ES2693708T3 - Método y sistema de cultivo celular - Google Patents

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ES2693708T3
ES2693708T3 ES13731064.5T ES13731064T ES2693708T3 ES 2693708 T3 ES2693708 T3 ES 2693708T3 ES 13731064 T ES13731064 T ES 13731064T ES 2693708 T3 ES2693708 T3 ES 2693708T3
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David HORNA TOMÁS
Miquel Costa Ferrando
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Abstract

Un método de cultivo celular caracterizado por que se implementa en un sistema que comprende: * al menos un dispositivo (1) adecuado para el cultivo celular, comprendiendo el dispositivo (1): - al menos una cámara (2) de biorreactor que comprende al menos una superficie interna (3, 22, 39) adecuada para el cultivo celular, - medios de entrada y salida (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) de fluido, y - al menos una precámara (4) en conexión con la al menos una cámara (2) de biorreactor, que comprende una entrada (5) para introducir células, y por que comprende los siguientes pasos: a) llenar la precámara (4) con un medio de cultivo bajo condiciones fisicoquímicas iniciales con un volumen predeterminado de líquido, b) introducir células en la precámara (4) a través de la entrada celular (5), c) pasar el medio de cultivo con las células a la al menos una cámara (2) de biorreactor, d) dejar que las células se asienten y dejarlas en reposo durante un tiempo predeterminado hasta que se adhieran a la al menos una superficie interior (3, 22, 39) adecuada para el cultivo celular cuyas propiedades fisicoquímicas hacen que se comporte de tal manera que favorezca la adhesión celular bajo una o varias condiciones fisicoquímicas iniciales, e) dejar circular el medio de cultivo a través del dispositivo (1) y a través de los medios de entrada y salida (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) de fluido, f) una vez que se obtiene un número objetivo de células o se alcanza una densidad crítica en la al menos una cámara (2, 2', 2") de biorreactor utilizada para el cultivo, cambiar al menos una de las condiciones fisicoquímicas iniciales del medio de cultivo a condiciones fisicoquímicas modificadas bajo las que se previene la adhesión celular, de tal manera que el volumen restante dentro del dispositivo (1) bajo condiciones fisicoquímicas modificadas se ubique en las cámaras (2, 2', 2") de biorreactor que se han utilizado para la amplificación celular, g) pasar el medio de cultivo con las células a la precámara (4), y si se ha alcanzado el número objetivo de células, extraer el medio de cultivo con las células en suspensión a través de medios de salida (24), o si no se ha alcanzado el número objetivo de células, introducir medio de cultivo adicional en la precámara y repetir los pasos a partir del paso c).

Description

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DESCRIPCION
Metodo y sistema de cultivo celular Objeto de la invencion
La invencion esta comprendida dentro de dispositivos automatizados para el cultivo celular. La invencion se refiere a un metodo y sistema de cultivo celular que permite modificar de forma controlada la densidad y el numero de celulas en un cultivo. Espedficamente, la presente invencion se refiere a un metodo iterativo cuyo numero de pasos de iteracion se modifica dependiendo de la demanda de densidad y el numero de celulas necesarias para la duracion del cultivo.
Antecedentes de la invencion
Los biorreactores automatizados fabricados por compares como Caridian BCT, PAN-systech, o el "biorreactor de onda" de General Electric, se pueden encontrar en el estado de la tecnica.
La solicitud de patente internacional WO 2010/121601 A2 de PAN-systech muestra un biorreactor automatico para cultivos celulares de multiples pocillos.
La solicitud de patente internacional WO 2011/135339 A2 describe un reactor que comprende una plataforma que define un deposito de fluido dispuesto para recibir fluido, una pluralidad de camaras de reaccion, en donde las camaras de reaccion se diferencian entre sf, una pluralidad de canales de suministro para transportar fluido desde el al menos un deposito de fluido a una o mas de la pluralidad de camaras de reaccion, y medios de bombeo dispuestos para bombear fluido a traves de uno o mas de una pluralidad de canales de suministro.
El documento US 2007/134790 A1 describe un biorreactor de cultivo celular que tiene una camara de cultivo para el crecimiento celular, un deposito de medio de cultivo montado externamente a la camara de cultivo, un mecanismo de circulacion de fluido para mover el medio de cultivo desde el deposito a traves de la camara de cultivo, y un mecanismo de aireacion para introducir aire en y retirar aire de la camara de cultivo. El biorreactor de cultivo celular comprende un mecanismo multiple montado en el extremo superior de la camara de cultivo, un mecanismo de circulacion de fluido conectado de manera fluida al deposito del medio de cultivo, para recibir el medio de cultivo del deposito del medio de cultivo y distribuir el medio de cultivo en la camara de cultivo.
La solicitud de patente internacional WO 2010/121601 A2 se refiere a un dispositivo para cultivar automaticamente celulas en paralelo en recipientes de cultivos celulares, en particular placas de microtitulacion (placas MT), que tienen un alojamiento en el que se dispone una unidad de observacion que comprende un microscopio y una camara, un dispositivo de receptaculo para recibir los recipientes de cultivo celular, y una unidad de distribucion de fluido para llenar y/o vaciar automaticamente los recipientes de cultivo celular, en particular los pocillos de las placas MT, con lfquido, en donde las condiciones climaticas en el dispositivo, en particular la composicion de gas y temperatura, se puede regular al menos en el area de los recipientes de cultivo celular.
Sin embargo, los dispositivos y metodos conocidos en el estado de la tecnica tienen el problema tecnico de no ser lo suficientemente versatiles en el sentido de que no permiten realizar multiples expansiones celulares dentro de un mismo biorreactor por demanda, lo que conduce a la incapacidad de controlar y modificar con precision la densidad celular y el numero total de celulas a medida que avanza en el proceso de amplificacion, y en un rango estrecho de valores en los que se puede realizar el trabajo.
Estas limitaciones complican enormemente la utilizacion de biorreactores para la terapia celular.
Descripcion de la invencion
Se ha desarrollado un metodo de cultivo celular de acuerdo con la reivindicacion 1 y un sistema de cultivo celular de acuerdo con la reivindicacion 10 para resolver los problemas considerados en el estado de la tecnica. Las reivindicaciones dependientes definen realizaciones particulares de la invencion.
