ES2653523T3

ES2653523T3 - Compuesto peptídico de tipo motilina que tiene una susceptibilidad de absorción transmucosa impartida al mismo

Info

Publication number: ES2653523T3
Application number: ES10804474.4T
Authority: ES
Inventors: Seiji Sato; Takeshi Hanada; Naomi Wakabayashi; Yutaka Masuda; Yuriko Harada
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2018-02-07
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: RU2540012C2; CA2769013C; MX2012001193A; TW201106964A; IL217781A; BR112012000719A2; CN102574904B; AU2010279076B2; CO6430471A2; IL217781A0; EP2460826B1; WO2011013728A1; IN2012DN00569A; CA2769013A1; US8710184B2; SG177592A1; JPWO2011013728A1; KR101789605B1; AU2010279076A1; JP5647609B2

Abstract

Un compuesto que comprende la secuencia representada por la siguiente fórmula general 1: X1 Val X2 Ile Phe Thr Tyr Gly X3 Leu Gln Arg X4 Gln Glu Lys Glu Arg X5 Lys Pro Gln (fórmula 1) [en la que todos los enlaces entre aminoácidos, excepto el enlace X1-Val, son enlaces amida; el enlace X1-Val es un enlace amida o un enlace representado por la siguiente fórmula 2**Fórmula** X1 es fenilalanina, ß-homofenilglicina o acetilnaftilalanina; X2 es prolina o sarcosina; X3 es ácido glutámico o ácido aspártico; X4 es metionina o leucina; X5 es asparragina o prolina] o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en el que el compuesto tiene una actividad estimulante de tipo motilina de la motilidad gastrointestinal y muestra una mayor eficacia de absorción tras una administración transmucosa en comparación con la motilina nativa

Description

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X1 es un aminoácido aromático o un aminoácido heteroaromático; X2 es prolina o sarcosina; X3 es ácido glutámico o ácido aspártico; X4 es metionina o leucina;

5 X5 es asparragina o prolina]

: o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y están caracterizadas por mantener una actividad estimulante de la motilidad gastrointestinal comparable a la de la motilina nativa y todavía tienen una mayor susceptibilidad de absorción tras una administración transmucosa.

En la anterior fórmula 1, X1 es un aminoácido aromático o un aminoácido heteroaromático. El aminoácido aromático

: o el aminoácido heteroaromático se refiere a cualquier aminoácido que contenga un anillo aromático en el mismo, y algunos ejemplos incluyen, por ejemplo, α-aminoácidos tales como fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptófano (Trp), así como β-homofenilglicina (Phg(C#CH2)), acetilnaftilalanina (Ac-Nal), y similares. En la presente divulgación

15 pueden mencionarse fenilalanina (Phe), β-homofenilglicina (Phg(C#CH2)) y acetilnaftilalanina (Ac-Nal) como los ejemplos más preferidos del aminoácido X1.

En la anterior fórmula 1, X1 puede ser un L-aminoácido o un D-aminoácido. En la técnica anterior, hasta ahora se han preparado variantes mediante la sustitución de los L-aminoácidos por D-aminoácidos como el aminoácido en la posición 1 de la motilina (Miller P. et al., Peptides, 16, 11-18 (1995)), y se ha demostrado que esas variantes mantienen la actividad de la motilina.

En la anterior fórmula 1, X2 es prolina (Pro) o sarcosina (Sar, denominada también N-metilglicina o MeGly); X3 es ácido glutámico (Glu) o ácido aspártico (Asp); X4 es metionina (Met) o leucina (Leu); y X5 es asparragina (Asn) o 25 prolina (Pro). Los aminoácidos marcados como X1 hasta X5 pueden usarse en cualquier combinación.

En los compuestos peptídicos de la anterior fórmula 1, el enlace entre el primer aminoácido (X1) y el segundo aminoácido (Val) es un enlace amida o un enlace representado por la siguiente fórmula 2

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(fórmula 2) El enlace de la fórmula 2 también se denomina un enlace -psi[CH2NH]-. El enlace X1-Val puede ser tanto un enlace amida como un enlace -psi[CH2NH]-, independientemente del tipo de aminoácido que constituya X1. 35 Los compuestos de la anterior fórmula 1 de la presente invención incluyen, por ejemplo, los compuestos

representados por las siguientes secuencias o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 3); Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 4); Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Asp Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 5);

45 Phg(C#CH2) Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO:

6); Phg(C#CH2) Val Sar Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 7);

Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 8); Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 9);

55 Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 10); Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Leu Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO: 11); Phg(C#CH2) Val Sar Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Pro Lys Pro Gln (SEQ ID NO:

12);

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invención a partir del medio de cultivo que contiene el derivado peptídico de la presente invención, pueden emplearse los mismos procedimientos de separación/purificación que los usados para obtener los compuestos peptídicos mediante una síntesis química.

