CN111304341A - 一种鉴定食品中猪源性成分的pcr-aflp方法 - Google Patents
一种鉴定食品中猪源性成分的pcr-aflp方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111304341A CN111304341A CN202010277570.0A CN202010277570A CN111304341A CN 111304341 A CN111304341 A CN 111304341A CN 202010277570 A CN202010277570 A CN 202010277570A CN 111304341 A CN111304341 A CN 111304341A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- amplification
- dna
- aflp
- food
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title claims abstract description 32
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 42
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 15
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 15
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 15
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 claims abstract description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 18
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 9
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 6
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 6
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 6
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 claims description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 claims description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 claims description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 abstract description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 7
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 241001633942 Dais Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- STJMRWALKKWQGH-UHFFFAOYSA-N clenbuterol Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)C1=CC(Cl)=C(N)C(Cl)=C1 STJMRWALKKWQGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001117 clenbuterol Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000006486 human diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明本发明涉及一种鉴定食品中猪源性成分的PCR‑AFLP方法，属于食品检测领域。通过对猪、牛、羊、鸡、鸭的生鲜和高压基因组DNA进行提取，然后使用AFLP试剂盒对基因组DNA进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增，然后建立起AFLP试剂盒检测食品中猪源性成分的方法的检测方法，并对方法的灵敏度及特异性进行检测。结果表明，此方法可以有效鉴别出食品中肉制品的猪源性成分，且灵敏度达0.1％。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴定食品中猪源性成分的PCR-AFLP方法，属于食品检测领域。
背景技术
