ES2661080T3

ES2661080T3 - Nuevos anticuerpos humanizados 12G4 mutados y sus fragmentos dirigidos contra el receptor humano de la hormona anti-mulleriana de tipo II

Info

Publication number: ES2661080T3
Application number: ES11718450.7T
Authority: ES
Inventors: Christian Behrens; Isabelle Navarro-Teulon
Original assignee: Centre Nat De Lutte Contre Le Cancer; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre National de Lutte Contre Le Cancer; LFB SA
Current assignee: Centre Nat De Lutte Contre Le Cancer; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre National de Lutte Contre Le Cancer; LFB SA
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2018-03-27
Anticipated expiration: 2031-04-01
Also published as: BR112012028859A2; US9012607B2; JP6043998B2; FR2959994B1; BR112012028859B1; CN103119059B; WO2011141653A1; EP2569333B1; US20150232563A1; CN103119059A; JP6435295B2; JP2013534408A; FR2959994A1; CA2798336A1; US9637544B2; JP2017029139A; US20130136743A1; EP2569333A1; DK2569333T3; BR112012028859A8

Abstract

Anticuerpo monoclonal 12G4 humanizado mutado que une específicamente el receptor de tipo II de la hormona anti-mulleriana humana, que posee: a) una cadena ligera constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: - SEC ID nº 82 o SEC ID nº 84, y b) una cadena pesada constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: - SEC ID nº 86 o SEC ID nº 88.

Description

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-una mutación en la región variable, particularmente FR de la cadena ligera (I177T), es decir la sustitución de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido hidrófilo, que posee además un valor de índice hidropático, según la solicitud internacional WO 2008/053330, totalmente diferente (+4,5 para la isoleucina y -0,7 para la treonina), y

-una mutación en la cadena pesada (Q3R), es decir la sustitución de una glutamina por una arginina cuyo valor de índice hidropático, según la solicitud internacional WO 2008/053330, varía de -3,5 para la glutamina a -4,5 para la arginina,

y que presenta no obstante una afinidad sustancialmente mejor que la del anticuerpo humanizado 12G4 no mutado, y superior a la del anticuerpo quimérico 12G4 no mutado.

Asimismo, el anticuerpo 3C_23K que, a parte de las mutaciones del anticuerpo 3C_23 posee además una segunda mutación en la CDR de la región variable de la cadena ligera (E184K) en el que un ácido glutámico está sustituido por una lisina, es decir la sustitución de un aminoácido ácido por un aminoácido básico que tiene como consecuencia una carga totalmente diferente ya que son de signos opuestos, presenta, no obstante, todavía una actividad pero, sobre todo, una afinidad sustancialmente mejor que la del anticuerpo humanizado 12G4 no mutado, y superior a la del anticuerpo quimérico 12G4 no mutado, y no provoca reacción inmune.

La presente descripción describe un anticuerpo monoclonal humanizado 12G4 mutado tal como se ha definido anteriormente, en el que una al menos de dichas mutaciones en las regiones FR de la cadena ligera (VL) corresponde a la sustitución de uno al menos de los aminoácidos siguientes: I132T, A143T, T150A, S158P, L175Q, I177T, Y178H, V187A, S192T, G197D, F212S.

La presente descripción describe un anticuerpo monoclonal humanizado 12G4 mutado tal como se ha definido anteriormente, en el que al menos una de dichas mutaciones en la cadena pesada corresponde a la sustitución de uno al menos de los aminoácidos siguientes: Q1E, Q3E, Q3R, Q6E, A9T, V11A, K12R, K13R, K19E, V20A, A24G, A24V, A24T, Q39E, A40V, S31G, L45P, D56N, A76T, A79T, R87G, T58A, Q62R, V67M, I70N, T74A, S77P, A79T, S88P, E89D, F102S, A103T, L110P, S114T.

La presente descripción describe un anticuerpo monoclonal humanizado 12G4 mutado tal como se ha definido anteriormente, que posee una cadena ligera y una cadena pesada seleccionadas entre las siguientes:

a) una cadena ligera que comprende o que está constituida de una región variable cuya secuencia en aminoácidos está representada por la SEC ID nº 2 en la que al menos una sustitución de aminoácidos siguiente situada en uno de los CDR se ha efectuado: S179P, E184K, E184G, E184D, S182F, o

una cadena ligera que comprende o que está constituida de una región variable cuya secuencia en aminoácidos está representada por la SEC ID nº 2 en la que al menos una sustitución de aminoácidos siguiente, situada en uno de los CDR se ha efectuado: S179P, E184K, E184G, E184D, S182F, y al menos una sustitución de aminoácidos siguientes situada en las regiones FR se ha efectuado: I132T, A143T, T150A, S158P, L175Q, Y178H, V187A, S192T, G197D, F212S,

y de una región constante cuya secuencia en aminoácidos está representada por la SEC ID nº 6,

b) una cadena pesada cuya secuencia en aminoácidos está representada por la SEC ID nº 58 en la que una sustitución de uno al menos de los aminoácidos siguientes: Q1E, Q3E, Q3R, Q6E, A9T, V11A, K12R, K13R, K19E, V20A, A24G, A24V, A24T, Q39E, A40V, S31G, L45P, D56N, A76T, A79T, R87G, T58A, Q62R, V67M, I70N, T74A, S77P, A79T, S88P, E89D, F102S, A103T, L110P, S114T se ha efectuado.

La tabla VII del ejemplo 3 presenta los diferentes clones obtenidos y sus sustituciones. Muestra también que el índice hidropático varía de manera importante en función de las mutaciones, sin tampoco conducir a una pérdida de actividad y/o de afinidad para el antígeno y permite incluso para algunos clones obtener un aumento de la afinidad con respecto al anticuerpo quimérico correspondiente (relación Ac de la invención/anticuerpo quimérico igual o superior a 1).

En este modo de realización, es posible constituir un anticuerpo que procede de la combinación de dos anticuerpos previamente obtenidos y aumentar aún más la actividad y la afinidad para el receptor AMHR-II con respecto al anticuerpo quimérico 12G4 no mutado.

a) una cadena ligera que comprende o que está constituida de una región variable cuya secuencia en aminoácidos está representada por:

-SEC ID nº 22 (sin líder) o SEC ID nº 24 (con líder), o

-SEC ID nº 30 (sin líder) o SEC ID nº 32 (con líder), o -SEC ID nº 34 (sin líder) o SEC ID nº 36 (con líder), o

5 -SEC ID nº 46 (sin líder) o SEC ID nº 48 (con líder), y de una región constante cuya secuencia en aminoácidos está representada por la SEC ID nº 6,

10 b) una cadena pesada que comprende o que está constituida de una región variable cuya secuencia en aminoácidos está representada por: -SEC ID nº 38 (sin líder), o SEC ID nº 40 (con líder), 15 -SEC ID nº 26 (sin líder), o SEC ID nº 28 (con líder), -SEC ID nº 8 (sin líder), o SEC ID nº 10 (con líder), -SEC ID nº 42 (sin líder), o SEC ID nº 44 (con líder), 20 -SEC ID nº 50 (sin líder), o SEC ID nº 52 (con líder), y de una región constante cuya secuencia en aminoácidos está representada por la SEC ID nº 12. 25 La presente descripción describe un anticuerpo monoclonal humanizado 12G4 mutado, que posee: a) una cadena ligera constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: -SEC ID nº 70 (sin líder) o SEC ID nº 72 (con líder), y 30 b) una cadena pesada constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: -SEC ID nº 74 (sin líder), o SEC ID nº 76 (con líder), (anticuerpo 3C_23) 35 o, a) una cadena ligera constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: -SEC ID nº 78 (sin líder) o SEC ID nº 80 (con líder), y 40 b) una cadena pesada constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: SEC ID nº 58 (sin líder), o SEC ID nº 60 (con líder), (anticuerpo 6B_78) 45 o, a) una cadena ligera constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: -SEC ID nº 78 (sin líder) o SEC ID nº 80 (con líder), y 50 b) una cadena pesada constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: -SEC ID nº 90 (sin líder), o SEC ID nº 92 (con líder), (anticuerpo 4C_35) 55 o, a) una cadena ligera constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: -SEC ID nº 94 (sin líder) o SEC ID nº 96 (con líder), y 60 b) una cadena pesada constituida de la secuencia en aminoácidos representada por: -SEC ID nº 98 (sin líder), o SEC ID nº 100 (con líder), (anticuerpo 5B_42) 65

