seleccionar protemas que se unen a un ADN diana dado procedente de un combinado grande de matrices de dedo de cinc parcialmente aleatorizadas. Esfuerzos mas recientes han utilizado un sistema de levadura tftbrida, un sistema de una bacteria hibrida y dos sistemas tftbridos, y celulas de mamfteros.
Nucleasas TAL
"Nucleasa TALE" o "nucleasa MBBBD" se refiere a protemas disenadas mediante ingeniena genetica que son el resultado de la fusion de un dominio de union a a Dn derivado normalmente de protemas efectoras analogas al activador de la transcripcion (TALE) o un dominio de union base por base modular (MBBBD), con un dominio catalftico que tiene actividad endonucleasa. Dicho dominio suele proceder de enzimas, tales como por ejemplo I-Tevl, ColE7, NucA y Fok-I. La nucleasa TALE puede formarse en formas monomericas o dimericas dependiendo del dominio catalftico seleccionado (documento WO2012138927). Dichas nucleasas TALE disenadas mediante ingeniena genetica estan comercialmente disponibles con el nombre comercial TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, Francia).
De acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, el dominio de union a ADN se deriva de un efector analogo al activador de la transcripcion (TALE), en el que la especificidad de la secuencia viene dada por una serie de 33-35 repeticiones de aminoacidos que se originan a partir de las protemas bacterianas AvrBs3, PthXol, AvrHahl, PthA, T a llc de Xanthomonas o Ralstonia como ejemplos no limitantes.
Estas repeticiones difieren esencialmente en dos posiciones de aminoacidos que especifican una interaccion con un par de bases (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009). Cada par de bases en el ADN diana se pone en contacto por una unica repeticion, con la especificidad resultante de dos variantes de aminoacidos de la repeticion (el dipeptido variable de la repeticion asf denominado, (RVD). Los dominios de union a TALE pueden comprender ademas un dominio de traslocacion en el extremo N responsable del requerimiento de una primera base de timina (TO) de la secuencia dirigida y un dominio en el extremo C que contiene senales de localizacion nuclear (NLS). Un dominio de union a acido nucleico de TALE corresponde generalmente a un nucleo de una estructura principal de TALE disenado mediante ingeniena genetica que comprende una pluralidad de secuencias de repeticion de TALE, comprendiendo cada repeticion un RVD espedfico de cada base de nucleotidos de un sitio de reconocimiento de TALE. En la presente invencion, cada secuencia de repeticion de TALE de dicho nucleo de la estructura principal esta constituido por 30 a 42 aminoacidos, mas preferentemente 33 o 34 en el que dos aminoacidos cnticos (el dipeptido variable de la repeticion asf denominado, RVD) localizado en las posiciones 12 y 13 media el reconocimiento de un nucleotido de dicha secuencia del sitio de union a TALE; equivalente a dos aminoacidos cnticos que pueden localizarse en posiciones diferentes de 12 y 13, especialmente en la secuencia de repeticion de TALE con mas de 33 o 34 aminoacidos de longitud. Preferentemente, los RVD asociados con el reconocimiento de diferentes nucleotidos son HD para reconocer C, NG para reconocer T, NI para reconocer A, NN para reconocer G o A. En otra realizacion, los aminoacidos cnticos 12 y 13 pueden estar mutados hacia otros restos de aminoacidos a fin de modular su especificidad hacia los nucleotidos A, T, C y G, y en particular para potenciar su especificidad. Un dominio de union al acido nucleico de TALE comprende normalmente entre 8 y 30 secuencias de repeticion de TALE. Mas preferentemente, dicho nucleo de estructura principal de la presente invencion comprende entre 8 y 20 secuencias de repeticion de TALE; de nuevo mas preferentemente 15 secuencias de repeticion de TALE. Este puede comprender tambien una unica secuencia de repeticion de TALE truncada adicional constituida por 20 aminoacidos localizados en el extremo C de dicho conjunto de secuencias de repeticion de TALE, es decir, una secuencia de repeticion semi-Tale en el extremo C adicional.
Se pueden usar otros dominios de union a ADN disenados mediante ingeniena genetica como secuencias alternativas para formar dominios de union de acidos nucleicos espedficos basa por base modulares asf denominados (MBBBD) como se describe en el documento WO 2014/018601. Dicho MBBBD puede disenarse mediante ingeniena genetica, por ejemplo, a partir de protemas identificadas recientemente, concretamente protemas EAV36_BURRH, E5AW43_BURRH, E5AW45_BURRH y E5AW46_BURRH procedentes del genoma secuenciado recientemente del hongo endosimbionte Burkholderia Rhizoxinica (Lackner, Moebius et al. 2011). Estos polipeptidos de union a acido nucleico comprenden modulos de aproximadamente 31 a 33 aminoacidos que son espedficos de base. Estos modulos presentan menos de 40% de identidad de la secuencia con repeticiones comunes de TALE de Xanthomonas y presentan mas variabilidad en la secuencia de polipeptidos. Los diferentes dominios de las anteriores protemas (modulos, extremos N y C) de Burkholderia y Xanthomonas son utiles para disenar mediante ingeniena genetica nuevas protemas o estructuras principales que tengan propiedades de union con las secuencias de acido nucleico espedficas y pueden combinarse para formar protemas TALE-MBBBD quimericas.
A modo de ejemplos, la presente invencion abarca un metodo para disenar mediante ingeniena genetica los linfocitos T a fin de inactivar la expresion de los genes que codifican marcadores antigenicos tales como CD38, CS1 y CD70 utilizando nucleasas TALE espedficas.
Particularmente adecuadas para la realizacion de la invencion, las nucleasas TALE tales como las de la SEQ ID NO: 2-3;5-6;8-9, SEQ ID NO: 64-65;67-68;70-71 y SEQ ID NO: 73-74;76-77;79-80 para los genes CD38, CS1 y CD70, respectivamente. Estas nucleasas TALE espedficas, su secuencia diana y el protocolo utilizado se presentan mas a fondo en los Ejemplos 1-3 siguientes.
Metodos de administracion
Los inventores han considerado cualesquiera medios conocidos en la tecnica para permitir la administracion en el interior de las celulas o los compartimentos subcelulares de dichas celulas los polinucleotidos que expresan las endonucleasas, sus posibles coefectores (por ejemplo, ARN o ADN grna asociado con Cas9 o las nucleasas Argonauta) asf como los receptores de antfgenos quimericos. Estos medios incluyen la transduccion vmca, la electroporacion y tambien los medios de administracion liposomicos, transportadores polimericos, transportadores qmmicos, lipoplexos, poliplexos, dendnmeros, nanopartmulas, emulsiones, la ruta de la endocitosis o fagocitosis natural como ejemplos no limitantes.
Como una realizacion preferida de la invencion, los polinucleotidos que codifican las endonucleasas de la presente invencion se transfectan en el ARNm a fin de obtener la expresion transitoria y evitar la integracion cromosomica del ADN extrano, por ejemplo, mediante electroporacion. Los inventores han determinado diferentes condiciones optimas para la electroporacion del ARNm en los linfocitos T presentados en la Tabla 1. El inventor utilizo la tecnologfa cytoPulse que permite, mediante el uso de campos electricos pulsados, para permeabilizar transitoriamente las celulas vivas para la administracion de material en las celulas (patente de EE.UU. 6.010.613 y el documento WO 2004/083379). Se puede modificar la duracion del pulso, la intensidad asf como el intervalo entre pulsos a fin de alcanzar las mejores condiciones para una eficacia de transfeccion alta con mortalidad minima. Basicamente, los primeros pulsos del campo electrico alto permiten la formacion del poro, mientras que los posteriores pulsos del campo electrico menor permiten el movimiento del polinucleotido en la celula. En un aspecto de la presente invencion, el inventor describe las etapas que conducen a la consecucion de >95% de eficacia de la transfeccion del ARNm en linfocitos T, y el uso del protocolo de electroporacion para expresar transitoriamente diferentes tipos de protemas en los linfocitos T. En particular, la invencion se refiere a un metodo para transformar los linfocitos T que comprende poner en contacto dicho linfocito T con ARN y aplicar al linfocito T una secuencia de pulso agil que consiste en:
(a) un pulso electrico con un intervalo de voltaje de 2250 a 3000 V por centimetro, una anchura de pulso de 0,1 ms y un intervalo de pulso de 0,2 a 10 ms entre los pulsos electricos de la etapa (a) y (b);
(b) un pulso electrico con un intervalo de voltaje de 2250 a 3000 V con una anchura de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso electrico de la etapa (b) y el primer pulso electrico de la etapa (c); y
(c) 4 pulsos electricos con un voltaje de 325 V con una anchura de pulso de 0,2 ms y un intervalo de pulso de 2 ms entre cada uno de los 4 pulsos electricos.
En una realizacion concreta, el metodo para transformar el linfocito T comprende poner en contacto dicho linfocito T con ARN y aplicar al linfocito T una secuencia de pulso agil que consiste en:
(a) un pulso electrico con un voltaje de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000V por centimetro, una anchura de pulso de 0,1 ms y un intervalo de pulso de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ms entre los pulsos electricos de la etapa (a) y (b);
(b) un pulso electrico con un intervalo de voltaje de 2250, de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000V con una anchura de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso electrico de la etapa (b) y el primer pulso electrico de la etapa (c); y
(c) 4 pulsos electricos con un voltaje de 325 V con una anchura de pulso de 0,2 ms y un intervalo de pulso de 2 ms entre cada uno de los 4 pulsos electricos.
Se divulgan en la presente solicitud cualesquiera valores incluidos en el intervalo de valor descrito anteriormente. El medio de electroporacion puede ser cualquier medio adecuado conocido en la tecnica. Preferentemente, el medio de electroporacion tiene una conductividad en un intervalo que se extiende desde 0,01 a 1,0 miliSiemens.
Tabla 1: Se utilizaron diferentes programas de citopulsos para determinar el voltaje mmimo requerido para la electro oracion en linfocitos T derivados de PBMC.
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Transduccion vinca
De acuerdo con la presente invencion, el uso de vectores retrovmcos y mas preferentemente de vectores lentivmcos es particularmente adecuado para expresar los receptores del antfgeno quimericos en los linfocitos T. Son bien conocidos en la tecnica los metodos para la transduccion vmca (Walther et al. (2000) Viral Vectors for Gene Transfer. Drugs. 60(2):249-271). Los vectores vmcos integradores permiten la integracion estable de los polinucleotidos en el genoma de los linfocitos T y expresar los receptores del antfgeno quimerico durante un periodo de tiempo mas largo.
Linfocitos T no alorreactivos
Aunque el metodo que se describe en el presente documento podna llevarse a cabo in vivo como parte de una terapia genica, por ejemplo, utilizando vectores vmcos que se dirigen a linfocitos T en la circulacion de la sangre, que incluinan secuencias geneticas que expresan una endonucleasa de corte raro junto con otras secuencias geneticas que expresan un CAR, se pretende que el metodo de la invencion se practique ex vivo en linfocitos T cultivados obtenibles de pacientes o donantes. Los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica ex vivo pueden tanto reimplantarse en un paciente a partir de donde se originan, como parte de un tratamiento autologo, como usarse como parte de un tratamiento alogenico. En este ultimo caso, es preferible disenar mediante ingeniena genetica adicionalmente la celula para hacerlas no alorreactivas para asegurar su injerto adecuado. Por consiguiente, el metodo de la invencion puede incluir etapas adicionales de procurar los linfocitos T de un donante e inactivar los genes del mismo implicados en el reconocimiento de MHC y/o de ser dianas de farmacos inmunosupresores tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2013/176915.
Los receptores de los linfocitos T (TCR) son receptores de la superficie celular que participan en la activacion de los linfocitos T en respuesta a la presentacion del antfgeno. El TCR esta constituido generalmente de dos cadenas, alfa y beta, que se ensamblan para formar un heterodfmero y se asocian con las subunidades transductoras de CD3 para formar el complejo receptor de los linfocitos T presente sobre la superficie de la celula. Cada cadena alfa y beta del TCR consiste en una region variable en el extremo N analoga a inmunoglobulina (V) y una region constante (C), un dominio transmembrana hidrofobo y un dominio citoplasmico corto. Como para las moleculas de inmunoglobulina, la region variable de las cadenas alfa y beta se genera por la recombinacion de V(D)J, creando una gran diversidad de especificidades antigenicas en la poblacion de linfocitos T. Sin embargo, en contraste con las inmunoglobulinas que reconocen el antfgeno intacto, los linfocitos T se activan por fragmentos peptfdicos procesados en asociacion con una molecula de MHC, introduciendo una dimension extra al reconocimiento del antfgeno por las celulas, conocida como restriccion de MHC. El reconocimiento de las disparidades de MHC entre el donante y el receptor mediante el receptor de los linfocitos T conduce a la proliferacion de linfocitos T y al desarrollo potencial de GVHD. Se ha mostrado que la expresion de la superficie normal de TCR depende de la smtesis y el ensamblaje coordinado de los siete componentes del complejo (Ashwell y Klusner 1990). La inactivacion de TCRalfa o TCRbeta puede dar como resultado la eliminacion del TCR de la superficie de los linfocitos T evitando el reconocimiento del aloantfgeno y por tanto de GVHD.
