ES2638511T3 - Composiciones cosméticas que comprenden unos oligómeros de ácidos hialurónico y unas células vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafrán - Google Patents

Abstract

Composición cosmética que comprende unas células vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que se presenta en forma de vesículas, comprendiendo dichas vesículas una membrana vegetal formada de una bicapa lipídica que delimita un volumen interno que contiene una fase encapsulada, caracterizándose dicha composición por que comprende además al menos un oligómero de ácido hialurónico de peso molecular inferior a 10 kDa y por que un extracto de azafrán está presente en la fase encapsulada de las vesículas.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Composiciones cosmeticas que comprenden unos oligomeros de acidos hialuronico y unas celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran

La presente invencion se refiere al campo tecnico general de los productos cosmeticos para uso topico, utilizables en particular sobre la piel.

Mas precisamente, la presente invencion se refiere a composiciones cosmeticas para aplicacion topica que comprenden unos oligomeros de acido hialuronico y unas celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran. Se refiere tambien a un procedimiento cosmetico no terapeutico para los cuidados de la piel que utiliza tal composicion, asf como a la utilizacion no terapeutica de tal composicion cosmetica para el cuidado de la piel, y en particular para mejorar la firmeza de la piel, en particular favoreciendo la regeneracion de la dermis, y para reducir las arrugas cutaneas.

La piel es un verdadero organo que comprende varias capas integradas, que va desde la capa superficial, la epidermis, hasta las capas mas profundas, la dermis y la hipodermis, y cada una de estas capas posee unas propiedades espedficas que permiten al conjunto reaccionar y adaptarse a las condiciones de su entorno y conferir a la piel su flexibilidad y su resistencia.

La epidermis, principalmente compuesta de queratinocitos de melanocitos y de celulas de Langerhans, tiene un papel fundamental para asegurar la proteccion y el mantenimiento de una buena troficidad. Los queratinocitos son unas celulas extremadamente dinamicas que sufren una proliferacion y una diferenciacion permanentes al final de las cuales se transforman en celulas muertas (corneocitos), eliminandose regularmente por descamacion.

La dermis se compone principalmente de colageno, de elastina y de proteoglicanos, moleculas sintetizadas por los fibroblastos dermicos. Las fibras de colageno aseguran la resistencia mecanica y la textura de la piel, la elastina es responsable de la elasticidad, y los proteoglicanos, que combinan protemas y glicosaminoglicanos, desempenan una funcion principal de estructura y de hidratacion de la piel. Los glicosaminoglicanos, tales como el acido hialuronico, son unas moleculas muy higroscopicas que son capaces de retener unas cantidades importantes de agua. Otras celulas, como los macrofagos y los leucocitos, estan tambien presentes en la capa de la dermis.

La hipodermis, que es la capa mas profunda de la piel, contiene los adipocitos que producen unos lfpidos para que el tejido subcutaneo fabrique una capa grasa que protege los musculos, los huesos y los organos internos contra los choques.

El colageno es una protema de estructura principal que presenta mas del 70% de la cantidad de protemas de la piel. Se describen 14 tipos de colageno en la piel humana. El colageno I es el principal y representa el 90% del colageno total en la piel.

A lo largo el tiempo, se producen profundas modificaciones a nivel de la dermis. La poblacion de fibroblastos, celulas especializadas en la smtesis de las fibras de elastina y de colageno, disminuira a la mitad entre los 20 y los 80 anos. Estos fibroblastos aseguran el equilibrio entre la smtesis, la maduracion y la degradacion de las fibras de elastina y de colageno. En el tiempo, el equilibrio se desplazara hacia una degradacion de estas fibras con, como resultado, una perdida de elasticidad y de tonicidad de la dermis y una flacidez que se opone mas a los efectos de contraccion de los musculos subyacentes, llevando a la aparicion de arrugas. Asf, con el envejecimiento, la dermis sufre un adelgazamiento y una rigidificacion: la piel es menos flexible, menos firme con la edad y aparecen arrugas. Ademas, la piel debe continuadamente hacer frente a multiples agresiones exteriores que pueden acelerar el proceso natural del envejecimiento.

