ES2660018T3 - Plantas resistentes a plagas de insectos - Google Patents

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ES2660018T3 ES12722309.7T ES12722309T ES2660018T3 ES 2660018 T3 ES2660018 T3 ES 2660018T3 ES 12722309 T ES12722309 T ES 12722309T ES 2660018 T3 ES2660018 T3 ES 2660018T3
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Abstract

Una planta transgénica, o material reproductor o de propagación para una planta transgénica o una célula vegetal transgénica cultivada, que expresa o es capaz de expresar al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga, en la que el ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador en la que el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos que es al menos un 85% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.

Description

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DESCRIPCION
Plantas resistentes a plagas de insectos Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, al control genético de infestación por parte de especies de plagas de insectos, particularmente a la prevención y/o el control de infestación por parte de plagas de plantas. Más específicamente, la invención se refiere a la regulación por disminución de la expresión de genes diana en especies de plagas de insectos por parte de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) interferente. También se proporcionan plantas transgénicas que (i) expresan o son capaces de expresar ARN interferentes de la invención y (ii) son resistentes a la infestación por parte de especies de plagas de insectos.
Antecedentes de la invención
Existe abundancia de especies de plagas de insectos que pueden infectar o infestar una amplia variedad de ambientes y organismos hospedadores. Las plagas de insectos incluyen una variedad de especies de los órdenes de insectos Hemiptera (chinches de campo), Coleóptera (escarabajos), Siphonaptera (pulgas), Dichyoptera (cucarachas y mantis), Lepidoptera (polillas y mariposas), Orthoptera (por ejemplo, langostas) y Diptera (moscas). La infestación por parte de plagas puede dar lugar a daños significativos. Las plagas de insectos que infestan especies de plantas son particularmente problemáticas en la agricultura, ya que pueden causar daños serios a cultivos y reducir significativamente los rendimientos de las plantas. Una amplia gama de diferentes tipos de plantas son susceptibles a la infestación por parte de plagas, incluyendo cultivos comerciales tales como arroz, algodón, soja, patata y maíz.
Tradicionalmente, la infestación con plagas de insectos se ha prevenido o controlado mediante el uso de plaguicidas químicos. Sin embargo, estos químicos no siempre son adecuados para su uso en el tratamiento de cultivos, ya que pueden ser tóxicos para otras especies y pueden provocar daño significativo al medio ambiente. En las décadas más recientes, los investigadores han desarrollado métodos más ecológicos para controlar la infestación por parte de plagas. Por ejemplo, se han utilizado microorganismos tales como las bacterias Bacillus thuringiensis que expresan de forma natural proteínas tóxicas para plagas de insectos. Los científicos han aislado los genes que codifican estas proteínas insecticidas y las han utilizado para generar cultivos transgénicos resistentes a plagas de insectos, por ejemplo, plantas de maíz y algodón manipuladas genéticamente para producir proteínas de la familia Cry.
Si bien las toxinas bacterianas han sido sumamente exitosas para controlar ciertos tipos de plagas, no son eficaces contra todas las especies de plagas. Por lo tanto, los investigadores han buscado otras estrategias dirigidas para controlar las plagas y en particular para lograr una interferencia de ARN o "silenciamiento génico" como medio para controlar plagas a nivel genético.
La interferencia de ARN "iARN" es un proceso mediante el cual la expresión de genes en el contexto de una célula o todo un organismo se regula por disminución con especificidad de secuencia. La iARN actualmente es una técnica bien establecida en la técnica de inhibición o regulación por disminución de la expresión de genes en una amplia gama de organismos, incluyendo organismos de plagas tales como hongos, nematodos e insectos. Además, estudios previos han demostrado que la regulación por disminución de genes diana en especies de plagas de insectos puede utilizarse como medio para controlar la infestación por parte de plagas.
El documento WO2007/074405 describe métodos para inhibir la expresión de genes diana en plagas de invertebrados, incluyendo el escarabajo de la patata de Colorado. Además, el documento WO2009/091864 describe composiciones y métodos para la supresión de genes diana de especies de plagas de insectos, incluyendo plagas del género Lygus.
Si bien el uso de la iARN para regular por disminución la expresión de genes en especies de plagas es bien conocido en la técnica, el éxito de esta técnica como medida para controlar las plagas depende de la selección de los genes diana más apropiados, concretamente aquellos en los que la pérdida de función provoca una alteración significativa en un proceso biológico esencial y/o la muerte del organismo. La presente invención, por tanto, está dirigida a la regulación por disminución de genes diana particulares en plagas de insectos como medio para alcanzar una prevención y/o control más eficaces de la infestación por parte de plagas de insectos, particularmente de plantas.
Sumario de la invención
Los autores de la presente invención buscaron identificar medios mejorados para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos utilizando estrategias genéticas. En particular, investigaron el uso de la iARN para regular por disminución genes de tal forma que se altere la capacidad de la plaga de insectos de sobrevivir, crecer, perdurar a lo largo de las diferentes etapas del ciclo vital de los insectos (por ejemplo, mediante la metamorfosis de crisálida a adulto), colonizar ambientes específicos y/o infestar organismos hospedadores y así limitar el daño causado por la plaga.
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Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una planta transgénica, o material reproductor o de propagación para una planta transgénica o una célula vegetal transgénica cultivada, que expresa o es capaz de expresar al menos un ácido ribonucleico (ARN o ARN bicatenario) interferente que funciona tras la captación por una especie de plaga de insectos regulando por disminución un gen diana en dicha plaga de insectos, donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador donde el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos que es al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189.
En un aspecto particular de la invención, las moléculas de ARN interferente expresadas por las plantas de la presente invención comprenden al menos una región bicatenaria, típicamente el elemento silenciador del ARN interferente, que comprende una hebra de ARN codificante hibridada mediante formación de pares de bases complementarias a una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana.
En una realización, la presente invención se refiere a una planta transgénica, o material reproductor o de propagación para una planta transgénica o una célula vegetal transgénica cultivada que expresa o es capaz de expresar una molécula de ARN interferente que comprende al menos una región bicatenaria, típicamente el elemento silenciador de la molécula de ARN interferente, que comprende una hebra de ARN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias con una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 nucleótidos contiguos, que es al menos un 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada dentro del trascrito de ARN de un gen diana del complejo de troponina/miofilamento.
En una realización, el gen diana codifica una proteína wings up A - de alas levantadas - (troponina I) de insecto (por ejemplo, un ortólogo de insecto de la proteína CG7178 Dm), estando representado dicho gen diana por las SEQ ID NO: 1 y 2. En una realización preferida, el ortólogo de insecto tiene al menos un 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID NO: 79.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido que comprende al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 y donde dicho polinucleótido es no más largo de 10 000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.
En un aspecto particular de la divulgación, el polinucleótido aislado es parte de una molécula de ARN interferente, típicamente parte del elemento silenciador, que comprende al menos una región bicatenaria que comprende una hebra de ARN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias a una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada dentro del transcrito de ARN del gen diana. Más particularmente, el polinucleótido aislado se clona en una construcción de ADN en una orientación codificante y no codificante de forma tal que al transcribirse el polinucleótido codificante y no codificante se forma una molécula de ARNbc, que funciona tras la captación por parte de una plaga inhibiendo o regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que se clona en una construcción de ADN en una orientación codificante y no codificante de modo que tras la transcripción del polinucleótido codificante y no codificante se forme una molécula de ARNbc, que funciona tras la captación por un insecto inhibiendo o regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro del complejo de troponina/miofilamento.
En un aspecto, el gen diana codifica una proteína wings up A (troponina I) de insecto (por ejemplo, un ortólogo de insecto de la proteína CG7178 Dm), estando representado dicho gen diana por las SEQ ID NO: 1 y 2. En un aspecto preferido, el ortólogo de insecto tiene al menos un 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID NO: 79. De acuerdo con otros aspectos, la presente divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que se clona en una construcción de ADN en una orientación codificante y no codificante de modo que tras la transcripción del polinucleótido codificante y no codificante se forme una molécula de ARNbc, que funciona tras la captación por un insecto inhibiendo o regulando por disminución la expresión de un gen diana que codifica una proteína ribosómica de insecto.
Preferiblemente, los métodos de la invención tienen aplicación práctica en la prevención y/o el control de infestación por parte de plagas de insectos, en particular, control de infestación por parte de plagas de plantas de cultivo tales
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como, aunque sin limitación, algodón, patata, arroz, fresas, alfalfa, soja, tomate, colza, girasol, sorgo, mijo, maíz, berenjena, pimiento y tabaco. Además, el ARN interferente de la invención puede introducirse en las plantas a proteger mediante técnicas de ingeniería genética de rutina.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para generar una planta transgénica resistente a la infestación por parte de una especie de plaga de insectos que comprende:
(a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha especie de plaga de insectos, donde el gen diana
(i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ iD NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean de forma óptima y se comparan, son al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189;
(b) regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada; y
(c) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión del ARN interferente de la construcción de ADN recombinante, siendo dicha planta, por tanto, resistente a dicha plaga en comparación con una planta sin transformar.
En un aspecto adicional, en este documento se proporciona un método para prevenir y/o controlar la infestación por una plaga de insectos en un campo de plantas de cultivo, comprendiendo dicho método expresar en dichas plantas una cantidad eficaz de un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha especie de plaga de insectos, donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador donde el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos que es al menos un 85% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189.
En todos los aspectos de la divulgación, en aspectos preferidos, el gen diana
(i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ iD NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, o que tienen una secuencia de nucleótidos tal que, cuando las dos secuencias se alinean de forma óptima y se comparan, son al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189.
En todos los aspectos de la divulgación, en aspectos preferidos, el gen diana
(i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ iD NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, o que tienen una secuencia de nucleótidos tal que, cuando las dos secuencias se alinean de forma óptima y se comparan, son al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189.
Breve descripción de las Tablas y las Figuras
Tabla 1 Dianas novedosas de Lygus hesperus identificadas de la primera detección.
Tabla 1B Dianas novedosas de Lygus hesperus en la ruta de Lh594.
Tabla 1C Dianas novedosas de Lygus hesperus identificadas de la segunda ronda de detección.
Tabla 2 Secuencias polinucleotídicas de genes diana identificados en Lygus hesperus.
Tabla 3 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en Lygus hesperus.
Tabla 4 ARNbc (hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente) que corresponden a genes diana de Lygus hesperus y cebadores para producir los ARNbc.
Tabla 5 Dianas de Lygus hesperus clasificadas de acuerdo con las curvas de respuesta a dosis (DRC) y comparadas con las dianas de referencia Lh423 y Lh105.
Tabla 6 Dianas de Lygus hesperus de la clasificación de la segunda ronda de detección de acuerdo con las DRC y comparadas con las dianas de referencia Lh423 y Lh594.
Tabla 7 Presentación de las pruebas de patata transgénica que tiene horquillas de Lygus hesperus.
Tabla 8 Secuencia de amplicones para el gen diana y los dos genes constitutivos para qRT-PCR.
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Tabla 9 Secuencias polinucleotídicas de genes diana identificados en el escarabajo de la patata de Colorado (CPB). Tabla 10 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en CPB.
Tabla 11 ARNbc (hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente) que corresponde a genes diana de CPB y cebadores para producir los ARNbc.
Tabla 12 Secuencias polinucleotídicas de genes diana identificados en el saltamontes pardo del arroz (BPH).
Tabla 13 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en BPH.
Tabla 14 ARNbc (hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente) correspondientes a los genes diana de BPH y los cebadores para producir los ARNbc.
Tabla 15 Cebadores utilizados para la amplificación de ADNc de áfidos, basados en la secuencia genómica de pulgón del guisante.
Tabla 16 Secuencias polinucleotídicas de genes diana identificados en áfidos.
Tabla 17 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en áfidos.
Tabla 18 ARNbc (hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente) correspondientes a los genes diana de áfidos y los cebadores para producir los ARNbc.
Tabla 19 Cebadores degenerados utilizados para la amplificación de ADNc de Ld594 de CPB
Tabla 20 Cebadores degenerados utilizados para la amplificación de ADNc de BPH
Tabla 21: Dianas novedosas de Leptinotarsa decemlineata de la detección.
Tabla 22: Diana novedosa identificada de Nilaparvata lugens.
Tabla 23: Dianas novedosas identificadas de Acyrthosiphon pisum.
Figura 1: Segundo ensayo de confirmación de las placas Lh001_009. barras claras: mortalidad en el día 6 a 8. Los clones candidatos se "Lygxxx" y los códigos de nomenclatura de dianas "Lhxxx".
Figura 2: Segundo ensayo de confirmación de las placas Lh010_020. barras claras: mortalidad en el día 6 a 8. Los clones candidatos se "Lygxxx" y los códigos de nomenclatura de dianas "Lhxxx".
Figura 3: Análisis de mortalidad de dianas novedosas de Lygus de las placas Lh001 a Lh009, expresado como % de mortalidad en un periodo de 10 días. Los controles se indican con líneas de puntos. Control positivo: ARNbc de Lh423 (RpL19). Controles negativos: ARNbc de GFP y dieta únicamente (Control).
Figura 4: Análisis de mortalidad de dianas novedosas de Lygus de las placas Lh010 a Lh020, expresado como % de mortalidad en un periodo de 10 días. Los controles se indican con líneas de puntos. Control positivo: Lh423 (RpL19). Controles negativos: GFP y dieta únicamente (Control).
Figura 5 Representación esquemática del vector de expresión de plantas que aloja el casete de ARNh de Lygus hesperus. rB: límite derecho; LB: límite izquierdo; P35S: Promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor; T35S: terminador de 35S del virus del mosaico de la coliflor; TNOS: terminador de la nopalina sintasa; GFP: gen indicador fluorescente verde; NPT II: secuencia codificante del gen de la neomicina fosfotransferasa II; KmR: gen de resistencia a kanamicina; pBR322 ori: origen de replicación de pBR322; pBR322 bom: movilización de pBR322; pVS1 rep: replicón de pVS1; pVS1 sta: elemento de estabilidad de pVS1.
Figura 6 Montaje del ensayo de patata-Lygus in planta. Las flechas blancas indican los daños por los insectos.
Figuras 7 a 11 Dianas novedosas de Lygus hesperus - curvas de respuesta a la dosis a concentraciones de ARNbc sintético purificado que varían de 0,4 a 0,025 pg/pl (en la figura, la unidad "pg/pl" no se muestra). Se usaron ARNbc de GFP y agua milliQ como controles negativos. Los ARNbc de las dianas se produjeron usando los cebadores como se describe en la sección 1.1 de ejemplos.
Figura 12 Curva de respuesta a la dosis de Lh594, a concentraciones de ARNbc que varían de 0,05 a 0,001 pg/pl. Se usaron ARNbc de gFp y agua milliQ como controles negativos.
Figura 13 A Actividad de ARNbc en bioensayo de Lygus hesperus en ausencia de ARNt. Lh594 (5 pg/pl); control positivo: Lh423 (5 pg/pl); controles negativos: ARNbc de GFP (5 pg/pl) y agua milliQ; B Identificación del límite de
Barras oscuras: mortalidad en el día 3 a 6, nombraron usando los códigos de cribado
Barras oscuras: mortalidad en el día 3 a 6, nombraron usando los códigos de cribado
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actividad de Lh594 usando una concentración decreciente de ARNbc (de 5 |jg a 0,25 |jg). Controles negativos: ARNbc de GFP (5 jg/jl) y agua milliQ.
Figura 14 Segundo ensayo de confirmación de las placas Lh010 a Lh020 de las dianas de la segunda detección. Barras oscuras: mortalidad en el día 4 a 8, barras claras: mortalidad en el día 4 a 6. Los clones candidatos se nombraron usando los códigos de cribado "Lygxxx" y los códigos de nomenclatura de dianas "Lhxxx".
Figura 15 Resultados del ensayo para las dianas de la ruta de troponina de Lygus, ensayadas a 0,5 jg/jl fijos.
Figuras 16 A-B Dianas novedosas de Lygus hesperus de la ruta de troponina - curvas de respuesta a la dosis a concentraciones de ARNbc sintético purificado que varían de 0,4 a 0,025 jg/jl (en la figura, la unidad "jg/jl" no se muestra siempre). Se usaron ARNbc de GFP y agua milliQ como controles negativos.
Figuras 17 A-D Dianas novedosas de Lygus hesperus de las dianas de la segunda detección - curvas de respuesta a dosis a concentraciones de ARNbc sintético purificado que varían de 0,5 a 0,05 jg/jl. Se usaron ARNbc de GFP y agua milliQ como controles negativos.
Figuras 18 A-B Pruebas y selección de eventos transgénicos de GUS. Se evaluaron ocho eventos independientes de la línea transgénica de horquilla de GUS (P001) en el ensayo de una sola maceta de Lygus hesperus y se compararon con plántulas WT. Todas las plántulas se sometieron al mismo tratamiento. Se agregaron a cada maceta ninfas de Lygus hesperus de un día de vida y se verificó la supervivencia a los 9 días.
Figura 19 Pruebas de los eventos transgénicos de Lh423: Se evaluaron 28 eventos transgénicos independientes (línea P006) en el ensayo de una sola maceta de Lygus hesperus. Las plántulas transgénicas de Lh423 se compararon con las plántulas WT y con los eventos transgénicos de GUS (línea P001). Se agregaron a cada maceta ninfas de Lygus hesperus de un solo día de vida y se verificó la supervivencia a los 9 días.
Figura 20 Pruebas de los eventos transgénicos de Lh423: se muestran 6 eventos transgénicos independientes (P006) que provocaron > 60% de supervivencia. Las plántulas transgénicas de Lh423 se compararon con las plántulas WT y con las líneas transgénicas de GUS (P001). Se agregaron a cada maceta ninfas de Lygus hesperus de un solo día de vida y se verificó la supervivencia a los 9 días.
Figura 21 Pruebas de los eventos transgénicos de Lh594: se evaluaron 25 eventos transgénicos independientes (P007) en el ensayo de una sola maceta de Lygus hesperus. Las plántulas transgénicas de Lh594 se compararon con las plántulas Wt y con los eventos transgénicos de GUS (P001). Se agregaron a cada maceta ninfas de Lygus hesperus de un solo día de vida y se verificó la supervivencia a los 11 días.
Figura 22 Pruebas de los eventos transgénicos de Lh594: se muestran 6 eventos transgénicos independientes (P007) que provocaron un 60% de supervivencia. Las plántulas transgénicas de Lh594 se compararon con las plántulas WT y con las líneas transgénicas de GUS (P001). Se agregaron a cada maceta ninfas de Lygus hesperus de un solo día de vida y se verificó la supervivencia a los 11 días.
Figura 23 Valor relativo de los niveles de ARNm de Lh423 en los insectos después de alimentarse durante 5 días en plantas transgénicas que contenían una horquilla de GUS o una horquilla de Lh423. Se analizaron las muestras con cebadores que amplifican Lh423. Los datos se normalizaron usando GeNorm, con 2 genes constitutivos, Lh425 y Lh427.
Figura 24 Análisis de supervivencia de larvas de CPB tratadas con 1 jg de ARNbc de Ld594, Ld619 y Ld620. Los controles positivos incluyeron 1 jg de ARNbc de las dianas de referencia Ld513 y Ld049. Los controles negativos incluyeron agua milliQ y FP.