5 Los compuestos de la presente divulgación pueden usarse en el tratamiento de enfermedades que implican anomalías funcionales en el tracto gastrointestinal (por ejemplo, afecciones que están caracterizadas por una caída en el valor basal de la actividad de la motilidad gastrointestinal). Las anomalías funcionales en el tracto gastrointestinal son afecciones que presentan unos síntomas desagradables en el tracto gastrointestinal, aunque no se detectan unas anomalías orgánicas apreciables, tales como inflamaciones y úlceras, mediante una endoscopia, un análisis de sangre, etc. y un grupo de enfermedades que se denominan en conjunto "trastornos gastrointestinales funcionales" se clasifican y se definen finalmente por sus síntomas según los criterios de ROME III (Gastroenterology 130: 1377-1556, 2006). Las enfermedades que implican anomalías funcionales en el tracto gastrointestinal incluyen afecciones tales como dispepsia funcional, gastroparesia diabética, enfermedad por reflujo gastroesofágico, síndrome de intestino irritable, proliferación de pequeñas bacterias intestinales, pseudo-obstrucción

15 del colon, íleo paralítico, pseudo-obstrucción intestinal idiopática crónica e íleo postoperatorio.

Debería mencionarse que las anomalías funcionales en el tracto gastrointestinal son diagnosticadas no solo mediante los síntomas subjetivos, tales como dolor abdominal, náuseas, vómitos, diarrea, estreñimiento, náuseas, pirosis, meteorismo abdominal y pérdida de apetito, sino también por ensayos objetivos tales como la medición de la presión en el tracto gastrointestinal, un análisis de los jugos gástricos, una monitorización del pH gástrico, una prueba de vaciado gástrico, un análisis por rayos X gastrointestinal y una endoscopia.

Los compuestos de la presente divulgación o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden usarse en animales, incluyendo el hombre, en unas cantidades suficientes para conferir la actividad estimulante de la

25 motilidad gastrointestinal deseada, tanto solos como en una mezcla con excipientes, agentes de relleno, portadores farmacéuticamente aceptables conocidos etc.

Para los propósitos de la presente invención, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales con bases inorgánicas, sales con bases orgánicas, sales con ácidos inorgánicos, sales con ácidos orgánicos, y sales con aminoácidos básicos o ácidos, pero estos no son los únicos ejemplos, y puede usarse cualquier sal común.

Los compuestos peptídicos según la presente divulgación también pueden ser administrados a través de varias vías de inyección, tales como una inyección subcutánea, una inyección intramuscular y una inyección intravenosa. Además, dado que los compuestos peptídicos según la presente divulgación proporcionan una elevada absorción

35 tras una administración transmucosa, pueden ser administrados a través de las vías transmucosas, a saber, vías sin inyección tales como la vía oral, intranasal, pulmonar, transoromucosa y transvaginal, así como una instilación ocular. Deseablemente, los compuestos son administrados por vía oral, intranasal o pulmonar, y lo más deseablemente, son administrados por vía pulmonar o intranasal.

Cuando los presentes compuestos se usan para el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente, su dosis depende del estado del paciente, del grado del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración, de la frecuencia de administración, etc. y, en el caso de una administración en el hombre, la dosis puede variar desde un nivel bajo de 0,01 μg/kg. Una dosis preferida puede ser de 0,01-500 μg/kg, más preferentemente de 0,05-100 μg/kg. Las cantidades de estos intervalos pueden ser administradas deseablemente 1-3 veces al día.

45 Los compuestos peptídicos de la presente invención o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden usarse junto con portadores farmacéuticamente aceptables. Algunos portadores farmacéuticamente aceptables que pueden usarse incluyen diversas sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas que son convencionales como artículos farmacéuticos, y se combinan en forma de excipientes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes o similares en preparaciones sólidas, y como disolventes, solubilizantes, agentes suspensores, agentes de tonicidad, tampones, antisépticos, antioxidantes o similares en preparaciones líquidas. Un ejemplo típico de excipiente es la lactosa; algunos ejemplos típicos de lubricantes son el talco y la sílice coloidal. Algunos ejemplos típicos de disolventes son agua para inyección, prolina glicol, aceite de sésamo y aceite de maíz; algunos agentes suspensores incluyen tensioactivos tales como estearil trietanolamina, lauril sulfato de sodio, ácido

55 laurilaminopropiónico, lecitina y monoestearato de glicerilo, pero por supuesto pueden usarse otros artículos farmacéuticos habituales.

Ejemplos

En las siguientes páginas se describe la presente invención más específicamente mediante referencia a los ejemplos de trabajo, a los ejemplos comparativos y similares, pero debería entenderse que la presente invención no está limitada en modo alguno a los ejemplos de trabajo.

Los significados de las principales abreviaturas usadas en los ejemplos de trabajo se muestran a continuación. 65 Phg(C#CH2): L-β-homofenilglicina

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compuesto 6 (MT140).