De este modo, se buscan constantemente nuevos activos cosmeticos a fin de luchar contra los signos cutaneos del envejecimiento y, en particular contra la atrofia de la dermis y la aparicion de arrugas.

Las celulas elicitadas y desdiferenciadas de cultivo vegetal de buganvilla se describen en la solicitud de patente FR 14 53647. Estas celulas permiten transportar cualquier tipo de ingrediente activo y liberarlos de manera progresiva en el nucleo de las diferentes capas de la epidermis, aunque estos ingredientes activos sean hidrosolubles o liposolubles. En efecto, las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla se presentan en forma de vesmulas que comprenden una membrana vegetal formada de una bicapa lipfdica que delimita un volumen interno que contiene una fase encapsulada. Los constituyentes de la membrana son identicos a los lfpidos inter-corneocitarios de la capa superior de la epidermis y a los lfpidos intercelulares (acidos grasos, ceramidas, colesterol). Asf, despues de la aplicacion de las celulas desdiferenciadas y elicitadas, el contenido celular se difundira por simple cizallamiento de la piel: el o los ingredientes activos se benefician de una encapsulacion natural y de una liberacion por bio- mimetismo. Asf, tras la aplicacion sobre la piel, la accion de las celulas se efectua en 3 tiempos, que son 1) la fragmentacion de las membranas lipfdicas de las celulas enteras, 2) la insercion en los lfpidos inter-corneocitarios y 3) la liberacion progresiva del o de los ingredientes activos por bio-mimetismo dentro de la epidermis. Se ha demostrado asf que la encapsulacion de un extracto de azafran, como ingrediente activo, por las celulas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla tiene un efecto positivo sobre la proliferacion de las celulas de la dermis y de la epidermis de la piel, favoreciendo as^ su regeneracion.

Sin embargo, aunque esta composicion tiene un efecto favorable sobre la abundancia del colageno I y la regeneracion de la dermis, permanece la necesidad de proponer nuevos ingredientes activos que permitan luchar mas eficazmente contra los signos del envejecimiento cutaneo y, en particular, contra la perdida de firmeza de la piel y la aparicion de arrugas.

El acido hialuronico es un glicosaminoglicano presente en todos los vertebrados, principalmente en los tejidos conjuntivos, epiteliales y nerviosos. Es uno de los principales componentes de la matriz extracelular. El acido hialuronico es un constituyente natural de la dermis que desempena una funcion importante en la hidratacion, la tonicidad y la elasticidad de la piel. Es en los organismos jovenes donde se encuentra en mayor cantidad. En efecto, con el tiempo, su presencia disminuye, en particular por que los radicales libres a los que estamos expuestos (sol, polucion, etc.) lo destruyen.

En cosmetica, los oligomeros de acido hialuronico de bajo peso molecular (es decir generalmente inferior a 10 kDa) desempenan una funcion importante en la migracion y la proliferacion de las celulas, dos procesos que intervienen durante cualquier regeneracion, reconstruccion, o cicatrizacion de las heridas. Las capacidades regeneradoras de los oligomeros de bajo peso molecular pueden utilizarse por lo tanto eficazmente para tratar el envejecimiento de la piel.

Los trabajos realizados por la solicitante han mostrado que unos oligomeros de acido hialuronico de bajo peso molecular, es decir inferior a 10 kDa, potencializan el efecto de las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran sobre la proliferacion de las celulas de la dermis, mas particularmente sobre la smtesis del colageno I, favoreciendo asf su regeneracion. La asociacion de oligomeros de acido hialuronico de bajo peso molecular, es decir inferior a 10 kDa, y de celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran puede, por lo tanto, utilizarse ventajosamente a favor para el cuidado de la piel, y en particular para favorecer la regeneracion de la dermis. Ademas, a las dosis utilizadas, los ensayos efectuados han mostrado que las composiciones cosmeticas a base de celulas desdiferenciadas de buganvilla utilizadas en la presente invencion no presentan ninguna citotoxicidad.