肉是人类饮食中必不可少的成分之一，但基于经济，宗教和健康因素，防止掺假和欺诈性替代肉类产品是消费者的强烈需求。根据与食品安全相关的法律法规，肉制品应准确说明其种类来源和含量，但是掺假和欺诈性产品通常在世界范围内发生。近年来，中国在肉制品领域发生了“瘦肉精事件”，瑞典，英国和法国发生了“马肉危机”，沃尔玛发生了“狐狸肉事件”。为了获得更大的利益，一些非法商人在牛肉和羊肉中掺入猪肉，甚至有些人会使用生病的猪肉进行掺假，以获取更多利益；使用鸡肉，鸭，鹅和水产品等产品掺假猪肉的案件也有报道。所以食品的商业标签不再是可靠的信息来源，全球各个国家的消费者都在关注食品供应的来源、生产方法的安全性。到目前为止，尚不清楚如何在整个食品供应链中确保食品的安全和质量，这对于政府监管部门和食品行业本身就是一个巨大的挑战。因此需要一种可靠、灵敏的对食品肉制品中猪源性成分进行检测的技术。
目前的对于食品中肉制品动物源性成分检测的方法主要分为两类，一种是基于蛋白质的检测，例如质谱，色谱，蛋白质组学和酶联免疫测定。另一种是基于DNA的检测方法。与蛋白质相比，DNA是一种相对稳定的有机分子，热处理后仍可以保持其稳定性。不同物种的生物因其基因序列见存在着较为固定的差异，因此可以根据其基因组DNA序列的差异进行食品中猪源性成分的检测，这种方法的优点是不受生物生长发育及生长环境的影响，鉴别准确率高。
为了建立食品中肉制品猪源性成分掺假的可追溯性，降低食品风险以及增强消费者对食品安全的信心，本发明通过对猪、牛、羊、鸡、鸭的生鲜和高压基因组DNA进行提取，然后使用AFLP试剂盒对基因组DNA进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增，然后建立起AFLP试剂盒检测食品中猪源性成分的方法的检测方法，并对方法的灵敏度及特异性进行检测。结果表明，此方法可以有效鉴别出食品中肉制品的猪源性成分，且灵敏度达0.1％。
发明内容
基于背景技术中所提到的问题，本发明拟提供一种鉴定食品中猪源性成分的PCR-AFLP方法，以有效地鉴别食品中肉制品中的猪源性成分。
一种鉴定食品中猪源性成分的PCR-AFLP方法，由以下步骤组成：
(1)从超市购得猪、牛、羊、鸡、鸭新鲜肉组织样品，并将样品在冷藏条件下运送回实验室，并放于-20℃保存；
将上述待测动物肌肉组织样本用生理盐水清洗三遍后，去除动物组织中的脂肪以及***后称取30mg，将动物组织样品放入液氮预冷的研钵中，然后将液氮缓缓加入研钵中，将样品迅速研磨至粉末状后将动物组织样本分别加入1.5mL离心管内，加入200μL的GA缓冲液彻底震荡悬浮；加入20μL蛋白酶K溶液混匀后放置于56℃，直至组织溶解，简短离心后除去管盖内壁的水珠；加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀70℃放置10min，溶液边清亮后，简短离心以除去管壁内水珠；加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15S，简短离心以去除管盖内壁水珠；将上一步所得溶液都加入CB3吸附柱中，12000rpm，离心30S，倒掉废液将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱内加入600μL漂洗液PW，12000rpm，离心30S，倒掉废液将吸附柱CB3放入收集管中；重复上一步操作；将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm，离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将提取的DNA溶液收集到离心管中储存在-20℃备用；
(2)配制1％的琼脂糖凝胶检测DNA的完整性，用酶标仪对DNA的纯度及浓度进行检测并将DNA稀释至50ng/μL，放置于-20℃备用；
(3)DNA酶切和连接反应：酶切成分如下：2μL的AFLP酶切-连接BUFFER，1μL的AFLPEcoRI-Mse I酶混合液，5μL50ng的模板DNA，最后将无菌水加入到试管当中，最终体积为20μL；然后将混合物混匀后再37℃下保温酶切2小时后于70℃灭活15min；在连接体系中加入20μL EcoRI-MseI接头混合物和1μL T4DNA连接酶，20℃保温2-3小时将接头与酶切片段相连酶切片段的两端，形成带有接头的片段；反应结束后在40μL体系中加入360μL超纯水，得到10倍连接稀释液，直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用；
(4)PCR预扩增：预扩增引物为EcoRI-Mse I预扩增引物对，反应体系30μL，5μL10倍连接稀释液；10μL EcoRI-MseI预扩增引物对；15μL PCR Magic Mix3.0。PCR循环条件：72℃预合成2分钟；94℃变性30s，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；共20次循环，取10μLPCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，产物大小为100bp-1500bp的弥散型条带，在剩余的20μL预扩增产物中加入980μL超纯水稀释，得到50倍PCR稀释液直接作为下步模板或-20℃保存待用；
表1
(5)选择性PCR扩增：从8对E/M选择性扩增引物中进行互相组合，组合成64种选择性扩增引物对，通过电泳分析，筛选出条带最少,分辨率最高的引物用于物种间鉴别，反应体系为30μL：5μL的50倍PCR稀释液，5μL的E-ACC引物工作液，5μL的M-CTT引物工作液，15μL的PCR MagMix 3.0。PCR循环条件：先94℃变性30秒，65℃退火30秒，每次循环递减0.7℃，72℃延伸1分钟，共13次循环，再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，
(6)最终72℃延伸5分钟；
表2
