JP2022542562A - ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の安定性組成物および作製のプロセス - Google Patents

ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の安定性組成物および作製のプロセス Download PDF

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Abstract

本発明は、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を調製するための改善された組成物およびプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、並外れた安定性を有するｍＲＮＡ－ＬＮＰを提供し、これは、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないＬＮＰが望ましい場合に、特に有用である。本発明は、部分的には、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まない、予想外に安定したｍＲＮＡ担持ＬＮＰが、ポロキサマーなどの両親媒性ブロックコポリマーの存在下でｍＲＮＡと脂質を混合することによって作製され得るという驚くべき発見に基づく。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月２３日に出願された米国仮出願第６２／８７７，５９７号に対する優先権を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、様々な疾患の治療にますます重要なアプローチとなっている。ＭＲＴは、療法を必要とする患者の体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を産生するために、患者にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与することを伴う。脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの効率的なインビボ送達のためにｍＲＮＡを封入するために一般的に使用される。
脂質ナノ粒子を使用してｍＲＮＡのインビボ送達および／または発現を強化することができる、改良された方法および組成物の開発に多くの努力がなされており、これは、スケーラブルかつ費用効率の高い製造プロセスに適合することができる。同時に、ｍＲＮＡのインビボ送達および／または発現に対するあらゆるそのような強化はまた、脂質媒介性ｍＲＮＡ送達に関連する組成物の安全性および忍容性を維持または改善することが重要である。
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を調製するためのさらに改善された組成物およびプロセスを提供する。本発明に先行して、貯蔵安定性およびインビボ循環時間を増加させることが知られていたため、ＰＥＧ修飾脂質は、典型的に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に含まれていた。一方で、ＰＥＧ修飾脂質は、とりわけ、抗ＰＥＧ抗体を産生することによって、血中クリアランス促進（ＡＢＣ）および／または自然免疫応答を誘導し得る。この問題に対処するために、ＰＥＧ修飾脂質を含まないｍＲＮＡ－ＬＮＰの調製が試みられている。しかしながら、ＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧの非存在下で形成されたｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、特に凍結および解凍後に、大きくかつ不安定なサイズを有するか、または沈殿する傾向があり、治療用途に適さないことが観察されている。本発明は、部分的には、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まない、予想外に安定したｍＲＮＡ担持ＬＮＰが、ポロキサマーなどの両親媒性ブロックコポリマーの存在下でｍＲＮＡと脂質を混合することによって作製され得るという驚くべき発見に基づく。以下により詳細に記載するように、本発明に従って作製されたｍＲＮＡ－ＬＮＰは、典型的な量のＰＥＧ修飾脂質を含有する従来のＬＮＰに匹敵するサイズを有し、より重要なことに、１回以上の凍結融解サイクル後に安定性である。具体的には、本発明によるｍＲＮＡ－ＬＮＰは、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの５０％以内、およびいくつかの場合では１０％以内の平均直径を維持する。さらに、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まない（例えば、０．５％未満のＰＥＧ修飾脂質を含む）ポロキサマー遮蔽ＬＮＰは、従来のＬＮＰ（例えば、５％のＰＥＧ修飾脂質を含むもの）と同様のインビボタンパク質発現プロファイルを達成した。したがって、本発明は、並外れた安定性を有するさらに改善されたｍＲＮＡ－ＬＮＰを提供し、かつ、例えば、抗ＰＥＧ抗体の生成および／またはＡＢＣを回避するために、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないＬＮＰが望ましい場合に、特に有用である。
一態様では、本発明は、タンパク質またはペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する脂質ナノ粒子を含む安定性組成物を提供し、脂質ナノ粒子の各々が、１つ以上のカチオン性脂質、および０．５％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含み、かつ１回以上の凍結融解後に安定性である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質をさらに含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および約０．５％未満ＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質として１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、および約０．５％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの５０％以内の平均直径を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの４０％以内の平均直径を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの３０％以内の平均直径を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの２０％以内の平均直径を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの１０％以内の平均直径を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの５％以内の平均直径を維持する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５０％～９９％のｍＲＮＡ封入効率を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約６０％～９０％のｍＲＮＡ封入効率を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約６０％の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約７０％の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約８０％の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９０％の封入効率を有する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、コレステロール系脂質をさらに含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、０．４％以下のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、０．３％以下のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、０．２％以下のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、０．１％以下のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、ＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、両親媒性ブロックコポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、３％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、３％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、２．５％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、２％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、１．５％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、１％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、０．５％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、０．０５％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、０．０１％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、総組成物の０．０５重量％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、総組成物の０．０４重量％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、総組成物の０．０３重量％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、総組成物の０．０２重量％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、総組成物の０．０１重量％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、両親媒性ブロックコポリマーの残留物を含む。
いくつかの実施形態では、好適な両親媒性ブロックコポリマーは、ポロキサマーである。
いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー８４である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１０１である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１０５である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１０８である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１２２である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１２３である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１２４である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１８１である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１８２である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１８３である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１８４である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１８５である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー１８８である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２１２である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２１５である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２１７である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２３１である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２３４である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２３５である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２３７である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２３８である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２８２である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２８４である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー２８８である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー３０４である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー３３１である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー３３３である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー３３４である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー３３５である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー４０１である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー４０２である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー４０３である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、それらの組み合わせである。
一態様では、本発明は、タンパク質またはペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する脂質ナノ粒子を含む安定性組成物を提供し、脂質ナノ粒子の各々は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、ポロキサマーを含み、かつＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを実質的に含まず、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、１回以上の凍結融解サイクル後に安定性である。
一態様では、本発明は、タンパク質またはペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する脂質ナノ粒子を含む安定性組成物を提供し、脂質ナノ粒子の各々は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、ポロキサマーを含み、かつＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを実質的に含まず、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子は、少量の抗ＰＥＧ抗体を生成するかもしくは全く生成せず、かつ／または血中クリアランス促進（ＡＢＣ）を低下させる。
いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、０．１％未満の量で脂質ナノ粒子中に存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、０．０５％未満の量で脂質ナノ粒子中に存在する。
いくつかの実施形態では、好適な非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。いくつかの実施形態では、好適な非カチオン性脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、コレステロール系脂質を含まない。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の各々は、二成分脂質ナノ粒子である。
いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約１０～約１５０のエチレンオキシド単位を有する。
いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約１０～約１００のプロピレンオキシド単位を有する。
いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約４，０００ｇ／ｍｏｌ～約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約１，０００ｇ／ｍｏｌ～約５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約１，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約２，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約３，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約４，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約５，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約６，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約７，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約８，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約９，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約１０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約２５，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約３０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約４０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、好適なポロキサマーは、約５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５０ｎｍ未満の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２００ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１８０ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１６０ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１５０ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１４０ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１３０ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１２０ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１１０ｎｍ以下の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１００ｎｍ以下の平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．３以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．２５以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．２０以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１８以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１７以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１６以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１５以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１４以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１３以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１２以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１１以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．１０以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．０９以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．０８以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．０７以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．０６以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．０５以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。