Por lo tanto, todavfa, de acuerdo con la invencion, el injerto de los linfocitos T puede mejorarse inactivando al menos un gen que codifica un componente TCR. TCR se vuelve no funcional en las celulas inactivando el gen de TCR alfa y/o el(los) gen(es) de TCR beta.
Con respecto al uso del sistema Cas9/CRISPR, los inventores han determinado secuencias diana adecuadas en los 3 exones que codifican TCR, permitiendo una reduccion significativa de la toxicidad en las celulas vivas, reteniendo a la vez la eficacia de la escision. En la Tabla 2 se indican las secuencias diana preferidas (+ para la relacion menor de celulas negativas para TCR, + para la relacion intermedia, ++ para la relacion mayor).
T l 2: n i i n r l ARN i iliz n n linf i T
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Los antigenos de MHC son tambien protemas que juegan un papel principal en las reacciones de trasplante. El rechazo esta mediado por linfocitos T que reaccionan a los antigenos de histocompatibilidad en la superficie de los tejidos implantados, y el grupo mas grande de estos antigeno es el de los antigenos de histocompatibilidad mayor (MHC). Estas protemas en la superficie de todos los vertebrados superiores y se denominan antigenos HLA (para los antigenos de leucocitos humanos) en celulas humanas. al igual que TCR, las protemas MHC tiene un papel vital en la estimulacion de los linfocitos T. Las celulas presentadoras de antigenos (a menudo celulas dendrfticas) expresan peptidos que son los productos de degradacion de protemas extranas sobre la superficie celular del MHC. En presencia de una senal coestimuladora, el linfocito T se activa, y actuara en una celula diana que tambien expresa el mismo complejo de peptido/MHC. Por ejemplo, un linfocito T auxiliar estimulado dirigira un macrofago que expresa un antigeno junto con su MHC, o un linfocito T citotoxico (LTC) actuara en una celula infectada por virus expresando peptidos vmcos extranos.
Por lo tanto, a fin de proporcionar menos linfocitos T alorreactivos, el metodo de la invencion puede comprender ademas la etapa de inactivar o mutar un gen HLA.
La agrupacion de genes HLA de clase I en seres humanos comprende tres loci mayores, B, C y A, asf como varios loci menores. Las agrupacion HLA de clase II comprende tambien tres loci mayores, DP, DQ y DR, y ambas agrupaciones de genes de clase I y clase II son polimorficas, porque existe varios alelo diferentes en los genes de clase y clase II en la poblacion. Existen tambien algunas protemas accesorias que juegan tambien un papel en el funcionamiento de HLA. Las subunidades Tapi y Tap2 son partes del complejo transportador TAP que es esencial en la carga de antigenos peptidicos sobre los complejos HLA de la clase I, y las subunidades proteosomicas LMP2 y LMP7 juegan papeles en la degradacion proteolftica de antigenos en peptidos para expresar en HLA. La reduccion en LMP7 ha mostrado reducir la cantidad de MHC de clase I en la superficie de la celula, quiza a traves de una ausencia de estabilizacion (Fehling et al. (1999) Science 265:1234-1237). Ademas de TAP y LMp, existe un gen de la tapasina, cuyo producto forma un puente entre el complejo TAP y las cadenas de HLA de clase I y potencia la carga del peptido. La reduccion en la tapasina da como resultado celulas con ensamblaje de MHC de clase I alterado, expresion reducida de la superficie celular de MHC de clase I y respuestas inmunitarias alteradas (Grandea et al. (2000) Immunity 13:213­ 222 y Garbi et al. (2000) Nat. Immunol. 1:234-238). Cualquiera de los anteriores genes puede inactivarse como parte de la presente invencion como se divulga, por ejemplo, en el documento WO 2012/012667.
Metodos para disenar mediante ingeniena genetica linfocitos T resistentes a farmacos:
Para mejorar la terapia contra el cancer y el injerto selectivo de linfocitos T alogenicos, se puede conferir resistencia al farmaco a los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica para protegerlos de los efectos secundarios toxicos de los agentes quimioterapeuticos o inmunosupresores. De hecho, los inventores han observado que la mayona de los pacientes se trataron con agentes quimioterapeuticos y agentes inmunosupresores como cuidado medico normal, antes de recibir la inmunoterapia de linfocitos T. Tambien se encuentra que pueden aprovecharse estos tratamientos para ayudar a la seleccion de los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica, anadiendo tanto farmacos quimioterapeuticos en medio de cultivo para la expansion de las celulas ex vivo antes del tratamiento, como obteniendo una expansion selectiva de los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica in vivo en pacientes bajo inmunoterapia o tratamientos inmunosupresores.
Tambien la resistencia al farmaco de los linfocitos T permite su enriquecimiento in vivo o ex vivo, puesto que los linfocitos T que expresan el gen de la resistencia a farmacos, sobreviviran y se multiplicaran con respecto a las celulas sensibles a farmacos. En particular, la presente invencion se refiere a un metodo para disenar mediante ingeniena genetica linfocitos T alogenicos y resistencia a farmacos resistentes para la inmunoterapia que comprenden:
(a) Proporcionar un linfocito T;
(b) Seleccionar al menos un farmaco;
(c) Modificar el linfocito T para conferir resistencia al farmaco a dicho linfocito T;
(d) Expandir dicho linfocito T disenado mediante ingeniena genetica en presencia de dicho farmaco, y opcionalmente, las etapas anteriores pueden combinarse con las etapas de los metodos como se ha descrito previamente.
Se puede conferir resistencia al farmaco a un linfocito T inactivado uno o mas genes responsables de la sensibilidad de la celula al farmaco (gen(es) de sensibilizacion al farmaco), tal como el gen de la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HPRT) (Genbank: M26434.1). En particular, HPRT puede inactivarse en linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica para conferir resistencia a un metabolito citostatico, la 6-tioguanina (6TG) que se convierte por HPRT en el nucleotido de tioguanina citotoxica y que se usa normalmente para tratar pacientes con cancer, in particular leucemias (Hacke, Treger et al. 2013). Otro ejemplo es si la inactivacion del CD3 expresada normalmente en la superficie del linfocito T puede conferir resistencia a anticuerpos dirigidos contra CD3 tales como teplizumab.
Puede conferirse tambien resistencia a farmacos a los linfocitos T expresando un gen de resistencia a farmacos. Dicho gen de resistencia a farmacos se refiere a una secuencia de acidos nucleico que codifica la "resistencia" a un agente, tal como un agente quimioterapeutico (por ejemplo, metotrexato). En otras palabras, la expresion del gen de resistencia a farmacos en una celula permite la proliferacion de las celulas en presencia del agente en una extension mayor que la proliferacion de una celula correspondiente sin el gen de resistencia a farmacos. Un gen de resistencia a farmacos de la invencion puede codificar la resistencia a antimetabolitos, metotrexato, vinblastina, cisplatino, agentes alquilantes, antraciclinas, antibioticos citotoxicos, anti-inmunofilinas, sus analogos o derivados, y similares.
Se han identificado variantes alelicas de diversos genes tales como dihidrofolato reductasa (DHFR), inosina monofosfato deshidrogenasa 2 (IMPDH2), calcineurina o metilguanina transferasa (MGMT) por conferir resistencia a farmacos a una celula. Dicho gen de resistencia a farmacos puede expresarse en la celula tanto introduciendo un transgen que codifica dicho gen en la celula como integrando dicho gen de resistencia a farmacos en el genoma de la celula mediante recombinacion homologa. Se han identificado algunos genes de resistencia a farmacos diferentes que pueden utilizarse potencialmente para conferir resistencia a farmacos a las celulas dirigidas (Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al.
2005; Kushman, Kabler et al. 2007).
DHFR es una enzima implicada en la regulacion de la cantidad de tetrahidrofolato en la celula y es esencial para la smtesis de ADN. Los analogos de folato tales como metotrexato (MTX) inhiben DHFR y se usan por tanto como agentes antineoplasicos en escenarios clmicos. Se han descrito diferentes forma mutantes de DHFR que tienen una resistencia aumentada a la inhibicion por antifolatos utilizada en terapia. En una realizacion concreta, el gen de resistencia a farmacos de acuerdo con la presente invencion puede ser una secuencia de acido nucleico que codifica una forma mutante de DFHR natural humano (GenBank: AAH71996.1) que comprende al menos una mutacion que confiere resistencia a un tratamiento con antifolato, tal como metotrexato. En una realizacion concreta, la forma mutante de DHFR comprende al menos un aminoacido mutado en la posicion G15, L22, F31 o F34, preferentemente en las posiciones L22 o F31 ((Schweitzer, Dicker et al. 1990); solicitud internacional WO 94/24277; patente de Estados Unidos US 6.642.043).
Como se usa en el presente documento, "agente antifolato" o "analogos de folato" se refiere a una molecula dirigida para interferir con la ruta metabolica del folato en algun nivel. Los ejemplos de agentes antifolato incluyen, por ejemplo, metotrexato (MTX); aminopterina; trimetrexato (Neutrexin™); edatrexato; acido N10-propargil-5,8-dideazafolico (CB3717); ZD1694 (Tumodex), acido 5,8-didesazaisofolico (|Ah Q); acido 5,10-didesazatetrahidrofolico (DDATHF); Acido 5-desazafolico; PT523 (N alfa-(4-amino-4-desoxipteroil)-N delta-hemiftaloil-L-ornitina); 10-etill-10-desazaaminopterina (DDATHF, lomatrexol); piritrexim; 10-EDAM; ZD1694; GW1843; Pemetrexato y PDX (10-propargil-10-deaazaaminopterina).
Otro ejemplo de gen de resistencia a farmacos puede ser tambien una forma mutante o modificada de la ionisina-5'-monofosfato deshidrogenasa II (IMPDH2), una enzima limitante de la velocidad en la smtesis de novo de los nucleotidos de guanosina. La forma mutante o modificada de IMPDH2 es un gen de resistencia al inhibidor de IMPDH. Los inhibidores de IMPDH pueden ser acido micofenolico (MPA) o su profarmaco micofenalato de mofetilo (MMF). El IMPDH2 mutante puede comprender al menos una, preferentemente dos mutaciones en el sitio de union a MAP del IMPDH2 humano natural (NP_000875.2) que conduce a una resistencia significativamente aumentada al inhibidor de IMPDH. Las mutaciones estan preferentemente en las posiciones T333 y/o S351 (Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 20l3). En una realizacion concreta, el resto de treonina en la posicion 333 se sustituye con un resto de isoleucina y el resto de serina en la posicion 351 se sustituye con un resto de tirosina.
Otro gen de resistencia a farmacos es la forma mutante de calcineurina. Calcineurina (PP2B) es una serina/treonina protema fosfatasa que se expresa de forma ubicua que esta implicada en muchos procesos biologicos y que es fundamental para la activacion de los linfocitos T. La calcineurina es un heterodfmero compuesto de una subunidad catalttica (CnA; tres isoformas) y una subunidad reguladora (CnB; dos isoformas). Tras el encaje del receptor de los linfocitos T, la calcineurina desfosforila el factor de transcripcion NFAT, permitiendo a este translocarse en el nucleo y activar el gen diana clave tal como IL2. FK506 en complejo con FKBP12, o ciclosporina A (CsA) en complejo con CyPA bloquea el accesos NFAT al sitio activo de la calcineurina, evitando su desfosforilacion e inhibiendo por tanto la activacion de los linfocitos T (Brewin, Mancao et al. 2009). El gen de resistencia a farmacos de la presente invencion puede ser una secuencia de acido nucleico que codifica una forma mutante de la calcineurina resistente a inhibidores de la calcineurina tales como FK506 y/o CsA. En una realizacion concreta, dicha forma mutante puede comprender al menos un aminoacido mutado del heterodfmero de calcineurina a natural en las posiciones: V3l4, Y341, m 347, T351, W352, L354, K360, preferentemente mutaciones dobles en las posiciones T351 y L354 o V314 e Y341. La correspondencia de las posiciones de aminoacidos descritas en el presente documento se expresa frecuentemente en terminos de las posiciones de los aminoacidos de la forma del heterodfmero de calcineurina humana natural (GenBank: ACX34092.1).
