ES2710875T3 - Procedimiento para preparar ansamitocinas purificadas - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para preparar ansamitocinas purificadas que comprende las etapas de: 1) cultivo de un microorganismo productor de ansamitocinas en un medio de cultivo líquido; 2) extracción en fase sólida de ansamitocinas del medio de cultivo sobre una resina; 3) elución isocrática o con gradiente de ansamitocinas de la resina usando un disolvente orgánico o un disolvente orgánico combinado con agua; 4) concentración de las ansamitocinas extraídas; y 5) opcionalmente purificación de las ansamitocinas por una cualquiera de a), b), c) y d): a) cromatografía de adsorción sobre gel de sílice o alúmina, b) cristalización, c) cromatografía de adsorción sobre gel de sílice o alúmina seguida de cristalización, y d) cristalización seguida de cromatografía de adsorción sobre gel de sílice o alúmina; y en donde dichas ansamitocinas comprenden una mezcla de compuestos de la siguiente estructura:**Fórmula** en donde R es COCH3, COCH2CH3, COCH(CH3)2, COCH2CH2CH3, COCH2CH(CH3)2 o COCH2CH2CH2CH3.
Description
DESCRIPCION
Procedimiento para preparar ansamitocinas purificadas
Campo de la invencion
La invencion se refiere a un procedimiento para preparar ansamitocinas purificadas. Ansamitocinas se refiere a una mezcla de ansamitocinas que difieren en su cadena lateral de ester en C-3. Las ansamitocinas se pueden convertir en maitansinol con alcohol en C-3.
Antecedentes de la invencion
Las ansamitocinas son compuestos muy citotoxicos obtenidos de fermentacion de microorganismos tales como Actinosynnema pretiosum. Las ansamitocinas se han convertido qulmicamente en maitansinoides que contienen tiol, cuyo uso terapeutico en forma de conjugados de agente de union a celulas-maitansinoide se ha descrito (patentes de EE.UU. n° 5.208.020; 5.410.064; 6.333.410; y 6.441.163).
El procedimiento de fermentacion con cepas del genero Actinosynnema tales como Actinosynnema pretiosum produce varias especies de ansamitocinas que llevan distintos sustituyentes ester en C-3 (Fig. 1). Los diferentes esteres en C-3 producidos incluyen P-3 (isobutirilo), P-3' (n-butirilo), P-2 (propionilo), P-4 (iso-valerilo), P-4' (nvalerilo). Todos estos esteres se pueden escindir de forma reductora para dar el maitansinol con alcohol en C-3 (P 0), que es el precursor para la slntesis de matiansinoides que contienen tiol. Ademas, se producen pequenas cantidades de ansamitocinas no deseadas que estan modificadas en otros sitios, tales como N-desmetilo, 20-O-desmetilo y 19-descloro. Tras la desacilacion reductora estas ansamitocinas no producen maitansinol.
Se han descrito procedimientos para producir ansamitocinas a partir de la fermentacion del genero Actinosynnema (Patentes de EE.UU. n° 4.162.940; 4.450.234; 4.228.239; 4.331.598; y 4.356.265). El rendimiento de ansamitocinas producidas varla, con valores que en general estan en el intervalo de 12 mg/l a 100 mg/l. Las ansamitocinas tlpicamente se recuperan y purifican por un procedimiento de multiples etapas que implican la adicion de un coadyuvante de filtracion y un disolvente organico al caldo de fermentacion completo, seguido de concentracion de la capa organica y precipitation con eter de petroleo. El precipitado se purificaba mas usando cromatografla en sllice y cristalizacion, seguido de la purification adicional por recristalizacion o cromatografla.
Por lo tanto, el procedimiento es diflcil e implica varias etapas donde debe manejarse material muy toxico. Esto hace que el aumento de escala de dicho procedimiento sea muy diflcil. Ademas, se debe asegurar la seguridad del operador humano a lo largo de las diferentes etapas del procesamiento.
Una solicitud reciente (US 2002/0015984 A1) reivindica algunas mejoras en el procedimiento para la production de ansamitocinas. Se describe que los valores de ansamitocinas en el caldo de fermentacion estan en el intervalo de 65 a 86 mg/l. Las mejoras reivindicadas inclulan inactivation termica del caldo a 75°C, extraction en un disolvente hidrocarbonado aromatico tal como tolueno, cromatografla por columna de sllice abierta, seguido de cristalizacion. Los documentos US 4.307.016 y US 4.361.650 ensenan el aislamiento de 20-desmetoxi-20-hidroxi-maitansinol por extraccion en fase solida aprovechando la propiedad debilmente acida y lipofila de los compuestos de esta clase. El adsorbente preferido usado es gel de sllice.
