DE19952847B4

DE19952847B4 - Vorrichtung zum Kultivieren und/oder Differenzieren und/oder Halten von Zellen und/oder Geweben

Info

Publication number: DE19952847B4
Application number: DE19952847A
Authority: DE
Inventors: Will Minuth
Original assignee: Minuth Will Prof Dr
Current assignee: Minuth Will Prof Dr
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 1999-11-03
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2019-11-04
Also published as: DE19952847A1

Abstract

Vorrichtung zum Kultivieren und/oder Differenzieren und/oder Halten von Zellen oder Geweben in einem einen Zellträger oder Gewebeträger aufweisenden Kultivierbereich (13, 14) einer geschlossenen Kammer eines Kulturbehälters (6, 6a), die Anschlüsse zum Zuführen und Abführen eines Kulturmediums aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der Kultivierbereich (13, 14) von einem von dem Kulturmedium durchströmbaren Kapillarnetz umgeben ist, in das die Zellen nicht einwachsen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Kultivieren und/oder Differenzieren und/oder Halten von Zellen und/oder Geweben entsprechend Oberbegriff Patentanspruch 1.

Behälter oder Container zum Kultivieren und Differenzieren von Zellen und Geweben sind in unterschiedlichsten Ausführungen bekannt. Bekannt ist speziell auch ein Container zum Kutlivieren und/oder Differenzieren von Zellen und Geweben ( US 4 531 324 ), der eine Vielzahl von Kammern bildet.

Bekannt ist eine Zellträgermatrix ( US 5 736 399 ), die zum Einwachsen von Zellen aus einem Netz oder Gewebe aus einer Vielzahl von natürlichen oder synthetischen Fäden besteht, um dreidimensionale tierischen Zellstrukturen herzustellen, wobei das Vermehren und Ausbreiten der Zellen in der Matrix zumindest weitestgehend willkürlich erfolgten.

Bekannt ist weiterhin auch, in Zellkulturvorrichtungen für eine dreidimensionale Kultivierung einen Kulturraum in Form eines porösen Konstruktes vorzusehen, in welchem sich die in diesem Konstrukt eingelagerten Zellen dreidimensional ausbreiten können ( DE 197 25 318 A1 , WO 99/52 356 A1).

Bekannt ist weiterhin ( DE 35 30 440 , EP 0 205 790 ) für eine drei-dimensionale Kultivierung und Vermehrung von Zellen ein poröses Konstrukt oder eine poröse Matrix vorzusehen, die beispielsweise aus einer Vielzahl von perlenartigen Partikeln besteht und in welcher eingelagerte Zellen sich drei-dimensional ausbreiten und vermehren können, und zwar in den Zwischenräumen zwischen den die Matrix bildenden Perlen oder Partikeln. Zur Sicherstellung der Versorgung der Zellen sind in den Partikeln Mikrokanäle gebildet, über die ein Kulturmedium an die Zellen herangeführt bzw. Stoffwechselprodukte abgeführt werden können.

Bekannt ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Knorpelgeweben und Implantaten. Bei diesem Verfahren erfolgt eine Vermehrung von Knorpelzellen auf einer Knochenerstatzplatte in der Weise, dass die Knorpelzellen auch in diese Knochenersatzplatte einwachsen. Durch mechanisches Zuschneiden und/oder Vorformen der Knochenersatzplatte kann damit ein beispielsweise zur Reparatur von Gelenkdefekten geeignetes Implantat erzeugt werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung aufzuzeigen, mit der die Vermehrung, Verankerung und/oder Differenzierung der Zellen steuerbar ist. Zur Lösung dieser Aufgabe ist eine Vorrichtung entsprechend dem Patentanspruch 1 ausgebildet.

Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Bei der Erfindung erfolgt eine gezielte Steuerung der Zellvermehrung, Zellverankerung und/oder Differenzierung durch die im Kapilarnetz enthaltenen Informationen. Ein Material bzw. eine Matrix mit derartigen Eigenschaften werden nachstehend auch als „smart" bezeichnet.

Zellen und Gewebe im natürlichen Organismus funktionieren in der Regel perfekt. Werden diese Zellen oder Gewebe aber unter Kulturbedingungen gehalten, so sind wichtige Eigenschaften nur noch teilweise oder gar nicht mehr vorhanden. Werden derartige suboptimal generierte Gewebe z.B. beim Tissue engineering als Implantate in der Medizin verwendet, so kann dies fatale Folgen haben. Anstatt typischer Proteine werden z.B. atypische Eigenschaften entwickelt. Werden solche suboptimal hergestellten Gewebe für die Implantation verwendet, so kann dies zu Entzündungsund Abstoßreaktionen führen. Werden derartige suboptimal generierte Gewebe für die Biomaterialtestung oder Toxikologie verwendet, so kann nicht davon ausgegangen werden, daß diese Gewebe dann die gleichen Reaktionen zeigen, wie sie vom Organismus her bekannt sind. Der Grund für diese zelluläre Dedifferenzierung liegt häufig an den suboptimalen Kulturbedingungen.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß zur Verbesserung der Kulturbedingungen u.a. eine möglichst optimale, auch gasblasenfreie und gleichmäßige Zuführung von Kulturmedien an die jeweils verwendeten Kulturcontainer bzw. in die dortigen Kammern auch bei geringen Flußraten sowie eine gleichmäßige, dreidimensionale Versorgung der Kulturen mit den jeweiligen Kulturmedium bzw. mit der jeweiligen Nährflüssigkeit notwendig sind, was bei bisher bekannten Systemen oder Vorrichtungen nicht gewährleistet ist.

Gewebe bzw. Zellkulturen müssen zum optimalen Kultivieren und/oder Differenzieren und/oder Halten kontinuierlich oder in Intervallen mit immer frischem Medium versorgt werden. „Halten" bedeutet im Sinne der Erfindung insbesondere, daß das betreffende Gewebe oder die betreffende Zellkultur zumindest über einen gewissen Zeitraum in einem bestehenden Zustand (beispielsweise natürlichen Zustand) gehalten wird, um so z.B. Untersuchungen an bzw. mit dem Gewebe durchführen zu können. Für die Versorgung benutzt man vorzugsweise eine Peristaltikpumpe mit individuell wählbaren Pumpraten. Dabei wird das Kulturmedium aus einer Flasche oder einem Beutel über einem speziellen Schraubverschluß angesaugt. Wird Medium hierbei mit hohen Pumpraten abgesaugt, besteht in der Regel kein Problem. Allerdings bestehen erhebliche Probleme bei niedrigen Pump- oder Flußraten.

Müssen Gewebe mit geringen Pumpraten versorgt werden, so wird die Flüssigkeit häufig nicht oder nur verzögert angesaugt, weil über Mikroundichtigkeiten in den Ansaugteilen auch Luft angesaugt wird. Weiterer Nachteil bekannter Methode besteht auch darin, daß das Kulturmedium über eine Reihe sehr unterschiedlicher Materialien angesaugt wird. Im typischen Fall geschieht dies zuerst über ein Glasrohr, dann über einem Silikonschlauch mit großem Durchmesser, dann über das Kanalsystem der eigentlichen Verschlußkappe und schließlich über einen gesteckten Lueranschluß, der das Medium dann über einen kleinlumigen Schlauch zur Kulturkammer leitet.

Im typischen Fall werden Medien vom Boden einer Flasche in die Höhe angesaugt, um im Flaschenhals über eine Schraubkappe den abführenden Schlauch zu gelangen. Dabei muß durch Pumpenunterdruck ein Höhenunterschied der jeweiligen Flaschenhöhe überwunden werden.

Da bei dieser Anwendung dicklumige Ansaugschläuche verwendet werden, ist das Totvolumen extrem groß. Daher dauert es lange, bis bei kleinen Pumpraten Medium angesaugt wird, was dann mit Luftblasen versetzt in der Kammer erscheint. Speziell für Gradientenkammerversuche ist diese Methode nicht geeignet, da die Totvolumina der Ansaugwege nicht identisch groß sind. Dadurch dauert es unterschiedlich lange, bis das Kulturmedium beide Kompartimente der Gradientenkammer füllt. Durch Über- oder Unterdruck in der jeweiligen Hälfte einer Gradientenkammer führt dies zum Durchbruch des Gewebes. Gradienten können dadurch nicht mehr aufgebaut werden.

Experimentelles Ziel bei der künstlichen Herstellung von Geweben in allen Bereichen der Biomedizin ist es, daß möglichst serumfreie Kulturmedien verwendet werden. Zudem müssen den Medien häufig Hormone und Wachstumsfaktoren in sehr geringer Dosierung zugegeben werden, die in vielen Fällen schlecht löslich sind. Wenn zum Ansaugen eines Mediums aus einem Vorratsbehälter nacheinander unterschiedliche Flüssigkeitskanalmaterialien wie Glas, Silikon, Polysulfon und Polypropylen verwendet werden, ist nicht auszuschließen, daß essentielle Bestandteile des Mediums an diese Materialien gebunden werden und damit den Kulturen nicht mehr zur Verfügung stehen. Die Bioverfügbarkeit dieser Mediumkomponenten ist damit nicht mehr gegeben.

Während die Verwendung der herkömmlichen auf dem Markt erhältlichen Anschluß- bzw. Schraubkappen, wie ausgeführt, bei großen Pumpvoluminar grundsätzlich zu keinen Problemen führt, ist beim Ansaugen des Kulturmediums mit einem kleinen Pumpvolumen nicht zu verhindern, daß über Leckagen in den Leitungen und Anschlüssen Luft mit angesaugt wird, so daß häufig Luftblasen im Medium zu beobachten sind.

