ES2645661T3 - Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basada en fragmentos de restricción - Google Patents

Abstract

Método para identificar la presencia o ausencia de fragmentos de restricción en una muestra, que comprende las etapas de: (a) proporcionar dos o más muestras de ácidos nucleicos; (b) digerir cada muestra de ácido nucleico con al menos una endonucleasa de restricción para obtener un conjunto de fragmentos de restricción; (c) proporcionar adaptadores sintéticos bicatenarios que comprenden - una sección identificadora específica de la muestra, - al menos un extremo que se puede ligar al extremo romo o que sobresale de un fragmento de restricción; (d) ligar los adaptadores sintéticos bicatenarios a los fragmentos de restricción en el conjunto, para proporcionar un conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador; (e) determinar la secuencia de al menos la sección identificadora específica de la muestra, y parte de la secuencia del fragmento de restricción situada adyacente a la secuencia derivada del adaptador, (f) comparar dos o más muestras para la presencia o ausencia de fragmentos de restricción ligados al adaptador; (g) identificar la presencia o ausencia de fragmentos de restricción ligados al adaptador en la muestra.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

reconocimiento de la endonucleasa de restricción y cualquier base selectiva opcional. Cuando se usa un identificador de muestra con 6 pb, los restos son del cortador inusual EcoRI (AACCT), el uso de dos bases selectivas proporciona una secuencia interna del fragmento de restricción de 12 pb que se puede usar para identificar únicamente el fragmento de restricción en la muestra.

[0063] En una realización preferente basada en la tecnología de secuenciación Solexa mencionada anteriormente, la amplificación de los fragmentos de restricción ligados al adaptador se realiza con un cebador que contiene como máximo un nucleótido selectivo en su extremo 3’, preferentemente ningún nucleótido selectivo en su extremo 3’, es decir, el cebador solamente es complementario con el adaptador (un cebador +0).

[0064] En realizaciones alternativas dirigidas a los métodos de secuenciación que se describen en el presente documento, los cebadores usados en la amplificación pueden contener secciones específicas (como alternativa al cebador o secuencias de unión al cebador que se describen en el presente documento) que se usan en la etapa de secuenciación posterior para unir los fragmentos de restricción protegidos con el adaptador o los amplicones con la superficie. Estas se indican generalmente como la región clave o la secuencia compatible con el cebador 5’.

[0065] En una realización de la divulgación, la muestra de ácido nucleico se digiere con al menos una enzima de restricción y al menos se liga un adaptador que comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa de restricción de tipo IIs. La digestión posterior del fragmento de restricción ligado al adaptador con una endonuclease de restricción de tipo IIs proporciona, ya que la distancia entre el sitio de reconocimiento y de restricción de una enzima de tipo IIs es relativamente corta (hasta aproximadamente 30 nucleótidos), un fragmento de restricción más corto y uno más largo, al que se puede ligar un adaptador compatible con un sitio de restricción de tipo IIs. Por lo general, se desconoce el saliente del sitio limitado por IIs de modo que se puede usar un conjunto de adaptadores que se degeneran en el saliente. Después de la amplificación (selectiva), los amplicones se pueden secuenciar. La secuencia adaptadora en esta realización por lo general es la que sigue: 5’-sitio de unión al cebador---secuencia identificadora de la muestra---secuencia del extremo cohesivo de tipo IIs degenerado- 3’. El cebador de PCR asociado generalmente es el que sigue: secuencia cegadora--secuencia identificadora de la muestra---secuencia del extremo cohesivo de tipo IIs degenerado---nucleótidos selectivos -3’. El cebador usado para iniciar la secuenciación por síntesis por lo general tiene la estructura: 5’sitio de unión al cebador-3’. Puede ser preferente una etapa de selección del tamaño después de la digestión con la enzima IIs para retirar los fragmentos más pequeños. Al igual que en esta realización, los restos del sitio de restricción son para este tipo de enzima por lo general del orden de 2 a 4 pb, esto resulta en combinación con un identificador de la muestra de 6 pb en la secuenciación de 15 a 17 pb de un fragmento de restricción.

[0066] En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a kits que comprenden uno o más cebadores, y/o uno o más adaptadores para uso del método, además de componentes convencionales para kits per se. Además, la presente invención encuentra aplicación, entre otros, en el uso del método para la identificación de marcadores moleculares, para genotipificación, análisis de segregación en masa, formación de mapas genéticos, retrocruzamiento asistido por marcador, formación de mapas de sitios de rasgos cuantitativos, formación de mapas de desequilibrio de unión.

Ejemplo

[0067] Se aisló ADN de 2 padres y 88 descendencias usando métodos convencionales. Los padres (2 x) y la descendencia (= 4 x) estaban en dúplex con diferentes índices para someter a ensayo la reproducibilidad. Se usaron marcas para distinguir las muestras entre sí diferían por lo menos en 2 nucleótidos de cualquier otra marca usada en los experimentos. La calidad se está sometiendo a ensayo en las distintas etapas usando geles de agarosa y PAA.