En otra realizacion concreta, dicha forma mutante puede comprender al menos un aminoacido mutado del heterodfmero de calcineurina b natural en las posiciones: V120, N123, L124 o K125, preferentemente mutaciones dobles en las posiciones L124 y K125. La correspondencia de las posiciones de aminoacidos descritas en el presente documento se expresa con frecuencia en terminos de las posiciones de los aminoacidos de la forma del polipeptido del heterodfmero de calcineurina b humana natural (GenBank: ACX34095.1).
Otro gen de resistencia a farmacos es 0(6)-metilguanina metiltransferasa (MGMT) que codifica la alquil guanina transferasa humana (hAGT). AGT es una protema reparadora del ADN que confiere resistencia a los efectos citotoxicos de los agentes alquilantes, tales como nitrosoureas y temozolomida (TMZ). 6-bencilguanina (6-BG) es un inhibidor de AGT que potencia la toxicidad de la nitrosourea y se administra simultaneamente con TMZ para potenciar los efectos citotoxicos de este agente. Algunas formas mutantes de MGMT que codifican variantes de AGT son muy resistentes a la inactivacion por 6-BG, pero retienen su capacidad de reparar el dano del ADN (Maze, Kurpad et al.
1999). En una realizacion concreta, la forma mutante de AGT puede comprender un aminoacido mutado de la posicion P140 de AGT natural (UniProtKB: P16455).
Otro gen de resistencia a farmacos puede ser el gen de la protema 1 de resistencia a multifarmacos (MDR1). Este gen codifica una glicoprotema de membrana, conocida como glicoprotema-P (P-GP) implicada en el transporte de subproductos metabolicos a traves de la membrana celular. La protema P-Gp presenta una amplia especificidad hacia algunos agentes quimioterapeuticos no relacionados estructuralmente. Por lo tanto, puede conferirse resistencia a farmacos a las celulas mediante la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica MDR-1 (NP_000918).
El gen de resistencia a farmacos puede ser tambien a antibioticos citotoxicos, tal como el gen ble o el gen mcrA. La expresion ectopica del gen ble o del gen mcrA en celulas inmunitarias proporciona una ventaja selectiva cuando se expone al agente quimioterapeutico, respectivamente la bleomicina o la mitomicina C.
Los linfocitos T pueden tambien hacerse resistente a los agentes inmunosupresores. Un agente inmunosupresor es un agente que suprime la funcion inmunitaria por uno de los varios mecanismos de accion. En otras palabras, un agente inmunosupresor es un papel jugado por un compuesto que presenta una capacidad de disminuir la extension y/o la voracidad de una respuesta inmunitaria. Como ejemplo no limitante, un agente inmunosupresor puede ser un inhibidor de calcineurina, una diana de rapamicina, un bloqueante de la cadena a de interleuquina-2, un inhibidor de la inosina monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la acido dihidrofolico reductasa, un corticoesteroide o un antimetabolito inmunosupresor. Los inmunosupresores citotoxicos clasicos actuan inhibiendo la smtesis de ADN. Otros pueden actuar mediante la activacion de los linfocitos T o inhibiendo la activacion de las celulas auxiliares. El metodo de acuerdo con la invencion permite conferir resistencia inmunosupresora a los linfocitos T para inmunoterapia inactivando la diana del agente inmunosupresor en los linfocitos T. A modo de ejemplos no limitantes, las dianas para el agente inmunosupresor puede ser un receptor de un agente inmunosupresor tal como: CD52, un receptor glucocorticoide (RG), un miembro de los genes de la familia FKBP y un miembro de los genes de la familia ciclofilina.
En los hospedadores inmunocompetentes, las celulas alogenicas son normalmente rechazadas rapidamente por el sistema inmunitario del hospedador. Se ha demostrado que, los leucocitos alogenicos presentes en productos sangumeo no irradiados persistira durante no mas de 5 a 6 dfas. Por lo tanto, para evitar el rechazo de las celulas alogenicas, el sistema inmunitario del hospedador debe suprimirse eficazmente. Los glucocorticoesteroides son ampliamente utilizados terapeuticamente para la inmunosupresion. Esta clase de hormonas esteroides se une al receptor glucocorticoide (RG) presente en el citosol de los linfocitos T dando como resultado la translocacion en el nucleo y la union de los motivos de ADN espedficos que regulan la expresion de numerosos genes implicados en el proceso inmunologico. El tratamiento de los linfocitos T con esteroides glucocorticoides da como resultado niveles reducidos de produccion de citoquinas que conducen a la anergia de los linfocitos T e interfieren en la activacion de los linfocitos T. Alemtuzumab, tambien conocido como CAMPATH1-H, es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige a CD52, una glicoprotema de 12 aminoacidos unida a glicosilfosfatidil-inositol- (GPI) (Waldmann y Hale, 2005). CD52 se expresa a altos niveles en los linfocitos T y B y a niveles menores en los monocitos mientras que esta ausente en los granulocitos y los precursores de la medula osea. El tratamiento con Alemtuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra CD52, ha mostrado inducir un rapido agotamiento de linfocitos y monocitos en circulacion. Se usa frecuentemente en el tratamiento de linfomas de linfocitos T y en determinados casos como parte de un regimen de acondicionamiento para el trasplante. Sin embargo, en el caso de inmunoterapia adoptiva, el uso de farmacos inmunosupresores tendra tambien un efecto perjudicial sobre los linfocitos T terapeuticos introducidos. Por lo tanto, para usar eficazmente una estrategia de inmunoterapia adoptiva en estas condiciones, las celulas introducidas necesitanan ser resistentes al tratamiento inmunosupresor.
Como una realizacion preferida de las etapas anteriores, dicho gen de la etapa (b), espedfico para un tratamiento inmunosupresor, es CD52, y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) comprende un anticuerpo humanizado que se dirige al antfgeno CD52. Como realizacion diferente, dicho gen de la etapa (b), espedfico para un tratamiento inmunosupresor, es un receptor glucocorticoide (RG) y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) comprende un corticoesteroide tal como dexametasona. Como realizacion diferente, dicho gen diana de la etapa (b), espedfico para un tratamiento inmunosupresor, es un miembro de los genes de la familia FKBP o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) comprende FK506, conocido tambien como tacrolimus o fujimicina. Como realizacion diferente, dicho miembro de los genes de la familia FKBP es FKBP12 o una variante del mismo. Como realizacion diferente, dicho gen de la etapa (b), espedfico para un tratamiento inmunosupresor, es un miembro de los genes de la familia ciclofilina o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) comprende ciclosporina.
En una realizacion particular de la invencion, la etapa de modificacion genetica del metodo se basa en la inactivacion de dos genes seleccionados entre el grupo que consiste en CD52 y RG, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, RG y TCR alfa, RG y TCR beta, TCR alfa y TCR beta. En otra realizacion, la etapa de modificacion genetica del metodo se basa en la inactivacion de mas de dos genes. La modificacion genetica esta preferentemente operada ex vivo utilizando al menos dos grnas de ARN que se dirigen a diferentes genes.
Inactivando un gen, se pretende que el gen de interes no se exprese en forma de protema funcional.
Diseno mediante ingenieria genetica de linfocitos T muy activos para inmunoterapia
De acuerdo con la presente invencion, los linfocitos T se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotoxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares. En otra realizacion, dicha celula puede derivarse del grupo que consiste el linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Se pueden extraer de la sangre o derivarse de citoblastos. Los citoblastos pueden ser citoblastos adultos, embriocitoblastos, mas concretamente, citoblastos no humanos, citoblastos del cordon umbilical, celulas progenitoras, citoblastos de la medula osea, citoblastos pluripotentes inducidos, citoblastos totipotentes o hemocitoblastos. las celulas humanas representativas son celulas CD34+. Antes de la expansion y de la modificacion genetica de las celulas de la invencion, se puede obtener una fuente de celulas de un sujeto mediante una variedad de metodos no limitantes. Se pueden obtener linfocitos T de numerosas fuentes no limitantes, incluyendo celulas mononucleares de sangre periferica, medula osea, tejido de ganglios linfaticos, cordon umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infeccion, fluido asdtico, derrame pleural, tejido del bazo, y tumores. En determinadas realizaciones de la presente invencion, se puede usar cualquier numero de lmeas de linfocitos T disponible y conocido por los expertos en la materia. En otra realizacion, dicha celula puede derivarse de un donante sano, de un paciente al que se ha diagnosticado cancer o un paciente al que se ha diagnosticado una infeccion. En otra realizacion, dicha celula es parte de una poblacion mixta de celulas que presentan diferentes caractensticas fenotipicas. En el alcance de la presente invencion se abarca tambien una lmea de celulas obtenidas a partir de un linfocito T transformado de acuerdo con el metodo anteriormente descrito.
Como un aspecto adicional de la invencion, los linfocitos T de acuerdo con la invencion pueden disenarse ademas mediante ingeniena, preferentemente mediante ingeniena genetica, para potenciar su actividad y/o activacion, especialmente, modulando la expresion de las protemas implicadas en la regulacion global de los linfocitos, denominados "checkpoints inmunitarios".
Check points inmunitarios
Las personas normalmente expertas en la materia entenderan, que la expresion "checkpoints inmunitarios" significa un grupo de moleculas expresadas por linfocitos T. Estas moleculas sirven eficazmente como "frenos" para modular por defecto o inhibir una respuesta inmunitaria. Las moleculas checkpoint inmunitarias incluyen, aunque no de forma limitativa la de Muerte programada 1 (PD-1, conocida tambien como PDCD1 o CD279, numero de registro: NM_005018), Antigeno 4 de linfocito T citotoxico (CTLA-4, tambien conocido como CD152, GenBank, numero de registro AF414120.1), LAG3 (tambien conocida como CD223, numero de registro: NM_002286.5), Tim3 (tambien conocida como HAVCR2, GenBank, numero de registro: JX049979.1), BTLA (tambien conocida como CD272, numero de registro: NM_181780.3), BY55 (tambien conocida como CD160, GenBank, numero de registro: CR541888.1), TIGIT (tambien conocida como IVSTM3, numero de registro: NM_173799), LAIR1 (tambien conocida como CD305, GenBank, numero de registro: CR542051.1, {Meyaard, 1997 n.° 122}), SIGLEC10 (GeneBank, numero de registro: AY358337.1), 2B4 (tambien conocida como CD244, numero de registro: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7 {Nicoll, 1999 n.° 123}, SIGLEC9 {Zhang, 2000 n.° 124;lkehara, 2004 n.° 125}, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF {Quigley, 2010 n.° 121}, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 que inhibe directamente las celulas inmunitarias. Por ejemplo, CTLA-4 es una protema de la superficie celular expresada en determinados linfocitos T CD4 y CD8; cuando se encaja por sus ligandos (B7-1 y B7-2) sobre las celulas presentadoras de antfgenos, La funcion de activacion y efectora de los linfocitos T estan inhibidas. Por tanto, la presente invencion se refiere a un metodo para disenar mediante ingeniena genetica linfocitos T, especialmente para inmunoterapia, que comprende modificar geneticamente linfocitos T inactivando al menos una protema implicada en el checkpoint inmunitario, en particular PD1 y/o CTL-4 o cualesquiera protemas checkpoint inmunitarias referidas en la Tabla 3.
T l : Li n ifi n r m h k in inm ni ri .
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Linfocitos T disenados mediante inaenieria aenetica que expresan receptores de antiaenos quimericos contra celulas patoloaicas
Los receptores de antiaenos quimericos introducidos en los linfocitos T de acuerdo con la invencion pueden adoptar diferentes disenos tales como unos CAR monocatenarios o multicatenarios. Estos diferentes disenos permiten diversas estrategias para mejorar la especificidad y la eficacia de la union hacia las celulas patoloaicas dirigidas. Algunas de estas estrateaias se ilustran en las fiauras de la presente solicitud. Los CAR monocatenarios son la version mas clasica en la tecnica. Las arquitecturas CAR multicatenarias se desarrollaron por el solicitante para permitir la modulacion de la actividad de los linfocitos T en terminos de especificidad e intensidad. Las multiples subunidades pueden acoaer dominios de coestimulacion adicionales o mantener dichos dominios a una distancia, asf como otros tipos de receptores, mientras que la arquitectura monocatenaria clasica se puede considerar alaunas veces como demasiado sensible y menos permisiva a interacciones multiespedficas.
CAR monocatenario
La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de linfocitos T espedficos de antiaenos autoloaos aenerados ex vivo, es una estrateaia prometedora para tratar las infecciones vtiicas y el cancer. Los linfocitos T utilizados para la inmunoterapia adoptiva se pueden aenerar tanto por expansion de los linfocitos T espedficos de antiaenos como por redireccion de los linfocitos T mediante inaeniena aenetica (Park, Rosenbera et al. 2011). La transferencia de linfocitos T espedficos de antiaenos vtiicos es un procedimiento bien establecido utilizado para el tratamiento del trasplante asociado a las infecciones vtiicas y neoplasias malianas relacionadas con virus raros. De manera similar, el aislamiento y la transferencia de linfocitos T espedficos de tumores ha mostrado ser satisfactorio en el tratamiento del melanoma.
