ES2654929T3 - Variantes de unión de anti-albúmina de suero mejoradas - Google Patents

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Abstract

Un dominio variable único de inmunoglobulina de anti-albúmina sérica (SA) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 412.

Description

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DESCIRPCION
Variantes de unión de anti-albúmina de suero mejoradas
La invención se refiere a variantes mejoradas del dominio variable sencillo de inmunoglobulina de anti-albúmina de suero DOM7h-14, así como a ligandos y fármacos conjugados que comprenden dichas variantes, composiciones, ácido nucleicos, vectores y huéspedes.
Antecedentes de la invención
Los documentos WO04003019 y WO2008/096158 describen restos de unión de anti-albúmina de suero (SA), tales como dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-SA (dAbs), que tienen semividas terapéuticamente útiles. Estos documentos describen dAbs anti-SA así como ligandos multiespecíficos que comprenden dichos dAbs, por ejemplo, ligandos que comprenden un dAb anti-SA y un dAb que se une específicamente a un antígeno diana, tal como TNFR1. Se describen restos de unión que se unen específicamente a albúminas de suero de más de una especie, por ejemplo dAbs anti-SA de reactividad cruzada de ser humano/ratón.
Los documentos WO05118642 y WO2006/059106 describen el concepto de conjugar o asociar un resto de unión anti-SA, tal como un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-SA, a un fármaco, para aumentar la semivida del fármaco. Se describen y ejemplifican proteínas, péptidos y fármacos NCE (nueva entidad química). El documento WO2006/059106 describe el uso de este concepto para aumentar la semivida de agentes insulinotrópicos, por ejemplo, hormonas incretinas tales como el péptido tipo glucagón (GLP)-1.
También se hace referencia a Holt y col, “Anti-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs”, Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, N° 5, pág. 283-288, 2008.
El documento WO2008/096158 describe DOM7h-14, que es un buen dAb anti-SA. Sería deseable proporcionar dAbs mejorados que fueran variantes del DOM7h-14 y que la albúmina de suero se les uniera específicamente, preferiblemente albúminas de especies humanas y no humanas, que proporcionarían utilidad en modelos animales de enfermedades así como para la terapia y/o diagnóstico en seres humanos. También sería deseable permitir la elección entre restos de unión (dAbs) anti-SA de afinidad relativamente moderada y elevada. Dichos restos podrían unirse a fármacos, eligiéndose el resto de unión anti-SA de acuerdo con la solicitud final contemplada. Esto permitiría al fármaco adaptarse mejor a las indicaciones crónicas o agudas del tratamiento y/o prevención, dependiendo de la elección del resto de unión anti-SA. También sería deseable proporcionar anti-dAbs, que sean monoméricos o sustancialmente lo sean en solución. Esto sería especialmente ventajoso cuando el dAb anti-SA esté unido a un resto de unión, por ejemplo, un dAb, que se une específicamente a un receptor de la superficie celular, tal como TNFR1, con el propósito de antagonizar al receptor. El estado monomérico del dAb anti-SA es útil para reducir la posibilidad de entrecruzamiento del receptor, ya que es menos probable que se formen multímeros que puedan unirse y producir entrecruzamientos de los receptores (por ejemplo, TNFR1) en la superficie celular, aumentando de esta manera la probabilidad de agonismo de los receptores y la señalización perjudicial de los receptores.
Sumario de la invención
Aspectos de la presente invención resuelven estos problemas.
Con este fin, los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que pueden dirigirse mutaciones beneficiosas en la región CDR3 de 92 a 96 (numeración de las posiciones de acuerdo con Kabat) comparada del DOM7h-14.
La presente invención proporciona un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de anti-albúmina de suero (SA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 412.
La presente invención también proporciona un ligando multi-específico que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-SA de la presente invención y un resto de unión que se une específicamente a un antígeno diana distinto de SA. En una realización, el ligando multi-específico comprende además un enlazante entre el dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-SA y el resto de unión que se une específicamente al antígeno diana distinto de SA, en el que el enlazante es AST o ASTSGPS. En una realización, en el ligando multiespecífico, el antígeno diana distinto de SA es TNFR1.
La presente invención proporciona un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-SA de la presente invención, en el que el dominio variable es conjugado a un fármaco. La presente invención proporciona un producto de fusión que comprende un polipéptido, proteína, péptido o fármaco NCE fusionado o conjugado a un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la presente invención. En una realización, el producto de fusión comprende además el enlazante TVAAPSC.
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En una realización, se proporciona un conjugado que comprende un fármaco NCE con jugado a un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la presente invención. La presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende un fármaco polipeptídico o peptídico fusionado a un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la presente invención.
La presente invención también proporciona una composición que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, ligando multi-específico, producto de fusión, conjugado o proteína de fusión de la presente invención y un diluyente, vehículo, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la presente invención. La presente invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ligando multi-específico o proteína de fusión de la presente invención. En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 413.
La presente invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de la presente invención. La presente invención también proporciona una célula huésped aislada que comprende el vector de la presente invención.
La presente invención también proporciona una composición que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, ligando multi-específico, producto de fusión, conjugado o proteína de fusión de la presente invención para uso como un medicamento.
Se describe una variante de dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-albúmina de suero (SA) de DOM7h- 14, en el que la variante comprende al menos una mutación en la región CDR3 de 92 a 96 (numeración de las posiciones de acuerdo con Kabat) en comparación con DOM7h-14 y en el que la variante tiene de 1 a 8 cambios en comparación con la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14. También se proporciona un resto de unión a antialbúmina de suero (SA) que comprende la CDR3 de una variante de este aspecto de la invención.
Se describe una variante de dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-albúmina de suero (SA) de DOM7h- 14, en el que la variante comprende una Ser en la posición 22 y una Glu en la posición 42 (numeración de acuerdo con Kabat) en comparación con DOM7h-14 y en el que la variante tiene de 0 a 4 cambios adicionales en comparación con la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14.
Se describen variantes de DOM7h-14 con buena afinidad a la anti-albúmina de suero. La elección de variantes puede permitir la adaptación de la semivida de acuerdo con el entorno terapéutico y/o profiláctico deseado. Por ejemplo, en una realización, la afinidad de la variante para la albúmina de suero es relativamente alta, de manera que la variante sería útil para incluir en productos que encuentren utilidad en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, afecciones, toxicidades crónicas o persistentes, u otras indicaciones crónicas. En una realización, la afinidad de la variante para la albúmina de suero es relativamente moderada, de manera que la variante sería útil para incluirla en productos que encuentren utilidad en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, afecciones, toxicidades agudas u otras indicaciones agudas. En una realización, la afinidad de la variante para la albúmina de suero es intermedia, de manera que la variante sería útil para incluirla en productos que encuentren utilidad en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, afecciones, toxicidades agudas o crónicas u otras indicaciones agudas o crónicas.
Es concebible que una molécula con una afinidad y especificidad elevada apropiada para la albúmina de suero permaneciera en circulación el suficiente tiempo para tener el efecto terapéutico deseado (Tomlinson, Nature Biotechnology 22, 521 - 522 (2004)). En este caso, una variante anti-SA de elevada afinidad permanecería en la circulación en suero coincidiendo con la de la albúmina de suero de la especie (documento WO2008096158). Una vez en circulación, cualquier agente terapéutico fusionado a la variante AlbudAb™ (una AlbudAb es un dAb antialbúmina de suero o dominio variable sencillo de inmunoglobulina), ya sea NCE, péptido o proteína, sería capaz por consiguiente de actuar durante más tiempo sobre su diana y presentar un efecto terapéutico más duradero. Esto permitiría dirigir enfermedades crónicas o persistentes sin necesidad de dosis frecuentes.
Una variante con afinidad moderada (pero específica para SA) permanecería únicamente en la circulación en suero durante un tiempo corto (por ejemplo, durante algunas horas o algunos días) permitiendo la dirección específica de las dianas terapéuticas implicadas en enfermedades agudas mediante el agente terapéutico fusionado.
De este modo es posible adaptar el producto que contiene anti-SA al área de enfermedad terapéutica eligiendo una variante anti-SA con la afinidad de unión a albúmina y/o semivida en suero apropiada.
Un aspecto de la invención proporciona un ligando multiespecífico que comprende una variante anti-SA como se ha descrito anteriormente y un resto de unión que se une específicamente a un antígeno diana distinto de SA.
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Un aspecto de la descripción proporciona un producto de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión o fusión con un péptido o fármaco de NCE (nueva entidad química), que comprende un polipéptido, proteína, péptido o fármaco de NCE fusionado o conjugado (para una NCE) a cualquier variante como se ha descrito anteriormente, en el que la variante es DOM7h-14-10 (o una variante que tiene un aminoácido que es al menos un 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntico con la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14-10). DOM7h-14-10 produce únicamente una modesta disminución de la afinidad cuando se fusiona o se conjuga con la pareja, haciéndole útil en los productos de fusión.
Un aspecto de la descripción proporciona una composición que comprende una variante, proteína de fusión o ligando de cualquier aspecto anterior y un diluyente, transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto de la descripción proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un paciente, que comprende administrar al menos una dosis de una variante de acuerdo con cualquier aspecto o realización de la invención a dicho paciente.
Un aspecto de la descripción proporciona una fusión a polipéptido o conjugado que comprende un dAb anti-albúmina de suero como se describe en este documento (por ejemplo, DOM7h-14-10) y una incretina o agente insulinotrópico, por ejemplo, exendina-4, GLP-1(7-37), GLP-1(6-36) o cualquier incretina o agente insulinotrópico descrito en el documento WO06/059106.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Alineamiento de la secuencia de aminoácidos para dAbs de la variante DOM7h-14. Un “.” en una posición particular indica que en esa posición se encuentra el mismo amino en DOM7h-14. Las CDR se indican subrayadas y en negrita (la primera secuencia subrayada es la CDR1, la segunda secuencia subrayada es la CDR2 y la tercera secuencia subrayada es la CDR3).
Figura 2: Parámetros cinéticos de variantes de DOM7h-14. Unidades KD = nM; unidades Kd = s-1; unidades Ka = M"1 s-1. La anotación A e-B significa A x 10"B y C e D significa C x 10D Se indican los intervalos cinéticos globales de diversas especies, de acuerdo con las confirmaciones de los ejemplos a continuación. También se proporcionan intervalos opcionales para usar en entornos terapéuticos particulares (indicaciones, afecciones o enfermedades agudas o crónicas e “intermedias” para usar tanto en entornos crónicos como agudos). Los dAb y productos de elevada afinidad que comprenden éstos son útiles para entornos crónicos. Los dAb y productos de afinidad media que comprenden éstos son útiles para entornos intermedios. Los dAb y productos de baja afinidad que comprenden éstos son útiles para entornos agudos. La afinidad en este aspecto es la afinidad para la albúmina de suero. Se enumeran diversos ejemplos de dAbs anti-suero y proteínas de fusión y éstos confirman los intervalos descritos. Muchos de los ejemplos tienen cinéticas favorables en seres humanos y en uno o más animales no humanos (por ejemplo, en seres humanos y en monos Cynomolgus y/o en ratón). La elección del dAb o del producto que comprende éste puede adaptarse, de acuerdo con la invención, dependiendo del entorno (por ejemplo, crónico o agudo) a tratar terapéuticamente.
Descripción detallada de la invención
En esta memoria descriptiva, la invención se ha descrito haciendo referencia a realizaciones, de manera que se permite realizar una memoria descriptiva clara y concisa. Se pretende y debe apreciarse que las realizaciones puedan combinarse de diversas maneras o realizarse por separado sin alejarse de la invención.
A menos que se indique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el habitualmente entendido por un experto en la materia (por ejemplo, en cultivos celulares, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación y bioquímica). Para métodos moleculares, genéticos y bioquímicos se usan técnicas convencionales (véase en líneas generales, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a Ed, John Wiley & Sons, Inc) y métodos químicos.
Como se usa en este documento, la expresión “antagonista del Receptor del Factor de Necrosis Tumoral 1 (TNFR1)” o “antagonista anti-TNFR1” o similar se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que se une a TNFR1 y puede inhibir una (es decir, una o más) función de TNFR1. Por ejemplo, un antagonista de TNFR1 puede inhibir la unión de TNFa a TNFR1 y/o inhibir la transducción de señal mediada a través de TNFR1. Por consiguiente, con un antagonista de TNFR1 pueden inhibirse las respuestas celulares y los procedimientos mediados por TNFR1 (por ejemplo, muerte celular inducida por TNFa en un ensayo de citotoxicidad de L929 convencional).
Un “paciente” es cualquier animal, por ejemplo, un mamífero, por ejemplo, un primate no humano (tal como un babuino, mono rhesus o mono Cynomolgus), ratón, ser humano, conejo, rata, perro, gato o cerdo. En una realización, el paciente es un ser humano.
Como se usa en este documento, “péptido” se refiere de aproximadamente dos a aproximadamente 50 aminoácidos que
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Como se usa en este documento, “polipéptido” se refiere a al menos aproximadamente 50 aminoácidos que están unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Los polipéptidos generalmente comprenden una estructura terciaria y plegada en los dominios funcionales.
Como se usa en este documento un anticuerpo se refiere a IgG, IgM, IgA, IgD o IgE o un fragmento (tal como un Fab, F(ab')2, Fv, Fv unido por puentes disulfuro, scFv, anticuerpos multiespecíficos de conformación cerrada, scFv unido por puentes disulfuro, diacuerpo) que procede de cualquier especie que produce de manera natural un anticuerpo o que es creado mediante tecnología de ADN recombinante; o aislado de suero, células B, hibridomas, transfectomas, levaduras o bacterias.
Como se usa en este documento, “formato de anticuerpo” se refiere a cualquier estructura polipeptídica adecuada en la que pueden incorporarse uno o más dominios variables de anticuerpo para conferir especificidad de unión para el antígeno en la estructura. En la técnica se conoce una diversidad de formatos de anticuerpo adecuados tales como, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, un fragmento Fv, (por ejemplo, Fv monocatenario (scFv), Fv unido por puentes disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), un dominio variable de anticuerpo sencillo (por ejemplo, un dAb, Vh, Vhh, Vl) y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, modificados por la unión covalente de polietilenglicol u otro polímero adecuado o un VHH humanizado).
La frase “dominio variable sencillo de inmunoglobulina” se refiere a un dominio variable de anticuerpo (Vh, Vhh, Vl) que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de los diferentes dominios o regiones V. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina puede presentarse en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multimérico) con otras regiones variables o dominios variables en los que las otras regiones o dominios no necesitan la unión al antígeno mediante el dominio variable de inmunoglobulina sencillo (es decir, en el que el dominio variable sencillo de inmunoglobulina se une al antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un “anticuerpo de dominio” o “dAb” es lo mismo que un “dominio variable sencillo de inmunoglobulina” como se usa el término en este documento. Un “dominio variable de inmunoglobulina sencillo” es lo mismo que un “dominio variable sencillo de inmunoglobulina” como se usa el término en este documento. Un “dominio variable de anticuerpo sencillo” o un “dominio variable sencillo de anticuerpo” es lo mismo que un “dominio variable sencillo de inmunoglobulina” como se usa el término en este documento. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina en una realización es un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables de anticuerpos sencillos de otras especies tales como roedores (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/29004), tiburón nodriza y dAbs Vhh de Camélidos. Los Vhh de Camélidos son polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina que proceden de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen de manera natural anticuerpos de cadena pesada desprovistos de cadenas ligeras. El Vhh puede humanizarse.
Un “dominio” es una estructura de proteína plegada que tiene una estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales específicas de las proteínas, y en muchos casos pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin que el resto de la proteína y/o del dominio pierda la función. Un “dominio variable de anticuerpo sencillo” es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpos. Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpo completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles se han reemplazado por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpos, o dominios variables de anticuerpo que se han truncado o comprenden extensiones N o C-terminal, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan al menos la actividad y especificidad de unión del dominio de longitud completa.