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-SEC ID nº 7 (sin líder) o SEC ID nº 9 (con líder), o -SEC ID nº 37 (sin líder) o SEC ID nº 39 (con líder), o -SEC ID nº 41 (sin líder) o SEC ID nº 43 (con líder), o -SEC ID nº 49 (sin líder) o SEC ID nº 51 (con líder), b) región constante -SEC ID nº 11. En un modo de realización ventajoso, la invención se refiere a un ácido nucleico definido anteriormente, en el que la

secuencia que codifica la cadena ligera se selecciona entre las secuencias siguientes: a) secuencia que codifica la cadena ligera SEC ID nº 81 (sin líder) o SEC ID nº 83 (con líder), y b) secuencia que codifica la cadena pesada SEC ID nº 85 (sin líder) o SEC ID nº 87 (con líder), (anticuerpo 3C_23K)

La presente descripción describe un ácido nucleico definido anteriormente, en el que la secuencia que codifica la cadena ligera se selecciona entre las secuencias siguientes: -SEC ID nº 69 (sin líder) o SEC ID nº 71 (con líder), o -SEC ID nº 77 (sin líder) o SEC ID nº 79 (con líder), o -SEC ID nº 93 (sin líder) o SEC ID nº 95 (con líder), y la secuencia que codifica la cadena pesada se selecciona entre las secuencias siguientes: -SEC ID nº 73 (sin líder) o SEC ID nº 75 (con líder), o -SEC ID nº 57 (sin líder) o SEC ID nº 59 (con líder), o -SEC ID nº 89 (sin líder) o SEC ID nº 91 (con líder), o

-SEC ID nº 97 (sin líder) o SEC ID nº 99 (con líder). La presente descripción describe un ácido nucleico definido anteriormente, en el que la secuencia que codifica la cadena ligera y la secuencia que codifica la cadena pesada son las siguientes:

a) secuencia que codifica la cadena ligera SEC ID nº 69 (sin líder) o SEC ID nº 71 (con líder), y b) secuencia que codifica la cadena pesada SEC ID nº 73 (sin líder) o SEC ID nº 75 (con líder), (anticuerpo 3C_23) o, a) secuencia que codifica la cadena ligera SEC ID nº 77 (sin líder) o SEC ID nº 79 (con líder), y b) secuencia que codifica la cadena pesada SEC ID nº 57 (sin líder) o SEC ID nº 59 (con líder), (anticuerpo 6B_78) o, a) secuencia que codifica la cadena ligera SEC ID nº 77 (sin líder) o SEC ID nº 79 (con líder), y b) secuencia que codifica la cadena pesada SEC ID nº 89 (sin líder) o SEC ID nº 91 (con líder), (anticuerpo 4C_35)

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a) secuencia que codifica la cadena ligera SEC ID nº 93 (sin líder) o SEC ID nº 95 (con líder), y

b) secuencia que codifica la cadena pesada SEC ID nº 97 (sin líder) o SEC ID nº 99 (con líder),

(anticuerpo 5B_42)

Según otro aspecto, la solicitud se refiere a un vector de expresión que comprende al menos un ácido nucleico definido anteriormente, estando dicho ácido nucleico bajo el control de los elementos que permiten su expresión.

Por “vector de expresión”, se define una molécula de ADN que posee unos elementos que permiten su replicación (duplicación) en al menos un organismo vivo. Estos elementos que permiten la replicación son en particular unos orígenes de replicación de levadura o de bacterias, o también unos elementos de control de la replicación de un virus.

Los vectores según la solicitud son en particular unos plásmidos, unos fagos, unos cromosomas artificiales de levadura (YAC), unos cromosomas artificiales de bacterias (BAC), los genomas modificados de virus replicativos o de virus integrativos, etc.

Estos vectores son denominados “de expresión” ya que disponen de secuencias nucleotídicas que permiten la expresión, es decir la transcripción en ARN, de las secuencias nucleotídicas que controlan.

En la solicitud, dicha secuencia de ácido nucleico contenida en dicho vector se coloca “bajo el control de los elementos que permiten su expresión”. Esto significa que dicho vector de expresión posee al menos una secuencia de iniciación de la transcripción tal como un promotor de un virus como el promotor precoz del virus del simio SV40,

o del citomegalovirus (CMV) o también las secuencias promotoras del virus del sarcoma de Rous (RSV), y en particular una secuencia o promotor que comprende una caja TATAA. Además, dicho vector posee también al menos una secuencia de terminación de la transcripción, y en particular una secuencia de poliadenilación procedente de un gen de mamífero, en particular humano.

A estas secuencias indispensables para la expresión de la secuencia nucleotídica contenida en dicho vector pueden añadirse otras secuencias que permiten regular o modular la expresión de dicha secuencia. Una lista no exhaustiva comprende: unos intrones de genes de mamíferos, y en particular humanos, unas secuencias de regulación de la transcripción de tipo amplificador (“potenciadores”) o también unas secuencias transcritas pero no traducidas de genes de mamífero, y en particular humanos.

Un modo de realización ventajoso de la invención se refiere a un vector de expresión tal como definido anteriormente, que codifica el anticuerpo tal como se reivindica y que comprende al menos un ácido nucleico seleccionado entre los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias siguientes SEC ID nº 83, 87

En otro modo de realización ventajoso, la invención se refiere a un vector de expresión tal como definido anteriormente, que comprende

-un primer ácido nucleico seleccionado entre los ácidos nucleicos de secuencias siguientes: SEC ID nº 83, estando dicho primer ácido nucleico bajo el control de los elementos que permiten su expresión, y

-un segundo ácido nucleico seleccionado entre los ácidos nucleicos de secuencias siguientes: SEC ID nº 87, estando dicho segundo ácido nucleico bajo el control de los elementos que permiten su expresión.

Este vector de expresión comprende por lo tanto dos secuencias de ácidos nucleicos antes mencionadas, y más particularmente comprende une secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal definido anteriormente, y une secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo monoclonal definido anteriormente.

Preferiblemente, dicho vector de expresión contiene un primer elemento que permite la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal definido anteriormente y un segundo elemento que permite la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo monoclonal definido anteriormente, siendo dicho primer y dicho segundo elemento que permiten la expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos idénticos o diferentes, y preferiblemente idénticos. Estos elementos de control son en particular las secuencias terminales largas repetidas (LTR) del virus RSV.

Otro modo de realización se refiere a un vector de expresión definido anteriormente, que comprende al menos un gen de resistencia a un antibiótico.

Mediante la expresión “al menos un gen de resistencia” se entiende que dicho vector de expresión puede contener 1

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La figura 17 presenta la determinación de la afinidad de unión del anticuerpo al receptor AMHR-II en un ensayo Elisa clásico obtenido con unos anticuerpos mutados (Fab) según la invención.

El eje de las abscisas representa la concentración en (Fab) en µg/ml y el eje de las ordenadas representa la DO a 450 nm.

La curva en línea discontinua con unos círculos vacíos blancos representa la unión del anticuerpo humanizado 12G4 no mutado.

La curva con unos triángulos llenos negros representa la unión del anticuerpo humanizado 12G4 mutado, que posee una mutación en la CDR (E184K) de la región variable de la cadena ligera (anticuerpo 6B_78).

La curva con unos triángulos vacíos blancos representa la unión del anticuerpo humanizado 12G4 mutado, que posee una mutación en la CDR (S179P) de la región variable de la cadena ligera, una mutación en la región FR (I177T) de la región variable de la cadena ligera y una mutación en la región variable de la cadena pesada (Q3R). (anticuerpo 3C_23).