Se han aenerado satisfactoriamente novedosas especificidades en los linfocitos T mediante la transferencia aenetica de receptores de linfocitos T transaenicos o receptores de antiaenos quimericos (CAR) (Jena, Dotti et al. 2010). Los CAR son receptores sinteticos que consisten en un resto de direccionamiento que esta asociado con uno o mas dominios de senalizacion en una unica molecula de fusion. En aeneral, el resto de union de un CAR consiste en un dominio de union a antiaeno de un anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fraamentos liaeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos mediante un enlazador flexible. Los restos de union basados en los dominios del receptor o el liaando se han usado tambien satisfactoriamente. Los dominios de senalizacion para los CAR de primera aeneracion se derivan de la reaion citoplasmica de CD3zeta o de las cadenas aamma del receptor Fc. Los CAR de primera aeneracion se ha mostrado que rediriaen satisfactoriamente la citotoxicidad de los linfocitos T. Sin embarao, fracasaron en proporcionar una expansion prolonaada y una actividad antitumoral in vivo. Los dominios de senalizacion procedentes de moleculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134), y 4-1BB (CD137) se han anadido solos (seaunda aeneracion) o en combinacion (tercera aeneracion) para potenciar la supervivencia y aumentar la proliferacion de linfocitos T modificados por CAR. Los CAR han permitido de forma satisfactoria rediriair los linfocitos T contra antiaenos expresados en la superficie de celulas tumorales procedentes de diversas neoplasias malianas, incluyendo linfomas y tumores solidos (Jena, Dotti et al. 2010).
Ademas del CAR que se diriae al marcador antiaenico, que es comun con las celulas patoloaicas y los linfocitos T, tales como CD38, Se preve que exprese CAR adicionales diriaidos hacia otros marcadores antiaenicos no necesariamente expresados por los linfocitos T, con el fin de potenciar la especificidad de los linfocitos T.
Los ejemplos de receptores de antiaenos quimericos que se pueden expresar adicionalmente que se pueden expresar adicionalmente por los linfocitos T para crear celulas multiespedficas, son receptores antiaenicos diriaidos contra marcadores antiaenicos de mieloma multiple o leucemia linfoblastica, tales como TNFRSF17 (UNIPROT Q02223), SLAMF7 (UNIPROT Q9NQ25), GPRC5D (UNIPROT Q9NZD1), FKBP11 (UNIPROT Q9NYL4), KAMP3, ITGA8 (UNIPROT P53708), y FCRL5 (UNIPROT Q68SN8).
Como ejemplos adicionales, el antiaeno de la diana puede ser de cualquier aarupacion de moleculas de diferenciacion (por ejemplo, CD16, CD64, CD78, CD96, CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123 y CD138), un antiaeno superficial asociado a tumor, tal como ErbB2 (HER2/neu), antigeno carcinoembrionario (CEA), molecula de adhesion a celulas epiteliales (EpCAM), receptor de factor de crecimiento epidermico (EGFR), EGFR variante III (EGFRvlll), CD19, CD20, CD30, c D40, disialogangliosido GD2, mucina del conducto epitelial, gp36, TAG-72, glicoesfingoftpidos, antigeno asociado a glioma, p-gonadotropina corionica humana, alfafetoprotema (AFP), AFP reactiva a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de la telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxil esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, antigeno espedfico de prostase (AEP), PAP, NY-Es O-1, LAGA-1a, p53, prostema, PSMA, supervivencia y telomerasa, antigeno tumoral-1 de carcinoma de prostata (PCTA-1), MAGE, ELF2M, neutrofilo elastasa, efrina B2, CD22, factor de crecimiento de la insulina (IGF1)-I, iGF-II, receptor de IGFI, mesotelina, una molecula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presenta un epftopo antigenico espedfico de tumor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, antfgenos de tumores estromales, el extradominio A (EDA) y el extradominio B (EDB) de la fibronectina y el dominio A1 de tenascina-C (TnC A1) y la protema asociada a fibroblasto (fap); un antfgeno espedfico de linaje o espedfico de tejido tal como CD3, CD4, CD8, c D24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), GM-CSF, receptores de citoquinas, endoglina, una molecula del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), BCMA (CD269, TNFRSF 17), o un antfgeno superficial espedfico de virus tal como un antfgeno espedfico del VIH (tal como VIH gpl20); un antfgeno espedfico del VEB, un antfgeno espedfico del CMV, un antfgeno espedfico del VPH, un antfgeno espedfico del virus de Lasse, un antfgeno espedfico del virus de la gripe asf como cualquier derivado o variante de estos marcadores superficiales. Los antfgenos no son necesariamente antfgenos de marcadores superficiales, pero pueden ser tambien antfgenos pequenos endogenos presentados por HLA de clase I en la superficie de las celulas.
A modo de ejemplos, la presente invencion abarca CAR monocatenarios que se dirigen espedficamente al marcador de la superficie celular, tales como CD38, CS1 y/o CD70 como se describe en los ejemplos, junto con una inactivacion de los genes que codifican respectivamente c D38, CS1 y/o CD70 en las celulas que expresan dichos CARS.
Como ejemplo espedfico, las cadenas VH y VL del scFv dirigido contra CD38 comparten al menos un 80%, preferentemente 90% y mas preferentemente 95% de identidad con respectivamente la SEQ ID NO:10 y 12 y la SEQ ID NO:11 y 13.
Como ejemplo espedfico, el anticuerpo o la union al epftopo en el antfgeno CD38, caracterizada porque dicho anticuerpo o fragmento de union a epftopo del mismo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoacidos representadas por las SEQ ID NOS: 14-17, y en las que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoacidos representadas por las SEQ ID NOS: 21-23.
En otro ejemplo espedfico, el anticuerpo o la union al epftopo en el antfgeno CD38, caracterizada porque dicho anticuerpo o fragmento de union a epftopo del mismo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoacidos representadas por las SEQ ID NOS: 18-20, y en las que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoacidos representadas por las SEQ ID NOS: 24-26.
En otro ejemplo espedfico, las cadenas VH y VL del scFv dirigido contra CS1 comparten al menos un 80%, preferentemente 90% y mas preferentemente 95% de identidad con respectivamente la SEQ ID NO:38-40-42-44-46 y la SEQ ID NO: 39-41-42-45-46.
En otro ejemplo mas espedfico, las cadenas VH y VL del scFv dirigido contra CD70 comparten al menos un 80%, preferentemente un 90% y mas preferentemente un 95% de identidad al nivel del polinucleotido o acido nucleico con respectivamente la SEQ ID NO:81-82; 85-86; 89-91 y la SEQ ID NO: 83-84; 87-88; 91-92.
En una realizacion, la invencion abarca un polinucleotido que codifica un unico CAR dirigido contra CD38 que comparte al menos un 80%, preferentemente un 90% y mas preferentemente un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 35-37. En otra realizacion, la invencion abarca un polinucleotido que codifica un unico CAR dirigido contra CS1 que comparte al menos un 80%, preferentemente un 90% y mas preferentemente un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 48-62.
En otra realizacion mas, la invencion abarca un polinucleotido que codifica un unico CAR dirigido contra CD70 que comparte al menos un 80%, preferentemente un 90% y mas preferentemente un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 93-101.
La presente invencion se dirige mas concretamente a los linfocitos T que estan provistos con un CAR que presenta alguna identidad con aquellos descritos en la presente solicitud y que transportana mutaciones inducidas por la endonucleasa de corte raro en un gen que codifica el marcador celular dirigido por dicha CAR (es decir, el CAR presenta afinidad con el producto de dicho gen inactivado). Por identidad se entiende al menos 70%, preferentemente 80%, mas preferentemente 90% e incluso mas preferentemente 95% de identidad con el polinucleotido o polipeptido como se determina por el software tal como FASTA, o BLAST que esta disponible como parte del paquete de analisis de la secuencia GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.). Las "identidades" de BLASTP muestran el numero y la fraccion de restos totales en las parejas de secuencias de alta puntuacion que son identicas. Las secuencias de aminoacidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad o similitud con las secuencias de aminoacidos divulgadas en el presente documento se contemplan y estan abarcadas por esta divulgacion. Se aplica lo mismo con respecto a las secuencias de polinucleotidos utilizando BLASTN.
CAR multisubunidad
Los receptores de antigenos quimericos de la tecnica anterior introducidos en los linfocitos T estan formados por polipeptidos monocatenarios que necesitan el agregado en serie de los dominios de senalizacion. Sin embargo, el movimiento de los dominios de senalizacion desde su posicion en la yuxtamembrana natural puede interferir con su funcion. para superar este inconveniente, el solicitante diseno recientemente un CAR multicatenario derivado de FceRI para permitir la posicion normal de la yuxtamembrana detodos los dominios de senalizacion relevantes. En esta nueva arquitectura, el dominio de union a IgE de alta afinidad de la cadena FceRI alfa esta sustituido por un dominio de union a ligando extracelular tal como scFv para redirigir la especificidad de los linfocitos T contra las dianas celulares y las colas de los extremos N y/o C de la cadena FceRI beta se usan para colocar senales coestimuladoras en las posiciones normales de la yuxtamembrana.
Por consiguiente, el CAR expresado por los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica de acuerdo con la invencion puede ser un receptor de antfgeno quimerico multicatenario (CAR) adaptado particularmente para la produccion y expansion de los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica de la presente invencion. Dichos CAR multicatenarios comprenden al menos dos de los siguientes componentes:
a) un polipeptido que comprende el dominio transmembrana de la cadena FceRI alfa y un dominio de union a ligando extracelular,
b) un polipeptido que comprende una parte de la cola citoplasmica del extremo N y el extremo C y el dominio transmembrana de la cadena FceRI beta y/o
c) al menos dos polipeptidos que comprende cada uno una parte de la cola intracitoplasmica y el dominio transmembrana de la cadena FceRI gamma, por lo cual, diferentes polipeptidos se multimerizan juntos de forma espontanea para formar CAR dimericos, trimericos o tetramericos.
De acuerdo con dichas arquitecturas, los dominios de union a ligando y los dominios de senalizacion nacen en polipeptidos separados. Los diferentes polipeptidos se anclan en la membrana en proximidad cercana permitiendo interacciones entre sf. En dichas arquitecturas, los dominios de senalizacion y coestimuladores pueden estar en posiciones en la yuxtamembrana (es decir, adyacentes a la membrana celular en el lado interno de esta), que se considera que permite la funcion mejorada de los dominios coestimuladores. La arquitectura multisubunidad ofrece tambien mas flexibilidad y posibilidades de disenar CAR con mas control sobre la activacion de los linfocitos T. Por ejemplo, es posible incluir algunos dominios de reconocimiento de antfgenos extracelulares que tienen diferente especificidad para obtener una arquitectura CAR multiespedfica. Es tambien posible controlar la relacion relativa entre las diferentes subunidades en el CAR multicatenario. Este tipo de arquitectura se ha descrito recientemente por el solicitante en el documento PCT/US2013/058005 (WO2014/039523).
El ensamblaje de diferentes cadenas como parte de un unico CAR multicatenario se hace posible, por ejemplo, utilizando diferentes cadena alfa, beta y gamma del receptor de alta afinidad para IgE (FceRI) (Metzger, Alcaraz et al.
1986) al cual se fusionan los dominios de senalizacion y coestimuladores. La cadena gamma comprende una region transmembrana y una cola citoplasmica que contienen un motivo de activacion basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) (Cambier 1995).
El CAR multicatenario puede comprender algunos dominios de union a ligando extracelulares, para unir simultaneamente diferentes elementos en la diana aumentando por tanto la activacion y la funcion de los linfocitos T. En una realizacion, los dominios de union a ligando extracelulares pueden colocarse en tandem o en el mismo polipeptido transmembrana, y opcionalmente pueden separarse por un enlazador. En otra realizacion, dichos dominios de union a ligando extracelulares diferentes pueden colocarse diferente polipeptidos transmembrana que componen el CAR multicatenario. En otra realizacion, la presente invencion se refiere a una poblacion de CAR multicatenarios que comprenden cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelulares. en particular, la presente invencion se refiere a un metodo de disenar mediante ingeniena genetica linfocitos T que comprende proporcionar un linfocito T y que expresan en la superficie de dicha celula una poblacion de CAR multicatenarios comprendiendo cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelulares. En otra realizacion concreta, la presente invencion se refiere a un metodo de disenar mediante ingeniena genetica linfocitos T que comprende proporcionar un linfocito T e introducir en dicha celula polinucleotidos que codifican polipeptidos que componen una poblacion de CAR multicatenarios comprendiendo cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelulares. En una realizacion concreta, el metodo de disenar mediante ingeniena genetica un linfocito T comprende expresar en la superficie de la celula al menos una parte de una cadena FceRI beta y/o gamma fusionada con un dominio de transduccion de la senal y algunas partes de las cadenas FceRI alfa fusionadas a diferentes dominios de union a ligando extracelulares. En una realizacion mas concreta, dicho metodo comprende introducir en dicha celula al menos un polinucleotido que codifica una parte de la cadena FceRI beta y/o gamma fusionada a un dominio de transduccion de la senal y algunas cadenas FceRl alfa fusionadas a diferentes dominios de union a ligando extracelulares. Por poblacion de CAR multicatenarios, se entiende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas CAR multicatenarios comprendiendo cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelulares. Los diferentes dominios de union a ligando extracelulares de acuerdo con la presente invencion pueden unirse preferentemente de forma simultanea a diferentes elementos en la diana aumentando por tanto la activacion y funcion de los linfocitos T.