所述鉴定过程的产物检测方法，具体步骤为：取1μL选择性扩增产物与9μL的去离子甲酰胺上样缓冲液混匀后于95℃变性5min后迅速置于4℃冷却5分钟，将所得到的选择性PCR产物在10％的尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
电泳结束后进行银染并观察结果，对于在不同位置存在的扩增条带进行了统计分析，“1”代表条带的存在，“0”代表条带的缺失，将AFLP指纹转换为1和0的数字矩阵，计算扩增片段、多态片段数量、多带百分比，使用Quantity One软件将电泳图谱数字化，基于戴斯相似系数分析了各样品的相似性。
所述10％变性尿素聚丙烯酰胺凝胶配制由以下组分组成：尿素42g，40％丙烯酰胺22.2mL，1XTBE缓冲液20mL，双蒸水32.5mL。
本发明的有益效果
(1)使用E-ACC/M-CTT组合引物就能将5种物肉制品很好的区分开，且在混合肉中灵敏度为0.1％。
(2)为给予分子标记的肉类掺假鉴别技术提供基础，并帮助整个食品中肉制品掺假提供一种有效的鉴别手段。
附图说明
图1为猪、牛、羊、鸡、鸭生鲜组织预扩增结果图；
图2.为猪、牛、羊、鸡、鸭高压组织预扩增电泳图；
图3.猪、牛、羊、鸡、鸭相似性比较图；
图4猪、牛、羊、鸡、鸭选择性扩增图；
图5牛、羊DNA与不同浓度猪DNA掺假指纹图谱。
具体实施方式
实施例1
在实施例中，从大型超市收集了猪、牛、羊、鸡、鸭新鲜组织样品，并将样品在冷藏条件下运送回实验室，并放于-20℃保存。
主要仪器：Eppendorf公司移液器(10μL、20μL、100μL、1000μL、5mL)DYY-6D型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；PCR仪(德国Biometar GmbH公司)；ChemiDocTM Touchlmaging System(美国伯乐)；VARIOSKAN LUX-1510型酶标仪(美国赛默飞世)；高通量组织研磨机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Eppendorf迷你离心机(德国艾本德)。
主要试剂：DL10000maker、100bp maker、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、深加工食品DNA提取试剂盒、动物组织DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、PCR Magic MIX3.0(上海联迈生物有限公司)、无水乙醇(天津富宇精细化工有限公司)；异丙醇(山东禹王集团)；50X TAE(上海索莱宝生物科技有限公司)
2.2接头与引物
限制性Mse I和EcoR I内切酶、Mse I和EcoR I预扩增引物、+3型Mse I和EcoR I选择性扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2.2 DNA提取
将待测动物肌肉组织样本用生理盐水清洗三遍后，去除动物组织中的脂肪以及***后称取30mg，将动物组织样品放入液氮预冷的研钵中，然后将液氮缓缓加入研钵中，将样品迅速研磨至粉末状后将动物组织样本分别加入1.5mL离心管内。按照试剂盒说明说书提取模板DNA，将所提取的的DNA储存在-20℃备用。
2.3 DNA浓度及纯度测定
配制1％的琼脂糖凝胶检测DNA的完整性，用酶标仪对DNA的纯度及浓度进行检测并将DNA稀释至50ng/μL，放置于-20℃备用。
2.4 AFLP分析
DNA酶切和连接反应，酶切成分如下：2μL的AFLP酶切-连接BUFFER，1μL的AFLPEcoRI-Mse I酶混合液，5μL50ng的模板DNA，最后将无菌水加入到试管当中，最终体积为20μL。然后将混合物轻柔混匀后再37℃下保温酶切2小时后于70℃灭活15min。在连接体系中加入20μL EcoRI-MseI接头混合物和1μL T4DNA连接酶，20℃保温2-3小时将接头与酶切片段相连酶切片段的两端，形成带有接头的片段。反应结束后在40μL体系中加入360μL超纯水，得到10倍连接稀释液，直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。
表1
PCR预扩增所述带有接头的片段，预扩增引物为EcoRI-Mse I预扩增引物对，反应体系30μL：5μL10倍连接稀释液；10μL EcoRI-MseI预扩增引物对；15μL PCR Magic Mix3.0。PCR循环条件：72℃预合成2分钟；(94℃变性30s，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟)共20次循环，取10μLPCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，产物大小为100bp-1500bp的弥散型条带。在剩余的20μL预扩增产物中加入980μL超纯水稀释，得到50倍PCR稀释液直接作为下步模板或-20℃保存待用。
选择性PCR扩增：从8对E/M选择性扩增引物中进行互相组合，组合成64种选择性扩增引物对。通过电泳分析，筛选出条带最少,分辨率最高的引物用于物种间鉴别，反应体系为30μL：5μL的50倍PCR稀释液，5μL的E-ACC引物工作液，5μL的M-CTT引物工作液，15μL的PCRMagMix 3.0。PCR循环条件：先94℃变性30秒，65℃退火30秒(每次循环递减0.7℃)，72℃延伸1分钟，共13次循环，再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，最终72℃延伸5分钟。