Con el fin de reducir el coste de produccion de ansamitocinas, se han producido nuevas cepas del genero Actinosynnema que dan valoraciones significativamente mayores (hasta 400 mg/l en fermentadores) que las descritas previamente. Los procedimientos descritos previamente para la produccion de ansamitocinas tienen varios inconvenientes, y por lo tanto no se pueden adaptar para las nuevas cepas de alta produccion que se han desarrollado. Por ejemplo, la inactivacion termica a 75°C da como resultado algo de degradation de la ansamitocina y una perdida de rendimiento de 10 a 20%. La extraccion del caldo de fermentacion que contiene alto contenido de ansamitocinas con hidrocarburos aromaticos es ineficaz e incompleta, puesto que las ansamitocinas no son muy solubles en dichos disolventes. La purificacion de las ansamitocinas en columnas de sllice autoempaquetadas abiertas tiene dos inconvenientes: 1) variabilidad de un lote a otro en la pureza y recuperation, y 2) exposition humana significativa que produce problemas de seguridad.
Por lo tanto, existe una necesidad de producir ansamitocinas con altos rendimientos y tambien de proporcionar un procedimiento eficaz para su aislamiento y purificacion, a la vez que se minimiza la exposicion del trabajador al farmaco altamente toxico.
Resumen de la invencion
Un procedimiento para preparar ansamitocinas purificadas que comprende las etapas de:
1) Cultivo de un microorganismo productor de ansamitocinas en un medio de cultivo llquido;
2) Tratamiento opcional del medio de cultivo para facilitar la extraccion de ansamitocinas;
3) Extraccion en fase solida de ansamitocinas del medio de cultivo sobre una resina;
4) Elucion isocratica o con gradiente de ansamitocinas de la resina usando un disolvente organico o un disolvente organico combinado con agua;
5) Concentracion de las ansamitocinas extraldas; y
6) Opcionalmente purificacion adicional de las ansamitocinas por una cualquiera de a), b), c) y d):
a) cromatografla de adsorcion sobre gel de sllice o alumina,
b) cristalizacion,
c) cromatografla de adsorcion sobre gel de sllice o alumina seguida de cristalizacion, y
d) cristalizacion seguida de cromatografla de adsorcion sobre gel de sllice o alumina;
y en donde dichas ansamitocinas comprenden una mezcla de compuestos de la estructura de la figura 1, en donde R es COCH3 , COCH2CH3, COCH(CH3)2, COCH2CH2CH3 , COCH2CH(CH3)2 o COCH2CH2CH2CH3. El procedimiento puede incluir opcionalmente:
(i) inactivacion qulmica o termica de los microorganismos en el caldo de fermentacion;
(ii) una etapa de lavado en la que una solucion bruta de ansamitocinas en disolvente organico se lava con agua, una solucion salina acuosa, un acido acuoso o una base acuosa en cualquier combinacion secuencial, sea antes o despues de la precipitacion cuando se lleva a cabo durante la purificacion.
En los metodos descritos antes, se prefiere que el microorganismo productor de ansamitocinas sea del genero Actinosynnema, mas preferiblemente Actinosynnema pretlosum. El microorganismo productor de ansamitocinas tambien puede ser Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 o cepas derivadas del mismo o Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921) o cepas derivadas del mismo. Como se describe en la patente de EE.UU. n° 4.450.234, Actinosynnema pretiosum ATCc 31565 se deposito en (i) el Instituto de la Fermentacion, Osaka, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japon, el 20 de agosto, 1979, con el numero de acceso de IFO 13963; (ii) Instituto Nacional de Biociencia y Tecnologla Humana (antes Instituto de Investigacion de la Fermentacion), Agencia de Tecnologla y Ciencia Industriales, Ministerio de Comercio Internacional e Industria, 1-3, higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japon, el 29 de agosto, 1979, con el numero de acceso de FERM-P NO. 5185; y (iii) la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU., el 11 de septiembre, 1979, con el numero de acceso de ATCC 31565. Ademas, Actinosynnema pretiosum PF4-4 se deposito bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU., el 11 de diciembre, 2001, y se ha concedido el n° de acceso de ATCC PTA-3921.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra la estructura de diferentes esteres en C-3 de ansamitocinas que se pueden hacer por fermentacion.
Descripcion detallada de la invencion
Se describen metodos para el cultivo de un microorganismo altamente productivo para ansamitocinas en un medio de cultivo llquido en fermentadores grandes. Si es necesario, el microorganismo se puede inactivar por tratamiento termico o tratamiento con cloroformo antes de la etapa de extraccion.