Im ungünstigsten Fall bestehen diese Probleme darin, daß das Medium bei kleinen Flußraten überhaupt nicht angesaugt wird. Verursacht wird dies durch äußerlich nicht erkennbare Miniaturundichtigkeiten zwischen dem Glasrohr, dem ausgestreckten dicken Silikonschlauch, dem daran anschließenden Rohrsystem in der Schraubkappe und dem aufgesteckten und damit abführenden Luerstecker. In dieses Leitungssystem soll Medium eingeleitet werden, daß zur optimalen Versorgung der Kulturen z.B. maximal mit Sauerstoff beladen ist. Beim Ansaugen des Mediums entstehen in der Flüssigkeitssäule mit dem Auge zuerst nicht erkennbare Gasblasen, die mit zunehmendem Transport des Mediums immer größer werden und schließlich wie ein Embolus eine Weiterleitung des Mediums massiv behindern.

Beobachtet wird auch, daß sich bei konventionellen Ansaugsystemen Gasblasen auch dort sammeln und immer größer werden, wo das Kulturmedium an Stellen vorbeifließt, deren Wandung aus unterschiedlichen Materialien besteht. Da bei den bisherigen Versuchen sowohl eine Absaugflasche, als auch eine Abfallflasche für das Medium benötigt wird, bereiten immer größer werdende Gasblasen in beiden Gefäßen Probleme. Wenn sich immer größer werdende Gasblasen im Ansaugstutzen befinden, so führt dies nach einiger Zeit zum Abriß der Flüssigkeitssäule und die Gasblase gelangt dadurch in das Leitungssystem, danach folgt wiederum Flüssigkeit. Speziell bei Leitungen mit kleinem Durchmesser oder bei kapillarähnlichen Schläuchen führt dies zu massiven Druckveränderungen.

Müssen wie z.B. in einer Gradientenkammer zwei Leitungen parallel mit gleichen Flüssigkeitsmengen geführt werden, so kommt es beim Ansaugvorgang zu ungleichen Transportraten des Mediums und zu Druckunterschieden, was wiederum das Gewebe in der Gradientenkammer durchbricht.

Nach Durchströmen des Mediums durch einen Kulturcontainer muß es gesammelt werden. Dies geschieht im typischen Fall über einen Schlauch, der über eine Steckverbindung mit einer Verschlußkappe und einem einleitenden Schlauchsystem am Boden des Sammelbehälters endet. Das Medium wird dabei auf der Höhe des Behälterhalses eingepumpt und wird dabei meist mehrere Zentimeter tiefer am Behälterboden eingeleitet. Wie beim Ansaugen des Mediums sind beim Sammeln mehrere Materialien wie Polypropylen, Polysulfon, Silikon und Glas miteinander verbunden. Auch an diesen unterschiedlichen Materialübergängen sammeln sich kleine Luftblasen, die bei geringen Perfusionsraten des Mediums immer größer werden. Das wesentliche Problem besteht darin, daß sich diese Luftblasen immer am höchsten Punkt des Verschlusses sammeln, somit nicht auf den Boden des Gefäßes gelangen und dort das Schlauchsystem nicht verlassen können. Durch diese Gasblasenbildung baut sich ein immer größer werdenden Druck auf, da sich die nachgepumpte Flüssigkeit an diesen Luftblasen vorbeidrücken muß.

Werden z.B. in einer Gradientenkammer zwei parallel laufende Schlauchverbindungen benötigt, so entstehen trotz gleicher Förderraten des Medium aufgrund der Gasblasenbildung unterschiedliche Druckbedingungen in der Kammer, die sich drastisch auf das im Innern befindliche Gewebe auswirken. Wenn in einer Gradientenkammer im luminalen und baselen Kompartiment unterschiedliche Drücke auftreten, führt dies zum Platzen des Gewebes, welches seine Barrierefunktion jetzt nicht mehr ausüben kann.

Vielfach ist es auch erforderlich, flüssige Kulturmedien mit Sauerstoff oder anderen Gasen oder Gasgemischen zu versorgen, was nach dem derzeitigen Stand der Technik so erfolgt, daß das betreffende Gas bzw. Gasgemisch über eine Schlauchleitung in die das Kulturmedium enthaltende Vorratsflasche eingeleitet wird. Dies hat vielfach zur Folge, daß sich Gase in Form von Bläschen im Kulturmedium befindet. Wird ein solches, mit Gas angereichertes Kulturmedium über ein Schlauchsystem dem Kulturbehälter bzw. -container zugeführt, so perlen im Verlauf des Mediumtransportes Gasblasen aus, die sich an beliebigen Stellen des Versorgungssystems sammeln können und dort in das Kulturmedium verdrängen und damit zumindest den gleichmäßigen Fluß des Kulturmediums stören. Derartige Gasblasen lassen sich dann auch nicht ohne weiteres entfernen. Entstehen derartige Gasblasen innerhalb des Kulturbehälters oder gar innerhalb des dortigen, zu kultivierenden Gewebes, so führt dies zu Störungen in der Versorgung des Gewebes oder aber zu dessen Zerstörung.

Viele Gewebe in unserem Organismus üben ihre Funktion an Grenzschichten aus, wobei sie auf der einen Seite einem anderen Milieu als auf der unteren Seite ausgesetzt sind. Dieses natürliche Vorkommen von Geweben läßt sich in Gradientenkulturkammern simulieren, wobei oberhalb und unterhalb des Gewebes ganz unterschiedliche Kulturmedien vorbeigepumpt werden. Denkbar ist, daß das Gewebe nicht nur Flüssigkeiten, sondern auch einer gasförmigen Umgebung auf der einen Seite ausgesetzt ist. Das Gewebe befindet sich dabei in einer Gradientenkammer. Dabei kann es direkt zwischen zwei Halbkammern eingespannt oder auf einem speziellen Träger gehalten werden. Zur Versorgung des Gewebes wird über ein Schlauch- oder Kanalsystem Kulturmedium in den Gradientencontainer eingeleitet.

Nachteilig ist hierbei, daß eine mehr oder weniger stark pulsierende, d.h. insbesondere hinsichtlich Menge und Druck schwankende Flüssigkeitswelle das Gewebe in der Kammer des Kulturcontainers bzw. -behälters erreicht. Besonders nachteilig ist dies in Gradientenkammern von Perfusionskulturen, wenn hierdurch in der oberen und unteren Teilkammer (oberes und unteres Kompartiment) unterschiedliche Drücke entstehen. Da ausschließlich das Gewebe die Trennung zwischen oberem und unterem Kompartiment bewirkt, kommt es bei unterschiedlichem Druck in der Kammer zuerst zu einer Ausstülpung des Gewebes zu der Seite mit niedrigem Druck. Wird der Druck auf der einen Seite größer und ist dieser Druckunterschied zu stark, dann reißt das Gewebe und beide Kompartimente vermischen sich miteinander. Damit ist die Wirkung der Gradientenkammer aufgehoben.

Unterschiedliche Drucke in der Gradientenkammer werden nicht nur durch das Einleiten des Kulturmediums erzeugt, sondern entstehen vor allem auch durch auch durch Luftblasen, die durch nicht vollständig gasequilibrierte Medien entstehen. An einer beliebigen Stelle im Schlauchsystem oder in der Kammer entsteht ein Gasbläschen. Durch Vorbeiströmen des Kulturmediums lagern sich immer mehr Bläschen an, wodurch die Primärblase immer größer wird. Dadurch wird der Strömungskanal für das Kulturmedium immer mehr eingeschränkt, und verschließt sich mit der Zeit. Das Kulturmedium wird aber kontinuierlich weitergefördert, muß sich an der Luftblase vorbeiquetschen. Dies geschieht bei langsamen Pumpraten nicht kontinuierlich, sondern in Wellen, da die verstopfende Blase eine gewisse Elastizität aufweist. Experimente zeigen, daß durch die Luftblasenbildung Druck auf und abgebaut wird.

Geschieht dies in einer Gradientenkammer nur auf einer Seite und auf der anderen Seite nicht, dann kommt es zu Druckunterschieden zwischen dem oberen und unteren Kammerkompartiment. Dadurch wiederum wird das die Kammer trennende Gewebe mal in die eine und dann in die andere Richtung gedrückt. da lebendes Gewebe solchen Druckunterschieden nicht beliebig standhalten kann, wird es nach einer gewissen Zeit zerreißen. Folge davon ist, daß sich oberes und unteres Kompartiment in der Gradientenkammer vermischen und damit die gewünschte Wirkung aufgehoben ist.

Nachteilig ist bei bekannten Systemen insbesondere auch, daß insbesondere bedingt durch die Gasblasenbildung in den Leitungen zum Zuführen und Abführen des Kulturmediums speziell bei niedrigen Flußraten für dieses Kulturmedium Druckschwankungen auftreten, die dann direkt an das in der Kammer des Kulturbehälters befindliche Gewebe übertragen werden, und zwar durch das in dieser Kammer befindliche flüssige Kulturmedium, welches wie in hydraulischer Stempel auf die Zellen bzw. das Gewebe einwirkt. Bei derartigen Druckschwankungen kann es somit zumindest zu Beschädigungen an den Geweben kommen.