La presente invencion se refiere tambien a un linfocito T aislado que comprende una poblacion de CAR multicatenarios que comprenden cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelulares.
El dominio de transduccion de la senal o dominio de senalizacion intracelular del CAR multicatenario de la invencion es responsable de la senalizacion intracelular tras la union del dominio de union a ligando extracelular con la diana dando como resultado la activacion de los linfocitos T y la respuesta inmunitaria. En otras palabras, el dominio de transduccion de la senal es responsable de la activacion de al menos una de las funciones efectoras normales del linfocito T en la que se expresa el CAR multicatenario. Por ejemplo, la funcion efectora de un linfocito T puede ser una actividad citolftica o actividad auxiliar que incluye la secrecion de citoquinas.
En la presente solicitud, la expresion " dominio de transduccion de la senal" se refiere a la porcion de una protema que transduce la senal de la funcion de senalizacion efectora y dirige la celula para llevar a cabo una funcion especializada.
Los ejemplos preferidos de dominio de transduccion de la senal para su uso en CAR monocatenarios o multicatenarios pueden ser las secuencias citoplasmicas del receptor de Fc o del receptor de los linfocitos T y los correceptores que actuan en concierto para iniciar la transduccion de la senal tras el encaje del receptor antigenico, asf como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintetica que tenga la misma capacidad funcional. El dominio de transduccion de la senal comprende dos clases distintas de secuencia de senalizacion citoplasmica, aquellas que inician la activacion primaria dependiente del antigeno, y aquellas que actuan de una manera independiente al antfgeno para proporcionar una senal secundaria o coestimuladora. La secuencia de senalizacion citoplasmica primaria puede comprender motivos de senalizacion que se conocen como motivos de activacion basados en la tirosina inmunorreceptora de los ITAM. Los ITAM son motivos de senalizacion bien definidos que se encuentran en la cola intracitoplasmica de una variedad de receptores que sirven como sitios de union para las tirosina quinasas de clase syk/zap70. Los ejemplos de ITAM utilizados en la invencion pueden incluir como ejemplos no limitantes aquellos derivados de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRepsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una realizacion preferida, el dominio de transduccion de la senalizacion del CAR multicatenario puede comprender el dominio de senalizacion CD3zeta, o el dominio intracitoplasmico de las cadenas FceRI beta o gamma.
En una realizacion concreta, el dominio de transduccion de la senal del CAR multicatenario de la presente invencion comprende una molecula de senalizacion coestimuladora. Una molecula coestimuladora es una molecula de la superficie celular diferente de un receptor antigenico o sus ligandos que se requiere para una respuesta inmunitaria eficaz.
Los dominios de union a ligando pueden ser cualquier receptor antigenico utilizado anteriormente, y referido a, con respecto a un CAR monocatenario referido en la bibliograffa, en particular scFv de los anticuerpos monoclonales. Se incorporan por referencia los CAR biespedficos o multiespedficos que se describen en el documento WO 2014/4011988.
De forma similar a la descrita anteriormente con respecto a los CAR monocatenarios, la presente invencion abarca linfocitos T provistos con CAR multicatenarios que se dirigen espedficamente a un marcador superficial celular tal como CD38, CS1 o CD70. De acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, los CAR descritos anteriormente se expresan en linfocitos T, mientras que la inactivacion de los genes endogenos que codifican dicho(s) marcador(es) superficial(es) esta inducida por la expresion de una endonucleasa de corte raro.
Activacion y expansion de linfocitos T
El metodo de acuerdo con la invencion incluye generalmente una etapa adicional de activar y/o expandir los linfocitos T. Esto se puede llevar a cabo antes o despues de la modificacion genetica de los linfocitos T, utilizando los metodos que se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20060121005. De acuerdo con estos metodos, Los linfocitos T de la invencion pueden expandirse por contacto con una superficie que tiene unida a la misma un agente que estimula una senal asociada con un complejo CD3 TCR y un ligando que estimula una molecula coestimuladora sobre la superficie de los linfocitos T.
En particular, las poblaciones de linfocitos T pueden estimularse in vitro tal como por contacto con un anticuerpo dirigido contra CD3, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, o un anticuerpo dirigido contra CD2 inmovilizado sobre una superficie, o por contacto con un activador de la protema quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionoforo de calcio. Para la coestimulacion de una molecula accesoria sobre la superficie de los linfocitos T, se usa un ligando que se une a la molecula accesoria. Por ejemplo, una poblacion de linfocitos T puede ponerse en contacto con un anticuerpo dirigido contra CD3 y un anticuerpo dirigido contra CD28, en condiciones adecuadas para estimular la proliferacion de los linfocitos T. Para estimular la proliferacion tanto de los linfocitos T CD4+ como de los linfocitos T CD8+, un anticuerpo dirigido contra CD3 y un anticuerpo dirigido contra CD28. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada senal pueden estar en solucion o acoplados a una superficie. Como puede apreciar facilmente las personas normalmente expertas en la materia, la relacion de partfculas a celulas puede depender del tamano de partfculas relativo a la celula diana. En realizaciones adicionales de la presente invencion, las celulas, tales como linfocitos T, se combinan con perlas revestidas con un agente, las perlas y las celulas se separan posteriormente, y a continuacion se cultivan las celulas. En una realizacion alternativa, antes del cultivo, las perlas y las celulas revestidas con agente no se separan, sino que se cultivan juntas. Las protemas de la superficie celular pueden estar ligadas permitiendo que las perlas paramagneticas a las cuales se unen anti-CD3 y anti-CD28 (3x28 perlas) para poner en contacto los linfocitos T. en una realizacion, las celulas (por ejemplo, 4 a 10 linfocitos T) y las perlas (por ejemplo, las perlas paramagneticas DYNABEADS* M-450 CD3/CD28 T en una relacion de 1:1) se combinan en un tampon, preferentemente PBS (sin cationes divalentes tales como. calcio y magnesio). De nuevo, las personas normalmente expertas en la materia pueden apreciar facilmente cualquier concentracion celular que pueda usarse. La mezcla puede cultivarse durante varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 14 dfas o cualquier valor entero horario comprendido entre los anteriores. En otra realizacion, la mezcla puede cultivarse durante 21 dfas. Las condiciones adecuadas para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio adecuado (por ejemplo, medio esencial mmimo o medio RPMI 1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener los factores necesarios para la proliferacion y la viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero de feto de bovino o suero humano), interleuquina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp, y TNF- o cualesquiera otros aditivos para el crecimiento de las celulas conocidos por el experto en la materia. Otros aditivos para el crecimiento de las celulas incluyen, aunque no de forma limitativa, un tensioactivo, plasmanate, y agentes reductores tales como N-acetil-cistema y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir r Pm I 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoacidos anadidos, piruvato de sodio, y vitaminas, tanto exento de suero como suplementado con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina(s) suficiente para el crecimiento y la expansion de los linfocitos T. Antibioticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de celulas que son para infundirse en un sujeto. Las celulas diana se mantienen en las condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37° C) y atmosfera (por ejemplo, aire mas CO2 al 5%) adecuadas. Los linfocitos T que se han expuesto a tiempos de estimulacion variados pueden presentar diferentes caractensticas.
En otra realizacion concreta, dichas celulas pueden expandirse mediante cultivo simultaneo con tejido o celulas. Dichas celulas pueden tambien expandirse in vivo, por ejemplo, en la sangre del sujeto tras administrar dichas celulas en el sujeto.
Aplicaciones terapeuticas
Los linfocitos T obtenibles mediante los diferentes metodos descritos anteriormente se pretende que se usen como un medicamento para tratar, entre otros, cancer, infecciones o enfermedades inmunitarias en un paciente que lo necesite.
Dicho tratamiento puede ser mejorante, curativo o profilactico. Puede ser tanto parte de un tratamiento de inmunoterapia autologa como parte de un tratamiento de inmunoterapia alogenica. Por autologo, se entiende que las celulas, la lmea de celulas o la poblacion de celulas usadas para tratar pacientes se originan a partir de dicho paciente o de un donante compatible con el antfgeno de leucocitos humano (HLA). Por alogenico se entiende que las celulas o la poblacion de celulas usadas para tratar pacientes no se originan de dicho paciente sino de un donante.
Los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica de acuerdo con uno de los metodos anteriores se pueden combinar, congelar, y administrar a uno o varios pacientes. Cuando se preparan de forma no alorreactiva, estan disponibles como un producto terapeutico "disponible en existencias", los que significa que se pueden infundir de manera universal a pacientes que lo necesitan.
Dichos tratamientos se preven principalmente para los pacientes a los que se ha diagnosticado cancer, infeccion vmca, trastornos autoinmunitarios o enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD). Los canceres son preferentemente leucemias y linfomas, que tienen tumores fluidos, pero se pueden referir tambien a tumores solidos. Los tipos de canceres que se van a tratar con los CAR de la invencion incluyen, aunque no de forma limitativa, carcinoma, blastoma, y sarcoma y determinadas leucemias o neoplasias malignas linfoides, tumores benignos y malignos y neoplasias malignas por ejemplo, sarcomas, carcinomas, y melanomas. Se incluyen tambien tumores/canceres en personas adultas y tumores/canceres pediatricos.
La presente invencion proporciona en las Tablas 4 a 14 ejemplos de marcadores antigenicos, que pueden dirigirse con las celulas disenadas mediante ingeniena genetica de la invencion para tratar diferentes tipos de canceres.
Los marcadores antigenicos preferidos usados para la inmunoterapia de la presente invencion son, de forma mas concreta, CD38, CD319 (CS1) y CD70.
Los linfocitos T actuales, cuando se proveen con los CAR espedficos dirigidos contra las propias celulas inmunitarias del paciente, especialmente los linfocitos T, permiten la inhibicion o regulacion de dichas celulas, lo que es una etapa clave para tratar las enfermedades autoinmunitarias, tales como la poliartritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, smdrome de Sjogren, esclerodermia, fibromialgia, miositis, espondilitis anquilosante, diabetes de tipo insulinodependiente, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison, enfermedad de Crohn, enfermedad celfaca, esclerosis lateral amiotrofica (ELA) y esclerosis multiple (EM). Por consiguiente, la presente invencion abarca los linfocitos T de la invencion para su uso en un metodo para tratar una enfermedad inmunitaria dirigiendo dichos linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica contra los propios linfocitos T del paciente.
Los anteriores tratamientos pueden tener lugar en combinacion con una o mas terapias seleccionadas entre el grupo de terapias de anticuerpos, quimioterapia, terapia de citoquinas, terapia de celulas dendnticas, terapia genica, terapia hormonal, terapia de luz laser y radioterapia.
Los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica tal como se ha descrito anteriormente, cuando se vuelven resistentes a los farmacos quimioterapeuticos y a los farmacos inmunosupresores que se usan como atencion medica habitual, especialmente metotrexato y la combinacion de fludarabina y ciclofosfamida, son particularmente adecuados para tratar varias formas e cancer. De hecho, la presente invencion se basa preferentemente en celulas o poblaciones de celulas. En este aspecto, se espera que la quimioterapia y/o el tratamiento inmunosupresor deba ayudar la seleccion y la expansion de los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica in vivo.