一態様では、本発明は、とりわけ、タンパク質またはペプチドのインビボ産生のためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための方法を提供し、この方法は、本発明による安定性組成物を対象に投与することを含む。
一態様では、本発明は、とりわけ、タンパク質またはペプチドのインビボ産生のためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための方法を提供し、この方法は、本発明による安定性組成物を対象に投与することを含み、安定性組成物の投与は、対象において抗ＰＥＧ抗体および／または血中クリアランス促進（ＡＢＣ）をもたらさない。
一態様では、本発明は、とりわけ、タンパク質またはペプチドに欠損を有する対象を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする対象に、本発明による安定性組成物を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、対象において少量の抗ＰＥＧ抗体を生成するか、または全く生成しない。
いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、対象において血中クリアランス促進（ＡＢＣ）を低下させるか、または回避する。
いくつかの実施形態では、安定性組成物は、静脈内注射によって投与される。
いくつかの実施形態では、安定性組成物は、肺送達によって投与される。
いくつかの実施形態では、安定性組成物は、筋肉内送達によって投与される。
いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約６時間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約１２時間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約１８時間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約２４時間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約３０時間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約３６時間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約４８時間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約７２時間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約５日間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約１週間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約２週間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約３週間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、安定性組成物の投与は、投与後少なくとも約４週間、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現をもたらす。
一態様では、本発明は、とりわけ、ポロキサマーの存在下でｍＲＮＡの溶液と脂質溶液とを混合する工程を含む、脂質ナノ粒子にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入するプロセスを提供する。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、および０．５％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、事前に形成された脂質ナノ粒子を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、周囲温度よりも高い事前に決められた温度である。
いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、最初にｍＲＮＡ溶液に添加される。
いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも低い量で存在する。
いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約１％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約２％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約３％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約４％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約５％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約６％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約７％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約８％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約９％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約１０％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約１５％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約２０％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約２５％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約３０％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約３５％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約４０％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約４５％低い量で存在する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、そのＣＭＣよりも約５０％低い量で存在する。
いくつかの実施形態では、プロセスは、ポロキサマーを除去する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、透析によって除去される。
いくつかの実施形態では、除去時に、約０．１％未満のポロキサマーが残存する。いくつかの実施形態では、除去時に、約０．０５％未満のポロキサマーが残存する。いくつかの実施形態では、除去時に、約０．０１％未満のポロキサマーが残存する。
いくつかの実施形態では、除去時に、残留量のポロキサマーが残存する。
いくつかの実施形態では、除去後に残存するポロキサマーの量は、検出不能である。
いくつかの実施形態では、プロセスは、いかなるコレステロール脂質も混合することを含まない。
一態様では、本発明は、とりわけ、本明細書に開示されるプロセスに従って形成されたｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を含む組成物を提供する。
本出願において、「または」の使用は、別段明記されない限り、「および／または」を意味する。本開示において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびにこの用語の変化形、例えば、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の添加物、成分、整数、または工程を除外することを意図するものではない。本出願において使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、同義語として使用される。両方の用語は、関連技術分野の当業者によって理解される任意の通常の変動を網羅することを意味する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を指しているが、単に例示として与えられるものあり、限定するものでないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。
以下の図面は、単に例示を目的とするものであり、限定するものではない。
ポンプシステムを使用して、ｍＲＮＡおよびポロキサマーを含む水溶液を脂質溶液と混合して、ＬＮＰ形成溶液中にｍＲＮＡ－ＬＮＰを生成し、次いで、ＬＮＰ形成溶液を医薬品製剤溶液と交換することを伴う、例示的なＬＮＰ－ｍＲＮＡ封入プロセスの概略図を示す。 １回または２回の凍結／融解サイクル前後の、表３に示されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤のサイズおよび封入効率の例示的なグラフ表示を示す。 表４に示されるような、様々なＰＥＧ修飾脂質％およびポロキサマー％を有するｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤のサイズ、ＰＤＩ、および封入効率の例示的なグラフ表示を示す。 表４に示されるような、様々なＰＥＧ修飾脂質％およびポロキサマーを有するｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤のサイズおよび封入効率の例示的なグラフ表示を示す。 投与後６時間および２４時間でＥＬＩＳＡを介して測定されたタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。検出されたタンパク質は、表７に示されるＬＮＰ製剤に封入されたｍＲＮＡのインビボ翻訳から生じたものであり、皮下投与または静脈内投与によってマウスに送達された。 図６Ａおよび図６Ｂは、ポロキサマーの量を定量化するための例示的な方法を示す。図６Ａは、青色の沈殿物を形成する、ポロキサマーとチオシアン酸コバルトとの間の化学反応を示す。図６Ｂは、６２４ｎｍで測定された、ポロキサマーの既知の濃度での標準曲線を示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、ポロキサマーの量を定量化するための例示的な方法を示す。図６Ａは、青色の沈殿物を形成する、ポロキサマーとチオシアン酸コバルトとの間の化学反応を示す。図６Ｂは、６２４ｎｍで測定された、ポロキサマーの既知の濃度での標準曲線を示す。 投与後２４時間でＥＬＩＳＡを介して測定されたＯＴＣタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。検出されたタンパク質は、表８に示されるＬＮＰ製剤に封入されたｍＲＮＡのインビボ翻訳から生じたものであり、静脈内投与によってマウスに送達された。
定義
本発明がより容易に理解されるように、最初に、ある特定の用語を以下に定義する。以下の用語および他の用語に対する追加の定義は、明細書全体を通して記載される。
およそまたは約：本明細書で使用される場合、目的の１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、明記された参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段明記されない限り、または文脈から別段明らかでない限り（そのような数が、可能性のある値の１００％を超える場合を除いて）、明記された参照値のいずれかの方向（より大きいかまたはより小さい）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に収まる値の範囲を指す。
送達：本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、局所送達および全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質またはペプチドが発現され、標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質またはペプチドが発現され、患者の循環系（例えば、血清）に分泌され、全身に分配され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。
有効性：本明細書で使用される場合、「有効性」という用語、または文法的等価物は、関連するタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡの送達に関連する、生物学的に関連するエンドポイントの改善を指す。いくつかの実施形態では、生物学的エンドポイントは、投与後のある特定の時点での塩化アンモニウム負荷に対する保護である。
封入：本明細書で使用される場合、「封入」という用語、または文法的等価物は、ナノ粒子内に個々のｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。
発現：本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡの「発現」は、ペプチド（例えば、抗原）、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば、酵素）へのｍＲＮＡの翻訳を指し、また文脈によって示されるように、ペプチド、ポリペプチド、または完全に組み立てられたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾も含み得る。本出願では、「発現」および「産生」という用語、ならびに文法的等価物は、互換的に使用される。
改善する、増加する、または低減する：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、もしくは「低減する」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される治療の不在下での対照試料もしくは対象（または複数の対照試料もしくは対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を指す。「対照試料」は、試験物品を除き、試験試料と同じ条件に供された試料である。「対照対象」は、治療されている対象と同じ疾患形態に罹患しており、治療されている対象とほぼ同じ年齢である対象である。
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境下で、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養下などで生じる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系の文脈では、この用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生きている細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾されたＲＮＡおよび修飾されていないＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域および非コード領域を含有し得る。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製され得、組換え発現系を使用して産生され得、任意選択的に精製、化学合成などをされ得る。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖、骨格修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、シュードウリジン、および５－メチルシチジン）、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基、修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、および／もしくは修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれらを含む。
Ｎ／Ｐ比：本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」という用語は、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質中の正に荷電された分子単位の、その脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡ中の負に荷電された分子単位に対するモル比を指す。したがって、Ｎ／Ｐ比は、典型的には、脂質ナノ粒子内のカチオン性脂質中のアミン基のモルの、その脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡ中のリン酸基のモルに対する比として計算される。
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広範な意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、もしくは組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、もしくは組み込まれ得る化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／もしくは二本鎖のＤＮＡならびに／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、美容、および／または治療目的のために、提供される組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳動物）が含まれる。いくつかの実施形態では、患者は、ヒトである。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。
薬学的に許容される：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、炎症刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的なベネフィット／リスクの比率に見合う、ヒトおよび動物の組織と接触した使用に好適な物質を指す。
薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１－１９において薬学的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩としては、好適な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基に由来するものが挙げられる。薬学的に許容される非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸と形成されるか、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸と形成されるか、またはイオン交換などの当該技術分野で使用される他の方法を使用して形成される、アミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、およびＮ＋（Ｃ１－４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学的に許容される塩としては、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成される、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。さらなる薬学的に許容される塩としては、適切な求電子剤、例えば、四級化アルキル化アミノ塩を形成するためのハロゲン化アルキルを使用して、アミンの四級化から形成される塩が挙げられる。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得、疾患の診断または治療のために医療提供者を受診するヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書では、「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患もしくは障害に罹患し得るか、またはそれに罹り易いが、疾患もしくは障害の症状を呈する場合も呈さない場合もある。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性のすべてもしくはほぼすべての範囲または程度を呈する定性的状態を指す。生物学技術分野の当業者であれば、生物学的および化学的現象が、完了すること、および／または完了に至ること、または絶対的結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを、理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
治療すること：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にもしくは完全に緩和する、改善する、軽減する、抑制する、予防する、その発症を遅延させる、その重症度を低減する、および／またはその発生率を低減するために使用される任意の方法を指す。治療は、疾患の徴候を呈していない対象、および／または疾患の初期の徴候のみを呈している対象に、その疾患に関連する病態を発症させるリスクを減少させることを目的として施され得る。
詳細な説明
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を調製するためのさらに改善された組成物およびプロセスを提供する。本発明に先行して、貯蔵安定性およびインビボ循環時間を増加させることが知られていたため、ＰＥＧ修飾脂質は、典型的に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に含まれていた。一方で、ＰＥＧ修飾脂質は、とりわけ、抗ＰＥＧ抗体を産生することによって、血中クリアランス促進（ＡＢＣ）および／または自然免疫応答を誘導し得る。この問題に対処するために、ＰＥＧ修飾脂質を含まないｍＲＮＡ－ＬＮＰの調製が試みられている。しかしながら、ＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧの非存在下で形成されたｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、特に凍結および解凍後に、大きくかつ不安定なサイズを有するか、または沈殿する傾向があり、治療用途に適さないことが観察されている。本発明は、部分的には、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まない、予想外に安定したｍＲＮＡ担持ＬＮＰが、ポロキサマーなどの両親媒性ブロックコポリマーの存在下でｍＲＮＡと脂質を混合することによって作製され得るという驚くべき発見に基づく。したがって、本発明は、並外れた安定性を有するさらに改善されたｍＲＮＡ－ＬＮＰを提供し、かつ、例えば、抗ＰＥＧ抗体の生成および／またはＡＢＣを回避するために、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないＬＮＰが望ましい場合に、特に有用である。
本発明は、ＬＮＰにｍＲＮＡを封入し、その結果、安定性ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物を得る、本発明のプロセスを提供する。具体的には、本発明は、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）の存在下でｍＲＮＡ溶液と脂質溶液とを混合することによって、ＬＮＰにｍＲＮＡを封入するプロセスを提供する。両親媒性ポリマーは、例えば、透析によってｍＲＮＡ－ＬＮＰから除去され得る。本発明は、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないＬＮＰにｍＲＮＡを封入するのに特に有用である。
本発明の様々な態様は、以下のセクションに詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。
ＬＮＰにｍＲＮＡを封入するプロセス
本発明は、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）の存在下でＬＮＰにｍＲＮＡを封入するプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡを封入するプロセスは、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子が形成されるように、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）の存在下で脂質溶液をｍＲＮＡ溶液と混合する工程を含む。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、混合前にｍＲＮＡ溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、混合前に脂質溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液との混合中に添加される。
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、所望の濃度で目的のタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡを含む水溶液である。好適なｍＲＮＡ溶液を調製するために、様々な方法が使用され得る。例示的な方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６／００３８４３２、ＵＳ２０１８／０１５３８２２、およびＵＳ２０１８／０１２５９８９に記載されている。
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質および非カチオン性脂質（ヘルパー脂質とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（ヘルパー脂質とも称される）、およびＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（ヘルパー脂質とも称される）、コレステロール系脂質、およびＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含む。様々な脂質を、所望のそれぞれの量および／または比率で好適な溶媒中に溶解して、本明細書に記載のプロセスで使用される脂質溶液を調製し得る。好適な脂質溶液を調製するために、様々な方法が使用され得る。例示的な方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６／００３８４３２、ＵＳ２０１８／０１５３８２２、およびＵＳ２０１８／０１２５９８９に記載されている。
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、総脂質の１ｍｏｌ％未満、０．９ｍｏｌ％未満、０．８ｍｏｌ％未満、０．７ｍｏｌ％未満、０．６ｍｏｌ％未満、０．５ｍｏｌ％未満、０．４ｍｏｌ％未満、０．３ｍｏｌ％未満、０．２ｍｏｌ％未満、もしくは０．１ｍｏｌ％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、総脂質の１重量％未満、０．９重量％未満、０．８重量％未満、０．７重量％未満、０．６重量％未満、０．５重量％未満、０．４重量％未満、０．３重量％未満、０．２重量％未満、もしくは０．１重量％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、総脂質の０．０９ｍｏｌ％未満、０．０８ｍｏｌ％未満、０．０７ｍｏｌ％未満、０．０６ｍｏｌ％未満、０．０５ｍｏｌ％未満、０．０４ｍｏｌ％未満、０．０３ｍｏｌ％未満、０．０２ｍｏｌ％未満、もしくは０．０１ｍｏｌ％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、総脂質の０．０９重量％未満、０．０８重量％未満、０．０７重量％未満、０．０６重量％未満、０．０５重量％未満、０．０４重量％未満、０．０３重量％未満、０．０２重量％未満、もしくは０．０１重量％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。
典型的には、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも低い量で混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣよりも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％低い量で、混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣよりも約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％低い量で、混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣよりも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％低い量で、混合物中に存在する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液もしくは脂質溶液、または両方は、混合前に周囲温度よりも高い事前に決められた温度に加熱され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、混合前に別個に事前に決められた温度に加熱される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、周囲温度で混合されるが、次いで、混合後に事前に決められた温度に加熱される。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、事前に決められた温度に加熱され、周囲温度でｍＲＮＡ溶液と混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、事前に決められた温度に加熱され、周囲温度で脂質溶液と混合される。
いくつかの実施形態では、周囲温度であるｍＲＮＡストック溶液を、加熱された緩衝溶液に添加して、所望の事前に決められた温度を達成することによって、ｍＲＮＡ溶液を事前に決められた温度に加熱する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、形成後に加熱される。実施例に示されるように、驚くべきことに、プロセス中（形成前、形成中、または形成後）に加熱工程を含むことにより、加熱工程を含まない他の同一のプロセスと比較して、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの特に高い封入をもたらすことが見出された。
本明細書で使用される場合、「周囲温度」という用語は、室内の温度、または加熱もしくは冷却することなく目的の物体を取り囲んでいる温度を指す。いくつかの実施形態では、溶液のうちの１つ以上が維持される周囲温度は、約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、または１６℃以下である。いくつかの実施形態では、溶液のうちの１つ以上が維持される周囲温度は、約１５～３５℃、約１５～３０℃、約１５～２５℃、約１５～２０℃、約２０～３５℃、約２５～３５℃、約３０～３５℃、約２０～３０℃、約２５～３０℃、または約２０～２５℃の範囲である。いくつかの実施形態では、溶液のうちの１つ以上が維持される周囲温度は、２０～２５℃である。
したがって、周囲温度よりも高い事前に決められた温度は、典型的には、約２５℃超である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な事前に決められた温度は、約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃以上である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な事前に決められた温度は、約２５～７０℃、約３０～７０℃、約３５～７０℃、約４０～７０℃、約４５～７０℃、約５０～７０℃、または約６０～７０℃の範囲である。特定の実施形態では、本発明に好適な事前に決められた温度は、約６５℃である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、ポンプを使用して混合される。そのような混合を用いる封入手順は広範囲のスケールで起こり得るため、所望のスケールに適応するために、異なる種類のポンプが使用され得る。しかしながら、一般的には、パルスレスフローポンプを使用することが望ましい。本明細書で使用される場合、パルスレスフローポンプは、安定した流量とともに連続的な流れを確立できる任意のポンプを指す。好適なポンプの種類としては、ギアポンプおよび遠心ポンプが挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的なギアポンプとしては、Ｃｏｌｅ－ＰａｒｍｅｒまたはＤｉｅｎｅｒギアポンプが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な遠心ポンプとしては、ＧｒａｉｎｇｅｒまたはＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒによって製造されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、様々な流量で混合され得る。典型的には、ｍＲＮＡ溶液は、脂質溶液の速度よりも速い速度で混合され得る。例えば、ｍＲＮＡ溶液は、脂質溶液の速度よりも少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍速い速度で混合され得る。
混合のための好適な流量は、スケールに基づいて決定され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約４０～４００ｍｌ／分、６０～５００ｍｌ／分、７０～６００ｍｌ／分、８０～７００ｍｌ／分、９０～８００ｍｌ／分、１００～９００ｍｌ／分、１１０～１０００ｍｌ／分、１２０～１１００ｍｌ／分、１３０～１２００ｍｌ／分、１４０～１３００ｍｌ／分、１５０～１４００ｍｌ／分、１６０～１５００ｍｌ／分、１７０～１６００ｍｌ／分、１８０～１７００ｍｌ／分、１５０～２５０ｍｌ／分、２５０～５００ｍｌ／分、５００～１０００ｍｌ／分、１０００～２０００ｍｌ／分、２０００～３０００ｍｌ／分、３０００～４０００ｍｌ／分、または４０００～５０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、約２０００ｍｌ／分、約３０００ｍｌ／分、約４０００ｍｌ／分、または約５０００ｍｌ／分の流量で混合される。
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、２０～５０ｍｌ／分、２５～７５ｍｌ／分、３０～９０ｍｌ／分、４０～１００ｍｌ／分、５０～１１０ｍｌ／分、７５～２００ｍｌ／分、２００～３５０ｍｌ／分、３５０～５００ｍｌ／分、５００～６５０ｍｌ／分、６５０～８５０ｍｌ／分、または８５０～１０００ｍｌの範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で混合される。
典型的には、本明細書に記載の本発明のプロセスは、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）を除去する工程を含む。いくつかの実施形態では、プロセス中に添加される両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、続いてｍＲＮＡ－ＬＮＰの形成後に除去される。例えば、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、透析などの緩衝液交換技法によって除去され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ形成溶液は、製品製剤溶液を構成する溶液に交換される。例えば、形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰを含有する混合物は、１つ以上の製剤溶液中で透析されて、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ形成中に存在する両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）を除去し得る。好適な製剤は当該技術分野で既知であり、例示的な製剤は、本出願の製剤セクションに記載されている。
ＬＮＰ形成溶液から製剤溶液へのｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む溶液の交換は、当該技術分野で既知の様々な緩衝液交換技法のうちのいずれかによって達成することができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ形成溶液を製剤溶液と交換する工程は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの精製および／または濃縮を伴う。様々な方法を使用して、溶液中のｍＲＮＡ－ＬＮＰの精製またはｍＲＮＡ－ＬＮＰの濃縮とともに、溶液の交換を達成し得る。
例えば、いくつかの実施形態では、この溶液の交換は、透析濾過によって達成される。透析濾過は分画プロセスであり、それによって小さな望ましくない粒子がフィルターを通り抜け、一方で、より大きな所望のナノ粒子は、溶液中のそれらのナノ粒子の濃度を変化させることなく保持物内に維持される。透析濾過は、溶液から塩または反応緩衝液を除去するためにしばしば使用される。透析濾過は、連続または不連続のいずれかであり得る。連続透析濾過では、透析濾過溶液は、濾液が生成されるのと同じ速度で試料供給に添加される。不連続透析濾過では、溶液は、最初に希釈され、次いで開始濃度に戻るように濃縮される。不連続透析濾過は、所望のナノ粒子濃度に達するまで繰り返され得る。
いくつかの実施形態では、溶液が交換され、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、接線流濾過を使用して精製される。クロスフロー濾過とも称される接線流濾過（ＴＦＦ）は、濾過の種類であり、濾過される物質は、フィルターを通り抜けずに、フィルターを横切って接線方向に通過する。ＴＦＦでは、望ましくない透過物がフィルターを通り抜け、一方で、所望の保持物（ｍＲＮＡ－ＬＮＰおよび遊離ｍＲＮＡ）は、フィルターに沿って通過し、下流で収集される。いくつかの実施形態では、所望の物質がＴＦＦで保持物に含有されるが、これは、従来的な全量濾過において通常遭遇するものとは反対のものである。
様々なＴＦＦ技法が既知であり、本発明を実践するために使用することができる。例示的なＴＦＦ精製方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６／００４０１５４およびＵＳ２０１５／０３７６２２０に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰにおけるｍＲＮＡの封入は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ、ならびにＬＮＰ形成溶液に封入されなかったいくらかの遊離ｍＲＮＡを含む製剤溶液を、本明細書に記載の事前に決められた温度に加熱することによってさらに強化することができる。