Mit der Erfindung wird eine optimale Versorgung der in dem jeweiligen Kulturcontainer befindlichen Zellen und Gewebe mit dem jeweiligen Medium erreicht und somit die Voraussetzung für die Ausbildung gewebetypischer Differenzierungsleistungen geschaffen. Weiterhin wird verhindert, daß durch Gasblasenbildung Oberflächen oder Teile des Gewebes oder des Innenraumes des Containers nicht gleichmäßig vom Medium erreicht und durchströmt werden. Erzielt wird diese dadurch, daß der das Gewebe umgebende Raum der Kulturkammer (auch künstlicher interstitieller Raum) mit dem das durchströmbare Kapillarnetz (auch artifizielle interstitielle Matrix) bildenden Material ausgefüllt ist, über welches eine gleichmäßige Verteilung des jeweiligen Kulturmediums auf das gesamte, zu kultivierende Gewebe erfolgt und die auch verhindert, daß Druckschwankungen bei der Zuführung des Kulturmediums sich auf das Gewebe auswirken und dieses zerstören könnten.

Durch die erfindungsgemäße Ausbildung wird weiterhin vermieden, daß Druckschwankungen beispielsweise in der Versorgungsleitung sich unmittelbar auf die in der jeweiligen Kammer angeordneten Zellen oder Gewebe auswirken können.

Als poröse oder durchströmbare Material oder Kapillarnetz wird ein biokompatiebles Material, d.h. ein Material verwendet, durch welches das Kultivieren und Differenzieren der Zellen und Gewebe in der gewünschten Weise nicht beeinträchtigt wird. Durch die kapillare Wirkung des Kapillarnetzes werden insbesondere auch nicht mit dem Kulturmedium versorgte Bereich sowie Blasenbildung vermieden. Für das Kapillarnetz eignen sich beispielsweise Vlies-Materialien aus Cellulose, Glasfasern oder schwammähnliche Materialien aus Kunststoff. Speziell durch die Verwendung von flexiblen und/oder schwammartigen Materialien besteht auch die Möglichkeit, den Innenraum der Kammer vollständig oder nahezu vollständig mit dem das Kapillarnetz bildende Material auzufüllen und/oder dieses Material in direktem Kontakt mit dem zu kultivierenden Gewebe anzubringen, wobei sich das Kapillarnetz dann der jeweiligen Form des Gewebes anpassen kann.

Beispielsweise durch geeignete Beschichtungen des das Kapillarnetz bildenden Materials bzw. der Fasern dieses Materials mit Silikon oder Silan kann verhindert werden, das zu kultivierende Zellen in den Raum des Kapillarnetzes hineinwandern.

Zusätzlich kann der Kapillarraum auch genutzt werden, um über einen Sezidierungsmechanismus spezielle, auf die zu kultivierende Zellen bzw. auf das zu kultivierende Gewebe einwirkende Wirkstoffe einzubringen, und zwar beispielsweise dadurch, daß diese Wirkstoffe mit Trenn- oder Hilfsstoffen überschichtet sind, die sich im Kulturmedium nach einer vorbestimmten Zeitdauer abbauen und den jeweiligen Wirkstoff freigeben. Hierbei ist es auch möglich, diese Wirkstoffe in mehreren Schichten übereinander vorzusehen, so daß zeitlich aufeinander folgend unterschiedliche Wirkstoffe und/oder unterschiedliche Wirkstoffkonzentrationen freigegeben werden. Grundsätzlich besteht auch die Möglichkeit, die in den Kapillarraum eingebrachten Wirkstoffe in einer die Freisetzung dieser Wirkstoffe verzögernden, abbaubaren Masse einzubetten. Als Wirkstoffe können beispielsweise Wachstumsfaktoren, Morphogene und Hormone verwendet werden, um einen möglichst hohen zellulären Differenzierungsgrad im kultivierten Gewebe zu erhalten.

Die Einbringung dieser Wirkstoffe in das Kapillarnetz hat auch den Vorteil, daß viele derartige Substanzen leicht an Fremdmaterialien, wie z.B. an den Schläuchen der Zuführung für das Kulturmedium absorbiert werden und es deshalb besonders vorteilhaft ist, diese Wirkstoffe möglichst dicht an dem jeweils zu kultivierenden Gewebe freizusetzen.

Das kapillare Netz kann mit den Wirkstoffen getränkt werden. Durch die Dicke der Überschichtung läßt sich die Verzögerungsdauer für das Freisetzen des jeweiligen Wirkstoffen optimal einstellen.

Das verwendete Kapillarnetz hat weiterhin den Vorteil, daß eine Kulturkammer, beispielsweise eine Grandientenkammer, bei der ein derartiges Kapillarnetz den Innenraum der Kammer, beispielsweise die Teilräume beidseitig des zu kutlivierenden Gewebes ausfüllt, problemlos geöffnet werden kann, ohne daß das Kulturmedium ausfließt. Vielmehr wird dieses in dem das Kapillarnetz bildenden Material zurückgehalten. Bei Kammern ohne ein derartiges Kapillarnetz besteht nicht nur die Gefahr, daß das Kulturmedium ausfließt, sondern auch die Gefahr, daß Kulturmedium beim erneuten Verschließen der Kammer teilweise aus dem Öffnungsspalt in die Kammer zurückgelangt und dann zu einer Kontamination des Gewebes führt.

Das Kapilllarnetz bzw. der von diesen Netz gebildete künstliche interstitielle Raum in einem Kulturcontainer für wachsendes Gewebe läßt sich somit auf wenigstens vier verschiedene Arten herstellen:

1. Anwendungen von Vliesen und Schaumstoffen, konventionell oder bioabbaubar wie z.B. Poly-lactid/glycol-Säure
2. Verwendung eines isolierten, natürlichen und chemisch aufgearbeiteten Materials aus extrazellulären Matrixproteinen
3. Biotechnologisch hergestellte (rekombinante) Proteinen von extrazellulären Matrixproteinen mit smartem Struktur und Funktionscharakter
4. Chemisch definierte Komponenten mit smarten Eigenschaften.

Mit diesen vier ganz unterschiedlichen Konzepten lassen sich interstitielle Räume in Gewebecontainern bauen, die Informationen von biologischen Sequenzen für Stoffwechselaktivitäten enthalten, zudem Informationen für Zellvermehrung und Zellverankerung definieren. Damit wird es möglich Grenzen zwischen dem wachsenden Gewebe und dem interstitiellen Raum festzulegen, zu verschieben und beliebige Oberflächenkonturen des wachsenden Gewebes zu erzeugen.

1. Anwendung von Schaumstoffen:

Für die Simulierung eines artifiziellen und klar strukturierten Raumes, der ein wachsendes Gewebe umgibt, können im einfachsten Fall Vliese aus Fasermaterial wie z.B. Cellulose den Konturen der Kulturkammer entsprechend zugeschnitten werden. Solche Fasermaterialien finden sich z.B. bei technischen Filterpapieren.

Eine andere Möglichkeit sind bioverträgliche chemische Polymere mit gleichmässiger Faser- bzw. Porenverteilung, Vernetzungsgrad und guter Elastizität. Diese Eigenschaft ist besonders wichtig bei allen den geschilderten Matrices. Einerseits muß sich die Matrix dem wachsenden Gewebe gut anlegen und andererseits kann durch die gleichmässige Porenverteilung eine optimale Verteilung des vorbeiströmenden Mediums erreicht werden.

2. Verwendung eines isolierten natürlichen und chemisch aufgearbeiteten Materials aus extrazellulären Matrixproteinen:

Zur Konstruktion eines artifiziellen Interstitiums können natürliche und chemisch aufgearbeitete Matrixproteine verwendet werden. Dazu gehören z.B. Kollagenpräparationen von beliebigen Spezies z.B. aus der Haut, Knochen, Knorpel, Horn, Huf und aus Gewebepräparationen wie Schwimmblasen von Fischen, Hahnenkämmen und Luftröhren. Spezielle Kollagene können zudem aus individuellen Organpräparationen hergestellt werden. Dabei gibt es die Möglichkeit neben den unterschiedlichen Kollagenformen andere für die Gewebeentwicklung wesentlichen Matrixproteine wie Proteoglykane, Fibronektine, Vitronektine und Laminine individuell in der Präparation zu belassen, zu entfernen oder zusätzliche Moleküle hinzuzufügen.

Eingesetzt werden in den Kulturcontainer oder -behälter dann Kollagenpräparate, die individuelle Vernetzungsgrade besitzen und für das Zellwachstum hemmende oder fördernde Eigenschaften haben. Dieser artifizielle Raum umhüllt das wachsende Gewebe, sorgt für eine gleichmäßige Flüssigkeitszufuhr und definiert wie unter natürlichen Bedingungen die Grenze des wachsenden Gewebes. Dadurch kann die Expansion des Gewebes, die Oberflächenstruktur und ein nicht gewolltes somit unkontrollierbares Auswachsen der Zellen verhindert werden.

3. Biotechnologisch hergestellte (rekombinante) Proteine von extrazellulären Matrixbestandteilen mit Struktur und Funktionscharakter:

Artifzielle interstitielle Matrices können aus biotechnologisch hergestellten, rekombinanten Matrixproteinen bestehen. Analog zur Aminosäureesquenz von bekannten Sturkturproteinen lassen sich beliebige fibrilläre Proteine mit Kollagen bzw. nicht nicht-kollagen artigen Eigenschaften von extrazellulären Matrixproteinen herstellen. Diese Bestandteile können dann miteinander polymersiert werden, so daß dreidimensional Netze mit unterschiedlichen Maschenweiten entstehen. Solche Konstrukte lassen sich im Gegensatz zu natürlich vorkommenden Kollagenen noch im Hinblick auf funktionelle Eigenschaften optimieren.