Ejemplo 1: síntesis del Compuesto 1 (MT095)

5 Este ejemplo se llevó a cabo con el fin de sintetizar químicamente el compuesto 1 (MT095, SEQ ID NO: 3).

Se trató una resina Fmoc-Gln(Trt)-Alko (producto de WATANABE CHEMICAL; 47,6 mg, 0,03 mmol) con piperazina al 20 % durante 20 minutos, y después se repitieron la introducción de los aminoácidos Fmoc mediante HBTU/HOBt y la eliminación de Fmoc mediante piperazina, partiendo del extremo C terminal de la SEQ ID NO: 3 de forma secuencial, para construir así un Fmoc-péptido-resina. Finalmente se introdujo el Boc-Phe-OH por medio de DCC/HOBt y a la resina peptídica protegida resultante se le añadió un reactivo desprotector (5,0 ml) que contiene no solo un 90 % de ácido trifluoroacético, sino también fenol, agua y TIPS, y la mezcla se agitó durante 2 horas a la temperatura ambiente. La resina se eliminó mediante una filtración y el filtrado se concentró; a continuación se añadió éter al residuo para formar un precipitado. El precipitado se recuperó mediante una filtración y se secó para

15 dar aproximadamente 30 mg de un producto peptídico en bruto.

El producto peptídico en bruto se disolvió en 1,0 ml de ácido acético 1 N y después de cargar la solución en una columna Inertsil PREP ODS ( 20 mm x 250 mm; producto de GL Sciences, Inc.), se llevó a cabo la elución a un gradiente lineal del 0 % al 50 % de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1 % durante 50 minutos (caudal: 10 ml/min). Con una monitorización UV (a 220 nm), las fracciones deseadas se clasificaron para recuperarlas y se liofilizaron, para dar aproximadamente 5,0 mg del producto final.

El producto final obtenido se cargó en una columna Inertsil PREP ODS ( 4,6 mm x 250 mm; producto de GL Sciences, Inc.), se llevó a cabo la elución a un gradiente lineal del 5 % al 65 % de acetonitrilo en ácido

25 trifluoroacético al 0,1 % durante 30 minutos (caudal: 1,5 ml/min). Con una monitorización UV (a 220 nm), se midió la pureza del producto final.

El producto final obtenido se sometió a una MALDI TOF-EM (Daltonics BIFLEX III, producto de Bruker) para la verificación de su peso molecular y un análisis de los aminoácidos (que consiste en un tratamiento con HCl 6 N a 110 ºC durante 24 horas hasta que el producto se hidroliza en sus aminoácidos, que fueron cuantificados respectivamente mediante una HPLC) para verificar el contenido en péptidos. Valor medido con la MALDI-TOF EM: 2738,718 (teórico, 2739,2); pureza con una HPLC analítica: 96,0 %; contenido en péptidos mediante un análisis de los aminoácidos: 643 μg/mg.

35 Ejemplo 2: síntesis del Compuesto 6 (MT140)

Este ejemplo se llevó a cabo con el fin de sintetizar químicamente el compuesto 6 (MT140, SEQ ID NO: 8).

Se trató una resina Fmoc-Gln(Trt)-Alko (producto de WATANABE CHEMICAL; 47,6 mg, 0,03 mmol) con piperazina al 20 % durante 20 minutos y después se repitieron la introducción de los aminoácidos Fmoc mediante HBTU/HOBt y la eliminación de Fmoc mediante piperazina, partiendo del extremo C terminal de la SEQ ID NO: 8 de forma secuencial, para construir así un Fmoc-péptido-resina. Finalmente se introdujo el aldehído Boc-Phe por medio de cianotrihidroborato de sodio/ácido acético al 1 % y a la resina peptídica protegida resultante se le añadió un reactivo desprotector (5,0 ml) que contiene no solo un 90 % de ácido trifluoroacético, sino también fenol, agua y TIPS, y la

45 mezcla se agitó durante 2 horas a la temperatura ambiente. La resina se eliminó mediante una filtración y el filtrado se concentró; a continuación se añadió éter al residuo para formar un precipitado. El precipitado se recuperó mediante una filtración y se secó para dar aproximadamente 30 mg de un producto peptídico en bruto.

El producto en bruto se disolvió en 1,0 ml de ácido acético 1 N y después de cargar la solución en una columna Inertsil PREP ODS ( 20 mm x 250 mm; producto de GL Sciences Inc.), se llevó a cabo la elución a un gradiente lineal del 0 % al 50 % de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1 % durante 50 minutos (caudal: 10 ml/min). Con una monitorización UV (a 220 nm), las fracciones deseadas se recuperaron y se liofilizaron para dar aproximadamente 5,0 mg del producto final.

55 El producto final obtenido se cargó en una columna Inertsil PREP ODS ( 4,6 mm x 250 mm; producto de GL Sciences Inc.), se llevó a cabo la elución a un gradiente lineal del 5 % al 65 % de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1 % durante 30 minutos (caudal: 1,5 ml/min). Con una monitorización UV (a 220 nm), se midió la pureza del producto final.

El producto final obtenido se sometió a una MALDI TOF-EM (Daltonics BIFLEX III, producto de Bruker) para la verificación de su peso molecular. Valor medido con la MALDI-TOF EM: 2725,040 (teórico, 2725,2); pureza con una HPLC analítica: 98,7 %; contenido en péptidos mediante un análisis de los aminoácidos: 707 μg/mg.