En la presente solicitud, el término “prevención” y “prever” implica la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad o afección. “Tratamiento” y “tratar” implica la administración de la composición protectora después de que comiencen a manifestarse los síntomas de la enfermedad o afección. “Supresión” o “suprimir” se refiere a la administración de la composición después de un suceso inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad o afección.
Como se usa en este documento, el término “dosis” se refiere a la cantidad de ligando administrado a un sujeto toda al mismo tiempo (dosis unitaria) o en dos o más administraciones durante un intervalo de tiempo definido. Por ejemplo, dosis puede hacer referencia a la cantidad de ligando (por ejemplo, ligando que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une al antígeno diana) administrada a un sujeto en el transcurso de un día (24 horas) (dosis diaria), dos días, una semana, dos semanas, tres semanas o uno o más meses (por ejemplo, mediante una administración única o mediante dos o más administraciones). El intervalo entre dosis puede ser cualquier cantidad de tiempo deseada. La expresión “farmacéuticamente eficaz” cuando se refiere a una dosis significa la cantidad suficiente de
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ligando, dominio o agente farmacéuticamente activo para proporcionar el efecto deseado. La cantidad que es “eficaz” variará de sujeto en sujeto, dependiendo de la edad y el estado general del individuo, el fármaco o agente farmacéuticamente activo particular y similar. Por tanto, no siempre es posible especificar una cantidad “eficaz” exacta que pueda aplicarse a todos los pacientes. Sin embargo, usando experimentación rutinaria, un experto en la materia puede determinar una dosis “eficaz” apropiada en cualquier caso individual.
Para cualquier experto en la materia serán familiares los métodos para realizar el análisis farmacocinético y para determinar la semivida del ligando (por ejemplo, el dominio variable sencillo, la proteína de fusión o el ligando multiespecífico). Pueden encontrarse más detalles en Kenneth, A y col: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters y col, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Rev. edición ex. (1982), que describe parámetros farmacocinéticos tales como semividas t alfa y t beta y el área bajo la curva (AUC). Opcionalmente, todos los parámetros y los valores farmacocinéticos indicados en este documento deben interpretarse como valores en un ser humano. Opcionalmente, todos los parámetros y valores farmacocinéticos indicados en este documento deben interpretarse como valores en ratón, rata o mono Cynomolgus.
Las semividas (t1^ alfa y t1^ beta) y el AUC pueden determinarse a partir una curva de la concentración en suero del ligando frente al tiempo. Para realizar el modelo de la curva, puede usarse, por ejemplo, el paquete de análisis WinNonlin, por ejemplo la versión 5.1 (disponible de Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, EE.UU.). Cuando se usan modelos de dos compartimentos, en una primera fase (la fase alfa) el ligando se distribuye principalmente en el paciente, con alguna eliminación. Una segunda fase (fase beta) es la fase en la que el ligando se ha distribuido y la concentración en suero va disminuyendo a medida que el paciente va eliminando el ligando. La semivida t alfa es la semivida de la primera fase y la semivida t beta es la semivida de la segunda fase. Por tanto, en una realización, en el contexto de la presente invención, el dominio variable, la proteína de fusión o el ligando tienen una semivida ta en el intervalo de (o de aproximadamente) 15 minutos o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es (o aproximadamente es) 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Adicionalmente, o de manera alternativa, el dominio variable, la proteína de fusión o el ligando de acuerdo con la descripción tendrá una semivida ta en el intervalo de hasta, e incluyendo, 12 horas (o aproximadamente 12 horas). En una realización, el límite superior del intervalo es (o aproximadamente es) 11, 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es (o es aproximadamente) de 1 a 6 horas, de 2 a 5 horas o de 3 a 4 horas.
En una realización, la presente descripción proporciona el dominio variable, la proteína de fusión o el ligando de acuerdo con la invención que tiene una semivida tp en el intervalo de (o de aproximadamente) 2,5 horas o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es (o es aproximadamente) 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Adicionalmente, o de manera alternativa, la semivida tp es (o es aproximadamente) de hasta, e incluyendo, 21 ó 25 días. En una realización, el límite superior del intervalo es (o es aproximadamente) 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 19 días, 20 días, 21 días o 22 días. Por ejemplo, el dominio variable, la proteína de fusión o el ligando de acuerdo con el descripción tendrá una semivida tp en el intervalo de 12 a 60 horas (o aproximadamente de 12 a 60 horas). En una realización adicional, estará en el intervalo de 12 a 48 horas (o aproximadamente de 12 a 48 horas). Aún en otra realización adicional, estará en el intervalo de 12 a 26 horas (o aproximadamente de 12 a 26 horas).
Como una alternativa al uso de modelos de dos compartimentos, cualquier experto en la materia estará familiarizado con el uso de modelos no compartimentales, que pueden usarse para determinar semividas terminales (en este sentido, la expresión “semivida terminal”, como se usa en este documento, significa una semivida terminal determinada usando modelos no compartimentales). Para realizar el modelo de la curva de esta manera, puede usarse, por ejemplo, el paquete de análisis WinNonlin, por ejemplo la versión 5.1 (disponible de Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, EE.UU.). En este ejemplo, en una realización, el dominio variable sencillo, la proteína de fusión o el ligando tienen una semivida terminal de al menos (o de al menos aproximadamente) 8 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 28 horas, 20 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 7 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días o 25 días. En una realización, el límite superior de este intervalo es (o es aproximadamente) 24 horas, 48 horas, 60 horas o 72 horas o 120 horas. Por ejemplo, la semivida terminal es (o es aproximadamente) de 8 horas a 60 horas, o de 8 horas a 48 horas o de 12 horas a 120 horas, por ejemplo, en un ser humano.
Además, o como alternativa al criterio anterior, el dominio variable, la proteína de fusión o el ligando de acuerdo con la descripción tiene un valor AUC (área bajo la curva) en el intervalo de (o de aproximadamente) 1 mg.min/ml o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es (o es aproximadamente) 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 mg.min/ml. Adicionalmente, o de manera alternativa, el dominio variable, la proteína de fusión o el ligando de acuerdo con la descripción tienen una AUC en el intervalo de (o de aproximadamente) hasta 600 mg.min/ml o más. En una realización, el límite superior del intervalo es (o es aproximadamente) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 mg.min/ml. Ventajosamente, el dominio variable, la proteína de fusión o el ligando tendrán una AUC en (o aproximadamente en) el intervalo seleccionado del grupo que consiste en: de 15 a 150 mg.min/ml, de 15 a 100 mg.min/ml, de 15 a 75 mg.min/ml y de 15 a 50 mg.min/ml.
“Resonancia de Plasmón Superficial”: Pueden usarse ensayos de competición para determinar si un antígeno o epítopo específico, tal como albúmina de suero humana, compite con otro antígeno o epítopo, tal como una albúmina de suero del mono Cynomolgus, para unirse a un ligando de unión de albúmina de suero descrito en este documento, tal como un dAb específico. De manera similar, pueden usarse ensayos de competición para determinar si un primer ligando tal como 5 dAb, compite con un segundo ligando tal como un dAb para unirse a un antígeno o epítopo diana. El término “compite”, como se usa en este documento, se refiere a una sustancia, tal como una molécula, compuesto, preferiblemente una proteína, que es capaz de interferir en cualquier grado con la interacción de unión especifica entre dos o más moléculas. La frase “no se inhibe de manera competitiva” significa que la sustancia, tal como una molécula, compuesto, preferiblemente una proteína, no interfiere en ningún grado cuantificable o significativo con la interacción de unión 10 especifica entre dos o más moléculas. La interacción de unión especifica entre dos o más moléculas incluye preferiblemente la interacción de unión específica entre un dominio variable sencillo y su pareja o diana afín. La molécula interferente o competidora puede ser otro dominio variable sencillo o puede ser una molécula que sea estructuralmente y/o funcionalmente similar a una pareja o diana afín.
La expresión “resto de unión” se refiere a un dominio que se une específicamente a un antígeno o epítopo 15 independientemente de un dominio de unión a antígeno o epítopo diferente. Un resto de unión puede ser un anticuerpo de dominio (dAb) o puede ser un dominio que sea un derivado de una estructura de proteína no de inmunoglobulina, por ejemplo, una estructura seleccionada del grupo que consiste en CTLA-4, lipocalín, SpA, un Affibody, un avímero, GroEl, transferrina, GroES y fibronectina, que se une a un ligando que no es el ligando natural (en el caso de la presente invención, el resto se une a albúmina de suero). Véase el documento WO2008/096158, que describe ejemplos de 20 estructuras proteicas y métodos para seleccionar dominios de unión específicos a antígeno o epítopo a partir de repertorios (véanse los Ejemplos 17 a 25).
La descripción proporciona una variante de dominio variable sencilla de inmunoglobulina anti-albúmina de suero (SA) de DOM7h-14, en el que la variante comprende al menos una mutación en la región CDR3 de 92 a 96 (numeración de las posiciones de acuerdo con Kabat) en comparación con DOM7h-14 y en el que la variante tiene de 1 a 8 cambios en 25 comparación con la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14.
Opcionalmente, la variante comprende un motivo AQG(X1)(X2)(X3)P(X4)T, en el que A se encuentra en la posición 89 (de acuerdo con Kabat) y al menos una de (X1) a (X4) representa un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de DOM7h-14.
En una realización, la posición 95 (de acuerdo con Kabat) es Pro. Adicionalmente o como alternativa, en una realización, 30 la posición 98 (de acuerdo con Kabat) es Ala. Adicionalmente o como alternativa, en una realización, la posición 90 (de acuerdo con Kabat) es Gln. Adicionalmente o como alternativa, en una realización, la posición 91 (de acuerdo con Kabat) es Gly. Adicionalmente o como alternativa, en una realización, la posición 97 (de acuerdo con Kabat) es Thr.
En una realización, la variante comprende una mutación en cada una de las posiciones 92, 93 y 94 y opcionalmente en la posición 96 (numeración de acuerdo con Kabat) comparada con DOM7h-14.
35 Opcionalmente, la variante comprende uno o más restos aminoacídicos seleccionados de:
Posición 92 = L o F,
Posición 93 = R, M o K,
Posición 94 = H o K, y
Posición 96 = K o M (numeración de acuerdo con Kabat)
40 En una realización, la variante comprende una Lys o Met en la posición 96 (numeración de acuerdo con Kabat) en comparación con DOM7h-14. En esta realización, opcionalmente la variante comprende uno o más restos aminoacídicos seleccionados de:
Posición 92 = L o F,
Posición 93 = R, M o K, y
45 Posición 94 = H o R (numeración de acuerdo con Kabat)
En una realización, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio variable sencillo seleccionado de DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-28 y DOM7h-14-36 o tiene hasta 4 cambios en comparación con la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la variante comprende al menos una mutación en la región CDR3 de 92 a 96 (numeración de las posiciones de acuerdo con Kabat) en 50 comparación con DOM7h-14.
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Un aspecto de la descripción proporciona un resto de unión a anti-albúmina de suero (SA) que comprende CDR3 o una variante de acuerdo con el primer aspecto de la descripción. En una realización, el resto de unión SA comprende la CDR1 de la variante seleccionada o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50% con la CDR1 de la variante seleccionada. Adicionalmente o como alternativa, en una realización el resto de unión SA comprende la CDR2 de la variante seleccionada o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50% con la CDR2 de la variante seleccionada.
En un aspecto adicional de la descripción, se proporciona una variante de DOM7h-14 de dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-albúmina de suero (SA), en la que la variante comprende una Ser en la posición 22 y una Glu en la posición 42 (numeración de acuerdo con Kabat) en comparación con DOM7h-14, y en la que la variante tiene de 0 a 4 cambios adicionales en comparación con la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14.En una realización, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14-19 o tiene hasta 4 cambios en comparación con la secuencia de aminoácidos DOM7h-14-19, en la que la variante comprende una Ser en la posición 22 y una Glu en la posición 42 (numeración de acuerdo con Kabat) comparada con DOM7h-14.
En una realización, la variante o el resto de unión de acuerdo con cualquier aspecto o realización de la invención comprende una más de las siguientes características cinéticas:
(a) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA humana con una constante de disociación (KD) de (o de aproximadamente) 0,1 a (o a aproximadamente) 10.000 nM, opcionalmente de (o de aproximadamente) 1 a (o a aproximadamente) 6.000 nM, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(b) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA humana con una constante de velocidad de disociación (Kd) de (o de aproximadamente) 1,5 x 10-4 a (o de aproximadamente a) 0,1 s-1, opcionalmente de (o de aproximadamente) 3 x 10-4 a (o de aproximadamente a) 0,1 s-1 determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(c) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA humana con una constante de velocidad de asociación (Ka) de (o de aproximadamente) 2 x 106 a (o de aproximadamente a) 1 x 104 M'1s'1, opcionalmente de (o de aproximadamente) 1 x 106 a (o de aproximadamente a) 2 x 104 M'V determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(d) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA de mono Cynomolgus con una constante de disociación (KD) de (o de aproximadamente) 0,1 a (o a aproximadamente) 10.000 nM, opcionalmente de (o de aproximadamente) 1 a (o a aproximadamente) 6.000 nM, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(e) La variante o resto de cualquier reivindicación anterior, en la que la variante comprende un sitio de unión que se une
específicamente a SA de mono Cynomolgus con una constante de velocidad de disociación (Kd) de (o de
aproximadamente) 1,5 x 10-4 a (o a aproximadamente) 0,1 s-1 opcionalmente de (o de aproximadamente) 3 x 10-4 a (o a aproximadamente) 0,1 s-1, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(f) La variante o resto de cualquier reivindicación anterior, en la que la variante comprende un sitio de unión que se une
específicamente a SA de mono Cynomolgus con una constante de velocidad de asociación (Ka) de (o de
aproximadamente) 2 x 106 a (o a aproximadamente) 1 x 104 M'V1, opcionalmente de (o de aproximadamente) 1 x 106 a (o a aproximadamente) 5 x 103 M-V, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(g) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA de rata con una constante de disociación (KD) de (o de aproximadamente) 1 a (o a aproximadamente) 10.000 nM, opcionalmente de (o de aproximadamente) 20 a (o a aproximadamente) 6.000 nM, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(h) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA de rata con una constante de velocidad de disociación (Kd) de (o de aproximadamente) 2 x 10-3 a (o a aproximadamente) 0,15 s-1, opcionalmente de (o de aproximadamente) 9 x 10-3 a (o a aproximadamente) 0,14 s-1, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(i) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA de rata con una constante de velocidad de asociación (Ka) de (o de aproximadamente) 2 x 106 a (o a aproximadamente) 1 x 104 M-V, opcionalmente de (o de aproximadamente) 1 x 106 a (o a aproximadamente) 3 x 104 M-V, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
(j) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA de ratón con una constante de disociación (KD) de (o de aproximadamente) 1 a (o a aproximadamente) 10.000 nM, determinada de acuerdo con la
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resonancia de plasmón superficial;
(k) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA de ratón con una constante de velocidad de disociación (Kd) de (o de aproximadamente) 2 x 10-3 a (o a aproximadamente) 0,15 s-1, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial; y/o
(l) La variante o resto comprende un sitio de unión que se une específicamente a SA de ratón con una constante de velocidad de asociación (Ka) de (o de aproximadamente) 2 x 106 a (o a aproximadamente) 1 x 104 M-1s-1, opcionalmente de (o de aproximadamente) 2 x 106 a (o a aproximadamente) 1,5 x 104 M-1s-1, determinada de acuerdo con la resonancia de plasmón superficial;
Opcionalmente la variante o resto tiene:
I: una KD de acuerdo con (a) y (b), una Kd de acuerdo con (b) y (e) y una Ka de acuerdo con (c) y (f); o II: una KD de acuerdo con (a) y (g), una Kd de acuerdo con (b) y (h) y una Ka de acuerdo con (c) e (i); o III: una KD de acuerdo con (a) y (j), una Kd de acuerdo con (b) y (k) y una Ka de acuerdo con (c) y (l); o IV: una cinética de acuerdo con I y II; o V: una cinética de acuerdo con I y III; o VI: una cinética de acuerdo con I, II y III.