表2
2.5 AFLP产物检测
取1μL选择性扩增产物与9μL的去离子甲酰胺上样缓冲液混匀后于95℃变性5min后迅速置于4℃冷却数分钟。将所得到的选择性PCR产物在10％的尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，10％变性尿素聚丙烯酰胺凝胶配制：尿素42g，40％丙烯酰胺22.2mL，1XTBE缓冲液20mL，双蒸水32.5mL。
电泳结束后进行银染并观察结果。对于在不同位置存在的扩增条带进行了统计分析，“1”代表条带的存在，“0”代表条带的缺失。将AFLP指纹转换为1和0的数字矩阵，计算扩增片段、多态片段数量、多带百分比。使用Quantity One软件将电泳图谱数字化，基于戴斯相似系数分析了各样品的相似性。
3结果
3.1 AFLP预扩增结果
对猪、牛、羊、鸡、鸭生鲜组织、高压组织进行预扩增，结果见图1。可知使用+1型EcoRI-Mse I预扩增引物对对于生鲜、高压组织样品均能扩增出500-1000bp的弥散性条带，为下一步选择性扩增做好了基础。
3.2 AFLP引物选择
为了确保选择性扩增引物可以产生高分辨率和多态性条带，通过重复优化PCR反应条件来选择扩增引物。最后从64种组合引物中选择了条带分辨率高、条带数量少的E-ACC/M-CTT引物对。
3.3 AFLP鉴别肉类种类
为了能够有效区分出不同的物种，筛选出产生条带少和分辨率高的+3型E-ACC和M-CTT引物对。图3给出了组合引物E-ACC/M-CTT对于生鲜组织及高压组织的扩增图。Quantity One软件将电泳结果转化为数字化的电泳图谱，通过条带在电泳中的迁移率计算各物种间条带的距离，然后通过戴斯相似性系数计算各物种的相似性。与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显著提高了实验效率并提高了结果的准确性，表明了该方法的优势。
3.4灵敏度分析
在牛、羊、鸡、鸭的生鲜和高压组织所提取的DNA中，分别添加0.001％、0.0005ng；0.01％、0.005ng、0.1％、0.05ng；1％0.5ng；10％、5ng的猪的DNA，总浓度为50ng/μL，进行选择性扩增，所有泳道均能扩增出50-150Bp大小的弥散条带(图2)。
用猪与牛、羊、鸡、鸭的DNA混合物以确定AFLP的检测灵敏度，E-ACC/M-CTT引物对混合肉的预扩增产物进行选择性扩增后，所有梯度的选择性扩增条带分辨率清晰，生鲜牛、羊、鸡、鸭与猪肉的DNA混合物都可以检测到0.1％的猪DNA掺假量。
4结论
分子标记技术的使用有助于建立可靠的鉴别方法，不仅可以防止食品欺诈，还能提高消费者对肉制品食品安全的信心。本研究使用AFLP分子标记技术建立了一种可以检测食品中肉制品动物源性的检测方法。首先，通过从64种+3型EcoR I/Mse I引物中筛选出E-ACC/M-CTT选择性组合引物；其次，对每个样本在选择性引物下的多态性片段进行统计分析；最后，通过计算将牛、羊、鸡、鸭与猪所得到的条带进行相似度比对。结果表明，AFLP技术
是一种有效地个体鉴定工具，本研究使用E-ACC/M-CTT组合引物就能将5种物种很好的区分开，且在混合肉中灵敏度为0.1％。为给予分子标记的肉类掺假鉴别技术提供基础，并帮助整个食品中肉制品掺假提供一种有效的鉴别手段。
表3
Claims (3)
1.一种鉴定食品中猪源性成分的PCR-AFLP方法，其特征在于，由以下步骤组成：
(1)从超市购得猪、牛、羊、鸡、鸭新鲜肉组织样品，并将样品在冷藏条件下运送回实验室，并放于-20℃保存；
(2)将上述待测动物肌肉组织样本用生理盐水清洗三遍后，去除动物组织中的脂肪以及***后称取30mg，将动物组织样品放入液氮预冷的研钵中，然后将液氮缓缓加入研钵中，将样品迅速研磨至粉末状后将动物组织样本分别加入1.5mL离心管内，加入200μL的GA缓冲液彻底震荡悬浮；加入20μL蛋白酶K溶液混匀后放置于56℃，直至组织溶解，简短离心后除去管盖内壁的水珠；加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀70℃放置10min，溶液边清亮后，简短离心以除去管壁内水珠；加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15S，简短离心以去除管盖内壁水珠；将上一步所得溶液都加入CB3吸附柱中，12000rpm，离心30S，倒掉废液将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱内加入600μL漂洗液PW，12000rpm，离心30S，倒掉废液将吸附柱CB3放入收集管中；重复上一步操作；将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm，离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将提取的DNA溶液收集到离心管中储存在-20℃备用；