El primer aspecto inventivo de la invencion consiste en el metodo de cultivo celular mencionado y se caracteriza por que se implementa en un sistema que comprende:
• al menos un dispositivo adecuado para el cultivo celular, comprendiendo el dispositivo:
s al menos una camara de biorreactor que comprende al menos una superficie interna adecuada para el cultivo celular,
s medio de entrada y salida de fluido, y
s al menos una precamara en conexion con la al menos una camara de biorreactor que comprende una entrada para introducir celulas,
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y por que comprende los siguientes pasos:
a) llenar la precamara con un medio de cultivo bajo condiciones fisicoqmmicas iniciales con un volumen predeterminado de Kquido,
b) introducir celulas a traves de la entrada de celulas para introducir celulas en la precamara,
c) pasar el medio de cultivo con las celulas a la al menos una camara de biorreactor,
d) dejar que las celulas se asienten y dejarlas en reposo durante un tiempo predeterminado hasta que se adhieran a la al menos una superficie interior adecuada para el cultivo celular cuyas propiedades fisicoqmmicas hacen que se comporte de tal manera que favorezca la adhesion celular bajo una o varias condiciones fisicoqmmicas iniciales,
e) dejar circular el medio de cultivo a traves del dispositivo y a traves de los medios de entrada y salida de fluido
f) una vez que se obtiene un numero objetivo de celulas o se alcanza una densidad cntica en la al menos una camara de biorreactor utilizada para el cultivo, cambiar al menos una de las condiciones fisicoqmmicas iniciales del medio de cultivo a condiciones fisicoqmmicas modificadas bajo las que se previene la adhesion celular, de manera que el volumen restante dentro del dispositivo bajo condiciones fisicoqmmicas modificadas se ubique en las camaras que se han utilizado para la amplificacion celular,
g) transferir el medio de cultivo con las celulas a la precamara, y
si se ha alcanzado el numero objetivo de celulas, introducir un volumen adicional del medio de cultivo en la precamara y extraer el medio de cultivo con las celulas en suspension a traves de medios de salida, o si no se ha alcanzado el numero objetivo de celulas, introducir medio de cultivo adicional en la precamara y repetir los pasos a partir del paso c).
El objeto del metodo de la invencion es permitir modificar de forma controlada la densidad y el numero de celulas en un cultivo. Espedficamente, la invencion se refiere a un metodo iterativo cuyo numero de pasos de iteracion se modifica dependiendo de la demanda de densidad y el numero de celulas necesarias para la duracion del cultivo.
Espedficamente, el metodo iterativo comienza con la introduccion del medio de cultivo en la precamara del dispositivo, de manera que el medio se separa de la al menos una camara de biorreactor. Se introducen luego las celulas objeto de la amplificacion y se transfiere luego la mezcla completa formada por el medio y las celulas a la al menos una camara de cultivo a traves de la conexion entre la precamara y la camara. A lo largo de este documento, los terminos "amplificacion celular" y "cultivo celular" se entienden como sinonimos. Por otro lado, cuando se hace mencion de condiciones fisicoqmmicas, se refiere a las condiciones particulares de al menos un parametro, tal como la temperatura, el nivel de pH o la concentracion salina o similares.
Para realizar con exito un proceso de amplificacion celular, es conveniente que las celulas se adhieran a una superficie donde comienzan los procesos de division celular. Para ese fin, el siguiente paso del metodo comprende dejar las celulas en reposo de manera que se adhieran a una superficie interna del dispositivo en la al menos una camara de biorreactor adecuada para el cultivo celular. Esta superficie esta adaptada para cambiar su idoneidad para la adhesion celular en funcion del valor de al menos una de las condiciones fisicoqmmicas iniciales, por ejemplo, la temperatura, el pH o la concentracion salina, ya sea debido a la naturaleza del material con el que estaba fabricado, o al hecho de que esta recubierto con un gel o un producto cuyas propiedades cambian con la al menos una condicion fisicoqmmica inicial seleccionada, por ejemplo, la temperatura. La al menos una de las condiciones fisicoqmmicas iniciales del medio de cultivo, por ejemplo, una primera temperatura T1, se selecciona de manera que la caractenstica de la superficie interna a esa temperatura sea tal que permita la adhesion celular.
Cuando las celulas se adhieren a la superficie, se inicia un flujo continuo de medio de cultivo bajo condiciones fisicoqmmicas iniciales. Este flujo continuo proporciona a las celulas los nutrientes necesarios, como los aminoacidos y las vitaminas, de manera continua y renovada, de modo que la tasa de crecimiento es constante y optima. Por lo tanto, la amplificacion celular se lleva a cabo hasta obtener una densidad celular espedfica, a partir de la cual la calidad del cultivo no es la requerida, o un numero objetivo de celulas.
Una vez que se ha obtenido esta densidad o este numero objetivo de celulas, al menos una de las condiciones fisicoqmmicas iniciales del medio se cambia a condiciones fisicoqmmicas modificadas, para las cuales la superficie adecuada para el cultivo celular tiene una caractenstica fisicoqmmica que permite que las celulas vuelvan a estar en suspension en el medio.
En una realizacion no limitante, la forma de cambiar al menos una de las condiciones fisicoqmmicas es vaciar las camaras de biorreactor de medio de cultivo a temperatura T1 y luego llenar las camaras de cultivo que contienen celulas con medio a temperatura T2. En un ejemplo particular, el volumen del medio que se introduce en cada camara bajo las condiciones fisicoqmmicas modificadas es el volumen que se ha introducido en cada camara al inicio del proceso. Las celulas bajo estas condiciones fisicoqmmicas modificadas se desprenden de las superficies adecuadas para la adhesion celular. El medio lfquido con las celulas en suspension se transfiere luego a la precamara.
Una vez que el medio lfquido bajo condiciones fisicoqmmicas modificadas y las celulas en suspension estan en la precamara, existen dos opciones:
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• o bien se necesita una mayor cantidad de celulas, en cuyo caso se agrega mas medio de cultivo a la precamara y se repiten todos los pasos desde el paso c) hasta alcanzar el numero objetivo de celulas, o
• se ha alcanzado el numero objetivo de celulas, en cuyo caso se extrae el medio lfquido con las celulas en suspension de la precamara.