いくつかの実施形態では、除去時に、混合物中に存在する両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）の元の量の約０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％未満が残存する。いくつかの実施形態では、除去時に、残留量の両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）が製剤中に残存する。本明細書において使用される場合、残留量とは、組成物中の物質（ポロキサマーなどの本明細書に記載の両親媒性ポリマー）の実質的にすべてが除去された後に残存する量を意味する。残留量は、既知の技法を使用して、定性的または定量的に検出可能であり得る。残留量は、既知の技法を使用しても検出可能でない場合がある。
いくつかの実施形態では、過剰なｍＲＮＡも、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの形成中に存在する両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）とともに除去される。
両親媒性ブロックコポリマー
本発明を実践するために、様々な両親媒性ブロックコポリマーが使用され得る。いくつかの実施形態では、両親媒性ブロックコポリマーは、界面活性剤または非イオン性界面活性剤とも称される。
いくつかの実施形態では、本発明に好適な両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポロキサミン（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
ポロキサマー
いくつかの実施形態では、好適な両親媒性ポリマーは、ポロキサマーである。例えば、好適なポロキサマーは、以下の構造を有するポロキサマーであり、
Figure 2022542562000002
 式中、ａは、１０～１５０の整数であり、ｂは、２０～６０の整数である。例えば、ａが約１２であり、ｂが約２０であるか、またはａが約８０であり、ｂが約２７であるか、またはａが約６４であり、ｂが約３７であるか、またはａが約１４１であり、ｂが約４４であるか、またはａが約１０１であり、ｂが約５６である。
いくつかの実施形態では、本発明に好適なポロキサマーは、約１０～約１５０のエチレンオキシド単位を有する。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、約１０～約１００のエチレンオキシド単位を有する。
他の両親媒性ポリマー
いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポロキサミン、例えば、ｔｅｔｒｏｎｉｃ３０４またはｔｅｔｒｏｎｉｃ９０４である。
いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、例えば、３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰである。
いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポリソルベート、ソルビタン、およびそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリソルベート、例えば、ＰＳ２０である。
いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールエーテルである。いくつかの実施形態では、好適なポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉ）の化合物：
Figure 2022542562000003
 またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｔは、１～１００の整数であり、Ｒ１ＢＲＩＪは、独立して、Ｃｉｏ－４０アルキル、Ｃｉｏ－４０アルケニル、またはＣｉｏ－４０アルキニルであり、任意選択的に、Ｒ５ＰＥＧの１つ以上のメチレン基は、独立して、Ｃ３－１０カルボシクリレン、４～１０員ヘテロシクリレン、Ｃ６－１０アリーレン、４～１０員ヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－０－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲ Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、－Ｃ（Ｏ）０－－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）０－－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）０－－Ｃ（Ｏ）Ｓ－－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲ）Ｎ（Ｒ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）０－－ＯＳ（Ｏ）０－－ＯＳ（Ｏ）２－－Ｓ（Ｏ）２０－－ＯＳ（Ｏ）２０－－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）０－－Ｓ（Ｏ）２－－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２０－で置換されており、ＲＮの各事例は、独立して、水素、Ｃ１－６アルキル、または窒素保護基である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃｉｓアルキルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉａ）の化合物：
Figure 2022542562000004
 またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓは、１～１００の整数である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃｉｓアルケニルである。例えば、好適なポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉｂ）の化合物：
Figure 2022542562000005
 またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓは、１～１００の整数である。
安定性ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物
とりわけ、本発明は、本明細書に記載の本発明のプロセスを使用して調製されるｍＲＮＡ－ＬＮＰを提供する。具体的には、本発明は、少量（例えば、０．５重量％もしくはｍｏｌ％未満）のＰＥＧ修飾脂質もしくはＰＥＧを含むかまたは全く含まないｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む、安定性組成物を提供する。そのようなｍＲＮＡ－ＬＮＰは、インビボでのｍＲＮＡの効果的な送達および発現に好適である。本出願では、ＬＮＰおよびｍＲＮＡ－ＬＮＰは、具体的に指示されない限り、互換的に使用される。例えば、本明細書で使用されるｍＲＮＡ－ＬＮＰは、具体的に特定されない限り、ｍＲＮＡ担持ＬＮＰおよび空のＬＮＰの両方を含む。
典型的には、ＬＮＰ組成物に関連する「安定性」という用語は、沈殿なしに室温で２時間超または４℃で一晩保存することができるＬＮＰ組成物を意味する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の安定性組成物は、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの６０％以内の平均直径を維持するＬＮＰを含む。
カチオン性脂質
本明細書において使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種およびリピドイド種のうちのいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、それらの多くは市販されている。
本発明の組成物および方法に使用するための好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１０／１４４７４０号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート：
Figure 2022542562000006
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１３／１４９１４０号に記載のイオン化可能なカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のうちの１つのカチオン性脂質：
Figure 2022542562000007
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素、任意選択的に置換される可変飽和または不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、および任意選択的に置換される可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２は、各々独立して、水素、任意選択的に置換されるＣ１－Ｃ３０アルキル、任意選択的に置換される可変不飽和Ｃ１－Ｃ３０アルケニル、および任意選択的に置換されるＣ１－Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、ｍおよびｏは、各々独立して、ゼロおよび任意の正の整数からなる群から選択され（例えば、ｍは、３である）、ｎは、ゼロまたは任意の正の整数である（例えば、ｎは、１である）。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）：
Figure 2022542562000008
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（「ＨＧＴ５００１」）：
Figure 2022542562000009
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質および（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）：
Figure 2022542562000010
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号にアミノアルコールリピドイドとして記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000011
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１１８７２５号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000012
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１１８７２４号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000013
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容される塩が挙げられる。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１３／０６３４６８号および同第２０１６／２０５６９１号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2022542562000014
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、ＲＬの各事例は、独立して、任意選択的に置換されるＣ６－Ｃ４０アルケニルである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000015
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000016
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000017
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000018
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１５／１８４２５６号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2022542562000019
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各Ｘは、独立して、ＯまたはＳであり、各Ｙは、独立して、ＯまたはＳであり、各ｍは、独立して、０～２０であり、各ｎは、独立して、１～６であり、各ＲＡは、独立して、水素、任意選択的に置換されるＣ１－５０アルキル、任意選択的に置換されるＣ２－５０アルケニル、任意選択的に置換されるＣ２－５０アルキニル、任意選択的に置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意選択的に置換される３～１４員のヘテロシクリル、任意選択的に置換されるＣ６－１４アリール、任意選択的に置換される５～１４員のヘテロアリールまたはハロゲンであり、各ＲＢは、独立して、水素、任意選択的に置換されるＣ１－５０アルキル、任意選択的に置換されるＣ２－５０アルケニル、任意選択的に置換されるＣ２－５０アルキニル、任意選択的に置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意選択的に置換される３～１４員のヘテロシクリル、任意選択的に置換されるＣ６－１４アリール、任意選択的に置換される５～１４員のヘテロアリールまたはハロゲンである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「ターゲット２３」：
Figure 2022542562000020
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／００４２０２号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000021
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000022
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000023
 またはその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／７５８，１７９号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2022542562000024
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６脂肪族であり、各ｍは、独立して、１～４の値を有する整数であり、各Ａは、独立して、共有結合またはアリーレンであり、各Ｌ１は、独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、各Ｌ２は、独立して、Ｃ２－Ｃ１０脂肪族であり、各Ｘ１は、独立して、ＨまたはＯＨであり、各Ｒ３は、独立して、Ｃ６－Ｃ２０脂肪族である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2022542562000025
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2022542562000026
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2022542562000027
 またはその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ ２０１０，１４１，２１０－２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000028
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１５／１９９９５２号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000029
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000030
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000031
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000032
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000033
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000034
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000035
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000036
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000037
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000038
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000039
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000040
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000041
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／００４１４３号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000042
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000043
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000044
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000045
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000046
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000047
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000048
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000049
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000050
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000051
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000052
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000053
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000054
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000055
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000056
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000057
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000058
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／０７５５３１号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2022542562000059