La curva con unos círculos vacíos blancos representa la unión del anticuerpo humanizado 12G4 mutado, que posee una mutación en la CDR (E184K) de la región variable de la cadena ligera una mutación en la CDR (S179P) de la región variable de la cadena ligera, una mutación en la región FR (I177T) de la región variable de la cadena ligera y una mutación en la región variable de la cadena pesada (Q3R). (anticuerpo 3C_23K).

La curva con unos círculos llenos negros representa la unión del anticuerpo quimérico 12G4 no mutado.

La figura 18 corresponde a la representación esquemática del vector de clonación H622-14 para el anticuerpo 12G4 quimérico que contiene la cadena pesada en la que el líder VH AMHR-II está fusionado a la región variable de la cadena pesada (VH AMHR-II), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CH T125), y la cadena ligera en la que el líder VK AMHR-II está fusionado a la región variable de la cadena ligera (VK AMHR-II), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CK T125).

Se representan también los diferentes elementos de regulación (promotores, intrones quiméricos, sitios de poliadenilación, etc.) así como los genes de resistencia a los antibióticos y los orígenes de replicación.

La figura 19 corresponde a la representación esquemática del vector de clonación H622-18 para el anticuerpo 12G4 humanizado no mutado que contiene la cadena pesada en la que el líder VH AMHR-II humanizado está fusionado a la región variable de la cadena pesada (VH AMHR-II humanizado), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CH T125), y la cadena ligera en la que el líder VK AMHR-II está fusionado a la región variable de la cadena ligera (VK AMHR-II humanizado), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CK T125).

La figura 20 corresponde a la representación esquemática del vector de clonación H622-18 MAO 3C23 para el anticuerpo 12G4 humanizado mutado 3C_23 que contiene la cadena pesada en la que el líder VH 3C_23 está fusionado a la región variable de la cadena pesada (VH 3C_23), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CH T125), y la cadena ligera en la que el líder VK 3C_23 está fusionado a la región variable de la cadena ligera (VK 3C_23), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CK T125).

La figura 21 corresponde a la representación esquemática del vector de clonación H622-18 MAO 6B_78 para el anticuerpo 12G4 humanizado mutado 6B_78 que contiene la cadena pesada en la que el líder VH AMHR-II humanizado está fusionado a la región variable de la cadena pesada (VH AMHR-II humanizado), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CH T125), y la cadena ligera en la que el líder VK 6B_78 está fusionado a la región variable de la cadena ligera (VK 6B_78), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CK T125).

La figura 22 corresponde a la representación esquemática del vector de clonación H622-18 MAO 3C_23K para el anticuerpo 12G4 humanizado mutado 3C_23K que contiene la cadena pesada en la que el líder VH 3C_23K está

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fusionado a la región variable de la cadena pesada (VH 3C_23K), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CH T125), y la cadena ligera en la que el líder VK 3C_23K está fusionado a la región variable de la cadena ligera (VK 3C_23K), ella misma fusionada a la región constante de la inmunoglobulina humana (CK T125).

La figura 23 presenta los protocolos esquemáticos de construcción de los fragmentos scFv.

La flecha negra debajo de la región 2/3 de VH indica la secuencia que codifica los 2/3 N-terminal del enlace peptídico.

La flecha negra debajo de la región 2/3 de VL indica la secuencia que codifica los 2/3 C-terminal del enlace peptídico.

Las figuras 24A y 24B representan la subclonación de las secuencias nucleotídicas de las cadenas ligeras VL-CL y pesadas VH-CH1 de los anticuerpos mLFB112 y huLFB112 en los vectores de expresión pMG62-Fab.

Figura 24A: mLFB112

Figura 24B: huLFB112

La figura 25 presenta la actividad ADCC de los anticuerpos anti-AMHRII humanizados de la invención comparada con la del anticuerpo 12G4 humanizado no mutado. Los resultados se expresan en porcentaje de lisis de la célula ASC1 (eje de las ordenadas) en función de la cantidad de anticuerpo añadida en ng/ml (eje de las abscisas). Media +/-SEM.

La curva con rombos representa el anticuerpo anti-AMHRII 3C_23 (R901 3C_23), la curva con los triángulos con la punta hacia arriba representa el anticuerpo anti-AMHRII 6B_78 (R901 6B_78, la curva con los triángulos con la punta hacia abajo representa el anticuerpo anti-AMHRII 3C_23K (R901 3C_23K), la curva con los círculos representa el anticuerpo anti-AMHRII 12G4 humanizado no mutado.

La figura 26 presenta el mapa del vector de expresión plásmido pIRES-neo utilizado para la generación de la línea cov434-AMHRII.

Las figuras 27A y 27B presentan la actividad ADCC de los anticuerpos anti-AMHRII quiméricos y humanizados producidos en las células YB2/0 (figura 27A) y las células CHO (figura 27B) sobre la línea COV434-AMHRII.

Los resultados se expresan en porcentaje de lisis de las células COV434-AMHRII (eje de las ordenadas) en función de la cantidad de anticuerpo añadida en ng/ml (eje de las abscisas). Media de 3 ensayos +/-SEM.

Figura 27A: la curva con rombos representa el anticuerpo anti-AMHRII 12G4 quimérico no mutado, la curva con los cuadrados llenos representa el anticuerpo anti-AMHRII YB2/0 3C_23 (R901 3C_23), la curva con los triángulos con la punta hacia abajo representa el anticuerpo anti-AMHRII YB2/0 6B_78 (R901 6B_78), la curva con los triángulos con la punta hacia arriba representa el anticuerpo anti-AMHRII YB2/0 3C_23K (R901 3C_23K) y la curva con los rectángulos vacíos representa el anticuerpo anti-CD20 utilizado como control negativo.

Figura 27B: la curva con rombos representa el anticuerpo anti-AMHRII 12G4 quimérico no mutado, la curva con los triángulos con la punta hacia arriba representa el anticuerpo anti-AMHRII CHO 3C_23 (R901 3C_23), la curva con los triángulos con la punta hacia abajo representa el anticuerpo anti-AMHRII CHO 3C_23K (R901 3C_23K), la curva con los círculos representa el anticuerpo anti-AMHRII CHO 6B_78 (R901 6B_78) y la curva con los rectángulos vacíos representa el anticuerpo anti-CD20 utilizado como control negativo.

La figura 28 presenta la actividad ADCC de los anticuerpo anti-AMHRII humanizados producidos en las células YB2/0 y CHO sobre la línea Asc 1. Los resultados se expresan en porcentaje de lisis de las células Asc 1 (eje de las ordenadas) en función de la cantidad de anticuerpo añadida en ng/ml (eje de las abscisas). Media 3 ensayos +/-SEM.

La curva con rombos representa el anticuerpo anti-AMHRII YB2/0 3C_23K, la curva con los triángulos con la punta hacia arriba representa el anticuerpo anti-AMHRII CHO 3C_23K.

La figura 29 presenta la actividad ADCC de los anticuerpo anti-AMHRII humanizados producidos en YB2/0 y CHO sobre la línea META 2815. Los resultados se expresan en porcentaje de lisis de las células META 2815 (eje de las ordenadas) en función de la cantidad de anticuerpo añadida en ng/ml (eje de las abscisas). Media 3 ensayos +/-SEM.

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Figura 33B: eje de las ordenadas: porcentaje de supervivencia

5 eje de las abscisas: días después de la inyección de las células tumorales. Curva con rombos: vehículo Curva con rectángulos: anticuerpo anti-AMHRII YB2/0 3C_23K.

10 Las figuras 34A y 34B presentan la evolución de los volúmenes tumorales (figura 34A) y curvas de supervivencia (figura 34B) bajo el efecto del tratamiento por 3C_23K-YB2/0, inyecciones intraperitoneales de anticuerpo realizadas a 2-3 días de intervalo a una dosis de 10 mg/kg/inyección para un total de 18 inyecciones (flechas negras) en el modelo META 2815.