El metodo proporciona la ventaja tecnica de ser capaz de controlar in vivo el numero de celulas requeridas a lo largo del metodo, con la versatilidad subsiguiente de ser capaz de modificar el numero objetivo final de celulas de acuerdo con los requisitos del metodo aplicado.
En un segundo aspecto inventivo, la presente invencion se refiere a un sistema de cultivo celular que comprende;
• al menos un dispositivo adecuado para el cultivo celular, comprendiendo el dispositivo:
s al menos una camara de biorreactor que comprende al menos una superficie interna adecuada para el cultivo celular,
s medios de entrada y salida de fluido
s al menos una precamara en conexion con la al menos una camara de biorreactor que comprende una entrada para introducir celulas,
• sensores de concentracion de oxfgeno, concentracion de dioxido de carbono, pH y temperatura para controlar los niveles de estas variables, y
• una unidad de control que comprende un sistema de control optico, estando adaptada la unidad de control para llevar a cabo el metodo de control para controlar el cultivo celular de acuerdo con el primer aspecto inventivo.
El sistema tambien se puede utilizar de manera versatil para diferentes usos, por ejemplo, para la reprogramacion de celulas o la expansion de celulas mediante el intercambio de dispositivos desmontables, cada uno de los cuales esta adaptado para el tipo de trabajo que realiza.
Todas las caractensticas descritas en esta especificacion (incluidas las reivindicaciones, la descripcion y los dibujos) se pueden combinar en cualquier combinacion, excepto las combinaciones de tales caractensticas mutuamente exclusivas.
Descripcion de los dibujos
Para complementar la descripcion que se realizara a continuacion y con el fin de ayudar a comprender mejor las caractensticas de la invencion de acuerdo con una realizacion practica preferida de la misma, se adjunta un conjunto de dibujos como una parte integral de dicha descripcion, en la que se muestra lo siguiente con un caracter ilustrativo y no limitativo:
la Figura 1 muestra una realizacion de un sistema de acuerdo con la invencion.
La Figura 2.1, la Figura 2.2, la Figura 2.3 y la Figura 2.4 muestran un ejemplo particular de una secuencia de pasos del metodo de acuerdo con la invencion aplicado a un ejemplo particular del sistema.
La Figura 3 muestra un ejemplo particular de una camara (2) de biorreactor con superficies adicionales (39) para la adhesion celular.
Descripcion detallada de la invencion
Sistema de cultivo celular
El sistema de cultivo celular propuesto por la invencion es un sistema que comprende:
• al menos un dispositivo (1) adecuado para el cultivo celular, comprendiendo el dispositivo (1):
s al menos una camara (2) de biorreactor que comprende al menos una superficie interna (22, 3, 39) adecuada para cultivo celular,
s medios de entrada y salida de fluido (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24),
s al menos una precamara (4) en conexion con la al menos una camara (2) de biorreactor que comprende una entrada (5) para introducir celulas.
El medio de cultivo esta contenido en una camara (7) para contener medio de cultivo celular que se mantiene en la condicion de presion, condicion de temperatura, condicion de pH, nivel de oxfgeno y nivel de dioxido de carbono deseada. Para ese fin, en una realizacion, esta camara (7), para contener medio de cultivo, esta provista de sensores para estas condiciones y esta conectada a un cilindro de oxfgeno, a un cilindro de dioxido de carbono, a un
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dispensador de NaOH, a un cilindro de nitrogeno que controla la presion (todas estas conexiones con sus correspondientes valvulas) y, en un ejemplo particular, a un intercambiador de calor (11) que permite cambiar la temperatura, la condicion fisicoqmmica particular en este ejemplo.
La camara (7), para contener medio de cultivo celular, esta en conexion con un dispositivo (1) por medio de al menos un primer conducto (9) para transportar medio de cultivo; al menos un segundo conducto (10) para transportar gases que ademas conecta un sistema de alimentacion de gas, N2 en la realizacion de la Figura 1, con el dispositivo (1). Estos al menos un primer y segundo conducto de transporte (9, 10), en el ejemplo representado en la Figura 1, tambien tienen valvulas para controlar el flujo del medio y del gas; una de las valvulas para controlar el flujo del medio permite seleccionar, en el ejemplo de la Figura 1, donde la al menos una de las condiciones fisicoqmmicas iniciales que cambian es la temperatura, entre dos vfas alternativas para el medio de cultivo, una de las cuales pasa por un intercambiador de calor (11) que permite acondicionar su temperatura antes de alcanzar el dispositivo (1).
Ventajosamente, en una realizacion particular del sistema de acuerdo con la invencion, el dispositivo (1) es desmontable y proporciona al sistema un elemento que se puede adquirir independientemente y se adapta a diferentes cultivos celulares, tales como, por ejemplo, celulas de mairnfero, celulas bacterianas, etc. Por lo tanto, el dispositivo adapta el sistema para diferentes fines solo mediante el intercambio del dispositivo (1) desmontable dependiendo del metodo a realizar.