La presente invencion tiene por lo tanto como primer objeto una composicion cosmetica que comprende unas celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que se presentan en forma de vesfculas, comprendiendo dichas vesfculas una membrana vegetal formada de una bicapa lipfdica que delimita un volumen interno que contiene una fase encapsulada, caracterizandose dicha composicion por que comprende ademas al menos un oligomero de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa y por que un extracto de azafran esta presente en la fase encapsulada de las vesfculas.

Segun la invencion, la composicion cosmetica es preferentemente una composicion cosmetica para aplicacion topica.

La invencion tiene tambien como otro objeto un procedimiento cosmetico no terapeutico para los cuidados de la piel, en particular para mejorar la firmeza de la piel, favoreciendo la regeneracion de la dermis, y para reducir las arrugas cutaneas, caracterizado por que consiste en aplicar sobre las zonas de la piel en cuestion al menos una composicion cosmetica tal como se ha definido anteriormente, es decir una composicion cosmetica que comprende al menos un oligomero de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa y unas celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que se presentan en forma de vesfculas, cuya fase encapsulada comprende al menos un extracto de azafran. Finalmente, la invencion tiene por objeto la utilizacion no terapeutica de una composicion cosmetica para aplicacion topica que comprende al menos un oligomero de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa y unas celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran, para los cuidados de la piel, en particular para mejorar la firmeza de la piel, en particular favoreciendo la regeneracion de la dermis de la piel, y para reducir las arrugas cutaneas.

Todas las especies de buganvilla se pueden utilizar segun la presente invencion, pero se pueden mencionar en particular Bougainvillea glabra, Bougainvillea alba, Bougainvillea spectabilis, Bougainvillea infesta, et Bougainvillea buttiana.

Por celulas vegetales desdiferenciadas de buganvilla, se entiende cualquier celula vegetal procedente de un cultivo in vitro de celulas de buganvilla, no presentando dichas celulas ningun caracter de una especializacion particular y siendo capaces de vivir por ellas mismas y sin depender de otras celulas.

Las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla utilizables segun la presente invencion se pueden obtener mediante tecnicas conocidas de crecimiento o multiplicacion celular, en medio lfquido o solido, de celulas de buganvilla cultivadas in vitro en un entorno controlado, en condiciones asepticas en ausencia de microorganismos.

La tecnica de cultivo vegetal presenta la ventaja de producir unas celulas cultivadas en condiciones del entorno bien

5

10

15

20

25

30

35

40

45

definidas y reproducibles, en lo que se refiere en particular a la temperatura, la luz y el medio de cultivo y producir unas celulas no diferenciadas que se encuentran en la misma etapa fisiologica en un instante dado (desdiferenciadas). Otra ventaja es la formacion de metabolitos secundarios en un tiempo mas corto, del orden de una a tres semanas, que en la planta, en la que este plazo es de varios meses.

Por ejemplo, se pueden preparar unas celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla a partir de explantes de hojas, flores, tallo o rafz.

Las celulas desdiferenciadas y elicitadas utilizables segun la invencion se pueden obtener mediante cualquier metodo conocido por la tecnica anterior tal como, por ejemplo, segun los metodos descritos por E. F. George y P. D. Sherrington en Plant Propagation by tissue culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories (Exegetics Ltd, 1984).

Los medios de cultivo utilizables segun la invencion son los generalmente conocidos por el experto en la materia. Se puede citar a tttulo de ejemplo los medios de Gamborg, de Murashige Skoog, de Heller, de White, y cuya descripcion completa puede encontrarse en «Plant Culture Media: formulations and uses», E. F. George, DJM Puttock y H. J. George (Exegetics Ltd 1987, Tomos 1 y 2).