En determinadas realizaciones de la presente invencion, las celulas son para su uso en la administracion a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultaneamente o despues) cualquier numero de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, aunque no de forma limitativa el tratamiento con agentes, tales como la terapia antivmca, Tratamiento con cidofivir e interleuquina-2, citarabina (conocida tambien como ARA-C) o nataliziimab para pacientes con EM o tratamiento efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML. En realizaciones adicionales, los linfocitos T de la invencion pueden ser para su uso en combinacion con quimioterapia, radiacion, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, y FK506, anticuerpos, u otros agentes inmunosupresores tales como CAMPATH, anticuerpos dirigidos contra CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, acido micoplienolico, esteroides, FR901228, citoquinas, e irradiacion. Estos farmacos inhiben tanto la fosfatasa dependiente de calcio, calcineurina (ciclosporina y FK506) como inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la senalizacion inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 11; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). En una realizacion adicional, las composiciones celulares de la presente invencion son para su uso en la administracion a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultaneamente o despues) del trasplante de medula osea, la terapia supresora de linfocitos T que utiliza cualquiera de los agentes quimioterapeuticos tales como, fludarabina, radioterapia de haces externos (XRT), ciclofosfamidas, o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH, En otra realizacion, las composiciones celulares de la presente invencion son para su uso en la administracion tras la terapia supresora de linfocitos B tal como los agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, los sujetos pueden experimentar un tratamiento convencional con una alta dosis de quimioterapia seguido por transporte de citoblastos de sangre periferica. En determinadas realizaciones, tras el transplante, los sujetos pueden recibir una infusion de linfocitos T expandidos de la presente invencion. En un ejemplo adicional, las celulas expandidas se administran antes o tras la cirugfa. Dichas celulas modificadas obtenidas mediante uno cualquiera de los metodos descritos aqrn pueden ser para su uso en el tratamiento de pacientes que lo necesitan frente al rechazo de hospedador contra injerto y la enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD); por tanto, en el alcance de la presente invencion son celulas modificadas obtenibles mediante el metodo de la invencion para su uso en un metodo de tratar pacientes que lo necesitan frente al rechazo de hospedador contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD) que comprende tratar a dicho paciente administrando a dicho paciente una cantidad eficaz de celulas modificadas que comprende los genes TCR alfa y/o TCR beta inactivados.
Dichos linfocitos T de la invencion pueden experimentar una expansion solida de linfocitos T in vivo tras la administracion a un paciente, y pueden persistir en los fluidos corporales durante un lapso de tiempo prolongado, preferentemente durante una semana, mas preferentemente durante 2 semanas, incluso mas preferentemente durante al menos un mes. Aunque los linfocitos T de acuerdo con la invencion se espera que persistan durante estos periodos, se pretende que su duracion en el cuerpo del paciente no exceda de un ano, preferentemente 6 meses, mas preferentemente 2 meses, e incluso mas preferentemente un mes.
La administracion de las celulas o la poblacion de celulas de acuerdo con la presente invencion puede llevarse a cabo de una manera convencional, incluyendo por inhalacion mediante aerosol, inyeccion, ingestion, transfusion, implante o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por via subcutanea, intradermica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyeccion intravenosa o intralinfatica, o por via intraperitoneal. En una realizacion, las composiciones celulares de la presente invencion se administran preferentemente mediante inyeccion intravenosa.
La administracion de las celulas o poblacion de celulas puede consistir en la administracion de 104-109 celulas por kg de peso corporal, preferentemente 105 a 106 celulas/kg de peso corporal incluyendo todos los valores enteros de cantidades de celulas comprendidos en los intervalos citados. Las celulas o poblacion de celulas se pueden administrar en una o mas dosis. En otra realizacion, dicha cantidad eficaz de celulas se administra como una unica dosis. En otra realizacion, dicha cantidad eficaz de celulas se administra como mas de una dosis durante un lapso de tiempo. El calendario de administracion esta comprendido en el criterio del medico a cargo del tratamiento y depende de la dolencia clmica del paciente. Las celulas o poblacion de celulas se pueden obtener a partir de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Aunque las necesidades individuales vanan, la determinacion de los intervalos optimos de cantidades eficaces de un tipo de celula dado para una enfermedad o dolencias concretas se encuentra comprendido en los conocimientos del experto en la materia. una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapeutico o profilactico deseado. La dosificacion administrada sera dependiente de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
Dicha cantidad eficaz de celulas o composicion que comprende aquellas celulas puede administrarse por via parenteral. Dicha administracion puede ser una administracion intravenosa. Dicha administracion puede llevarse a cabo directamente mediante inyeccion en un tumor.
Identificacion del marcador antigenico superficial expresado en la superficie de los linfocitos T, mientras se expresa en exceso es tumores solidos implicados en diferentes tipos de canceres (Tablas 5 a 13)
Los inventores usaron datos de la micromatriz BioGPS procedentes de un panel de datos de una micromatriz de tejidos cancerosos normales (Atlas de genes U133A/GNF1H humanos) que se puede descargar de los datos uniprot de BioGPS (Tumores primarios humanos (U95)) que contienen la localizacion subcelular.
Los inventores dibujaron la distribucion de valores provenientes de tejidos normales y determinaron un valor umbral de 5 para la expresion relativa.
Los inventores exploraron todos los genes ensayados con micromatrices (44.000 sondas que representan aproximadamente 13.000 genes) y comprobaron su localizacion en la membrana (se descartaron las protemas no denominadas protemas de membranas). Se comprobo la expresion de los linfocitos T CD8+ a partir de la base de datos BioGPS. Los genes se relacionaron de acuerdo con el tipo de cancer cuando la expresion correspondiente fue la mas alta (Tablas 5 a 13).
Identificacion del marcador antigenico superficial expresado en la superficie de los linfocitos T, mientras se expresa en exceso en diferentes tumores fluidos de la sangre (Tabla 14)
Para este estudio, no estuvieron disponibles los datos de secuenciacion del ARN y por tanto se usaron datos de micromatrices que se obtuvieron a partir de un gran estudio del consorcio MILE (Innovaciones de micromatrices en leucemia), implicando 11 laboratorios (http://www.ngrl.org.uk/wessex/downloads/tm08/TM08-S4-l_KenMills.pdf -Haferlach et al. 2010, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20406941). Estos datos brutos incluyen resultados de LLA (leucemia linfoblastica aguda), LMA (leucemia mielogena aguda), LLC (leucemia linfoblastica cronica) y LMC (leucemia mielogena cronica) y SMD (smdrome mielodisplasico). Los inventores usaron tambien de forma normal los datos de uniprot para la localizacion subcelular.
Los inventores dibujaron en primer lugar la distribucion global de los valores de todos los genes en todos los tejidos estudiados. A continuacion, para tener una idea del nivel necesario para la expresion, los inventores tomaron una lista de genes que se expresaban en algunos tumores fluidos y para los cuales estan disponibles anticuerpos terapeuticos (CD52, CD 20, CD33, CD19, CD25, CD44, CD47, CD96, CD116, CD117, CD135, TIM-3). Para cada gen, los inventores observaron el valor obtenido en el tumor en que se expresaba. A continuacion, los inventores calcularon el promedio para cada tumor y el par de genes para el cual el gen parece proporcionar una protema de membrana celular (localizacion de la membrana celular descripcion de al menos un dominio transmembrana en la protema). Los inventores descartaron genes para los cuales la expresion en todos los tejidos estuvo por debajo de este umbral de 0. 15. Los inventores enumeraron y clasificaron en la Tabla 14, aquellos genes cuya expresion relativa en los linfocitos T estuvo por encima de 0,2. Por lo tanto, La Tabla 4 proporciona presuntos candidatos de marcadores antigenicos para el direccionamiento de celulas de tumores fluidos segun la invencion, en particular, para tratar la LLA, LMA, LLC, LMC y SMD.
Ejemplo de etapas para disenar mediante ingenieria genetica linfocitos T de acuerdo con la invencion para inmunoterapia
Para una mejor comprension de la invencion, se proporciona a continuacion un ejemplo de los pasos a seguir para producir linfocitos T dirigidos contra las celulas de leucemia positivas para CD38:
1. Proporcionar linfocitos T a partir de un cultivo celular o procedentes de una muestra de sangre de un paciente individual o de un banco de sangre y activar dichos linfocitos T utilizando perlas de activador C28 dirigidas contra CD3 (Dynabeads®). Las perlas proporcionan las senales primarias y las senales coestimuladoras que se requieren para la activacion y expansion de los linfocitos T.
2. Transducir dichas celulas con un vector retrovtiico que comprende un transgen que codifica un receptor de un antigeno quimerico consistente en la fusion del dominio de activacion CD3zeta, Dominio de coestimulacion 4-1BB, un dominio transmembrana y una bisagra procedente de CD28 fusionados con una secuencia que codifica la cadena variable de un anticuerpo dirigido contra CD38. Para la mejora de la seguridad del linfocito T transformado, puede introducirse adicionalmente un gen sensible a rituximab como se describe en el documento WO 2013/153391 en el vector lentivmco separados por dos secuencias de separacion de T2A.
3. (opcionalmente) Disenar mediante ingeniena genetica linfocitos T no alorreactivos y/o resistentes:
a) Es posible inactivar TCR alfa en dichas celulas para eliminar el TCR desde la superficie de la celula y evitar el reconocimiento del tejido hospedador como extrano por el TCR alogenico y evitar por tanto la GvHD siguiendo los protocolos que se muestran en el documento WO 2013/176915.
b) Es tambien posible inactivar un gen que codifica la diana para un agente inmunosupresor o un farmaco quimioterapeutico para volver dichas celulas resistente al tratamiento inmunosupresor o quimioterapeutico para evitar el rechazo al injerto sin alterar los linfocitos T trasplantados. En este ejemplo, la diana de los agentes inmunosupresores es CD52 y el agente inmunosupresor es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra CD52 (por ejemplo: Alemtuzumab) como se describe en el documento WO 2013/176915.
4. Se llevo a cabo la inactivacion del gen electroporando linfocitos T con ARNm que codifica la endonucleasa espedfica de TAL (TALEN™ - Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, Francia). Los linfocitos T inactivados se clasificaron utilizando perlas magneticas. Por ejemplo, Los linfocitos T que expresan todavfa el gen dirigido (por ejemplo, CD38, CD70 y CD70) se pueden eliminar mediante fijacion sobre una superficie solida, y las celulas inactivadas no se exponen al estres de pasarse a traves de una columna. Este metodo aumenta ligeramente la concentracion de linfocitos T adecuados disenados mediante ingeniena genetica.
5. Expansion in vitro de linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica antes de la administracion a un paciente o in vivo tras la administracion a un paciente mediante la estimulacion del complejo CD3. Antes de la etapa de administracion, los pacientes pueden someterse a un tratamiento inmunosupresor tal como CAMPATH1-H, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra CD52.
6. Opcionalmente, se exponen dichas celulas con anticuerpos biespedficos ex vivo antes de la administracion a un paciente o in vivo tras la administracion a un paciente para poner las celulas disenadas mediante ingeniena genetica en proximidad con un antigeno diana.
Analisis funcional de los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica electroporados con un ARNm monocistronico que codifica un receptor de antigeno quimerico monocatenario dirigido contra CD38 (CAR CD38):
Para verificar que el genoma disenado mediante ingeniena genetica no afecta la capacidad de los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica de presentar actividad antitumoral, especialmente, cuando se proporciona con un receptor de un antigeno quimerico (CAR CD38), Los linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica se incubaron durante 4 horas con celulas Daudi que expresan CD38 en su superficie. La regulacion en exceso de la superficie celular de CD107a, un marcador de la liberacion de granulos citotoxicos por los linfocitos T (denominado desgranulacion) se midio mediante un analisis de citometna de flujo (Betts, Brenchley et al. 2003).
24 horas despues de la electroporacion, se tineron las celulas con un colorante de viabilidad fijable eFluor-780 y un fragmento F(ab')2 de cabra conjugado con PE dirigido IgG de raton espedfico para evaluar la expresion de la superficie celular del CAR en las celulas vivas. La gran mayona de linfocitos T vivos alterados geneticamente por CD38, expresan el CAR en su superficie. Los linfocitos T se cultivaron simultaneamente con celulas Daudi (CD38+) durante 6 horas y se analizaron mediante citometna de flujo para detectar la expresion del marcador de desgranulacion CD107a en su superficie (Betts, Brenchley et al. 2003).
Los resultados mostraron que CD38 altero los linfocitos T manteniendo la misma capacidad de desgranular en respuesta a PMA/ionomicina (control positivo) o celulas Daudi CD38+. La regulacion en exceso de CD107 es dependiente de la presencia de un CD38+. Estos datos sugieren que el genoma disenado mediante ingeniena genetica de los linfocitos T actuales no tuvo impacto negativo sobre la capacidad de los linfocitos T de desarrollar una respuesta antitumoral controlada.