Metodo de cultivo celular
El metodo presentado por la invencion se caracteriza por que se implementa en un sistema que comprende:
• al menos un dispositivo (1) adecuado para el cultivo celular, comprendiendo el dispositivo (1):
s al menos una camara (2) de biorreactor que comprende al menos una superficie interna (22, 3, 39) adecuada para cultivo celular,
s medios de entrada y salida de fluido (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24),
s al menos una precamara (4) en conexion con la al menos una camara (2) de biorreactor que comprende una entrada (5) para introducir celulas,
y por que comprende los siguientes pasos:
a) llenar la precamara (4) con un medio de cultivo bajo condiciones fisicoqmmicas iniciales con un volumen predeterminado de lfquido, colocandose la precamara (4) de tal manera que el medio de cultivo no pase a la al menos una camara (2) de biorreactor,
b) introducir celulas a traves de la entrada (5) de celulas para introducir celulas en la precamara (4),
c) pasar el medio de cultivo con las celulas a la al menos una camara (2) de biorreactor,
d) dejar que las celulas se asienten y dejarlas en reposo durante un tiempo predeterminado hasta que se adhieran a la al menos una superficie interior (22, 3, 39) adecuada para el cultivo celular cuyas propiedades fisicoqmmicas hacen que se comporte de tal manera que favorezca la adhesion celular bajo varias condiciones fisicoqmmicas iniciales,
e) dejar circular el lfquido a traves del dispositivo (1) y a traves de los medios de entrada y salida de fluido (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) hasta obtener un numero objetivo de celulas o hasta alcanzar una densidad cntica en la al menos una camara (2) de biorreactor llena de medio de cultivo,
f) una vez que se obtiene un numero objetivo de celulas o se alcanza una densidad cntica en la al menos una camara (2, 2', 2") de biorreactor utilizada para el cultivo, cambiar al menos una de las condiciones fisicoqmmicas iniciales del medio de cultivo a condiciones fisicoqmmicas modificadas bajo las que se previene la adhesion celular, de manera que el volumen restante dentro del dispositivo (1) bajo condiciones fisicoqmmicas modificadas se ubique en las camaras (2, 2', 2'') de biorreactor que se han utilizado para la amplificacion celular,
g) pasar el medio de cultivo con las celulas a la precamara (4), y
si se ha alcanzado el numero objetivo de celulas, extraer el medio de cultivo con las celulas en suspension a traves de medios de salida (24), o
si no se ha alcanzado el numero objetivo de celulas, introducir medio de cultivo adicional en la precamara (4) y repetir los pasos a partir del paso c).
En una realizacion en el primer paso, solo se llena una camara (2) de biorreactor para cultivo celular. En un ejemplo particular, la precamara (4) del dispositivo (1) se llena con medio de cultivo a traves de una valvula (13), como se observa en las Figuras 1 y 2. La cantidad de medio de cultivo que se acumula en la precamara (4) antes de cerrar esta valvula (13) suele ser, pero no siempre, igual al volumen de la primera camara (2) de biorreactor. En este ejemplo, solo una camara (2) de biorreactor se llena en el primer paso. Antes de llenar la camara de biorreactor, se introducen las celulas en la precamara (4) a traves de la entrada (5) para introducir las celulas de modo que esten en suspension en el medio de cultivo.
En el ejemplo particular de la Figura 1, el medio de cultivo con las celulas en suspension se pasa a la primera
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camara (2) de biorreactor mediante el movimiento del dispositivo (1) y la introduccion de nitrogeno a traves de la valvula (15), ya que es inerte para las celulas. El dispositivo (1) se mueve mediante un mecanismo (16) para mover el dispositivo (1). El ejemplo particular de la Figura 1 muestra un dispositivo (1) con tres camaras (2, 2', 2") de biorreactor:
En un ejemplo particular, la precamara (4) esta en conexion con la primera camara (2) de biorreactor por medio de una segunda valvula (14) que esta ubicada en la parte de la pared cerca de la esquina de la precamara que separa las camaras.
En el ejemplo particular representado en la Figura 2.2, el dispositivo (1) cambia su posicion de horizontal a vertical, entendiendose asf la posicion vertical, por lo que la pared mas larga del dispositivo (1) se ubica en una direccion vertical, y entendiendose asf la posicion horizontal, por lo que la pared mas larga del dispositivo (1) esta ubicada en una direccion horizontal, por medio de un mecanismo (16) para mover el dispositivo (1), como se ve en la Figura 1, que en esta realizacion particular es un motor capaz de transferir un movimiento de rotacion.
La segunda valvula (14) esta en una posicion tal que el medio de cultivo con las celulas en suspension esta ubicado en la precamara (4) a una altura igual o mayor que la valvula, por lo que puede pasar a traves de la misma. Para facilitar la transferencia del medio fluido entre la precamara (4) y la camara (2) de biorreactor, en un ejemplo particular, la precamara (4) comprende una valvula (15) de entrada de gas conectada a un cilindro de nitrogeno y la ultima camara (2") de biorreactor, que en este ejemplo es la tercera camara de biorreactor, comprende una segunda valvula (19) de salida de gas. Por lo tanto, la transferencia del medio de cultivo con las celulas en suspension se facilita mediante la inyeccion de, en este caso particular, nitrogeno, ya que es inerte para las celulas.
Una vez que el medio de cultivo con las celulas en suspension ha pasado a la primera camara (2) de biorreactor, el mecanismo (16) para mover el dispositivo (1) mueve el dispositivo (1) a una posicion tal que la segunda valvula (14) entre la precamara (4) y la primera camara (2) de biorreactor esta, en este ejemplo particular, a una altura igual o mayor que la del medio de cultivo con las celulas en suspension, y el medio de cultivo se ubica asf en la camara (2) de biorreactor sin la posibilidad de tener una via de escape hacia la precamara (4). Este paso se muestra en la Figura 2.3.
En una realizacion mostrada en la Figura 3, la camara (2) de biorreactor comprende internamente una serie de superficies (39) adicionales para la adhesion celular, que pueden ser de forma esferica o tubular, entre otras formas, de modo que la superficie util para el cultivo es mayor que la permitida por las superficies internas (22, 3) adecuadas para el cultivo celular de la camara (2) de biorreactor. En un ejemplo particular, las superficies adicionales (39) para la adhesion celular son una pluralidad de biomoleculas, preferentemente protemas, peptidos o moleculas sinteticas biologicamente activas comprendidas en al menos una superficie interna del dispositivo.
En una realizacion particular, para hacer posible la adhesion, las superficies adicionales (39) para la adhesion celular y las superficies internas (22, 3) adecuadas para el cultivo celular de la camara (2) de biorreactor se recubren con un gel que cambia sus propiedades fisicoqmmicas con la temperatura. En un ejemplo particular, este gel es poli(n- isopropil acrilamida). A 37 °C, este gel es adecuado para la adhesion celular y permite que las celulas se adhieran a las superficies (3, 22, 39) cubiertas por el gel para facilitar la amplificacion celular. En un ejemplo particular, no se utiliza un gel sino que las superficies internas (3, 22, 39) adecuadas para el cultivo celular de la camara (2) de biorreactor estan adaptadas para cambiar sus propiedades dependiendo de la temperatura para permitir la adhesion celular.