La descripción también proporciona un ligando que comprende una variante o resto de cualquier aspecto o realización anterior de la descripción. Por ejemplo, el ligando puede ser un ligando dual específico (para ejemplos de ligandos de especificidad dual, véase el documento WO04003019). En un aspecto, se describe un ligando multiespecífico que comprende una variante o resto anti-SA de cualquier aspecto o realización anterior de la invención y un resto de unión adicional que se une específicamente a un antígeno diana distinto de SA. El o cada resto de unión puede ser cualquier resto de unión que se una específicamente a una diana, por ejemplo, el resto es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, scFv, Fab, dAb o un resto de unión que comprenda una estructura de proteína no de inmunoglobulina. Dichos restos se describen con detalle en el documento WO2008/096158 (véanse los ejemplos 17 a 25). Son ejemplos de estructuras de proteínas no de inmunoglobulina CTLA-4, lipocalina, proteína A estafilocócica (spA), Affibody™, Avimers™, GroEL y fibronectinas.
En una realización, se proporciona un enlazante entre el resto de unión anti-diana y la variante sencilla o resto anti-SA, comprendiendo el enlazante la secuencia de aminoácidos AST, opcionalmente ASTSGPS, por ejemplo, en la que se usa anti-SA y dAbs anti-diana. Enlazantes alternativos se describen en el documento WO200708814 y en el documento WO2008/096158 (véase el pasaje de la página 135, de la línea 12 a la página 140, línea 14).
En una realización del ligando multiespecífico, el antígeno diana puede ser, o ser parte de, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, que pueden ser de origen natural o sintéticos. En este aspecto, el ligando de la descripción puede unirse al antígeno diana y actuar como un antagonista o agonista (por ejemplo, agonista del receptor EPO). Cualquier experto en la materia apreciará que la elección es amplia y variada. Pueden ser, por ejemplo, proteínas de seres humanos o animales, citocinas, receptores de citocinas, en los que los receptores de citocinas incluyen receptores para citocinas, enzimas, co-factores para enzimas o proteínas de unión a ADN. Las citocinas y factores de crecimiento adecuados incluyen, pero preferiblemente sin limitación: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor 10 del crecimiento de fibroblasto, ligando FLT3, Fractalkina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-p1, insulina, IFN-y, IGF-I, IGF-II, IL-1a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina a, Inhibina p, IP- 10, factor 2 del crecimiento de queratocitos (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibidora de Müllerian, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1a, MIP-1p, MIP-3a, MIP-3p, MIP-4, factor 1 inhibidor de progenitores mieloides (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor del crecimiento nervioso, p-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1a, SDF1p, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-a, TGF-p, TGF-P2, TGF-P3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, TNF-p, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-p, GRO-y, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 y HER 4, CD4, receptores de quimioquina humana CXCR4 o CCR5, proteína no estructural de tipo 3 (NS3) del virus de la hepatitis C, TNF-alfa, IgE, IFN-gamma, MMP-12, CEA, H. pylori, TB, gripe, Hepatitis E, MMP-12, receptores de internalización que se sobrexpresan en determinadas células, tales como el receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR), receptor de ErBb2 en células tumorales, un receptor celular internalizador, receptor de LDL, receptor de FGF2, receptor de ErbB2, receptor de transferrina, receptor de PDGF, receptor de VEGF, PsmAr, una proteína matriz extracelular, elastina, fibronectina, laminina, antitripsina-a1,
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inhibidor de proteasa del factor tisular, PDK1, GSK1, Bad, caspasa-9, Forkhead, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, y un antígeno del virus de la gripe. Deberá apreciarse de que esta enumeración no es exhaustiva.
En una realización, el ligando multiespecífico comprende una variante o resto dAb anti-SA de la invención y un resto de unión anti-TNFR1, por ejemplo, un dAb anti-TNFR1. Opcionalmente, el ligando sólo tiene un resto de unión anti-TNFR1 (por ejemplo, dAb) para reducir la posibilidad de entrecruzamiento del receptor. En una realización, la variante dAb anti-SA es DOM7h-14-10.
En una realización, el resto de unión anti-TNFR1 es DOM1h-131-206 descrito en el documento WO2008149148. En una realización, el ligando multiespecífico comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de DOM1h-131-206 y la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14-10.
En una realización, el resto de unión anti-TNFR1 o dAb es cualquiera de dicho resto o dAb descrito en la solicitud en trámite junto con la presente USSN 61/153.746. En una realización, el resto de unión anti-TNFR1 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM1h-574-156, DOM1h- 574-72, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 o DOM1h-574-180 o la secuencia de aminoácidos de cualquier dAb anti-TNFR1 descrita en la Tabla 3. En una realización, el ligando multiespecífico comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de DOM1h-574-156 y la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14-10.
En una realización, el ligando de la invención es una proteína de fusión que comprende una variante o resto de la invención fusionada directa o indirectamente a uno o más polipéptidos. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una “fusión a fármaco” como se describe en el documento WO2005/118642, que comprende una variante o resto de la invención y un fármaco polipeptídico como se define en esa solicitud PCT.
Como se usa en este documento, “fármaco” se refiere a cualquier compuesto (por ejemplo, molécula orgánica pequeña, ácido nucleico, polipéptido) que puede administrarse a un individuo para producir un efecto benéfico, terapéutico o de diagnóstico mediante la unión a y/o modificando la función de una molécula diana biológica en el individuo. La molécula diana puede ser una molécula diana endógena codificada por el genoma del individuo (por ejemplo, una enzima, receptor, factor de crecimiento, citocina codificada por el genoma del individuo) o una molécula diana exógena codificada por el genoma de un patógeno (por ejemplo, una enzima codificada por el genoma de un virus, bacteria, hongo, nematodo u otro patógeno). Los fármacos adecuados para usar en las proteínas y conjugados de fusión que comprenden una variante de dAb anti-SA de la invención se describen en el documento WO2005/118642 y en el documento WO2006/059106. Por ejemplo, el fármaco puede ser el péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1) o una variante, interferón alfa 2b o una variante o exendina-4 o una variante.
En una realización, la descripción proporciona un conjugado de fármaco como se define y se describe en el documento WO2005/118642 y en el documento WO2006/059106, en el que el conjugado comprende una variante o resto de la descripción. En un ejemplo, el fármaco está unido de manera covalente a la variante o resto (por ejemplo, la variante o resto y el fármaco se expresan como parte de un polipéptido sencillo). De manera alternativa, en un ejemplo, el fármaco no está unido o asociado de manera covalente a la variante o resto. El fármaco puede estar unido de manera covalente o no covalente a la variante o resto de manera directa o indirecta (por ejemplo, mediante un enlazante adecuado y/o mediante unión no covalente de parejas de unión complementarios (por ejemplo, biotina y avidina)). Cuando se emplean parejas de unión complementarias, uno de las parejas de unión puede unirse de manera covalente al fármaco directamente o mediante un resto enlazante adecuado y la pareja de unión complementaria puede unirse de manera covalente a la variante o resto directamente o mediante un resto enlazante adecuado. Cuando el fármaco es un polipéptido o péptido, la composición del fármaco puede ser una proteína de fusión, en la que el polipéptido o péptido, fármaco y el resto de unión de polipéptido son partes específicas (restos) de una cadena polipeptídica continua. Como se describe en este documento, los restos de unión al polipéptido y los restos de fármaco polipeptídicos pueden unirse directamente entre sí mediante un enlace peptídico, o unirse mediante un aminoácido, péptido o enlazante polipeptídico adecuado.
Un ligando que contiene una variante (monómero) de dominio variable sencillo o resto de la descripción o más de un dominio variable sencillo o resto (multímero, proteína de fusión, conjugado y ligando de especificidad dual como se define este documento) que se une específicamente a la albúmina de suero, puede comprender adicionalmente una o más entidades seleccionadas de, pero preferiblemente no limitadas, un marcador, un marcaje, un dominio variable sencillo adicional, un dAb, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un marcador y un fármaco. Una o más de estas entidades puede localizarse en el extremo COOH o en el extremo N o en ambos extremos N y COOH del ligando que comprende el dominio variable sencillo o resto, (de dominio variable sencillo de inmunoglobulina o no inmunoglobulina). Una o más de estas entidades pueden localizarse en el extremo COOH, o en el extremo N, o en ambos extremos N y COOH del dominio variable sencillo o resto que se une específicamente a la albúmina de suero del ligando que contiene un dominio variable sencillo (monómero) o resto o más de un dominio variable sencillo o resto (multímero, proteína de fusión, conjugado y ligando de especificidad dual como se define en este documento). Los ejemplos no limitantes de marcadores que pueden
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posicionarse en uno o ambos de estos extremos incluyen un marcador HA, his o myc. Las entidades, que incluyen uno o más marcajes, marcadores y fármacos, pueden unirse al ligando que contiene un dominio variable sencillo (monómero) o más de un dominio variable sencillo o resto (multímero, proteína de fusión, conjugado y ligando de especificidad dual como se define en este documento) que se une a la albúmina de suero, de manera directa o mediante enlazantes, como se describe anteriormente.
Un aspecto de la descripción proporciona un producto de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión o fusión con un péptido o conjugado con un fármaco NCE (nueva entidad química) que comprende un fármaco polipeptídico fusionado o conjugado (para un NCE) a cualquier variante o resto como se describe anteriormente, en la que la variante o resto es DOM7h-14-10 (o una variante que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 95, 96, 97, 98 ó 99% con la secuencia de aminoácidos de DOM7h-14-10). DOM7h-14-10 producen únicamente una modesta disminución de la afinidad cuando se fusiona o se conjuga con la pareja haciéndole útil en los productos de fusión.
La invención proporciona una composición que comprende una variante, proteína de fusión, conjugado o ligando de cualquier aspecto de la invención y un diluyente, transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se incluye en este documento un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las variantes, restos, proteínas de fusión, conjugados o ligandos descritos en este documento, por ejemplo, un ligando que contiene una variante de dominio variable sencillo (monómero) de la invención o más de una variante de dominio variable sencillo (por ejemplo, multímero, proteína de fusión, conjugado, y ligando de especificidad dual como se define en este documento) que se une específicamente a la albúmina de suero o que se une específicamente a la albúmina de suero humana y al menos a una albúmina de suero no humana o fragmentos funcionalmente activos de los mismos. También se incluye en este documento un vector y/o un vector de expresión, una célula huésped que comprende el vector, por ejemplo, una célula vegetal o animal y/o una línea celular transformada con un vector, un método de expresión y/o de producción de una o más variantes, restos, proteínas de fusión o ligandos que contienen una variante de dominio variable sencillo (monómero) o resto o más de una variante de dominio variable sencillo o resto (por ejemplo, multímero, proteína de fusión, conjugado, y ligando específico dual como se define en este documento) que se une específicamente a la albúmina de suero, o fragmento (o fragmentos) de la misma codificada por dichos vectores, que incluye en algunos casos cultivar la célula huésped de manera que una o más variantes, proteínas de fusión, ligandos o fragmentos de los mismos se expresen y opcionalmente recuperen el ligando que contiene un dominio variable sencillo o resto (monómero) o más de un dominio variable sencillo o resto (por ejemplo, multímero, proteína de fusión, conjugado, y ligando específico dual, como se define en este documento) que se une específicamente a la albúmina de suero, del medio de cultivo de la célula huésped. También se incluyen métodos para poner en contacto un ligando descrito en este documento con albúmina de suero, que incluye albúmina de suero y/o albúmina (o albúminas) de suero no humanas, y/o una o más dianas distintas de la albúmina de suero, en la que las dianas incluyen moléculas biológicamente activas e incluyen proteínas de animales, citocinas como las enumeradas anteriormente e incluyen métodos en los que el poner en contacto se realiza in vitro así como la administración de cualquiera de las variantes, restos, proteínas de fusión o ligandos descritos en este documento a un animal huésped individual o célula in vitro y/o ex vivo. Preferiblemente, la administración de ligandos descritos en este documento que comprenden un dominio variable sencillo (inmunoglobulina o no inmunoglobulina) dirigidos a la albúmina de suero y/o albúmina (o albúminas) de suero no humanas, y uno o más dominios dirigidos a una o más dianas distintas a la albúmina de suero, aumentarán la semivida, incluyendo la semivida T beta y/o terminal del ligando anti-diana. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes, proteínas de fusión o dominios sencillos que contienen ligandos o fragmentos de los mismos, incluyendo fragmentos funcionales de los mismos, se contemplan en este documento. Los vectores que codifican las moléculas de ácido nucleico que incluyen, pero preferiblemente no limitan, vectores de expresión, se contemplan en este documento, como también células huésped de una línea celular u organismo que contiene uno o más de estos vectores de expresión. También se contemplan métodos para producir cualquier variante, proteína de fusión o ligando, incluyendo, pero preferiblemente sin limitación, cualquiera de los ácidos nucleicos, vectores y células huésped mencionadas anteriormente.
Un aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de acuerdo con la invención o un ligando multiespecífico de la invención o una proteína de fusión de la invención.
Un aspecto de la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de una variante de DOM7h-14 seleccionada de DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36 y DOM7h-14-19 o una secuencia de nucleótidos que es al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntica con respecto a dicha secuencia seleccionada.
Un aspecto de la invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de la invención. Un aspecto de la invención proporciona una célula huésped aislada que comprende el vector.
Se hace referencia al documento WO2008/096158 para detalles de sistemas de vectores de bibliotecas, combinación de dominios variables sencillos, caracterización de ligandos específicos duales, estructura de ligandos específicos duales, estructuras para usar en la construcción de ligandos específicos duales, usos de dAb anti-albúmina de suero y ligandos
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multiespecíficos y ligandos que mejoran la semivida y composiciones y formulaciones que comprenden dAb antialbúmina de suero. Estas descripciones proporcionan una guía de uso con la presente invención, que incluyen variantes, restos, ligandos, proteínas de fusión, conjugados, ácidos nucleicos, vectores, huéspedes y composiciones de la presente invención.
Las secuencias de la variante DOM7h-11, que no son de acuerdo con la invención, se describen en una Solicitud de Patente provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente titulada IMPROVED ANTI-SERUM ALBUMIN BINDING VARIANTS, presentada el mismo día que la presente solicitud. Estas secuencias de las variantes de DOM7h-11 son las SEQ ID N°: 1-10 en la solicitud en trámite junto con la presente.