Da rekombinante Kollagene und andere Matrixproteine Stück für Stück aus einzelnen Aminosäuren aufgebaut werden, können während der Synthese neben der natürlichen Sequenz noch zusätzliche Informationsmotive eingebaut werden. Diese Motive sind besonders wichtig für die Zelladhäsion und nehmen Zellverankerungsproteine wie Integrine, Cadhrine, Immunglobuline und Selektive auf. Solche Peptidsequenzen bestehen z.B. aus Arg-Gly-Asp (RGD Sequenz), welche bei Vitronektin, Fibronektin und Kollagenen gefunden wird. Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR Sequenz) wird in β1 Laminin gefunden. Arg-Glu-Asp-Val (REDV Sequenz) ist Bestandteil von Fibronektin.

Mit solchen oder ähnlichen Motiven lassen sich Informationen für Zellanhaftung, Zellwandungen, Zellteilung oder Differenzierung individuell einarbeiten und dienen damit dem gezielten Fernsteuern von Zellen. Wird eine solche smarte Matrix auf ein wachsendes Gewebe aufgelegt, so können damit die einzelnen Zelleigenschaften an der Grenzfläche des Wachstums beeinflußt werden. Damit lassen sich Bereiche definieren, an denen Zellen in die Matrix einwachsen können oder wo das Einwachsen der Zellen speziell verhindert werden soll. Daraus resultieren natürlich Abschlüsse bzw. Oberflächen von künstlich hergestellten Geweben, wie sie z.B. bei der Implantation von Knorpel notwendig sind. Es können nicht nur die Verteilung von Zellen, sondern auch spezielle Zelleigenschaften und Differenzierungsäußerungen über diese interstitielle Matrix vermittelt und damit gesteuert werden.

Zudem können die Informationsmotive in natürlichen Konzentrationen eingearbeitet werden oder in beliebigen Abwandlungen. So können z.B. Sequenzabschnitte für jeweils zwei Informationen alternierend, im Block oder randomisiert in die Sequenz eingearbeitet werden. Vorstellbar ist, daß die Information für Zellverankerung A von Zelltyp A mehrmals in einem grössern Block verweigert wird, während die Information B für Zelltyp B in einem darauffolgenden Block erscheint. Damit kann z.B. erreicht werden, daß ein funtkioneller Zelltyp im wachsenden Gewebe bleibt, während ein anderer Zelltyp dies Areal verläßt.

Ein artifizielles Interstitium, welches ein wachsendes Gewebe umhüllt, muß für sein Größerwerden Raum schaffen. Durch die Zuführung von speziellen Enzymen (Proteasen, Metalloproteinasen) oder durch eine eigene Gewebeproduktion können Teil jedes Fasernetzes ganz gezielt aufgelockert werden. Durch speziell eingebaute Sequenzen in den Peptidketten können die Proteasen an ganz gezielten Orten wirksam werden und so für eine Auflockerung des Netzwerkes sorgen. Bedingt durch diese Proteaseauflösung können wiederum neue Informationssequenzen für das wachsende Gewebe freigesetzt und abgelesen werden, die vor der Proteasewirkung für die Zellen nicht erreichbar waren. Damit kann eine wachstums/differenzierungs -fördernde bzw. wachstums/differenzierungs -hemmende Wirkung erreicht werden.

4. Chemisch definierte Komponenten mit modifizierten smarten Eigenschaften

Eine weitere Möglichkeit einen interstitiellen Raum zu konstruieren sind organische Polymere, die mit entsprechenden funktionellen Gruppen für die Zellinformation ausgestattet werden. So können z.B. RGD Motive u.a. auf
Polyethylentherephthalat (PET)
Polytetrafluonethylen (PTFE)
Polyvinylalkohol(PVA)
Polyacrylamid und
Polyurethan
aufgebracht werden. Oberflächenmodifikationen auf der Basis von Aminosäuresequenzen sind außerdem machbar z.B. auf hydrophilen Polymeren bestehend u.a. aus
Polyvinylpyrollidon (PVP)
Polyethylenglykol (PEG)
Polyethylenoxid (PEO) und
Polyhydroxyethylenmetacrylat (HEMA).

Zudem können zusätzliche Motive für Zellfunktionen eingebaut werden, wie sie schon unter 3. beschrieben wurden. Bei dieser Ausbildung der interstitiellen Matrix bzw. des Kapillarnetzes werden also Substanzen, die das Wachsen, Verhalten usw. von Zellen beeinflussen in das die matrixbildende Kettenmaterial eingebaut. Als „Grundmaterial" für dieses Kettenmaterial eignen sich biotechnologisch herstellbare fibriläre Proteine. Die Konzentration der Motive im Kettenmaterial oder in der Matrix, die Art und Sequenz dieser Motive usw. können dem jeweiligen Ergebnis entsprechend gewählt werden. Durch diese Ausbildung der Matrix ist es beispielsweise insbesondere auch möglich, Grenzschichten zu bilden, die ein Auswandern von Zellen auf einem Gewebe verhindern und/oder die eine gewünschte Differenzierung der Zellen und/oder Formgebung eines kultivierten Gewebes ermöglichen. Durch entsprechende Wahl des Kettenmaterials für die Matrix bzw. der in diesem Kettenmaterial enthaltenen Motive ist es beispielsweise auch möglich, Implantate mit definierten Oberflächen und definierten Eigenschaften dieser Oberflächen biotechnologisch herzustellen.

Bei dieser Ausführung dienen die auf chemischen Wege definierten bzw. gewonnenen organischen Polymere beispielsweise als Träger, auf die die biotechnologisch hergestellten rekombinanten Matrixproteine mit den eingebauten Motiven aufgebracht sind.

Da es mit den vorgenannten artifiziellen interstitiellen Matrices möglich ist, Gewebe auch über längere Zeit im natürlichen Zustand zu halten und insbesondere auch ein Auswandern von Zellen zu verhindern, eröffnet die Erfindung auch die Möglichkeit von pharmakologischen und toxikologischen Anwendungen.

Nicht nur bei der Implantation von generierten Geweben in den menschlichen Körper, sondern auch beim Testen von Pharmaka und bei Wirkstoffuntersuchungen von Toxinen zeigt das neu konzipierte System bisher unerreichte Möglichkeiten. Da in den vorgestellten Containern nicht nur Zellen, sondern ganze funktionelle Gewebe generiert werden können, wird experimientell und biotechnologisch eine klaffende Lücke zwischen der reinen Zellkultur und dem Organismus geschlossen. Mit der vorgestellten Technik können isolierte Gewebe oder Teile von Organen oder daraus entstehende Konstrukte in bisher nicht gekannter Qualität und in beliebig langen Zeiträumen erhalten werden. Da bei den Konstrukten die natürlich vorkommenden unterschiedlichen Zelltypen miteinander kultiviert werden, können Aussagen zur Zellinteraktion nach Pharmakapplikation oder Intoxikation getroffen werden, die allein an reinen Zellkulturen oder am Organismus nicht gemacht werden können.

Z.B. können embryonale, halb gereifte und terminal differenzierte Gewebe über beliebig lange Zeiträume kontinuierlich oder diskontinuierlich mit Pharmaka oder Toxinen in den neu konstruierten Bontainern behandelt werden. Dies eröffnet neue Perspektiven bei Langzeitversuchen, in den nicht bekannt ist, wie, in welchem Ausmaß und an welchen Zellen applizierte Moleküle verstoffwechselt, gespeichert und wieder abgegeben werden. Besondere Bedeutung hat die Technik, weil Gewebe unter naturalistischen Bedingungen gehalten werden können.

Bindegewebe wird in den neu konzipierten Containern z.B. mit einem Medium versorgt. Epithelien können wie unter natürlichen Bedingungen mit unterschiedlichen Medien auf der luminalen und basalen Seite wie in einem natürlichen Gradienten kultiviert werden. Dabei kann das Gewebe ganz unterschiedliche Flüssigkeiten oder gasförmigen Medien ausgesetzt werden, wie dies für die einzelnen Gewebe in einem Organismus typisch sind.

Besondere Vorteile der Methode bestehen darin, daß das für den Test benutzte Pharmakon oder Toxin für beliebige Zeit von derjenigen Seite aus appliziert werden kann, von der auch im Organismus das Gewebe entweder von luminal oder von basal versorgt werden würde. Das Gewebe wird dabei von einem kontinuierlichen Mediumstrom versorgt. Durch geeignete Messung im Effluat kann festgestellt werden, in welchem Maße ein Pharmakon oder Toxin in Gewebe aufgenommen, hindurchtransportiert, verstoffwechselt, gespeichert und wieder ausgeschieden wird.

Das erfindungsgemäße System ermöglicht es weiterhin Wechselwirkungen zwischen Geweben zu untersuchen, und hierbei insbesondere auch zu untersuchen, welche Bedeutung solche Wechselwirkungen von unterschiedlichen Geweben bei der Entstehung von Krankheiten haben. Dieses Wissen ist für die Therapie von Krankheiten und für die Entwicklung neuer Pharmaka von entscheidender Bedeutung.

Die Vorteile bestehen darin, daß auf der Basisplatte eines Kulturcontainers ein Gewebetyp kultiviert werden kann, während in dem artifizellen Interstitium ein zweites Gewebe gehalten wird. Durch die Interaktion besteht die Möglichkeit eines der Gewebe zu schädigen. Gleichzeitig kann damit untersucht werden, wie die Schädigung entsteht und welche Möglichkeiten es gibt, mit Pharmaka die Entzündung oder irreversible Schädigung zu unterdrücken. Beispiele für solche Untersuchungen wäre z.B. die Entstehung von chronischen bzw. akuten Krankheiten wie Rheuma, Osteoporose, Morbus, Parkinson und Multipler Sklerose.