Figura 25 Efectos de ARNbc de Ld594, Ld619 y Ld620 tras pupación de larvas de CPB de 4.° estadio, en comparación con el control sin tratar (UTC). Se alimentaron chinches con 1 jg de ARNbc dispensado en discos de hojas de patata, luego se dejaron alimentarse con hojas de patata sin tratar (A) durante 4 días antes de colocarse sobre vermiculita. Para evaluar el efecto del ARNbc, los insectos muertos se excavaron de la vermiculita (debido a los efectos fuertes inducidos por el ARNbc de Ld594, no se recuperaron pupas de la vermiculita y, por lo tanto, no hay ninguna imagen disponible para este ARNbc diana) (B).
Figura 26 Efecto del ARNbc de Ld594, 619 y 620 de CPB en la supervivencia y estado físico de adultos de CPB. Las evaluaciones se realizaron en los días 4, 6, 7, 8, 11 y 13. Control MQ: agua milliQ.
Figura 27 Actividad del ARNbc de la ruta de Nl594 en saltamontes pardo del arroz. Los ARNbc se evaluaron a 0,5 jg/jl en presencia de un 0,1% de CHAPSO. Control positivo: ARNbc de Nl537 (0,5 jg/jl), controles negativos: ARNbc de GFP (0,5 jg/jl) y dieta únicamente.
Figure 28 Actividad del ARNbc de Ap594, Ap423, Ap537 y Ap560 en A. pisum. Los ARNbc se ensayaron a 0,5 jg/jl en presencia de 5 jg/jl de ARNt. Control negativo: ARNbc de GFP (0,5 jg/jl).
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Figura 29 Porcentajes de mortalidad de larvas de L. decemlineata con dieta tratadas con ARNbc. Ld583, Ld584, Ld586 y Ld588 representan clones diana. Control positivo: Ld513; control negativo: FP.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la presente invención han descubierto que la regulación por disminución de la expresión de genes diana particulares en especies de plagas de insectos mediante iARN puede utilizarse para prevenir y/o controlar de modo eficaz la infestación por parte de dichas plagas de insectos. El uso de la iARN para regular por disminución la expresión de genes diana en especies de plagas de insectos se aplica en este documento a la generación de plantas resistentes a la infestación por parte de plagas de insectos.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona plantas transgénicas resistentes a la infestación por parte de especies de plagas de insectos. En particular, en este documento se proporcionan plantas transgénicas que expresan o son capaces de expresar al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana como se describe en otras partes de este documento dentro de dicha plaga. El ARN interferente puede ser cualquiera de los divulgados más adelante en este documento. Preferiblemente, el ARN interferente comprende o consiste en al menos un elemento silenciador y dicho elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales (la hebra codificante) comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. La regulación por disminución de un gen diana de plaga puede utilizarse para alterar una función o proceso biológico esencial en la plaga, donde "esencial" se refiere al hecho de que la función o el proceso es necesario para iniciar o mantener la infestación por parte de la plaga.
Como se usa en este documento, el término "planta" puede incluir cualquier material reproductor o de propagación para una planta. Las referencias a una planta también pueden incluir células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos vegetales, callos vegetales, acúmulos vegetales y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces y similares. La descendencia, las variantes y los mutantes de cualquiera de las plantas transgénicas descritas en este documento se encuentran dentro del alcance de la presente invención. También se incluyen las semillas de cualquiera de dichas plantas transgénicas.
Como se usa en este documento, el término "control" de una infestación por plaga se refiere a cualquier efecto sobre una plaga que sirve para limitar y/o reducir los números de organismos de plagas y/o la lesión provocada por la plaga. Los genes diana preferidos son, por lo tanto, genes esenciales que controlan o regulan una o más funciones biológicas esenciales dentro de la plaga de insectos, por ejemplo, división celular, reproducción, metabolismo energético, digestión, función neurológica y similares. La regulación por disminución de estos genes esenciales mediante técnicas de iARN puede provocar la muerte del insecto o de otra forma, retardar de modo significativo el crecimiento y desarrollo o deteriorar la capacidad de la plaga de colonizar un ambiente o infestar organismos hospedadores.
Los autores de la presente invención ahora han identificado genes diana mejores de especies de plagas de insectos que pertenecen al género Lygus, Leptinotarsa, Nilaparvata y Acyrthosiphum, que son dianas concebidas para su uso individual o en combinación como un medio eficaz para el control mediado por iARN de la infestación de insectos de cultivos agronómicamente importantes. Los ortólogos de estos genes diana recientemente identificados pueden utilizarse en otras especies de insectos para controlar la infestación por parte de plagas de los cultivos relevantes correspondientes.
Más específicamente, los autores de la presente invención describen en esta ocasión que los genes que codifican las proteínas del complejo de troponina/miofilamento forman excelentes genes diana para la supresión por parte de la maquinaria de inhibición de ARN. Uno de estos genes diana codificaba la proteína troponina I de insecto (wings up A) que es un ortólogo de la proteína de Drosophila CG7178. Esta proteína está implicada en la contracción muscular y pertenece a una ruta fisiológica que aún no había sido totalmente explorada para el control de plagas (insectos) mediante la inhibición de ARN. Además, dado que este complejo proteico es específico para animales, no se conocen homólogos u ortólogos de genes vegetales, lo que reduce el riesgo de fenotipos vegetales de tipo incorrecto al expresar el ARNbc diana en plantas. Adicionalmente, en Drosophila, la troponina I se describe como un gen haploinsuficiente que exhibe un fenotipo mutante en estado heterocigoto. Estos genes son particularmente susceptibles a los niveles de expresión de ARNm reducidos y, como tales, pueden considerarse dianas ideales de la iARN.
A continuación se enumeran genes diana adicionales interesantes en este complejo de troponina/miofilamento y están siendo adicionalmente evaluados para el control mediante iARN en Lygus hesperus y otras especies de plagas de insectos:
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ID anotación
Citología Identificador de Dm
up
sostenida CG7107
Tm1
tropomiosina 1 CG4898
Tm2
tropomiosina 2 CG4843
Mhc
cadena pesada de miosina CG17927
Mlc-c
cadena citoplásmica ligera de miosina CG3201
sqh
calabacín CG3595
zip
cremallera CG15792
En una realización, la presente invención se refiere a una planta o material reproductor o de propagación para una planta transgénica o una célula vegetal transgénica cultivada, que expresa o es capaz de expresar un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por una especie de plaga de insectos regulando por disminución un gen diana en dicha plaga de insectos, donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador donde el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos que es al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2 o el complemento de las mismas.
En una realización preferida, el gen diana codifica una proteína de insecto troponina I (por ejemplo, un ortólogo de insecto de la proteína CG7178 Dm).
En una realización, la presente invención se refiere a una planta o material reproductor o de propagación para una planta transgénica o una célula vegetal transgénica cultivada, que expresa o es capaz de expresar un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por una especie de plaga de insectos regulando por disminución un gen diana en dicha plaga de insectos, donde el ARN comprende al menos un elemento silenciador donde el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos que es al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
Como se usa en este documento, un "gen diana" comprende cualquier gen en la plaga de insectos que se pretende regular por disminución. En una realización preferida, el gen diana se regula por disminución de forma tal que controla la infestación por parte de la plaga, por ejemplo, alterando un proceso biológico esencial de la plaga, o disminuyendo la patogenicidad de la plaga. Los genes diana preferidos incluyen, por lo tanto, aunque sin limitación, aquellos que tienen funciones clave en la regulación de la alimentación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción, infestación e infectividad. De acuerdo con una realización, el gen diana es tal que cuando su expresión se regula por disminución o se inhibe, la plaga de insectos muere. De acuerdo con otra realización, el gen diana es tal que cuando su expresión se regula por disminución o se inhibe, se previene o retarda o atrofia o retrasa o impide el crecimiento de la plaga, se previene la reproducción de la plaga, o se previene la transición a través de ciclos vitales de la plaga. De acuerdo con otra realización de la invención, el gen diana es tal que cuando su expresión se regula por disminución o se inhibe, se reduce el daño causado por la plaga y/o la capacidad de la plaga de infectar o infestar ambientes, superficies y/o especies de plantas o cultivos; o la plaga deja de alimentarse de sus recursos alimenticios naturales tales como plantas y productos de las plantas. En general, los términos "infestar" e "infectar" o "infestación" e "infección" se utilizan indistintamente en todo el documento.
Los genes diana pueden expresarse en todas o algunas de las células de la plaga de insectos. Además, los genes diana pueden expresarse solamente por la plaga de insectos en una etapa particular de su ciclo vital, por ejemplo, la fase de adulto maduro, la fase de ninfa o larva inmadura o la etapa de huevos.
Como se usa en este documento, las especies de "plaga" son preferiblemente especies de insectos que causan infección o infestación, preferiblemente de plantas.
Los insectos patógenos de plantas preferidos de acuerdo con la invención son plagas de plantas que se seleccionan del grupo que consiste en Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L. juncta (falso escarabajo de la patata) o L. texana (falso escarabajo de la patata de Texas)); Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes pardo del arroz)); Laodelphax spp. (por ejemplo, L. striatellus (saltamontes pardo pequeño del arroz)); Nephotettix spp. (por ejemplo, N. virescens o N. cincticeps (saltahojas verde) o N. nigropictus
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(saltahojas del arroz)); Sogatella spp. (por ejemplo, S. furcifera (saltaplantas de dorso blanco)); Chilo spp. (por ejemplo, C. suppressalis (barrenador bandeado de los tallos del arroz), C. auricilius (barrenador de franjas doradas de los tallos) o C. polychrysus (barrenador de cabeza oscura de los tallos)); Sesamia spp. (por ejemplo, S. inferens (barrenador rosa del arroz)); Tryporyza spp. (por ejemplo, T. innotata (barrenador blanco del arroz) o T. incertulas (barrenador amarillo del arroz)); Anthonomus spp. (por ejemplo, A. grandis (gorgojo del algodón)); Phaedon spp. (por ejemplo, P. cochleariae (escarabajo de las hojas de la mostaza)); Epilachna spp. (por ejemplo, E. varivetis (barrenador de las judías mexicano)); Tribolium spp. (por ejemplo, T. castaneum (escarabajo rojo del suelo)); Diabrotica spp. (por ejemplo, D. virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental), D. barben (gusano de la raíz del maíz norteño), D. undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz sureño), D. virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano); Ostrinia spp. (por ejemplo, O. nubilalis (barrenador del maíz europeo)); Anaphothrips spp. (por ejemplo, A. obscrurus (arañuela del césped)); Pectinophora spp. (por ejemplo, P. gossypiella (gusano cogollero rosa)); Heliothis spp. (por ejemplo, H. virescens (gusano de los brotes del tabaco)); Trialeurodes spp. (por ejemplo, T. abutiloneus (mosca blanca de alas bandeadas), T. vaporariorum (mosca blanca de invernadero)); Bemisia spp. (por ejemplo, B. argentifolii (mosca blanca de hojas plateadas)); Aphis spp. (por ejemplo, A. gossypii (pulgón del algodón)); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche manchada) o L. hesperus (chinche manchada del oeste)); Euschistus spp. (por ejemplo, E. conspersus (chinche hedionda moteada)); Clorochroa spp. (por ejemplo, C. sayi (chinche de las llanuras)); Nezara spp. (por ejemplo, N. viridula (chinche verde del sur)); Thrips spp. (por ejemplo, T. tabaci (arañuelas de la cebolla)); Frankliniella spp. (por ejemplo, F. fusca (arañuela del tabaco) o F. occidentalis (arañuela de las flores occidental)); Acheta spp. (por ejemplo, A. domesticus (grillo del hogar)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (pulgón verde del melocotonero)); Macrosiphum spp. (por ejemplo, M. euphorbiae (pulgón de la patata)); Blissus spp. (por ejemplo, B. leucopterus leucopterus (chinche de los cereales)); Acrosternum spp. (por ejemplo, A. hilare (chinche hedionda verde)); Chilotraea spp. (por ejemplo, C. polychrysa (barrenador de las cañas del arroz)); Lissorhoptrus spp. (por ejemplo, L. oryzophilus (gorgojo del agua del arroz)); Rhopalosiphum spp. (por ejemplo, R. maidis (pulgón de las hojas del maíz)); y Anuraphis spp. (por ejemplo, A. maidiradicis (pulgón de la raíz del maíz)).
De acuerdo con realizaciones más específicas, la invención es aplicable a especies que pertenecen a la familia de Chrysomelidae o galerucas. Escarabajos crisomélidos, tales como escarabajos de la patata de Colorado, pulguillas, gusanos de la raíz del maíz y curculiónidos tales como los gorgojos del arroz son plagas particularmente importantes. Especies Leptinotarsa específicas para controlar de acuerdo con la invención incluyen el escarabajo de la patata de Colorado (Leptinotarsa decemlineata (Say) y falso escarabajo de la patata (Leptinotarsa juncta (Say). CPB es una plaga (grave) de nuestra patata nacional, otras especies de patata de tubérculo y sin tubérculo cultivadas y silvestres y otras especies de plantas solanáceas (solanos) incluyendo las especies de cultivo tomate, berenjena, pimientos, tabaco (especies Nicotiana incluyendo plantas ornamentales), alquequenje, arroz, maíz o algodón; y las especies de malezas/hierbas, ortiga de caballo, solano común, manzana espinosa, beleño y duraznillo. Los gusanos de la raíz del maíz incluyen especies encontradas en el género Diabrotica (por ejemplo, D. undecimpunctata undecimpunctata, D. undecimpunctata howardii, D. longicornis, D. virgifera y D. balteata). Los gusanos de la raíz del maíz provocan grandes daños al maíz y las cucurbitáceas.
De acuerdo con una realización más específica, la invención es aplicable a especies que pertenecen al orden de hemípteros (familia de Aphidoidea), tales como Myzus persicae (pulgón verde del melocotonero, Aphis fabae (pulgón de la judía negra), Acyrthosiphum pisum (pulgón del guisante), Brevicoryne brassicae (pulgón del repollo), Sitobion avenae (pulgón de los cereales), Cavariella aegopodii (pulgón de la zanahoria), Aphis craccivora (pulgón del cacahuate,), Aphis gossypii (pulgón del algodón,), Toxoptera aurantii (pulgón negro de los cítricos), Cavariella spp (pulgón del sauce), Chaitophorus spp (pulgones de las hojas del sauce), Cinara spp. (pulgones del pino negro), Drepanosiphum platanoides (pulgones del sicomoro) Elatobium spp (pulgones del abeto) que causan daño a plantas tales como árboles Prunus, particularmente melocotonero, albaricoquero y ciruelo; árboles que son principalmente cultivados para producción de madera tales como sauces y álamos, a cultivos en hileras tales como maíz, algodón, soja, trigo y arroz, a cultivos de hortalizas de las familias Solanaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae y Cucurbitaceae, incluyendo aunque sin limitación, alcachofa, espárrago, judías, remolachas, brécol, coles de Bruselas, repollo, zanahoria, coliflor, cantalupo, apio, maíz, pepino, hinojo, col rizada, colirrábano, nabo, berenjena, lechuga, mostaza, quingombó, perejil, chirivía, guisante, pimiento, patata, rábano, espinaca, calabacín, tomate, nabo, berro y sandía; o cultivos de campo tales como, aunque sin limitación, tabaco, remolacha azucarera y girasol; un cultivo de flores u otras plantas ornamentales tales como pinos y coníferas. Otros hemípteros pertenecen a Nilaparvata ssp. (por ejemplo, N. lugens, Sogatella furcifera) y causan daños a las plantas del arroz. Otros hemípteros pertenecen a Lygus ssp. (por ejemplo, Lygus hesperus, Lygus rugulipennis, Lygus lineolaris, Lygus sully) y otras especies de insectos que se alimentan de plantas en la familia de los Miridae, y causan daño a plantas de algodón, patatas, fresas, algodón, alfalfa, colza, melocotón, ciruelas, uva, lechuga, berenjena, cebolla y judías verdes. También varios árboles mediterráneos y varios árboles ornamentales tales como el olmo (Ulmus spp.), pino piñonero (Pinus Pinea), plátano de Londres (Platanus Acerifolia), pomera blanca (Malus alba). Otros hemípteros pertenecen a la familia de los Pentatomoidea y son comúnmente conocidos como chinche de escudo y chinches hediondas (por ejemplo, la chinche hedionda marmórea marrón (Halyomorpha halys), la chinche hedionda moteada (Euschistus conspersus), chinche verde del sur (Nezara viridula), chinche del bosque (Pentatoma rufipes), chinche Arlequín (Murgantia histrionica) y chinche del arroz (Oebalus pugnax)) y causan daño a frutas, incluyendo manzanas, melocotones, higos, moras, frutas cítricas y caquis, mora, y hortalizas, incluyendo maíz dulce, tomates, semillas de soja, judías de Lima y pimientos verdes, repollo, coliflor, nabos, rábano picante, coles, mostaza, coles de
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Bruselas, patata, berenjena, quingombó, judías, espárrago, remolachas, malezas, árboles frutales y cultivos de campo tales como campos de maíz y semillas de soja. Las chinches también son una plaga de céspedes, sorgo y arroz.
Una planta a usar en los métodos de la invención, o una planta transgénica de acuerdo con la invención, abarca cualquier planta, pero es preferiblemente una planta que es susceptible a ser infestada por parte de un insecto patógeno de planta.
Por consiguiente, la presente invención incluye plantas y métodos como se describe en este documento, donde la planta se elige del siguiente grupo de plantas (o cultivos): alfalfa, manzana, albaricoque, alcachofa, espárrago, aguacate, plátano, cebada, judías, remolacha, mora, arándano, brécol, coles de Bruselas, repollo, colza, zanahoria, yuca, coliflor, un cereal, apio, cereza, cítrico, clementina, café, maíz, algodón, pepino, berenjena, escarola, eucalipto, higos, uvas, pomelo, cacahuetes, alquequenje, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino, maíz, mango, melón, mijo, champiñón, semillas de avena, quingombó, cebolla, naranja, una planta o flor o árbol ornamental, papaya, perejil, guisante, melocotón, cacahuete, turba, pimiento, caqui, piña, plátano grande, ciruela, granada, patata, calabaza, achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, soja, semilla de soja, espinacas, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, mandarina, té, tabaco, tomate, una vid, sandía, trigo, ñames y calabacín.
En aspectos específicos, la presente divulgación proporciona genes diana que codifican proteínas implicadas en la función de una proteína wings up A (troponina I), una proteína mitocondrial citocromo c oxidasa subunidad II o una de las proteínas ribosómicas especificadas en la tabla 1.
En aspectos preferidos, la presente divulgación proporciona genes diana seleccionados del grupo de genes (i) que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, o que tienen una secuencia de nucleótidos tal que, cuando las dos secuencias se alinean de forma óptima y se comparan, son al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas;
y donde la secuencia de nucleótidos de dicho gen no tiene más de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos de longitud.
Como se usa en este documento, la expresión "que tiene" tiene el mismo significado que "que comprende".
Como se usa en este documento, la expresión "identidad de secuencia" se utiliza para describir la relación de secuencia entre dos o más nucleótidos o secuencias de aminoácidos. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación (un número definido de posiciones), donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, brechas) en comparación con la secuencia de referencia para lograr una alineación óptima. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base nucleotídica o resto de aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones "coincidentes", dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100. Los métodos y programas informáticos para determinar la identidad de secuencia están disponibles en la técnica e incluyen el software Blast y el análisis GAP. Para ácidos nucleicos, el porcentaje de identidad se calcula preferiblemente mediante la herramienta de alineación BlastN, con la cual se calcula el porcentaje de identidad en la totalidad de la longitud de la secuencia de nucleótidos de consulta.