Las ansamitocinas purificadas que podrlan incluir una mezcla de diferentes esteres en C-3, tales como ansamitocinas P-3, P- 3', P-4, P-4', P-2 y P-1 (Fig. 1), se pueden tratar con un agente de reduction para dar el compuesto con hidroxilo en C-3, maitansinol (P-0). Las ansamitocinas purificadas tlpicamente contienen solo cantidades minoritarias de ansamitocinas no deseadas que tienen modificaciones en sitios de la molecula distintos de la position C-3. Preferiblemente, la cepa productora de ansamitocinas es del genero Actinosynemma. Mas preferiblemente, el microorganismo es Actinosynnema pretlosum. El microorganismo tambien puede ser Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921) y sus derivados y Actinosynnema pretiosum ATCC 31566 y sus derivados. El microorganismo se puede desarrollar por tecnicas de cultivo de fermentacion que son conocidas para los expertos en la tecnica, usando los medios especlficos descritos en la presente memoria o cualquier otro medio que se describa en la tecnica (Patentes de EE.UU. n° 4.162.940; 4.450.234; 4228.239; 4.331.598; y 4.350.265). El microorganismo se puede cultivar en un medio de cultivo llquido. El crecimiento de la cepa bacteriana PF4-4 se lleva a cabo en condiciones controladas y se puede usar una amplia variedad de medios y condiciones. Por ejemplo, PF4-4 se puede cultivar en condiciones similares y con medios similares a los descritos para ATCC 31565 o ATCC 31281 en las patentes de EE.UU. publicadas n° 4.137.230; 4.162.940; 4.331.598; 4.356.265; y 4.450.234; y como se describe en Hatano et al., Agric. Biol. Chem. 48, 1721-1729, 1984. Por lo tanto, la cepa PF4-4 tolera una amplia
variedad de fuentes de carbono, que tambien soporta la produccion fermentativa de ansamitocinas. Se dan medios de cultivo de ejemplo en las tablas 1 y 2. La tabla 1 muestra los medios que soportan la produccion de ansamitocinas por microorganismos productores de ansamitocinas, tales como Actinosynnema pretlosum PF4-4 y la tabla 2 muestra medios adicionales adecuados para la propagacion y/o crecimiento de Actinosynnema pretiosum PF4-4, y otros microorganismos productores de ansamitocinas.
Tabla 1. Composicion de los medios de produccion (las entradas son % en p/v)
Tabla 2 Medios relacionados
Los metodos preferidos para la produccion fermentativa de ansamitocinas a partir de la cepa PF4-4 se describen mas en los ejemplos 1 y 2 mas adelante.
Fermentacion:
El cultivo se puede llevar a cabo mediante condiciones de cultivo tales como condiciones de cultivo estacionario, agitado, sumergido aerobico o cualesquiera otras. Para un buen crecimiento del cultivo y alta produccion de ansamitocinas en fermentadores de tanques grandes, se prefiere el cultivo sumergido aerobico. La produccion de ansamitocinas se puede potenciar ademas mediante alimentacion de nutrientes durante la fermentacion. Por ejemplo, cuando se cultiva el organismo en medio FM4-6, la alimentacion adicional de glucosa durante la duracion de la fermentacion o de glucosa durante aproximadamente las primeras 24 a 72 horas, preferiblemente durante aproximadamente las primeras 48 h, seguido de alimentacion con glucosa y un nutriente proteico tal como harina de semilla de algodon (por ejemplo, Proflo o Pharmamedia de Trader's Protein, Memphis, TN) o harina de soja, y un alcohol o un aldehfdo para facilitar la formacion de la cadena lateral de ester en C-3, tal como isobutanol, isobutiraldehfdo, n-butanol, n-butiraldehfdo, n-propanol, n-propionaldehfdo, isopropanol, isopropionaldehfdo, pentanol, valeraldehfdo, isopentanol, isovaleraldehfdo, hasta el final de la fermentacion, puede dar como resultado la duplicacion de la produccion de ansamitocinas. Aunque las condiciones de cultivo dependen de los medios usados y la escala de produccion, normalmente se prefiere llevar a cabo la fermentacion en el intervalo de pH de 5 a 9, preferiblemente con un pH inicial de 6,5 a 8,0. Mas preferiblemente, el intervalo de pH es de 7 a 8, incluso mas preferiblemente de 7 a 7,4. El pH mas preferido es 7,2. La temperatura puede estar en el intervalo de 15° a 35°C, con un intervalo preferido de 25° a 30°C. Mas preferiblemente, la temperatura es 28°C. La fermentacion se continua hasta que se ha logrado la acumulacion maxima de ansamitocinas. El tiempo de cultivo puede variar y depende de varios factores que incluyen el metodo de cultivo, la composicion del medio y la temperatura. Tlpicamente, el tiempo de la fermentacion esta en el intervalo de 96 a 336 h.
Analisis de ansamitocinas:
En las patentes de EE.UU. n° 4.331.598 y 4.450.234, se describe la cepa original ATCC 31565 como productora de dos clases de ansamitocinas que se distinguen por la presencia de un grupo metilo o hidroximetilo en C-14 (vease la fig. 1). Para ambas clases, se producen varias ansamitocinas diferentes que difieren en su respectiva cadena lateral de acilo unida al atomo de oxlgeno de C-3, y con respecto a si C-14 lleva un grupo metilo o hidroximetilo (o, en posteriores estudios, N-desmetilo). La nomenclatura usada en la presente memoria para los compuestos permutados se ha definido antes con respecto a la fig. 1.