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Tabla 5: marcadores anti enicos ex resados sobre la su erficie de celulas de tumor de colon linfocitos T
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Tabla 6: marcadores anti enicos ex resados sobre la su erficie de celulas de tumor de mama linfocitos T
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T l 7: m r r n i n i x r r l rfi i l l m r i iv lin f i T
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T l ^: m r r n i n i x r r l rfi i l l m r r n l lin f i T
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T l : m r r n i n i x r r l rfi i l l m r h i lin f i T
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T l 1: m r r ni ni x r r l rfii l l m r lm n linf i T
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Tabla 11: marcadores anti enicos ex resados sobre la su erficie de celulas de tumor de ovario linfocitos T
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T l 12: m r r ni ni x r r l rfii l l m r n r linf i T
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T l 1 : m r r ni ni x r r l rfi i l l m r r linf i T
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Tabla 14: marcadores antigenicos expresados sobre la superficie de los linfocitos T y expresado en exceso en celulas de tumores fluidos LLA LMA LMC SMD LLC CTRL
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Ejemplo 1 INACTIVACION GENICA (KO) EN EL GEN CD38 Y EXPRESION DE CAR DIRIGIDO CONTRA CD38 Presentacion de la ADP ribosa hidrolasa ciclica diana de CD38
CD38 es una glicoprotema que se encuentra en la superficie de muchas celulas inmunitarias, incluyendo celulas de mieloma multiple (MM) que expresan un alto nivel de CD38 en una gran mayona de pacientes. c D38 es una diana validada para las MM dado que muchos estudios han mostrado la destruccion eficaz de las celulas CD38+ MM procedentes de pacientes y las lmeas de celulas CD38+ MM utilizando mAb dirigidos contra CD38 por CDC y ADCC (Ellis, J. H. K. et al, Journal of Immunology, 1995, 155 (2), 925-937). Daratumumab es un anticuerpo monoclonal CD38 humano terapeutico que induce la destruccion del mieloma multiple y otros tumores hematologicos (De Weers, M. y col., J Immunol 2011 186:1840-1848). En algunos estudios, Se ha mostrado que CD38 se expresa tambien mucho por los linfocitos T activados (Sandoval-Montes CJ et al., 2005, Leukoc Biol. 77(4):513-21).
Expresion de CD38 por los linfocitos T
Se analizo la expresion de CD38 por los linfocitos T tras la utilizacion de perlas de CD3/CD28 y la estimulacion de IL2 mediante FACS cada 3-4 dfas durante 17 dfas. Se observo que mas del 90% de linfocitos T se expresan entre el dfa 6 y el dfa 17 despues de la activacion (Figura 10B).
Por lo tanto, a fin de evitar la destruccion de los linfocitos T activados por CAR+ dirigido contra CD38 necesita evitarse la expresion superficial de los linfocitos T CD38 en los linfocitos T. Esto puede llevarse a cabo mediante la inactivacion del gen CD38 utilizando nucleasas TALE. TALEN es una marca comercial propia del solicitante (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 PARfS) que designa un formato personalizado de nucleasas TAL.
Estrategia para la inactivacion genica (KO) de CD38
Se disenaron y produjeron nucleasas TALE heterodimericas que se dirigfan a dos secuencias de 17 pb de longitud separadas por un separador de 13 pb en el gen CD38. Cada semidiana se reconocio por las repeticiones de las nucleasas semi TALE relacionadas en la Tabla 15 siguiente y en la Figura 10A.
La secuencia de repeticiones para la TALEN de la izquierda para la diana CD38ex1_T2 era NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-NN-NG-NG-NN-NN-HD-NN-NI-NG, y la de la TALEN de la derecha era NN-NG-HD-HD-HD-HD-NN-HD-NI-NN-NG-NN-HD-HD-HD-NG.
T l 1 : n i l i n D TALEN n r l in iv i n l ni n D
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Cada construccion de nucleasa TALE se subclono utilizando la digestion con la enzima de restriccion en un vector de expresion de mairnferos bajo el control del promotor T7. Se sintetizaron los ARNm que codificaban la nucleasa TALE escindiendo CD38 a partir de plasmidos que transportaban la secuencia de codificacion en la direccion 3' del promotor T7.
Los linfocitos T purificados se activaron durante 72 horas con perlas revestidas con anti CD3/CD28 y se transfecto IL-2 recombinante mediante electroporacion (Cytopulse) con cada uno de los 2 ARNm (10 |jg cada uno) que codifican la mitad de las nucleasas CD38ex1_T2 TALE. Para investigar, las lmeas de celulas CD38 KO, se evaluo el porcentaje de linfocitos T negativos para CD38 mediante citometna en el dfa 3, 6, 10 y 13 dfas despues la transfeccion de ARNm de TALEN. Se observo que el 15% de los linfocitos T transfectados eran deficientes para CD38 (Figura 10 C) y esta deficiencia fue estable durante 13 dfas despues de la transfeccion.
Ademas, se han disenado dos nucleasas TALE alternativas que se dirigen al gen CD38. Cada semidiana se reconocio por las repeticiones de las nucleasas semi TALE relacionadas en la Tabla 16 siguiente y en la Figura 10A. La secuencia de repeticiones para la TALEN de la izquierda para la diana CD38ex1_T4 era NG-NN-HD-NN-NI-NN-NG-NG-HD-NI-NN-HD-HD-HD-NN-NN-NG, y la de la TALEN de la derecha era NG-NN-HD-NG-NN-HD-HD-NN-NN-HD-NG-HD-NG-HD-NG-NI. La secuencia de repeticiones para la TALEN de la izquierda para la diana CD38ex1_T5 era NG-NN-NI-NG-HD-HD-NG-HD-NN-NG-HD-NN-NG-NN-NN-NG, y la de la TALEN de la derecha era HD-NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-HD-NN-HD-HD-NI-NN-HD-NI.
T l 1: n i l i n if r n D l TALEN rr n i n r in iv i n
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Estrategia para la expresion del CAR dirigido contra CD38
Estructura y composicion de los CAR dirigidos contra CD38
En la Tabla 17 se presentan la cadena VH y VL del scFv dirigido contra CD38. La SEQ ID NO:10-11 corresponde al anticuerpo humanizado dirigido contra c D38 daratumumab (Genmab) y la SEQ ID NO: 12-13 al MOR202 (o MOR03087) tal como se describe en la patente US 8.263.746B.
La SEQ ID NO:14-20 y la SEQ ID NO:21-26 corresponden a la secuencia de CDR para respectivamente la cadena VH (HCDR) y la cadena VL (LCDR) tal como se describe en la solicitud WO 2008/047242.
Tabla 17: Secuencias de las cadenas VH y VL de los anticuerpos scFv dirigidos contra CD38 daratumumab, M R2 2 l DR ifi r l n VH VL.
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Para el scFv daratumumab se han disenado tres diferentes construcciones CAR (GMB005-V1 y V2 y V3) tales como las presentadas en la Figura 11A y se presenta su secuencia en la Tabla 18 siguiente. Las tres construcciones comparten los mismos componentes, en terminos de peptidos de senalizacion (CD8a), enlazador GS (entre las cadenas VH y VL de scFv), dominio transmembrana (TM), dominio 4-1BB coestimulador, y dominio de activacion CD3Z (secuencias presentadas en la Tabla 18). Sus diferencias proceden de la eleccion de la bisagra (Tabla 18):
V1: bisagra de FcRIla
- V2: bisagra de CD8a
- V3: bisagra de IgG1
Tabla 18: Secuencia polipeptidica de 3 estructuras diferentes de los CAR dirigidos contra CD38 basados en el scFv daratumumab de los com onentes individuales utilizados
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Cribados
Se transfectaron TALEN de CD38 en el dfa 4 despues de la activacion. 3 dfas despues, las celulas deficientes en CD38 se clasificaron mediante seleccion negativa y se transfectaron 3 dfas despues con los ARNm de los CAR dirigidos contra CD38. Las moleculas CAR generadas se cribaran a continuacion para la actividad de expresion y desgranulacion hacia la expresion de CDR38 de las lmeas de celulas diana tras la transfeccion transitoria del ARNm de CAR. Las lmeas de celulas diana que expresan diferentes niveles de expresion de CD38 (Figura 11B) se usaran para el ensayo de actividad:
- U266 CD38+ y U266 CD38- obtenidas mediante separacion magnetica utilizando microperlas dirigidas contra CD38
- L363, una lmea de celulas de mieloma multiple que expresan niveles intermedios de CD38
- Daudi, una lmea de celulas derivada de linfoma de Burkitt que expresa niveles altos de CD38
- K562, una lmea de celulas negativa para CD38 derivada de leucemia mielogena cronica.
Al primer cribado seguira una segunda etapa de cribado en la que se ensayaran numerosos candidatos seleccionados para su capacidad de inducir la desgranulacion, liberacion de IFNy y actividad citotoxica espedfica hacia las lmeas de celulas diana seleccionadas. A continuacion se reducira la seleccion de candidatos y se evaluaran algunos candidatos seleccionados para la produccion de vectores de lentivirus y la actividad de CAR en linfocitos T CD38 KO que expresan de forma estable los CAR.
Ejemplo 2 ACTIVIDAD DEL CAR DIRIGIDO CONTRA CS1 EN EL CONTEXTO DE CS1 KO
Presentacion de la diana de CS1
Mieloma multiple (MM) es una neoplasia maligna de linfocitos B caracterizada por la expansion clonica anomala de las celulas plasmatica (PC) en la medula osea, con unos 21.700 nuevos casos estimados y 10.710 muertes de MM identificadas en los Estados Unidos en 2012 (Siegel R, et al. Cancer J Clin 201262:10-29). En 2013, se ha estimado que se diagnosticaran de nuevo 22.350 individuos con MM en los Estados Unidos y que moriran de este 10.710 personas, que representan el 20% de las muertes de todas las neoplasias malignas hematologicas. A pesar del uso de inhibidores del proteosoma y de farmacos inmunomoduladores, que han mejorado la supervivencia global (Palumbo A, et al. Leukemia 2009 23:449-456), MM sigue siendo una neoplasia maligna incurable (Podar K, et al. Leukemia 200923:10-24) para la cual se necesitan urgentemente novedosas estrategias terapeuticas.
La glicoprotema CS1 de la superficie celular (denominada tambien en la bibliograffa SLAMF7, CD319 o CRACC -Secuencia de referencia NCBI: NP_067004.3) se expresa mucho y de forma muy ubicua sobre la superficie de las celulas de mieloma (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84). CS1 se expresa a niveles muy bajos en la mayona de celulas inmunoefectoras, incluyendo los linfocitos citolfticos naturales (NK), algunos subgrupos de linfocitos T, y linfocitos B normales, y es casi indetectable en celulas mieloides (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775­ 84). De forma destacable, CS1 se expresa de forma minoritaria en hemocitoblastos humanos (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84), que se pueden usar para el trasplante de citoblastos para tratar neoplasias malignas hematologicas, incluyendo MM. Las funciones de CS1 en MM siguen sin entenderse de forma completa, y se ha documentado que CS1 puede jugar un papel en la adhesion de celulas de mieloma, crecimiento clonogeno, y tumorigenicidad (Benson DM Jr, et al. J Clin Oncol 201230:2013-5; Tai YT, et al. Blood 2009 113:4309-18).
Estructura del CAR dirigido contra CS1
Las mismas estructuras V1, V2 y V3 se disenan tal como en el Ejemplo 1 para el CAR monocatenario diana del antfgeno dirigido contra CD38, con los mismos componentes en terminos de bisagra, dominio transmembrana, dominios de coactivacion y dominios de transduccion (tales como los representados graficamente en la Figura 11A y las secuencias que se muestran en la Tabla 18).
En la Tabla 19 se presentan las cadenas VH y VL del scFv dirigido contra CS1. La SEQ ID NO:38-40-42-44-46 y la SEQ ID NO:39-41-43-45-47 corresponden respectivamente a la cadena VH y la cadena VL del scFv Luc63, Luc90, Luc34, LucX1 y LucX2 de murino.
En la Tabla 20 se presentan los CAR dirigidos contra CS1 con el anterior scFv; basandose estos CAR en las versiones V1, V2 y V3 de la Figura 11A, en la que se usan respectivamente la bisagra FcERy corta, la bisagra CD8a media y la bisagra IgG1 larga. Las partes subrayadas corresponden a las cadenas VH y VL de scFv unidas por un enlazador.
Tabla 19: Secuencias de las cadenas VH VL de los anticuer os scFv diri idos contra CS1
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Tabla 20: Secuencia polipeptfdica de CAR dirigidos contra CS1 basados en las versiones V1, V2 y V3 en la Figura
11A
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Estrategia para el diseno mediante ingenieria genetica del CAR CS1+ y KO CS1
CS1 se expresa a altos niveles en celulas plasmacitoides de pacientes con mieloma multiple, haciendo de este una interesante diana para el desarrollo de CAR. Los linfocitos T, especialmente el subgrupo c D8, expresan bajos niveles de CS1, lo que es un inconveniente para el desarrollo de CAR de linfocitos T, debido a que podnan destruirse cuando expresan un CAR dirigido contra CS1.
En este ejemplo, los inventores evaluaron la actividad del CAR Luc90-v2 (la secuencia se muestra en la Tabla 20) en linfocitos T humanos que, o bien se transfectaron de forma simulada, como se transfectaron con un TALEN que se dirigfa al gen CS1 (SLAMF7), para observar si se potencio la actividad de CAR cuando se altero el gen CS1 en los linfocitos T CAR+. En la Figura 12 se muestra el curso del experimento.