Bei derartigen Untersuchungen werden also beispielsweise das kranke Gewebe in dem Kapillarnetz bzw. in der artifiziellen interfiziellen Matrix angeordnet, und zwar ohne Berührung mit dem zu kultivierenden Gewebe. Auf diese Weise können dann Einflüsse beispielsweise des kranken Gewebes auf das kultivierte Gewebe untersucht werden, die ohne einen direkten Zell-Zell-Kontakt auftreten. Selbstverständlich ist es dann auch möglich durch direkten Kontakt des kranken Gewebes mit dem kultivierten Gewebe Einflüsse zu untersuchen, die durch Zell-Zell-Kontakt auftreten. Auch bei diesen „interaktiven Gewebesystemen" ist es für die Untersuchungen wesentlich, daß ein Auswandern der Zellen bei der Probe des kranken oder geschädigten Gewebes und bei dem kultivierten Gewebe durch die verwendete Matrix bzw. durch das verwendete Kapillarnetz verhindert wird.

In weiterer Ausgestalltung sieht die Erfindung einen verbesserten Anschluß zwischen einem Behälter oder einer Flasche zur Versorgung des Systems mit dem Kulturmedium bzw. zur Aufnahme von rückgeführtem Kulturmedium vor. Hierfür wird der Schlauch, über den das jeweilige Kulturmedium dem Behälter bzw. der Flasche entnommen oder dieser zugeführt wird, direkt durch den Behälterverschluß hindurchgeführt, und zwar unter Verwendung einer Abdichtung, die den Spalt zwischen Verschluß und Schlauchaußenfläche dicht abschließt. Da der Versorgungsschlauch direkt in das Innere des jeweiligen Behälters reicht, also auf die üblichen Schraub- oder Verschlußkappen verzichtet ist, sind auch Anschlüsse und Übergänge im Zuführ- und Abführkanal für das Kulturmedium, die zu Leckagen führen könnten ebenso vermieden, wie sich ändernde Querschnitte dieses Kanales, die (Querschnitte) zu Störungen im Fluß und/oder zu unerwünschten Anlagerungen von Luft- und Gasblasen führen könnten. Auch ständig wechselnde Materialien mit unterschiedlichen Adsorptionseigenschaften sind verhindert.

An der Anschlußkappe kann dann zusätzlich noch ein Port vorgesehen sein, der beispielsweise zur Entnahme von Kulturmedium aus der Flasche, auch zur Entnahme von Proben usw. verwendet werden kann. Weiterhin ist an der Verschlußkappe beispielsweise ein Füllstandsensor vorgesehen und/oder ein als Belüftung bzw. Entlüftung dienender Durchlaß mit einem Filter bzw. Sterilfilter.

In weiterer Ausgestalltung sieht die Erfindung eine Begasungs- oder Dosiereinrichtung vor, mit der Gase oder Gasgemische sehr fein verteilt durch Diffusion in das Kulturmedium eingebracht werden können, und zwar insbesondere auch in der Weise, daß diese Gase oder Gasgemische vollständig im Kulturmedium gelöst sind und Überschüsse wirksam vermieden sind, welche zu Gasblasen führen könnten, die das Zu- und Abführen des Kulturmediums sowie die Versorgung der Zellen und Gewebe in der Kulturkammer mit dem Kulturmedium stören, embolische Effekte erzeugen und/oder zu Druckschwankungen im System führen könnten.

Die Begasungseinrichtung besteht im wesentlichen aus einem Schlauch aus einem gaspermeablen Material, der von dem Kulturmedium durchströmt wird und in einem Raum untergebracht ist, der mit einer Atmosphäre ausgefüllt ist, die das dem Kulturmedium zuzuführende Gas oder Gasgemisch enthält bzw. aus diesem Gas oder Gasgemisch besteht. Der Innendurchmesser, die Wandstärke und die Länge des Schlauches bestimmt die Diffusionsrate. Als Material für den Schlauch eignet sich beispielsweise Silikon. Der Schlauch ist beispielsweise in einer geschlossenen Kammer aufgenommen, die einen Gaseintritt und einen Gasauslaß aufweist. Der Schlauch bildet in dieser Kammer z.B. eine Spirale, an der das Gas bzw. Gasgemisch vorbeiströmt. Wird Kulturmedium durch den Schlauch langsam hindurchgepumpt, so kommt es durch Diffusion durch die Wandung des Schlauches zur Anreicherung des Gases oder Gasgemisches im Kulturmedium. Hierdurch können unter absolut sterilen Bedingungen und unter hypo-Iso- oder hyperbaren Bedingungen beliebige Gase im Kulturmedium angereichtert werden. Umgekehrt ist es aber auch möglich, bestimmte Gase aus dem Kulturmedium zu entfernen. Simulieren lassen sich hiermit u.a. auch sehr sauerstoffarme und sauerstoffreiche Medien.

Mit der Dosierungseinrichtung ist aber nicht nur ein Zuführen oder Entfernen von Gasen möglich, sondern auch anderer Stoffe, die in einem gas- oder dampfförmigen Zustand vorliegen. Weiterhin ist es möglich, die Kammer mit einem flüssigen Medium zu durchströmen, welches die dem Kulturmedium zuzusetzenden Stoffe in gelöster Form enthält, wie z.B. ein Narkotikum, welches dem Kulturmedium durch Division durch das Schlauchmaterial hindurch zugeführt wird.

Die Dosiereinrichtung kann weiterhin auch so ausgebildet sein, daß der von dem Kulturmedium durchströmte Schlauch in das Lumen eines weiteren äußeren Schlauches eingeführt ist, der dann beispielsweise aus einem inperbeablen Material besteht. Der zwischen den beiden Schläuchen gebildete Raum wird dann mit dem Gas oder Gasgemisch oder aber mit dem flüssigen Medium durchströmt, und zwar für das Zuführen oder Entfernen von Stoffen an das Kulturmedium bzw. aus dem Kulturmedium.

Die Erfindung sieht weiterhin in einer vorteilhaften Ausbildung eine Ausgleichseinrichtung vor, in der nach dem Dosieren beispielsweise mit einem Gas- oder Gasgemisch im Kulturmedium vorhandene, zur Gasblasenbildung neigende Überschüsse an Gas entfernt werden, bevor das Kulturmedium der jeweiligen Kulturkammer zugeführt wird. Die Ausgleicheinrichtung besteht im wesentlichen aus einem Gasausgleichsbehälter. In diesem wird das mit Gas beladene Kulturmedium auf der basalen Seite zugeführt, und zwar beispielsweise über eine Pumpe. Im Inneren des Behälters steigt das zugeführte Medium auf und kann sich in diesem Behälter, der bis zu einem vorgegebenen Niveau mit dem flüssigen Kulturmedium gefüllt und darüber einen Gasraum bildet, äquilibrieren. Gasblasen des überschüssigen, nicht gelösten Gases treten aus dem Medium aus. Das gasblasenfreie Medium wird an einem beispielsweise trichterartigen Auslaß gesammelt und über eine Schlauchleitung beispielsweise dem Kulturbehälter oder Container zugeführt.

Mit Hilfe einer geeigneten Ansaugung von Kulturmedium, eines Gasanreicherungsmodul, eines Gasausgleichsbehälter sowie eines artifiziellen Kapillarnetzes, welches dem kutlivierten Gewebe vorgeschaltet ist, lassen sich neue Kammersysteme vom Mikromaßstab bis zum technischer Maßstab z.B. für die Generierung von artifitiellem Gewebe für das Tissue engineering, für die Biomaterial- und die Pharmaforschung konzipieren. Gezüchtet werden damit Zellen und Gewebe, die über einen typischen körpereigenen Differenzierungsgrad verfügen und über beliebig lange Zeiträume unter Kulturbedingungen gehalten werden sollen.

Dabei werden Zellen oder Gewebe auf einem geeigneten Träger in ein neu konzipiertes Kammersystem eingebracht. Ein Typ dieser Kammer besteht aus einem Basisteil oder -platte mit Deckel. Dieser Typ von Perfusionskammer ist so aufgebaut, daß auf die Basisplatte ein Zellträger oder ein Gewebestück aufgelegt wird. Dann wird ein Deckelteil aufgelegt, welches innen mit einem artifiziellen Kapillarnetz ausgefüllt ist. Zwischen Deckelteil und Basisplatte ist eine Dichtung ausgebildet. Im Deckelteil oder in der Basisplatte ist mindestens ein Einlaß für das Kulturmedium vorgesehen. Auf der gegenüberliegenden Seite ist mindestens ein Auslaß für das Medium vorhanden. Wird das Deckelteil auf die Basisplatte gesetzt, so wird die Kammer durch Anpressen mit Hilfe eines Verschlusses abgedichtet. Im Inneren der Kammer legt sich das artifizielle Kapillarnetz dicht an das vorhandene Gewebe.

Eine Gradientenkammer läßt sich aus zwei gleichartigen Deckelteilen und einer modifizierten Basisplatte herstellen. Dabei kann die Kammer luminal und basal mit gleichen oder unterschiedlichen Medien durchströmt werden. Für den Zusammenbau wird in die Basisplatte ein Zell- oder Gewebeträger eingelegt. Eine folienartige oder schnurartige Dichtung ist im Bereich des eingelegten Gewebes mit einer Öffnung versehen und dient zur Abdichtung zwischen oberem und unterem Kammerkompartiment. Oberhalb und unterhalb der Bödenplatte wird dann jeweils ein Deckelteil montiert, welches mit einem Verschlußmechanismus befestigt wird. Das obere und unter eDeckelteil können jetzt jeweils getrennt mit gleichen oder unterschieldichen flüssigen oder gasförmigen Medien durchströmt werden. Damit lassen sich Gradienten an Geweben erzeugen, wie sie unter natürlichen Bedingungen in unserem Organismus vorgefunden werden. Außerdem können Substanzen wie Hormone oder Pharmaka unter realistischen Bedingungen für das Gewebe appliziert werden.