Mediante técnicas similares se produjeron la motilina nativa así como los compuestos 1-13 (de las SEQ ID NOS: 3

65 15, respectivamente) y los compuestos comparativos 1 y 2 (de las SEQ ID NOS: 16 y 17, respectivamente). Sus valores de EM están recogidos en la Tabla 1 junto con los valores peptídicos determinados mediante un análisis de

los aminoácidos. [Tabla 1] Tabla 1: valores de la EM y contenido en péptidos de los compuestos

Nombre del compuesto: Estructura Contenido en péptidos (%) (análisis de los aminoácidos) Valores medidos de la EM (teóricos)

Motilina nativa: FVPIFTYGELQRMQEKERNKGQ (SEQ ID NO: 1) 88,6 2698,382 (2699,1)

Compuesto comparativo 1 (13Leu-motilina): FVPIFTYGELQRLQEKERNKGQ (SEQ ID NO: 16) 73,1 2680,432 (2681,0)

Compuesto comparativo 2 (MT139): F*VPIFTYGELQRMQEKERNKGQ (SEQ ID NO: 17) 71,8 2683,998 (2685,1)

Compuesto 1 (MT095): FVPIFTYGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 3) 64,3 2738,718 (2739,2)

Compuesto 2 (MT114): FVPIFTYGELQRLQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 4) 75,8 2720,544 (2721,1)

Compuesto 3 (MT116): FVPIFTYGDLQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 5) 76,8 2689,574 (2690,1)

Compuesto 4 (MT124): Phg(C#CH2)-VPIFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 6) 75,7 2703,920 (2704,1)

Compuesto 5 (MT126): Phg(C#CH2)-V-Sar-IFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 7) 58,3 2677,60 (2677,0)

Compuesto 6 (MT140): F*VPIFTYGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 8) 70,7 2725,040 (2725,2)

Compuesto 7 (MT141): F*VPIFTYGELQRLQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 9) 70,3 2706,980 (2707,1)

Compuesto 8 (MT107): FVPIFTYGELQRMQEICERPKPQ (SEQ ID NO: 10) - 2721,272 (2722,2)

Compuesto 9 (MT115): FVPIFTYGELQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 11) - 2703,463 (2704,1)

Compuesto 10 (MT125): Phg(C#CH2)-V-Sar-IFTYGELQRMQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 12) - 2695,845 (2695,1)

Compuesto 11 (MT128): Ac-Nal-VPIFTYGELQRMQEKERNKPQ (SEQ ID NO: 13) - 2830,62 (2831,2)

Compuesto 12 (MT154): F*VPIFTYGDLQRLQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 14) - 2676,598 (2676,1)

Compuesto 13 (MT155): F*VPCFTYGDLQRMQEKERPKPQ (SEQ ID NO: 15) - 2693,923 (2694,2)

Notas: el contenido en aminoácidos no se midió para los compuestos 8-13. El asterisco (*) en las estructuras del compuesto comparativo 2, así como en los compuestos 6, 7, 12 y 13, indica que el enlace entre los aminoácidos adyacentes es un enlace -psi[CH2NH]-.

Ejemplo 3: medición de la actividad inductora del CMI en ayunas

Este ejemplo se llevó a cabo con el fin de medir la actividad inductora del CMI en ayunas en el cuerpo del perro por 10 parte de los compuestos preparados mediante los métodos descritos en Ejemplos 1 y 2.

Según el método de ITOH et al. (Zen Itoh et al, Gastroenterologia Japonica 12; 275-283, 1977), la actividad inductora del CMI en ayunas de los compuestos fue evaluada mediante la medición del movimiento contráctil del tracto gastrointestinal de un perro consciente en el que se habían suturado transductores de fuerza. Más

15 específicamente, se sometieron a los perros bajo anestesia a una operación quirúrgica en la que se suturaron transductores de fuerza a las membranas serosas del antro gástrico, el duodeno, el yeyuno y el íleo a lo largo del músculo circular, y a continuación, se envió la tensión de cada transductor a un registrador a través de un amplificador.

20 Aproximadamente 10 minutos después de la finalización del CMI espontáneo en el periodo de ayuno (10 minutos después de fuertes contracciones del estómago), a los perros conscientes se les inyectaron rápidamente por vía intravenosa 0,1 μg/kg de motilina nativa o de compuestos derivados de la motilina seleccionados, y se observaron los movimientos contráctiles gastrointestinales resultantes. Los compuestos de prueba administrados indujeron unas fuertes contracciones del estómago, y su propagación hacía el duodeno se definió como un CMI; un compuesto fue

25 evaluado como una "actividad inductora positiva en el CMI" cuando indujo el CMI a una dosis de 0,1 μg/kg.

La FIG. 1 representa los patrones de la actividad inductora del CMI observados cuando se administraron por vía intravenosa tanto la motilina nativa como el compuesto 4 (MT124) y el compuesto 6 (MT140) a una dosis de 0, μg/kg, y la Tabla 2 muestra resultados de la comprobación de la motilina nativa y de los compuestos derivados de la motilina seleccionados para la actividad inductora del CMI en ayunas. En la FIG. 1, las flechas indican la cronología 5 de administración de la motilina nativa, así como la de los compuestos 4 y 6. Según se muestra en la FIG. 1, el antro gástrico comenzó a contraerse cuando se administró la motilina nativa (en el punto temporal indicado por la t) y la contracción continuó durante aproximadamente 10 minutos. Inmediatamente después de su comienzo en el antro gástrico, la contracción se propagó hasta el duodeno que, al igual que el antro gástrico, continuó con la contracción durante aproximadamente 10 minutos. Cuando se administraron el compuesto 4 (MT124) y el compuesto 6 (MT140)

10 por vía intravenosa, se produjeron contracciones con el mismo patrón al descrito anteriormente para la administración de la motilina nativa. También está claro, a partir de la FIG. 1 y de la Tabla 2, que no solo la motilina nativa y el compuesto 4 (MT124) y el compuesto 6 (MT140), sino también cualquier otro compuesto derivado de la motilina de la presente invención, indujeron un CMI en ayunas similar al CMI espontáneo, y su intensidad era casi comparable a la del CMI inducido por la motilina nativa.