Secuencias
Tabla 1: Secuencias de Aminoácidos de dAbs Variante DOM7h-14
DOM7h-14-10 (SEC ID N°: 1)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
DOM7h-14-18 (SEC ID N°: 2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
DOM7h-14-19 (SEC ID N°: 3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYHCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
DOM7h-14-28 (SEC ID N°: 4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQTGTHPTTFGQGTKVEIKR
DOM7h-14-36 (SEC ID N°: 5)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLILWNSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
Tabla 2: Secuencias de Nucleótidos de dAbs Variante DOM7h-14
DOM7h-14-10 (SEC ID N°: 6)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTTGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
DOM7h-14-18 (SEC ID N°: 7)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCCTTGCT TTTTCCCGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGCGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
DOM7h-14-19 (SEC ID N°: 8)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CAAAGCTCCT GATCTGGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACCA CTGTGCGCAG GCGGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
DOM7h-14-28 (SEC ID N°: 9)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGATGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTTGTTT GGTTCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACGGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTGCGCAG ACTGGGACGC
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ATCCCACGAC GTTCGGCCAA GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG DOM7h-14-36 (SEC ID N°: 10)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGGG ACGACGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCCTTTGG AATTCCCGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTGCGCAG GCTGGGACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
Tabla 3: Secuencias de Aminoácidos de dAbs anti-TNFRI
>DOM1h-509 (SEC ID N°: 11)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYRMHWVRQAPGKSLEWVSSIDTRGSSTYYADPVKGRFTISRDNSKNTL
YLQMNSLRAEDTAVYYCAKAVTMFSPFFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-510 (SEC ID N°: 12)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYGMRWVRQAPGKGLEWVSSITRTGRVTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWRNRHGEYLADFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-543 (SEC ID N°: 13)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMRYRMHWVRQAPGKGLEWVSSIDSNGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRTERSPVFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-549 (SEC ID N°: 14)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVDYEMHWVRQAPGKGLEWVSSISESGTTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL
YLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRFSASTFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574 (SEC ID N°: 15)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGHWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-1 (SEC ID N°: 16)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPYDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-2 (SEC ID N°: 17)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-7 (SEC ID N°: 18)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-8 (SEC ID N°: 19)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-9 (SEC ID N°: 20)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYMQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-10 (SEC ID N°: 21)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-11 (SEC ID N°: 22)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYTGRWEPFDHWGQGTLVTVSS
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>DOM1h-574-14 (SEC ID N°: 25)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-15 (SEC ID N°: 26)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-16 (SEC ID N°: 27)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-17 (SEC ID N°: 28)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGPEWVSQISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-18 (SEC ID N°: 29)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-19 (SEC ID N°: 30)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKDLEWVSQISNTGDHTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-25 (SEC ID N°: 31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-26 (SEC ID N°: 32)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-27 (SEC ID N°: 33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWKPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-28 (SEC ID N°: 34)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-29 (SEC ID N°: 35)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWRPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-30 (SEC ID N°: 36)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIANTGDRRYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAAYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-31 (SEC ID N°: 37)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFNYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-32 (SEC ID N°: 38)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
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>DOM1h-574-35 (SEC ID N°: 40)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFITYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL
YLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFQYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-36 (SEC ID N°: 41)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-37 (SEC ID N°: 42)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-38 (SEC ID N°: 43)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTGDRRYYDDSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-39 (SEC ID N°: 44)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRRYYADAVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFDYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-40 (SEC ID N°: 45)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFKYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-53 (SEC ID N°: 46)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGERRYYADSVKGRFTISRDNPKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-54 (SEC ID N°: 47)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVNYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPYEYWGQGTLVTVTS
>DOM1h-574-65 (SEC ID N°: 48)
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LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-66 (SEC ID N°: 49)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIANTGDRRYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWKPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-67 (SEC ID N°: 50)
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LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-68 (SEC ID N°: 51)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIANTGDRRYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWRPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-69 (SEC ID N°: 52)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIANTGDRRYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-70 (SEC ID N°: 53)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAVYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS
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>DOM1h-574-73 (SEC ID N°: 56)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWRPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-74 (SEC ID N°: 57)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-75 (SEC ID N°: 58)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTGDRRYYDDSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-76 (SEC ID N°: 59)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTGDRRYYDDSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWKPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-77 (SEC ID N°: 60)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTGDRRYYDDSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-78 (SEC ID N°: 61)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTGDRRYYDDSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWRPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-79 (SEC ID N°: 62)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTGDRRYYDDSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-84 (SEC ID N°: 63)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRRYYADAVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-85 (SEC ID N°: 64)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRRYYADAVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWKPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-86 (SEC ID N°: 65)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRRYYADAVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-87 (SEC ID N°: 66)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRRYYADAVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWRPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-88 (SEC ID N°: 67)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTGDRRYYADAVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-90 (SEC ID N°: 68)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFLKFSMGWVRQAPGKGLEWVSQIANTGDRRYYADSVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-91 (SEC ID N°: 69)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFLKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISNTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTL
YLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS
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>DOM1h-574-93 (SEC ID N°: 71)
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10
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30
35
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>DOM1h-574-156 (SEC ID N°: 133)
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>DOM1h-574-157 (SEC ID N°: 134)
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>DOM1h-574-159 (SEC ID N°: 136)
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>DOM1h-574-160 (SEC ID N°: 137)
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>DOM1h-574-161 (SEC ID N°: 138)
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>DOM1h-574-162 (SEC ID N°: 139)
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>DOM1h-574-163 (SEC ID N°: 140)
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>DOM1h-574-164 (SEC ID N°: 141)
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>DOM1h-574-165 (SEC ID N°: 142)
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>DOM1h-574-166 (SEC ID N°: 143)
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>DOM1h-574-167 (SEC ID N°: 144)
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>DOM1h-574-169 (SEC ID N°: 145)
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>DOM1h-574-170 (SEC ID N°: 146)
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5
10
15
20
25
30
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50
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60
>DOM1h-574-173 (SEC ID N°: 149)
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>DOM1h-574-174 (SEC ID N°: 150)
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>DOM1h-574-175 (SEC ID N°: 151)
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>DOM1h-574-176 (SEC ID N°: 152)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTADRRYYDHAVKGRFTISRDNSKNT
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>DOM1h-574-177 (SEC ID N°: 153)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIADTADRRYYDHAVKGRFTISRDNSKNT
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>DOM1h-574-178 (SEC ID N°: 154)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQIADTADRRYYDHSVKGRFTISRDNSKNT
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>DOM1h-574-179 (SEC ID N°: 155)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTADRRYYDDAVKGRFTITRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS
>DOM1h-574-180 (SEC ID N°: 156)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLEWVSQISDTADRTYYAHAVKGRFTISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS
Tabla 4: Secuencias de Nucleótidos de dAbs anti-TNFRI
>DOM1h-509 (SEC ID N°: 157)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTAGTCAGTATAGGATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGAGTCTAGAGTGGGTCTCAAGT
ATTGATACTAGGGGTTCGTCTACATACTACGCAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAA
GAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCTGTGACG
ATGTTTTCTCCTTTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-510 (SEC ID N°: 158)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTGCTGATTATGGGATGCGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCT
ATTACGCGGACTGGTCGTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATGGCGGAA
TCGGCATGGTGAGTATCTTGCTGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-543 (SEC ID N°: 159)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTATGAGGTATAGGATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCG
ATTGATTCTAATGGTTCTAGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAA
GAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTACG
GAGCGTTCGCCGGTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-549 (SEC ID N°: 160)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CGGATTCACCTTTGTTGATTATGAGATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCT
ATTAGTGAGAGTGGTACGACGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGTCGTTT
TTCTGCTTCTACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-574 (SEC ID N°: 161)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
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>DOM1h-574-1 (SEC ID N°: 162)
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CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
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>DOM1h-574-2 (SEC ID N°: 163)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
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>DOM1h-574-4 (SEC ID N°: 164)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
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GTCGTTGGGAGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-574-180 (SEC ID N°: 165)
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>DOM1h-574-7 (SEC ID N°: 166)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
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>DOM1h-574-8 (SEC ID N°: 167)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGTCCAGAGTGGGTCTCACAG
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>DOM1h-574-9 (SEC ID N°: 168)
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CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
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>DOM1h-574-19 (SEC ID N°: 178)
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>DOM1h-574-25 (SEC ID N°: 179)
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CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
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>DOM1h-574-26 (SEC ID N°: 180)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
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>DOM1h-574-27 (SEC ID N°: 181)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
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>DOM1h-574-33 (SEC ID N°: 187)
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>DOM1h-574-35 (SEC ID N°: 188)
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GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
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>DOM1h-574-69 (SEC ID N°: 200)
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>DOM1h-574-70 (SEC ID N°: 201)
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>DOM1h-574-71 (SEC ID N°: 202)
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>DOM1h-574-72 (SEC ID N°: 203)
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AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACTGG
GCGTTGGGTGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-574-165 (SEC ID N°: 290)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTTTCAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
GATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCACACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGG
TCGTTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-574-166 (SEC ID N°: 291)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTTTGAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
GATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCACACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGG
TCGTTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-574-167 (SEC ID N°: 292)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTTTGAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
GATTTCGGATACCGGTGATCGTAGATACTACGATCACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACTATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGG
TCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-574-168 (SEC ID N°: 293)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
se
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(662 :oN ai 03S) Vll-V¿9-HMOQ<
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
GATTGCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATCACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCC
AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGG
GTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-574-178 (SEC ID N°: 303)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTGTTAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
GATTGCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATCACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGGG
TCGGTGGGCGCCTTTTGAGTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>DOM1h-574-179 (SEC ID N°: 304)
GAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTTTCAAGTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACA
GATTTCGGATACTGCTGATCGTAGATACTACGATGACGCGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCACCCGCGACAATTCC
AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGATATATACGG
GTCGTTGGGAGCCTTTTGTCTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Tabla 5: Fusiones dAb anti-albúmina de suero (DOM7h)
(usados en estudios de Rata):
Fusión DOM7h-14/Exendina-4número DMS 7138
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 305)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQ
GTKVEIKR
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 306)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCT
TAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGC
GGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACC
ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC
TCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT
CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGA
CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Fusión DOM7h-14-10/Exendina-4número DMS 7139
Secuencia de aminoácidos(SEC ID N°: 307)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQ
GTKVEIKR
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 308)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCT
TAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGC
GGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACC
ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC
TCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT
CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGA
CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Fusión DOM7h-14-18/Exendina-4número DMS 7140
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 309)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 310)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCT
TAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGC
GGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACC
ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC
TCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT
CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTCTTATGAAGCCTATGAC
GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Fusión DOM7h-14-19/Exendina-4número DMS 7141
Secuencia de aminoácidos(SEC ID N°: 311)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIS
CRASQWIGSQLSWYQQKPGEAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQ
GTKVEIKR
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 312)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCT
TAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGC
GGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACC
ATCTCTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGGAAGCCCCTAAGC
TCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT
CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGA
CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Fusión DOM7h-11/Exendina-4número DMS 7142
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 313)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVPSRFSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTK
VEIKR
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 314)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCT
TAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGC
GGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACC
ATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC
TCCTGATCTGGTTTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT
CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGA
CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Fusión DOM7h-11-12/Exendina-4número DMS 7147
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 315)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGT
KVEIKR
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 316)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC
TCCTGATCTTGTTTGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC
ACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGAC
GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Fusión DOM7h-11-15/Exendina-4número DMS 7143
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 317)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGT
KVEIKR
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 318)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCT
TAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGC
GGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACC
ATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC
TCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC
ACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGAC
GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Fusión DOM7h-14-10/G4SC - NCE
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 319) que codifica DOM7h14-10/G4SC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP
EDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKRGGGGSC
La cisteína C-terminal puede unirse a una nueva entidad química (compuesto químico farmacéutico, NCE), por ejemplo usando un enlace de maleimida.
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 320) que codifica DOM7h14-10/G4SC
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAA
GTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCG
TTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA
GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGAC
CAAGGTGGAAATCAAACGGGGTGGCGGAGGGGGTTCCTGT
Fusión DOM7h14-10/TVAAPSC
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 321)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP
EDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKRTVAAPSC
La cisteína C-terminal puede unirse a una nueva entidad química (compuesto químico farmacéutico NCE), por ejemplo usando un enlace de maleimida.
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 322)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAA
GTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCG
TTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA
GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGAC
CAAGGTGGAAATCAAACGGACCGTCGCTGCTCCATCTTGT
(usada en estudios de ratón):-
Fusión DOM7h-11/DOM1m-21-23número DMS 5515
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 323)
Secuencia de aminoácidos más secuencia de nucleótidos más marcador myc (SEC ID N°: 324)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGT
TLSWYQQKPGKAPKLLIWFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKRAAA
EQKLISEEDLN
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 325)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACG
GATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAG
TTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCAT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGC
AAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTGGTTT
GGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA
GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGG
GACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Secuencia de nucleótidos más marcador myc (SEC ID N°: 326)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACG
GATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAG
TTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCAT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGC
AAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTGGTTT
GGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA
GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGG
GACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTAA
Fusión DOM7h-11-12/DOM1m-21-23 número DMS 5516
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 327)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGT
MLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
Secuencia de aminoácidos más secuencia de nucleótidos más marcador myc (SEC ID N°: 328)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGT
MLSWYQQKPGKAPKLLILFGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKRAAA
EQKLISEEDLN
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 329)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACG
GATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAG
TTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCAT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGC
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
AAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTGTTTG
GTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG
CAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGG
ACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Secuencia de nucleótidos más marcador myc (SEC ID N°: 330)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACG
GATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAG
TTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCAT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGC
AAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTGTTTG
GTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG
CAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGG
ACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTAA
Fusión DOM7h-11-15/DOM1m-21-23 número DMS 5517
Secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 331)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGT
MLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
Secuencia de aminoácidos más secuencia de nucleótidos más marcador myc (SEC ID N°: 332)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNT
LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQGTQVTVSSASTSGPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGT
MLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKRAAA
EQKLISEEDLN
Secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 333)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACG
GATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAG
TTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCAT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGC
AAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCT
TTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG
CAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGG
ACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Secuencia de nucleótidos más marcador myc (SEC ID N°: 334)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTC
CGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACG
GATTGATTCTTATGGTCGTGGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTCCA
AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAAATTTCTCAG
TTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAGTGGTCCAT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGC
AAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCT
TTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG
CAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGG
ACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTAA
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplificación
En el apartado experimental toda la numeración se realiza de acuerdo con Kabat (Kabat, E.A. National Institutes of Health (US) & Columbia University. Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed. (US Dept. Of Health and Human Services Public Health Service, National Institues of Health, Bethesda, MD, 1991)).
Se describen variantes derivadas de DOM7h-11 y DOM7h-14. Las variantes DOM7h-11 no son de acuerdo con la invención.
EJEMPLO 1: Maduración de Afinidad Vk Selecciones:
Se obtuvieron antígenos de HSA (Albúmina de Suero Humana) y RSA (Albúmina de Suero de Rata) de Sigma (esencialmente sin ácidos grasos, ~99% (electroforesis en gel de agarosa), polvo liofilizado Cat. N° A3782 y A6414, respectivamente).
Se prepararon productos biotinilados de los dos antígenos anteriores usando Sulfo-NHS-SS-Biotina unida a Ez (Pierce, Cat. N° 21331). El reactivo sin biotina se eliminó pasando las muestras dos veces a través de una columna de desalinización PD10 seguido de diálisis durante una noche frente un volumen sobrante 1000x de PBS a 4°C. El producto resultante se ensayó por espectrofotometría de masas y se observaron 1-2 biotinas por molécula.
Bibliotecas de maduración de afinidad:
Se crearon bibliotecas propensas a errores y CDR usando los dAb parentales DOM7h-11 y DOM7h-14 (véase el documento WO2008/096158 para las secuencias de DOM7h-11 y DOM7h-14). Las bibliotecas de CDR se crearon en el vector pDOM4 y las bibliotecas propensas a errores se generaron en el vector pDOM33 (para permitir la selección con o sin tratamiento con proteasa). El vector pDOM4 es un derivado del vector del fago Fd en el que la secuencia peptídica de señal del gen III se reemplazó con el péptido de señal de la proteína de superficie glicolipídica anclada (GAS) de levadura. Éste también contiene un marcador c-myc entre la secuencia líder y el gen III, que restablece al gen III en fase de lectura. Esta secuencia líder actúa bien en vectores de presentación de fagos pero también en otros vectores de expresión procariotas y puede usarse universalmente. pDOM33 es una versión modificada del vector pDOM4 en el que se ha eliminado el marcador c-myc lo que hace que la fusión fago-dAb sea resistente a la tripsina proteasa. Esto permite el uso de tripsina en la selección del fago para seleccionar los dAbs que son más estables a proteasa (véase el documento WO2008149143).