Der Vorteil dieser neuartigen Ausbildung besteht auch darin, daß für die einzelnen Kulturkammern nur noch minimale Höhen erforderlich sind und hierdurch das Totvolumen des gesamten Systems reduziert und der Austausch von Medien optimiert wird.

Die Erfindung wird nachstehend näher im Detail anhand der Figuren an Ausführungsbeispielen erläutert. Es zeigen:
1 in vereinfachter Darstellung ein System zum Kultivieren und/oder Differenzieren von Zellen oder Geweben gemäß der Erfindung;
2 in vereinfachter Schnitt- bzw. Explosionsdarstellung einen Kultur-Behälter zur Verwendung bei dem System der 1, wobei der untere Deckel im abgenommenen Zustand dargestellt ist;
3 in vereinfachter Darstellung und im Schnitt eine Dosiereinrichtung zur Verwendung bei dem System der 1;
4 in vereinfachter Darstellung und im Teilschnitt eine weitere mögliche Ausführungsform einer Dosiereinrichtung zur Verwendung bei dem System der 1;
5 in vereinfachter Prinzipdarstellung und im Schnitt eine Ausgleichskammer zur Verwendung bei dem System der 1;
6 in vereinfachter Teildarstellung einen Anschluß-Deckel zum Anschließen des Systems an einen Behälter bzw. an eine Flasche;
7 in einer Darstellung ähnlich 2 eine weitere Ausführung des Kulturbehälters;
8 in einer Darstellung ähnlich 2 eine weitere mögliche Ausführungsform eines Kulturbehälters bzw.- containers gemäß der Erfindung.
Das in der 1 wiedergegebene und dort allgemein mit 1 bezeichnete System umfaßt im wesentlichen folgende Elemente:

• Vorratsbehälter bzw. -flasche 2 für ein flüssiges Kulturmedium;
• Dosiereinrichtung 3 zum Zuführen und/oder Abführen insbesondere von gasförmigen Zusätzen an bzw. aus dem Kulturmedium;
• Pumpe 4, beispielsweise Schlauchpumpe,
• Ausgleichseinrichtung oder Ausgleichskammer 5, insbesondere zum Ausscheiden von Gas- und/oder Luftblasen und/oder überschüssigem Gas oder Gasgemisch aus dem Kulturmedium;
• Kulturbehälter 6, zur Aufnahme von Zellen und Geweben;
• Behälter 7 zum Sammeln von Kulturmedium.