15 [Tabla 2]

Tabla 2: actividad inductora del CMI en ayunas en perros a los que se les administró por vía intravenosa motilina nativa y derivados de la motilina

Nombre del compuesto: Dosis (μg/kg) Actividad inductora del CMI

Motilina nativa: 0,1 Positiva

Compuesto comparativo 1 (13Leu-motilina): 0,1 Positiva

Compuesto comparativo 2 (MT139): 0,1 Positiva

Compuesto 1 (MT095): 0,1 Positiva

Compuesto 2 (MT114): 0,1 Positiva

Compuesto 3 (MT116): 0,1 Positiva e

Compuesto 4 (MT124): 0,1 Positiva

Compuesto 5 (MT126): 0,1 Positiva

Compuesto 6 (MT140): 0,1 Positiva

Compuesto 7 (MT141): 0,1 Positiva

Compuesto 8 (MT107): 0,1 Positiva

Compuesto 9 (MT115): 0,1 Positiva

Compuesto 10 (MT125): 0,1 Positiva

20 A partir de estos resultados quedó claro que todos los compuestos que se prepararon en los Ejemplos 1 y 2 tenían el mismo nivel de actividad inductora del CMI en ayunas que la motilina nativa.

Ejemplo comparativo 1: experimento farmacocinético con motilina nativa administrada por vía intravenosa en ratas 25 Se administró motilina nativa a ratas por vía intravenosa y se midieron sus niveles plasmáticos.

La administración intravenosa se llevó a cabo con ratas que tenían un tubo de polietileno (PE-50; producto de Clay Adams) insertado previamente en la arteria femoral. Como animales de ensayo, se sometieron ratas SD macho de 7 30 semanas de edad (adquiridas en CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.) que consistían en 3 ratas por grupo, al siguiente experimento. Se disolvió la motilina nativa en una solución de manitol al 5 % para preparar una solución con una concentración de 100 μg/ml, y esta solución se administró a cada rata a una dosis de 1 ml/kg a través de la vena de la cola mediante una jeringa y una aguja de calibre 26G (siendo ambos productos de TERUMO). Antes de la administración y 1, 3, 5, 10, 20, 30 y 60 minutos después de la administración, se tomaron

35 muestras de sangre a través del tubo de polietileno insertado en la arteria femoral.

A la muestra de sangre recogida se añadió inmediatamente una solución de EDTA al 10 % · 2 Na · 2 H2O a una proporción en volumen de 1:100, y el plasma se separó mediante una centrifugación. El plasma se mezcló inmediatamente con una solución de 5.000 UI/ml de aprotinina a una proporción en volumen de 1:10 y se almacenó

40 a -80 ºC hasta su uso en la medición.

La medición de la concentración plasmática de la motilina nativa se llevó a cabo mediante la técnica de radioinmunoensayo (RIA) usando un anticuerpo anti-motilina. Más específicamente, después de añadir un anticuerpo anti-motilina a la muestra de plasma, se añadió [125I-Tyr7] motilina para que tuviera lugar una reacción 45 competitiva. Mediante la posterior adición de un anticuerpo secundario, se precipitó la unión de la motilina al anticuerpo anti-motilina, y después de la separación del sobrenadante, se midió la radioactividad en la fracción

precipitada con un contador  (producto de PerkinElmer).

El perfil obtenido de la concentración plasmática de la motilina nativa está representado en la FIG. 2. A partir de este perfil se calculó la concentración plasmática en el tiempo cero (C0) y el área bajo la curva de las concentraciones

5 plasmáticas (AUC) como parámetros farmacocinéticos; el C0 se determinó mediante una extrapolación, y el AUC mediante el método de los trapecios. Se calculó que los valores del C0 y del AUC resultantes de la administración intravenosa de la motilina nativa a una dosis de 100 μg/kg eran de 1.797 ng/ml y de 3.598 ng*min/ml, respectivamente.

Ejemplo 4: experimento farmacocinético con motilina nativa y compuestos derivados de la motilina administrados por vía pulmonar en ratas

Este ejemplo se llevó a cabo con el fin de medir mediante un RIA los cambios que se produjeron en las ratas en términos de las concentraciones plasmáticas de la motilina nativa y de los compuestos derivados de la motilina

15 administrados por vía pulmonar. Cuando se aplica la técnica del RIA, se detectan todas las sustancias que reaccionan con el anticuerpo anti-motilina, por lo que aparte de las formas inalteradas, también es probable que se detecten los metabolitos que reaccionan con el anticuerpo. Por lo tanto, después de la administración por vía pulmonar de la motilina nativa y de los compuestos derivados de la motilina en ratas, el plasma recogido se fraccionó mediante una HPLC y se midió la actividad inmunológica en cada fracción para demostrar que la sustancia que reaccionaba con el anticuerpo estaba en una forma inalterada, lo que verifica la idoneidad de la técnica del RIA como método para la medición de los cambios en la concentración plasmática.