(3)配制1％的琼脂糖凝胶检测DNA的完整性，用酶标仪对DNA的纯度及浓度进行检测并将DNA稀释至50ng/μL，放置于-20℃备用；(4)DNA酶切和连接反应：酶切成分如下：2μL的AFLP酶切-连接BUFFER，1μL的AFLP EcoRI-Mse I酶混合液，5μL50ng的模板DNA，最后将无菌水加入到试管当中，最终体积为20μL；然后将混合物混匀后再37℃下保温酶切2小时后于70℃灭活15min；在连接体系中加入20μL EcoRI-MseI接头混合物和1μL T4 DNA连接酶，20℃保温2-3小时将接头与酶切片段相连酶切片段的两端，形成带有接头的片段；反应结束后在40μL体系中加入360μL超纯水，得到10倍连接稀释液，直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用；(5)PCR预扩增：预扩增引物为EcoRI-Mse I预扩增引物对，反应体系30μL，5μL10倍连接稀释液；10μL EcoRI-MseI预扩增引物对；15μL PCR Magic Mix3.0，PCR循环条件：72℃预合成2分钟；94℃变性30s，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；共20次循环，取10μLPCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，产物大小为100bp-1500bp的弥散型条带，在剩余的20μL预扩增产物中加入980μL超纯水稀释，得到50倍PCR稀释液直接作为下步模板或-20℃保存待用；
(6)选择性PCR扩增：从8对E/M选择性扩增引物中进行互相组合，组合成64种选择性扩增引物对，通过电泳分析，筛选出条带最少,分辨率最高的引物用于物种间鉴别，反应体系为30μL：5μL的50倍PCR稀释液，5μL的E-ACC引物工作液，5μL的M-CTT引物工作液，15μL的PCRMagMix 3.0，PCR循环条件：先94℃变性30秒，65℃退火30秒，每次循环递减0.7℃，72℃延伸1分钟，共13次循环，再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，最终72℃延伸5分钟。
2.一种如权利要求1所述鉴定过程的产物检测方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)取1μL选择性扩增产物与9μL的去离子甲酰胺上样缓冲液混匀后于95℃变性5min后迅速置于4℃冷却5分钟，将所得到的选择性PCR产物在10％的尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
(2)电泳结束后进行银染并观察结果，对于在不同位置存在的扩增条带进行了统计分析，“1”代表条带的存在，“0”代表条带的缺失，将AFLP指纹转换为1和0的数字矩阵，计算扩增片段、多态片段数量、多带百分比，使用Quantity One软件将电泳图谱数字化，基于戴斯相似系数分析各样品的相似性。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述10％变性尿素聚丙烯酰胺凝胶配制由以下组分组成：尿素42g，40％丙烯酰胺22.2mL，1XTBE缓冲液20mL，双蒸水32.5mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010277570.0A CN111304341A (zh) | 2020-04-10 | 2020-04-10 | 一种鉴定食品中猪源性成分的pcr-aflp方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010277570.0A CN111304341A (zh) | 2020-04-10 | 2020-04-10 | 一种鉴定食品中猪源性成分的pcr-aflp方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111304341A true CN111304341A (zh) | 2020-06-19 |
Family
ID=71150389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010277570.0A Pending CN111304341A (zh) | 2020-04-10 | 2020-04-10 | 一种鉴定食品中猪源性成分的pcr-aflp方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111304341A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090253581A1 (en) * | 2006-04-04 | 2009-10-08 | Keygene N.V. | High Throughput Detection of Molecular Markers Based on AFLP and High Throughput Sequencing |
| CN107955837A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-04-24 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 用于猪个体及品种鉴定的aflp引物组合产品、试剂盒及方法 |
-
2020
- 2020-04-10 CN CN202010277570.0A patent/CN111304341A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090253581A1 (en) * | 2006-04-04 | 2009-10-08 | Keygene N.V. | High Throughput Detection of Molecular Markers Based on AFLP and High Throughput Sequencing |