Para las bibliotecas de maduración propensas a errores, el ADN plasmídico que codifica el dAb a madurar se amplificó por PCR, usando el KIT DE MUTAGÉNESIS ALEATORIA GENEMORPH® II (kit de mutagénesis único, aleatorio, Stratagene). Se realizó la digestión del producto con Sal I y Not I en una reacción de ligación con el vector del fago de corte pDOM33.
Para las bibliotecas CDR, se realizaron reacciones PCR usando oligonucleótidos degenerados que contenían codones NNK o NNS para diversificar las posiciones necesarias en el dAb a madurar por afinidad. A continuación se usó PCR de ensamblaje para generar un inserto diversificado de longitud completa. La digestión del inserto se realizó con Sal I y Not I y se usó en una reacción de ligación con pDOM4 para mutagénesis de restos múltiples y pDOM5 para mutagénesis de restos sencillos. El vector pDOM5 es un vector de expresión basado en pUC119 en el que la expresión de la proteína se realiza mediante el promotor LacZ. Una secuencia líder GAS1 (véase el documento WO 2005/093074) garantiza la secreción del dAbs soluble, aislado en el periplasma y sobrenadante de cultivo de E. coli. Los dAbs se clonaron usando SalI/NotI en este vector, que añade un marcador myc en el extremo C del dAb. Este protocolo usando SalI y Not I da como resultado la inclusión de una secuencia de aminoácidos ST en el extremo N.
La ligación producida por cualquier método se usó después para transformar la cepa E. coli TB1 por electroporación y las células transformadas se cultivaron en placas en agar TY 2x que contenía tetraciclina 15 |ig/ml, produciendo tamaños de bibliotecas de >5x107 clones.
Las bibliotecas propensas a errores tenían la siguiente tasa de mutación promedio y tamaño: DOM7h-11 (2,5 mutaciones por dAb), tamaño: 6,1 x 108, DOM7h-14 (2,9 mutaciones por dAb), tamaño: 5,4 x 108.
Cada biblioteca CDR tiene una diversidad de cuatro aminoácidos. Se generaron dos bibliotecas para cada una de las CDR 1 y 3 y una biblioteca para CDR2. Las posiciones diversificadas en cada biblioteca son las siguientes (aminoácidos en base a la secuencia DPK9 ficticia para VK):
5
10
15
20
25
30
35
40
Tamaño de la biblioteca
DOM7h-11 DOM7h-11
- Q27, S28, S30, S31 (CDR1)
8,8 x 107 5,8 x 107
- S30, S31, Y32, N34 (CDR1)
4,6 x 108 4,2 x 108
- Y49, A50, A51, S53 (CDR2)
3,9 x 108 2,4 x 108
-Q89, S91, Y92, S93 (CDR3
1,8 x 108 2,5 x 108
- Y92, Y93, T94, N96 (CDR3)
4,0 x 108 3,3 x 108
Ejemplo 2: Estrategias de selección:
Se adoptaron tres estrategias de selección de fagos para maduración de afinidad Vk AlbudAb™ (dAB anti-albúmina de suero):
1) Selecciones frente a HSA únicamente:
Se realizaron tres rondas de selección frente a HSA. Las bibliotecas propensas a errores y cada biblioteca de CDR se seleccionaron como un grupo individual en todas las rondas. La primera ronda de selección se realizó frente a HSA revestida de modo pasivo sobre un inmunotubo a 1 mg/ml. La segunda ronda se realizó frente a HSA 100 nM y la tercera ronda frente a HSA 10 nM (selecciones para CDR) o 20 ó 100 nM (selecciones para propensas a error), ambas como selecciones solubles seguido de una cuarta ronda de selección con las bibliotecas propensas a errores frente a HSA 1,5 nM como una selección soluble. Las bibliotecas propensas a errores se eluyeron con glicina 0,1 M pH 2,0 antes de la neutralización con Tris 1 M pH 8,0 y las bibliotecas CDR se eluyeron con tripsina 1 mg/ml antes de la infección en células TG1 en fase logarítmica. La tercera ronda de cada selección se subclonó en pDOM5 para la exploración. Las selecciones solubles usaron HSA biotinilado.
2) Selecciones de tripsina frente a HSA:
Para seleccionar los dAbs con resistencia a proteasa aumentada en comparación con el clon parental y con las propiedad biofísicas potencialmente mejoradas, se usó tripsina en selecciones de fagos (véase el documento WO2008149143). Se realizaron cuatro rondas de selección frente a HSA. La primera ronda de selección de bibliotecas propensas a errores se realizó frente a HSA revestida de modo pasivo a 1 mg/ml sin tripsina; la segunda ronda frente a HSA revestida de modo pasivo a 1 mg/ml con tripsina 20 |ig/ml durante 1 hora a 37°C; la tercera ronda de selección se realizó por selección soluble usando HSA biotinilado frente a HSA 100 nM con 20 |ig/ml o 100 |ig/ml de tripsina durante 1 hora a 37°C. La ronda de selección final se realizó por selección soluble usando HSA biotinilada frente a HSA 100 nM con tripsina 100 |ig/ml durante una noche a 37°C.
3) Selecciones de entrecruzamiento frente a HSA (ronda 1) y RSA (rondas 2-4):
La primera ronda de selección se realizó frente a HSA revestida de modo pasivo 1mg/ml o HSA 1 |iM (selección soluble), seguido de tres rondas adicionales de selecciones solubles frente a RSA biotinilada a concentraciones de 1 |iM para la ronda 1, 100 nm para la ronda 2 y 20 nM, 10 nM o 1 nM para la ronda 3.
Estrategia de exploración y determinación de afinidad:
Después de la selección en cada caso se preparó un conjunto de ADN de fagos de la ronda de selección apropiada usando un kit QIAfilter midiprep (Qiagen), la digestión del ADN se realizó usando las enzimas de restricción Sal1 y Not1 y los genes V enriquecidos se ligaron en los sitios correspondientes en pDOM5 el vector de expresión soluble que expresa el dAb con un marcador myc (véase el documento PCT/EP2008/067789). El ADN ligado se usó para electro transformar células HB 2151 de E. coli que después se cultivaron durante una noche en placas de agar que contenían el antibiótico carbenicilina. Las colonias resultantes se evaluaron individualmente para la unión al antígeno. En cada caso se ensayaron al menos 96 clones para la unión a HSA, CSA, (Albúmina de Suero de mono Cynomolgus), MSA (albúmina de suero de ratón) y RSA por BIAcore™ (resonancia de plasmón superficial). El antígeno MSA se obtuvo de Sigma (esencialmente sin ácidos grasos, ~99% (electroforesis en gel de agarosa), polvo liofilizado Cat. N° A3559) y CSA se purificó de la albúmina de suero de Cynomolgus usando resina azul prometic (Amersham). Se produjeron fragmentos solubles de dAb en cultivos de bacterias en medios de cultivo ONEX (Novagen) durante una noche a 37°C en placas de 96 pocillos. El sobrenadante de cultivo conteniendo dAb soluble se centrifugó y se analizó por BIAcore para la unión a microplacas CM5 con HSA, CSA, MSA y RS de elevada densidad. Se descubrió que los clones se unían a todas estas especies de albúmina de suero
mediante exploración de velocidad de disociación. Los clones se secuenciaron revelando secuencias dAb únicas.
La identidad mínima de los clones seleccionados con respecto al parental (a nivel de aminoácidos) eral del 97,2% (DOM7h-11-3: 97,2%, DOM7h-11-12: 98,2%, DOM7h11-15: 96,3%, DOM7h-11-18: 98,2%, DOM7h-11-19: 97,2%).
La identidad mínima de los clones seleccionados con respecto al parental (a nivel de aminoácidos) era del 96,3% 5 (DOM7h-14-10: 96,3%, DOM7h-14-18: 96,3%, DOM7h-14-19: 98,2%, DOM7h-14-28: 99,1%, DOM7h-14-36: 97,2%).
Los dAb únicos se expresaron como sobrenadantes bacterianos en un matraz agitador de 2,5 l en medio Onex a 30°C durante 48 h a 250 rpm. Los dAb se purificaron del medio de cultivo mediante absorción por proteína L agarosa seguido de elución con glicina 10 mM pH 2,0. La unión a HSA, CSA, MSA y RSA por BIAcore se confirmó usando proteína purificada a 3 concentraciones 1 |iM, 500 nM y 50 nM. Para determinar la afinidad de unión (Kd) de los AlbudAbs para 10 cada albúmina de suero; los dAb purificados se analizaron por BIAcore sobre un intervalo de concentración de albúmina de 5000 nM a 39 nM (5000 nM, 2500 nM, 1250 nM, 625 nM, 312 nM, 156 nM, 78 nM, 39 nM).
Tabla 6
AlbudAb
Afinidad (Kd) para SA (nM) Kd Ka
Rata
DOM7h-14
60 2,095E-01 4,00E+06
DOM7h-14-10
4 9,640E-03 4,57E+06
DOM7h-14-18
410 2,275E-01 5,60E+05
DOM7h-14-19
890 2,870E-01 3,20E+05
DOM7h-14-28
45 (140) 7,0E-02 (1,141e-1) 2,10E+06 (8,3e5)
DOM7h-14-36
30 (6120) 2,9E-02 (5,54e-2) 1,55E+06 (9e3)
DOM 7h-11
2100 1,00E-01 4,80E+04
DOM 7h-11-3
10000 (88000) (7,18e-1) (8,11e3)
DOM7h-11-12
200 5,22E-01 2,76E+06
DOM7h-11-15
20 2,10E-02 1,10E+06
DOM7h-11-18
80 (29000) 6,0E-02 (3,7e-1) 1,64E+06 (1,3e4)
DOM7h-11-19
28 (17000) 9,1e-02 (1,4e-1) 9,80E+05 (8,1e3)
Cyno
DOM 7h-14
66 9,65E-02 1,50E+06
DOM7h-14-10
9 1,15E-02 1,60E+06
DOM7h-14-18
180 1,05E-01 6,30E+5
DOM7h-14-19
225 1,56E-01 7,00E+05
DOM7h-14-28
66 (136) 1,3E-01 (1,34e-1) 2,50E+06 (9,8e5)
DOM7h-14-36
35 (7830) 1,9E-02 (1,1e-1) 9,80E+06 (1,43e4)
DOM 7h-11
1000 6,82E-01 8,00E+05
AlbudAb
Afinidad (Kd) para SA (nM) Kd Ka
DOM 7h-11-3
670 (200) 9,6E-02 (1,5e-1) 2,90E+05 (7,26e5)
DOM7h-11-12
>6000
DOM7h-11-15
3 5,57E-03 5,80E+06
DOM7h-11-18
10000 (65000) 1,36 (4,8e-1) 2,25E+05 (7,3e3)
DOM7h-11-19
>10000 (375000) (6,2e-1) (1,7e3)
Ratón
DOM 7h-14
12 4,82E-02 4,10E+06
DOM7h-14-10
30 3,41E-02 1,29E+06
DOM7h-14-18
65 9,24E-02 2,28E+06
DOM7h-14-19
60 5,76E-02 1,16E+06
DOM7h-14-28
26 (31) 3,4E-02 (7,15e-2) 1,60E+06 (2,28e6)
DOM7h-14-36
35 (33) 2,3E-02 (7,06e-2) 8,70E+05 (2,11e6)
DOM 7h-11
5000 9,00E-01
DOM 7h-11-3
>10000 (36000) (6,12e-1) (1,67e4)
DOM7h-11-12
130 1,89E-01 1,53E+06
DOM7h-11-15
10 9,40E-03 1,10E+06
DOM7h-11-18
150 (1600) 2,4E-02 (6,23e-2) 4,40E+05 (4e4)
DOM7h-11-19
100 (18000) 3,7E-02 (8,8e-2) 1,40E+06 (4,9e3)
Humana
DOM 7h-14
33 4,17E-02 1,43E+06
DOM 7h-14-10
12 1,39E-02 1,50E+06
DOM 7h-14-18
280 3,39E-02 1,89E+05
DOM 7h-14-19
70 5,25E-02 8,26E+05
DOM 7h-14-28
30 (8260) 3,3E-02 (5,6e-2) 1,24E+06 (6,78e3)
DOM 7h-14-36
28 (1260) 2,4E-02 (6,7e-2) 1,23E+06 (5,4e4)
DOM 7h-11
2800 6,41E-01 7,00E+05
DOM 7h-11-3
32 (130) 1,6E-02 (2,35e-2) 6,50E+05 (1,86e5)
DOM7h-11-12
350 4,13E-01 1,26E+06
AlbudAb
Afinidad (Kd) para SA (nM) Kd Ka
DOM7h-11-15
1 1,84E-03 2,00E+06
DOM7h-11-18
36 (32000) 5,1E-02 (2,7e-1) 3,40E+06 (8,39e3)
DOM7h-11-19
65 (38000) 1,1E-01 (2,09e-1) 1,80E+06 (5,4e3)
*: los valores entre paréntesis proceden de un segundo experimento SPR independiente.
Todas las variantes derivadas de DOM7h-14 tienen reactividad cruzada para la albúmina de suero de ratón, rata, ser humano y cyno. DOM7h-14-10 tenía afinidad mejorada para la albúmina de suero de rata, cyno y ser humano en
comparación con la parental. DOM7h-14-28 tenía afinidad mejorada para RSA. DOM7h-14-36 tenía afinidad mejorada 5 para RSA, CSA y MSA.
DOM7h-11-3 tenía afinidad mejorada para CSA y HSA. DOM7h-14-12 tenía afinidad mejorada para RSA, MSA y HSA. DOM7h-11-15 tenía afinidad mejorada para RSA, MSA, CSA y HSA. DOM7h-11-18 y DOM7h-11-19 tenía la afinidad mejorada para RSA, MSA y HSA.
Ejemplo 3: Orígenes de clones clave del linaje DOM7h-11:
10 DOM7h-11-3: A partir de la maduración de afinidad realizada frente a HSA usando la biblioteca CDR2 (Y49, A50, A51,
S53), producción de la ronda 3 HSA 10 nM.
DOM7h-11-12: A partir de la maduración de afinidad realizada frente a HSA usando la biblioteca propensa a error, producción de la ronda 3 (HSA, 100 nM) con tripsina 100 |ig/ml.
DOM7h-11-15: A partir de selecciones de entrecruzamiento realizadas frente a HSA como 1 ronda seguido de 3 rondas 15 adicionales de selección frente a RSA usando la biblioteca CDR2 (Y49, A50, A51, S53) a selección de 3 rondas con 1 nM de RSA.
DOM7h-11-18: A partir de selecciones de entrecruzamiento realizadas frente a HSA como 1 ronda seguido de 3 rondas adicionales de selección frente a RSA usando la biblioteca propensa a error, producción de la ronda 3 con 20 nM de RSA.
DOM7h-11-19: A partir de selecciones de entrecruzamiento realizadas frente a HSA como 1 ronda seguido de 3 rondas de 20 selección adicionales frente a RSA usando la biblioteca propensa a error, producción de la ronda 3 con 5 nM de RSA.
Tabla 7: Secuencias CDR (de acuerdo con Kabat; ref. como se ha indicado anteriormente)
AlbudAb
CDR
CDR1 CDR2 CDR3
DPK9 Vk ficticia
SQSISSYLN YAASSLQS QQSYSTPNT
(SEC ID N°: 335) (SEC ID N°: 336) (SEC ID N°: 337)
DOM7h-11
SRPIGTTLS WFGSRLQS AQAGTHPTT
(SEC ID N°: 338) (SEC ID N°: 339) (SEC ID N°: 340)
DOM7h-11-12
SRPIGTMLS LFGSRLQS AQAGTHPTT
(SEC ID N°: 341) (SEC ID N°: 342) (SEC ID N°: 343)
DOM 7h-11-15
SRPIGTMLS LAFSRLQS AQAGTHPTT
(SEC ID N°: 344) (SEC ID N°: 345) (SEC ID N°: 346)
DOM 7h-11-18
SRPIGTMLS WFGSRLQS AQAGTHPTT
(SEC ID N°: 347) (SEC ID N°: 348) (SEC ID N°: 349)
DOM 7h-11-19
SRPIGTMLS LFGSRLQS AQTGTHPTT
(SEC ID N°: 350) (SEC ID N°: 351) (SEC ID N°: 352)
AlbudAb
CDR
CDR1 CDR2 CDR3
DOM 7h-11-3
SRPIGTTLS LWFSRLQS AQAGTHPTT
(SEC ID N°: 353) (SEC ID N°: 354) (SEC ID N°: 355)
Ejemplo 4: Orígenes de clones clave del linaje DOM7h-14:
DOM7h-14-19: A partir de la maduración de afinidad realizada frente a HSA usando la biblioteca propensa a error, producción ronda 3 (HSA, 100 nM) con tripsina 100 |ig/ml.