Para ser más específicos, se insertó un tubo de polietileno (PE-240; producto de Clay Adams) en la tráquea de ratas SD macho de 7 semanas de edad (adquiridas en CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.); se disolvieron 25 la motilina nativa o el compuesto 2 (MT114) en una solución acuosa de ácido acético 0,1 N para preparar una solución con una concentración de 1 mg/ml y se administraron 25 μl de la solución en el tubo de polietileno a través de la tráquea por medio de un dispositivo de pulverización de líquidos intratraqueal (MicroSprayer; producto de Penn Century). Cinco minutos después de la administración se recogió sangre a través de la aorta abdominal y se trató como en el Ejemplo comparativo 1 para separar el plasma. Después de un pretratamiento con un cartucho Sep-Pak C18 (producto de Waters), el plasma se fraccionó mediante su inyección en una HPLC (LC-10A; producto de Shimadzu Corporation) equipada con una columna Cosmosil 5C18 (producto de nacalai tesque). Para cada muestra se muestreó un eluído a intervalos de un minuto desde justo después de la inyección de la muestra hasta 40 minutos después de la inyección de la muestra, y se midió la actividad inmunológica en cada fracción mediante un RIA. Como resultado, en cada una de las muestras plasmáticas, se detectó un pico de actividad inmunológica únicamente

35 en el punto de elución correspondiente al compuesto administrado (en su forma inalterada) y no se observó ningún otro pico. Dado que estos resultados sugieren que el compuesto detectado en el plasma después de la administración pulmonar estaba en una forma inalterada, con una probabilidad muy pequeña de presencia de metabolitos, se demostró que la técnica de RIA era adecuada como un método de ensayo para su uso en el ejemplo en consideración.

La administración pulmonar de las muestras también se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente usando ratas que tenían un tubo de polietileno previamente insertado en la arteria femoral. Como animales de ensayo se sometieron ratas SD macho de entre 7 y 10 semanas de edad (adquiridas en CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.) que consistían en 3 ratas por grupo al siguiente experimento. Se disolvió motilina nativa o compuestos

45 derivados de la motilina en una solución acuosa de ácido acético 0,1 N para preparar una solución con una concentración de 1 mg/ml y se administraron 25 μl de la solución en el tubo de polietileno a través de la tráquea por medio de un dispositivo de pulverización de líquidos intratraqueal (MicroSprayer; producto de Penn Century). Antes de la administración y 5, 10, 20, 30 y 60 minutos después de la administración se tomaron muestras de sangre a través del tubo de polietileno insertado en la arteria femoral. Las muestras de sangre recogidas se trataron como en el Ejemplo comparativo 1 para separar el plasma, y se midieron las concentraciones plasmáticas de la motilina nativa y de los compuestos derivados de la motilina mediante un RIA. En la medición se usaron los respectivos derivados como sustancias patrones para la construcción de las curvas de calibración para la determinación de los niveles plasmáticos.

55 Los perfiles de las concentraciones plasmáticas de la motilina nativa, así como del compuesto 2 (MT114) y del compuesto 6 (MT140) después de una administración pulmonar se muestran en la FIG. 3. Como también es evidente a partir de la FIG. 3, en comparación con el perfil de la concentración plasmática de la motilina después de una administración pulmonar de la motilina nativa a las ratas, las concentraciones plasmáticas del compuesto 2 (MT114) y del compuesto 6 (MT140) después de una administración pulmonar a la ratas tenía unos picos mayores, que demuestran que esos compuestos podrían mantener unas concentraciones in vivo mayores durante un periodo más largo que la motilina nativa.

Sobre la base de los perfiles de la motilina nativa o de los compuestos derivados de la motilina en plasma según se han obtenido mediante las pruebas descritas anteriormente, se calculó la concentración plasmática máxima (Cmáx) 65 y el área bajo la curva para las concentraciones plasmáticas (AUC) como parámetros farmacocinéticos; la Cmáx se determinó a partir de los valores observados, y el AUC mediante el método de los trapecios. Usando estos valores

se calculó la biodisponibilidad (BD (%)) mediante la siguiente ecuación:

BD (%) = [(AUC/Dosis) / (AUC (motilina_iv) / Dosis (motilina_iv))] x 100

5 AUC: AUC (ng*min/ml) después de una administración pulmonar Dosis: dosis (μg/kg) en la administración pulmonar AUC (motilina_iv): AUC (ng*min/ml) después de la administración intravenosa de la motilina nativa Dosis (motilina_iv): dosis (μg/kg) en la administración intravenosa de la motilina nativa.

10 Los parámetros farmacocinéticos de la motilina nativa y de los compuestos derivados de la motilina se muestran en la siguiente Tabla 3.