Ejemplo 1

[0068] Para cada muestra de ADN, se realiza una etapa de restricción-ligación usando EcoRI y MseI como enzimas. Los adaptadores se basan en las secuencias de hibridación situadas en la superficie del sistema de secuenciación de alto rendimiento Solexa, más en particular, un adaptador de EcoRI contiene la secuencia P5 (parte del cebador de la secuencia) y el adaptador de MseI contiene la secuencia P7 (secuencia de cebador de PCR unido por puente). El adaptador de EcoRI contiene adicionalmente la muestra que identifica la marca. Se usan 96 adaptadores de EcoRI diferentes y un adaptador de MseI. Es posible usar un adaptador de EcoRI degenerado. La preparación del molde incluye una etapa de selección del tamaño mediante incubación de la mezcla durante 10 minutos a 80 grados Celsius después de la etapa de restricción (EcoRI + MseI) pero antes de la etapa de ligación al adaptador. Los fragmentos menores de 130 nt se retiran (en una muestra de maíz). La complejidad de la mezcla se reduce mediante una amplificación previa selectiva usando +1 cebadores (es decir, que contiene un nucleótido aleatoriamente selectivo en el extremo 3’, usando 96 cebadores de EcoRI+1 si un cebador de MseI+1 (o un cebador de EcoRI+1 con marca degenerada y un cebador de MseI +1). Se realiza amplificación selectiva para reducir la complejidad de la mezcla hasta el tamaño deseado usando

11

cebadores EcoRI+2 (= P5 lateral) y MseI+3 (= P7 lateral) que necesitan el uso de 96 cebadores de EcoRI+2 y un cebador de MseI+3. Se realiza PCR de cola usando un cebador de EcoRI con la secuencia del cebador de PCR con puente en P5 como la cola. Los productos se codifican usando columnas de Sephadex™. Las concentraciones se determinan y se normalizan y se crean grupos. Los grupos se someten a secuenciación

5 masiva en paralelo basándose en tecnología de Solexa que comprende amplificación de PCR por puente y secuenciación seguido de análisis de datos para determinar los genotipos de los padres y la descendencia.

[0069] Un escenario alternativo no usa PCR de cola, pero usa cebadores de EcoRI+2 fosforilados. Debido a la falta de coincidencia con el adaptador original, la temperatura de hibridación en el perfil de pacificación se

10 reduce en 3 grados Celsius para 13 ciclos de contacto hacia abajo desde 62-53 grados Celsius seguido de 23 ciclos a 53 grados Celsius. Después de la ligación del adaptador con la secuencia de PCR con puente de P5, se realiza PCR con cebadores de PCR con puente de P5 y P7.

[0070] Un segundo escenario alternativo se basa en la preparación de moldes convencionales como se ha

15 descrito anteriormente en el presente documento, (pre)amplificación selectiva para reducir la complejidad. La amplificación selectiva se realiza con cebadores que contienen los sitios de restricción de EcoRI y MseI reconstituidos. Esto permite la retirada de las secuencias adaptadoras antes de la secuenciación, reduciendo de este modo la cantidad de datos a analizar. Se realiza purificación de los productos con columnas de SephadexTM para retirar restos de ADN Taq polimerasa. Se preparan moldes en los que las secuencias

20 adaptadoras (sitio reconstituido) se reemplazan con adaptadores de Solexa usando un aumento de diez veces de adaptador de EcoRI y enzima de EcoRI para compensar el aumento del número de sitios de EcoRI para el ADN genómico. Los adaptadores de EcoRI de Solexa también contienen las marcas, por lo tanto, se necesitan 96 adaptadores de EcoRI de Solexa marcados. La hebra de la parte final del adaptador se bloquea en el extremo 3’ (en este caso con grupo amino 3’) para bloquear la extensión con una polimerasa. Se realiza PCR

25 con cebadores de PCR con puente en P5 y P7. Los productos se purifican con columnas de Qiagen.

Ejemplo 2

[0071] Se realizó detección de fragmentos de AFLP basada en secuencias usando tecnología de Matriz de

30 Molécula Individual Clonal (CSMATM) de Solexa, una plataforma de Secuenciación por Síntesis capaz de analizar hasta 40 millones de fragmentos individuales en una sola ejecución de la secuencia.

[0072] La secuencia experimental implica la preparación de moldes de AFLP, amplificación (AFLP) selectiva, amplificación por puente de una sola molécula y secuenciación de millones de marcas de la secuencia a partir

35 de un extremo de la enzima de restricción de los fragmentos de AFLP. Se usaron las líneas precursoras B73 y Mo17 y 87 de maíz. Se usaron Líneas de la Misma Estirpe Recombinantes (RILs) y se secuencia non en 8,9 millones de extremos de fragmentos de EcoRI para AFLP para proporcionar una prueba del principio para detección con AFLP basada en secuencias.

40 [0073] Se seleccionaron líneas precursoras B73 y Mo17 y 87 RILs. Se prepararon moldes para AFLP usando la combinación de enzima de restricción EcoRI/MseI. Se realizó amplificación selectiva usando cebadores +2/+3 para AFLP. Se prepararon fragmentos de molde para amplificación por puente de CSMA de Solexa realizando una segunda restricción/ligación usando adaptadores de EcoRI que contienen secuencias únicas de marca de identificación (ID) de la muestra de 5 pb. Se incluyeron líneas precursoras y tres muestras de RIL dos veces

45 usando diferentes marcas de ID de la muestra de 5 pb para medir la reproducibilidad dentro del experimento.

[0074] Se identificaron marcadores de AFLP basados en secuencia mediante extracción de marcas de secuencias de 27 pb observadas a diferentes frecuencias en B73 y Mo17, que se segregan en la descendencia de RIL.

50 [0075] Se compararon datos de marcadores de AFLP basados en secuencia con puntuaciones de marcadores de AFLP obtenidas con identificación genética de AFLP convencional usando detección basada en la longitud de las cuatro combinaciones de EcoRI/MseI +3/+3 cebadorcorrespondiente.

55 Estadística de la ejecución de la secuencia en 5 flujos celulares

[0076]

# marcas de la secuencia generadas 8.941.407

# marcas de la secuencia con IDs de la muestra desconocidas 8.029.595

# marcas de la secuencia diferentes con IDs de la muestra conocidas 206.758

# datos de la secuencia en Mbp generados por 241,4

marcas de la secuencia por muestra total del intervalo de la frecuencia 55.374 - 112.527

12

imagen10

imagen11

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2