Un experto en la materia reconocerá que pueden identificarse homólogos u ortólogos (homólogos que existen en diferentes especies) de los genes diana representados por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189. También se divulgan estos homólogos y/u ortólogos de plagas. Los homólogos y/u ortólogos preferidos son genes de secuencia de nucleótidos similar a un grado tal que cuando los dos genes se alinean de forma óptima y se comparan, el homólogo y/o el ortólogo tienen una secuencia que es al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90% o un 95%, y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas. De forma similar, los homólogos y/u ortólogos preferidos también son proteínas que son similares en la secuencia de aminoácidos al punto de que cuando las dos secuencias de aminoácidos se alinean y comparan de forma óptima, el homólogo y/u ortólogo tiene una secuencia que es al menos un 75%, preferiblemente al menos un 80% o un 85%, más preferiblemente al menos un 90% o un 95%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 79 a 91, 326-359, 390-395.
Otros homólogos son genes que son alelos de un gen que comprende una secuencia representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189. Homólogos preferidos adicionales son genes que comprenden al menos un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en comparación con un gen que comprende una secuencia representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189.
El "ácido ribonucleico (ARN) interferente" de la presente divulgación es cualquier tipo de molécula de ARN capaz de regular por disminución o de "silenciar" la expresión de un gen diana incluyendo, aunque sin limitación, ARN
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codificante, ARN no codificante, ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), ARN bicatenario (ARNbc), ARN en horquilla (ARN) y similares. Los métodos para evaluar moléculas funcionales de ARN interferente son bien conocidos en la técnica y se describen en otras partes de este documento.
Las moléculas de ARN interferente de la presente invención producen la regulación por disminución específica de las secuencias de expresión de un gen diana mediante la unión a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana. La unión se produce como resultado de la formación de pares de bases entre regiones complementarias del ARN interferente y la secuencia de nucleótidos diana. Como se usa en este documento, la expresión "elemento silenciador" se refiere a la porción o región del ARN interferente que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria, o al menos parcialmente complementaria, a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana, y que funciona como la porción activa del ARN interferente para dirigir la regulación por disminución de la expresión de dicho gen diana. En un aspecto de la divulgación, el elemento silenciador comprende o consiste en una secuencia de al menos 17 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos 18 o 19 nucleótidos contiguos, más preferiblemente al menos 21 nucleótidos contiguos, incluso más preferiblemente al menos 22, 23, 24 o 25 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana.
Como se usa en este documento, "expresión de un gen diana" se refiere a la transcripción y acumulación del transcrito de ARN codificado por un gen diana y/o la traducción del ARNm en proteína. La expresión "regular por disminución" pretende hacer referencia a cualquiera de los métodos conocidos en la técnica mediante los cuales las moléculas de ARN interferente reducen el nivel del transcritos primarios de ARN, ARNm o proteína producida a partir de un gen diana. En ciertas realizaciones, la regulación por disminución se refiere a una situación en la que el nivel de ARN o proteína producida a partir de un gen se reduce al menos un 10%, preferiblemente al menos un 33%, más preferiblemente al menos un 50%, aún más preferiblemente al menos un 80%. En realizaciones particularmente preferidas, la regulación por disminución se refiere a una reducción en el nivel de ARN o proteína producida a partir de un gen al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, y aún más preferiblemente al menos un 99% dentro de las células de la plaga de insectos en comparación con una plaga de insectos de control apropiada que, por ejemplo, no se ha expuesto a un ARN interferente o se ha expuesto a una molécula de ARN interferente de control. En la técnica se conocen bien los métodos para detectar reducciones en los niveles de ARN o proteína e incluyen hibridación en solución de ARN, hibridación de tipo Northern, transcripción inversa (por ejemplo, análisis por RT-PCR cuantitativa), análisis de micromatrices, unión de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y transferencia de Western. En otra realización de la invención, la regulación por disminución se refiere a una reducción en los niveles de ARN o proteína suficiente para provocar un cambio detectable en un fenotipo de la plaga en comparación con un control de plaga apropiado, por ejemplo, muerte celular, detención del crecimiento o similares. La regulación por disminución puede medirse, por tanto, mediante análisis fenotípico de la plaga de insectos utilizando técnicas de rutina en la técnica.
En un aspecto preferido de la divulgación, el ARN interferente regula por disminución la expresión génica por interferencia de ARN o iARN. La iARN es un proceso de regulación génica específica de secuencia típicamente mediada por moléculas de ARN bicatenarias tales como ARN interferentes pequeños (ARNip). Los ARNip comprenden una hebra de ARN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias con una hebra de ARN no codificante. La hebra codificante o "hebra guía" de la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana. La hebra codificante del ARNip es capaz, por lo tanto, de hibridar con el transcrito de ARN mediante formación de pares de bases de Watson-Crick y de dirigirse al ARN para su degradación dentro de un complejo celular conocido como el complejo del silenciamiento inducido por iARN o RISC. Por tanto, en el contexto de las moléculas preferidas de ARN interferente de la presente invención, el elemento silenciador como se menciona en este documento puede ser una región bicatenaria que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales al menos una hebra comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria o al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. En una realización, la región bicatenaria tiene una longitud de al menos 30, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 pares de bases.
También se contemplan dentro del alcance de la presente invención moléculas de ARN bicatenarias (ARNbc) más largas que comprenden uno o más elementos silenciadores bicatenarios funcionales como se describe en otras partes en este documento y capaces de lograr el silenciamiento de genes mediado por iARN. Dichas moléculas de ARNbc más largas comprenden al menos 80, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 pares de bases. Estas moléculas de ARNbc pueden servir como precursores para las moléculas de ARNip activas que dirigen el transcrito de ARN al complejo RISC para la posterior degradación. Las moléculas de ARNbc presentes en el entorno que rodea a un organismo o las células del mismo pueden captarse por el organismo y procesarse por una enzima llamada Dicer para producir moléculas de ARNip. De forma alternativa, el ARNbc puede producirse in vivo, es decir, transcribirse de un polinucleótido o polinucleótidos que codifican el mismo, presente dentro de una célula, por ejemplo, una célula bacteriana o célula vegetal, y a continuación procesarse mediante Dicer dentro de la célula hospedadora o preferiblemente dentro de las células de la plaga de insectos tras la captación del precursor de ARNbc más largo. El ARNbc puede estar formado por dos hebras de ARN (codificante y no codificante) separadas que hibridan en virtud de la formación de pares bases complementarias. De forma alternativa, el ARNbc puede ser de una sola hebra que es capaz de plegarse sobre sí misma para formar un ARN en horquilla (ARN) o estructura de tallo-bucle. En el caso de un ARN, la región
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bicatenaria o "tallo" se forma a partir de dos regiones o segmentos del ARN que son esencialmente repeticiones invertidas del otro y presentan complementariedad suficiente para permitir la formación de una región bicatenaria. Uno o más elementos silenciadores bicatenarios funcionales pueden estar presentes en esta región de "tallo" de la molécula. Las regiones de repeticiones invertidas están típicamente separadas mediante una región o segmento del ARN conocido como la región de "bucle". Esta región puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que confiera flexibilidad suficiente para permitir que se produzca el autoemparejamiento entre las regiones complementarias flanqueadoras del ARN. En general, la región de bucle es básicamente monocatenaria y actúa como un elemento separador entre las repeticiones invertidas.
Todas las moléculas de ARN interferente de la invención producen la regulación por disminución específica de las secuencias de expresión de un gen diana mediante la unión a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana. La unión se produce como resultado de la formación de pares de bases complementarias entre el elemento silenciador del ARN interferente y la secuencia de nucleótidos diana. Las moléculas de ARN interferente de la invención comprenden al menos uno o al menos dos elementos silenciadores. En una realización de la presente invención, la secuencia de nucleótidos diana comprende una secuencia de nucleótidos representada por el transcrito de ARN del gen diana, o un fragmento del mismo, donde el fragmento es preferiblemente de al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 nucleótidos. En un aspecto preferido de la presente divulgación, la secuencia de nucleótidos diana comprende una secuencia de nucleótidos equivalente al transcrito de ARN codificado por cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en (i) un polinucleótido que comprende al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas. En un aspecto más preferido de lo anterior, dicho polinucleótido no es más largo de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.
Preferiblemente, las moléculas de ARN interferente de la presente invención comprenden al menos una región bicatenaria, típicamente el elemento silenciador del ARN interferente, que comprende una hebra de ADN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias con una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada dentro del transcrito de ARN del gen diana.
El elemento silenciador, o al menos una hebra del mismo donde el elemento silenciador es bicatenario, puede ser totalmente complementario o parcialmente complementario a la secuencia de nucleótidos diana del gen diana. Como se usa en este documento, la expresión "totalmente complementario" significa que todas las bases de la secuencia de nucleótidos del elemento silenciador son complementarias o "coinciden" con las bases de la secuencia de nucleótidos diana. La expresión "al menos parcialmente complementario" significa que hay una coincidencia menor a un 100% entre las bases del elemento silenciador y las bases de la secuencia de nucleótidos diana. El experto en la materia comprenderá que el elemento silenciador necesita ser solo al menos parcialmente complementario a la secuencia de nucleótidos diana para mediar la regulación por disminución de la expresión del gen diana. En la técnica existe constancia de que las secuencias de ARN con inserciones, eliminación y emparejamientos incorrectos con respecto a la secuencia diana pueden seguir siendo eficaces para la iARN. De acuerdo con la presente invención, se prefiere que el elemento silenciador y la secuencia de nucleótidos diana del gen diana compartan al menos un 85% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90% o 95% de identidad de secuencia, o más preferiblemente al menos un 97% o 98% de identidad de secuencia y aún más preferiblemente al menos un 99% de identidad de secuencia. De forma alternativa, el elemento silenciador puede comprender 1, 2 o 3 emparejamientos incorrectos en comparación con la secuencia de nucleótidos diana en cada extensión de 24 nucleótidos parcialmente complementarios.
El experto en la materia apreciará que el grado de complementariedad compartido entre el elemento silenciador y la secuencia de nucleótidos diana puede variar dependiendo del gen diana a regularse por disminución o dependiendo de la especie de plaga de insectos cuya expresión de genes se tiene que controlar.
En otra realización de la presente invención, el elemento silenciador comprende una secuencia de nucleótidos que es el ARN equivalente de cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en un polinucleótido que comprende al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas, o (ii) un polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 o 3000 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas, de modo que, cuando las dos secuencias se alinean de forma óptima y se comparan, dicho polinucleótido es al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas. Se apreciará que en dichas realizaciones el elemento silenciador puede comprender o consistir en una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, de las cuales una hebra, la
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hebra codificante, comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana.
La secuencia de nucleótidos diana se puede seleccionar de cualquier región o secuencia de nucleótidos adecuada del gen diana o transcrito de ARN de la misma. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos diana puede estar ubicada dentro de la 5'UTR o 3'UTR del gen diana o transcrito de ARN o dentro de regiones exónicas o intrónicas del gen.
El experto en la materia conocerá métodos para identificar las secuencias de nucleótidos diana más adecuadas dentro del contexto del gen diana completo. Por ejemplo, pueden sintetizarse y evaluarse múltiples elementos silenciadores dirigidos a diferentes regiones del gen diana. Como alternativa, se puede utilizar la digestión del transcrito de ARN con enzimas tales como ARNasa H para determinar sitios en el ARN que se encuentran en una conformación susceptible al silenciamiento génico. Los sitios diana también pueden identificarse utilizando estrategias informáticas, por ejemplo, el uso de algoritmos informáticos diseñados para predecir la eficacia del silenciamiento génico en función del direccionamiento a diferentes sitios dentro del gen completo.
Los ARN interferentes de la presente invención pueden comprender un elemento silenciador o múltiples elementos silenciadores, donde cada elemento silenciador comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana y que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de dicho gen diana. Las construcciones concateméricas de ARN de este tipo se describen en el documento WO2006/046148. En el contexto de la presente invención, el término "múltiple" significa al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, etc. y hasta al menos 10, 15, 20 o al menos 30. En una realización, el ARN interferente comprende múltiples copias de un único elemento silenciador, es decir, repeticiones de un elemento silenciador que se une a una secuencia de nucleótidos diana particular dentro de un gen diana específico. En otra realización, los elementos silenciadores dentro del ARN interferente comprenden o consisten en diferentes secuencias de nucleótidos complementarias a diferentes secuencias de nucleótidos diana. Debe estar claro que las combinaciones de múltiples copias del mismo elemento silenciador combinadas con elementos silenciadores que se unen a secuencias de nucleótidos diana diferentes se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Las diferentes secuencias de nucleótidos diana pueden originarse a partir de un solo gen diana en una especie de plaga de insectos para alcanzar una regulación por disminución mejorada de un gen diana específico en una especie de plaga de insectos. En ese caso, los elementos silenciadores pueden combinarse en el ARN interferente en el orden original en el que las secuencias de nucleótidos diana se encuentra en el gen diana, o los elementos silenciadores pueden mezclarse y combinarse aleatoriamente en cualquier orden de importancia en el contexto del ARN interferente en comparación con el orden de las secuencias de nucleótidos diana en el gen diana.
De forma alternativa, las diferentes secuencias de nucleótidos diana representan un solo gen diana pero se originan de diferentes especies de plagas de insectos.
De forma alternativa, las diferentes secuencias de nucleótidos diana pueden originarse de diferentes genes diana. Si el ARN interferente es para utilizarse en la prevención y/o el control de infestación por parte de plagas, se prefiere que los diferentes genes diana se seleccionen del grupo de genes que regulan las funciones biológicas esenciales de las especies de plagas de insectos, incluyendo, aunque sin limitación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción y patogenicidad. Los genes diana pueden regular las mismas o diferentes rutas biológicas o procesos. En una realización, al menos uno de los elementos silenciadores comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana donde el gen diana se selecciona del grupo de genes como se describe anteriormente.
En una realización adicional de la invención, los diferentes genes diana de los diferentes elementos silenciadores se originan de la misma especie de plaga de insectos. Esta estrategia está diseñada para lograr un ataque mejorado contra una sola especie de plaga de insectos. En particular, los diferentes genes diana pueden expresarse diferencialmente en las diferentes etapas del ciclo de vida del insecto, por ejemplo, las etapas de adulto maduro, larva inmadura y huevos. El ARN interferente de la invención, por tanto, puede utilizarse para prevenir y/o controlar una infestación por parte de plagas de insectos en más de una etapa del ciclo de vida del insecto.
En una realización alternativa de la invención, los diferentes genes diana de los diferentes elementos silenciadores se originan de diferentes especies de plagas de insectos. El ARN interferente de la invención, por tanto, puede utilizarse para prevenir y/o controlar una infestación por parte de más de una especie de plaga de insectos simultáneamente.
Los elementos silenciadores pueden disponerse como una región contigua del ARN interferente o pueden separarse mediante la presencia de secuencias conectoras. La secuencia conectora puede comprender una secuencia de nucleótidos aleatoria corta que no sea complementaria a ninguna secuencia de nucleótidos diana o genes diana. En una realización, el conector es una secuencia de ARN que es autoescindible de manera condicional, preferentemente un conector sensible al pH o un conector sensible a la hidrofobicidad. En una realización, el conector comprende una secuencia de nucleótidos equivalente a una secuencia intrónica. Las secuencias conectoras de la presente invención pueden tener una longitud de aproximadamente 1 par de bases a
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aproximadamente 10 000 pares de bases, siempre que el conector no altere la capacidad del ARN interferente de reducir la expresión del gen o los genes diana.
Además del o los elementos silenciadores y cualquier secuencia conectora, el ARN interferente de la invención puede comprender al menos una secuencia polinucleotídica adicional. En diferentes realizaciones de la invención, la secuencia adicional se selecciona de (i) una secuencia capaz de proteger el ARN interferente del procesamiento del ARN, (ii) una secuencia que afecta a la estabilidad del ARN interferente, (iii) una secuencia que permite la unión a la proteína, por ejemplo, para facilitar la captación del ARN interferente por parte de las células de la especie de la plaga de insectos, (iv) una secuencia que facilita la producción a gran escala del ARN interferente, (v) una secuencia que es un aptámero que se une a un receptor o a una molécula en la superficie de las células de la plaga de insectos para facilitar la captación, o (v) una secuencia que cataliza el procesamiento del ARN interferente dentro de las células de la plaga de insectos y mejora de esta forma la eficacia del ARN interferente. Las estructuras para potenciar la estabilidad de las moléculas de ARN son bien conocidas en la técnica y se describen adicionalmente en el documento WO2006/046148.
La longitud del ARN interferente de la invención necesita ser suficiente para la captación por parte de las células de una especie de plaga de insectos y la regulación por disminución de genes diana dentro de la plaga como se describe en otras partes de este documento. Sin embargo, el límite superior de longitud puede depender de (i) la necesidad de que el ARN interferente sea captado por las células de la plaga y (ii) la necesidad de que el ARN interferente sea procesado en las células de la plaga para mediar el silenciamiento de genes mediante la ruta de iARN. La longitud también puede determinarse por el método de producción y la formulación para la liberación del ARN interferente a células. Preferiblemente, el ARN interferente de la presente invención será entre 21 y 10000 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre 50 y 5000 nucleótidos o entre 100 y 2500 nucleótidos, más preferiblemente entre 80 y 2000 nucleótidos de longitud.
El ARN interferente puede contener bases de ADN, bases no naturales o uniones del esqueleto o modificaciones del esqueleto de azúcar-fosfato no naturales, por ejemplo, para mejorar la estabilidad durante el almacenamiento o mejorar la resistencia a la degradación por parte de las nucleasas. Además, el experto en la materia puede producir el ARN interferente química o enzimáticamente mediante reacciones manuales o automatizadas. Como alternativa, el ARN interferente se puede transcribir a partir de un polinucleótido que lo codifique. Por lo tanto, en este documento se proporciona un polinucleótido aislado que codifica cualquiera de los ARN interferentes de la presente invención.
En realizaciones preferidas, el polinucleótido aislado es parte de una molécula de ARN interferente, típicamente parte del elemento silenciador, que comprende al menos una región bicatenaria que comprende una hebra de ARN codificante hibridada por formación de pares de bases complementarias a una hebra de ARN no codificante, donde la hebra codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana. La hebra codificante del ARNbc, por lo tanto, es capaz de hibridar con el transcrito de ARN y de dirigirse al ARN para su degradación dentro del complejo del silenciamiento inducido por iARN o RISC.
Los polinucleótidos de la invención pueden insertarse mediante técnicas de clonación molecular de rutina en vectores o construcciones de ADN conocidos en la técnica. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, se proporciona una construcción de ADN que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención. Preferiblemente, en este documento se proporciona una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que codifica al menos uno de los ARN interferentes de la presente invención. La construcción de ADN puede ser un vector de ADN recombinante, por ejemplo un vector bacteriano o de levadura o un vector de plantas. En una realización preferida de la invención, la construcción de ADN es una construcción de expresión y el polinucleótido se encuentra unido de forma funcional a al menos una secuencia reguladora capaz de dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica. La expresión "secuencia reguladora" debe considerarse en un contexto amplio y pretende hacer referencia a cualquier secuencia de nucleótidos capaz de lograr la expresión de los polinucleótidos a los cuales está unido de forma funcional incluyendo, aunque sin limitación, promotores, potenciadores y otros elementos activadores de la transcripción sintéticos o naturales. La secuencia reguladora puede ubicarse en el extremo 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica. La expresión "unido de forma funcional" se refiere a una unión funcional entre la secuencia reguladora y la secuencia polinucleotídica de tal forma que la secuencia reguladora dirige la expresión del polinucleótido. Los elementos unidos de forma funcional pueden ser contiguos o no contiguos.
Preferiblemente, la secuencia reguladora es un promotor que se selecciona del grupo que comprende, aunque sin limitación, promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de tejido y promotores específicos de etapa de crecimiento/desarrollo. En una realización, el polinucleótido se coloca bajo el control de un promotor constitutivo fuerte tal como cualquiera seleccionado del grupo que comprende el promotor CaMV35S, promotor CaMV35S doble, promotor de ubiquitina, promotor de actina, promotor de rubisco, promotor GOS2, promotor 34S del virus del mosaico de la escrofularia. En otra realización, la secuencia reguladora es un promotor de plantas para su uso en la regulación de la expresión del polinucleótido en plantas. Los promotores de plantas, en particular, los promotores específicos de tejido vegetal abarcados por el alcance de la presente invención se describen más detalladamente en otras partes de este documento.
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Opcionalmente, una o más secuencias de terminación de transcripción pueden incorporarse en la construcción de
expresión de la invención. La expresión "secuencia de terminación de la transcripción" abarca una secuencia de
control al final de una unidad de transcripción, que señala la terminación de la transcripción, el procesamiento en 3' y la poliadenilación de un transcrito primario. Las secuencias reguladoras adicionales incluyendo, aunque sin limitación, potenciadores de la traducción o la transcripción, pueden incorporarse en la construcción de expresión, por ejemplo, como con el promotor CaMV35S doble potenciado.
La presente invención también abarca un método para generar cualquiera de los ARN interferentes de la invención que comprende las etapas de (i) poner en contacto un polinucleótido que codifica dicho ARN interferente o una
construcción de ADN que lo comprende con componentes sin células; o (ii) introducir (por ejemplo, mediante
transformación, transfección o inyección) un polinucleótido que codifica dicho ARN interferente o una construcción de ADN que lo comprende dentro de una célula.
La invención también, por tanto, se refiere a cualquier ribonucleótido bicatenario producido a partir de la expresión de un polinucleótido descrito en este documento.
Por consiguiente, en este documento también se proporciona una célula hospedadora transformada con cualquiera de los polinucleótidos descritos en este documento. También se abarcan por las presentes células hospedadoras que comprenden cualquiera de los ARN interferentes de la presente invención, cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención o una construcción de ADN que los comprende. La célula hospedadora puede ser una célula procariota incluyendo, aunque sin limitación, células bacterianas gram-positivas y gram-negativas, o una célula eucariota incluyendo, aunque sin limitación, células de levadura o células vegetales. Preferiblemente, dicha célula hospedadora es una célula bacteriana o una célula vegetal. La célula bacteriana puede elegirse del grupo que comprende, aunque sin limitación, células Gram positivas y Gram negativas que comprenden Escherichia spp. (por ejemplo, E. coli), Bacillus spp. (por ejemplo, B. thuringiensis), Rhizobium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Pseudomonas spp. y Agrobacterium spp. El polinucleótido o construcción de ADN de la invención puede existir o mantenerse en la célula hospedadora como un elemento extracromosómico o puede incorporarse de forma estable en el genoma de la célula hospedadora. Las características de interés particular en la selección de una célula hospedadora para los propósitos de la presente invención incluyen la facilidad con la que el polinucleótido o la construcción de ADN que codifica el ARN interferente puede introducirse en el hospedador, la disponibilidad de los sistemas de expresión compatibles, la eficacia de la expresión y la estabilidad del ARN interferente en el hospedador.
Preferiblemente, los ARN interferentes de la invención se expresan en una célula hospedadora de una planta. Las plantas de interés preferidas incluyen, aunque sin limitación, algodón, patata, arroz, tomate, colza, soja, girasol, sorgo, mijo, maíz, alfalfa, fresas, berenjena, pimiento y tabaco.
En situaciones en las que el ARN interferente se expresa dentro de una célula hospedadora y/o se utiliza para prevenir y/o controlar una infestación por parte de plagas de un organismo hospedador, se prefiere que el ARN interferente no exhiba efectos inesperados significativos, es decir, el ARN interferente no afecte a la expresión de los genes dentro del hospedador. Preferiblemente, el elemento silenciador no exhibe complementariedad significativa con secuencias de nucleótidos que no sean la secuencia de nucleótidos diana pretendida del gen diana. En una realización de la invención, el elemento silenciador muestra menos de un 30%, más preferiblemente menos de un 20%, más preferiblemente menos de un 10% y aún más preferiblemente menos de un 5% de identidad de secuencia con cualquier gen de la célula u organismo hospedador. Si los datos de la secuencia genómica están disponibles para el organismo hospedador, es posible verificar de forma cruzada la identidad con el elemento silenciador utilizando herramientas bioinformáticas convencionales. En una realización, no hay identidad de secuencia entre el elemento silenciador y un gen de la célula hospedadora u organismo hospedador en una región de 17, más preferiblemente en una región de 18 o 19 y aún más preferiblemente en una región de 20 o 21 nucleótidos contiguos.
En la aplicación práctica de la invención, los ARN interferentes de la invención pueden utilizarse para prevenir y/o controlar cualquier plaga de insectos pertenecientes a los órdenes Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera y Siphonaptera.
En este documento también se proporciona un método para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas, que comprende poner en contacto una especie de plaga de insectos con una cantidad eficaz de al menos un ARN en donde el ARN funciona tras captarse por dicha plaga regulando por disminución la expresión de un gen diana esencial de la plaga. El gen diana esencial puede ser cualquier gen de la plaga implicado en la regulación de un proceso biológico esencial necesario para que la plaga inicie o mantenga la infestación incluyendo, aunque sin limitación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción y patogenicidad. En particular, el gen diana puede ser cualquier gen de la plaga como se describe en otras partes de este documento.
Además, en este documento se proporciona un método para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos en un campo de plantas de cultivo, comprendiendo dicho método expresar en dichas plantas una cantidad eficaz de un ARN interferente como se describe en este documento.
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Cuando el método es para el control de infestación por parte de plagas, la expresión "cantidad eficaz" abarca la cantidad o concentración de ARN interferente que se necesita para producir un efecto fenotípico en la plaga de tal forma que se reduzcan las cantidades de organismos de la plaga que infestan un organismo hospedador y/o se reduzca el daño causado por la plaga. En una realización, el efecto fenotípico es la muerte de la plaga y el ARN interferente se utiliza para alcanzar al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% de mortalidad de la plaga en comparación con plagas de insectos de control. En una realización adicional, los efectos fenotípicos incluyen, aunque sin limitación, atrofia en el crecimiento de la plaga, cese de la alimentación y puesta de huevos reducida. Las cantidades totales de organismos de la plaga que infestan un organismo hospedador pueden reducirse, por tanto, al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% en comparación con plagas de control. De forma alternativa, el daño causado por la plaga de insectos pude reducirse al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% en comparación con plagas de insectos de control. Por lo tanto, el método de la invención puede utilizarse para alcanzar al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% de control de la plaga.
En los métodos descritos en este documento para regular por disminución la expresión de un gen diana en una especie de plaga de insectos, las moléculas de ARN bicatenarias que comprenden al menos 21 pb, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas, pueden usarse para regular por disminución la expresión del gen diana ortólogo en un insecto coleóptero, hemíptero, lepidóptero o díptero elegido del grupo que comprende, aunque sin limitación, Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L. juncta (falso escarabajo de la patata) o L. texana (falso escarabajo de la patata de Texas)); Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes pardo del arroz)); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche manchada) o L. hesperus (chinche manchada del oeste)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (pulgón verde del melocotonero)); Diabrotica spp. (por ejemplo, D. virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental), D. barberi (gusano de la raíz del maíz norteño), D. undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz sureño) o D. virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano).
En una realización, la planta a tratarse se manipula para que exprese el ARN interferente de intracelular mediante la transcripción de un polinucleótido incorporado en la misma. Dado que las plagas se alimentan de los tejidos de la planta, las células que contienen el aRn interferente se desintegrarán dentro del tracto digestivo del insecto y el ARN interferente se distribuirá de esta forma dentro del cuerpo del insecto, provocando la regulación por disminución de los genes diana.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para generar una planta transgénica resistente a la infestación por parte de una especie de plaga de insectos que comprende las etapas de (a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha especie de plaga de insectos, (b) regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada; y (c) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión del ARN interferente a partir de la construcción de ADN recombinante, siendo así dicha planta resistente a dicha plaga en comparación con una planta sin transformar.
El ARN interferente expresado por la planta o parte de la misma puede ser cualquiera de los descritos en otras partes de este documento. Preferiblemente, el ARN interferente comprende o consiste en al menos un elemento silenciador y dicho elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales (la hebra codificante) comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. Cuando parte del ARN interferente es bicatenario, las dos hebras de la molécula pueden expresarse a partir de al menos dos polinucleótidos separados o pueden estar codificadas mediante un solo polinucleótido que codifica un ARN interferente con, por ejemplo, una estructura de tallo-bucle o una estructura denominada de horquilla como se describe en otras partes de este documento.
En un aspecto, el gen diana
(i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ iD NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189, o el complemento de las mismas, o que tienen una secuencia de nucleótidos tal que, cuando las dos secuencias se alinean de forma óptima y se comparan, son al menos un 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana no tiene más de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos de longitud. Además, es importante que el ARN interferente no altere la expresión de ningún gen del hospedador vegetal.
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Como se usa en este documento, la expresión "planta transgénica" o "célula vegetal transgénica" se refiere a cualquier planta o célula vegetal que se ha manipulado genéticamente o que desciende de una planta que se ha manipulado genéticamente para presentar una secuencia polinucleotídica exógena. "Exógeno" se refiere al hecho de que el polinucleótido se origina fuera de la célula vegetal. Típicamente, el polinucleótido exógeno no es nativo de la planta transgénica, es decir, no se encuentra de forma natural dentro del genoma de la planta.
Como se usa en este documento, la expresión "transformación" se refiere a la introducción de moléculas polinucleotídicas exógenas en una planta o célula de la misma. En la técnica se conocen técnicas para introducir polinucleótidos en plantas. En una realización de la presente invención, las plantas se "transforman de forma estable" con un polinucleótido o construcción de ADN que lo comprende, es decir, el polinucleótido o construcción de ADN introducido en la célula vegetal se integra en el genoma de la planta y tiene capacidad hereditaria por la descendencia de la misma. Los protocolos de transformación para introducir polinucleótidos o construcciones de ADN en las células de plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta en cuestión. Los métodos de transformación adecuados incluyen, aunque sin limitación, microinyección, electroporación, transformación mediada por Agrobacterium y aceleración de partículas balísticas. En la técnica también se conocen métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido o construcción de ADN en una ubicación específica en el genoma de la planta utilizando sistemas de recombinación específica de sitio.
La construcción de ADN que comprende el polinucleótido que codifica la molécula activa de ARN interferente puede ser cualquier vector adecuado para la transformación de células vegetales. Los vectores adecuados incluyen, aunque sin limitación, plásmidos bacterianos, por ejemplo, el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, y sistemas de vectores víricos. La construcción de ADN introducida en las células de una planta no debe ser dañina ni tóxica para la planta y/o no debe ser dañina ni tóxica para ningún organismo más alto en la cadena alimenticia que se alimente de dichas plantas.
En una realización, la construcción de ADN es una construcción de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un ARN interferente unido de forma funcional a una secuencia reguladora capaz de dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica en plantas tal como cualquiera seleccionada del grupo que comprende el promotor CaMV35S, promotor CaMV35S doble, promotor de ubiquitina, promotor de actina, promotor de rubisco, promotor GOS2, promotor 34S del virus del mosaico de la escrofularia y el promotor CaMV35S doble potenciado. Preferiblemente, la secuencia reguladora es un promotor de plantas que se selecciona de los conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, puede preferirse que la planta produzca moléculas de ARN interferente únicamente en las partes de la planta que entrarán en contacto con y/o se verán dañadas por la especie de plaga de insectos, por ejemplo, las partes aéreas de la planta, las raíces, etc. Este efecto puede conseguirse mediante el uso de promotores de plantas específicos de tejido incluyendo, aunque sin limitación, promotores específicos de las hojas, promotores específicos de la raíz, promotores específicos del tallo, promotores específicos de la flor y promotores específicos del fruto conocidos en la técnica. Ejemplos adecuados de un promotor específico de raíz son los promotores PsMTA y de la quitinasa de clase III. Ejemplos de promotores específicos de tejido fotosintético o específicos de hoja y tallo que también son fotoactivados son promotores de dos proteínas de unión a clorofila (cab1 y cab2) de remolacha azucarera, ribulosa-bisfosfato carboxilasa (Rubisco), codificada por rbcS, las subunidades A (gapA) y B (gapB) de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de cloroplastos, promotor del gen de Solanum tuberosum que codifica la proteína específica para hojas y tallos (ST-LS1), genes inducibles por defensa y regulados por el tallo, tales como los promotores JAS, promotores específicos de flor tales como el promotor de la chalcona sintasa y promotores específicos de frutos tales como el RJ39 de la fresa.
En otras realizaciones, puede preferirse que la planta produzca moléculas de ARN interferente solamente en una etapa particular de su crecimiento. Este efecto puede alcanzarse mediante el uso de promotores específicos del desarrollo de plantas que dirigen la expresión solamente durante ciertos periodos del desarrollo de la planta. En particular, es importante proteger a las plantas de la infestación por parte de plagas durante las etapas más tempranas del crecimiento de las plantas o durante la floración (por ejemplo, en el caso del arroz) o durante la fructificación o maduración del fruto o el llenado de la semilla, ya que estos son los momentos en los que la planta puede verse más severamente dañada.
La construcción de ADN para su uso en la transformación de una planta de acuerdo con el presente método puede comprender más de un polinucleótido que codifica una molécula de ARN interferente de la presente invención. En una realización, los diferentes polinucleótidos pueden codificar moléculas de ARN interferente dirigidas a diferentes secuencias de nucleótidos dentro del mismo gen diana. En una realización adicional, los diferentes polinucleótidos pueden codificar moléculas de ARN interferente dirigidas a diferentes secuencias de nucleótidos dentro de diferentes genes diana, donde los diferentes genes diana se originan de la misma o diferentes especies de plaga de insectos. Cuando la construcción de ADN codifica más de un ARN interferente, estos ARN pueden expresarse de forma diferencial dentro de diferentes tejidos de la planta, ya que se encuentran bajo el control de diferentes secuencias promotoras específicas de tejido, como se describe en otras partes de este documento. En una realización, la planta se manipula para que exprese un ARN interferente en las hojas que regula por disminución la expresión de un gen diana en un insecto que se alimenta de las hojas, y para expresar adicionalmente un ARN interferente en las raíces que regula por disminución la expresión de un gen diana en un insecto que coloniza el suelo y se alimenta de las raíces de la planta.
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La construcción de ADN también puede comprender al menos otro polinucleótido de interés, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una molécula de ARN reguladora adicional, un polinucleótido que codifica una proteína tóxica para especies de plagas de insectos y/o un polinucleótido que codifica una proteína que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas.
De acuerdo con el presente método, una planta se regenera a partir de una célula vegetal transformada utilizando técnicas conocidas en la técnica. Una de dichas técnicas comprende la digestión enzimática de la pared celular vegetal para producir un protoplasto vegetal, que posteriormente puede sufrir múltiples rondas de división y diferenciación celular para producir una planta adulta. Las plantas adultas generadas de esa forma pueden evaluarse posteriormente para determinar su resistencia a la infestación por parte de plagas. "Resistente", como se usa en este documento, debe interpretarse ampliamente y se refiere a la habilidad de la planta para defenderse contra el ataque de una plaga que típicamente es capaz de infringir daño o pérdida a la planta. Resistente puede significar que la planta ya no es susceptible a la infestación por parte de plagas o que cualquier síntoma de enfermedad que resulte de la infestación por parte de plagas se reduce al menos aproximadamente un 20%, preferiblemente al menos un 30%, 40% o 50%, más preferiblemente al menos un 60%, 70% o 80% y aún más preferiblemente al menos un 90%. En la técnica son comúnmente conocidas técnicas para medir la resistencia de una planta a especies de plagas de insectos e incluyen, aunque sin limitación, medir en el transcurso del tiempo el diámetro promedio de la lesión, el peso o la biomasa de la plaga, la supervivencia y/o mortalidad de la plaga y/o el porcentaje general de tejidos vegetales descompuestos.
En una realización, el presente método para producir una planta transgénica también incluye la etapa de generar descendencia o descendientes de la planta transgénica y evaluar la resistencia de la descendencia a la plaga de insectos. Pueden producirse dos o más generaciones para asegurarse de que la expresión del rasgo de resistencia se mantiene y hereda de forma estable. Las semillas también pueden cosecharse de la planta transgénica progenitora y/o su descendencia para evaluar la resistencia a una plaga de insectos.
La presente invención también abarca un método para generar plantas transgénicas resistentes a la infestación por parte de una especie de plaga de insectos que comprende las etapas de cruzar una primera planta transgénica que porta una construcción de ADN que codifica un ARN interferente que funciona regulando por disminución la expresión de un gen diana de la plaga, con una segunda planta que carezca de dicha construcción de ADN, y seleccionar la descendencia resistente a dicha plaga. El cruce puede llevarse a cabo mediante cualquier método utilizado de forma rutinaria en el contexto de la reproducción de plantas. La descendencia seleccionada para la resistencia a las plagas adicionalmente puede autopolinizarse para producir una posterior generación de descendencia resistente a las plagas. En una realización, pueden llevarse a cabo múltiples rondas de autopolinización para generar 2, 3, 4, 5 o más generaciones de descendencia. La descendencia resultante puede evaluarse para determinar su resistencia a las plagas para asegurarse de que la expresión del rasgo de resistencia se mantiene y hereda de forma estable.
En una realización adicional, cualquier planta de descendencia resistente a las plagas derivada de un cruce entre una primera planta transgénica progenitora que porta una construcción de ADN de interés y una segunda planta progenitora que carezca de dicha construcción de ADN puede cruzarse nuevamente con la segunda planta progenitora y evaluarse la posterior descendencia para determinar su resistencia a la infestación por parte de plagas. Las plantas o su descendencia pueden evaluarse para determinar su resistencia a la infestación por parte de plagas mediante análisis fenotípicos como se describe en otras partes de este documento o mediante técnicas moleculares convencionales. Por ejemplo, las plantas resistentes a plagas pueden identificarse mediante la detección de la presencia de una secuencia polinucleotídica que codifica un ARN interferente que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana. En la técnica se conocen técnicas para detectar la presencia de secuencias polinucleotídicas específicas dentro de células e incluyen PCR, digestión enzimática y análisis de SNP.
Los métodos de la invención pueden utilizarse para generar plantas "transgénicas acumuladas" que son resistentes a especies de plaga de insectos y que opcionalmente tienen al menos otro rasgo deseado. Como se usa en este documento, una planta transgénica "acumulada" se refiere a una planta que porta más de una secuencia polinucleotídica exógena. La expresión "más de una" se refiere a la posibilidad de una planta de portar al menos 2, al menos 3, al menos 4 polinucleótidos exógenos. En una realización, la célula vegetal transformada con la construcción de ADN que codifica el ARN interferente dirigido a un gen de plaga se puede haber manipulado genéticamente previamente para portar un polinucleótido exógeno separado. De forma alternativa, el método para generar una planta transgénica a partir de una célula vegetal como se describe en este documento puede comprender un protocolo de transformación conjunta cuando la construcción de ADN que codifica un ARN interferente de la invención se proporciona a una célula de planta simultánea o secuencialmente con un polinucleótido exógeno separado.