15 Figura 34A: eje de las ordenadas: volúmenes tumorales en mm3, 20 eje de las abscisas: días después de la inyección de las células tumorales. Curva con rombos: vehículo Curva con rectángulos: anticuerpo anti-AMHRII YB2/0 3C_23K. 25 Figura 34B: eje de las ordenadas: porcentaje de supervivencia 30 eje de las abscisas: días después de la inyección de las células tumorales. Curva con rombos: vehículo Curva con rectángulos: anticuerpo anti-AMHRII YB2/0 3C_23K. 35

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Determinación de la afinidad de los anticuerpos anti-AMHR-II

40 Se determina la afinidad de los anticuerpos para sus antígenos, AMHR-II, mediante la técnica SPR (Surface Plasmon Resonance) sobre BIACore X100 (BIACore, GE Healthcare). El receptor AMHR-II recombinante, expresado en forma de proteína de fusión con una región Fc, se inmoviliza por un acoplamiento covalente entre sus funciones aminas y los grupos carboxilos del dextrán activados en ésteres de succinimida, presentes en la superficie del chip sensor de tipo CM5. Los grupos COOH del chip sensor se activan durante 7 minutos mediante una mezcla

45 EDC/NHS (0.1 M N-hidroxisuccinimida y 0,1 M 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida) a un caudal de 10 µl/min después la proteína de fusión AMHR-II/Fc, diluida a 5 µg/ml en tampón acetato de sodio 10 mM, pH 4.0, se inyecta a 5µl/min sobre la pista 2 del chip sensor a fin de alcanzar 300 RU. Los grupos ésteres que no han reaccionado con las aminas de la proteína de fusión se desactivan mediante la inyección de una solución de etanolamina-HCl 1M, pH 8,5 durante 7 min. a un principio de 10 µl:min. La pista 1 que sirve de control negativo se

50 activó y desactivó como la pista 2.

Todas las mediciones se efectúan a 25°C. Los anticuerpos a analizar se diluyen en el tampón de ejecución HBS-EP (BIACore, GE Healthcare) a concentraciones de 6,25 a 3 333 nM e inyectados sobre el chip sensor durante 2 min a un caudal de 30 µl/min. La etapa de disociación se continúa durante 10 min, después la superficie de regenera

55 mediante la inyección de tampón glicina 10 mM, pH 1,5 durante 30 s a 10 µl/min.

Los sensogramas obtenidos se analizan utilizando el modelo cinético 1: 2 del programa BIAevaluation 3.1.

Resultados

60 Los anticuerpos se han producido en las células CHO o YB 2/0 (Tabla I)

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B) Cada una de las cadenas ligeras y pesadas está bajo la dependencia de un promotor. RBS: “Ribosome Binding Site”.

3.2 Construcción y validación de las herramientas moleculares.

5 Construcción del banco por MutaGen™.

El objetivo definido para esta etapa era obtener un banco de 5x106 variantes con 1 a 2 mutaciones en aminoácidos por scFv.

10 La introducción de mutaciones dentro de los dominios VL y VH del anticuerpo humanizado huLFB112 se ha realizado mediante la tecnología MutaGen™. Al final, se obtuvo un banco de gran tamaño compuesto de aproximadamente 5x107 clones mutados con 1 a 5 mutaciones de aminoácidos por scFv es decir 10 veces la diversidad prevista inicialmente.

15 Para ello, se han construido varios sub-bancos según diferentes condiciones experimentales: condiciones U, M, US y UE definidas por diferentes cebadores nucleotídicos, enzimas mutasas utilizadas y número de replicaciones. Estos sub-bancos son de una cantidad de 4 y denominados R20U, 45M, R20US y R20UE. Para el conjunto de estos subbancos, se ha efectuado un total de 295 secuencias a fin de precisar las diferentes características de la

20 mutagénesis. La tabla III siguiente presenta una visión de los principales datos procedentes del análisis de las secuenciaciones.

Tabla III. Análisis de las mutaciones de los diferentes sub-bancos.

Nombre del banco

R20U: 45M R20US R20UEta TOTAL

Tamaño del banco: 2,0E+07 6,0E+06 9,9E+07 5,0E+05 1,3E+08

Condición: U M US UE

Número de secuencias: 87 67 85 56 295

Análisis de las secuencias de nucleótidos

Frecuencia de las mutaciones por kb: 2,76 3,66 3,31 4,9

% de deleciones: 10% 20% 6% 5%

% de adiciones: 2% - 0,8% -

% de sustituciones: 72% 80% 93% 95%

Frecuencia de mutaciones por kb (sin deleciones): 2,0 2,45 3,10 3,68

Análisis de las secuencias de aminoácidos

% de secuencias (en peso) (+ mutación silenciosa): 63% 46% 44% 41%

% de secuencias con desfase del marco de lectura (+ codón stop): 13% 28% 13% 27%

% de secuencias con aminoácidos mutados: 24% 25% 43% 32%

Nombre de clones scFv con unos aminoácidos mutados: 4,8E+06 1,5E+06 4,3E+07 1,6E+05 4,9E+07

Número de mutaciones de aminoácidos por scFv: 1,3 1,2 1,8 2,11

Clones scFv con 1 aminoácido mutado: 65% 49% 50% 33% 2,5E+07

Clones scFv con 2 aminoácidos mutados: 25% 34% 33% 39% 1,6E+07

Clones scFv con 3 aminoácidos mutados: 10% 13% 8% 6% 4,2E+06

Clones scFv con 4 aminoácidos mutados: - 4% 6% 22% 2,5E+06

Clones scFv con 5 aminoácidos mutados: - - 3% - 1,2E+06

25

3.2. Desarrollo de las condiciones de selección.

A fin de evaluar diferentes estrategias de selección, se ha realizado una mezcla artificial entre los fagos-scFv murinos y humanizados (mezcla 1/200, mLFB112/huLFB112), siendo el objetivo simular el cribado del banco. Esta

30 simulación de cribado debe permitir la validación de diferentes condiciones de selección que tienen como finalidad amplificar rápidamente el clon más afín dentro de esta mezcla artificial (es decir el clon murino mLFB112 en este caso).

Las diferentes estrategias evaluadas:

35 i) Utilización de una cantidad constante de diana inmovilizada durante los turnos de selección (Cond. 1)

ii) Disminución de la cantidad de diana inmovilizada durante los turnos de selección (Cond. 2)

40 ii) Ensayo de una condición “koff”: tiempo de incubación largo de los fagos-scFv con la diana (Cond. 3)

5

10

15

20

25

30

Estas diferentes condiciones se han realizado sobre 3 turnos de selección. Se han realizado unas secuenciaciones sobre los clones retenidos después de cada turno de selección. Los resultados se indican en la tabla IV siguiente

Tabla IV. Evaluación de tres estrategias de cribado

Condición 1: Bp1 Bp2 Bp3

Recubrimiento: 500 ng 500 ng 500 ng

Número de fagos scFv utilizados para el turno de selección: 1,6E+11 1,2E+11 2,0E+11

Número de fagos scFv recuperados al final del turno de selección: 3,3E+5 2,4E+5 2,7E+6

% de mLFB112/huLFB112: 0/100 1/99 90/10

Condición 2: Bp1 Bp2 Bp3

Recubrimiento: 500 ng 100 ng 100 ng

Número de fagos scFv utilizados para el turno de selección: 1,6E+11 1,2E+11 1,8E+11

% de mLFB112/huLFB112: 0/100 1/99 30/70

Condición 3: Bp1 Bp2 Bp3

Recubrimiento: 500 ng 100 ng koff 100 ng koff

Número de fagos scFv utilizados para el turno de selección: 1,6E+11 1,8E+11 1,6E+11

Número de fagos scFv recuperados al final del turno de selección: 3,3E+5 6,7E+5 2,0E+6

% de mLFB 112/huLFB 112: 0/100 1/99 30/70

A la vista de estos resultados, parece que la condición 1 (cantidad fija de diana) tiene un mejor rendimiento para amplificar el clon de mejor afinidad, el mLFB112 (9 clones de 10). Utilizar una cantidad más baja de diana (100ng/pocillo) parece menos apropiado; solamente 3 clones de 10 después de 3 turnos de selección corresponden al clon de mejor afinidad. Al igual que para la condición 3 basada en un tiempo de incubación largo (“koff selection”) que no permite amplificar suficientemente el clon mLFB1 12. Además, el número de fagos recuperados para esta última condición al final de los 3 turnos es poco elevado (2x104 fagos). Por lo tanto, parecía juicioso utilizar las condiciones 2 y 3 para una mezcla más diversificada de clones como es el caso para el banco construido en el ámbito de este proyecto.