Cuando ha tenido lugar la adhesion celular, un nuevo medio de cultivo circula de forma continua a traves del dispositivo a una temperatura tal que la superficie interna (3, 22, 39) adecuada para el cultivo mantiene las condiciones fisicoqmmicas que facilitan la adhesion celular, que entra, en el ejemplo particular mostrado en la Figura 1, a traves de la valvula (13) de entrada de medio de la precamara (4) y que sale a traves de las valvulas (14, 17, 18, 23) de salida de medio. Ventajosamente, al hacer que el medio fluya de forma continua, el medio se renueva a las condiciones requeridas para el cultivo celular.
En una realizacion, el sistema comprende sensores para la concentracion de oxfgeno, concentracion de dioxido de carbono, pH y temperatura ubicados despues de la valvula (17) de salida para controlar los niveles de estas variables durante el proceso de amplificacion.
En un ejemplo particular como se muestra en la Figura 1, una unidad de control (20) que comprende un sistema de control optico (21) se utiliza para controlar la densidad y el numero de celulas y para detener la amplificacion cuando se alcanza el numero objetivo de celulas.
En esta realizacion, el dispositivo (1) que se coloca horizontalmente en este paso del proceso tiene una superficie (22) transparente; debajo de esta superficie (22) transparente, que se puede cubrir con un gel y sobre la cual las celulas pueden adherirse y multiplicarse en este paso, se ubica al menos un microscopio que mide el numero de celulas y la densidad celular. Este microscopio optico transmite esta informacion a la unidad de control (20) y el sistema funciona asf automaticamente.
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Una vez que se ha obtenido el numero objetivo de celulas o la densidad celular alcanza un valor a partir del cual la calidad del cultivo es inferior a la requerida, las condiciones fisicoqmmicas del medio que circula en un flujo continuo se cambian a condiciones fisicoqmmicas modificadas para las cuales la superficie interior (3, 22, 39) adecuada para el cultivo celular tiene una caractenstica fisicoqmmica tal que permite que las celulas esten nuevamente en suspension en el medio. Para ese fin, una vez que el dispositivo (1) ha alcanzado condiciones fisicoqmmicas modificadas, por ejemplo, una temperatura T2 debido a la entrada de flujo a esta temperatura, el flujo continuo del medio se detiene y se deja reposar en el dispositivo (1) hasta que las celulas estan nuevamente en suspension. El medio lfquido con las celulas en suspension se transfiere luego a la precamara (4). En el ejemplo particular de la Figura 1, cuando se alcanza el numero objetivo de celulas o la densidad maxima, que se detectan automaticamente en la realizacion particular que se muestra en la Figura 1 por medio de la unidad de control (20) que tiene un sistema de control optico (21), el medio de cultivo que circula de forma continua circula a una temperatura T2 lo suficientemente larga como para permitir que esta temperatura sea uniforme en todo el dispositivo (1). A esta temperatura, las superficies internas (3, 22, 39) adecuadas para el cultivo celular tienen propiedades que no son adecuadas para la adhesion celular, por lo que las celulas se suspenden nuevamente, perdiendo su adhesion a la superficie o superficies adecuadas para el cultivo. En un ejemplo particular, el medio de cultivo pasa desde la salida de la camara (7) para contener medio de cultivo celular a traves de conductos de transporte (9) que comprenden un intercambiador de calor (11); asf la temperatura cambia de T1 a T2.
En un ejemplo particular, la temperatura T2 es de 24 °C, ya que el gel de poli(n-isopropil acrilamida) utilizado en esta realizacion se comporta de tal manera que la adhesion celular no se produce a esta temperatura.
Luego se interrumpe el flujo continuo del medio de manera tal que el volumen restante dentro del dispositivo es igual al de la camara (2) de biorreactor utilizada para la amplificacion, y que todo el volumen del medio a la temperatura T2 se encuentra en la primera camara (2) de biorreactor.
Cuando las celulas se han separado y estan nuevamente en suspension en el medio de cultivo, el medio de cultivo con las celulas en suspension se transfiere a la precamara. En el ejemplo de las figuras 1, 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4, el dispositivo (1) gira, en un ejemplo particular, con la ayuda de un mecanismo (16) para mover el dispositivo (1) en una direccion opuesta a la direccion del paso anterior de la Figura 2.3 hasta alcanzar la posicion que se muestra en la Figura 2.4, de modo que se encuentre en posicion vertical, con la segunda valvula (14) al mismo nivel o por debajo del medio de cultivo con las celulas en suspension. En esta posicion, y con la ayuda de los cambios de presion causados por las valvulas (15, 19) de entrada y salida de gas para la entrada y salida de un gas, en un ejemplo particular, nitrogeno, se transfiere el medio de cultivo con las celulas en suspension a la precamara (4).
Si el cultivo se lleva a cabo en la primera camara para obtener un mayor numero de celulas totales, la calidad del cultivo disminuina a medida que se acumula un gran numero de celulas, que comparten una superficie de crecimiento limitada. La ventaja proporcionada por el metodo iterativo de acuerdo con la invencion es que el numero de celulas cultivadas aumenta en la medida en que se necesitan mas celulas, pero no a expensas de una densidad tal que la calidad del cultivo se vea afectada negativamente. Para ese fin, una segunda camara (2') de biorreactor se llena, lo que resulta en una nueva iteracion del metodo de acuerdo con la invencion, ya que no se ha alcanzado el numero objetivo final de celulas y la calidad de las celulas amplificada en la primera camara (2) de biorreactor se ve afectada por la densidad adquirida por el medio de cultivo con las celulas. La realizacion de la invencion es como se describe a continuacion:
La precamara (4) se llena con una cantidad adicional de medio de cultivo que llega a traves de los conductos de transporte (9) desde la camara (7) para contener el medio de cultivo celular y entra a traves de la valvula (13). Esta cantidad adicional de medio de cultivo tiene un volumen generalmente igual al de la segunda camara (2') de biorreactor. Por lo tanto, en este paso de esta realizacion, el volumen total del medio de cultivo en la precamara (4) es igual a la suma de la capacidad de la primera camara (2) de biorreactor mas la segunda camara (2') de biorreactor.