Las plantas transgénicas acumuladas que muestran resistencia a plagas también pueden generarse mediante técnicas de reproducción de plantas convencionales. En una realización, una primera planta transgénica resistente a las plagas se cruza con una segunda planta manipulada genéticamente para expresar un polinucleótido exógeno o gen heterólogo que confiere un rasgo deseado de la planta. Cualquier descendencia producida puede evaluarse para determinar su resistencia a plagas y adquisición del rasgo deseado adicional. De forma alternativa o
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adicionalmente, cualquier descendencia resistente a las plagas producida a partir del cruce puede cruzarse nuevamente con la segunda progenitora para generar más descendencia que pueda seleccionarse para heredar el gen heterólogo portado por la segunda progenitora y así el rasgo deseado adicional de la planta. Los polinucleótidos exógenos que porta una planta transgénica acumulada de la invención pueden expresarse en las mismas partes de la planta o pueden expresarse de forma diferencial en virtud del hecho de que la expresión de cada uno está controlada por un promotor específico de tejido diferente.
En una realización, el polinucleótido exógeno o gen heterólogo que confiere un rasgo deseable adicional codifica otro ARN interferente dirigido la misma o diferentes especies de plaga de insectos. En una realización adicional, el gen heterólogo codifica una proteína dañina o tóxica para una especie de plaga de insectos de las plantas, por ejemplo, una proteína insecticida seleccionada del grupo que incluye, aunque sin limitación, proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis, proteínas insecticidas de Xenorhabdus, proteínas insecticidas de Photorhabdus, proteínas insecticidas de Bacillus laterosporous, proteína insecticidas de Bacillus sphaericus y proteína insecticidas de VIP, tales como una proteína seleccionada del grupo que incluye, aunque sin limitación, las proteínas insecticidas Cry1Ab, Cry1C, Cry2Aa, Cry3, CryET70, Cry22, CryET33, CryET34, CryET80, CryET76, TIC100, TIC101, TIC851, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 y PS149B1. En otra realización adicional, el gen heterólogo codifica una proteína que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas. Los ejemplos de genes que confieren resistencia o tolerancia a herbicidas incluyen Bar, EPSPS que confiere resistencia al glifosato, ALS que confiere resistencia a la imidazolinona y sulfonilurea y bxn que confiere resistencia al bromoxinilo.
En este documento también se proporciona un método para producir semillas híbridas a partir de cualquiera de las plantas transgénicas generadas mediante los métodos de la presente invención, comprendiendo dicho método las etapas de (i) plantar la semilla obtenida de una primera planta endogámica y la semilla obtenida de una segunda planta endogámica, donde al menos una de las plantas endogámicas es una planta transgénica resistente a la infestación por parte de plagas, (ii) cultivar las semillas en plantas que dan flores, (iii) evitar la autopolinización de al menos una de la primera o segunda planta adulta, (iv) permitir que ocurra la polinización cruzada entre la primera y la segunda planta; y (v) cosechar las semillas que resultan de la polinización cruzada. La semilla híbrida producida mediante este método y las plantas híbridas producidas mediante el cultivo de dicha semilla se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las plantas híbridas producidas mediante este método típicamente serán genéticamente uniformes y probablemente exhiban heterosis o vigor híbrido. Por tanto, pueden generarse cultivos con el potencial de aumentar el rendimiento mediante dicho método.
Incluidas en el grupo de plantas transgénicas de la presente invención se encuentran las plantas transgénicas producidas por cualquiera de los métodos descritos en este documento. Por tanto, en una realización de la invención las plantas transgénicas comprenden rasgos transgénicos acumulados que portan un primer polinucleótido exógeno que confiere resistencia a plagas y al menos otro polinucleótido exógeno o gen heterólogo que confiere un rasgo deseado adicional de la planta. Los genes heterólogos adicionales pueden comprender genes que codifican agentes plaguicidas adicionales, genes que codifican proteínas tóxicas o dañinas para especies de plagas de insectos y/o genes que codifican proteínas que confieren resistencia a herbicidas como se describe en otras partes de este documento.
Las plantas transgénicas preferidas de acuerdo con la invención incluyen, aunque sin limitación, algodón, patata, arroz, tomate, colza, soja, girasol, sorgo, mijo, maíz, alfalfa, fresas, berenjena, pimiento y tabaco.
En este documento también se proporciona el uso del ácido ribonucleico (ARN) interferente como se describe en este documento o la construcción de ADN como se describe en este documento para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos, preferiblemente infestación por parte de plagas de insectos de plantas.
La invención se comprenderá además con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
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Ejemplos
Ejemplo 1 Identificación de genes diana en especies de plagas de insectos
1.1. Biblioteca de ADNc normalizado de Lygus hesperus y preparación de ARNbc en placas de múltiples pocilios para ensayos de detección
Se aislaron ácidos nucleicos de ninfas de Lygus hesperus de diferentes etapas de vida, incluidas ninfas recién eclosionadas de 2, 4, 6 y 9 días de edad y adultas. Se preparó una biblioteca de ADNc usando el kit de síntesis de ADNc por PCR SMARTer™, siguiendo las instrucciones del fabricante (Clontech Cat. n.° 634925). La biblioteca de ADNc se normalizó usando el kit Trimmer (Evrogen Cat. n.° NK001) y se clonó en el vector PCR4-TOPO (Invitrogen). La normalización de los clones introdujo adaptadores M2 (Trimmer Kit, Evrogen, SEQ ID NO 92: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) orientados en dirección opuesta en cada extremo de los clones. Las construcciones del vector recombinante se transformaron en células de la cepa TOP10 de Escherichia coli (Invitrogen). Posteriormente se diluyeron las células transformadas y se sembraron en placa para obtener colonias individuales o clones. Los clones se revisaron para asegurarse de que la redundancia de clones para la biblioteca no excediera un 5%. Se recogieron clones únicos en medios de LB (caldo Luria) líquido, en placas de 96 pocillos profundos y se cultivaron durante una noche a 37°C. Las placas también incluyeron clones de control positivo (Lh423) y negativo (FP).
Para generar el ARNbc, se generaron mediante PCR fragmentos de ADN codificantes y no codificantes que contenían la secuencia promotora T7. En resumen, por clon, se distribuyó 1 pl de suspensión bacteriana en placas de PCR de múltiples pocillos que contienen REDTaq® (Sigma Cat. n.° D4309) y los cebadores oGCC2738 (SEQ ID NO 93: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) y oGCC2739 (SEQ ID NO 94:
GCGTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGTGGTATCAACGCAG) basados en las secuencias M2 y T7-M2, respectivamente. La reacción de PCR estuvo seguida por transcripción in vitro, donde por clon, se añadieron 6 pl de producto de PCR a 9 pl del sistema de producción de ArN a gran escala-T7 RiboMAX™(Promega Cat. n.° P1300) y se incubaron durante una noche a 37°C. La solución final de ARNbc se diluyó 2 veces en dieta de sacarosa de L. hesperus, que contenía sacarosa a un 15% y 5 pg/pl de ARNt de levadura (Invitrogen Cat. n.° 15401-029) y se usó para la detección. El ARNbc correspondiente al clon de control positivo Lh423 es la SEQ ID NO 101 y al clon de control negativo FP es la SEQ ID nO 104 (véase la Tabla 4).
1.2. Detección de genes diana de Lygus hesperus novedosos y potentes usando una biblioteca de ADNc de expresión de ARNbc
Se ha desarrollado un nuevo ensayo de detección de dianas de Lygus hesperus. La configuración del ensayo fue la siguiente: cada pocillo de una placa de 96 pocillos aloja una ninfa de L. hesperus de un día de vida expuesta a un bolsita de parafilm que contiene dieta de sacarosa que incluye el ARNbc de ensayo o el ARNbc de control en presencia de ARNt. Cada placa contenía ARNbc de 90 clones diferentes, 3 x Lh423 (control positivo) y 3 x FP (proteína fluorescente; control negativo). Cada clon (ARNbc de prueba) se replicó en tres placas. Después de tres días de exposición, se registró el número de supervivencia de las ninfas y la dieta se remplazó con una dieta (compleja) de cultivos frescos en ausencia de ARNbc. La mortalidad se evaluó en los días 4, 6 y 8. Se usó una configuración idéntica para los ensayos de confirmación de primera y segunda ronda, con 8 y 20 insectos respectivamente, con una ninfa por pocillo.
El sistema de ensayo se validó usando ARNbc correspondiente a la diana Lh423 como control positivo y un ARNbc de proteína fluorescente como control negativo: más de un 90% fueron verdaderos positivos y menos de un 5% fueron falsos positivos, respectivamente.
Se evaluaron veinte placas de 96 pocillos, denominadas Lh001 a Lh020 (véase la línea inferior en las Figuras 1 y 2), que contenían 1800 clones individuales. Se identificaron 205 candidatos y se evaluaron en un primer ensayo de confirmación. Al fijar el umbral para que muestre > 50% de mortalidad, se identificaron 41 clones independientes y evolucionaron hasta una segunda ronda de confirmación. En el ensayo, los clones se compararon con los controles positivos Lh423 (RpL19) y Lh105.2 (Sec23) y el control negativo Pt (que codifica una proteína fluorescente de coral). El ARNbc correspondiente al clon de control positivo (Lh423) es la SEQ ID NO 101, al clon de control positivo Lh105.2 es la SeQ ID NO 102 y al clon de control negativo (Pt) es la SEQ ID NO 104 (véase la Tabla 4).
La segunda ronda de ensayos de confirmación, que evaluó 20 insectos / ARNbc de prueba, se inició para todos los ARNbc de prueba que exhibieron > 50% de mortalidad en la primera confirmación (Figuras 1 y 2). Las dianas candidatas correspondientes a los ARNbc de ensayo confirmados se nombraron con un "número Lhxxx" (véase la Tabla 1). Usando el mismo corte a > 50% de mortalidad, se confirmaron 15 dianas en la primera detección.
Se realizó una segunda detección para identificar más dianas de Lygus hesperus. Los resultados de los ensayos de confirmación de segunda ronda se representan en la Figura 14. Usando el mismo corte a > 50% de mortalidad, se confirmaron varias dianas en la segunda detección (véase la Tabla 1C).
1.3. Identificación de dianas de Lygus
En paralelo a los ensayos de confirmación de insectos, se secuenciaron los insertos que correspondían a los clones positivos y se utilizaron búsquedas de BlastX en bases de datos de proteínas de Drosophila y Tribolium para confirmar la identidad de las dianas. La Tabla 1 proporciona un resumen del análisis bioinformático y la anotación actual de las novedosas secuencias diana de L. hesperus identificadas.
5 Se identificaron quince novedosas dianas de L. hesperus en la primera detección y se identificaron 11 novedosas dianas de L. hesperus en la segunda detección. Todas las dianas muestran alta potencia contra ninfas de L. hesperus, lo que indica que los ADNc que codifican los ARN bicatenarios contenidos en los mismos son esenciales para la supervivencia de la plaga y, por tanto, representan genes diana de interés con fines de control de plagas. Las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana se determinaron, por lo tanto, 10 y se proporcionan en las Tablas 2 y 3 respectivamente.
Lh594, el ortólogo de Lygus hesperus de troponina I de Drosophila, que participa en la contracción muscular y, por lo tanto, está ausente en las plantas, representa una novedosa clase de diana que pertenece a una ruta fisiológica específica de animales en la que aún no se ha explorado el GM-iARN. En la mosca de la fruta, la troponina I se describe como un gen haploinsuficiente que exhibe un fenotipo mutante en estado heterocigoto. Dichos genes 15 pueden ser particularmente susceptibles a niveles de expresión de ARNm reducidos y de esa forma pueden considerarse dianas de iARN ideales.
En esta ruta de Lh594, se seleccionaron ocho dianas (véase la Tabla 1B). Para cada diana, se diseñaron hasta 4 pares de cebadores de PCR degenerados basados en las alineaciones de las secuencias de varios insectos, incluidos abeja, Tribolium y áfido. Los cebadores se utilizan para amplificar los segmentos de dianas de Lygus 20 hesperus. Las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana se determinaron y se proporcionan en las Tablas 2 y 3 respectivamente.
Tabla 1: Las novedosas dianas de Lygus hesperus se clasificaron en % de mortalidad de acuerdo con los resultados del segundo ensayo de confirmación (primera detección).
ID de la diana
confirmad ón de 2.° categoría Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Lh594
1 CG7178 wings up A (troponina I) wupA
Lh618
2 CG2168 proteína ribosómica S3A RpS3A
Lh609
3 CG4087 proteína ribosómica LP1 RpLP1
Lh595
4 - no se encontró coincidencia con Drosophila, diana/secuencia específica de Lygus
Lh611
5 CG6779 proteína ribosómica S3 RpS3
Lh560
6 CG10423 proteína ribosómica S27 RpS27
Lh596
7 - no se encontró coincidencia con Drosophila, diana/secuencia específica de Lygus RpL34b
Lh615
8 CG11522 proteína ribosómica L6 RpL6
Lh617
9 CG7283 proteína ribosómica L10Ab RpL10Ab
Lh612
10 CG13389 proteína ribosómica S13 RpS13
Lh246
11 CG3195 proteína ribosómica L12 RpL12
Lh429
12 CG8900 proteína ribosómica S18 RpS18
Lh610
13 CG5502 proteína ribosómica L4 RpL4
Lh597
14 no se encontró coincidencia
Lh598
15 CG34069 subunidad II de citocromo c oxidasa mt:CoII
mitocondrial
Lh614
- CG7610 cadena de ATP sintasa-Y ATPsyn-Y
Tabla 1B: Dianas novedosas de Lygus hesperus en la ruta de Lh594
ID de la diana
Mejor(es) coincidencia(s) con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Lh619
CG7107 troponina T (sostenida) up
Lh620
CG17927 cadena pesada de miosina Mhc
Lh621
CG4843 tropomiosina 2 (Tm2) Tm2
Lh622
CG3201 cadena citoplásmica ligera de miosina Mlc-c
Lh623
CG3595 calabacín sqh
Lh624
CG15792 cremallera zip
Lh625
*CG2981,CG7930,CG907 3,CG6514,CG12408 troponina C
Lh626
*CG9073,CG7930,CG298 1,CG12408,CG6514 troponina C
*incierto: múltiples coincidencias en la familia - clasificadas de acuerdo con el valor e
Tabla 1C: Las novedosas dianas de Lygus hesperus se clasificaron en % de mortalidad de acuerdo con los resultados del segundo ensayo de confirmación (segunda detección).
ID de la diana
confirmación de 2.° clasificación Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Lh631
1 CG6846 Proteína ribosómica L26 RpL26
Lh634.2
2 CG12775 Proteína ribosómica L21 RpL21
Lh634.1
3 CG12775 Proteína ribosómica L21 RpL21
Lh630
4 CG11271 Proteína ribosómica S12 RpS12
Lh632
5 CG2998 Proteína ribosómica S28b RpS28b
Lh618.2
6 CG2168 Proteína ribosómica S3A RpS3A
Lh629
7 CG4651 Proteína ribosómica L13 RpL13
Lh633.2
8 CG17521 Proteína ribosómica L10 RpL10
Lh628
9 CG17489 Proteína ribosómica L5 RpL5
Lh633
10 CG17521 Proteína ribosómica L10 RpL10
Lh627
11 CG2033 Proteína ribosómica S15Aa RpS15A
5 1.4. Clonación de ADNc de longitud completa por RACE (amplificación rápida de los extremos de ADNc)
Para clonar el ADNc de longitud completa, empezando desde un clon conocido del fragmento interno de las dianas más potentes, se usó el kit de RACE de 5'/3' (Roche, Cat. n.° 1 734 792; basado en Sambrook, J. y Russell, D.M). Se siguió el protocolo convencional, descrito en el Manual de Instrucciones. En resumen, para una RACE de 5', se diseñó un cebador no codificante específico de la secuencia diana en la secuencia conocida y se utilizó para una 10 primera síntesis de ADNc de primera hebra, usando ARN de Lygus como molde. Se agregó una cola al ADNc de primera hebra y se utilizó como ancla para la síntesis de la segunda hebra y amplificación de una porción del extremo desconocida del transcrito. Para una RACE de 3', se utilizó un cebador de ancla oligo dT para la síntesis de ADNc de primera hebra. Para las RACE de 5' y 3', se utilizaron cebadores anidados, específicos para la secuencia
5
10
15
20
25
30
35
40
diana en una segunda reacción de PCR. Los fragmentos de PCR se analizaron sobre gel de agarosa, se purificaron, se clonaron y se secuenciaron para confirmación.
Las secuencias de ADNc de longitud completa que corresponden a las dianas se ensamblaron en VectorNTi, un paquete de software de análisis de secuencias completamente integrado para análisis de secuencia de ADN (Invitrogen).
Ejemplo 2 producción in vitro de ARN bicatenario para el silenciamiento de genes
2.2. Producción de ARNbc que corresponde a las secuencias parciales de los genes diana de Lygus hesperus
Se sintetizó ARN bicatenario en cantidades de miligramos. Primero se generaron mediante PCR dos moldes separados de promotor de polimerasa de ARN 5' T7 (un molde codificante y un molde no codificante). Se diseñaron y se llevaron a cabo PCR para producir polinucleótidos de molde codificante y no codificante, que tenía cada uno el promotor T7 en una orientación diferente con respecto a la secuencia diana a transcribir.
Para cada uno de los genes diana, el molde codificante se generó usando un cebador directo T7 específico de diana y un cebador inverso específico de diana. Los moldes no codificantes se generaron usando los cebadores directos específicos de diana y los cebadores inversos T7 específicos de diana. Las secuencias de los cebadores respectivos para amplificar los moldes codificante y no codificante mediante PCR para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 4. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron. Los moldes T7 codificante y no codificante resultantes se mezclaron y se transcribieron mediante la adición de la ARN polimerasa T7. Los aRn monocatenarios producidos mediante transcripción a partir de los moldes se dejaron hibridar, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron mediante precipitación. La hebra codificante del ARNbc resultante producida de cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 4.
2.2. Ensayos de análisis de supervivencia para novedosas dianas de Lygus hesperus
Para posibilitar la clasificación de acuerdo con la potencia, los ARNbc in vitro correspondientes a las novedosas dianas se sintetizaron y aplicaron a L. hesperus en bioensayos de análisis de supervivencia de 10 días. En resumen, se colocaron ninfas de L. hesperus de un día de vida en placas de 96 pocillos con sellos de sacarosa que contenían 0,5 |jg/|jl del ARNbc diana, enriquecido con 5 jg/jl de ARNt de levadura. Las placas se incubaron durante 3 días en condiciones de cultivo de Lygus convencionales. El día 3, 6 y 8, los sellos de dieta se renovaron con sellos que contenían dieta de Lygus únicamente. Se utilizó Lh423 (RpLl9) como control positivo y se utilizó ARNbc de GFP y dieta de sacarosa como controles negativos.
Los resultados de los análisis de supervivencia confirmaron los datos del primer y el segundo ensayo de confirmación. Se estableció Lh594 como una diana muy potente, con actividad y velocidad hasta destrucción más fuerte que el control fuerte Lh423.
Hasta ahora, la detección de Lygus en busca de novedosas dianas identificó nuevas dianas con actividades mayores o en el intervalo del control positivo Lh423; estos incluyen Lh429, Lh594, Lh609, Lh610, Lh611, Lh617 y Lh618. La mortalidad inducida por estas dianas se muestra en las Figuras 3 y 4.