La ansamitocina P-3 es el producto principal de PF4-4 y la cepa original ATCC 31565, en determinadas condiciones de crecimiento. Si las bacterias se cultivan en presencia de valina o acido isobutlrico (vease la patente de EE. UU. n° 4.228.239), o alcohol isobutllico o isobutiraldehldo (vease la patente de EE.UU. n° 4.356.265), otros compuestos ansamitocinas estan presentes solo en cantidades minoritarias.
Cuando la cepa PF4-4 se cultiva en diferentes medios de fermentacion (denominados FM en la tabla 1), los cuales contienen todos alcohol isobutllico, la ansamitocina P-3 es la ansamitocina predominante producida. En un metodo para determinar la cantidad de ansamitocinas, muestras de los caldos de fermentacion se diluyen con etanol
o acetonitrilo, despues se agitan fuertemente y finalmente se centrifugan. Despues se determina en el llquido sobrenadante el contenido de ansamitocina P-3.
Las ansamitocinas preferiblemente se fraccionan y analizan por cromatografla llquida de alto rendimiento de fase inversa (HPLC), pero se puede usar cualquier tecnica adecuada, tal como, por ejemplo, se puede usar MALDI-TOF o cromatografla en capa fina.
Extraccion de ansamitocinas:
Las ansamitocinas se pueden extraer del caldo de fermentacion por metodos usados en general para la recuperacion de metabolitos secundarios. Puesto que las ansamitocinas son facilmente solubles en disolventes no aromaticos, se pueden extraer facilmente por agitacion con disolventes inmiscibles con el agua no aromaticos tales como acetatos de alquilo, en donde la cadena de alquilo es lineal o ramificada y tiene 1-5 atomos de carbono, dialquilcetonas y disolventes halogenados. Los ejemplos de acetatos de alquilo adecuados incluyen acetato de nbutilo, acetato de etilo y acetato de metilo. Un ejemplo de una dialquilcetona adecuada es metilisobutilcetona. Un ejemplo de un disolvente halogenado adecuado es diclorometano. Se prefiere la extraccion con acetato de n-butilo. Preferiblemente, la relacion del caldo de fermentacion al disolvente inmiscible con el agua no aromatico es 1:1 en volumen.
Las ansamitocinas de acuerdo con la invencion son adsorbidas del caldo de fermentacion sobre diferentes resinas, tales como Amberlite XAD-4, XAD-16 disponibles en el mercado en Rohm and Haas Company, Diaion HP20, HP21, Sepabeads SP825, SP850, SP70, SP700 disponibles en el mercado en Mitsubishi Chemical Industries Ltd. Estos ejemplos no limitan el alcance, tambien se pueden usar otras resinas conocidas por el experto en la tecnica para el proposito anterior. La resina tambien se puede usar como un recubrimiento sobre una estructura secundaria tal como un iman o un material de alta densidad de modo que el pollmero se puede recuperar del caldo por metodos magneticos o por metodos que se basan en la densidad adsorbente tales como cromatografla de lecho expandido. Una vez que las ansamitocinas son adsorbidas sobre la resina, se eluyen usando uno o mas disolventes organicos mediante elucion isocratica o con gradiente. En una realización la resina se puede anadir directamente al caldo para extraer las ansamitocinas.
Las ansamitocinas se pueden recuperar de la resina por varios medios. En una realización, la resina se puede recuperar por filtracion. En una segunda realización, la resina se puede recuperar por centrifugacion y el sedimento despues se puede eluir con uno o mas disolventes organicos o con uno o mas disolventes organicos combinados con agua. En una tercera realización, la fase acuosa y los residuos solidos se pueden retirar de la resina por cromatografla de lecho expandido. Despues la resina se puede comprimir en la columna de lecho expandido y eluir con uno o mas disolventes organicos o con uno o mas disolventes organicos combinados con agua por elucion isocratica o con gradiente. En una cuarta realización, la resina puede extraer las ansamitocinas mientras se esta separando del caldo de fermentacion mediante una membrana parcialmente permeable. Por ejemplo, se puede agitar una membrana de dialisis empaquetada con resina con caldo de fermentacion, el agua y los componentes de bajo peso molecular pueden pasar a traves de la membrana, permitiendo que las ansamitocinas se unan a la resina. Despues se puede retirar la bolsa de dialisis del caldo y la resina recuperada despues se puede eluir como se ha descrito antes.
Antes de la extraccion, los microbios en el caldo de fermentacion se pueden inactivar, si se desea, por exposicion a calentamiento suave de aproximadamente 50° a 55°C durante de aproximadamente 30 minutos a 2 horas, o por adicion de cloroformo al 1% (v/v) (Toru Hasegawa et al. 1983, Int. J. Syst. Bacteriol. 33:314-320).
Tambien, antes o durante la extraccion, el procedimiento puede incluir tratamiento del medio de cultivo para facilitar la extraccion de ansamitocinas con disolvente. El tratamiento puede incluir, pero no se limita a calentamiento, ajuste de pH, o tratamiento enzimatico o qufmico, tal como la adicion de polisulfato ferrico, agentes desemulsionantes, sflice de combustion o codisolventes tales como acetona o alcoholes tales como metanol.