La segunda valvula (14) esta en una posicion tal que el medio de cultivo con las celulas en suspension esta ubicado en la precamara (4) a una altura igual o mayor que la valvula, por lo que puede pasar a traves de la misma. Para facilitar la transferencia del medio fluido entre la precamara (4) y la camara (2, 2') de biorreactor, en un ejemplo particular, la precamara (4) comprende una valvula de entrada de gas (15) conectada a un cilindro de nitrogeno. La ultima camara (2") de biorreactor, que en este ejemplo es la tercera camara de biorreactor, comprende una valvula (19) de salida de gas. Por lo tanto, la transferencia del medio de cultivo con las celulas en suspension se facilita mediante la inyeccion de, en este caso particular, nitrogeno, ya que es inerte para las celulas.
En la realizacion mostrada en la Figura 1, las camaras (2, 2') de biorreactor estan en comunicacion por medio de una tercera valvula (18) que permite el paso del medio de cultivo entre ellas. En este paso de esta realizacion particular, cuando todo el medio de cultivo abandona la precamara (4), las camaras (2, 2') de biorreactor se llenan.
Una vez que el medio de cultivo con las celulas en suspension ha pasado a la primera camara (2) de biorreactor y a la segunda camara (2') de biorreactor, el mecanismo (16) para mover el dispositivo (1) mueve el dispositivo (1) nuevamente a una posicion tal que la segunda valvula (14) entre la precamara (4) y la primera camara (2) de
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biorreactor se ubique, en este ejemplo particular, a una altura igual o mayor que la del medio de cultivo con las celulas en suspension, y el medio de cultivo se ubica asf en las camaras (2, 2') de biorreactor sin la posibilidad de tener una via de escape hacia la precamara (4).
En una realizacion particular, la primera camara (2) de biorreactor y la segunda camara (2') de biorreactor tienen una serie de superficies (39) adicionales para la adhesion celular que pueden ser de forma esferica o tubular, entre otras formas, de modo que la superficie util para el cultivo es mayor que la permitida por las superficies internas (3, 22) adecuadas para el cultivo celular de ambas camaras (2, 2') de biorreactor. En una realizacion particular, para hacer posible la adhesion, las superficies adicionales (39) para la adhesion celular y las superficies internas (3, 22) adecuadas para el cultivo celular de la camara (2, 2') de biorreactor se recubren con un gel que cambia sus propiedades como una condicion fisicoqmmica espedfica, en este ejemplo, la temperatura, cambia. En un ejemplo particular, este gel es un gel de poli(n-isopropil acrilamida). A 37 °C, este gel es tal que permite que las celulas se adhieran a las superficies (3, 22, 39) cubiertas por el gel, para facilitar la division celular. En un ejemplo particular, no se utiliza un gel sino que las superficies internas (3, 22, 39) adecuadas para el cultivo celular de las camaras (2, 2') de biorreactor estan adaptadas para cambiar sus propiedades dependiendo de la temperatura para permitir la adhesion celular.
Cuando ha tenido lugar la adhesion celular, un nuevo medio de cultivo circula de forma continua a traves del dispositivo a una temperatura tal que las superficies internas (3, 22, 39) adecuadas para el cultivo mantienen las condiciones fisicoqmmicas que facilitan la adhesion celular, que entra, en el ejemplo particular mostrado en la Figura 1, a traves de la valvula (13) de entrada de medio de la precamara (4) y que sale a traves de la valvula (17) de salida de medio de la ultima camara (2") para llenarse. Ventajosamente, al hacer que el medio fluya de forma continua, el medio se renueva a las condiciones requeridas para el cultivo celular.
En una realizacion, el sistema comprende sensores para la concentracion de oxfgeno, concentracion de dioxido de carbono, pH y temperatura ubicados despues de la valvula (17) de salida para controlar los niveles de estas variables durante el proceso de amplificacion.
En un ejemplo particular como se muestra en la Figura 1, una unidad de control (20) que comprende un sistema de control optico (21) se utiliza para controlar la densidad y el numero de celulas y para detener la amplificacion cuando se alcanza el nivel objetivo.
En esta realizacion, el dispositivo (1) que se coloca horizontalmente en este paso del proceso tiene una superficie (22) transparente; debajo de esta superficie (22) transparente, que se puede cubrir con un gel y sobre la cual las celulas pueden adherirse y multiplicarse en este paso, se ubican una serie de microscopios que miden el numero de celulas y la densidad celular. Estos microscopios opticos transmiten esta informacion a la unidad de control (20) y el sistema funciona asf automaticamente.
Cuando se alcanza la densidad a partir de la cual la calidad del cultivo no es la requerida o se alcanza el numero de celulas deseadas, que se detectan automaticamente en la realizacion particular que se muestra en la Figura 1 por medio de la unidad de control (20) que tiene un sistema de control optico (21), el medio de cultivo, que circula de forma continua, cambia el valor de la al menos una condicion fisicoqmmica inicial seleccionada, en este ejemplo, la temperatura, a una temperatura T2 lo suficientemente larga como para permitir que esta temperatura sea uniforme en todo el dispositivo (1). A esta temperatura, las superficies internas (3, 22, 39) adecuadas para el cultivo celular tienen propiedades fisicoqmmicas que no son adecuadas para la adhesion celular, por lo que las celulas se suspenden nuevamente, perdiendo su adhesion a la superficie o superficies adecuadas para el cultivo. En un ejemplo particular, el medio de cultivo pasa desde la salida de la camara (7) para contener medio de cultivo celular a traves de conductos de transporte (9) que comprenden un intercambiador de calor (11); asf la temperatura cambia de T1 a T2.
En un ejemplo particular, la temperatura T1 es de 37 °C y la temperatura T2 es de 24 °C ya que el gel de poli n- isopropil acrilamida utilizado en esta realizacion se comporta de manera tal que es adecuado para la adhesion celular a 37 °C y tal que no es adecuado para la adhesion celular a 24 °C.
Luego se interrumpe el flujo continuo del medio de tal manera que el volumen restante dentro del dispositivo es igual a la suma de los volumenes de las camaras (2, 2') de biorreactor utilizadas para la amplificacion, y que todo este volumen del medio a la temperatura T2 esta ubicado en estas dos camaras (2, 2') de biorreactor.