Para obtener una clasificación más precisa de las dianas de acuerdo con su actividad, se realizaron análisis de concentración de respuesta a la dosis. Las novedosas dianas se ensayaron en ensayos in vitro, con concentraciones que varían de 0,4 a 0,025 jg/jl. Por condición, se evaluaron ninfas de 24 horas de vida en la configuración de placas de 96 pocillos, en dieta de sacarosa enriquecida con vehículo de ARNbc y ARNt. Los resultados se presentan como % de supervivencia en un experimento de 10 días (Figuras 7 a 11) y se resumen en la Tabla 5.
Basándose en los análisis de la curva de concentración, las dianas se clasificaron por comparación con los controles de referencia Lh423 y Lh105 (Tabla 5).
Tabla 5: Clasificación de novedosas dianas de Lygus de acuerdo con DRC y comparadas con las dianas de referencia Lh423 y Lh105.
5
10
15
20
25
ID de la diana
Potencia expresada como jg/jl de ARNbc necesaria para alcanzar un 90% de destrucción en el día 7
Lh594
0.025 (en el día 6)
Lh618
0.05-0.1
Lh612
0.05
Lh615
0.05
Lh423
0.1
Lh595
0.1
Lh560
0.1
Lh610
0.1
Lh617
0.1
Lh105
0.2
Lh614
0.2 (en el día 6)
Lh611
0.2
Lh596
0.3
Lh609
ND
Lh429
ND
La potencia de Lh594 se confirmó adicionalmente. El efecto de esta diana se observa claramente al menos un día antes que las otras dianas y el control positivo de referencia Lh105 y Lh423. Dado que Lh594 era muy potente, la LD50 no se alcanzó en el experimento de DRC convencional, con una concentración en el intervalo de 0,4 a 0,025 |jg/|jl de ARNbc (Figura 8), el experimento de Lh594 por lo tanto se repitió, incluidas concentraciones más bajas en el intervalo de 0,05 a 0,001 jg/jl de ARNbc (Figura 12). En conclusión, la actividad de Lh594 se observó a una concentración de 0,0025 jg/jl y aproximadamente un 90% de destrucción (correspondiente a aproximadamente un 10% de supervivencia) se obtuvo en el día 6 con 0,025 jg de ARNbc.
Para explorar más la potencia de Lh594 y la función del vehículo de ARNt en la respuesta de la iARN en Lygus hesperus, se configuraron ensayos de alimentación in vitro adicionales en ausencia del ARNt portador. Se produjeron ARNbc de Lh594, Lh423 (control de referencia) y GFP (control negativo) in vitro, usando el método convencional. Los ARNbc se purificaron y se evaluaron a 5 jg/jl en ausencia de ARNt (Figura 13 A).
En ausencia de ARNt, las dianas Lh594 y Lh423 indujeron una letalidad alta en ninfas de Lygus. Los resultados de este experimento se han reproducido desde entonces. El ARNbc diana fue capaz de inducir efectos de iARN por alimentación en ninfas de Lygus en ausencia de ARNt.
Para investigar la actividad de ARNbc a concentraciones más bajas en ausencia del ARNt portador, se configuraron experimentos adicionales, usando cantidades decrecientes de ARNbc (Figura 13 B).
Se siguió una estrategia similar para las dianas de Lygus que se identificaron en la segunda detección. Para obtener una clasificación de las dianas de acuerdo con su actividad, se realizaron análisis de concentración de respuesta a la dosis. Las novedosas dianas se ensayaron en ensayos in vitro, con concentraciones que varían de 0,5 a 0,05 jg/jl. Por condición, se evaluaron ninfas de 24 horas de vida en la configuración de placas de 96 pocillos, en dieta de sacarosa enriquecida con vehículo de ARNbc y ARNt. Los resultados se presentan como % de supervivencia en un experimento de 9 días (Figuras 17 A-D). Lh594 y Lh423 se han incluido en el ensayo como dianas de referencia. Los resultados se resumen en la Tabla 6. Basándose en los análisis de curvas de concentración, las dianas se clasificaron por comparación con el control de referencia Lh423.
Tabla 6: Dianas novedosas de Lygus de la clasificación de la segunda detección de acuerdo con DRC y comparados con las dianas de referencia Lh423 y Lh594.
5
10
15
20
25
30
35
ID de la diana
Potencia expresada como pg/pl de ARNbc necesaria para alcanzar un 90% de destrucción en el día 7
Lh594
0.025 (en el día 6)
Lh634
0.1
Lh423
0.1
Lh631
0.4
Lh633
0.4
Lh627
0.5
Lh628
0.5
Lh630
0.5
Lh632
0.5
Lh629
ND
Ejemplo 3 Detección de la ruta de troponina
Para posibilitar el ensayo de las dianas de la ruta de Troponina, los ARNbc producidos in vitro correspondientes a Lh619, Lh620, Lh621, Lh622, Lh622, Lh623, Lh624, Lh625 y Lh626 se sintetizaron y aplicaron a L. hesperus en bioensayos de análisis de supervivencia de 10 días. En resumen, se colocaron ninfas de L. hesperus de un día de vida en placas de 96 pocillos con sellos de sacarosa que contenían 0,5 pg/pl del ARNbc diana, enriquecido con 5 |jg/|jl de ARNt de levadura. Las placas se incubaron durante 3 días en condiciones de cultivo de Lygus convencionales. El día 3, 6 y 8, los sellos de dieta se renovaron con sellos que contenían dieta de Lygus únicamente. Se utilizó Lh594 (Troponina I) como control positivo y se utilizó ARNbc de GFP y dieta de sacarosa como controles negativos (Figura 15). Luego se incluyeron cuatro dianas en análisis de curvas de respuesta a la dosis en un ensayo in vitro, con concentraciones en el intervalo de 0,4 a 0,025 pg/pl. Por condición, se evaluaron ninfas de 24 horas de vida en la configuración de placas de 96 pocillos, en dieta de sacarosa enriquecida con vehículo de ARNbc y ARNt. Los resultados se presentan como % de supervivencia en un experimento de 10 días (Figuras 16 A-B).
Ejemplo 4 Generación de plantas resistentes a especies de plagas de insectos
4.1. Montaje de vectores de expresión de plantas que comprenden una secuencia de horquilla de Lygus hesperus para la transformación de patata o algodón
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN funciona a través de los fragmentos de ARNbc, las secuencias polinucleotídicas diana se clonaron en una orientación no codificante y codificante, separadas por un separador (SEQ ID NO 98:
CTCGAGCCTGAGAGAAAAGCATGAAGTATACCCATAACTAACCCATTAGTTATGCATTTATGTTATATCTATTCAT GCTTCTACTTTAGATAATCAATCACCAAACAATGAGAATCTCAACGGTCGCAATAATGTTCATGAAAATGTAGTGT GTACACTTACCTTCTAGA, o
SEQ ID NO 385:
TCTAGAAGGTAAGTGTACACACTACATTTTCATGAACATTATTGCGACCGTTGAGATTCTCATTGTTTGGTGATTG ATTATCTAAAGTAGAAGCATGAATAGATATAACATAAACTAGTAACTAATGGGTTAGTTATGGGTATACTTCATGCT TTTCTCTCAGGCTCGAG), para formar una construcción de horquilla de ARNbc. Las construcciones de horquilla de ARNbc que codifican las moléculas de ARNbc de L. hesperus derivadas de los genes diana mencionados en este documento se subclonaron en un vector de expresión de plantas. De manera similar, una construcción de control de horquilla de ARNbc de GUS, donde la secuencia polinucleotídica codificante que codifica GUS (SEQ ID NO 97: CCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATAC GCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAGTGTACGTATCTGAAATCAAAAAACTCGACG GCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAAAACTGTGGAATTGATCCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGG AATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGTCACAGCCAA AAGCCAGACAGAGT) se clonó en orientación no codificante y codificante, separada por el mismo intrón (SEQ ID NO 98 o SEQ ID NO 385), se subclonó en un vector de expresión de plantas.
5
10
15
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25
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40
45
50
55
El vector de expresión de plantas comprende también elementos necesarios para el mantenimiento del plásmido en una célula bacteriana. La construcción de la horquilla de ARNbc se ubica entre el borde izquierdo (BI) y el borde derecho (BD), 3' posterior al promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (P35S) y 5' anterior al terminador de TNOS. Se subclonó un casete de expresión del indicador GFP que comprende la secuencia de GFP flanqueada por el promotor y el terminador P35S en el vector de transformación de plantas que alberga el casete de horquilla de L. hesperus. Un casete de expresión de NPT II que comprende la secuencia de NPT II flanqueada por el promotor y terminador P35S se utiliza para seleccionar las plantas que se han transformado eficazmente. Un montaje correcto de los fragmentos genéticos en el vector de expresión de plantas se confirmó mediante secuenciación (Figura 5).
Los vectores de expresión de plantas que comprenden las horquillas de las dianas de L. hesperus individuales se transformaron posteriormente en Agrobacterium tumefaciens. Para todos los genes diana de L. hesperus mencionados en este documento, los fragmentos pueden seleccionarse y clonarse como horquillas de una manera similar.
4.2. Transformación de patata con un vector de expresión de plantas que comprende una secuencia de horquilla de Lygus hesperus y ensayo de las plantas de patata transformadas para la resistencia contra L. hesperus
El ejemplo que se proporciona a continuación es una ejemplificación del hallazgo de que las plantas de patata transgénica que expresan los ARN de horquilla específicos de genes diana afectan adversamente a la supervivencia y/o el desarrollo de las especies de plagas de insectos.
iARN por alimentación de Lygus hesperus in planta
Después de los resultados positivos obtenidos en los experimentos de alimentación de ARNbc en L. hesperus, se realizaron experimentos de viabilidad in planta.
El ensayo in planta se desarrolló con plántulas de patata in vitro que pueden soportar la supervivencia de los insectos al menos 8 días, manteniendo la mortalidad de fondo baja. Las ninfas de L. hesperus sobreviven y se alimentan en plántulas de patata de tipo silvestre. Esto está respaldado por el daño visual causado por insectos que puede observarse en las hojas y yemas (Figura 6).
En el ensayo, L. hesperus se alimenta con patata transgénica, que expresa el ARNbc de horquilla dirigido a las dianas de L. hesperus identificadas en este documento. Se generaron plásmidos que contienen construcciones de horquilla y un control de GUS.
Las plántulas se analizaron mediante PCR para confirmar la integración del ADN-T y la presencia de la horquilla, antes de que se propagara. Se produjeron explantas en exceso con el fin de obtener al menos 30 eventos independientes para cada construcción.
Transformación de patata
Plantas de patata transformadas de forma estable se obtuvieron usando un protocolo adaptado recibido por Julie Gilbert en el Proyecto de Genoma de Patata NSF (
http://www.potatogenome.org/nsf5). Las explantas de internudo de tallo de la "Línea V" de patata (obtenidas originalmente del Laboratorio de Reproducción Vegetal en PRI Wageningen, Países Bajos) que deriva del diploide susceptible Solanum tuberosum 6487-9 se utilizaron como material de partida para la transformación. Las explantas derivadas in vitro se inocularon con C58CiRifR de Agrobacterium tumefaciens que contenía las construcciones de horquilla. Después de tres días de cocultivo, las explantas se colocaron en un medio selectivo que contenía 100 mg/l de kanamicina y 300 mg/l de timentina. Después de 6 semanas tras la transformación, los primeros brotes putativos se retiraron y se arraigaron en un medio selectivo. Los brotes que se originaron de diferentes explantas se trataron como eventos independientes, los brotes que se originaron del mismo callo se denominaron "hermanos" hasta que su estado clonal pudiera verificarse mediante transferencia de Southern, y los cortes nodales de un brote se denominaron "clones".
El estado transgénico de los brotes de enraizamiento se revisó mediante fluorescencia de GFP o mediante PCR más/menos para la secuencia diana insertada. Los brotes positivos luego se propagaron por clonación en cultivo tisular para asegurar que estuvieran disponibles suficientes repeticiones para los ensayos de Lygus hesperus. Estos brotes se mantuvieron en medio de cultivo tisular o se transfirieron al suelo, lo que permite una mayor flexibilidad para ensayar la resistencia contra ninfas/adultos de L. hesperus. Las primeras plantas estuvieron disponibles para pruebas catorce semanas tras la transformación.
Bioensayo
Las plantas de patata transgénica jóvenes se mantuvieron en medio de cultivo tisular o se cultivaron en suelo en una cámara de cuarto de crecimiento de plantas con las siguientes condiciones: 25 ± 1°C, 50 ± 5% de humedad relativa, fotoperiodo de 16:8 horas de luz:oscuridad. Por construcción, varios eventos (por ejemplo, veinte) se generaron con una cantidad adecuada de clones (por ejemplo, diez) por evento. Se colocaron varias ninfas/adultos de Lygus jóvenes en plantas de patata jóvenes (por ejemplo, en la etapa de hojas 4-5 desplegadas) confinadas
individualmente y se dejaron durante al menos siete días antes de evaluar la resistencia contra Lygus hesperus en términos de supervivencia de ninfas/larvas/adultos, desarrollo retrasado y crecimiento atrofiado y/o daño por alimentación sobre la planta reducido.
La viabilidad de iARN in planta para la protección de cultivos contra Lygus se evaluó en un ensayo usando patatas 5 transgénicas que expresaban horquillas que correspondían a genes diana de Lygus. La Tabla 7 resume los números de patatas transgénicas generadas y evaluadas. Los eventos transgénicos se generaron con horquillas que correspondían a dianas Lh423 de Lygus (la secuencia de horquilla para Lh423 está representada en la SEQ ID No 402; la secuencia codificante de la diana Lh423 está representada en la SEQ ID NO 101) y Lh594 (la secuencia de horquilla para Lh594 está representada en la SEQ ID NO 401; la secuencia codificante de la diana Lh594 está 10 representada en la SEQ ID NO 2) y GUS como control (la secuencia de horquilla para GUS está representada en la sEq ID NO 403; la secuencia codificante de GUS está representada en la sEq ID NO 97). En este ensayo se utilizó como intrón la SEQ ID NO 385.
Tabla 7
Gen
Construcción N.° de eventos N.° de plántulas Línea transformación de
GUS
pGCC121 46 20x2 P001
Lh423
pGCC133 28 20x30 P006
Lh594
pGCC135 25 20x30 P007
Tipo silvestre
- 20
Las plántulas se propagaron primero en cajas, luego en macetas individuales, que contenían medio de 15 enraizamiento de MS (4,4 g/l de sales de MS y vitaminas, 30 g/l de sacarosa, 10 g/l de Gelrite, pH 5,7), en preparación para los ensayos de alimentación de Lygus. Dos eventos independientes de GUS se seleccionaron de 8 eventos independientes evaluados en 2 experimentos independientes (Figura 18 A-B). En el ensayo, se evaluaron 20-30 plantas transgénicas del mismo evento, cada una plantada en una maceta separada, y se compararon con plántulas WT. Para las líneas transgénicas que tienen las horquillas Lh423 y Lh594, 28 y 25 eventos independientes 20 se evaluaron respectivamente y para cada evento transgénico independiente se evaluaron 20 a 30 plántulas, cada una plantada en una maceta separada (Figura 6).
Como se esperaba en transformantes primarios, se observó un intervalo de actividad para los 28 eventos transgénicos de Lh423 independientes (Figura 19); 6 eventos de P006 independientes indujeron más de un 60% de letalidad en el día 9 y en un evento, la letalidad alcanzó un 80% en el día 9 (Figura 20).
25 Como se esperaba en transformantes primarios y como se observa para los transformantes primarios de Lh423, se observó un intervalo de actividad también para los 25 eventos transgénicos de Lh594 (Figura 21); 6 eventos de P007 independientes indujeron más de un 60% de letalidad en el día 9 y en un evento, la letalidad alcanzó un 80% en el día 9 (Figura 22). Además, se observaron claramente retrasos de crecimiento y atrofia en los insectos supervivientes.
30 Resultados de qRT-PCR en Lygus alimentados con plantas
Para demostrar que la reducción observada en la supervivencia de Lygus alimentados con plántulas de patata transgénicas que expresan horquillas dirigidas contra genes endógenos fue una verdadera respuesta de iARN, el nivel de regulación por disminución del ARNm diana (Lh423) se midió mediante PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Los insectos se dejaron alimentar con 3 eventos que tienen la horquilla de Lh423 (P006/59, /22 y /29) y 35 de un evento que tiene el control de horquilla de GUS (P001/28) como control. Los insectos se recogieron después de 5 días y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. El ARN total se extrajo de 5 grupos de 5 insectos usando reactivo de TRI y de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SIGMA). Después del tratamiento con DNasa l (Promega) para quitar el ADN genómico seguido por extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol, los ARN precipitados se disolvieron en agua. Para cada muestra, se transcribió de forma inversa 1 |jg de 40 ARN con una mezcla de hexámeros aleatorios y cebadores oligo dT anclados. Se realizó PCR de tipo qRT-PCR en el BioRad I-Cycler, usando iQ SYBR Green Supermix (Biorad) y usando las condiciones recomendadas por el fabricante. Los cebadores de qRT-PCR (Tabla 8) se diseñaron usando BeaconDesign; para evitar accidentes de PCR previsibles en presencia del ARNbc expresado en plantas ingerido por los insectos, las secuencias de cebador estaban ubicadas en la posición 3' de la secuencia de ARNbc. Se utilizó el algoritmo GeNorm para normalizar el 45 nivel de ARNm diana usando 2 genes de constitutivos, Lh425 (SDHA) y Lh427 (rpl 11).
En el control, se observaron transgénicos de GUS y no se observó regulación por disminución del ARNm diana endógeno de Lh423. Pero los resultados claramente demostraron una regulación por disminución del ARNm de
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Lh423 de Lygus endógeno que corresponde al ARNbc ingerido por los animales alimentados con 3 eventos diferentes de plantas transgénicas de Lh423 (Figura 23).
4.3. Transformación de algodón con un vector de expresión de plantas que comprende una secuencia de horquilla de Lygus hesperus y ensayo del material calloso o plantas de algodón transformadas para la resistencia contra L. hesperus
El ejemplo que se proporciona a continuación es una ejemplificación del hallazgo de que las plantas o callo de algodón transgénico que expresan los ARN de horquilla específicos de genes diana afectan adversamente a la supervivencia y/o el desarrollo de las especies de plagas de insectos.
Transformación de algodón
La superficie de la semilla de Coker 312 se esteriliza usando primero un lavado de 5 minutos en un 70% de etanol y agitando luego en un 20% de una solución blanqueadora (Clorox Co. Estados Unidos, 1% de cloro disponible) más 10 gotas del detergente no iónico, Tween® 20, por litro. La semilla se enjuaga luego 3 veces en agua destilada estéril antes de secarse mediante transferencia por adsorción en papeles de filtro estériles. La semilla estéril se germina sobre un medio de Germinación (SG) durante 4-6 días, y en este punto los hipocótilos se cosechan y se cortan en longitudes de 0,5 cm listos para inoculación de Agrobacterium. Las secciones de corte se colocan en papeles de filtro estériles superponiendo un medio basado en Murashige y Skoog que no contiene fitohormonas. Las explantas se incuban en un ciclo de 16:8 horas de día:noche a 28oC +/- 2oC durante 3 días antes de la inoculación.