En el caso de extraccion de la fase organica, la extraccion se lleva a cabo a un pH entre 2,0-13,0, pero preferiblemente a un pH de aproximadamente 6,0 a 7,0, y mas preferiblemente a un pH de aproximadamente 6,5 a 7,0, y preferiblemente con acetato de n-butilo. Con el fin de mejorar la eficacia de la extraccion, el caldo se puede mantener a una temperatura entre 5°C y 80°C, preferiblemente entre 30°C y 45°C durante el procedimiento de extraccion.
El tiempo de extraccion depende de varios factores que incluyen la composicion del caldo, la temperatura del caldo y el disolvente de extraccion, el metodo de mezclamiento del caldo y el disolvente, y el disolvente usado para la extraccion. El tiempo de extraccion esta en el intervalo de 1 hora a 120 horas, dependiendo del metodo de extraccion. Por ejemplo, cuando se elige un procedimiento de extraccion y filtracion rapido, el tiempo de extraccion puede estar en el intervalo entre 1-12 horas.
Se pueden usar coadyuvantes de filtracion durante la filtracion. Dichos coadyuvantes incluyen, pero no se limitan a Celpure P1000, Celatom FW- 80, Hyflo Super Cel y Celite. Opcionalmente, los coadyuvantes de filtracion se pueden anadir directamente al caldo durante la filtracion. Opcionalmente, los filtros tambien pueden estar prerecubiertos con un coadyuvante de filtracion. Los metodos de filtracion que se pueden usar en este procedimiento incluyen, pero no se limitan a filtracion de flujo tangencial, filtracion por tambor con rascadores recubierto de coadyuvante de filtracion y filtracion discontinua.
En los casos donde la extraccion se lleva a cabo a pH extremos tales como pH 1 - pH 5 o pH 8 - pH 13, o a temperaturas muy elevadas tales como 60°C - 90°C, la extraccion deberla completarse a una velocidad que evite la descomposicion excesiva de las ansamitocinas. Si es necesario, la extraccion tambien se puede llevar a cabo de forma extremadamente rapida por centrifugacion continua. En dicho caso, el pH o temperatura del caldo de fermentacion se ajustarla segun entrara el caldo en la centrlfuga de modo que se evite la exposicion prolongada a condiciones duras. Los ejemplos de equipamiento de centrifugacion que se han usado en el procesamiento de la fermentacion y se podrlan usar para extraer ansamitocinas, incluyen, pero no se limitan a decantadores centrlfugos y centrlfugas de discos apilados. Despues, el extracto de disolvente organico retenido se puede concentrar a presion reducida para dar un residuo que contiene las ansamitocinas. Alternativamente, se puede mezclar un disolvente miscible con agua con el caldo de fermentacion y centrifugar para separar solidos dando una solucion sin solidos, de una sola fase. La solucion despues se puede procesar, por ejemplo, por adicion de un disolvente inmiscible con el agua para producir la separacion de las fases organicas y acuosas seguido de concentration de la fase organica. Lavado acuoso de las ansamitocinas en solucion
Las ansamitocinas en una solucion de disolvente organico inmiscible con el agua se pueden lavar con agua, acido acuoso, base acuosa, agua parcial o totalmente saturada con sal o una combination de cualquiera de los lavados acuosos descritos. Los ejemplos de acidos acuosos incluyen, pero no se limitan a soluciones acuosas de acido clorhldrico, acido sulfurico, acido acetico, acido formico y acido fosforico, a un pH entre 1-6,9. El acido acuoso tambien incluye un sistema tamponado acuoso acido. Los ejemplos de sistemas tamponados acidos incluyen, pero no se limitan a fosfato sodico, fosfato potasico, acetato amonico y formiato amonico, ajustandose el pH de cada uno para usar en sus respectivos intervalos de tamponamiento acido. Los ejemplos de bases acuosas incluyen, pero no se limitan a soluciones acuosas de bicarbonato sodico, bicarbonato potasico, carbonato sodico, hidroxido sodico, hidroxido amonico y fosfato sodico a un pH entre 7,1-13. La base acuosa tambien incluye un sistema tamponado acuoso basico. Los ejemplos de sistemas tamponados basicos incluyen, pero no se limitan a fosfato sodico, fosfato potasico, borato sodico y carbonato amonico, ajustandose el pH de cada uno para usar en sus respectivos intervalos de tamponamiento basico.
Los lavados acidos o basicos deben completarse sin descomposicion apreciable de las ansamitocinas, que variarla con el pH. Si es necesario, se pueden llevar a cabo extracciones extremadamente rapidas por tecnicas centrlfugas. Los ejemplos de agua parcial o totalmente saturada con sal incluyen, pero no se limitan a cloruro sodico acuoso en diferentes niveles de saturation, sulfato sodico acuoso en diferentes niveles de saturation, y cloruro potasico acuoso en diferentes niveles de saturacion. Tambien se pueden llevar a cabo lavados acuosos en los que se combina una mezcla de una solucion salina acuosa total o parcialmente saturada con una base acuosa o un acido acuoso.