Cuando las celulas se han separado y estan nuevamente en suspension en el medio de cultivo, el dispositivo (1) se gira con la ayuda del mecanismo (16) para mover el dispositivo (1), en el ejemplo particular de la Figura 1, de modo que se ubica en posicion vertical, como se indica en la Figura 2.4, con la segunda valvula (14) al mismo nivel o por debajo del medio de cultivo con las celulas en suspension. En esta posicion, y con la ayuda de los cambios de presion causados por las valvulas (15, 19) de entrada y salida de gas para la entrada y salida de un gas, en un ejemplo particular, nitrogeno, se transfiere el medio de cultivo con las celulas en suspension a la precamara (4).
Si el cultivo se lleva a cabo en la primera y segunda camara para obtener un mayor numero de celulas totales, la calidad del cultivo disminuina a medida que se acumula un gran numero de celulas, compartiendo una misma
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superficie de crecimiento. La ventaja proporcionada por el metodo iterativo de acuerdo con la invencion es que el numero de celulas cultivadas aumenta en la medida en que se necesitan mas celulas, pero no a expensas de una densidad tal que la calidad del cultivo se vea afectada negativamente. Para ese fin, una tercera camara (2'') de biorreactor se llena, lo que da como resultado una nueva iteracion del metodo de acuerdo con la invencion. Los pasos en este ejemplo son similares a los descritos anteriormente para llenar una camara de biorreactor y para llenar dos camaras de biorreactor, y todas las realizaciones particulares consideradas tambien son aplicables. Espedficamente, en la realizacion mostrada en la Figura 1, las camaras (2, 2', 2'') de biorreactor estan en comunicacion por medio de las valvulas (18, 23) que permiten el paso del medio de cultivo entre ellas.
En la realizacion particular mostrada en la Figura 1, que comprende tres camaras de biorreactor, esta tercera camara (2") de biorreactor corresponde a la ultima camara de biorreactor que se va a llenar, de manera que comprende la valvula (19) de salida de gas y la valvula (17) de salida de medio.
En esta realizacion particular, cuando el medio de cultivo con las celulas en suspension se transfiere de la manera descrita anteriormente a la precamara (4) a traves de las valvulas (14, 18, 23), el cultivo celular ya no se puede continuar sin deterioro en la calidad del cultivo.
En la realizacion de la Figura 1, una vez que se ha alcanzado el numero objetivo de celulas mediante el llenado sucesivo de las tres camaras mencionadas anteriormente, se transfiere el medio de cultivo desde la precamara (4) hacia una valvula (24) de salida final de manera que el medio de cultivo abandona el dispositivo (1).
En una realizacion particular, el medio de cultivo que se transfiere desde el dispositivo (1) pasa a traves de un sistema de filtracion (25) en el que las celulas se separan del medio de cultivo de la siguiente manera:
En una realizacion particular, el sistema de filtracion (25) comprende una camara (26) para contener medio lfquido, tal como un lfquido tamponado, y conductos (27) ubicados entre dicha camara para contener lfquido y el sistema de filtracion (25). Este sistema de filtracion (25) comprende medios de entrada y salida de lfquido y medios de entrada y salida de medio de cultivo. En ambos casos, los medios de entrada y salida son valvulas en una realizacion particular. En la realizacion particular de la Figura 1, el medio de cultivo entra en el sistema de filtracion (25) a traves de una valvula (28) y sale del sistema de filtracion a traves de la valvula (32); el lfquido a su vez entra en el sistema de filtracion (25) a traves de una valvula (29) y sale del sistema de filtracion a traves de una valvula (30).
El sistema de filtracion (25) comprende internamente un filtro (31) que, en una realizacion particular, comprende medios de vibracion (37). El filtro (31) retiene las celulas en suspension en el medio de cultivo; en la realizacion particular correspondiente, las celulas se separan del filtro (31) por medio del movimiento provocado por los medios de vibracion (37) en el filtro (31). En una realizacion particular, el lfquido que entra en el sistema de filtracion (25) a traves de la valvula (29) recoge las celulas de modo que las celulas que estan en suspension en el lfquido; en esta realizacion particular, el lfquido, que en una realizacion particular es un lfquido tamponado, salen del sistema de filtracion (25) a traves de la valvula (30). Por lo tanto, el lfquido con una concentracion celular espedfica (concentracion C) se encuentra en la salida de dicha valvula (30). En la realizacion particular de la Figura 1, el medio de cultivo sale del sistema de filtracion (25), sin celulas en suspension, a traves de la valvula (32).
En una realizacion particular, el sistema comprende un sistema de esterilizacion (33). Espedficamente, en la realizacion particular mostrada en la Figura 1, el sistema de esterilizacion (33) comprende una camara (34) para contener sustancia esterilizante, una bomba (35) para bombear la sustancia esterilizante a traves de los conductos de transporte (9, 10) y una valvula (36) que regula la entrada de sustancia esterilizante al resto del sistema.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de cultivo celular caracterizado por que se implementa en un sistema que comprende:
    • al menos un dispositivo (1) adecuado para el cultivo celular, comprendiendo el dispositivo (1):
    s al menos una camara (2) de biorreactor que comprende al menos una superficie interna (3, 22, 39) adecuada para el cultivo celular,
    s medios de entrada y salida (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) de fluido, y
    s al menos una precamara (4) en conexion con la al menos una camara (2) de biorreactor, que comprende una entrada (5) para introducir celulas,
    y por que comprende los siguientes pasos:
    a) llenar la precamara (4) con un medio de cultivo bajo condiciones fisicoqmmicas iniciales con un volumen predeterminado de lfquido,
    b) introducir celulas en la precamara (4) a traves de la entrada celular (5),
    c) pasar el medio de cultivo con las celulas a la al menos una camara (2) de biorreactor,
    d) dejar que las celulas se asienten y dejarlas en reposo durante un tiempo predeterminado hasta que se adhieran a la al menos una superficie interior (3, 22, 39) adecuada para el cultivo celular cuyas propiedades fisicoqmmicas hacen que se comporte de tal manera que favorezca la adhesion celular bajo una o varias condiciones fisicoqmmicas iniciales,
    e) dejar circular el medio de cultivo a traves del dispositivo (1) y a traves de los medios de entrada y salida (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) de fluido,
    f) una vez que se obtiene un numero objetivo de celulas o se alcanza una densidad cntica en la al menos una camara (2, 2', 2”) de biorreactor utilizada para el cultivo, cambiar al menos una de las condiciones fisicoqmmicas iniciales del medio de cultivo a condiciones fisicoqmmicas modificadas bajo las que se previene la adhesion celular, de tal manera que el volumen restante dentro del dispositivo (1) bajo condiciones fisicoqmmicas modificadas se ubique en las camaras (2, 2', 2") de biorreactor que se han utilizado para la amplificacion celular,
    g) pasar el medio de cultivo con las celulas a la precamara (4), y
    si se ha alcanzado el numero objetivo de celulas, extraer el medio de cultivo con las celulas en suspension a traves de medios de salida (24), o
    si no se ha alcanzado el numero objetivo de celulas, introducir medio de cultivo adicional en la precamara y repetir los pasos a partir del paso c).