3.3. Cribado primario (turnos de selección).

Tras el desarrollo de las condiciones de cribado, se decidió por lo tanto utilizar 2 condiciones de cribado:

Cond. A: 1 µg/pocillo de diana durante 4 turnos de selección, después 2 turnos con 0,5µg/pocillo

Cond. B: 0.5µg/pocillo durante 6 turnos de selección.

Los resultados obtenidos se presentan en la tabla V siguiente.

Tabla V: Resultados de los turnos de selección.

Condiciones A: Turno de Turno de Turno de Turno de Turno de Turno de

selección 1: selección 2 selección 3 selección 4 selección 5 selección 6

Recubrimiento: 1µg 1µg 1µg 1µg 0,5µg 0,5µg

Número: de fagos scFv 4,8E+11 8,0E+11 2,8E+11 8,0E+11 4,5E+11 6,0E+11

utilizados para el turno de

selección

Número: de fagos scFv 2,0E+5 1,3E+5 2,4E+5 7,5E+5 7,3E+5 1,4E+5

recuperados: al final del

turno de selección

Condiciones B: Turno de Turno de Turno de Turno de Turno de Turno de

Recubrimiento: 0,5µg 0,5µg 0,5µg 0,5µg 0,5µg 0,5µg

Número: de fagos scFv 4,8E+11 8,0E+11 3,2E+11 6,4E+11 7,5E+10 4,2E+11

utilizados para el turno de

selección

Número: de fagos scFv 2,0E+5 8,6E+5 5,4E+5 1,3E+5 2,6E+5 6,5E+5

recuperados: al final del

turno de selección

Al final de estas selecciones, los clones obtenidos se secuenciaron a partir del 3º turno de selección. Los resultados obtenidos se compararon con los obtenidos para el banco de partida (tabla VI).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla VI: Resultados de las secuenciaciones.

Banco: Turno de Turno de Turno de Turno de

selección 3: selección 4 selección 5 selección 6

Número de secuencias: 295 87 168 114 98

% de secuencias con 39% 26% 26% 35% 20% aminoácidos mutados % de secuencias con cambio del 14% 13% 27% 32% 49% marco de lectura % de secuencias (en peso) (+ 47% 61% 48% 34% 32% mutación silenciosa) Banco: banco inicial procedente de la mezcla de los 4 bancos R20U, 45M, R20US, R20Ueta.

El análisis de estas secuenciaciones reveló la presencia de clones redundantes. En total, sobre el conjunto de los clones secuenciados, se obtuvieron 113 clones mutados únicos.

3.4. Cribado secundario (ELISA-fagos).

El cribado secundario consiste en analizar los clones seleccionados al final del cribado primario de manera individual. Para ello, los 113 clones mutados únicos se inocularon en placa de cultivo (96 pocillos-1,2ml).

Después de la producción de las partículas fágicas, los sobrenadantes de cultivo que contienen los fagos-scFv se utilizaron para efectuar un ensayo de unión ELISA. La unión de los clones mutados se evaluó a dos diluciones (½ y ¼ de los sobrenadantes que contienen los scFv-fagos). Los clones murinos (mLFB112) y humanizados (huLFB112) construidos bajo el formato scFv-fagos se utilizaron como referencias sobre cada una de las placas de ensayo. Cada uno de los clones mutados se ensayó 2 veces como mínimo.

Los resultados se expresan en forma de relación, es decir las diferencias de unión (DO405nm) entre los clones mutados y las referencias huLFB112 y mLFB1 12.

-Relación con respecto al scFv humanizado huLFB112 (Relación / huLFB112)

-Relación con respecto al scFv murino mLFB1 12 (Relación / mLFB112)

Sobre los 113 clones ensayados, sólo los mejores clones se presentan a continuación.

La tabla VII siguiente presenta los diferentes clones obtenidos y las mutaciones presentes (posición y sustitución de los aminoácidos) en la cadena ligera y/o pesada, así como la afinidad de unión de clones determinada por Elisa.

Los valores indicados después de las sustituciones corresponden a las modificaciones de los valores del índice hidropático en función de las diferentes sustituciones.

Los valores de afinidad de unión corresponden a la relación de la afinidad de unión del anticuerpo de la invención para el receptor AMHRR-II sobre la afinidad de unión del anticuerpo humanizado 12G4 no mutado o la afinidad de unión del anticuerpo quimérico 12G4 no mutado.

Los valores de afinidad de unión dados son el resultado de la media de al menos cuatro valores y las cifras entre paréntesis corresponden a la desviación típica.

La tabla VII muestra que, con las sustituciones efectuadas, a pesar de que estas conducen a una variación importante del índice hidropático, la afinidad de unión del anticuerpo para el receptor es muy superior a la del anticuerpo humanizado 12G4 no mutado y al menos igual a la del anticuerpo quimérico 12G4 no mutado: relación AC invención/12G4 quimérico superior o igual a 1.

El anticuerpo humanizado mutado presenta una afinidad restablecida, incluso superior a la del anticuerpo quimérico

o murino.

Tabla VII

Numeración
Numeración: FIJACIÓN DE LA DIANA AMHRII-Fc DETERMINADA POR ELISA

VH: VL Relación AC invención/12G4 humanizado Relación AC invención/12G4 quimérico

clon: 1 -115 131 -236

4C_35: L45P +3,8_-1,6 E184K -3,5_-3,9 4,3 (0,5) 1,9 0,4)

5B_81: L45P +3,8_-1,6 - 3,5 (0,9) 1,6 (0,3)

6B_78: - E184K -3,5_-3,9 NT NT

3C_23: Q3R -3,5_-4,5 I177T +4,5_-0,7 2,6(1,1) 1,2 (0,3)

S179P -0,8_-1,6

3C_23K: Q3R -3,5_-4,5 I177T +4,5_-0,7 NT NT

S179P -0,8_-1,6

E184K -3,5_-3,9

5B_42: T74A -0,7_1,8 S179P -0,8_-1,6 NT NT

4F_196: Q3E -3,5_-3,5 - 3,0 (1,0) 1,5 (0,3)

Q62R -3,5_-4,5

E89D -3,5_-3,5

6B_87: Q1E -3,5_-3,5 - 2,1 (0,2) 1,0 (0,1)

A24V +1,8_+4,2

4F_169: Q6E -3,5_-3,5 - 2,0 (0,7) 1,0 (0,2)

T58A -0,7_+1,8

3D_74: - S158P -0,8_-1,6 2 (0,7) 0,8 (0,2)

4C_44: R87G -3,9_-0,4 NT NT

5A_66: V67M +4,2_+1,9 F212S +2,8_-0,8 2,2 (0,4) 1,1 (0,1)

6B_14: S31G -0,8_-0,4 - 2,6 0,3) 1,1 (0,2)

Q39E -3,5_-3,5

4C_47: Q3E -3,5_-3,5 - NT NT

S88P -0,8_-1,6

4E_153: D56N -3,5_-3,5 - 2,0 (0,4) 1,0 (0,1)

I70N +4,5_-3,5

F102S +2,8_-0,8

3C_24: - E184G -3,5_-0,4 NT NT

5B_18: Q3E -3,5_-3,5 - 1,8 (0,2) 0,9 (0,2)