| CN107955837A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-04-24 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 用于猪个体及品种鉴定的aflp引物组合产品、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 无: "100903 AFLP试剂盒使用手册V1.4", 《HTTP://WWW.DOCIN.COM/P-2153123491.HTML》 * |
| 无: "血液细胞组织基因组DNA提取试剂盒试用说明书", 《HTTP://WWW.DOCIN.COM/P-353484067.HTML》 * |
| 高丹丹 等: "动物肉制品基因组DNA的提取和纯化", 《食品科技》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105648046B (zh) | 一次性鉴别绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和鸭肉的方法 | |
| Keto-Timonen et al. | An improved amplified fragment length polymorphism (AFLP) protocol for discrimination of Listeria isolates | |
| CN104946790A (zh) | 一种溯源鉴定8种动物源性成分的pcr方法 | |
| CN111334585B (zh) | 同时检测8种动物成分的引物、试剂盒及检测方法和应用 | |
| KR101296221B1 (ko) | 중합효소연쇄반응을 이용한 축종 판별방법 | |
| CN113073140A (zh) | 一种用于同时鉴别7种肉源食品的pcr检测用引物组和方法 | |
| Sophian et al. | Analysis of Purity and Concentration of Isolated DNA in Making Raw DNA of Rat Species: Analysis of Purity and Concentration of Isolated DNA in Making Raw DNA of Rat Species | |
| CN110373473B (zh) | 一种鉴定猪肉成分的分子标记及其应用 | |
| CN111304341A (zh) | 一种鉴定食品中猪源性成分的pcr-aflp方法 | |
| Aravindran et al. | Market surveillance on non-halal additives incorporated in surimi based products using polymerase chain reaction (PCR)-southern hybridization analysis | |
| CN106995852B (zh) | 利用单拷贝核基因检测食品和饲料中绵羊源性成分的实时荧光pcr检测方法 | |
| CN106868185B (zh) | 一种用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组及其应用 | |
| CN106811534B (zh) | 一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒 | |
| CN114686600A (zh) | 基于七重pcr技术的肉类检测用引物组和方法 | |
| CN116334234A (zh) | 一种鉴定或辅助鉴定动物源饲料成分来源的引物组合物及其应用 | |
| CN114561476A (zh) | 用于同时鉴别12种肉源食品的多重pcr检测用引物组和方法 | |
| CN114836413A (zh) | 提取dna的试剂盒及dna提取方法 | |
| Huang et al. | Identification of species in commercial frozen shrimp meat in Taiwan | |
| CN112094919A (zh) | 一种快速鉴别牛猪鸡鸭动物源成分的多重pcr引物组及其方法和试剂盒 | |
| CN107012219B (zh) | 一种用于检测大鼠鼠源性成分的方法 | |
| CN111118176A (zh) | 一种袋鼠、豚鼠与褐家鼠多重pcr检测试剂盒及方法 | |
| US20180037959A1 (en) | Process using ZEN hydrolysis probe for detection of porcine contamination and a kit thereof | |
| CN111122756A (zh) | 检测可食用肉的特征多肽及方法 | |
| CN116875702B (zh) | 一种鉴定常见动物种属的引物组及其试剂盒和应用 | |
| CN114836523B (zh) | 利用单拷贝核基因检测食品和饲料中火鸡源性成分的实时荧光pcr检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200619 |