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｌ１またはＬ２のうちの一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２のうちの他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、Ｇ１およびＧ２は、各々独立して、非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり、Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり、Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり、Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、または－ＮＲ５ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ５は、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり、ｘは、０、１または２である。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／１１７５２８号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000060
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000061
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000062
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／０４９２４５号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式のうちの１つの化合物：
Figure 2022542562000063
 ならびにその薬学的に許容される塩を含む。これら４つの式のうちのいずれか１つにおいて、Ｒ４は、独立して、－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択され、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ｎは、１、２、または３である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000064
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000065
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000066
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000067
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／１７３０５４号および同第２０１５／０９５３４０号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000068
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000069
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000070
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2022542562000071
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、コレステロール系カチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するイミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」：
Figure 2022542562000072
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１２／１７０８８９号に記載の切断可能なカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質を含み、
Figure 2022542562000073
 ，
式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意選択的に置換されるアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、式中、Ｒ２は、以下の２つの式のうちの１つからなる群から選択され、
Figure 2022542562000074
 式中、Ｒ３およびＲ４は、各々独立して、任意選択的に置換される可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アルキルおよび任意選択的に置換される可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され、式中、ｎは、０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００１」：
Figure 2022542562000075
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００２」：
Figure 2022542562000076
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００３」：
Figure 2022542562000077
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００４」：
Figure 2022542562000078
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」：
Figure 2022542562000079
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、２０１８年５月１６日に出願され、参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６２／６７２，１９４号に記載の切断可能なカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、一般式のうちのいずれか、または米国仮出願第６２／６７２，１９４号に記載の構造（１ａ）～（２１ａ）および（１ｂ）～（２１ｂ）ならびに（２２）～（２３７）のうちのいずれかである、カチオン性脂質を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質を含み、
Figure 2022542562000080
 式中、ＲＸは、独立して、－Ｈ、－Ｌ１－Ｒ１、または－Ｌ５Ａ－Ｌ５Ｂ－Ｂ’であり、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の各々は、独立して、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり、各Ｌ４ＡおよびＬ５Ａは、独立して、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり、各Ｌ４ＢおよびＬ５Ｂは、独立して、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ２－Ｃ２０アルケニレン、またはＣ２－Ｃ２０アルキニレンであり、各ＢおよびＢ’は、ＮＲ４Ｒ５または５～１０員の窒素含有ヘテロアリールであり、各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して、Ｃ６－Ｃ３０アルキル、Ｃ６－Ｃ３０アルケニル、またはＣ６－Ｃ３０アルキニルであり、各Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、Ｃ２－Ｃ１０アルケニル、またはＣ２－Ｃ１０アルキニルであり、各ＲＬは、独立して、水素、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、またはＣ２－Ｃ２０アルキニルである。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、６２／６７２，１９４の化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む。
Figure 2022542562000081
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む。（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法に好適な他のカチオン性脂質としては、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（「ＤＯＧＳ」）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）が挙げられる。
また、本発明の組成物および方法に好適な追加の例示的なカチオン性脂質としては、ｌ，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリチルチルオキシプロップ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－ｌ－（シス，シス－９’，ｌ－２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）、２，３－ジリノレオイロイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）、ｌ，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）、ｌ，２－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）、２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）、（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）、（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ、ｆｓｌ－ジメチ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）、および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）も挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０４２８７７号、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０）を参照されたい）。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）、国際特許公開第２００５／１２１３４８号）。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法に好適な１つ以上のカチオン性脂質としては、２，２－ジリノレイ１－４－ジメチルアミノエチ１－［１，３］－ジオキソラン（「ＸＴＣ」）、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（「ＡＬＮＹ－１００」）、および／または４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド（「ＮＣ９８－５」）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の、少なくとも約５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、または７０重量％を構成する、１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の、少なくとも約５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、６５ｍｏｌ％、７０ｍｏｌ％、または８０ｍｏｌ％を構成する、１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の、約３０～７０重量％（例えば、約３０～６５重量％、約３０～６０重量％、約３０～５５重量％、約３０～５０重量％、約３０～４５重量％、約３０～４０重量％、約３５～５０重量％、約３５～４５重量％、または約３５～４０重量％）を構成する、１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の、約３０～７０ｍｏｌ％（例えば、約３０～６５ｍｏｌ％、約３０～６０ｍｏｌ％、約３０～５５ｍｏｌ％、約３０～５０ｍｏｌ％、約３０～４５ｍｏｌ％、約３０～４０ｍｏｌ％、約３５～５０ｍｏｌ％、約３５～４５ｍｏｌ％、または約３５～４０ｍｏｌ％）を構成する、１つ以上のカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ステロール系カチオン性脂質は、本明細書に記載のカチオン性脂質の代わりに、またはそれに加えて使用され得る。好適なステロール系カチオン性脂質は、ジアルキルアミノ含有ステロール系カチオン性脂質、イミダゾール含有ステロール系カチオン性脂質、およびグアニジニウム含有ステロール系カチオン性脂質である。例えば、ある特定の実施形態は、イミダゾールを含む１つ以上のステロール系カチオン性脂質、例えば、以下の構造（Ｉ）により示される、イミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートを含む、組成物を対象とする。ある特定の実施形態では、機能性タンパク質をコードするＲＮＡ （例えば、ｍＲＮＡ）の送達のための脂質ナノ粒子は、１つ以上のイミダゾール系カチオン性脂質、例えば、以下の構造により示される、イミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートを含み得る。
Figure 2022542562000082
いくつかの実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の割合は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、リポソームの約３０～５０重量％（例えば、約３０～４５重量％、約３０～４０重量％、約３５～５０重量％、約３５～４５重量％、または約３５～４０重量％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ脂質）は、モル比で、リポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％を構成する。
非カチオン性／ヘルパー脂質
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、非カチオン性／ヘルパー脂質を含む。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という語句は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質、またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という語句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を有する多数の脂質種のうちのいずれかを指す。非カチオン性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、総脂質の少なくとも約５重量％もしくはｍｏｌ％、１０重量％もしくはｍｏｌ％、１５重量％もしくはｍｏｌ％、２０重量％もしくはｍｏｌ％、２５重量％もしくはｍｏｌ％、３０重量％もしくはｍｏｌ％、３５重量％もしくはｍｏｌ％、４０重量％もしくはｍｏｌ％、４５重量％もしくはｍｏｌ％、５０重量％もしくはｍｏｌ％、５５重量％もしくはｍｏｌ％、６０重量％もしくはｍｏｌ％、６５重量％もしくはｍｏｌ％、または７０重量％もしくはｍｏｌ％を構成し得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、総脂質の約３０～５０重量％もしくはｍｏｌ％（例えば、約３０～４５重量％もしくはｍｏｌ％、約３０～４０重量％もしくはｍｏｌ％、約３５～５０重量％もしくはｍｏｌ％、約３５～４５重量％もしくはｍｏｌ％、または約３５～４０重量％もしくはｍｏｌ％）を構成する。
コレステロール系脂質
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、１つ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質としては、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、総脂質の少なくとも約５重量％もしくはｍｏｌ％、１０重量％もしくはｍｏｌ％、２０重量％もしくはｍｏｌ％、３０重量％もしくはｍｏｌ％、４０重量％もしくはｍｏｌ％、５０重量％もしくはｍｏｌ％、６０重量％もしくはｍｏｌ％、または７０重量％もしくはｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、総脂質の約３０～５０重量％もしくはｍｏｌ％（例えば、約３０～４５重量％もしくはｍｏｌ％、約３０～４０重量％もしくはｍｏｌ％、約３５～５０重量％もしくはｍｏｌ％、約３５～４５重量％もしくはｍｏｌ％、または約３５～４０重量％もしくはｍｏｌ％）を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、総脂質の約５重量％もしくはｍｏｌ％未満、１０重量％もしくはｍｏｌ％未満、２０重量％もしくはｍｏｌ％未満、３０重量％もしくはｍｏｌ％未満、４０重量％もしくはｍｏｌ％未満、５０重量％もしくはｍｏｌ％未満、６０重量％もしくはｍｏｌ％未満、または７０重量％もしくはｍｏｌ％未満を構成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、コレステロール系脂質を含まない。
ＰＥＧ修飾脂質
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、少量（例えば、０．５ｍｏｌ％もしくは重量％未満）の１つ以上のＰＥＧ修飾脂質（「ＰＥＧ化脂質」としても既知）またはＰＥＧを含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用も、本発明によって企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６－Ｃ２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した、長さ最大２ｋＤａ、最大３ｋＤａ、最大４ｋＤａ、または最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。いくつかの実施形態では、特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．５ｍｏｌ％未満、０．４ｍｏｌ％未満、０．３ｍｏｌ％未満、０．２ｍｏｌ％未満、もしくは０．１ｍｏｌ％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．５重量％未満、０．４重量％未満、０．３重量％未満、０．２重量％未満、もしくは０．１重量％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．４ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質もしくはＰＥＧ、０．３ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質もしくはＰＥＧ、０．２ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質もしくはＰＥＧ、または０．１ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質もしくはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０９ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０８ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０７ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０６ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０５ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０４ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０３ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０２ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、総脂質の０．０１ｍｏｌ％もしくは重量％以下のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを実質的に含まない。