Die vorgenannten Elemente sind in der vorstehend angegebenen Reihenfolge über Leitungen 8 miteinander verbunden, die von Längen eines Schlauches aus einem geeigneten Material, beispielsweise aus Längen eines Silikon-Schlauches gebildet sind. Dargestellt ist in der 1 noch eine weitere Ausgleichskammer 5', die Bestandteil einer zweiten Linie zum Zuführen und Abführen eines Kulturmediums ist, mit der die untere Teilkammer des Kulturbehälters 6 mit einem Kultur- oder Behandlungsmedium versorgt wird. Die Gasräume der beiden Ausgleichskammern 5 und 5' sind über eine Leitung 9 miteinander verbunden. Hierdurch wird erreicht, daß die Medien der oberen und unteren Teilkammer des Kulturbehälters 6 mit gleichem Druck zugeführt werden.
Der Kulturbehälter 6 ist in der 2 sehr schematisch dargestellt. Er besteht im wesentlichen aus einem oberen Deckel 10 und einem unteren Deckel 11, die jeweils einen geschlossenen Boden 10' bzw. 11' und eine geschlossene Umfangswand 10'' bzw. 11'' aufweisen. Bei der dargestellten Ausführungsform weisen die Deckel 10 und 11, die in Größe und Form gleich sind, jeweils einen quadratischen Boden 10' bzw. 11' auf. Mit 12 ist eine Basis- oder Grundplatte bezeichnet. Bei geschlossenem Kulturbehälter 6 liegen die Deckel 10 und 11 jeweils mit ihrer offenen Seite abgedichtet gegen die Oberseite bzw. Unterseite der Basisplatte 12 an, und zwar abgedichtet über nicht dargestellte Ringdichtungen. Der Zusammenhalt der Deckel 10 und 11 und der Basisplatte 12 wird beispielsweise durch eine nicht dargestellte Klammer bewirkt. Die Basisplatte 12 weist eine Öffnung 13 auf, in der ein Zellträger oder Gewebehalter 14 angeordnet ist. Um eine Verwechslung zwischen Oberseite und Unterseite der Basisplatte 12 zu vermeiden, sind Oberseite und Unterseite der Basisplatte unterschiedlich markiert und/oder farblich gestaltet. Bei der dargestellten Ausführungsform ist auf die Oberseite der Basisplatte eine Folie 15 aufgebracht.
Bei geschlossenem Kulturbehälter 6 bilden die Deckel 10 und 11, die mit dem Rand ihrer Öffnung abgedichtet gegen die Oberseite bzw. Unterseite der Basisplatte 12 anliegen jeweils eine Teilkammer, die nach außen hin geschlossen ist. Jeder Deckel 10 bzw. 11 ist mit zwei Anschlüssen 16 versehen, über die ein Zuführen und Abführen des Kulturmediums möglich ist. Der gesamte Innenraum jeder Teilkammer ist mit einem ein Kapillarnetz bildenden Material 17 ausgefüllt. Dieses Material reicht bei geschlossenem Behälter 6 bis unmittelbar an den Zell- oder Gewebeträger 14 bzw. bis an das auf diesem Träger vorgesehenen Gewebe oder die dortige Zellkultur. Das Material 17 ist der Gestalt, daß es eine feine, gleichmäßige Verteilung des Kulturmediums im Bereich des Zell- oder Gewebeträgers 14 bewirkt und insbesondere auch Druckschwankungen weitestgehend dämpft. Als Material 16 eigenen sich beispielsweise Fasermaterialien oder Fließe aus Zellulose, Glasfasern, aber auch schwammähnliche Materialien, z.B. aus Kunststoff.
Das Material 17 ist beispielsweise mit Wirkstoffen versehen bzw. getränkt, die mit einer Schutzschicht überschichtet sind, und zwar derart, daß diese Schutzschicht erst nach einer vorgegebenen Zeitdauer von dem das jeweilige Material 17 durchströmenden Kulturmedium gelöst und dadurch die betreffenden Wirkstoffe freigesetzt werden. Diese Wirkstoffe sind beispielsweise Hormone, Morphogene usw.
Bei dem in der 1 wiedergegebenen System sind die oberen und unteren Teilkammern des Kulturbehälters 6 von unterschiedlichen Medien durchströmt. Hierfür ist die obere Teilkammer mit ihren Anschlüssen 16 über die Leitungen 8 an den Ausgang der Ausgleichskammer 5 und über eine Leitung 8 mit einem Behälter 7 zum Sammeln des Kulturmediums angeschlossen. In gleicher Weise ist auch die untere Kammer mit ihren Anschlüssen an die Ausgleichskammer 5' und an einen nicht dargestellten, den Behälter 7 entsprechenden Behälter angeschlossen. Das Kulturmedium durchströmt die Teilkammer jeweils von dem mit der Ausgleichskammer 5 bzw. 5' verbundenen Anschluß zu dem mit dem Behälter 7 verbundenen Anschluß 16.
Die 3 zeigt in vereinfachter Darstellung und im Schnitt eine Dosiereinrichtung 3. Diese besteht im wesentlichen aus einem geschlossenen Behälter 18, durch den ein Schlauch 19 aus einem permeablen Material, beispielsweise aus einem gaspermeablen Material mit einer vorgegebenen Länge hindurchgeführt ist. Der Schlauch 19, der beispielsweise ein Silikonschlauch ist, ist im Inneren des z.B. zylinderförmigen Behälters 18 wendelförmig angeordnet und mit seinen Anschlüssen 19' beidendig abgedichtet aus den Innenraum des Behälters 18 herausgeführt. Der Behälter 18 besitzt weiterhin zwei Anschlüsse 20 zum Zuführen bzw. Abführen eines Strömungsmediums, beispielsweise eines Gases. Der Schlauch 19 bildet den von dem Kulturmedium durchströmten Strömungsweg der Dosiereinrichtung 3. Mit diesem Strömungsweg ist die Dosiereinrichtung bei der dargestellten Ausführung einerseits an den Behälter 2 und andererseits über die Pumpe 4 an die Ausgleichskammer 5 bzw. 5' angeschlossen. Die Dosiereinrichtung 3 wird beispielsweise dazu verwendet, um den Kulturmedium in fein dosierter Form und mit einer exakt reproduzierbaren Dosierung ein Gas- oder Gasgemisch beizumischen, ohne daß hierbei im Kulturmedium Gas- oder Luftblasen entstehen. Das Gas oder Gasgemisch wird hierfür dem Innenraum des Behälters 18 über den einen Anschluß am Boden zugeführt und aus den Behälter am anderen Anschluß 20 abgeführt. Das im Innenraum des Behälters 18 vorhandene Gas oder Gasgemisch diffundiert dann durch die Wandung des Schlauches 19 in das diesen Schlauch langsam durchströmende Kulturmedium.
Die Dosiereinrichtung 3 kann auch dazu verwendet werden, andere, beispielsweise in einer Trägerflüssigkeit lösbarer und durch den Schlauch 19 difundierende Zusätze in das Kulturmedium einzubringen. In diesem Fall wird der betreffende Zusatz oder Wirkstoff in einem flüssigen oder gasförmigen Trägermaterial gelöst durch den Behälter 18 geführt.
Weiterhin kann die Dosiereinrichtung 3 auch dazu verwendet werden, bestimmte Stoffe aus dem Kulturmedium durch Diffusion zu entfernen. In diesem Fall wird dann beispielsweise der Innenraum des Behälters 18 mit einem Medium durchströmt, welches die außer dem Kulturmedium zu entfernenden Stoffe aufnimmt und abführt.
4 zeigt als eine weitere mögliche Ausführungsform eine Dosiereinrichtung 3a, die sich von der Dosiereinrichtung 3 dadurch unterscheidet, daß der Raum, in dem der Schlauch 19 untergebracht ist, nicht von einem Behälter 18, sondern von einem den Schlauch 19 umgebenen weiteren Schlauch 21 gebildet ist, der vorzugsweise aus einem für den an das Kulturmedium zuzuführenden bzw. von dem Kulturmedium abzuführenden Stoff nicht permeabel ist. Der Schlauch 19 ist an beiden Enden des Schlauches 21 aus diesem abgedichtet herausgeführt. An diesen Enden sind auch Anschlüsse 22 zum Zuführen und Abführen eines Mediums in dem bzw. aus dem zwischen den Schläuchen 19 und 21 gebildeten Ringraum vorgesehen.
Die 5 zeigt die Ausgleichskammer 5. Diese besteht im wesentlichen aus dem geschlossenem Behälter 23 mit einer im Behälterinnenraum angebrachten Zwischenwand 24, die mit dem Boden sowie der Umfangswand des Behälters 23 verbunden ist, allerdings einen Abstand von der Oberseite des Behälters 23 aufweist. Im Bereich des Bodens sind zwei Anschlüsse 25 vorgesehen, und zwar beidseitig von der Zwischenwand 24. Über einen Anschluß 25 wird das Kulturmedium zugeführt, welches dann den oberen Rand der Zwischenwand 24 überströmt und in die Teilkammer 23'' gelangt und dort über den Anschluß 25 abgeführt wird. Oberhalb der Teilkammern 23' und 23'', d.h. oberhalb des oberen Randes der Zwischenwand 24 ist ein Gasraum 23''' mit einem Anschluß 26 gebildet. Über den Anschluß 26 kann das sich im Gasraum 23''' sammelnde Gas oder Gasgemisch abgeführt werden. Über eine Druckregelung wird der Gasraum 23''' beispielsweise auf einen vorgegebenen konstanten Druck gehalten.
Während mit der Dosiereinrichtung 3 bzw. 3a sehr fein dosiert und die Gefahr von Gas- und Luftblasen vermeidend den Kulturmedium ein Gas- oder Gasgemisch beigegeben werden kann, werden in der Ausgleichskammer 5 evtl. doch vorhandene Gas- oder Luftblasen sowie überschüssiges, nicht oder nur unvollständig gelöstes Gas zumindest soweit entfernt, daß die Funktion störende Gas- oder Luftblasen in dem in den Kulturbehälter 6 zugeführten Mediumstrom nicht mehr enthalten sind.
Wie eingangs erwähnt, bereiten insbesondere die auf dem Markt angebotenen und allgemein verwendeten Anschlüsse bzw. Schraubdeckel, über die Vorratsbehälter oder Flaschen an ein System zum Kultivieren von Zellen und Gewebe angeschlossen werden, erhebliche Probleme u.a. dadurch, daß diese Anschlüsse eine Vielzahl von Übergängen zwischen Leitungs- oder Kanalabschnitten mit unterschiedlichen Materialien und Durchmessern bedingen und hier insbesondere auch die Gefahr der Ansammlung von Gasblasen und damit die Gefahr von Störungen im Mediumfluß sowie von unerwünschten Druckschwankungen im System besteht, und zwar insbesondere bei kleinen Flußraten.
Um dieses Problem zu vermeiden zeigt die 6 in vereinfachter Darstellung und im Teilschnitt einen Anschlußdeckel. Dieser Deckel besteht im wesentlichen aus einer Kappe 27 aus einem geeigneten Material, beispielsweise aus Kunststoff, die auf das Gewinde am Hals der Flasche 2 bzw. 7 aufschraubbar ist. Im Boden der Kappe 27 ist eine Öffnung 28 vorgesehen, durch die der Schlauch 28 von außen her in das Innere der Flasche 2 hindurchgeführt ist. Der Durchtritt des Schlauches 30 ist an der Außenfläche und an der Innenfläche des Kappenbodens 28 abgedichtet ist, und zwar unter Verwendung von jeweils einem Dichtungsring 31 und einer Platte 32, die den jeweiligen, den Schlauch 30 dicht umschließenden Dichtungsring 31 in einer Erweiterung der Öffnung 29 hält und gegen diese Erweiterung 29 sowie auch gegen den Umfang des Schlauches 30 derart anpreßt, daß eine Abdichtung ohne Einengung des Lumens des Schlauches 30 erreicht ist. Der Schlauch 30 ist dann gleichzeitig die Verbindungsleitung, mit der die jeweiligen Flasche 2 bzw. 7 an die Dosiereinrichtung 3 oder 3a bzw. an den Ausgang des Kulturbehälters 6 angeschlossen ist.
Die 7 zeigt in vereinfachter Darstellung und im Schnitt einen Kulturbehälter 6a, der sich von dem Kulturbehälter 6 im wesentlichen dadurch unterscheidet, daß an einer gemeinsamen Basisplatte 12a eine Vielzahl von Kultivierungsbereichen, d.h. bei der dargestellten Ausführungsform von Öffnungen 13 mit jeweils einem Zell- oder Gewebeträger 14 vorgesehen sind. In dem oberen Deckel 10a sind eine Vielzahl von Teilkammern 33 gebildet, von denen jeweils eine einem Kultivierbereich zugeordnet ist und die individuell von einem Kultur- oder Behandlungsmedium durchströmbar sind. Der unter Deckel 11a bildet bei der dargestellten Ausführungsform eine für sämtliche Kultivierungsbereiche gemeinsame Teilkammer 34. Bei geschlossenem Kulturbehälter 6a sind die einzelnen Teilkammern 33 im Deckel 10a gegeneinander abgedichtet. Der Deckel 10a ist hierfür mit einer Dichtung 35 versehen, mit der dieser Deckel gegen die Oberseite der Basisplatte 12a anliegt. Ebenso liegt der Deckel 11a mit einer Dichtung 36 abgedichtet gegen die Unterseite der Basisplatte 12a an. Die einzelnen Kammer 33 besitzen jeweils eigene Anschlüsse 37 oder es ist eine für alle Kammern 33 gemeinsame Anschluß- oder Verteilerplatte 38 mit internen, die Anschlüsse bildenden Kanälen 39 vorgesehen, an die dann die äußeren Verbindungsschläuche angeschlossen sind.
Grundsätzlich besteht auch die Möglichkeit für die Kultivierungsbereiche auch im unteren Deckel 12a jeweils getrennte Teilkammern vorzusehen oder im oberen und/oder unteren Deckel jeweils für Gruppen von mehreren Kultivierungsbereichen gemeinsame Teilkammern zu bilden usw.
Gerade die Verwendung eines Kultivierbehälters 6a mit mehreren Teilkammern an einer oder an beiden Seiten der Basisplatte 12a setzt ein besonders blasenfreies Zuführen des Kulturmediums voraus, insbesondere dann, wenn diese Teilkammern kleine Abmessungen aufweisen.
Weiterhin sind insbesondere auch an dem vorbeschriebenen Kultivierbehältern folgende Modifikationen möglich:
Anstelle der Anschlüsse 16 und 37 an den Deckeln oder aber zusätzlich zu diesen Anschlüssen können auch entsprechende Anschlüsse auch am Basisteil bzw. an der Basisplatte 12, 12a vorgesehen sein, und zwar beispielsweise bei der Basisplatte 12a wiederum in Form von Verteiler- oder Zuführkanälen. Weiterhin können sowohl in den Deckeln, als auch im Basisteil Vertiefungen und/oder Erhebungen zur Aufnahme von Geweben enthalten sein. Außerdem können unter Verwendung von speziellen Halterungen Träger mit Gewebe eingebracht werden.
Sowohl in den Deckeln als auch im jeweiligen Basisteil 12 bzw. 12a können Kühl- oder Heizelemente oder aber Kanäle für ein wärmetransportierendes Medium, beispielsweise Wasser oder einer anderen Flüssigkeit zum Heizen oder Kühlen der Zellen oder Gewebe vorgesehen sein.
Die Deckel, aber auch die Basisplatten können zumindest in einem Teilbereich aus lichtdurchlässigem Material hergestellt sein, um so die in der jeweiligen Kulturkammer untergebrachten Zellen oder Gewebe beobachten zu können. Weiterhin ist es möglich in den Deckeln und/oder im Basisteil Verbindungen für Flüssigkeit, aber auch für elektrische und elektronische Schaltungen oder Sensoren vorzusehen, beispielsweise für Meßzwecke und/oder einer Überwachung der Zellen.
Das kapillare Netz bzw. das dieses Netz bildende Matrixmaterial 17 ist z.B. so ausgeführt ist, daß ein An- oder Einwachsen der Zellen in dieses Material verhindert ist. Es besteht aber auch die Möglichkeit, daß kapillare Netz gezielt für ein Einwachsen von Zellen zu nutzen. Da das kapillare Netz sich in unmittelbarem Kontakt mit dem Gewebe befindet, können weiterhin auch definierte Bereiche des Gewebes mit Proteinen der extrazellulären Matrix behandelt werden, um so ein gezieltes Einwachsen von Zellen und damit den Aufbau von Gewebestrukturen zu ermöglichen.
Grundsätzlich besteht die Möglichkeit, die Basisplatte 12 bzw. 12a so auszubilden, daß ohne zusätzliche Dichtung über die Basisplatte jeweils ein dichter Abschluß mit dem zugehörigen Deckelteil erzielt wird.
Speziell bei der in der 7 dargestellten Ausführungsform des Kulturbehälters 6a besteht die Möglichkeit, das Element 38 oder ein ähnliches, Verteiler- und/oder Anschlußkanäle aufweisendes Element in den Deckel 10a und/oder 11a zu integrieren. Weiterhin besteht auch die Möglichkeit ein der Anschluß- oder Verteilerplatte 38 entsprechendes Element beispielsweise an einer Längsseite des Deckels 10a und/oder 11a vorzusehen und/oder die Anschluß- und/oder Verteilerkanäle an dieser Längsseite des Deckels 10a und/oder 11a zu integrieren, und zwar insbesondere dann, wenn die Teilkammern 33 in einer Achsrichtung aufeinander folgend vorgesehen sind, die parallel zu dieser Längsseite liegen.
Wie vorstehend erläutert wurde, hat die interstitielle Matrix bei der Erfindung eine Mehrfachfunktion, d.h. diese Matrix dient zum einen zur Verbesserung der Verteilung bzw. Zuführung des Kulturmediums an bzw. um das jeweilige zu kultivierende oder zu haltende Gewebe. Weiterhin dient diese Matrix auch dazu, Belastungen des Gewebes insbesondere durch Druckschwankungen zu vermeiden. Die Matrix dient aber auch dazu, durch in dieser Matrix enthaltene Motive oder Motivstoffe Einfluß auf die Zellen, auf deren Wachstum usw. zu nehmen.
Die 8 zeigt in einer Darstellung ähnlich der 2 als weitere mögliche Ausführungsform einen Kulturbehälter 6b, der dem Kulturbehälter 6 entspricht und wiederum die beiden Deckel 10 und 11 und die zwischen diesen angeordnete Basisplatte 12 aufweist. Der Innenraum jeder von den Deckel 10 und 11 gebildeten Kammer ist mit dem Matrix-Matrial 17 ausgefüllt.
Bei der dargestellten Ausführungsform ist im unteren Deckel 11 eine Heizeinrichtung vorgesehen, die ein elektrisches Heizelement 40, welches z.B. von einer Heiz- oder Thermofolie gebildet ist, sowie einen Temperatur- Regler 41 mit Temperatur-Sensor aufweist. Bei der dargestellten Ausführungsform sind das Heizelement 40 und der Temperatursensor 42 in der Bodenwandung 11' des Deckels 11 untergebracht, und zwar vorzugsweise derart, daß die Heizvorrichtung entnommen werden kann. Hierdurch besteht die Möglichkeit, den Container 6a bzw. dessen Teile 10, 11 und 12 als nur einmal verwendbare Elemente auszubilden, die nach einer Verwendung in geeigneter Weise entsorgt werden, während die Heizvorrichtung mehrfach verwendbar ist. Die Besonderheit bei der dargestellten Ausführungsform besteht auch darin, daß die Heizvorrichtung bzw. das Wärmemodul vom Innenraum der Kammer des Kulturbehälters 6a getrennt ist, d.h. die Heizvorrichtung in keinem direkten Kontakt mit dem Kulturmedium und mit dem in der Kammer befindlichen Gewebe usw. steht, so daß ein Kontakt des Kulturmediums mit zusätzlichen Fremdmaterialien und evtl. hieraus resultierende Probleme, auch Sterilisationsprobleme wirksam vermieden sind. Die elektrische Heizvorrichtung ermöglicht es auch, mit einem entsprechenden Überwachungssystem beispielsweise auf einem Rechner den Stromverbrauch und das Steuerverhalten der Heizvorrichtung zu registrieren und damit zu kontrollieren, ob evtl. während der unter Umständen wochenlang durchgeführten Kultivierung, Untersuchung usw. Unregelmäßigkeiten bei der Wärmeversorgung aufgetreten sind.
Auf jeden Fall ermöglicht es die Heizvorrichtung den Innenraum des Kulturbehälters 6a auf eine vorgegebene, konstante Temperatur zu halten, die an der Steuerung 41 einstellbar ist, beispielsweise bei einer intelligenten Steuerung 41 auch durch Programmieren von außen über einen angschlossenen Computer.
Die beschriebene Heizvorrichtung kann auch bei anderen Komponenten des erfindungsgemäßen Systems vorgesehen sein.
Da die meisten Zellen und Gewebe bei einer konstanten Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von 37°C generiert werden müssen, war es bisher üblich, die Kulturcontainer und auch andere Komponenten eines Systems zum Kultivieren und/oder Differenzieren und/oder Halten von Zellen und/oder Geweben in Inkubatoren oder Wärmeeinrichtungen unterzubringen, allerdings mit dem Nachteil, daß diese Komponenten nur schwer zugänglich sind und auch optisch nur mangelhaft und nicht von allen Seiten beobachtet werden konnten.
Eine andere vielfach verwendete Methode, die Komponenten eines Systems zum Kultivieren, Differenzieren und/oder Halten von Zellen und/oder Gewebe auf einer Wärmeplatte anzuordnen, und zwar beispielsweise unter einer Abdeckhaube, hat den Nachteil, daß für eine Beobachtung die Abdeckhaube abgehoben werden muß, was zu Wärmeverlusten und Temperaturänderungen führt.