5 DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36: A partir de la maduración de afinidad realizada frente a
HSA usando la biblioteca de CDR3 (Y92, Y93, T94, N96), producción ronda 3.
Tabla 8: Secuencias CDR (de acuerdo con Kabat); ref. como se ha indicado anteriormente)
AlbudAb
CDR
CDR1 CDR2 CDR3
DPK9 Vk ficticia
SQSISSYLN YAASSLQS QQSYSTPNT
(SEC ID N°: 335) (SEC ID N°: 336) (SEC ID N°: 337)
DOM 7h-14
SQWIGSQLS MWRSSLQS AQGAALPRT
(SEC ID N°: 356) (SEC ID N°: 357) (SEC ID N°: 358)
DOM 7h-14-10
SQWIGSQLS MWRSSLQS AQGLRHPKT
(SEC ID N°: 359) (SEC ID N°: 360) (SEC ID N°: 361)
DOM 7h-14-18
SQWIGSQLS MWRSSLQS AQGLMKPMT
(SEC ID N°: 362) (SEC ID N°: 363) (SEC ID N°: 364)
DOM 7h-14-19
SQWIGSQLS MWRSSLQS AQGAALPRT
(SEC ID N°: 365) (SEC ID N°: 366) (SEC ID N°: 367)
DOM 7h-14-28
SQWIGSQLS MWRSSLQS AQGAALPKT
(SEC ID N°: 368) (SEC ID N°: 369) (SEC ID N°: 370)
DOM 7h-14-36
SQWIGSQLS MWRSSLQS AQGFKKPRT
(SEC ID N°: 371) (SEC ID N°: 372) (SEC ID N°: 373)
Ejemplo 5: Expresión y Caracterización Biofísica:
10 El nivel de expresión bacteriano se determinó de la manera habitual en matraces de agitación de 2,5 l seguido del cultivo en medio Onex a 30°C durante 48 horas a 250 rpm. Las características biofísicas se determinaron por SEC MALLS y DSC.
SEC MALLS (cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz LÁSER multiángulo) es una técnica no invasiva para la caracterización de macromoléculas en solución. En resumen, las proteínas (a una concentración de 1 15 mg/ml en tampón PBS de Dubelcco a 0,5 ml/min) se separaron de acuerdo con sus propiedades hidrodinámicas por cromatografía de exclusión por tamaño (columna: TSK3000 de TOSOH Biosciences; S200 de Phamarcia). Después de la separación, se midió la propensión de la proteína a la dispersión lumínica usando un detector de dispersión de luz LÁSER multiángulo (MALLS). La intensidad de la luz dispersa cuando la proteína pasa a través del detector se mide como una función de ángulo. Esta medida tomada junto con la concentración de la proteína determinada usando el detector de 20 índice refractivo (RI) permite calcular la masa molar usando ecuaciones apropiadas (parte integral del análisis informático
5
10
15
20
25
Astra v.5.3.4.12).
DSC (Calorimetría de Escáner Diferencial): en resumen, la proteína se calentó a una velocidad constante de 180 °C/h (a 1 mg/ml en PBS) y se midió un cambio térmico detectable asociado a la desnaturalización térmica. Se determinó el punto medio de transición (appTm), que se describe como la temperatura en la cual el 50% de la proteína se encuentra en su conformación nativa y el otro 50% desnaturalizada. En este caso, el valor DSC determinó el punto medio de transición aparente (appTm) ya que la mayoría de las proteínas examinadas no estaban completamente replegadas. A mayor Tm, más estable era la molécula. Las curvas desdobladas se analizaron mediante ecuaciones que no eran de 2 estados. El paquete informático usado era OriginR v7.0383.
Tabla 9
AlbudAb
Parámetros Biofísicos
SEC MALLS DSC Tm (°C)
DOM7h-14
M 60
DOM 7h-14-10
M 59
DOM 7h-14-18
M 58
DOM 7h-14-19
M 59
DOM 7h-14-28
M 58,3/60,2
DOM 7h-14-36
M 59,2
DOM 7h-11
M 66,9-72,2
DOM 7h-11-3
M (95%)* 66,6/70,5
DOM 7h-11-12
M (<2% D) 71,7
DOM 7h-11-15
M (<5% D) 58,5-60,5
DOM 7h-11-18
M (98%) 58,9/65,8
DOM 7h-11-19
M 71,8/76,6
*en otro ensayo, se observó principalmente el monómero mediante SEC MALLS, aunque inferior al 95%.
En la Tabla 9 se observan los niveles de expresión para todos los clones en el intervalo de 15 a 119 mg/l en E. coli.
En las variantes DOM7h-14 y DOM7h-11, durante la maduración de afinidad se mantuvieron los parámetros biofísicos favorables (monoméricos en solución según se determina por SEC MALL y appTm >55 °C según se determina por DSC) y los niveles de expresión. El estado monomérico es ventajoso porque evita la dimerización y el riesgo de productos que puedan entrecruzarse con las dianas tales como receptores de la superficie celular.
Ejemplo 6: Determinación de semivida en suero en rata, ratón y mono Cynomolgus
Se clonaron AlbudAbs DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-19, DOM7h-11, DOM7h11-12 y DOM7h-11-15 en el vector pDOM5. Para cada AlbudAb™, se expresaron cantidades de 20-50 mg en E. coli y se purificaron del sobrenadante de cultivo bacteriano usando la resina de afinidad para proteína L y se eluyó con glicina 100 mM pH 2. Las proteínas se llevaron a una concentración superior a 1 mg/ml, el tampón se intercambió a PBS y la endotoxina se agotó usando columnas de giro Q (Vivascience). Para realizar el análisis farmacocinético (PK) de rata, se dosificaron AlbudAbs como inyecciones i.v. únicas de 2,5 mg/kg usando 3 ratas por compuesto. Las muestras de suero se tomaron a 0,16, 1, 4, 12, 24, 48, 72, 120, 168 h. El análisis de los niveles en suero se realizó mediante ELISA anti-myc según el método descrito a continuación.
Para el PK de ratón, se dosificaron DOM7h-11, DOM7h11-12 y DOM7h-11-15 como inyecciones i.v. únicas de 2,5 mg/kg por dosis a un grupo de 3 sujetos y las muestras de suero se tomaron a 10 min; 1 h; 8 h; 24 h; 48 h; 72 h; 96 h. El análisis de los niveles en suero se realizó mediante ELISA anti-myc según el método descrito a continuación.
Para el PK del mono Cynomolgus se dosificaron DOM7h-14-10 y DOM7h11-15 como inyecciones i.v. únicas de 2,5 mg/kg
por dosis a un grupo de tres hembras de mono Cynomolgus y las muestras de suero se tomaron a 0,083, 0,25, 0,5, 1,2, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 h. El análisis de los niveles en suero se realizó mediante ELISA anti-myc según el método descrito a continuación.
Método de ELISA anti-myc
5 La concentración de AlbudAb en suero se midió por ELISA anti-myc. En resumen, en placas Nunc Maxisorp de 96 pocillos, se revistió durante una noche anticuerpo policlonal de cabra anti-myc (1:500; Abcam, catálogo número ab9132) y se bloqueó con BSA/PBS al 5% + tween al 1%. Se añadieron muestras de suero a un intervalo de diluciones junto a concentraciones conocidas convencionales. La unión de AlbudAb marcado con myc se detectó a continuación usando un anti-Vk policlonal de conejo (1:1000; reactivo casero, las extracciones se agruparon y la proteína A se purificó antes del 10 uso) seguido de un anticuerpo HRP anti-IgG de conejo (1:10.000; Sigma, catálogo número A2074). Las placas se lavaron entre cada etapa del ensayo con PBS 3 x + Tween 20 al 0,1% seguido de PBS 3 x. Después del último lavado se añadió TMB (Sustrato de Peroxidasa para Micropocillo de Componente SureBlue TMB1, KPL, catálogo número 52-00-00) y se dejó desarrollar. El proceso se detuvo con HCl 1 M y después se midió la señal usando una absorbancia a 450 nm.
A partir de datos ELISA sin procesar, la concentración de muestras desconocidas se estabilizó por interpolación frente a la 15 curva convencional teniendo en cuenta los factores de dilución. La concentración media que resulta de cada momento se determinó a partir de valores de repetición y se introdujeron en un paquete de análisis WinNonLin (por ejemplo, versión 5.1 (disponible de Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, EE.UU.). Los datos se ajustaron usando un modelo no- compartimental, en el que los parámetros PK se estimaron mediante el programa informático para proporcionar las semividas terminales. La información de la dosificación y los momentos se seleccionaron para reflejar la fase terminal de 20 cada perfil PK.
Tabla 10: PK de AlbudAb™ Sencillo
Especie
AlbudAb Albúmina Kd (nM) Parámetros PK
AUC h x |ig/ml CL ml/h/kg t1/2 h Vz ml/kg
Rata
DOM7h-14* 60
DOM7h-14-10 4 2134,6 1,2 42,1 71,2
DOM7h-14-18 410 617,3 4,1 38,4 228,1
DOM7h-14-19 890 632,6 4,1 36,3 213,3
DOM7h-11 2100 320,1 7,8 23,3 263,9
DOM7h-11-12 200 398,7 6,4 35,5 321,2
DOM7h-11-15 20 843,4 3,0 30,3 130,7
Ratón
DOM7h-11 5000 304,7 8,2 18,3 216,8
DOM7h-11-12 130 646,6 3,9 43,9 244,8
DOM7h-11-15 10 499,2 5,0 33,7 243,4
Cyno
DOM7h-14* 66 217,5
DOM7h-14-10 9 6174,6 0,4 200,8 117,8
5
10
15
20
25
30
Especie
AlbudAb Albúmina Kd (nM) Parámetros PK
AUC CL t1/2 Vz
h x |ig/ml ml/h/kg h ml/kg
DOM7h-11* 3300 135,1
DOM7h-11-15 3 4195 0,6 198,1 170,3
* Datos históricos
Los parámetros farmacocinéticos obtenidos de estudios de rata, ratón y mono Cynomolgus se ajustaron usando un modelo no compartimental. Clave: AUC: Área bajo la curva del tiempo de dosificación extrapolado al infinito; CL: eliminación; t1/2: es el tiempo durante el cual la concentración en sangre se divide en dos; Vz: volumen de distribución en base a la fase terminal.
DOM7h-11 12 y DOM7h-11-15 tienen una AUC y un t1/2 mejorados en rata y ratón en comparación con el parental. DOM7h-11-15 también tiene una AUC y un t1/2 mejorados en Cyno en comparación con el parental. Esta mejora del AUC/t1/2 equivale a una KD mejorada in vitro para la albúmina de suero.
Ejemplo 7: Fusiones AlbudAb™ IFN
Clonación y expresión
Al igual que en los AlbudAbs sencillos, los Albudabs Vk madurados por afinidad se unieron al Interferón alfa 2b (IFNa2b) para determinar si se mantenía un PK útil del AlbudAb como una proteína de fusión.
Secuencia de aminoácidos del interferón alfa 2b:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLL DKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRS KE (SEC ID N°: 374)
Secuencia de nucleótidos del interferón alfa 2b:
TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTC
TTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAA
ACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAT
GAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGG
TGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCT
CTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTC
AACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA (SEC ID N°: 375)
Mediante una región enlazante TVAAPS (véase el documento WO2007085814) se realizó la unión del IFNa2b con AlbudAb. Las construcciones se clonaron por SOE-PCR (extensión de solapamiento simple de acuerdo con el método de Horton y col. Gene, 77, p 61 (1989)). Se realizó por separado la amplificación PCR del AlbudAb y de las secuencias IFN usando cebadores con un solapamiento de ~15 pares de bases en la región enlazante TVAAPS. Los cebadores usados son los siguientes:
IFNa2b SOE fragmento 5' GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG (SEC ID N°: 376)
IFNa2b SOE fragmento 3' GGAGGATGGAGACTGGGTCATCTGGATGTC (SEC ID N°: 377)
Vk SOE fragmento 5' GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCC (SEC ID N°: 378)
Vk SOE fragmento 5' para introducir también GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC un marcador myc
TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCCCGT TTGATTTCCACCTTGGTCCC (SEC ID N°: 379)
Los fragmentos se purificaron por separado y posteriormente se ensamblaron en una reacción SOE (extensión PCR por
extensión de solapamiento simple) usando únicamente los cebadores flanqueantes.
IFNa2b SOE fragmento 5' GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG (SEC ID N°: 380)
Vk SOE fragmento 3' para introducir también GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC un marcador myc
TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCCCGT TTGATTTCCACCTTGGTCCC (SEC ID N°: 381)
La digestión del producto PCR ensamblado se realizó con las enzimas de restricción BamHI y HindlII y el gen se ligó en los sitios correspondientes en el pDOM50, un vector de expresión de mamíferos que es un derivado de pTT5 con una secuencia líder secretora IgG de ratón V-J2-C N-terminal para facilitar la expresión en el medio celular.
5 Secuencia líder (aminoácidos):
METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEC ID N°: 382)
Secuencia líder (nucleótidos):
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCCACCGGGC (SEC ID N°: 383)
Se preparó un ADN plasmídico usando QIAfilter megaprep (Qiagen). Se transfectó ADN 1 |ig /ml con Fectin-293 en 10 células HEK293E y se cultivaron en medio sin suero. La proteína se expresó en el cultivo durante 5 días y se purificó del sobrenadante del cultivo usando la resina de afinidad a proteína L y se eluyó con glicina 100 mM pH 2. Las proteínas se llevaron a una concentración superior a 1 mg/ml, se cambió el tampón a PBS y las endotoxinas se agotaron usando columnas de giro Q (Vivascience).
Tabla 11: Secuencias de interferón alfa 2b-AlbudAb con y sin marcador-myc (como secuencias de aminoácidos y 15 nucleótidos)
El Interferón alfa 2b es N-terminal con respecto a AlbudAb en las siguientes fusiones.