A9T +1,8_-0,7

A103T +1,8_-0,7

5B_84: Q1E -3,5_-3,5 - NT NT

A24G +1,8_-0,4

6B_86: Q3E -3,5_-3,5 G179D -0,4_-3,5 NT NT

4D_91: Q1E -3,5_-3,5 - 1,7 (0,1) 0,8 (0,2)

V11A +4,2_+1,8

6B_76: A40V +1,8_+4,2 S179P -0,8_-1,6 1,7 (0,1) 0,8 (0,2)

5A_28: - Y178H -1,3_-3,2 1,6 (0,6) 0,8 (0,2)

S179P -0,8_-1,6

3D_57: A76T +1,8_-0,7 - NT NT

A79T +1,8_-0,7

6A_80: A24V +1,8_+4,2 - 1,5 (0,2) 1,3 (0,1)

Q62E -3,5_-3,5

5B_67: K12R -3,9_-4,5 - NT NT

5B_86: S31G -0,8_-0,4 I132T +4,5_-0,7 NT NT

Q39E -3,5_-3,5: A143T +1,8_-0,7

5A_73: A24V +1,8_+4,2 - NT NT

5B_33: A76T +1,8_-0,7 - NT NT

3B_71: S114T -0,8_-0,7 S179P -0,8_-1,6 NT NT

3B_87: - L175Q +3,8_-3,5 NT NT

3D_68: - T150A -0,7_1,8 NT NT

4E_112: L110P +3,8_-1,6 V187A +4,2_+1,8 NT NT

S192T -0,8_-0,7

5B_54: A24T +1,8_-0,7 - NT NT

6A_18: K13R -3,9_-4,5 - NT NT

3C_40: - P224A -1,6_+1,8 NT NT

5A_83: Q62E -3,5_-3,5 - NT NT

S179P -0,8_-1,6

A79T +1,8_-0,7

5A_19: Q3E -3,5_-3,5 S182F -0,8_+2,8 NT NT

3A_29: V20A +4,2_+1,8 - NT NT

(Q1E, Q3E, Q6E, K19E, Q39E y Q62E: codón TAG suprimido, traducido en E en las bacterias E. Coli XL1-blue utilizadas) NT: no ensayado

Ejemplo 4: Comparación de los clones que presentan una mejora de afinidad

5

15

25

35

45

55

65

Los clones positivos 3C_23K, 3C_23 y 6B_78 se compararon entre sí por determinación de la afinidad de la unión del anticuerpo al receptor AMHR-II en un ensayo Elisa clásico obtenido con unos anticuerpos mutados (Fab) solubles según la invención.

Los resultados obtenidos se presentan en la figura 17.

Ejemplo 5: Establecimiento de la línea transfectada AMHRII cov434-AMHRII

La línea cov434-AMHRII se generó por transfección de un plásmido que expresa el ADNc que codifica AMHRII en la línea de tumor de la granulosa cov434 (van den Berg-Bakker, C., et al., 1993. Establishment and characterization of 7 ovarian carcinoma cell lines and one granulosa tumor cell line: Growth features and cytogenetics. International Journal of Cancer 53:613; Zhang, H. et al., 2000. Characterization of an immortalized human granulosa cell line (COV434). Molecular Human Reproduction 6:146) que no expresa AMHRII.

Brevemente, el ADNc de AMHRII se clonó en el plásmido comercial pIRES-neo (Clontech -Takara Bio Europe, Francia; referencia 6060-1). Gracias a la secuencia IRES, AMHRII y neo se expresan bajo el control de un mismo promotor CMV (Figura 26).

Esta construcción se transfectó de manera estable en la línea de cáncer de la granulosa cov434 (agente de transfección Fugene, Roche). Los transfectantes obtenidos se criban después por citometría y por transferencia western para la expresión del receptor AMHRII. Después de la sub-clonación, el clon celular cov434-AMHRII-1F3, que contiene un vector de tipo pIRES-neo, se retuvo para los estudios in vitro e in vivo. Esta línea se denomina a continuación cov434-AMHRII.

Ejemplo 6: Establecimiento de líneas primarias a partir de líquido de ascitis y de biopsia de pacientes que padecen cáncer epitelial ovárico

Las principales etapas de establecimiento de las líneas derivadas de extracciones de ascitis (línea Asc 1) son las siguientes:

-D0: Recepción del líquido de ascitis y cultivo inmediato de la extracción. La extracción se centrifuga durante 5 min a 1000 rpm y el residuo se recoge en 2 ml de medio para inoculación de un frasco T25 (medio RPMI 10%FCS).

-D2 -D46: Cultivo con observación microscópica regular. Se añade un medio nuevo regularmente durante este periodo. Se efectúan también unos lavados PBS cada 2 días a fin de eliminar los hematíes y los fibroblastos contaminantes.

-alrededor de D13, todas las células contaminantes han desaparecido y se observa un tapiz confluyente de células todavía heterogéneo (dos tipos diferentes).

-D46: Trasplante: a D46, se observa un tapiz homogéneo de células tumorales y las células se lavan entonces y se trasplantan por raspado para ser re-inoculadas en dos frascos T75.

-D61: Evaluación de la expresión AMHRII por FACS: después del lavado PBS, las células se despegan con un raspador y se analizan por citometría de flujo (marcado AcM 12G4 10µg/ml, AcII anti-ratón FITC). La realización de los bancos se efectúa en esta etapa. La línea AMHRII positiva se mantiene en cultivo para 10 días suplementarios a fin de confirmar la expresión del receptor AMHRII.

-D71: Confirmación de la expresión AMHRII por FACS.

Las líneas así establecidas se mantienen en medio RPMI 10%FCS, con un paso por semana (dilución 1/15).

En el caso de biopsias (línea META 2815), el tumor primario se mantiene en primer lugar sobre ratones desnudos (injertos de la extracción en el espacio intercapsular, 3 pasos sucesivos sobre ratones), después se extrae el tumor y se dilacera antes de recoger en el medio de cultivo. Se aplica después un protocolo idéntico al de las extracciones de ascitis.

Ejemplo 7: Evaluación de la afinidad de los diferentes anticuerpos humanizados candidatos

Este estudio se ha realizado sobre el anticuerpo murino 12G4 de origen, así como sobre los anticuerpos humanizados candidatos 3C23, 6B78 y 3C23K (de secuencia respectiva 3C_23, 6B_78 y 3C_23K) producidos en YB2/0. La afinidad de estos anticuerpos se ha evaluado sobre las células cov434-AMHRII.

Brevemente, la determinación del KD se ha efectuado según el método de saturación, mediante la adición de dosis crecientes de anticuerpo radiomarcado a un número constante de células cov434-AMHRII. Las células (1x106 en 50

5

15

25

35

45

55

µl PBS/BSA 0,5%) se incubaron (volumen final 150 µl) durante 1h a 4°C en presencia de dosis crecientes de anticuerpos previamente marcados con yodo 125 (125I). Para cada anticuerpo, se han efectuado unas diluciones de 4 en 4 en PBS/BSA 0,5% a partir de las soluciones de anticuerpo marcado y no marcado (84,4 µg/ml). La fijación no específica se evaluó por la incubación de las células en presencia de un exceso 100 veces molar de anticuerpo no marcado.

Después de la incubación, las muestras se congelaron en nitrógeno líquido, después se analizaron en un contador gamma. La fijación específica se determinó por sustracción de la fijación obtenida en presencia del exceso de anticuerpo no marcado.

El análisis Scatchard, realizado sobre el programa PRISM, ha permitido determinar las constantes de afinidades presentadas en la tabla VIII.

Tabla VIII: Constante de disociación (KD) de los anticuerpos anti-AMHRII

12G4 murino: 3C23 6B78 3C23K

KD (nM): 15,41 +/-0,97 7,33 +/-0,44 6,68 +/-0,21 5,30 +/-0,38

Según este estudio, parece que el anticuerpo anti-AMHRII humanizado 3C23K posee la mejor afinidad (KD = 5.3 nM) comparado con otros dos anticuerpos candidatos 6B78 y 3C23. El anticuerpo 3C23K presenta también una afinidad aproximadamente tres veces superior a la del anticuerpo murino de origen 12G4 (KD = 15,4 nM).