Los linfocitos T se purificaron a partir de muestras de capa leucocitaria y se activaron utilizando perlas revestidas de CD3/CD28. Se cotransfectaron las celulas 72h despues de la activacion con 10 |jg de ARNm el T01_izquierda TAL y 10 jg del ARNm que codifica el T01_derecha TAL. Se muestran las secuencias de los TAL en la Tabla 21 siguiente y las construcciones de plasmidos (T01, T02 y T03) con las repeticiones que se muestran en la Figura 13.
La Figura 14 muestra la localizacion diana de los TAL T01, T02 y T03 en el gen CS1 (SLAMF7): T01 y T02 se dirigen al exon 1 (Figura 14A), mientras que T03 se dirige al exon 2 (Figura 14B).
T l 21: n i l i n 1 l TALEN r in iv i n
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3 dfas despues de la transfeccion de TALEn, se transdujeron las celulas con un vector lentivmco recombinante que impulsa la expresion L90-v2 CAR lejos de un promotor EFla. El vector lentivmco se construye de una manera tal que se acopla la expresion de CAR con la expresion de la BFP (Protema Fluorescente Azul) a traves de un peptido que se salta el ribosoma. El CAR L90-v2 esta constituido por un dominio de union extracelular que reconoce la diana de CS1 (scFv L90) seguido por regiones bisagra y transmembrana derivadas de la protema hCD8a. La porcion intracelular de la molecula contiene un dominio coestimulador derivado de 41BB, seguido por el dominio de senalizacion CD3y ( secuencias presentadas en la Tabla 18-19-20 previa para los componentes individuales, las secuencias de scFv y CAR respectivamente).
Se evaluo la eficacia de la transduccion 6 dfas despues de la transduccion mediante citometna de flujo, tras la expresion de BFP. Se tineron tambien las celulas con anticuerpos dirigidos contra CD8 y dirigidos contra c S l.
Resultados
Expresion de CAR CS1
Los resultados de la Figura 16 muestran que las eficacias de transduccion son mayores en celulas transfectadas simuladas que en celulas que se han transfectado con TALEn que se dirige al gen CS1. Esto es probablemente debido a la destruccion espedfica de celulas de linfocitos T que expresan CS1 no transducido, aunque esta poblacion no esta afectada cuando las celulas no expresan ya CS1 como consecuencia de la alteracion del gen impulsada por TALEN.
No se observaron diferencias en los niveles de CS1 en este punto temporal entre TALEN o las celulas transfectadas simuladas (transfeccion del control negativo sin plasmido), debido a que los niveles de CS1 disminuyen en el tiempo tras la activacion inicial de linfocitos T. Por otro lado, se observo una disminucion significativa en el % de linfocitos CD8+ en celulas transfectadas simuladas que expresan CAR en comparacion con celulas CAR+ transfectadas con TALEN, indicando que se ha eliminado una alta proporcion de linfocitos CD8+ por los linfocitos T CAR+.
Evaluacion de la actividad citotoxica
Se evaluo la actividad citotoxica de estas celulas 8 dfas despues de la transduccion de CAR, cultivando simultaneamente la misma cantidad de celulas bien con una lmea de celulas que expresan CS1 (celulas L363) o como una lmea de celulas del control negativo que carece de CS1 (MOLM13). Se midio la viabilidad de las lmeas de celulas diana mediante citometna de flujo 4h despues del inicio de los cultivos simultaneos de celulas. Los resultados que se muestran en la Figura 15A muestran una viabilidad celular reducida de las celulas CS1(+) cuando se cultivaron simultaneamente con linfocitos T CAR+, aunque no se observo impacto sobre la viabilidad de las celulas CS1(-). Se calculo la lisis celular espedfica usando los datos de citometna de flujo, y fue 2 veces mayor cuando las celulas se han transfectado con TALEn que se dirige al gen CS1 antes de la transduccion de CAR (Figura 15B). Debe considerarse que el impacto puede ser incluso mayor, debido a que la cantidad de linfocitos T CAR+ presentes en los cultivos simultaneos es mayor cuando las celulas se transfectaron de forma simulada (veanse los datos de citometna de flujo de la Figura 16). Los resultados del experimento son los siguientes:
- para la muestra de NTD simulada, el % de celulas BFP+ es 0,1% y la cantidad de linfocitos CD8+ es del 53,9%; - para la muestra de TALEn/NTD, el % de celulas BFP+ es 0,2% y la cantidad de linfocitos CD8+ es del 49,5%; - para la muestra de L90-2 simulada, el % de celulas BFP+ es 94% y la cantidad de linfocitos CD8+ es del 1,8%; - para la muestra de TALEn /L90-2, el % de celulas BFP+ es del 61% y la cantidad de linfocitos CD8+ es del 8,3%.
Las eficacias de transduccion son mayores en celulas transfectadas simuladas que en celulas que se han transfectado con TALEn que se dirige al gen CS1 (NTD: no transducido).
Reactivacion tras la transduccion
A fin de confirmar que se ha alterado el gen CS1 e linfocitos T transfectados con TALEn, las diferentes muestras se reactivaron con perlas CD3/CD28 en DII tras la transduccion. 72 h despues de la reactivacion, las celulas se tineron con anticuerpos dirigidos contra CD8 y anticuerpos dirigidos contra CS1 y se analizo la expresion mediante citometna de flujo.
La Figura 17 muestra las eficacias de transduccion y los niveles de expresion de CD8/CS1 en cada muestra. Como se muestra en el panel inferior, se observo un aumento en los niveles de CS1 tras la reactivacion en celulas transfectadas simuladas, mientras que una baja cantidad de celulas son capaces de expresar CS1 en las poblaciones transfectadas con TALEn.
Los resultados del experimento son los siguientes:
- para la muestra de NTD simulada, el % de celulas BFP+ es el 0,01%, CS1 se expresa en el 65,2% de celulas y la cantidad de linfocitos CD8+ es del 80,7%;
- para la muestra de TALEn/NTD, el % de celulas BFP+ es el 0,2%, CS1 se expresa e el 9,7% de celulas y la cantidad de linfocitos CD8+ es del 78,8%;
- para la muestra de L90-2 simulada, el % de celulas BFP+ es el 94%, CS1 se expresa en el 37,5% de celulas y la cantidad de linfocitos CD8+ es del 16%.
- para la muestra de TALEn /L90-2, la intensidad de BFP es del 61%, la expresion de CS1 es 8,5% y la expresion de CD8 es del 68,5%.
Se observo un aumento en los niveles de CS1 tras la reactivacion en celulas transfectadas simuladas, mientras que una baja cantidad de celulas son capaces de expresar CS1 en las poblaciones transfectadas con TALEn.
En conjunto, estos resultados indican que el gen CS1 se altero en linfocitos T transfectados con TALEn, y que esto potencia la actividad citotoxica de las celulas CAR+ dirigidas contra CS1, preservando principalmente los linfocitos T CD8+ citotoxicos.
Ejemplo 3: DIANA DE CD70
Presentacion de la diana de CD70
CD70 es una citoquina que se une a CD27 y es parte de la familia TNF (Goodwin R.G. et al, 1993, Cell 73:447-456). Esta protema tiene un papel en las respuestas adaptativas de los linfocitos T, induce la proliferacion de linfocitos T coestimulados y potencia la generacion de linfocitos T citoltticos. Su numero de registro es P32970 (Uniprot). Algunos estudios tales como en SchLirch, C. et al. (J. Clin. Invest., 2012; doi:10.1172/JCI45977) sugieren que el bloqueo de las interacciones de CD27-CD70 podna ayudar a tratar la leucemia mielogena cronica (LMC).
Estrategia para CD70 KO
Se llevara a cabo la misma estrategia para la KO del gen CD70 como en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2. Se disenaron nucleasas TALE heterodimericas que se dirigfan a dos secuencias de 49 pb de longitud separadas por un separador de 15 pb en el gen CD70 y una nucleasa TALE que se dirigfa a una secuencia de 57 pb de longitud separadas por un separador de 23 pb. Cada semidiana se reconocio por las repeticiones de las nucleasas semi TALE relacionadas en la Tabla 22 siguiente.
T l 22: n i l i n D7 l TALEN r in iv i n
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Estrategia para la expresion de CAR dirigido contra CD70
Se llevara a cabo la misma estrategia para expresar un CAR dirigido contra CD70 tal como en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo 2.
Las mismas estructuras V1, V2 y V3 se disenaron tal como en el Ejemplo 1-2 con los mismos componentes en terminos de un peptido de senalizacion, un enlazador entre las cadenas VH y VL, un dominio transmembrana, dominios de coactivacion y dominios de transduccion (se muestran las arquitecturas generales en la Figura 11A, y las secuencias para los componentes individuales que se muestran en la Tabla 18). Solo la bisagra difiere entre las 3 versiones V1, V2 y V3, en la que se usan respectivamente la bisagra FcERy corta, la bisagra CD8a media y la bisagra IgG1 larga. En la Tabla 23 se presentan la cadena VH y VL del scFv dirigido contra CD70. La SEQ ID NO: 81-82, 85-86, 89-90 y la SEQ ID NO: 83-84, 87-88, 91-92 corresponden respectivamente a la cadena VH y la cadena VL del scFv Ab4, Ab8 de AMGEN y 1F6 de Seattle Genetics.
En la Tabla 24 se presentan los CAR dirigidos contra CD70 con el anterior scFv; basandose estos CAR en las versiones V1, V2 y V3 de acuerdo con la Figura 11A, en la que se usan respectivamente una bisagra FcEy corta, una bisagra CD8 media y una bisagra IgG1 larga.
Tabla 23: Secuencias de polinucleotidos y acidos nucleicos de las cadenas de VH y VL de los scFV de los ni r A 4 A 1F iri i nr D7
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Tabla 24: Secuencias polipeptidicas de CAR dirigidos contra CD70 basados en las versiones V1, V2 y V3 de acuerdo con la Fi ura 11A
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo ex vivo para preparar linfocitos T para inmunoterapia contra celulas patologicas que comprende la etapa de:
(a) Inactivar geneticamente un gen en un linfocito T, que esta implicado en la expresion o presentacion de un marcador antigenico, estando presente dicho marcador antigenico sobre la superficie de dicho linfocito T y la celula patologica;
(b) Expresar en dicho linfocitos T un transgen que codifica un receptor de antigeno quimerico dirigido contra dicho marcador antigenico presente en la superficie de dicha celula patologica.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la etapa a) se lleva a cabo utilizando una nucleasa de corte raro.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que dicha endonucleasa se expresa a partir de ARNm transfectado.
4. El metodo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho metodo incluye una etapa adicional de inactivar un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR).
5. El metodo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho metodo incluye una etapa adicional de inactivar un gen que codifica un componente de HLA.
6. El metodo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho metodo incluye una etapa adicional de inactivar un gen que codifica p2m.
7. El metodo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho metodo incluye una etapa adicional de inactivar un gen que codifica una protema checkpoint inmunitaria seleccionada entre CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 y GUCY1B3.
8. El metodo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho metodo incluye una etapa adicional de inactivar un gen que confiere sensibilidad de las celulas inmunitarias a los farmacos quimioterapeuticos o inmunosupresores.
9. El metodo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho linfocito T en la etapa a) se deriva de un linfocito T inflamatorio, un linfocito T citotoxico, un linfocito T regulador o un linfocito T auxiliar.
10. Un linfocito T disenado mediante ingeniena genetica obtenible de acuerdo con el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque un gen implicado en la expresion o presentacion de un marcador antigenico, que esta presente tanto en la superficie de dicho linfocito T como en la de una celula patologica, esta geneticamente inactivado dando como resultado por tanto la ausencia de dicho marcador antigenico en la superficie de dicho linfocito T; y caracterizado ademas porque dicho linfocito T expresa un receptor de antfgeno quimerico dirigido contra dicho marcador antigenico presente en la superficie de dicha celula patologica.
11. El linfocito T disenado mediante ingeniena genetica de acuerdo con la reivindicacion 10 que da como resultado el fenotipo [CAR CD38]+[CD38]-.
12. El linfocito T disenado mediante ingeniena genetica de acuerdo con la reivindicacion 10 que da como resultado el fenotipo [CAR CD70]+[CD70]-.
13. El linfocito T disenado mediante ingeniena genetica de acuerdo con la reivindicacion 10 que da como resultado el fenotipo [CAR CS1]+[CS1]-.
14. Una poblacion de linfocitos T disenados mediante ingeniena genetica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso en el tratamiento de un paciente al que se le ha diagnosticado la presencia de celulas patologicas que presentan marcadores antigenicos espedficos en comun con los linfocitos T.
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