両親媒性ブロックコポリマー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、３％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、２．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、２％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、１．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、０．５％未満（例えば、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満）の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、０．０１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、残留量の両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）を含有する。本明細書において使用される場合、残留量とは、組成物中の物質（ポロキサマーなどの本明細書に記載の両親媒性ポリマー）の実質的にすべてが除去された後に残存する量を意味する。残留量は、既知の技法を使用して、定性的または定量的に検出可能であり得る。残留量は、既知の技法を使用しても検出可能でない場合がある。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
本発明は、任意のｍＲＮＡを封入するために使用され得る。ｍＲＮＡは、典型的には、ＤＮＡからリボソームに情報を運ぶＲＮＡの種類と考えられている。典型的には、真核生物において、ｍＲＮＡプロセシングは、５’末端上に「キャップ」を、３’末端上に「尾部」を付加することを含む。典型的なキャップは、７－メチルグアノシンキャップであり、これは、最初に転写されたヌクレオチドへの５’－５’－三リン酸結合を介して連結されたグアノシンである。キャップの存在は、大半の真核細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。尾部の付加は、典型的にはポリアデニル化事象であり、これによりポリアデニリル部分がｍＲＮＡ分子の３’末端に付加される。この「尾部」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護する役割を果たす。メッセンジャーＲＮＡは、タンパク質を構成する一連のアミノ酸にリボソームによって翻訳される。
ｍＲＮＡは、様々な既知の方法のうちのいずれかによって合成され得る。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成され得る。簡潔には、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含有する線状もしくは環状ＤＮＡ鋳型を用いて実施される。正確な条件は、具体的な用途によって変動するであろう。
いくつかの実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ合成中に使用された様々な酵素および他の試薬を含む望ましくない不純物を除去するために、製剤および封入前に精製され得る。
本発明を使用して、様々な長さのｍＲＮＡを製剤および封入し得る。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ ６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上のインビトロで合成されたｍＲＮＡを製剤および封入し得る。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、または約８～１５ｋｂの範囲のインビトロで合成されたｍＲＮＡを製剤および封入し得る。
本発明を使用して、修飾されていないｍＲＮＡ、または典型的に安定性を強化する１つ以上の修飾を含むｍＲＮＡを製剤および封入し得る。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域から選択される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明による修飾されたｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））もしくはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含むがこれらに限定されない、天然に生じるヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）、ならびに、例えば、１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、シュードウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－シュードウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ベータ－Ｄ－マンノシル－ケオシン、ワイブトキソシン、ならびにホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン、シュードウリジン、５－メチルシチジン、およびイノシンなどの、プリン類およびピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として合成され得る。そのような類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および同第５，７００，６４２号から当業者に既知であり、その開示は、参照によりその全範囲が本明細書に含まれる。
典型的には、ｍＲＮＡ合成は、５’末端上に「キャップ」を、３’末端上に「尾部」を付加することを含む。キャップの存在は、大半の真核細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。「尾部」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。
したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、以下のように付加される。最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去し、２つの末端リン酸を残す。次いで、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合をもたらす。次いで、グアニンの７－窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。２’－Ｏ－メチル化はまた、７－メチルグアノシン三リン酸残基の後の第１の塩基および／または第２の塩基で生じ得る。キャップ構造の例としては、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ－ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ－ＲＮＡ、およびｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ－ＲＮＡ（式中、ｍは、２’－Ｏメチル残基を指す）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響する１つ以上の要素、例えば、鉄応答性要素を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０～５００ヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置安定性に影響するタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ５０～５００ヌクレオチド以上であり得る。
インビトロ転写反応からもたらされたｍＲＮＡが、いくつかの実施形態で望ましい場合があるが、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡの他の供給源が、本発明の範囲内であることが企図されている。
本発明を使用して、様々タンパク質をコードするｍＲＮＡを製剤および封入し得る。本発明に好適なｍＲＮＡの非限定的な例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）をコードするｍＲＮＡが挙げられる。
製剤
様々な製剤が、本発明に関連して使用され得る。
いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、緩衝剤または塩を含み得る。例示的な緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムを含み得る。例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムを含み得る。
いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、凍結保護剤を含むがこれに限定されない、薬学的に許容される賦形剤を含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、トレハロース、スクロース、マンノース、ラクトース、およびマンニトールのうちの１つ以上などの糖を含むがこれらに限定されない、薬学的に許容される賦形剤を含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、トレハロースを含む。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、スクロースを含む。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、マンノースを含む。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ラクトースを含む。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、マンニトールを含む。
いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、５重量対体積％～２０重量対体積％の糖、例えば、トレハロース、スクロース、マンノース、ラクトース、およびマンニトールを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、５重量対体積％～２０重量対体積％のトレハロースを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、５重量対体積％～２０重量対体積％のスクロースを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、５重量対体積％～２０重量対体積％のマンノースを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、５重量対体積％～２０重量対体積％のラクトースを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、５重量対体積％～２０重量対体積％のマンニトールを含む水溶液である。
いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、約１０重量対体積％の糖、例えば、トレハロース、スクロース、マンノース、ラクトース、およびマンニトールを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、約１０重量対体積％のトレハロースを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、約１０重量対体積％のスクロースを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、約１０重量対体積％のマンノースを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、約１０重量対体積％のラクトースを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、約１０重量対体積％のマンニトールを含む水溶液である。
いくつかの実施形態では、エタノールなどの非水性溶媒およびクエン酸塩のうちの一方または両方は、医薬品製剤溶液に存在しない。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、残留クエン酸塩のみを含む。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、エタノールなどの残留非水性溶媒のみを含む。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、約１０ｍＭ未満（例えば、約９ｍＭ、約８ｍＭ、約７ｍＭ、約６ｍＭ、約５ｍＭ、約４ｍＭ、約３ｍＭ、約２ｍＭ、または約１ｍＭ未満）のクエン酸塩を含有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、約２５％未満（例えば、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％未満）の非水性溶媒、例えば、エタノールを含有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、凍結乾燥前に、いかなるさらなる下流処理（例えば、緩衝液交換および／またはさらなる精製工程および／または追加の賦形剤）も必要としない。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、バイアル、シリンジ、または他の容器中に滅菌充填するための投与前に、いかなるさらなる下流処理（例えば、緩衝液交換および／またはさらなる精製工程および／または追加の賦形剤）も必要としない。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、対象への投与前に、いかなるさらなる下流処理（例えば、緩衝液交換および／またはさらなる精製工程および／または追加の賦形剤）も必要としない。
いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ｐＨ４．５～ｐＨ７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ｐＨ５．０～ｐＨ７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ｐＨ５．５～ｐＨ７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ｐＨ４．５超のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ｐＨ５．０超のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ｐＨ５．５超のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ｐＨ６．０超のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、ｐＨ６．５超のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、加熱後の好適な製剤溶液におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰの改善されたかまたは強化された量の封入は、医薬品製剤溶液のその後の凍結融解後に保持される。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、１０％のトレハロースであり、安定的に凍結され得る。
いくつかの実施形態では、加熱後の好適な製剤溶液中のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のトレハロース溶液中で安定的に凍結され得る（例えば、強化された封入を保持する）。いくつかの実施形態では、好適な製剤溶液は、いかなる下流の精製または処理も必要とせず、凍結形態で安定的に保存され得る。
治療用途
ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト対象への送達またはヒト対象の治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物は、対象の肺または肺細胞における送達に使用される。ある特定の実施形態では、本発明は、対象において欠損または非機能性であり得る内因性タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、肺疾患の治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを配達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、ＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡを製造するための方法において有用である。ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、嚢胞性線維症を治療するための治療用組成物として、必要とする対象の肺に送達される。ある特定の実施形態では、本発明は、肝疾患または代謝性疾患の治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを配達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。そのようなペプチドおよびポリペプチドとしては、尿素サイクル障害に関連するもの、リソソーム貯蔵障害に関連するもの、グリコーゲン貯蔵障害に関連するもの、アミノ酸代謝障害に関連するもの、脂質代謝もしくは線維性障害に関連するもの、メチルマロン酸血症に関連するもの、または濃縮された全長ｍＲＮＡの肝臓もしくは肝臓細胞への送達もしくはそれを用いた治療が治療上の利益を提供する任意の他の代謝性障害に関連するものを挙げることができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、尿素サイクル障害に関連するタンパク質を配達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸シンテターゼ１タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、カルバモイルリン酸シンテターゼＩタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸リアーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギナーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、リソソーム貯蔵障害に関連するタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファガラクトシダーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコセレブロシダーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロン酸－２－スルファターゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロニダーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヘパランＮ－スルファターゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ガラクトサミン－６スルファターゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リソソームリパーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アリールスルファターゼＢ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン貯蔵障害に関連するタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、酸アルファ－グルコシダーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋ホスホグリセリン酸ムターゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン脱分岐酵素を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸代謝に関連するタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オキサラーゼアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ酵素を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、脂質代謝または線維性障害に関連するタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰａｓｅリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｉ－カッパＢアルファ、インターフェロン関連発生制御因子１（ＩＦＲＤ１）、およびサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）のうちの１つ以上などの、１つ以上のＮＦ－カッパＢ阻害剤を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲ－ガンマタンパク質または活性バリアントを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロン酸血症に関連するタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡムターゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ウィルソン病タンパク質としても既知のＡＴＰ７Ｂタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ酵素を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子などの１つまたは凝固酵素を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心血管状態もしくは心血管細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、血管内皮成長因子Ａタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リラクシンタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－９タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－２受容体タンパク質を送達する、本明細書に記載のｐ ｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の筋肉もしくは筋肉細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジストロフィンタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心筋もしくは心筋細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるカリウムチャネルおよびナトリウムチャネルの一方または両方を調節するタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるＫｖ７．１チャネルを調節するタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるＮａｖ１．５チャネルを調節するタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の神経系もしくは神経系細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン１タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン２タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＬＮ３タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の血液もしくは骨髄または血液細胞もしくは骨髄細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－グロビンタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、ブルトンチロシンキナーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子などの１つまたは凝固酵素を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の腎臓もしくは腎臓細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＶ型コラーゲンアルファ５鎖（ＣＯＬ４Ａ５）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の眼もしくは眼細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、レチノスキシンタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａ（ＲＰＥ６５）タンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、２９０ｋＤａの中心体タンパク質（ＣＥＰ２９０）を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象もしくは対象の細胞のためのワクチンの送達またはそれを用いた治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ウイルスなどの感染病原体由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、サイトメガロウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ロタウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、単純ヘルペスウイルス１型または単純ヘルペスウイルス２型などの単純ヘルペスウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス２型などのヒト免疫不全ウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、またはヒトパラインフルエンザウイルス３型などのヒトパラインフルエンザウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、マラリアウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、チクングンヤ由来の抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象のがんに関連する抗原または対象のがん細胞から特定された抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象自身のがん細胞から決定された抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための、すなわち、個別化がんワクチンを提供するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、変異ＫＲＡＳ遺伝子から発現された抗原を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、抗体を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体であり得る。ある特定の実施形態では、抗体は、融合タンパク質の一部であり得る。いくつかの実施形態では、プロセスの工程（ｂ）における２つの別個のｍＲＮＡ－ＬＮＰは、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物は、異なる脂質組成物を含み、かつ抗体の軽鎖または重鎖をコードするｍＲＮＡを封入する、非同一性ＬＮＰの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、本発明は、ＯＸ４０に対する抗体を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦに対する抗体を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、組織壊死因子アルファに対する抗体を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する抗体を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ１９に対する抗体を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、免疫調節剤を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン１２を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン２３を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン３６ガンマを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質の構成的に活性なバリアントを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、エンドヌクレアーゼを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｃａｓ ９タンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メガヌクレアーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、眼疾患を治療するためのペプチドまたはタンパク質を送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、レチノスキシンを送達する、本明細書に記載のｍＲＮＡ－ＬＮＰを含む治療用組成物を製造するために使用される。
本発明のある特定の化合物、組成物、および方法が、ある特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、以下の実施例は、本発明を例示する役割のみを果たすものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１．ポロキサマーを使用した、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まない脂質ナノ粒子内のｍＲＮＡの封入
本実施例は、プロセスＡを適用することによって、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まない脂質ナノ粒子内にｍＲＮＡを封入する例示的なプロセスを例示する。本明細書で使用される場合、プロセスＡは、例えば、最初に脂質を脂質ナノ粒子へと事前に形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混合することによって、ｍＲＮＡを封入する従来の方法を指し、これは、その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／０００８６８０号に記載されている。
例示的な製剤プロセスを、図１に示す。本プロセスでは、脂質溶液（例えば、エタノール中）と、ｍＲＮＡおよびポロキサマーを含む水溶液とを別個に調製した。具体的には、脂質溶液（カチオン性脂質、ヘルパー脂質、双性イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質など）を、エタノール中に脂質を溶解させることによって調製した。水溶液は、クエン酸緩衝液中にｍＲＮＡおよびポロキサマーを溶解させることによって調製した。次いで、これらの２つの溶液を、ポンプシステムを使用して混合して、ｍＲＮＡが封入されたＬＮＰを得た。沈殿を防ぐために、混合物中のポロキサマーの量をその臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満に維持することが望ましいということは注目に値する。次いで、ｍＲＮＡ－ＬＮＰを含むＬＮＰ形成溶液を、１０％のトレハロースを含む溶液に対して透析し、室温で数時間、次いで４℃で一晩、余分なｍＲＮＡおよびポロキサマーを除去した。透析後、ｍＲＮＡ担持製剤溶液を濃縮し、その後の分析のために保存した。
以下の表１に示すように、５つの異なるＬＮＰ製剤を、上記の封入プロセスによって作製し、分析した。
Figure 2022542562000083
ＰＥＧ修飾脂質およびポロキサマーを両方とも含まない安定性ＬＮＰは、製剤溶液が崩壊および沈殿したため、形成することができなかった（表１、製剤４）。ポロキサマーの非存在下で、少量（例えば、０．４％）のＰＥＧ修飾脂質を含むＬＮＰは、３３７ｎｍの大きな粒子サイズを有した（表１、製剤５）。上記のように封入プロセス中に０．５％のポロキサマーを使用した場合、驚くべきことに、ＬＮＰのサイズは３倍に有意に減少した。（表１、製剤１～３）。さらに、安定性ＬＮＰは、ＰＥＧ修飾脂質の非存在下であっても形成し得る（表１、製剤１）。
本実施例は、封入プロセス中にポロキサマーを含むことにより、少量のＰＥＧ修飾脂質を含有するかまたは全く含有しない安定性ｍＲＮＡ－ＬＮＰをもたらしたことを実証する。意義深いことには、ポロキサマー遮蔽は、ＬＮＰのサイズを有意に減少させ、治療用途に特に好適な２００ｎｍ未満のサイズを有する、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないｍＲＮＡ－ＬＮＰをもたらした。
実施例２．ＬＮＰ形成後の加熱は、ＬＮＰの封入効率を増加させた
本実施例は、形成後にｍＲＮＡ－ＬＮＰを加熱する追加の工程が、封入効率を増加させることを例示する。
具体的には、上記のようにプロセスＡによってＬＮＰ中にｍＲＮＡを封入した後、得られたｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤溶液を、周囲温度を超えるまで加熱した。加熱後、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ溶液を冷却して、その後の分析のために保存した。各製剤について、サイズ、ＰＤＩ、および封入効率を加熱の前後に測定した。
Figure 2022542562000084
表２に示されるように、それぞれ０．２％および０．４％のＰＥＧ修飾脂質を含む製剤２および３の封入効率（ＥＥ％）は、加熱前の同じ製剤の封入効率と比較して、形成後の加熱工程後に有意に増加した。試験したすべての製剤のＰＤＩがわずかに減少し、粒子サイズは比較的一定のままであった。
実施例３．ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、複数回の凍結／融解サイクル後に安定性である
本実施例は、本発明に従って作製されたｍＲＮＡ担持ＬＮＰが、複数回の凍結／融解サイクル後に安定性であることを例示する。
具体的には、様々なＰＥＧ修飾脂質およびポロキサマーを含む３つの異なるＬＮＰ製剤を、上記の封入プロセスによって作製した。各製剤について、サイズおよび封入効率を、凍結／融解サイクルの前後に測定した。
Figure 2022542562000085
図２に示されるように、それぞれ０．４％および０％のＰＥＧを含有し、かつ２％のポロキサマーの存在下で形成されたＬＮＰ製剤７および８は、２回の凍結／融解サイクル後に約１００ｎｍの平均粒子サイズを維持した。より具体的には、１回および２回の凍結／融解サイクル後の粒子サイズの増加は、それぞれの元の平均サイズの１０％以内であるようであった。製剤６は、０．４％のＰＥＧを含有し、ポロキサマーを含まずに形成した。これは、凍結／融解前に約３７０ｎｍの平均粒子サイズを有し、この平均サイズは、２回の凍結／融解サイクル後に４００ｎｍ超に増加した。より驚くべきことに、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入プロセス中に２％のポロキサマーを含んだ製剤７および８について、封入効率は第１の凍結／融解サイクル後に有意に増加した。
実施例４．ポロキサマーの存在下での、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないｍＲＮＡ－ＬＮＰの形成
本実施例は、ポロキサマーの存在下で作製された、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないｍＲＮＡ－ＬＮＰが、治療用途に好適な平均サイズおよびサイズ分布を有することをさらに例示する。
表４に示すように、様々な量のＰＥＧ修飾脂質およびポロキサマーを含む異なるＬＮＰ製剤を、上記の封入プロセスによって作製し、分析した。特に、本実施例では、同じカチオン性脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、コレステロール、およびｍＲＮＡを使用して、ＬＮＰ製剤を調製した。
Figure 2022542562000086
ｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、ＰＥＧ修飾脂質の非存在下で形成した（製剤９～１１）。これは、上記のように、封入プロセス中にポロキサマーを添加することによって達成した。特に、ＰＥＧ修飾脂質を含まないｍＲＮＡ－ＬＮＰを、低パーセント（例えば、０．５％）のポロキサマーを用いて作製した（製剤９）。図３に示されるように、様々な量のポロキサマーを用いて作製された０．４％のＰＥＧ修飾脂質を含有するすべてのＬＮＰの平均サイズは、１００ｎｍ未満であった。様々な量のポロキサマーを用いて作製されたＰＥＧ修飾脂質を含まないすべてのＬＮＰの平均サイズは、１３０ｎｍ未満であった。様々な量のポロキサマーを用いて作製されたＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは含まないすべてのＬＮＰのＰＤＩは、約０．２５またはそれ未満であった。
図４に示されるように、ＰＥＧ修飾脂質％の効果も試験した。図４は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰが、ポロキサマーの存在下で、１００ｎｍ未満の平均サイズおよび０．２５未満のＰＤＩを有して、非常に少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まずに作製されたことを示す。同じ脂質成分（例えば、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、およびコレステロール）および同じｍＲＮＡを使用してｍＲＮＡ－ＬＮＰを調製したため、本実施例で観察される変化は、ＰＥＧ修飾脂質および／またはポロキサマーのパーセント変化に起因する。
実施例５．ポロキサマーは、少数の成分系を含むＬＮＰを安定化する
本実施例は、４つ未満の成分を含むｍＲＮＡ－ＬＮＰを本発明に従って作製することができ、治療用途に好適な平均サイズを有することを例示する。
具体的には、異なる成分（例えば、４、３、および２つ）を含むｍＲＮＡ－ＬＮＰを、上記のようにポロキサマーの存在下で作製し、特徴評価した。異なる製剤についての具体的な成分、平均粒子サイズ、ＰＤＩ、および封入効率を表５に示した。特に、本実施例では、同じ脂質成分（例えば、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、および／またはコレステロール）、および同じｍＲＮＡを使用して、ＬＮＰ製剤を調製した。
Figure 2022542562000087
表５に示されるように、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ポロキサマーが封入プロセス中に含まれる場合、三成分または二成分で作製した。すべては、許容可能なＰＤＩ（例えば、０．２０未満）および封入効率とともに、小さなサイズ（例えば、１２５ｎｍ未満）を有する。注目すべきことに、異なるカチオン性脂質対ヘルパー脂質の比を有する二成分ＬＮＰ（製剤１７および１８）は、両方ともに、小さな平均サイズ（１２０ｎｍ未満）および高い封入効率（例えば、７５％超）を有した。
実施例６．ＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない安定性ＬＮＰは、異なるカチオン性脂質および様々なポロキサマーで形成され得る
本実施例は、本発明を使用して、様々なカチオン性脂質および異なるｍＲＮＡを含有し、ＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない、安定性ｍＲＮＡ－ＬＮＰを産生することができることを例示する。
具体的には、表６に示されるように、ＥＰＯまたはＦＦＬタンパク質をコードするｍＲＮＡを、ポロキサマー４０７の存在下で、Ｎ／Ｐ比４で異なるカチオン性脂質を含有するＬＮＰに封入した。
Figure 2022542562000088
結果は、ＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない安定性ｍＲＮＡ－ＬＮＰが、様々なカチオン性脂質およびｍＲＮＡ構築物で形成され得ることを示す。ＣＣＢｅｎｅ、ＭＬ－７、およびＭＣ３を含むＬＮＰは、１２０ｎｍ未満の特に小さなサイズのＬＮＰを示した。