Filtracion antes de extraccion:
Alternativamente, antes de la extraccion, los solidos en el caldo de fermentacion que contiene las ansamitocinas se pueden separar por filtracion o centrifugacion. Las ansamitocinas en la masa de celulas solidas se pueden recuperar por lavado con un disolvente tal como etanol, etanol acuoso u otros disolventes organicos, tales como acetato de etilo, acetato de butilo, diclorometano o acetona, y es bien conocido para el experto en la tecnica. Las ansamitocinas en el filtrado se pueden recuperar por extraccion con un disolvente organico aromatico conocido como se describe en otra parte en esta solicitud.
Purificacion de las ansamitocinas:
El producto bruto se puede someter a procedimientos de purificacion tales como cromatografla de adsorcion sobre gel de silice o alumina, seguido de recristalizacion si es necesario. Preferiblemente, la cromatografla se lleva a cabo en una columna preempaquetada, tal como un cartucho de gel de silice Biotage usando el sistema de cromatografla Biotage. Las ansamitocinas deseadas se pueden eluir de la columna usando un gradiente de disolvente empezando con una mezcla de acetato de etilo y hexano y anadiendo cantidades crecientes de metanol. Las fracciones que contienen las ansamitocinas deseadas se pueden juntar y concentrar. Si se desea, las ansamitocinas se pueden purificar mas por cristalizacion usando un disolvente tal como acetato de etilo para disolver el producto, y despues adicion de un disolvente no polar tal como heptano o hexano para cristalizar el producto puro. El termino cristalizacion como se usa en la presente memoria abarca el termino precipitation, en cuanto que el solido formado a partir de la solucion puede tener una estructura amorfa o definida.
Complejos de agente de union a celula/maitansinoide:
El procedimiento de la invencion se puede usar para hacer complejos de agente de union a celula/maitansinoide que son utiles como profarmacos activados por tumor. Las ansamitocinas preparadas por el procedimiento de la invencion pueden sufrir escision reductora a maitansinol, el cual se puede usar como se describe en las patentes de EE.UU. n° 5.208.020. 5.416.064. 6.333.410 y 6.441.163 para producir derivados de
maitansinoide que contienen N-metil-L-alanina. Estos derivados despues se conjugan con agentes de union a celulas, preferiblemente anticuerpos, mediante diferentes conectores tales como conectores que contienen disulfuro.
Ejemplos
La invencion se ilustrara ahora por referencia a ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 de referencia. Produccion de ansamitocinas:
Siembra primaria: Se vertio medio de cultivo de siembra VM4-1' (400 ml/matraz) que comprendla almidon soluble al 2%, glucosa al 1%, harina de soja al 1%, licor de malz fermentado al 0,5%, (Roquette) Soytone al 0,5%, cloruro sodico al 0,3% y carbonato de calcio al 0,5%, en cada uno de once matraces Erlenmeyer de 2 litros de capacidad. Despues de esterilizacion, cada uno de los matraces se inoculo con el cultivo de PF4-4 (ATCC PTA-3921). Los matraces se incubaron a 28°C en un agitador orbital a 230 rpm durante 48 h.
Siembra secundaria: El contenido de los matraces de siembra primaria se juntaron. Un fermentador de 300 litros se cargo con 100 litros del medio de siembra VM4-1'. Despues de esterilizacion, el fermentador se inoculo con 4 litros del cultivo de siembra primaria reunido. El fermentador se mantuvo a 28°C, con agitacion a 80 rpm. El nivel de oxlgeno disuelto se mantuvo por encima de 30% de saturacion por aireacion y mayor agitacion si era necesaria. Despues de incubacion durante 24 h, el cultivo de siembra secundaria estaba listo para ser transferido a los recipientes de produccion.
Produccion: Se cargaron dos fermentadores de produccion de 300 litros cada uno con 250 litros de medio de produccion FM4-6 (vease la tabla 1). Despues de esterilizacion, se inoculo en cada uno de los fermentadores 15 litros del cultivo de siembra secundaria. Los fermentadores se mantuvieron a 28°C con agitacion a 107 ± 5 rpm y aireacion a 0,4 vvm. Despues del dla 2, el contenido de oxlgeno disuelto se mantuvo por encima de 30% aumentando la velocidad de agitacion a un maximo de 170 ± 5 rpm, y la tasa de aireacion a un maximo de 1 vvm. Se midio el valor de ansamitocinas diariamente por extraccion de una muestra del caldo de fermentacion y dilucion en etanol, seguido de cuantificacion por analisis por HPLC. La fermentacion se continuo hasta el dla 10, momento en el que la acumulacion de ansamitocinas se estabilizo. El valor de ansamitocinas el dla 10 en los dos fermentadores era 251 mg/l y 244 mg/l respectivamente. El pH del caldo de fermentacion se ajusto a 6,5 por adicion de acido fosforico. Los fermentadores se calentaron hasta 55°C y se mantuvieron a esta temperatura durante 1 h para inactivar el microorganismo. Despues los fermentadores se enfriaron a temperatura ambiente por extraccion con un disolvente organico.