Ejemplo 8: Comparación de la actividad ADCC de los anticuerpos de la invención frente a la actividad ADCC del anticuerpo 12G4 humanizado no mutado.

1 MATERIAL y MÉTODOS

1.1 Principio de los métodos ADCC

Las células dianas ASC1 procedentes de pacientes son adherentes y se preparan la víspera del ensayo. Se despegan mediante tripsina y se incuban en EMS + 5%SVF en placa de fondo plano a razón de 50 µl por pocillo a la concentración de 6 x 105 células/ml. Las placas se incuban durante la noche a 37°C, 7% CO2.

Al día siguiente, las células han adherido en el fondo del pocillo. El sobrenadante se aspira y el volumen de tampón necesario por pocillo se añade para realizar el ensayo en presencia de NK y de anticuerpo.

Las células asesinas (células NK) se purifican previamente mediante la técnica de depleción negativa desarrollada por la compañía Miltenyi (Miltenyi Biotec -NK cell isolation kit human ref. 130-092-657), a partir de sangre periférica de donantes sanos. La técnica ADCC consiste en incubar las células NK con las células dianas ASC1 en presencia de diferentes concentraciones del anticuerpo anti-AMHRII humanizados (0,005 a 5000 ng/ml) con una relación E/T de 10/1. Después de 4 horas de incubación, se mide la actividad citotóxica inducida por los anticuerpos anti-AMHRII por colorimetría determinando en los sobrenadantes una enzima intracelular denominada lactato deshidrogenasa (LDH) liberada por las células dianas lisadas (Roche Diagnósticos -Cytotoxicity Détection Kit LDH ref. 11644793001).

1.2 Elementos de estudio

-Anticuerpo anti-AMHRII:

∘: 829 10 054, YB2/0 humanizado, R901 3C23K

∘: 829 10 050, YB2/0 humanizado, R901 3C23

∘: 829 10 051, YB2/0 humanizado, R901 6B78

∘: 632 07 107, anti-AMHRII 12G4 humanizado no mutado -Células ASC1 informe de cultivo 871 10 063 Los resultados se presentan en la figura 25. La tabla IX presenta los datos brutos que corresponden a la Figura 25.

Tabla IX:

% de lisis (ADC 1193 11 081)

Ac ng/ml: Ac ng/ml (Log) 829 10 050 3C23 YB20 829 10051 6B78 YB20 829 10 054 3C23K YB20 632 07 107 Anti AMHRII hum 1st

0,001: -3,000 0 0 0 0

0,005: -2,301 8 14 8 18

0,05: -1,301 9 5 10 2

0,5: -0,301 13 3 26 0

5: 0,699 35 28 51 7

50: 1,699 46 42 67 24

500: 2,699 52 48 79 50

5000: 3,699 63 53 75 50

La tabla X presenta los Emax y EC50 obtenidos con los diferentes anticuerpos. Tabla X

82910 050 3C23 YB20: 82910 051 6B78 YB20 829 10 054 3C23K YB20 632 07 107 Anti AMHRII hum 1st

Emax (% de lisis): 65,55 51,89 79,02 52,40

EC50 (ng/ml): 6,298 5,383 1,704 52,35

Ejemplo 9: Comparación de la actividad ADCC de los anticuerpos de la invención frente al anticuerpo 12G4 10 quimérico

Se ha evaluado la actividad ADCC del anticuerpo candidato humanizado 3C_23K (ha12G4 de secuencia 3C_23K: mutaciones VHQ3R (SEC ID nº 82 (sin líder) o SEC ID nº 84 (con líder)), y VLI177T/S179P/E184K (SEC ID nº 86 (sin líder), o SEC ID nº 88 (con líder)).

15 Brevemente, las células efectoras (células asesinas NK por “Natural Killer”) se purifican previamente mediante la técnica de depleción negativa desarrollada por la compañía Miltenyi (Miltenyi Biotec -NK cell isolation kit human ref. 130-092-657), a partir de sangre periférica de donantes sanos, y esto después de una primera etapa de purificación de las células mononucleadas sobre Ficoll.

20 El ensayo in vitro de actividad ADCC consiste en incubar las células NK con las células diana (líneas cov434-AMHRII, Asc 1 y META 2815), en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpo anti-AMHRII (anticuerpo quimérico ch12G4, anticuerpos humanizados 3C_23K-YB2/0, producido en YB2/0, y 3C_23K-CHO, producido en CHO). La relación efector/diana aplicada es de 15/1. Los anticuerpos se diluyen en medio de cultivo a

25 concentraciones que van de 0,005 a 5000 ng/ml.

Después de 4 horas de incubación, la actividad citotóxica inducida por los anticuerpos anti-AMHRII se mide por colorimetría determinando en los sobrenadantes una enzima intracelular denominada lactato deshidrogenasa (LDH) liberada por las células dianas lisadas (Roche Diagnósticos -Cytotoxicity Détection Kit LDH ref. 11644793001).

30 El porcentaje de lisis se calcula según la fórmula siguiente:

% lisis = [(ER – SR) / (100 –SR)] – [(NC – SR) / (100 – SR)

35 con: ER = liberación de LDH en presencia de anticuerpos y de células NK

SR = liberación de LDH espontánea de la célula diana sola

NC = liberación de LDH en presencia de células NK y ausencia de anticuerpo. 40 Los resultados se expresan en porcentaje de lisis en función de la cantidad de anticuerpos.

Los valores Emax y EC50 se calculan con la ayuda del programa PRISM.

45 Los resultados obtenidos sobre la línea cov434-AMHRII se presentan en la figura 27. La baja actividad del anticuerpo 3C_23K-CHO no permite obtener un plano en las condiciones del ensayo. A fin de comparar la eficacia de los anticuerpos, se efectúa en este caso el cálculo de los 50% relativos, que representa la cantidad de anticuerpos 3C_23K-CHO requerida para alcanzar el 50% del plano del anticuerpo quimérico (50% relativo = 1). Según esta evaluación, el anticuerpo humanizado que posee la mejor actividad ADCC sobre la línea COV434

5

15

25

35

45

55

65

AMRHII es el anticuerpo 3C_23K (50% relativo: 0,.84) producido en YB2/0. Los anticuerpos humanizados de secuencia 3C_23 y 6B_78 poseen un valor del 50% relativo igual a 6,41 y 36,92, respectivamente.

Los resultados obtenidos sobre la línea Asc 1 se presentan en la figura 28. El anticuerpo 3C_23K-YB2/0 posee una actividad citotóxica dependiente de la dosis de las células Asc 1 con un EC50 estimado a 2,24 ng/ml. La baja actividad del anticuerpo 3C _23K-CHO no permite obtener un plano en las condiciones del ensayo. A fin de comparar la eficacia de los dos anticuerpos, se efectúa en este caso el cálculo de los 50% relativos, que representa la cantidad de anticuerpos 3C_23K-CHO requerida para alcanzar el 50% del plano del anticuerpo 3C_23K-YB2/0 (50% relativo = 1). Según esta evaluación, la actividad citotóxica del anticuerpo 3C_23K-YB2/0 es de aproximadamente 40 veces superior a la del anticuerpo producido en CHO (50% relativo = 39,4).

De manera similar, los resultados presentados en la figura 29 muestran que los anticuerpos 3C_23K-YB2/0 y 3C_23K-CHO inducen a una lisis dependiente de la dosis de las células META 2815. La actividad citotóxica del anticuerpo 3C_23K-YB2/0 (EC50 = 30,5ng/ml) es aproximadamente 146 veces superior a la del anticuerpo 3C_23K-CHO (EC50 = 466,9 ng/ml).