[Tabla 3]

15 Tabla 3: parámetros farmacocinéticos de la motilina nativa y de los compuestos derivados de la motilina administrados por vía pulmonar en ratas

Nombre del compuesto: Dosis Cmáx (ng/ml) AUC (ng*min/ml) BD (%)

(mg/rata): (mg/kg)

Motilina nativa: 25 80,7 ± 2,6 7,84 ± 0,98 94,9 ± 5,7 3,3 ± 0,1

Compuesto comparativo 1 (13Leu-motilina): 25 62,5 ± 0,0 4,53 ± 2,86 63,3 ± 36,6 2,8 ± 1,6

Compuesto comparativo 2 (MT139): 25 81,6 ± 3,0 9,30 ± 3,09 118,6 ± 41,0 4,1 ± 1,6

Compuesto 1 (MT095): 25 62,6 ± 2,6 9,09 ± 0,53 119,3 ± 15,0 5,3 ± 0,6

Compuesto 2 (MT114): 25 92,7 ± 3,4 26,60 ± 11,30 350,4 ± 146,6 10,4 ± 4,3

Compuesto 3 (MT116): 25 82,4 ± 1,6 24,60 ± 5,80 281,8 ± 24,0 9,5 ± 0,9

Compuesto 4 (MT124): 25 70,4 ± 9,9 14,61 ± 8,23 281,3 ± 201,7 11,0 ± 7,2

Compuesto 5 (MT126): 25 86,2 ± 0,0 14,81 ± 7,78 175,3 ± 90,7 5,7 ± 2,9

Compuesto 6 (MT140): 25 92,7 ± 3,4 34,22 ± 19,97 380,4 ± 191,5 11,5 ± 6,1

Compuesto 7 (MT141): 25 83,5 ± 4,7 17,20 ± 7,18 194,3 ± 47,9 6,4 ± 1,3

Compuesto 9 (MT115): 25 56,4 ± 1,5 8,99 ± 5,99 115,5 ± 64,2 5,7 ± 3,1

Compuesto 10 (MT125): 25 89,3 ± 0,0 6,10 ± 1,50 189,5 ± 25,5 5,9 ± 0,8

Compuesto 12 (MT154): 25 83,6 ± 5,6 30,09 ± 15,79 565,3 ± 341,1 18,7 ± 10,7

Compuesto 13 (MT155): 25 91,5 ± 1,9 18,42 ± 10,40 185,4 ± 48,5 5,6 ± 1,5

Como es evidente a partir de los datos mostrados en la Tabla 3, la biodisponibilidad (abreviada en lo sucesivo en el presente documento BD) del compuesto 1 (con la prolina sustituida por glicina como el aminoácido en la posición 21 20 de la motilina nativa; 21Pro-motilina; SEQ ID NO: 3) era de un 5,3 % tras la administración pulmonar a ratas, y este valor era mayor que la BD que se consiguió con la motilina nativa tras la administración pulmonar (3,3 %). El compuesto 2 (con la leucina sustituida por metionina como el aminoácido en la posición 13 de la motilina nativa, y con la prolina sustituida por el aminoácido en la posición 21; 13Leu-, 21Pro-motilina; SEQ ID NO: 4) tenía una BD del 10,4 % tras la administración pulmonar a ratas, una notable mejora con respecto al compuesto comparativo 1 (3Leu25 motilina; SEQ ID NO: 16) (2,8 %). Aún es más, el compuesto 6 (-psi[CH2NH]-enlace; 21Pro-motilina; SEQ ID NO: 8) tenía una BD del 11,5 % tras la administración pulmonar, una notable mejora con respecto al compuesto comparativo 2 (-psi[CH2NH]-motilina; SEQ ID NO: 17) (4,1 %). En resumen, los compuestos 1-13, que eran derivados de la motilina con una sustitución de la prolina en la posición 21, tenían unos valores de BD del 5,318,7 %, siendo todos mejores con respecto a la BD de la motilina nativa (3,3 %). A partir de estos resultados se

30 averiguó que la susceptibilidad de absorción tras la administración pulmonar mejora cuando se sustituye la prolina por el aminoácido en la posición 21 de la motilina nativa o de los compuestos peptídicos de tipo motilina.

Por lo tanto, cuando se administraron los compuestos 1-13, es decir, los derivados de la motilina con una sustitución de la prolina en la posición 21, por vía pulmonar a ratas, la eficacia de absorción en el cuerpo a través de la

35 membrana mucosa mejoró tan notablemente (véase la Tabla 3) que se demostró que las concentraciones in vivo de los compuestos absorbidos se mantenían a unos niveles mayores durante un periodo más largo que con la motilina nativa.

Ejemplo comparativo 2: experimento farmacocinético con motilina nativa y un compuesto derivado de la motilina 40 administrados por vía pulmonar en monos

En este ejemplo se administraron por vía intravenosa la motilina nativa y un compuesto derivado de la motilina a

monos y se midieron sus concentraciones plasmáticas.