Ejemplo de referencia 2: Produccion de ansamitocinas usando un procedimiento de alimentacion discontinua.
Un fermentador de produccion de 1500 litros se cargo con 900 litros de medio de produccion FM4-6 (vease la tabla 1). Despues de esterilizacion, se inocularon en el fermentador 54 litros de cultivo de siembra secundaria, preparado como se ha descrito antes. El fermentador se mantuvo a 28°C con agitacion a 107 ± 5 rpm y aireacion a 0,4 vvm. De 0 a 48 h, se alimento una solucion acuosa de glucosa al 28,5% a una velocidad de 0,39 ml/l/h. De 48 a 288 h la alimentacion se cambio a una solucion madre que comprendla glucosa al 21,5%, Proflo al 7,1% e isobutanol al 7,1%, que se alimento a una velocidad de 0,51 ml//l/h. Despues de 2 dlas, el contenido de oxlgeno disuelto se mantuvo por encima de 20% aumentando la velocidad de agitacion a un maximo de 170 ± 5 rpm, y la tasa de aireacion a un maximo de 1 vvm. Se midio el valor de ansamitocinas diariamente por extraccion de una muestra del caldo de fermentacion y dilucion en etanol, seguido de analisis cuantitativo por HPLC. La fermentacion se continuo hasta el dla 13, momento en el que la acumulacion de ansamitocinas se habla estabilizado. El valor de ansamitocinas el dla 13 en el fermentador era 304 mg/l. El pH del caldo de fermentacion se ajusto a 6,5 por adicion de acido fosforico.
Inactivacion termica. El fermentador se calento a 55°C y se mantuvo a esta temperatura durante 1 h para inactivar el microorganismo. Despues los fermentadores se enfriaron a entre 30 y 40°C para la extraccion con un disolvente organico.
Ejemplo 3 (comparativo): Extraccion y purificacion cromatografica de ansamitocinas.
El caldo de fermentacion del ejemplo 2 se mezclo con un volumen igual de acetato de n-butilo. La mezcla se mantuvo entre 30 y 40°C a 45°C, y se agito suavemente de modo que la mezcla de las dos fases se producla justo en la interfase del disolvente. La extraccion se continuo durante hasta 5 dlas, o hasta que el analisis por HPLC de la capa organica indicaba que se habla extraldo >80% de las ansamitocinas. Despues se separo la capa organica, y se evaporo usando un evaporador de pellcula descendente hasta un volumen final de entre 20 y 50 litros. El extracto concentrado se transfirio a un matraz que contenla 2,2 kg de gel de sllice. Las ansamitocinas brutas se aplicaron como recubrimiento sobre el gel de sllice por evaporacion del disolvente hasta sequedad usando un rotavapor, funcionando a presion reducida. Despues la sllice recubierta se transfirio a un modulo de inyeccion de muestra (SIM), obtenido de Blotage, Inc., Charlotesville, VA. El SIM se lavo con una mezcla de ciclohexano y hexano (2:1 v/v), y despues se conecto a un sistema Biotage 150M equipado con un cartucho de sllice. El producto deseado se eluyo de la columna usando una mezcla de acetato de etilo:hexano:metanol (29,4:68,6:2,0, v/v/v). Las fracciones
que contenlan ansamitocinas se juntaron y se evaporo el disolvente a presion reducida. El producto se seco mas con alto vaclo durante 24 h.
Ejemplo de referencia 4: Recristalizacion de ansamitocinas
El producto seco de la etapa anterior se disolvio en acetato de etilo caliente (23 ml/g de residuo). La mezcla se mantuvo entre 60-75°C hasta que se logro la disolucion completa de las ansamitocinas. Se anadio lentamente heptano (80 ml/g de residuo), mientras se mantenla la temperatura del lote entre 60-75°C. Despues de haber anadido todo el heptano, el lote se dejo enfriar a temperatura ambiente. Los cristales se recuperaron por filtracion y despues se secaron con alto vaclo para dar 221 gramos de ansamitocinas puras.
Ejemplo 5 (comparativo): Extraccion del caldo de fermentacion con filtracion.
El caldo de fermentacion (200 ml) preparado como se describe en el ejemplo 2, se mezclo energicamente durante 5 minutos con 200 ml de acetato de n-butilo (200 ml), dando como resultado una emulsion. Se anadio el coadyuvante de filtracion Cellatom FW-80 (20 g) y la mezcla se filtro con vaclo a traves de un embudo buchner que se habla recubierto previamente con coadyuvante de filtracion Cellatom FW-80. La torta de filtracion se lavo con 40 ml de acetato de n-butilo. El filtrado, ahora sin contaminantes solidos, que comprendla una capa organica y acuosa transparente se transfirio a un embudo de separacion. Se dreno la fase acuosa. Se retuvo la fase organica que contenla las ansamitocinas.