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que la al menos una de las condiciones fisicoqmmicas iniciales que cambian es la temperatura.
  3. 3. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende controlar automaticamente el numero y/o la densidad de celulas por medio de al menos una unidad de control (20) adecuada para controlar el cultivo celular llevado a cabo en el dispositivo (1).
  4. 4. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el control del numero y/o la densidad de celulas se realiza por medio de una unidad de control (20) que comprende un sistema de control optico (21) y a traves de una superficie (22) transparente comprendida en el dispositivo, comprendiendo el control del numero de celulas el paso:
    • una vez que ha pasado el medio de cultivo a la al menos una camara (2) de biorreactor, colocar el dispositivo
    (1) de manera que el medio de cultivo con las celulas en suspension se ubique en la superficie (22) transparente y esta superficie (22) transparente se coloca a su vez en el sistema de control optico (21) para controlar el numero y/o la densidad de celulas.
  5. 5. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende un paso para esterilizar el sistema por medio de un sistema de esterilizacion (33) conectado con dicho sistema.
  6. 6. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la transferencia entre la precamara (4) y la al menos una camara (2, 2', 2") de biorreactor se realiza mediante presion de tal manera que el medio pasa a traves de varias valvulas (14, 18, 23).
  7. 7. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que despues de extraer el medio de cultivo con las celulas en suspension a traves de los medios de entrada y salida (24) de fluido, las celulas se separan del medio de cultivo por medio de:
    • un medio lfquido contenido en una camara (26),
    • al menos un sistema de filtracion (25) conectado a dicha camara (26), que comprende:
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    o medios de entrada y salida (29) de medio Ifquido, o medios de entrada y salida (28, 32) de medio de cultivo, o al menos un filtro (31),
    y por que se implementan los siguientes pasos:
    • introducir el medio de cultivo con las celulas en el sistema de filtracion (25),
    • retener las celulas con el al menos un filtro (31),
    • introducir medio lfquido en el sistema de filtracion (25) a traves de los medios de entrada y salida (29) de medio
    lfquido,
    de modo que las celulas se separen del medio de cultivo.
  8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 7, caracterizado por que las celulas se separan del filtro mediante agitacion de dicho filtro por medio de al menos un medio de vibracion (37) comprendido en dicho filtro.
  9. 9. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones, caracterizado por que se preparan cultivos de diferentes tipos por medio de un sistema que comprende una pluralidad de dispositivos desmontables, cada uno de estos dispositivos utiliza al menos una superficie interna adecuada para el tipo de cultivo que se va a preparar.
  10. 10. Un sistema de cultivo celular que comprende:
    • al menos un dispositivo (1) adecuado para el cultivo celular, comprendiendo el dispositivo (1):
    o al menos una camara (2) de biorreactor que comprende al menos una superficie interna (3, 22, 39) adecuada para el cultivo celular,
    o medios de entrada y salida (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) de fluido, y
    o al menos una precamara (4) en conexion con la al menos una camara (2) de biorreactor que comprende una entrada (5) para introducir celulas,
    • sensores de concentracion de oxfgeno, concentracion de dioxido de carbono, pH y temperatura para controlar
    los niveles de estas variables, y
    • una unidad de control (20) que comprende un sistema de control optico (21), estando adaptada la unidad de
    control (20) para llevar a cabo el metodo de control para controlar el cultivo celular de acuerdo con la reivindicacion 1.
  11. 11. El sistema de acuerdo con la reivindicacion 10, caracterizado por que al menos una de las superficies internas (3) del dispositivo es transparente, formando una superficie (22) transparente de manera que se implementa un metodo de control de acuerdo con la reivindicacion 4.
  12. 12. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, caracterizado por que comprende al menos un sistema de esterilizacion (33).
  13. 13. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado por que comprende:
    • al menos una camara (26) para contener un medio lfquido,
    • al menos un sistema de filtracion (25) que comprende:
    o medios de entrada y salida (29) de medio lfquido, o medios de entrada y salida (28, 32) de medio de cultivo, o al menos un filtro (31),
    • medios (27) para transportar medio lfquido entre la camara (26) para contener un medio lfquido y el al menos un sistema de filtracion (25).
  14. 14. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado por que comprende valvulas de entrada y salida (14) desde la precamara (4) a la camara (2) de biorreactor y/o valvulas de entrada y salida (15, 19) de gas.
  15. 15. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado por que comprende superficies adicionales (39) para la adhesion celular en al menos una camara (2) de biorreactor, preferentemente protemas, peptidos o moleculas sinteticas biologicamente activas.
  16. 16. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado por que la al menos una superficie interna (22, 3, 39) adecuada para cultivo celular esta recubierta con un gel.
  17. 17. El sistema de acuerdo con la reivindicacion 16, caracterizado por que el gel es un hidrogel de poli(n-isopropil acrilamida).
  18. 18. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado por que el sistema de 5 filtracion (25) comprende un medio de vibracion (37).
  19. 19. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, caracterizado por que el dispositivo (1) es desmontable
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