Para la inoculación, se cultiva durante toda la noche un cultivo de LB líquido de Agrobacterium tumefaciens (10 ml), cepa GV3101 (pMP90) GentR o cepa LBA4404 que contiene la diana de horquilla de ARN seleccionada y un casete de selección de plantas que codifica resistencia a higromicina, y se utilizan 5 ml para inocular un cultivo de 100 ml la noche antes de la inoculación. El cultivo se centrifuga, se resuspende y se diluye hasta una OD600 de 0,15 en el medio de dilución bacteriano.
Los segmentos de hipocótilos se inoculan con la suspensión de Agrobacterium durante 5 minutos. Después de esto, las explantas se transfieren por adsorción a un papel de filtro estéril para quitar el exceso de suspensión bacteriana. Las explantas se inoculan en la oscuridad sobre Medio de Cocultivo de Algodón (CCM) durante 48 horas. Las explantas entonces se ubicaron en medio de inducción de callos selectivo (SCIM) que contenía 10mg/l de higromicina y 500 mg/l de Cefotaxima y que incluye las fitohormonas ácido 2,4-diclorofenoxiacético (0,1 pg/ml) y cinetina (0,1 pg/ml). Después de 4-6 semanas, se observan los primeros callos resistentes, y estos pueden retirarse a SCIM fresco y amplificarse adicionalmente para evaluación molecular y bioensayos de insectos. Las placas se renuevan cada 4-6 semanas para mantener los nutrientes y la selección de antibióticos.
Los callos que muestran proporcionar un resultado positivo en el bioensayo de alimentación de insectos se eligen para la regeneración y el callo se transfiere a medio no selectivo para la maduración de los embriones somáticos, la fórmula se basa en la publicación de Trolinder y Goodin, 1986. Una vez que los embriones han alcanzado 4 mm de longitud y han diferenciado los cotiledones y las radículas (2-3 meses después de la transferencia a medio de maduración), pueden transferirse a medio de enraizamiento de elongación. Este consiste en vermiculita esterilizada en grandes tubos de ensayo impregnada con un medio líquido basado en Stewart y Hsu (1977) enriquecido con cinetina, ácido giberélico ambos añadidos a la concentración final de 0,1 mg/l. Los embriones se incuban a 28°C en un ciclo de 16:8 día/noche, y una vez alcanzan la fase de 2-3 hojas, las plántulas pueden fortalecerse en macetas de vermiculita encerradas en un propagador para mantener la humedad. Una vez que las plantas se habían endurecido por completo (etapa de 4-6 hojas verdaderas), pueden colocarse en macetas en una mezcla 50:50 de turba:marga y se cultivaron en un ciclo de luz 14:10 a 30/20oC de día/noche.
Bioensayo
Se colocan ninfas de L. hesperus en una placa Petri que contiene tejido calloso de algodón indiferenciado que expresa el ARN de horquilla diana. Por construcción, se generan varios callos de algodón transformados y se evalúan en un bioensayo de alimentación para supervivencia reducida de ninfas/adultos y/o desarrollo retrasado y crecimiento atrofiado. Los callos transgénicos que no expresan el fragmento génico del ARN de horquilla diana de L. hesperus sirven como control negativo. Asimismo, las plantas de algodón regeneradas jóvenes de callos transgénicos se cultivan en suelo en una cámara de cultivo de plantas con las siguientes condiciones: 30/20°C de día/noche, 50 ± 5% de humedad relativa, fotoperiodo de 14:10 horas de luz:oscuridad. Por construcción, se generan varios eventos (por ejemplo, veinte). Varias ninfas/adultos jóvenes de L. hesperus se colocan en las plantas jóvenes (por ejemplo, en la fase de 4-5 hojas desplegadas) confinadas individualmente y se dejan durante al menos siete días antes de evaluar la resistencia contra L. hesperus en términos de reducción de la supervivencia de las ninfas/adultos, retardo en el desarrollo y crecimiento atrofiado, y/o disminución en los daños por alimentación sobre la planta. Las plantas de algodón no transformadas con el fragmento génico del ARN de horquilla diana de L. hesperus sirven como control negativo.
Ejemplo 5 Identificación de genes diana en Leptinotarsa decemlineata
5
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20
25
30
35
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45
50
5.1. Biblioteca de ADNc normalizado de Leptinotarsa decemlineata y preparación de ARNbc en placas de múltiples pocillos para ensayos de detección
Se aislaron ácidos nucleicos de larvas de Leptinotarsa decemlineata de diferentes etapas. Se preparó una biblioteca de ADNc usando el kit de síntesis de ADNc por PCR SMARTer™, siguiendo las instrucciones del fabricante (Clontech Cat. n.° 634925). La biblioteca de ADNc se normalizó usando el kit Trimmer (Evrogen Cat. n.° NK001) y se clonó en el vector PCR®-BLUNTII-TOPO® (Invitrogen). La normalización de los clones introdujo adaptadores M2 (Trimmer Kit, Evrogen, SEQ ID NO 92: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) orientados en dirección opuesta en cada extremo de los clones. Las construcciones del vector recombinante se transformaron en células de la cepa TOP10 de Escherichia coli (Invitrogen). Posteriormente se diluyeron las células transformadas y se sembraron en placa para obtener colonias individuales o clones. Los clones se revisaron para asegurarse de que la redundancia de clones para la biblioteca no excediera un 5%. Se inocularon clones únicos en medios de LB (caldo Luria) líquido, en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante una noche a 37°C. Las placas también incluyeron clones control positivos (Ld513) y negativos (FP).
Para generar el ARNbc, se generaron mediante PCR fragmentos de ADN codificantes y no codificantes que contenían la secuencia promotora T7. En resumen, por clon, se distribuyó 1 pl de suspensión bacteriana en placas de PCR de múltiples pocillos que contienen REDTaq® (Sigma Cat. n.° D4309) y los cebadores oGCC2738 (SEQ ID NO 93: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) y oGCC2739 (SEQ ID NO 94:
GCGTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGTGGTATCAACGCAG) basados en las secuencias M2 y la T7-M2, respectivamente. La reacción de PCR estuvo seguida de una transcripción in vitro, donde, por clon, se utilizaron 6 pl de producto de PCR en un volumen de reacción de 20 pl que contenía los reactivos de transcripción proporcionados por el Sistema de Producción de ARN a Gran Escala RiboMAX™ - kit T7 (Promega Cat. n.° P1300) y se incubaron durante toda la noche a 37°C. La solución de ARNbc final se diluyó en agua Milli-Q estéril y se utilizó para la detección. El ARNbc que corresponde al clon de control de Ld513 positivo es la SEQ ID NO 400 (véase la Tabla 11) y al clon de control de FP negativo es la SEQ ID NO 104 (véase la Tabla 4).
5.2. Detección de genes diana novedosos y potentes de Leptinotarsa decemlineata usando una biblioteca de ADNc de expresión de ARNbc
Cada pocillo de una placa de 48 pocillos contenía 0,5 ml de dieta artificial pretratada con una capa tópica de 25 pl (o 1 pg) del ARNbc de prueba o control. Una larva L2 se colocó en cada pocillo y se evaluaron 3 larvas por clon. Los números de supervivencia de CPB se evaluaron los días 4, 7 y 10.
En un segundo bioensayo, las larvas de CPB se alimentaron con dieta y se trataron con un ARNbc de prueba aplicado tópicamente generado a partir de clones derivados de una biblioteca de ADNc normalizado. Una larva se colocó en un pocillo de una placa de 48 pocillos que contenía una dieta de 0,5 ml pretratados con una capa de 25 pl de una solución de 40 ng/pl de ARNbc. Se evaluó un total de veinticuatro larvas por tratamiento (clon). El número de insectos supervivientes se evaluó en los días 4, 5, 6, 7, 8 y 11. El porcentaje de mortalidad larvaria se calculó respecto al día 0 (inicio del ensayo) (véase la Figura 29).
5.3. Identificación de dinas del escarabajo L. decemlineata
Las nuevas secuencias diana de la detección de 5.2. y las secuencias diana correspondientes a las dianas de la ruta de troponina, ortólogas a las secuencias Lh594, Lh619 y Lh620 de Lygus, se han identificado en L. decemlineata. Los cebadores que proporcionaron fragmento de ADNc relevante para Ld594 se enumeran en la Tabla 19. Las secuencias de ADNc y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana se determinaron y se proporcionan en las Tablas 9 y 10 respectivamente.
5.4. Producción de ARNbc correspondientes a las secuencias parciales de los genes diana de L. decemlineata
El ARNbc se sintetizó usando los cebadores proporcionados en la Tabla 11. La hebra codificante del ARNbc resultante producida de los genes diana se proporciona en la Tabla 11.
5.5. Ensayos de análisis de supervivencia para novedosas dianas de L. decemlineata Ensayo de larvas tempranas
Se produjeron ARNbc sintéticos para las 3 dianas, Ld594, Ld619 y Ld620, y se evaluaron en un ensayo de alimentación con las larvas de CPB (véase la Figura 24). Se llevó a cabo un ensayo de 10 días en placas de 48 pocillos, con dieta artificial (basada en Gelman et al, J Ins Sc,1:7, 1-10: Artificial diets for rearing the Colorado Potato Beetle), enriquecida con 1 pg de ARNbc/pocillo, con 12 larvas por condición.
Pudo observarse un claro efecto en el desarrollo de las larvas. Se configuró un segundo ensayo para investigar el efecto de estos ARNbc durante el transcurso de la pupación y la metamorfosis (véase el ensayo de pupación más abajo).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ensayo de pupación
Se configuró un ensayo de pupación de CPB para investigar el efecto de la desactivación por iARN de Ld594, Ld619 y Ld620 durante la pupación y la metamorfosis. Las larvas de cuarto estadio se alimentaron con 1 |jg de ARNbc sintetizado in vitro dispensado en un disco de hoja de patata y luego se transfirieron a un caja que contenía hojas de patata frescas sin tratar. Cuatro días después los insectos que sobrevivieron se colocaron en vermiculita para permitir la pupación. Los insectos tratados con Lh594 fueron lentos, más pequeños y en mayor medida fueron incapaces de superar la pupación. La eclosión de la pupa se evaluó al final del experimento. Para el control sin tratar, puparon 24 larvas y todas eclosionaron en adultos saludables. Para Ld620, se observó una disminución del número de larvas que evolucionaron hasta pupación. Para las tres dianas evaluadas, ninguna larva evolucionó en pupas saludables y ninguna emergió como adulto. Los insectos muertos recuperados de la vermiculita mostraron varios grados de malformaciones (Figura 25).
Ld594, Ld619 y Ld620 primero aparecieron como dianas no letales en el ensayos de larvas de CPB, a pesar de que se observó claramente una reducción de la vitalidad en los insectos tratados con ARNbc. Por otro lado, en el ensayo de pupación, las 3 dianas indujeron efectos importantes e inhibieron la entrada en pupación y/o metamorfosis.
Ensayo de adultos
Para evaluar la actividad de Ld594, Ld619 y Ld620 en adultos de CPB, se configuró un ensayo de disco de hojas. Un disco de hoja de patata (1,7 cm de diámetro) se recubrió con ARNbc o controles y se colocó en una placa Petri de 3,5 cm con un escarabajo adulto. Al día siguiente se proporcionó un disco nuevo de hojas tratadas a los insectos. El tercer día, los adultos se transfirieron a una caja que contenía suficientes hojas de patata frescas sin tratar para soportar la supervivencia de los controles sin tratar. Por tratamiento, se ensayaron 6 adultos y se contaron los números de supervivientes y de insectos moribundos a intervalos regulares desde el día 6 hasta el día 13. Los insectos se consideraban moribundos si eran incapaces de erguirse por sí mismos tras colocarlos sobre el dorso.
A pesar del nivel relativamente alto de fondo en el control negativo en este ensayo particular, se observaron claros efectos para los insectos que se habían expuesto a ARNbc de Ld594 o Ld619 (Figura 26).
Ejemplo 6 Identificación de genes diana en Nilaparvata lugens
6.1. Identificación de dianas de Nilaparvata lugens
Se han identificado en saltamontes pardo del arroz, Nilaparvata lugens, nuevas secuencias diana, que corresponden a las dianas de la ruta de Troponina y nombrados como Nl594 (Troponina I), Nl619 (Troponina T) y Nl626 (Troponina C). Las secuencias ortólogas de los genes de Lygus, nombrados como Nl594 (Troponina I), Nl619 (Troponina T) y Nl625/626 (Troponina C), se clonaron a través de PCR con cebador degenerado, usando ADNc de BPH como molde. Además, el ADNc de longitud completa se identificó para Nl594, usando RACE (véase el método anteriormente). Se utilizó el sistema de PCR AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante y con condiciones convencionales para las reacciones de PCR con cebador degenerado, normalmente de la siguiente forma: 1 ciclo con 10 minutos a 95°C, posteriormente 40 ciclos con 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto a 72°C y posteriormente 10 minutos a 72°C. Para aumentar la tasa de éxito, se diseñaron hasta 10 cebadores degenerados diferentes, directos e inversos, basándose en alineaciones de secuencias ortólogas en otras especies, y se utilizaron en varias combinaciones. Los fragmentos de PCR obtenidos se purificaron a partir del gel mediante el kit de extracción de gel (Qiagen Cat. n.° 28706) y se clonaron en un vector TOPO TA (Invitrogen). Se secuenciaron los clones y se utilizaron las secuencias de consenso en búsquedas Blast en bases de datos de secuencias de insectos disponibles para confirmar la relevancia del inserto. Los cebadores degenerados que resultaron en una amplificación exitosa se enumeran en la Tabla 20.
Se determinaron las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana y otro gen diana (NI537) y se proporcionan en las Tablas 12 y 13, respectivamente.
6.2. Producción de ARNbc que corresponde a las secuencias parciales de los genes diana de Nilaparvata lugens
El ARNbc se sintetizó usando los cebadores proporcionados en la Tabla 14. La hebra codificante del ARNbc resultante producida de cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 14.
6.3. Ensayos de análisis de supervivencia para novedosas dianas de Nilaparvata lugens
Los ARNbc se sintetizaron y se evaluaron en ensayos de iARN por alimentación de BPH previamente optimizados, en presencia del detergente zwitteriónico, CHAPSO, a un 0,1% de concentración final. Los ARNbc se evaluaron a 0,5 jg/jl de concentración final. Se utilizó Nl537, una diana potente en los ensayos de BPH como una diana de referencia en el ensayo. La supervivencia de los insectos se evaluó en el trascurso de 9 días.
Los resultados del bioensayo mostraron que en BPH, Nl594, Nl619 y Nl626 también fueron dianas de iARN potentes en BPH (Figura 27).
Ejemplo 7 Identificación de genes diana en Acyrthosiphon pisum
7.1. Identificación de dianas de Acyrthosiphon pisum
Se han identificado nuevas secuencias diana en áfidos y se nombraron como Ap423, Ap537, Ap560 y Ap594, siguiendo la misma nomenclatura: "Apxxx", donde "Ap" corresponde a Acyrthosiphon pisum y "xxx" a la ID de la 5 diana. Los cebadores se diseñaron basándose en la predicción de genes de dominio público de AphidBase (ref:
http://www.aphidbase.com/) (Tabla 15).
Las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de estos genes diana se determinaron y se proporcionan en las Tablas 16 y 17 respectivamente.
7.2. Producción de ARNbc que corresponde a las secuencias parciales de los genes diana de áfidos
10 El ARNbc se sintetizó usando los cebadores proporcionados en la Tabla 18. La hebra codificante del ARNbc resultante producida de cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 18.
7.3. Ensayos de análisis de supervivencia para novedosas dianas de áfidos
Se evaluó la iARN por alimentación en Acyrthosiphon pisum (pulgón del guisante) con 4 dianas: Ap594, Ap423, Ap560, Ap537. Las secuencias se amplificaron mediante PCR usando cebadores, diseñados sobre la información de 15 secuencias de dominio público (
http://www.aphidbase.com) y se preparó ADNc de áfidos. Se prepararon y se evaluaron ARNbc sintéticos a una concentración final de 0,5 pg/pl en presencia de 5 pg/pl de ARNt de levadura en una dieta de sacarosa. Diez ninfas de pulgón del guisante recién nacidas se colocaron en una placa Petri (32 mm). Se colocaron en una pipeta cincuenta pl de dieta (con ARNt y ARNbc) sobre la primera capa de parafilm. Una segunda capa de parafilm cubrió la dieta y creó una bolsita de alimentación donde los áfidos pudieron alimentarse. 20 Por diana se configuraron cinco repeticiones de diana de 10 ninfas recién nacidas. El ARNbc de GFP se utilizó como control negativo. La dieta se renovó el día 4 y 7 de los ensayos y se evaluó la supervivencia (Figura 28).