El conjunto de estos resultaos indican que los anticuerpos anti-AMHRII 3C_23K producidos en YB2/0 tienen la capacité de inducir a una lisis de las células que expresa el antígeno AMHRII. La diferencia de EC50 entre los anticuerpos anti-AMHRII-YB2/0 y anti-AMHRII-CHO sugiere una ventaja particular al anticuerpo anti-AMHRII-YB2/0 en condiciones de baja expresión antigénica, o de baja penetración del anticuerpo en el tumor.

Ejemplo 10: Estudios de proliferación celular

La inhibición de la proliferación celular se ha puesto en evidencia midiendo el crecimiento a lo largo del tiempo en presencia o no de los anticuerpos anti-AMHRII ensayados.

Brevemente, las células dianas (cov434-AMHRII, Asc 1, META2815) se cultivan en placas P6 (1 x 105 células/pocillo) durante 72h a 37°C, en presencia de los anticuerpos anti-AMHRII (10µg/ml) expresados en CHO o YB2/0, y esto con o sin agente de reticulación (AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fc Fragment Spécifié ref.: 109-006-008, Jackson Immunoresearch, Francia). Las células se tratan mediante tripsina durante 5 minutos, después contadas en CEDEX, un contador de células automáticas basado en la viabilidad celular (azul tripano). Se establece un control positivo de inhibición de la proliferación en presencia de 1µg/ml de colchicina (Ref.: C3915, Sigma-Aldrich, Francia). Se establece un control negativo en presencia de un anticuerpo no relevante (anti-P24). Todas las diluciones se realizan en medio de cultivo (RPMI, 10% SVF). Los resultados se expresan en porcentaje de proliferación, el valor de 100% corresponde a la proliferación de las células observada en ausencia de anticuerpos.

Los resultados obtenidos con la línea cov434-AMHRII se presentan en la figura 30.

Según estas observaciones, los anticuerpos 3C_23K-YB2/0 y 3C_23K-CHO indicen aproximadamente el 40% de inhibición de la proliferación celular de las células cov434-AMHRII, en presencia de un agente de reticulación (CK). Este efecto citoplástico no se observa en presencia de un anticuerpo no relevante (anticuerpo p24) mientras que el control positivo colchicina (10 µg/ml) induce el 88% de inhibición.

De manera similar, los resultados presentados en la figura 31 muestran que los anticuerpos 3C_23K-YB2/0 y 3C_23K-CHO inducen aproximadamente al 40% de inhibición de la proliferación celular sobre la línea META 2815 en presencia de un agente de reticulación (CK).

Esta inhibición de proliferación celular podría ser la consecuencia de una señalización celular inducida por los anticuerpos anti-AMHRII sobre las líneas cov434-AMHRII y META 2815.

Ejemplo 11: Efecto in vivo del anticuerpo 3C 23K-YB2/0 sobre unos tumores COV434-AMHRII

Se ha evaluado la eficacia antitumoral del anticuerpo 3C_23K-YB2/0 en tratamiento tardío sobre unos ratones hembras swiss desnudos después de la inyección subcutánea (s.c.) de células tumorales COV434-AMHRII. Se han realizado las inyecciones (iny.) intraperitoneal (i.p.) de anticuerpo a 2-3 días de intervalo a una dosis de 10 mg/kg/inyección para un total de 18 inyecciones. El grupo tratado por el anticuerpo 3C_23K-YB2/0 se ha comparado con el grupo tratado por el vehículo (PBS).

-Material y métodos

Se utilizaron unos ratones hembras swiss desnudos (Harlan). En el día 0 del experimento, los ratones han recibido una inyección subcutánea de 7.106 células tumorales COV434-AMHRII mezcladas con matrigel (relación 1:1). Los animales se trataron después por inyección i.p. de PBS o 3C_23K-YB2/0 con 10 mg/kg/iny. a partir del día 16 (volumen tumoral comprendido entre 84-270 mm3, 3 inyecciones por semana durante 6 semanas (18 inyecciones totales).

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Tabla XIV

Día de medición: Anova Kruskall wallis

Relación-F: Valor P Sig. Ensayo Valor P Sig.

12: 0,02 0,8817 0,0995 0,7523

17: 29,19 0,0001 * 11,3108 0,0007 *

24: 103,56 0 * 11,2941 0,0007 *

27: 32,08 0,0001 * 11,3108 0,0007 *

31: 33,37 0 * 11,3274 0,0007 *

35: 57,97 0 * 10,5788 0,0011 *

Ejemplo 13: Efecto in vivo del anticuerpo 3C_23K-YB2/0 sobre unos tumores Meta2815

5

Se ha evaluado la eficacia antitumoral del anticuerpo 3C_23K-YB2/0 en tratamiento tardío sobre unos ratones hembras swiss desnudos después de la inyección sub-cutánea (s.c.) de células tumorales Meta 2815. Las inyecciones (iny) intraperitoneal (i.p.) de anticuerpo se han realizado a 2-3 días de intervalo a una dosis de 10

10 mg/kg/inyección para un total de 18 inyecciones. El grupo tratado por el anticuerpo 3C_23K-YB2/0 se ha comparado con el grupo tratado por el vehículo (PBS).

-Material y métodos

15 Se utilizaron unos ratones hembras swiss desnudos (Harlan). En el día 0 del experimento, los ratones han recibido una inyección sub-cutánea de 8.106 células tumorales Meta2815. Los animales fueron después tratados por inyección i.p. de PBS o 3C_23K-YB2/0 con 10 mg/kg/iny. a partir del día 33 (volumen tumoral comprendido entre 45240mm3, 3 inyecciones por semana durante 6 semanas (18 inyecciones totales).

20 La medición del volumen tumoral se ha realizado 2 a 3 veces por semana. El volumen tumoral (TV) se ha calculado utilizando la fórmula siguiente:

TV (mm3) = (longitud x anchura x altura)/2

25 en la que la longitud corresponde al diámetro más ancho del tumor y la anchura al diámetro más pequeño del tumor.

Las curvas de crecimiento tumoral se han trazado utilizando la media de los volúmenes tumorales (MTV). Los animales fueron sacrificados cuando el volumen individual del tumor alcanzaba 2000 mm3. En cada uno de los grupos, les curvas se detuvieron cuando se había sacrificado el 30% de los animales del grupo.

30 La inhibición del crecimiento tumoral (T/C) definida como la relación del volumen tumoral mediano de los grupos tratados con respecto al grupo control tratado vehículo, se ha calculado de la siguiente manera: T/C = (TV media del grupo tratado/TV media del grupo vehículo) x 100

35 -T/C superior al 42%, el producto se considera como ineficaz.

-T/C entre el 42% y el 10%, el producto presenta un efecto anti-tumoral

-T/C inferior al 10%, el producto es realmente eficaz.

40 Las diferentes estadísticas entre los diferentes grupos se obtuvieron con el ensayo de Kruskal-Wallis, utilizando la comparación ANOVA (programa Statgraphics 34ersión34n XV). Se consideraron las diferencias como significativas si P<0,05. Una prueba logrank, que permite comparar los parámetros de supervivencia del estudio, también se ha realizado vía ANOVA (programa Statgraphics 34ersión34n XV). Se consideraron las diferencias como significativas

45 si P<0,05.

-Resultados

El anticuerpo 3C_23K-YB2/0 muestra una actividad anti-tumoral ya que se observa un retraso en el crecimiento 50 tumoral comparativamente al grupo tratado por el vehículo en el modelo Meta2815 (figuras 34ª y 34B).

La comparación estadística de los volúmenes tumorales en cada punto de medición, una vez el tratamiento iniciado, muestra que el anticuerpo 3C_23K-YB2/0 retrasa el crecimiento tumoral (Kruskal-Wallis, via ANOVA). La relación T/C calculada entre los grupos tratados por el 3C_23K-YB2/0 y vehículo muestra una diferencia significativa en

55 todos los puntos de medición también una vez iniciado el tratamiento. La prueba logrank muestra también que en término de supervivencia, el grupo tratado 3C_23K-YB2/0 es estadísticamente diferente del grupo tratado por el vehículo.

Claims

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