実施例７．ポロキサマーを使用して形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの送達によるインビボ発現の成功
本実施例は、ポロキサマーを用いて形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの投与が、インビボタンパク質発現の成功をもたらしたことを実証する。具体的には、ＥＰＯ ｍＲＮＡ担持ＬＮＰを、皮下（ＳＣ）経路および静脈内（ＩＶ）経路を介してＣＤ－１マウスに投与し、投与の６時間後および２４時間後に、マウスの肝臓および血清中でＥＰＯタンパク質発現レベルを検出した。以下の表７に示すように、様々な量のＰＥＧ修飾脂質を含み、０．５％のポロキサマーを用いて形成された４つの異なるＬＮＰを試験した。５％のＰＥＧ修飾脂質を含む従来のＬＮＰも、対照として投与した（表７に示される群ＢおよびＦ）。
Figure 2022542562000089
図５に示されるように、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないポロキサマー遮蔽ＬＮＰは、従来のＬＮＰ（例えば、５％のＰＥＧ修飾脂質を含むもの）と同様のインビボタンパク質発現プロファイルを達成した。これらのデータは、少量（例えば、０．５％以下）のＰＥＧ修飾脂質もしくはＰＥＧを含むかまたは全く含まない、本発明に従ってポロキサマーを使用して作製されたｍＲＮＡ－ＬＮＰが、治療目的のためにインビボタンパク質発現に首尾よく使用され得ることを実証する。
実施例８．ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤中のポロキサマーの定量化
本実施例は、本発明に従って作製されたｍＲＮＡ－ＬＮＰ中のポロキサマーの最終濃度を定量化する例示的な方法を例示する。
具体的には、この方法は、図６Ａに示されるように、ポロキサマーがチオシアン酸コバルトと競合し、青色の沈殿物を形成するという事実を利用する。沈殿物が形成された後、青色の沈殿物をアセトン中に溶解し、ポロキサマーに正比例する色強度を６２４ｎｍの波長で測定する。図６Ｂに示されるように、既知の濃度のポロキサマーを用いた標準曲線をプロットした。この標準曲線を使用して、所与の試料中のポロキサマーの量を決定することができる。
実施例９．様々なポロキサマーおよび非カチオン性脂質を含むｍＲＮＡ－ＬＮＰのインビボ発現の成功
本実施例は、様々なポロキサマーおよび非カチオン性脂質を使用して、ＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない安定性ｍＲＮＡ－ＬＮＰを産生することができることを例示する。本実施例は、ポロキサマーを用いて形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの投与が、インビボタンパク質発現の成功をもたらしたことをさらに実証する。
表８に示すように、様々なポロキサマー脂質および非カチオン性脂質、ならびに様々な量のＰＥＧ修飾脂質を含む異なるＬＮＰ製剤を、上記の封入プロセスによってカチオン性脂質ｃＤＤ－ＴＥ４－Ｅ１２を用いて作製し、分析した。この特定の実験では、ＯＴＣ（オルニチントランスカルバミラーゼ）をコードするｍＲＮＡを封入した。
Figure 2022542562000090
ｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、ＰＥＧ修飾脂質の非存在下で、またはそれを非常に少量（例えば０．５％）用いて形成した（製剤Ａ～Ｈ）。これは、上記のように、封入プロセス中にポロキサマーを添加することによって達成した。様々なポロキサマーおよび非カチオン性脂質を使用して、封入プロセスを最適化することができる。本実施例において作製されたすべてのＬＮＰの平均サイズは、約１３０ｎｍまたはそれ未満であり、ＰＤＩは約０．１５またはそれ未満、および封入効率は約９０％またはそれ超であった。対照として、ｍＲＮＡ担持ＬＮＰを、ポロキサマーを含まず、様々な比のＰＥＧ修飾脂質を用いて調製した（製剤Ｉ～Ｋ）。
表８のＯＴＣ ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を、静脈内（ＩＶ）経路を介してマウスに投与し、ＯＴＣタンパク質発現レベルを測定した。図７に示されるように、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むポロキサマー遮蔽ＬＮＰは、標的発現レベルとほぼ同じかまたはそれより高いインビボタンパク質発現を達成した。これらのデータは、様々なポロキサマーおよび非カチオン性脂質を使用して作製された、少量のＰＥＧ修飾脂質を含むかまたは全く含まないｍＲＮＡ－ＬＮＰが、治療目的のためにインビボタンパク質発現に首尾よく使用され得ることを実証する。製剤ＩおよびＪは、ポロキサマーを含む製剤Ａ～Ｈよりも高い効力を達成した。
等価物
当業者は、日常的な実験作業のみを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認できるであろう。本発明の範囲は、上記の発明を実施するための形態に限定されることは意図されておらず、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

Claims (66)

  1. メッセンジャーＲＮＡ ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を含む安定性組成物であって、前記ｍＲＮＡが、タンパク質またはペプチドをコードし、前記脂質ナノ粒子の各々が、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、および０．５％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含み、前記ｍＲＮＡを封入する前記脂質ナノ粒子が、１回以上の凍結融解後に安定性である、安定性組成物。
  2. 前記脂質ナノ粒子の各々が、１つのカチオン性脂質、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および約０．５％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含む、請求項１に記載の安定性組成物。
  3. 前記ｍＲＮＡを封入する前記脂質ナノ粒子が、１回以上の凍結融解サイクル後に、元の平均サイズの５０％以内の平均直径を維持する、請求項１または２に記載の安定性組成物。
  4. 前記ｍＲＮＡを封入する前記脂質ナノ粒子が、１回以上の凍結融解サイクル後に、前記元の平均サイズの１０％以内の平均直径を維持する、請求項１～３のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  5. 前記ｍＲＮＡを封入する前記脂質ナノ粒子が、１回以上の凍結融解サイクル後に、前記元の平均サイズの５％以内の平均直径を維持する、請求項１～４のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  6. 前記脂質ナノ粒子が、約５０％～９９％のｍＲＮＡ封入効率を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  7. 前記脂質ナノ粒子の各々が、コレステロール系脂質をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  8. 前記脂質ナノ粒子の各々が、０．４％以下のＰＥＧ修飾脂質、０．３％以下のＰＥＧ修飾脂質、０．２％以下のＰＥＧ修飾脂質、または０．１％以下のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  9. 前記脂質ナノ粒子の各々が、ＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  10. 前記脂質ナノ粒子の各々が、両親媒性ブロックコポリマーを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  11. 前記脂質ナノ粒子の各々が、３％未満の両親媒性ブロックコポリマー、２．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー、２％未満の両親媒性ブロックコポリマー、１．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー、１％未満の両親媒性ブロックコポリマー、０．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー、０．０５％未満の両親媒性ブロックコポリマー、または０．０１％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む、請求項１０に記載の安定性組成物。
  12. 前記組成物が、総組成物の０．０５重量％未満、０．０４重量％未満、０．０３重量％未満、０．０２重量％未満、または０．０１重量％未満の両親媒性ブロックコポリマーを含む、請求項１１に記載の安定性組成物。
  13. 前記組成物が、両親媒性ブロックコポリマーの残留物を含む、請求項１２に記載の安定性組成物。
  14. 前記両親媒性ブロックコポリマーが、ポロキサマーである、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  15. 前記ポロキサマーが、ポロキサマー８４、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３０４、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、ポロキサマー４０７、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１４に記載の安定性組成物。
  16. タンパク質またはペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する脂質ナノ粒子を含む安定性組成物であって、前記脂質ナノ粒子の各々が、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、ポロキサマーを含み、かつＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを実質的に含まず、前記ｍＲＮＡを封入する前記脂質ナノ粒子が、１回以上の凍結融解サイクル後に安定性である、安定性組成物。
  17. タンパク質またはペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する脂質ナノ粒子を含む安定性組成物であって、前記脂質ナノ粒子の各々が、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、ポロキサマーを含み、かつＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを実質的に含まず、前記ｍＲＮＡを封入する前記脂質ナノ粒子が、少量の抗ＰＥＧ抗体を生成するかもしくは全く生成せず、かつ／または血中クリアランス促進（ＡＢＣ）を低下させる、安定性組成物。
  18. 前記ポロキサマーが、０．１％未満の量で前記脂質ナノ粒子中に存在する、請求項１７に記載の安定性組成物。
  19. 前記ポロキサマーが、０．０５％未満の量で前記脂質ナノ粒子中に存在する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  20. 前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  21. 前記脂質ナノ粒子が、１回以上の凍結融解サイクル後に、前記元の平均サイズの５０％以内の平均直径を維持する、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  22. 前記脂質ナノ粒子が、１回以上の凍結融解サイクル後に、前記元の平均サイズの１０％以内の平均直径を維持する、請求項２１に記載の安定性組成物。
  23. 前記脂質ナノ粒子が、１回以上の凍結融解サイクル後に、前記元の平均サイズの５％以内の平均直径を維持する、請求項２２に記載の安定性組成物。
  24. 前記脂質ナノ粒子が、約５０％～９９％のｍＲＮＡ封入効率を有する、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  25. 前記脂質ナノ粒子の各々が、コレステロール系脂質をさらに含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  26. 前記脂質ナノ粒子の各々が、コレステロール系脂質を含まない、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  27. 前記脂質ナノ粒子の各々が、二成分脂質ナノ粒子である、請求項１６～２６のいずれかに記載の安定性組成物。
  28. 前記ポロキサマーが、約１０～約１５０のエチレンオキシド単位を有する、請求項１６～２７のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  29. 前記ポロキサマーが、約１０～約１００のプロピレンオキシド単位を有する、請求項２８に記載の安定性組成物。
  30. 前記ポロキサマーが、約４，０００ｇ／ｍｏｌ～約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する、請求項１６～２９のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  31. 前記ポロキサマーが、ポロキサマー８４、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３０４、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、ポロキサマー４０７、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  32. 前記脂質ナノ粒子が、約２００ｎｍ未満の平均サイズを有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  33. 前記平均サイズが、約１５０ｎｍ、１４０ｎｍ、１３０ｎｍ、１２０ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ以下である、請求項３２に記載の安定性組成物。
  34. 前記脂質ナノ粒子が、０．２５以下、０．２以下、０．１５以下、０．１以下の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の安定性組成物。
  35. タンパク質またはペプチドのインビボ産生のためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための方法であって、請求項１～３４のいずれか一項に記載の安定性組成物を対象に投与することを含む、方法。
  36. タンパク質またはペプチドのインビボ産生のためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための方法であって、請求項１～３５のいずれか一項に記載の安定性組成物を対象に投与することを含み、前記安定性組成物の前記投与が、前記対象において抗ＰＥＧ抗体および／または血中クリアランス促進（ＡＢＣ）をもたらさない、方法。
  37. タンパク質またはペプチドの欠損を有する対象を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、請求項１～３３のいずれか一項に記載の安定性組成物を投与することを含む、方法。
  38. 前記安定性組成物が、静脈内注射によって投与される、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記安定性組成物が、肺送達によって投与される、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記安定性組成物が、筋肉内送達によって投与される、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記安定性組成物の前記投与が、投与後少なくとも約１２、２４、３６、４８、６０、または７２時間、前記ｍＲＮＡによってコードされる前記タンパク質または前記ペプチドの発現をもたらす、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. ポロキサマーの存在下でｍＲＮＡ溶液と脂質溶液とを混合する工程を含む、脂質ナノ粒子にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入するプロセス。
  43. 前記脂質溶液が、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、および０．５％未満のＰＥＧ修飾脂質またはＰＥＧを含む、請求項４２に記載のプロセス。
  44. 前記脂質溶液が、事前に形成された脂質ナノ粒子を含む、請求項４２または４３に記載のプロセス。
  45. 前記ｍＲＮＡ溶液および／または前記脂質溶液が、周囲温度よりも高い事前に決められた温度である、請求項４２～４４のいずれか一項に記載のプロセス。
  46. 前記ポロキサマーが、最初に前記ｍＲＮＡ溶液に添加される、請求項４２～４５のいずれか一項に記載のプロセス。
  47. 前記ポロキサマーが、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも低い量で存在する、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のプロセス。
  48. 前記ポロキサマーが、そのＣＭＣよりも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％低い量で存在する、請求項４７に記載のプロセス。
  49. 前記ポロキサマーが、そのＣＭＣの約５０％未満の量で存在する、請求項４７に記載のプロセス。
  50. 前記プロセスが、前記ポロキサマーを除去する工程をさらに含む、請求項４２～４９のいずれか一項に記載のプロセス。
  51. 前記ポロキサマーが、透析によって除去される、請求項５０に記載のプロセス。
  52. 除去時に、約０．０５％未満のポロキサマーが残存する、請求項５０または５１に記載のプロセス。
  53. 除去時に、約０．０１％未満のポロキサマーが残存する、請求項５２に記載のプロセス。
  54. 除去時に、残留量のポロキサマーが残存する、請求項５２に記載のプロセス。
  55. 除去後に残存するポロキサマーの量が、検出不能である、請求項５０～５４のいずれか一項に記載のプロセス。
  56. 前記ポロキサマーが、約１０～約１５０のエチレンオキシド単位を有する、請求項４２～５５のいずれか一項に記載のプロセス。
  57. 前記ポロキサマーが、約１０～約１００のプロピレンオキシド単位を有する、請求項５６に記載のプロセス。
  58. 前記ポロキサマーが、約４，０００ｇ／ｍｏｌ～約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する、請求項４２～５７のいずれか一項に記載のプロセス。
  59. 前記ポロキサマーが、ポロキサマー８４、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３０４、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、ポロキサマー４０７、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項４２～５８のいずれか一項に記載のプロセス。
  60. 前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項４２～５９のいずれか一項に記載のプロセス。
  61. 前記プロセスが、いかなるコレステロール脂質も混合することを含まない、請求項４２～５９のいずれか一項に記載のプロセス。
  62. 前記脂質ナノ粒子が、少なくとも５０％の封入効率を有する、請求項４２～６１のいずれか一項に記載のプロセス。
  63. 前記脂質ナノ粒子が、約６０％～９９％の封入効率を有する、請求項４２～６１に記載のプロセス。
  64. 前記脂質ナノ粒子が、約２００ｎｍ以下の平均サイズを有する、請求項４２～６３のいずれか一項に記載のプロセス。
  65. 前記脂質ナノ粒子が、約１５０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１３０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１１０ｎｍ以下、または約１００ｎｍ以下の平均サイズを有する、請求項６４に記載のプロセス。
  66. 請求項４２～６３のいずれか一項に記載のプロセスに従って形成されたｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を含む組成物。
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