Tabla 2
ID de la diana
Secuencia de ADNc (hebra codificante) 5' ^ 3'
Lh594
SEQ ID NO 1
Lh609
SEQ ID NO 3
Lh610
SEQ ID NO 5
Lh610 (b)
SEQ ID NO 139
Lh611
SEQ ID NO 7
Lh611 (b)
SEQ ID NO 140
Lh617
SEQ ID NO 9
Lh618
SEQ ID NO 11
Lh618 (b)
SEQ ID NO 141
Lh429
SEQ ID NO 13
Lh423
SEQ ID NO 95
Lh105.2
SEQ ID NO 96
Lh560
SEQ ID NO 15
Lh615
SEQ ID NO 17
Lh612
SEQ ID NO 19
Lh246
SEQ ID NO 21
Lh597
SEQ ID NO 23
Lh598
SEQ ID NO 25
Lh619
SEQ ID NO 121
Lh619 (b)
SEQ ID NO 142
Lh619 (c)
SEQ ID NO 143
Lh620
SEQ ID NO 122
Lh620 (b)
SEQ ID NO 144
Lh620 (c)
SEQ ID NO 145
Lh621
SEQ ID NO 123
Lh622
SEQ ID NO 124
Lh623
SEQ ID NO 125
Lh623 (b)
SEQ ID NO 146
Lh624
SEQ ID NO 126
Lh624 (b)
SEQ ID NO 147
Lh625
SEQ ID NO 127
Lh625 (b)
SEQ ID NO 148
Lh626
SEQ ID NO 128
Lh626 (b)
SEQ ID NO 149
Lh614
SEQ ID NO 129
Lh627
SEQ ID NO 150
Lh628
SEQ ID NO 152
Lh629
SEQ ID NO 154
Lh630
SEQ ID NO 156
Lh631
SEQ ID NO 158
Lh632
SEQ ID NO 160
Lh633.1
SEQ ID NO 162
Lh633.2
SEQ ID NO 163
Lh634.1
SEQ ID NO 165
Lh634.2
SEQ ID NO 167
Lh595.1
SEQ ID NO 168
Lh595.2
SEQ ID NO 170
Lh596
SEQ ID NO 172
Tabla 3
ID de la diana
Secuencia de aminoácidos correspondiente al clon de ADNc como se representa en la Tabla 2
Lh594
SEQ ID NO 79
Lh609
SEQ ID NO 80
Lh610
SEQ ID NO 81
Lh610 (b)
SEQ ID NO 326
Lh611
SEQ ID NO 82
Lh611 (b)
SEQ ID NO 327
Lh617
SEQ ID NO 83
Lh618
SEQ ID NO 84
Lh618 (b)
SEQ ID NO 328
Lh429
SEQ ID NO 85
Lh429 (b)
SEQ ID NO 329
Lh423
SEQ ID NO 99
Lh105.2
SEQ ID NO 100
Lh560
SEQ ID NO 86
Lh615
SEQ ID NO 87
Lh612
SEQ ID NO 88
Lh246
SEQ ID NO 89
Lh597
SEQ ID NO 90
Lh598
SEQ ID NO 91
Lh619
SEQ ID NO 330
Lh620
SEQ ID NO 331
Lh621
SEQ ID NO 332
Lh622
SEQ ID NO 333
Lh623
SEQ ID NO 334
Lh624
SEQ ID NO 335
Lh625
SEQ ID NO 336
Lh626
SEQ ID NO 337
Lh614
SEQ ID NO 338
Lh627
SEQ ID NO 339
Lh628
SEQ ID NO 340
Lh629
SEQ ID NO 341
Lh630
SEQ ID NO 342
Lh631
SEQ ID NO 343
Lh632
SEQ ID NO 344
Lh633.1
SEQ ID NO 345
Lh633.2
SEQ ID NO 346
Lh634.1
SEQ ID NO 347
Lh634.2
SEQ ID NO 348
ID de la diana
Cebadores directos 5' ^ 3' Cebadores inversos 5' ^ 3' ARNbc: hebra representada por la aDn equivalente 5' ^ 3' codificante secuencia de
Lh594
SEQ ID NO 27 SEQ ID NO 29 SEQ ID NO 28 SEQ ID NO 30 SEQ ID NO 2
Lh609
SEQ ID NO 31 SEQ ID NO 33 SEQ ID NO 32 SEQ ID NO 34 SEQ ID NO 4
Lh610
SEQ ID NO 35 SEQ ID NO 37 SEQ ID NO 36 SEQ ID NO 38 SEQ ID NO 6
Lh611
SEQ ID NO 39 SEQ ID NO 41 SEQ ID NO 40 SEQ ID NO 42 SEQ ID NO 8
Lh617
SEQ ID NO 43 SEQ ID NO 45 SEQ ID NO 44 SEQ ID NO 46 SEQ ID NO 10
Lh618
SEQ ID NO 47 SEQ ID NO 49 SEQ ID NO 48 SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 12
Lh429
SEQ ID NO 51 SEQ ID NO 53 SEQ ID NO 52 SEQ ID NO 54 SEQ ID NO 14
Lh423
SEQ ID NO 105 SEQ ID NO 107 SEQ ID NO 106 SEQ ID NO 108 SEQ ID NO 101
Lh105.2
SEQ ID NO 109 SEQ ID NO 111 SEQ ID NO 110 SEQ ID NO 112 SEQ ID NO 102
GFP
SEQ ID NO 113 SEQ ID NO 115 SEQ ID NO 114 SEQ ID NO 116 SEQ ID NO 103
Pt
SEQ ID NO 117 SEQ ID NO 119 SEQ ID NO 118 SEQ ID NO 120 SEQ ID NO 104
Lh560
SEQ ID NO 55 SEQ ID NO 57 SEQ ID NO 56 SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 16
Lh615
SEQ ID NO 59 SEQ ID NO 61 SEQ ID NO 60 SEQ ID NO 62 SEQ ID NO 18
Lh612
SEQ ID NO 63 SEQ ID NO 65 SEQ ID NO 64 SEQ ID NO 66 SEQ ID NO 20
Lh246
SEQ ID NO 67 SEQ ID NO 69 SEQ ID NO 68 SEQ ID NO 70 SEQ ID NO 22
Lh597
SEQ ID NO 71 SEQ ID NO 73 SEQ ID NO 72 SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 24
Lh598
SEQ ID NO 75 SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 76 SEQ ID NO 78 SEQ ID NO 26
Lh619
SEQ ID NO 206 SEQ ID NO 208 SEQ ID NO 207 SEQ ID NO 209 SEQ ID NO 130
Lh620
SEQ ID NO 210 SEQ ID NO 212 SEQ ID NO 211 SEQ ID NO 213 SEQ ID NO 131
Lh621
SEQ ID NO 214 SEQ ID NO 216 SEQ ID NO 215 SEQ ID NO 217 SEQ ID NO 132
Lh622
SEQ ID NO 218 SEQ ID NO 220 SEQ ID NO 219 SEQ ID NO 221 SEQ ID NO 133
Lh623
SEQ ID NO 222 SEQ ID NO 224 SEQ ID NO 223 SEQ ID NO 225 SEQ ID NO 134
Lh624
SEQ ID NO 226 SEQ ID NO 228 SEQ ID NO 227 SEQ ID NO 229 SEQ ID NO 135
Lh625
SEQ ID NO 230 SEQ ID NO 232 SEQ ID NO 231 SEQ ID NO 233 SEQ ID NO 136
Lh626
SEQ ID NO 234 SEQ ID NO 236 SEQ ID NO 235 SEQ ID NO 237 SEQ ID NO 137
Lh614
SEQ ID NO 238 SEQ ID NO 240 SEQ ID NO 239 SEQ ID NO 241 SEQ ID NO 138
Lh627
SEQ ID NO 242 SEQ ID NO 244 SEQ ID NO 243 SEQ ID NO 245 SEQ ID NO 151
Lh628
SEQ ID NO 246 SEQ ID NO 248 SEQ ID NO 247 SEQ ID NO 249 SEQ ID NO 153
Lh629
SEQ ID NO 250 SEQ ID NO 25 SEQ ID NO 251 SEQ ID NO 253 SEQ ID NO 155
Lh630
SEQ ID NO 254 SEQ ID NO 256 SEQ ID NO 255 SEQ ID NO 257 SEQ ID NO 157
Lh631
SEQ ID NO 258 SEQ ID NO 260 SEQ ID NO 259 SEQ ID NO 261 SEQ ID NO 159
Lh632
SEQ ID NO 262 SEQ ID NO 264 SEQ ID NO 263 SEQ ID NO 265 SEQ ID NO 161
Lh633.2
SEQ ID NO 266 SEQ ID NO 268 SEQ ID NO 267 SEQ ID NO 269 SEQ ID NO 164
Lh634.1
SEQ ID NO 270 SEQ ID NO 272 SEQ ID NO 271 SEQ ID NO 273 SEQ ID NO 166
Lh595
SEQ ID NO 274 SEQ ID NO 275 SEQ ID NO 169
SEQ ID NO 276 SEQ ID NO 277
Lh596
SEQ ID NO 278 SEQ ID NO 279 SEQ ID NO 173
SEQ ID NO 280 SEQ ID NO 281
Tabla 8
ID de la diana
Cebadores directos 5' ^ 3' Cebadores inversos 5' ^ 3' Amplicón de qRT-PCR 5' ^ 3'
Lh423
SEQ ID NO 360 SEQ ID NO 361 SEQ ID 362
Lh425
SEQ ID 363 SEQ ID 364 SEQ ID 365
Lh427
SEQ ID 366 SEQ ID 367 SEQ ID 368
Tabla 9
ID de la diana
Secuencia de ADNc (hebra codificante) 5' ^ 3'
Ld594
SEQ ID NO 174
Ld619
SEQ ID NO 176
Ld620
SEQ ID NO 178
Ld583
SEQ ID NO 386
Ld584
SEQ ID NO 387
Ld586
SEQ ID NO 388
Ld588
SEQ ID NO 389
Ld513
SEQ ID NO 394
Tabla 10
ID de la diana
Secuencia de aminoácidos correspondiente al clon de ADNc como se representa en la Tabla 9
Ld594
SEQ ID NO 349
Ld619
SEQ ID NO 350
Ld620
SEQ ID NO 351
Ld583
SEQ ID NO 390
Ld584
SEQ ID NO 391
Ld586
SEQ ID NO 392
Ld588
SEQ ID NO 393
Ld513
SEQ ID NO 395
Tabla 11
ID de la
Cebadores Cebadores ARNbc: hebra codificante representada por la
diana
directos inversos secuencia de ADN equivalente
5' ^ 3' 5' ^ 3' 5' ^ 3'
Ld594
SEQ ID NO 282 SEQ ID NO 283 SEQ ID NO 175
SEQ ID NO 284 SEQ ID NO 285
Ld619
SEQ ID NO 286 SEQ ID NO 287 SEQ ID NO 177
SEQ ID NO 288 SEQ ID NO 289
Ld620
SEQ ID NO 290 SEQ ID NO 291 SEQ ID NO 179
SEQ ID NO 292 SEQ ID NO 293
Ld513
SEQ ID NO 396 SEQ ID NO 397 SEQ ID NO 400
SEQ ID NO 398 SEQ ID NO 399
Tabla 12
ID de la diana
Secuencia de ADNc (hebra codificante) 5' ^ 3'
NI594
SEQ ID NO 180
NI619
SEQ ID NO 182
NI626
SEQ ID NO 184
NI537
SEQ ID NO 186
Tabla 13
ID de la diana
Secuencia de aminoácidos correspondiente al clon de ADNc como se representa en la Tabla 12
NI594
SEQ ID NO 352
NI619
SEQ ID NO 353
NI626
SEQ ID NO 354
NI537
SEQ ID NO 355
Tabla 14
ID de la diana
Cebadores directos Cebadores inversos ARNbc: hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente
5' ^ 3' 5' ^ 3' 5' ^ 3'
NI594
SEQ ID NO 294 SEQ ID NO 295 SEQ ID NO 181
SEQ ID NO 296 SEQ ID NO 297
NI619
SEQ ID NO 298 SEQ ID NO 299 SEQ ID NO 183
SEQ ID NO 300 SEQ ID NO 301
NI626
SEQ ID NO 302 SEQ ID NO 303 SEQ ID NO 185
SEQ ID NO 304 SEQ ID NO 305
NI537
SEQ ID NO 306 SEQ ID NO 307 SEQ ID NO 187
SEQ ID NO 308 SEQ ID NO 309
Tabla 15
Diana
Secuencia de cebador directo Secuencia de cebador inverso
Ap594
SEQ ID NO 369 SEQ ID NO 370
Ap423
SEQ ID NO 371 SEQ ID NO 372
Ap537
SEQ ID NO 373 SEQ ID NO 374
Ap560
SEQ ID NO 375 SEQ ID NO 376
Tabla 16
ID de la diana
Secuencia de ADNc (hebra codificante) 5' ^ 3'
Ap594
SEQ ID NO 188
Ap423
SEQ ID NO 200
Ap537
SEQ ID NO 202
Ap560
SEQ ID NO 204
Tabla 17
ID de la diana
Secuencia de aminoácidos correspondiente al clon de ADNc como se representa en la Tabla 16
Ap594
SEQ ID NO 356
Ap423
SEQ ID NO 357
Ap537
SEQ ID NO 358
Ap560
SEQ ID NO 359
Tabla 18
ID de la diana
Cebadores directos Cebadores inversos ARNbc: hebra codificante representada por la secuencia de ADN equivalente
5' ^ 3' 5' ^ 3' 5' ^ 3'
Ap594
SEQ ID NO 310 SEQ ID NO 311 SEQ ID NO 189
SEQ ID NO 312 SEQ ID NO 313
Ap423
SEQ ID NO 314 SEQ ID NO 315 SEQ ID NO 201
SEQ ID NO 316 SEQ ID NO 317
Ap537
SEQ ID NO 318 SEQ ID NO 319 SEQ ID NO 203
SEQ ID NO 320 SEQ ID NO 321
Ap560
SEQ ID NO 322 SEQ ID NO 323 SEQ ID NO 205
SEQ ID NO 324 SEQ ID NO 325
5 Tabla 19
Diana
Cebador directo Cebador inverso
Ld594
SEQ ID NO 377 SEQ ID NO 378
Diana
Cebador directo Cebador inverso
Nl594
seq id no 379 seq id no 380
Nl619
seq id no 381 seq id no 382
Nl626
seq id no 383 seq id no 384
Tabla 21
ID de la diana
Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Ld583
CG4759 Proteína ribosómica L27 RpL27
Ld584
CG 17331 Proteasoma, subunidad tipo beta
Ld586
CG13704 desconocido
Ld588
CG4157 Rpn12
Tabla 22
ID de la diana
Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Nl594
CG7178 wings up A (troponina I) wupA
Nl619
CG7107 troponina T (sostenida) up
Nl626
*CG9073, CG7930, CG2981, CG12408, CG6514, CG2981, CG7930, CG9073, CG6514, CG12408 troponina C
Nl537
CG32744 Ubiquitina- 5E; proceso de modificación de proteína
*incierto: múltiples coincidencias en la familia
Tabla 23
ID de la diana
Mejor coincidencia con Drosophila NOMBRE SÍMBOLO
Ap594
CG7178 wings up A (troponina I) wupA
Ap423
CG2746 proteína ribosómica L19 RpL19
Ap537
CG32744 Ubiquitina-5E; proceso de modificación de proteína
Ap560
CG10423 proteína ribosómica S27 RpS27
5 Los expertos en la materia apreciarán que pueden hacerse numerosas variaciones y/o modificaciones a los ensayos mencionados anteriormente. Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de averiguar, usando poco más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a los ejemplos específicos. El presente ejemplo, por lo tanto, debe considerarse en todos los aspectos como ilustrativo y no restrictivo.

Claims (25)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    1. Una planta transgénica, o material reproductor o de propagación para una planta transgénica o una célula vegetal transgénica cultivada, que expresa o es capaz de expresar al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga, en la que el ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador en la que el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos que es al menos un 85% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
  2. 2. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de la reivindicación 1, en la que el ARN comprende al menos dos elementos silenciadores, en la que cada elemento silenciador comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana.
  3. 3. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que dicha especie de plaga de insectos se selecciona de las especies de insectos que pertenecen a los órdenes: Coleóptera, Hemiptera, Lepidoptera, Díptera, Dichyoptera, Orthoptera y Siphonaptera.
  4. 4. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de la reivindicación 3, en la que dicha especie de plaga de insectos se selecciona del grupo que consiste en Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L. juncta (falso escarabajo de la patata) o L. texana (falso escarabajo de la patata de Texas)); Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes pardo del arroz)); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche manchada) o L. hesperus (chinche manchada del oeste)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (pulgón verde del melocotonero)); Diabrotica spp. (por ejemplo, D. virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental), D. barberi (gusano de la raíz del maíz norteño), D. undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz sureño), D. virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano)).
  5. 5. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho gen diana codifica una proteína troponina I de insecto.
  6. 6. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de la reivindicación 5, en la que la regulación por disminución de la expresión de dicho gen diana de la plaga causa disminución del crecimiento, desarrollo, reproducción o supervivencia de dicha plaga en comparación con dicha especie de plaga expuesta a un ARN interferente dirigido a un gen no esencial o un ARN interferente que no regula por disminución ninguno de los genes dentro de dicha especie de plaga.
  7. 7. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicha planta transgénica, material de la misma o célula vegetal comprende adicionalmente un gen heterólogo.
  8. 8. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de la reivindicación 7, en la que dicho gen heterólogo codifica una proteína tóxica para una especie de plaga para las plantas.
  9. 9. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de la reivindicación 8, en la que dicha proteína se selecciona del grupo que consiste en una patatina, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Bacillus laterosporus y una proteína insecticida de Bacillus sphaericus.
  10. 10. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de la reivindicación 9, en la que dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis se selecciona del grupo que consiste en una Cry1, una Cry3, una TIC851, una CryET170, una Cry22, una TIC901, una TIC201, una TIC407, una TIC417, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de una proteína insecticida ET29 o ET37 con una proteína insecticida TIC810 o TIC812, y una proteína insecticida binaria PS149B1.
  11. 11. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de la reivindicación 7, en la que dicho gen heterólogo codifica una proteína que confiere tolerancia a herbicidas.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  12. 12. La planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica, o célula vegetal transgénica cultivada de la reivindicación 11, en la que dicha proteína se selecciona de una versión insensible a glifosato de una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una enzima catabólica que es capaz de descomponer dicamba, tal como dicamba monooxigenasa o un gen de la fosfinotricina acetil transferasa que es capaz de catabolizar glufosinato de amonio.
  13. 13. Semilla transgénica producida a partir de la planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que dicha semilla transgénica expresa o es capaz de expresar un ácido ribonucleico (ARN) interferente como se define en la reivindicación 1.
  14. 14. Un método para generar una planta transgénica resistente a la infestación por parte de una especie de plaga de insectos que comprende:
    (a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha especie de plaga de insectos, en el que el ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador en el que el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos que es al menos un 85% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas;
    (b) regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada; y
    (c) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión del ARN interferente de la construcción de ADN, siendo dicha planta, por tanto, resistente a dicha plaga en comparación con una planta sin transformar.
  15. 15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14, en el que dicha planta resistente a la infestación por una plaga de insectos se elige de algodón, patata, arroz, colza, girasol, sorgo, mijo, maíz, fresas, soja, alfalfa, tomate, berenjena, pimiento y tabaco.
  16. 16. Un método para prevenir y/o controlar la infestación por una plaga de insectos en un campo de plantas de cultivo, comprendiendo dicho método expresar en dichas plantas una cantidad eficaz de un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha especie de plaga de insectos, en el que el ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador en el que el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia de al menos 30 nucleótidos contiguos que es al menos un 85% complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 174, 180, 188, 2, 175, 181, 189 o el complemento de las mismas.
    287
    Figura 1
    100,0
  17. 90.0
  18. 80.0
  19. 70.0
  20. 60.0
    ra 50,0
    5
    |j 40,0 o
    E 30,0
    <D
    5 2°-°
    10,0
    0,0
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    0
    0
    O 0 O 0 0 0 0 O
    0
    0
    DO DO 00 DO DO 0 00 00 DO DO
    00
    >- >. >« >• DO > >■ >
    >*
    __1 __1 __I _l __1 —1 __1 _j
    □% muerte d6-c8 ■% muerte d3-c6
    Lh001-Lh009 confirmación 2
    imagen2
    imagen3
    Lh598
    100
    --*--Lh423 Control
    Lh 246
    Lh594
    Lh597
    60
    Ih599
    LlióOO
    Lh601
    40
    Lhb02
    Lh603
    Lh606
    Lh607
    Lh608
    GFP
    O “Control
    Días
    Figura 3
    imagen4
    Lh610
    100
    -^-Lh423 Control
    Lh429
    Lh605
    Lh609
    L16II
    LI16I6
    Lh617
    L16I8
    --♦--GFP
    ■O - Control
    Días
    Figura 4
    imagen5
    P35S
    L. hesperus
    pVSl sta
    ARNh
    TNOS
    P35S
    Vector de expresión
    pVSl rep
    de plantas
    GFP
    pBR322 bom
    T35S
    P35S
    pBR322 orí
    NPT
    TNOS IB
    KmR
    Figura 5
    imagen6
    Figura 6
    imagen7
    Diana de referencia - DRCLh423
    re
    "o
    c
    o
    >
    '£
    <u
    Q.
    3
    tn
    <D
    ■a
    90%
    80%
    70%
    60%
    50%
    40%
    30%
    20%
    10%
    0%
    ’V \
    V \
    _____________________________
    \
    -----A \
    \\
    1 \ 1 \ . . .. .
    v
    v_.
    ^ -I
    0 2 4 6 Días
    8 10
    —♦ * 0,4 Lh423 —» • 0,3 Lh423 —*• *0,2 Lh423 —*0,1 Lh423 —0,05 Lh423 0,025 Lh423 GFP Control
    Figura 7 continuación
    imagen8
    imagen9
    DRCLn560
    100%
    0,4 Lh560
    90%
    -------------------
    ^ s-----i;
    0,3 Lh560
    ns 80%
    «-----i!
    -0,2 LhS60
    70%
    — -O.ILhSGO
    0,05 Lh560
    0,025 Lh560
    50%
    GFP
    A------A
    40%
    Control
    30%
    20%
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