Ejemplo 6 (comparativo): Extraccion del caldo de fermentacion con centrifugacion usando un disolvente inmiscible con el agua.
Una parte de caldo de fermentacion, preparado como se describe en el ejemplo 2, se mezclo energicamente con una parte de acetato de n-butilo durante 2 min. La emulsion resultante se centrifugo durante 1 minuto y se extrajo la capa organica que contenla las ansamitocinas, exenta de los contaminantes solidos.
Ejemplo 7 (comparativo): Extraccion del caldo de fermentacion con centrifugacion usando un disolvente miscible con el agua.
Una parte de caldo de fermentacion, preparado como se describe en el ejemplo 2, se mezclo energicamente con una parte de acetona. La mezcla se centrifugo durante 1 minuto para sedimentar los solidos. El llquido sobrenadante se extrajo y se mezclo con media parte de hexanos. Se separo la capa acuosa dejando una fase organica transparente que contenla las ansamitocinas.
Ejemplo 8. Extraccion en fase solida de ansamitocinas usando perlas hidrofobas XAD-16.
Un litro de caldo de fermentacion, preparado como se describe en el ejemplo 2, se agito con 10 gramos de perlas XAD-16 durante seis horas. Despues la mezcla se centrifugo y se separo el llquido sobrenadante. El sedimento se transfirio a una columna pequena y se eluyo con agua desionizada, seguido de agua desionizada:acetonitrilo 90:10. Se combinaron las fracciones que contenlan ansamitocinas y el disolvente se evaporo para dar 112 mg de extracto concentrado. El analisis por HPLC indicaba que el extracto contenla 50 g de ansamitocinas.
Aunque la invencion se ha descrito con detalle y con referencia a sus realizaciónes especlficas, sera evidente para un experto en la tecnica que se pueden hacer en la misma diferentes cambios y modificaciones.
Claims (14)
1. Un procedimiento para preparar ansamitocinas purificadas que comprende las etapas de:
1) cultivo de un microorganismo productor de ansamitocinas en un medio de cultivo llquido;
2) extraccion en fase solida de ansamitocinas del medio de cultivo sobre una resina;
3) elucion isocratica o con gradiente de ansamitocinas de la resina usando un disolvente organico o un disolvente organico combinado con agua;
4) concentracion de las ansamitocinas extraldas; y
5) opcionalmente purification de las ansamitocinas por una cualquiera de a), b), c) y d):
a) cromatografla de adsorcion sobre gel de sllice o alumina,
b) cristalizacion,
c) cromatografla de adsorcion sobre gel de sllice o alumina seguida de cristalizacion, y
d) cristalizacion seguida de cromatografla de adsorcion sobre gel de sllice o alumina;
y en donde dichas ansamitocinas comprenden una mezcla de compuestos de la siguiente estructura:
en donde R es COCH3 , COCH2CH3 , COCH(CH3)2 , COCH2CH2CH3 , COCH2CH(CH3)2 o COCH2CH2CH2CH3.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la extraccion se lleva a cabo a un pH de 6 a 7; y/o a una temperatura de 30°C a 45°C.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el microorganismo productor de ansamitocinas es del genero Actinosynnema o Actinosynnema pretiosum.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el microorganismo productor de ansamitocinas es Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 o una cepa derivada del mismo o Actinosynnema pretiosum PF4-4 (ATCC PTA-3921) o una cepa derivada del mismo.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho cultivo es a un pH en el intervalo de 6,5 a 8 o de 7 a 7,4 o es 7,2; y/o en donde la temperatura esta en el intervalo de 15°C a 35°C o de 25°C a 30°C o es 28°C.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en donde la temperatura es 28°C y el pH es 7,2.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde se proporciona al menos un nutriente durante dicho cultivo.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en donde el al menos un nutriente es una fuente de carbono.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en donde la fuente de carbono es glucosa.
10. El procedimiento de la reivindicación 8 o reivindicación 9, en donde el al menos un nutriente es una fuente de carbono seguido de una fuente de carbono y un nutriente proteico.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en donde el nutriente proteico es harina de semilla de algodon o harina de soja.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en donde ademas se proporciona durante el cultivo un alcohol o un aldehldo que facilita la formacion de una cadena lateral de ester en C-3 de la ansamitocina.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en donde el aldehldo o alcohol se selecciona del grupo que consiste en isobutanol, isobutiraldehldo, n-butanol, n-butiraldehldo, n-propanol, n-propionaldehldo, isopropanol, isopropionaldehldo, pentanol, valeraldehldo, isopentanol y isovaleraldehldo.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que ademas comprende uno o mas de:
(i) inactivacion de los microorganismos en el medio de cultivo por inactivacion qulmica o termica; y
(ii) lavado, en el que una solucion bruta de ansamitocinas en el disolvente organico se lava con agua, una solucion salina acuosa, un acido acuoso o una base acuosa en cualquier combinacion secuencial, antes o despues de la precipitacion cuando se lleva a cabo durante la purification.
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