DMS7321
(IFNa2b-DOM7h-14)
aa + myc
CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQWIG SQLSWYQQKPGKA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGAALPRTFG QGTKVEIKR AAAEQKLISEEDLN* (SEC ID N°: 384)
nt + myc
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
Aminoácidos sin marcador
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASQWIG
SQLSWYQQKPGKA
PKLLIMWRSSLQSG
VPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATY
YCAQGAALPRTFG
QGTKVEIKR (SEC
ID N°: 386)
Nucleótidos sin marcador
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
AAGTCAGTGGATT
GGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCATGTGGCG
TTCCTCGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCTCAGGGTG
CGGCGTTGCCTAG
GACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGGGC
GGCCGCAGAACAA
AAACTCATCTCAG
AAGAGGATCTGAA
TTAA (SEC ID N°:
385)
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
AAGTCAGTGGATT
GGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCATGTGGCG
TTCCTCGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCTCAGGGTG
CGGCGTTGCCTAG
GACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGG
(SEC ID N°: 387)
DMS732 (IFNa2b-
DOM7h-14-10)
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASQWIG
SQLSWYQQKPGKA
PKLLIMWRSSLQSG
VPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATY
YCAQGLRHPKTFG
QGTKVEIKR
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASQWIG
SQLSWYQQKPGKA
PKLLIMWRSSLQSG
VPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATY
YCAQGLRHPKTFG
QGTKVEIKR (SEC
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
marcador
marcador
AAAEQKLISEEDLN
(SEC ID N°: 388)
* TGAACGATCTAGA GGCTTGCGTTATTC AGGGTGTAGGAGT TACTGAAACTCCCC TAATGAAAGAAGAT TCAATTCTAGCCGT TAGAAAATACTTTC AGCGTATCACATTG TATTTAAAGGAAAA GAAATACTCCCCAT GTGCATGGGAGGT GGTTAGAGCAGAA ATTATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACGA ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCAGTGGATT GGGTCTCAGTTAT CTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAA GTGGGGTCCCATC ACGTTTCAGTGGC AGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGTGCTCAGGGTT TGAGGCATCCTAA GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGGGC GGCCGCAGAACAA AAACTCATCTCAG AAGAGGATCTGAA TTAA (SEC ID N°: 389)
ID N°: 390)
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
AAGTCAGTGGATT
GGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCATGTGGCG
TTCCTCGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCTCAGGGTT
TGAGGCATCCTAA
GACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGG
(SEC ID N°: 391)
DMS7323
(IFNa2b-DOM7h-14-
18)
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
DMS7324 (IFNa2b-
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASQWIG
SQLSWYQQKPGKA
PKLLIMWRSSLQSG
VPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATY
YCAQGLMKPMTFG
QGTKVEIKRAAAEQ
KLISEEDLN* (SEC
ID N°: 392)
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
AAGTCAGTGGATT
GGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCATGTGGCG
TTCCTCGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCTCAGGGTC
TTATGAAGCCTATG
ACGTTCGGCCAAG
GGACCAAGGTGGA
AATCAAACGGGCG
GCCGCAGAACAAA
AACTCATCTCAGA
AGAGGATCTGAAT
TAA (SEC ID N°:
393)
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASQWIG
SQLSWYQQKPGKA
PKLLIMWRSSLQSG
VPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATY
YCAQGLMKPMTFG
QGTKVEIKR (SEC
ID N°: 394)
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
AAGTCAGTGGATT
GGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCATGTGGCG
TTCCTCGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCTCAGGGTC
TTATGAAGCCTATG
ACGTTCGGCCAAG
GGACCAAGGTGGA
AATCAAACGG
(SEC ID N°: 395)
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
DOM7h-14-19)
LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTISCRASQWIG SQLSWYQQKPGEA PKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATY YCAQGAALPRTFG QGTKVEIKR AAAEQKLISEEDLN* (SEC ID N°: 396)
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTcTC
CATCCTCCCTGTCT
GCATCTGTAGGAG
ACCGTGTCACCAT
CTCTTGCCGGGCA
AGTCAGTGGATTG
GGTCTCAGTTATCT
TGGTACCAGCAGA
AACCAGGGGAAGC
CCCTAAGCTCCTG
ATCATGTGGCGTT
CCTCGTTGCAAAGT
GGGGTCCCATCAC
GTTTCAGTGGCAG
TGGATCTGGGACA
GATTTCACTCTCAC
CATCAGCAGTCTG
CAACCTGAAGATTT
TGCTACGTACTACT
GTGCTCAGGGTGC
GGCGTTGCCTAGG
ACGTTCGGCCAAG
GGACCAAGGTGGA
marcador
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTISCRASQWIG
SQLSWYQQKPGEA
PKLLIMWRSSLQSG
VPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATY
YCAQGAALPRTFG
QGTKVEIKR (SEC
ID N°: 398)
marcador
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTcTC
CATCCTCCCTGTCT
GCATCTGTAGGAG
ACCGTGTCACCAT
CTCTTGCCGGGCA
AGTCAGTGGATTG
GGTCTCAGTTATCT
TGGTACCAGCAGA
AACCAGGGGAAGC
CCCTAAGCTCCTG
ATCATGTGGCGTT
CCTCGTTGCAAAGT
GGGGTCCCATCAC
GTTTCAGTGGCAG
TGGATCTGGGACA
GATTTCACTCTCAC
CATCAGCAGTCTG
CAACCTGAAGATTT
TGCTACGTACTACT
GTGCTCAGGGTGC
GGCGTTGCCTAGG
ACGTTCGGCCAAG
GGACCAAGGTGGA
DMS7325
(IFNa2b-DOM7h-11)
CDLPQTHSLGSRRT LMLLAQMRRISLFSC LKDRHDFGFPQEEF GNQFQKAETIPVLH EMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYT ELYQQLNDLEACVI QGVGVTETPLMKED SILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQ ESLRSKETVAAPSDI QMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASRPIGT TLSWYQQKPGKAP KLLIWFGSRLQSGV PSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYY CAQAGTHPTTFGQ GTKVEIKR AAAEQKLISEEDLN* (SEC ID N°: 400)
AATCAAACGGGCG
GCCGCAGAACAAA
AACTCATCTCAGA
AGAGGATCTGAAT
TAA (SEC ID N°: 397)
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
AAGTCGTCCGATT
GGGACGACGTTAA
GTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCTGGTTTGGT
TCCCGGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASRPIGT
TLSWYQQKPGKAP
KLLIWFGSRLQSGV
PSRFSGSGSGTDFT
LTISSLQPEDFATYY
CAQAGTHPTTFGQ
GTKVEIKR (SEC ID
N°: 402)
AATCAAACGG (SEC ID N°: 399)
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
AAGTCGTCCGATT
GGGACGACGTTAA
GTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCTGGTTTGGT
TCCCGGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
DMS7326
(IFNa2b-DOM7h-11-
12)
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASRPIGT
MLSWYQQKPGKAP
KLLILFGSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTL
TISSLQPEDFATYYC
AQAGTHPTTFGQG
TKVEIKR
AAAEQKLISEEDLN*
(SEC ID N°: 404)
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCGCAGGCTG
GGACGCATCCTAC
GACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGGGC
GGCCGCAGAACAA
AAACTCATCTCAG
AAGAGGATCTGAA
TTAA (SEC ID N°:
401)
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASRPIGT
MLSWYQQKPGKAP
KLLILFGSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTL
TISSLQPEDFATYYC
AQAGTHPTTFGQG
TKVEIKR (SEC ID
N°: 406)
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCGCAGGCTG
GGACGCATCCTAC
GACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGG
(SEC ID N°: 403)
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
DMS7327
(IFNa2b-DOM7h-11-
15)
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASRPIGT
MLSWYQQKPGKAP
KLLILAFSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTL
TISSLQPEDFATYYC
AQAGTHPTTFGQG
TKVEIKR
AAAEQKLISEEDLN*
(SEC ID N°: 408)
AAGTCGTCCGATT
GGGACGATGTTAA
GTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCTTGTTTGGT
TCCCGGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCGCAGGCTG
GGACGCATCCTAC
GACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGGGC
GGCCGCAGAACAA
AAACTCATCTCAG
AAGAGGATCTGAA
TTAA (SEC ID N°:
405
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
CDLPQTHSLGSRRT
LMLLAQMRRISLFSC
LKDRHDFGFPQEEF
GNQFQKAETIPVLH
EMIQQIFNLFSTKDS
SAAWDETLLDKFYT
ELYQQLNDLEACVI
QGVGVTETPLMKED
SILAVRKYFQRITLYL
KEKKYSPCAWEVV
RAEIMRSFSLSTNLQ
ESLRSKETVAAPSDI
QMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASRPIGT
MLSWYQQKPGKAP
KLLILAFSRLQSGVP
SRFSGSGSGTDFTL
TISSLQPEDFATYYC
AQAGTHPTTFGQG
TKVEIKR (SEC ID
N°: 410)
AAGTCGTCCGATT
GGGACGATGTTAA
GTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCTTGTTTGGT
TCCCGGTTGCAAA
GTGGGGTCCCATC
ACGTTTCAGTGGC
AGTGGATCTGGGA
CAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGTGCGCAGGCTG
GGACGCATCCTAC
GACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGG
(SEC ID N°: 407)
TGCGACTTGCCAC
AGACACATAGTTTG
GGATCAAGAAGAA
CATTGATGTTATTA
GCACAAATGCGTA
GAATTTCTTTGTTC
TCTTGTCTAAAGGA
CCGTCACGACTTC
GGATTCCCTCAGG
AAGAGTTTGGAAA
CCAATTCCAAAAAG
CAGAAACTATTCCT
GTCTTGCACGAAAT
GATCCAGCAAATAT
TCAATTTGTTTTCTA
CAAAGGACTCATCA
GCCGCTTGGGATG
AAACTCTGTTAGAT
AAATTCTACACTGA
ACTATATCAACAAC
TGAACGATCTAGA
GGCTTGCGTTATTC
AGGGTGTAGGAGT
TACTGAAACTCCCC
TAATGAAAGAAGAT
TCAATTCTAGCCGT
TAGAAAATACTTTC
AGCGTATCACATTG
TATTTAAAGGAAAA
GAAATACTCCCCAT
GTGCATGGGAGGT
GGTTAGAGCAGAA
ATTATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACGA
aa + myc nt + myc Aminoácidos marcador
ATTTGCAAGAATCT TTGAGATCTAAGGA AACCGTCGCTGCT CCATCTGACATCCA GATGACCCAGTCT CCATCCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGA GACCGTGTCACCA TCACTTGCCGGGC AAGTCGTCCGATT GGGACGATGTTAA GTTGGTACCAGCA GAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCC TGATCCTTGCTTTT TCCCGTTTGCAAAG TGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCA GTGGATCTGGGAC AGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGTCT GCAACCTGAAGATT TTGCTACGTACTAC TGCGCGCAGGCTG GGACGCATCCTAC GACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGG AAATCAAACGGGC GGCCGCAGAACAA AAACTCATCTCAG AAGAGGATCTGAA TTAA (SEC ID N°: 409)
sin
Nucleótidos
marcador
sin
ATTTGCAAGAATCT
TTGAGATCTAAGGA
AACCGTCGCTGCT
CCATCTGACATCCA
GATGACCCAGTCT
CCATCCTCCCTGTC
TGCATCTGTAGGA
GACCGTGTCACCA
TCACTTGCCGGGC
AAGTCGTCCGATT
GGGACGATGTTAA
GTTGGTACCAGCA
GAAACCAGGGAAA
GCCCCTAAGCTCC
TGATCCTTGCTTTT
TCCCGTTTGCAAAG
TGGGGTCCCATCA
CGTTTCAGTGGCA
GTGGATCTGGGAC
AGATTTCACTCTCA
CCATCAGCAGTCT
GCAACCTGAAGATT
TTGCTACGTACTAC
TGCGCGCAGGCTG
GGACGCATCCTAC
GACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGG
AAATCAAACGG
(SEC ID N°: 411)
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos resaltadas en negrita representan el sitio de clonación y el marcador MYC. *
representa el codon de terminación en el extremo del gen.
Determinación de Afinidad y Caracterización Biofísica:
Para determinar la afinidad de unión (Kd) de las proteínas de fusión AlbudAb-IFNa2b a cada albúmina de suero; las 5 proteínas de fusión purificadas se analizaron por BIAcore sobre albúmina (inmovilizada mediante acoplamiento de amina primaria sobre matrices CM5; BIAcore) usando concentraciones de las proteínas de fusión de 5000 nM a 39 nM (5000 nM, 2500 nM, 1250 nM, 625 nM, 312 nM, 156 nM, 78 nM, 39 nM) en tampón HBS-EP BIAcore.
Tabla 12: Afinidad para SA
AlbudAb
Fusión Afinidad para SA (nM) Kd Ka
Rata
DOM7h-14
IFNa2b 350 4,500E-02 1,28E+05
DOM7h-14-10
IFNa2b 16 4,970E-03 5,90E+05
DOM 7h-14-18
IFNa2b 780 2,127E-01 5,80E+05
DOM 7h-14-19
IFNa2b 1900 1,206E-01 7,96E+04
S0+306'e
10-399'l oos q2»Ndi 2I.-U.-MZ i/\ioa
S0+300'Z
10-3Z0'Z 0Z9 q2»Ndi H.-MZ i/\ioa
S0+3SS‘U
20"36l-'fr ose q2»Ndi 6l.-frl.-MZ i/\ioa
S0+3SI/9
1.0-3SZ'2 ozfr q2»Ndi 8l.-frl.-MZ i/\ioa
S0+38fr'£
eo-38s'9 2£ q2»Ndi 0l.-frl.-MZ i/\ioa
frO+368'6
20-31.2'2 WZ q2»Ndi frHMZ lAlOa
ouBiunn
S0+308'2
eO-369'9 82 q2»Ndi si.-h.-mz woa
S0+30e'9
20-36fr'6 09U q2»Ndi 2I.-H.-MZ lAlOa
pu
U0-3SS‘U 0009 q2»Ndi H.-MZ lAlOa
90+36U‘U
20-380 > 06fr q2»Ndi 6l.-frl.-MZ lAlOa
S0+3fr8'6
U0-30S‘U 081. q2»Ndi 8l.-frl.-MZ lAlOa
SO+398'9
20-3St?'e 09 q2»Ndi 0l.-frl.-MZ lAlOa
90+30S‘U
20-3 U2‘e 0fr2 q2»Ndi frHMZ lAlOa
upjey
S0+309'e
80-398 > SI- q2»Ndi Sl.-H.-MZ woa
S0+300'Z
U0-3St7‘C 0£9 q2»Ndi 2I.-H.-MZ lAlOa
S0+302‘U
U0-36S‘e ooee q2»Ndi H.-MZ lAlOa
S0+3£Z'2
20-3Zt?'8 02S q2»Ndi 6l.-frl.-MZ lAlOa
uo|un u|s
uo|un u|s
uo|un u|s
q2»Ndi 8l.-frl.-MZ lAlOa
S0+30S'fr
eo-3so'z 61- q2»Ndi 0l.-frl.-MZ lAlOa
S0+30'S
20-328''l 09 q2»Ndi frHMZ lAlOa
OUÁQ
S0+30S‘U
20-3099'!- 002 q2»Ndi SI.-H.-MZ lAlOa
so+3oe‘u
1.0-3001.'8 oozu q2»Ndi 2I.-H.-MZ lAlOa
pu
l.0-300S'Z 0009 q2»Ndi H.-MZ lAlOa
P>l (lAlu) VS Bjed pepmjjv upisnj qvpnqiv
5
10
15
20
25
AlbudAb
Fusión Afinidad para SA (nM) Kd Ka
DOM 7h-11-15
IFNa2b 10 1,87E-03 3,50E+05
Cuando IFNa2b está unido a las variantes AlbudAb, en todos los casos la afinidad de unión de AlbudAb para la albúmina de suero se reduce. DOM7h-14-10 y DOM7-11-15 conservan afinidad de unión mejorada para la albúmina de suero en todas las especies en comparación con el parental. DOM7h-11-12 también muestra afinidad de unión mejorada para la albúmina de suero en todas las especies en comparación con el parental.
Tabla 13: Caracterización Biofísica
La Caracterización Biofísica se realizó por SEC MALLS y DSC como se ha descrito anteriormente para los AlbudAbs sencillos.
AlbudAb
Fusión Número DMS Parámetros biofísicos
SEC MALLS DSC Tm (°C)
DOM 7h-14
IFNa2b DMS7321 M/D 58-65
DOM 7h-14-10
IFNa2b DMS7322 M/D 55-65
DOM 7h-14-18
IFNa2b DMS7323 M/D 55-65
DOM 7h-14-19
IFNa2b DMS7324 M/D 59-66
DOM 7h-11
IFNa2b DMS7325 M/D 65,8-66,2
DOM 7h-11-12
IFNa2b DMS7326 M/D 67-67,3
DOM 7h-11-15
IFNa2b DMS7327 M/D 56,3-66,2
M/D indica un equilibrio de monómero/dímero según se detecta por SEC MALLS
En la Tabla 13 se observa la expresión para todos los clones en el intervalo de 17,5 a 54 mg/l en HEK293.