Como animales de ensayo se sometieron monos cinomólogos macho de entre 8 y 9 años de edad (N = 1-2 por grupo) al siguiente experimento. Se disolvieron cada uno de la motilina nativa y el compuesto 2 en una solución de

5 manitol al 5 % para preparar soluciones con una concentración de 100 μg/ml; las soluciones fueron administradas a los animales a una dosis de 0,1 ml/kg a través de la vena cefálica derecha por medio de una jeringa y una aguja (siendo ambos productos de TERUMO). Antes de la administración y 5, 10, 15, 20, 30 y 60 minutos después de la administración, se tomaron muestras de sangre a través de la vena cefálica izquierda.

A la muestra de sangre recogida se añadió inmediatamente una solución de EDTA al 10 % · 2 Na · 2 H2O a una proporción en volumen de 1:100 y el plasma se separó mediante una centrifugación. El plasma se mezcló inmediatamente con una solución de 5.000 UI/ml de aprotinina a una proporción en volumen de 1:10 y se almacenó a -80 ºC hasta su uso en la medición.

15 La medición de las concentraciones plasmáticas de la motilina nativa y del compuesto derivado de la motilina se llevó a cabo mediante la técnica de radioinmunoensayo (RIA) usando un anticuerpo anti-motilina. Más específicamente, después de añadir un anticuerpo anti-motilina a la muestra de plasma, se añadió [125I-Tyr7] motilina para que tuviera lugar una reacción competitiva. Mediante la posterior adición de un anticuerpo secundario, se precipitó la unión de la motilina al anticuerpo anti-motilina, y después de la separación del sobrenadante, se midió la radioactividad en la fracción precipitada con un contador  (producto de PerkinElmer).

El perfil obtenido de la concentración plasmática de la motilina nativa en plasma está representado en la FIG. 4. A partir de los perfiles obtenidos para las concentraciones plasmáticas de la motilina nativa y del compuesto derivado de la motilina, se calculó la concentración plasmática en el tiempo cero (C0) y el área bajo la curva de las

25 concentraciones plasmáticas (AUC) como parámetros farmacocinéticos; el C0 se determinó mediante una extrapolación, y el AUC mediante el método de los trapecios. Se calculó que los valores del C0 y del AUC resultantes de la administración intravenosa de la motilina nativa a una dosis de 10 μg/kg eran de 233 ng/ml y de 786 ng*min/ml, respectivamente, y los equivalentes para el compuesto 2 eran de 273 ng/ml y de 926 ng*min/ml.

Ejemplo 5: experimento farmacocinético con motilina nativa y un compuesto derivado de la motilina administrados por vía intranasal en monos

Este ejemplo se llevó a cabo con el fin de medir mediante un RIA los cambios que se produjeron en monos en términos de las concentraciones plasmáticas de la motilina nativa y de un compuesto derivado de la motilina

35 administrados por vía transnasal.

En el experimento se usaron monos cinomólogos macho de entre 10 y 11 años de edad. Se mezclaron la motilina nativa o el compuesto 2 y celulosa microcristalina a una proporción de 1:40 para preparar preparaciones intranasales, porciones de 20 mg de las cuales se introdujeron en cápsulas de gelatina. Cada cápsula fue administrada en la cavidad nasal derecha de cada animal por medio de un dispositivo de administración intranasal (producto de Hitachi Automotive Systems, Ltd.). Antes de la administración y 5, 10, 15, 20, 30, 60, 120 y 180 minutos después de la administración, se recogieron muestras de sangre a través de la vena cefálica. Las muestras de sangre recogidas se trataron como en el Ejemplo comparativo 2 para separar el plasma, y las concentraciones plasmáticas de la motilina nativa y del compuesto derivado de la motilina se midieron mediante un RIA. En la

45 medición se usaron los respectivos derivados como sustancias patrones para la construcción de las curvas de calibración para la determinación de los niveles plasmáticos.

Los perfiles de las concentraciones plasmáticas de la motilina nativa y del compuesto 2 (MT114) en los monos después de la administración intranasal se muestran en la FIG. 5. Como también es evidente a partir de la FIG. 5, en comparación con el perfil de la concentración plasmática de la motilina después de la administración intranasal de la motilina nativa a los monos, la concentración plasmática del compuesto 2 (MT114) después de la administración intranasal a los monos tenía un nivel de pico elevado, lo que demuestra que el compuesto podía mantener una mayor concentración in vivo durante un periodo de tiempo más largo que la motilina nativa.

55 Sobre la base de los perfiles plasmáticos de la motilina nativa y del compuesto derivado de la motilina obtenidos mediante las pruebas descritas anteriormente, se calcularon la concentración plasmática máxima (Cmáx) y el área bajo la curva para las concentraciones plasmáticas (AUC) como parámetros farmacocinéticos; la Cmáx se determinó a partir de los valores observados, y el AUC mediante el método de los trapecios. Usando estos valores se calculó la biodisponibilidad (BD (%)) mediante la siguiente ecuación:

BD (%) -[(AUC/Dosis) / (AUC (iv) / Dosis (iv))] x 100

AUC: AUC (ng*min/ml) después de la administración intranasal Dosis: dosis (mg/kg) en la administración intranasal

65 AUC (iv): AUC (ng*min/ml) después de la administración intravenosa de cada compuesto Dosis (iv): dosis (mg/kg) en la administración intravenosa de cada compuesto.

Claims

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