Claims

Vorrichtung zum Kultivieren und/oder Differenzieren und/oder Halten von Zellen oder Geweben in einem einen Zellträger oder Gewebeträger aufweisenden Kultivierbereich (13, 14) einer geschlossenen Kammer eines Kulturbehälters (6, 6a), die Anschlüsse zum Zuführen und Abführen eines Kulturmediums aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der Kultivierbereich (13, 14) von einem von dem Kulturmedium durchströmbaren Kapillarnetz umgeben ist, in das die Zellen nicht einwachsen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kapillarnetz eine Hohlstruktur bildet, die die Form des wachsenden Gewebes bestimmt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kapillarnetz extrazelluläre Matrixproteine, insbesondere Kollagen aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kapillarnetz aus Zellstoff oder Papier gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kapillarnetz ein Faser- oder Vlies- oder Schaumstoffmaterial, insbesondere aus Polylaktid/glykolsäure, ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kapillarnetz Peptidketten aufweist, die durch Zuführen von Enzymen eine gesteuerte Auflösung des Kapillarnetzmaterials bewirken.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Proteasen oder Metalloproteinasen sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Kapillarnetz bildende Material ein hydrophiles, Flüssigkeit aufnehmendes Material ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Kapillarnetz bildende Material (17) mit einem das Wachstum beeinflussenden Wirkstoff versehen ist, insbesondere getränkt oder beschichtet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff in einem den Abbau dieses Stoffes verzögernden Trenn- oder Hilfsstoff eingebaut und/oder mit einem solchen Trenn- oder Hilfsstoff überschichtet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Kapillarnetz bildende Material oder Fasern dieses Materials mit einer das Anwachsen von Zellen an diesem Material verhindernden Oberflächenbeschichtung, insbesondere aus Silikon oder Silan, versehen sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass beidseitig von dem Kultivierbereich (13, 14) jeweils eine ein Kapillarnetz enthaltende Teilkammer gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kulturbehälter (6, 6a) aus einem vorzugsweise plattenförmigen Basisteil (12, 12a) besteht, an dem beidseitig jeweils ein vorzugsweise deckel- oder kappenartiger Behälterteil (10, 10a; 11, 11a) vorgesehen ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest an einer Seite des Basisteils (12a) eine Vielzahl von Teilkammern gebildet sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Dosiereinrichtung (3, 3a) zum Zuführen und/oder Abführen von Wirkstoffen in ein Kulturmedium, wobei die Dosiereinrichtung (3, 3a) von wenigstens einem Kanal mit einer permeablen Wandung gebildet ist, der von dem Kulturmedium durchströmbar und in einem Raum (18, 21) angeordnet ist, über den der zuzuführende oder abzuführende Wirkstoff zugeführt bzw. abgeführt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Raum von einem geschlossenen Behälter (11) gebildet ist, in welchem der Kanal verläuft.
Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Raum von einem den Kanal umschließenden Schlauch- oder Rohrabschnitt gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal von einem Schlauch- oder Rohrabschnitt gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dem Kulturbehälter (6, 6a) eine von dem Kulturmedium durchströmbare Ausgleichs- oder Entgasungskammer (5) vorgeschaltet ist, in der ein von dem Kulturmedium eingenommener Flüssigkeitsraum und über diesem ein Gasraum (23'') gebildet sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Anspruche, gekennzeichnet durch eine Verbindungs- oder Anschlusskappe (27) zum Anschließen einer Schlauchleitung (30) an einen Entnahme- oder Sammelbehälter, beispielsweise an eine Flasche (2, 7) für das Kulturmedium, wobei die Leitung von einem durch eine Öffnung der Kappe (27) abgedichtet hindurchgeführten Schlauch (30) gebildet ist.