Para las variantes IFNa2b-DOM7h-14 e IFNa2b-DOM7h-11, durante la maduración de afinidad se mantuvieron parámetros biofísicos y niveles de expresión favorables.
Determinación del PK para fusiones AlbudAb-IFNa2b
Las fusiones AlbudAbs IFNa2b DMS7321 (IFNa2b-DOM7h-14) DMS7322 (IFNa2b-DOM7h-14-10) DMS7323 (IFNa2b- DOM7h-14-18), DMS7324 (IFNa2b-DOM7h-14-19), DMS7325 (IFNa2b-DOM7h-11), DMS7326 (IFNa2b-DOM7h-11-12), DMS7327 (IFNa2b-DOM7h-11-15) se expresaron con el marcador myc en cantidades de 20-50 mg en células HEK293 y se purificaron del sobrenadante de cultivo usando resina de afinidad a proteína L y se eluyó con glicina 100 mM pH2. Las proteínas se llevaron a una concentración superior a 1 mg/ml, se intercambio de tampón en PBS de Dulbecco y la endotoxina se agotó usando columnas de giro Q (Vivascience).
Para el PK de rata, se dosificó IFN-AlbudAb como inyecciones i.v. únicas de 2,0 mg/kg usando 3 ratas por compuesto. Se tomaron muestras de suero a 0,16, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168 h. El análisis de los niveles en suero se realizó por EASY ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, número de catálogo RPN5960).
Para el PK de ratón, se dosificó DMS7322 (IFN2b-DOM7h-14-10) DMS7325 (IFN2b-DOM7h-11), DMS7326 (IFN2b- DOM7h-11-12), DMS7327 (IFN2b-DOM7h-11-15) todos marcados con myc como inyecciones i.v. únicas de 2,0 mg/kg por grupos de dosis de 3 sujetos y las muestras de suero se tomaron a 10 min; 1 h, 8 h; 24 h; 48 h; 72 h; 96 h. El análisis de los niveles en suero se realizó por EASY ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, número de catálogo RPN5960).
Especie
AlbudAb Fusión Albúmina Kd (nM) Parámetros PK
AUC h x |ig/ml CL ml/h/kg t1/2 h Vz ml/kg
Rata
7h-14 IFNa2b 350 832,1 2,4 27 94,5
7h-14-10 IFNa2b 16 1380,7 1,5 35,8 75,2
7h-14-18 IFNa2b 780 691,2 2,9 22,4 93,7
7h-14-19 IFNa2b 1900 969,4 2,2 25 78,7
7h-11 IFNa2b 6000 327,9 6,5 11 101,9
7h-11-12 IFNa2b 1700 747,1 2,8 25,8 104,7
7h-11-15 IFNa2b 200 1118,7 1,8 39,5 103,6
Ratón
7h-14 IFNa2b 240 761,2 2,6 30,4 115,3
7h-14-10 IFNa2b 60 750,5 2,7 30,9 118,6
7h-11 IFNa2b 6000 493,9 4,0 8,8 51,2
7h-11-12 IFNa2b 150 439,6 4,5 21,5 140,9
7h-11-15 IFNa2b 28 971,8 2,1 33,6 99,6
Los parámetros farmacocinéticos obtenidos de estudios de rata y ratón se ajustaron usando un modelo no- compartimental. Clave: AUC: Área bajo la curva del tiempo de dosificación extrapolado al infinito; CL: eliminación; t1/2: es 5 el tiempo durante el cual la concentración en sangre se divide en dos; Vz: volumen de distribución en base a la fase terminal.
Se ensayaron IFNa2b-AlbudAbs en rata y ratón. Para todas las proteínas de fusión de la variante IFNa2b-DOM7h-11 tanto en rata como en ratón, el valor t1/2 mejoró en comparación con el parental. La mejora del t1/2 equivale a una KD mejorada in vitro para la albúmina de suero.Para las variantes IFNa2b-DOM7h-14-10 la mejora de Kd in vitro para la 10 albúmina de suero también equivale a una mejora del t1/2 en rata.
Todas las proteínas de fusión IFNa2b-AlbudAbs mostraron una disminución en la unión a RSA de 5 a 10 veces en comparación con AlbudAb sencillo. Este efecto es más pronunciado (es decir, 10 veces) en la serie DOM7h-14 que en la serie DOM7h-11 (únicamente una disminución de 5 veces).
Ejemplo 8: Fusiones AlbudAb adicionales con proteínas, péptidos y NCE.
15 Se ensayaron diversas AlbudAbs fusionadas a otras entidades químicas concretamente anticuerpos de dominio (dAbs), péptidos y compuestos NCE. Los resultados se muestran en la tabla 15.
Especie
AlbudAb Fusión Albúmina Kd (nM) Parámetros PK
AUC h x |ig/ml CL ml/h/kg t1/2 h Vz ml/kg
Rata
DOM7h-14 Exendina-4 2400 18 57,1 11 901,9
DOM7h-14-10 Exendina-4 19 43,6 23,1 22,1 740,3
DOM7h-14-18 Exendina-4 16000 16,9 75,7 9,4 1002,5
DOM7h-14-19 Exendina-4 17000 31,4 32,5 11,9 556,7
DOM7h-11 Exendina-4 24000 6,1 168 7,1 1684,1
DOM7h-11-12 Exendina-4 1400 24,2 59,9 13 1068,7
DOM7h-11-15 Exendina-4 130 36,3 27,6 19,3 765,7
DOM7h14-10 NCE- GGGGSC 62
DOM7h14-10 NCE- TVAAPSC 35
Huma-no
DOM7h-14 NCE 204
Ratón
DOM7h-11 DOM1m-21-23 234 10,7 4,7 72,5
DOM7h-11-12 DOM1m-21-23 755 3,3 18 86,2
DOM7h-11-15 DOM1m-21-23 1008 2,5 17,4 62,4
Clave: DOM1m-21-23 es un dAb anti-TNFRI, Exendina-4 es un péptido (un agonista de GLP-1) de 39 aminoácidos de longitud. NCE, NCE-GGGGSC y NCE-TVAAPSC se describen a continuación.
5 Anteriormente se ha descrito el uso de fusiones genéticas con un dAb de unión a albúmina (AlbudAb) para ampliar la semivida PK del dAbs anti-TNFR1 in vivo (véase, por ejemplo los documentos WO04003019, WO2006038027, WO2008149148). En estas solicitudes PCT se hace referencia a los protocolos. En la tabla anterior, DOM1m-21-23 es un dAb anti-TNFR1 de ratón.
Para producir las fusiones genéticas de exendina-4 o con DOM7h-14 (u otro AlbudAb) que se unen a la albúmina de 10 suero, la secuencia exendina-4-enlazante-AlbudAb se clonó en el vector pTT-5 (obtenible de CNRC, Canadá). En cada caso la exendina-4 estaba en el extremo 5' de la construcción y el dAb en el extremo 3'. El enlazante era un enlazante (G4S)3. Se preparó ADN sin endotoxina en E. coli usando lisis alcalina (usando el kit Giga para plásmido sin endotoxina, obtenible de Qiagen CA) y se usó para transfectar células HEK293E (obtenibles de CNRC, Canadá). La transfección se realizó en matraces de células HEK293E / 250 ml a 1,75x106 células/ml usando 333 |il de fectin 293 (Invitrogen) y 250 |ig 15 de ADN por matraz y la expresión se realizó a 30°C durante 5 días. El sobrenadante se recogió por centrifugación y la purificación se realizó por purificación de afinidad en proteína L. La proteína se unió en lotes a la resina, se rellenó en una columna y se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS. La proteína se eluyó con 50 ml de glicina 0,1 M pH 2 y se neutralizó con Tris pH 8. La proteína del tamaño esperado se identificó sobre un gel SDS-PAGE.
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Fusiones NCE Albudab:
Se ensayó una fusión de AlbudAb con una nueva entidad química (NEC). La NCE, un inhibidor de ADAMTS-4 de molécula pequeña se sintetizó con un enlazante de PEG (enlazante de PEG 4 (es decir, 4 moléculas de PEG antes de la maleimida) y un grupo maleimida para la conjugación al AlbudAb. La conjugación del NCE al AlbudAb se realiza mediante un resto de cistina modificado por ingeniería genética en la posición de aminoácido R108C o después de un espaciador de 5 aminoácidos (GGGGSC) o 6 aminoácidos (TVAAPSC) en el extremo del AlbudAb. En resumen, el AlbudAb se redujo con TCEP (Pierce, Catálogo Número 77720), se desalinizó usando una columna PD10 (GE healthcare) en Bis-Tris 25 mM, EDTA 5 mM, glicerol al 10% (v/v) pH 6,5. Se añadió un exceso molar de 5 veces del NCE activado con maleimida en DMSO no sobrepasando el 10% de la concentración final (V/V). La reacción se incubó durante una noche a temperatura ambiente y se dializó exhaustivamente en Tris 20 mM pH 7,4.
Enlazante PEG:
imagen1
DOM7h-14 R108C:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKC (SEC ID N°: 412)
Nucleótidos:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAA GTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCG TTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAATGC (SEC ID N°: 413)
Véase la Tabla 5 para las secuencias de DOM7h-14-10/TVAAPSC y DOM7h-14-10/GGGGSC (es decir, DOM7h-14- 10/G4SC).
NCE-AlbudAbs DOM7h-14-10 GGGGSC y DOM7h14-10 TVAAPSC muestran una disminución de afinidad in vitro de 5 a 10 veces (Kd) para RSA según se determina por BIAcore cuando se fusionan a la entidad química. Aún no se dispone de los datos PK para estas moléculas.
Fusión dAb-Albudab: los 2 AlbudAbs DOM7h-11 con la mayor afinidad para RSA experimentaron una disminución de afinidad para RSA de 2 veces en un BIAcore cuando se fusionaron a un anticuerpo de dominio terapéutico (DOM1m-21- 23) en comparación con AlbudAb no fusionado. El clon DOM7h-11 muestra una Kd micromolar cuando se fusiona (2,8 |iM) así como cuando no se fusiona (~5 |iM).
Fusión Exendina-4 AlbudAb: el efecto de la fusión de AlbudAbs a un péptido en la capacidad de unión a RSA es aproximadamente de 10 veces, excepto DOM7h-14-10, que únicamente muestra una disminución de unión de 4 veces. El
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Para todos los datos anteriores, el T1/2 de la fusión aumentó con afinidad mejorada para las SA de las especies.
Generalmente se clasifican los efectos terapéuticos de Albudab como que son terapéuticamente susceptibles (para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades, afecciones o indicaciones) cuando las fusiones AlbudAb-fármaco muestran un intervalo de afinidad (Kd) de 0,1 nM a 10 nM para la unión a la albúmina de suero.
Los intervalos terapéuticos de las fusiones AlbudAbs y AlbudAb (Proteína-AlbudAb por ejemplo IFNa2b-DOM7h-14-10; Péptido-AlbudAbs por ejemplo Exendina-4-DOM7h-14-10; dAb-AlbudAbs por ejemplo DOM1m21-23-DOM7h11-15; NCE- AlbudAb por ejemplo ADAMTS-4-DOM7h-14-10) se definen a continuación: se muestran intervalos de afinidad (Kd) que son útiles para la terapia de afecciones, enfermedades o indicaciones crónicas o agudas que se muestran. También se muestran intervalos de afinidad marcados como “intermedios”. AlbudAb y las fusiones en este intervalo son útiles en enfermedades, afecciones o indicaciones agudas o crónicas. De este modo, la afinidad de la AlbudAb o fusión para la albúmina de suero puede adaptarse o seleccionarse de acuerdo con la enfermedad, afección o indicación a tratar. Como se describe anteriormente, la descripción proporciona AlbudAbs con afinidades que permiten que cada AlbudAb se clasifique como “afinidad elevada”, “afinidad media” o “afinidad baja”, permitiendo de esta manera al experto en la materia seleccionar la AlbudAb apropiada de la descripción de acuerdo con la terapia en cuestión. Véase la Figura 2.
Ejemplo 9: Secuencias DOM7h-11-15S12P
Secuencia de Aminoácidos de DOM7h-11 -15S12P
diqmtqspsslpasvgdrvtitcrasrpigtmlswyqqkpgkapkllilafsrlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpe
DFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR (SEC ID N°: 414)
Un aspecto de la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de DOM7h-11- 15S12P o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a dicha secuencia seleccionada. DOM7h-11-15S12P se produjo usando la siguiente secuencia de ácidos nucleicos (la C subrayada indica el cambio (frente a los ácidos nucleicos que codifican DOM7h-11-15) que conduce a una prolina en la posición 12):
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAA GTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTT TCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAACGG (SEC ID N°: 415)
DOM7h-11-15S12P se construyó usando DOM7h-11-15 como un molde en una PCR en la que se usó un cebador para introducir la mutación S12P. La secuencia del cebador es:
GCAACAGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGG (SEC ID N°: 416).
Un aspecto alternativo de la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°: 415 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a dicha secuencia seleccionada. En una realización, DOM7h-11-15S12P se codifica por, y se expresa a partir de, un vector que contiene una región enlazante y una secuencia C-terminal que codifica una proteína o un fármaco peptídico de un dominio variable simple u otro fragmento de anticuerpo para preparar el producto de fusión de proteína en-línea. El enlazante, en una realización, comprende la secuencia de aminoácidos TVA, por ejemplo, TVAAPS. Otros aspectos de la descripción son un vector que comprende el ácido nucleico; y una célula huésped aislada que comprende el vector. La descripción también proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un paciente, que comprende administrar al menos una dosis de DOM7h-11-15S12P a dicho paciente.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un dominio variable único de inmunoglobulina de anti-albúmina sérica (SA) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 412.
  2. 2. Un ligando multiespecífico que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina anti-SA según la reivindicación 1 y un resto de unión que se une específicamente al antígeno diana distinto de SA.
  3. 3. Un ligando multiespecífico según la reivindicación 2, que comprende además un enlazante entre el dominio variable único de inmunoglobulina anti-SA y el resto de unión que se une específicamente al antígeno diana distinto de SA.
  4. 4. Un ligando multiespecífico según la reivindicación 3, en el que el enlazante es AST o ASTSGPS.
  5. 5. Un dominio variable único de inmunoglobulina anti-SA según la reivindicación 1, en el que el dominio variable está conjugado con un fármaco.
  6. 6. Un producto de fusión que comprende un polipéptido, proteína, péptido o fármaco NCE fusionado o conjugado a un dominio variable único de inmunoglobulina según la reivindicación 1.
  7. 7. Un producto de fusión según la reivindicación 6 que comprende además el enlazante TVAAPSC.
  8. 8. Un conjugado que comprende un fármaco NCE conjugado con un dominio variable único de inmunoglobulina según la reivindicación 1.
  9. 9. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido o fármaco peptídico fusionado a un dominio variable único de inmunoglobulina según la reivindicación 1.
  10. 10. Una composición que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina, un ligando multiespecífico, un producto de fusión, un conjugado o una proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente y un diluyente, portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
  11. 11. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable único de inmunoglobulina según la reivindicación 1.
  12. 12. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ligando multiespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o la proteína de fusión de la reivindicación 9.
  13. 13. Un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 413.
  14. 14. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 11, 12 ó 13.
  15. 15. Una célula huésped aislada que comprende el vector de la reivindicación 14.
  16. 16. Una composición que comprende un dominio variable único de inmunoglobulina, ligando multiespecífico, producto de fusión, conjugado o proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente para su uso como un fármaco.
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