Se entiende por “elicitacion” la realizacion de una tension o de una agresion (biologica, qrnmica o ffsica) sobre las celulas vegetales en su medio de cultivo a fin de provocar uno o varios mecanismos de defensa que se concretizan en particular, pero no unicamente, por la smtesis de metabolitos secundarios de interes tales como las fitoalexinas.

Segun la invencion, la elicitacion de las celulas desdiferenciadas de buganvilla en medio de cultivo se puede realizar por aplicacion de agentes qrnmicos o de tensiones diversas tales como presion, depresion, vado, variacion de presion, presencia de un gas, atmosfera variable, calor, fno, luz, ciclos de luminosidad, radiaciones, toxinas, agitacion, contaminacion por microorganismos (bacterias, levaduras, virus), ultrasonidos, rayos infrarrojos o ultravioleta, asfixia.

Segun la presente invencion, se pueden utilizar mas particularmente unas celulas desdiferenciadas, elicitadas y liofilizadas de buganvillas. La liofilizacion de las celulas permite mejorar su conservacion y, a continuacion, facilitar su incorporacion en las composiciones cosmeticas.

Los elementos determinados en las celulas liofilizadas son los siguientes (para 100 g de celulas liofilizadas):

Protemas (determinadas segun el metodo descrito en el decreto del 8 de septiembre de 1977 relativo a los metodos oficiales de analisis de los productos dieteticos y de regimen): 13,56 g

El aminograma del extracto proteico ha puesto en evidencia los principales aminoacidos siguientes. A continuacion, los contenidos en aminoacidos se indican en gramos por 100 g de celulas liofilizadas.

Acido aspartico

10,61

Acido glutamico

10,15

Prolina

6,75

Lisina

6,38

Valina

5,79

Alanina

5,29

Serina

5,27

Glicina

4,82

Arginina

4,72

Glutamina

4,63

Isoleucina

4,61

Leucina

4,60

Fenilalanina

4,25

Treonina

4,01

Tirosina

3,70

Asparagina

3,29

Triptofano

3,02

Metionina

2,58

Cistema

1,89

Ornitina

0,24

Lfpidos (determinados segun el metodo descrito en el decreto del 8 de septiembre de 1977 relativo a los metodos oficiales de analisis de los productos dieteticos y de regimen): 1,08 g, que se compone en particular del 73% en masa aproximadamente de acidos grasos saturados e insaturados de C-is y del 21% en masa aproximadamente de acidos grasos saturados de C-ia.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Azucares (determinados por cromatograffa ionica - deteccion amperometrica pulsada (PAD)):

- Glucosa

11,23 g

- Fructosa

13,10 g

- Lactosa

< 0,12 g

- Sacarosa

10,78 g

- Maltosa

< 0,13 g

Las celulas elicitadas y desdiferenciadas de buganvilla segun la presente invencion encapsulan un extracto de flores de azafran (Crocus sativus) a tttulo de ingrediente activo. El extracto de azafran se puede obtener a partir de flores de azafran, despues de la retirada de los estigmas y de los pistilos. Las flores sin estigmas y pistilos se secan despues, se reducen a polvo y despues se extraen con agua por maceracion.

Asf, las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran se obtienen preferentemente mediante el procedimiento que comprende las etapas siguientes:

1) la preparacion de celulas desdiferenciadas por cultivo in vitro en medio de cultivo de explantes de buganvilla,

2) la elicitacion de las celulas desdiferenciadas obtenidas en la etapa anterior en el medio de cultivo,

3) la extraccion de las celulas desdiferenciadas y elicitadas obtenidas anteriormente en la etapa anterior,

4) la incubacion de las celulas desdiferenciadas y elicitadas obtenidas en la etapa 3) con una solucion o una dispersion que contiene el extracto de azafran en el medio lfquido.

La etapa 4) de incubacion se realiza preferentemente a una temperatura inferior o igual a 30°C, y aun mas preferiblemente a una temperatura que vana de 20 a 30°C, durante un tiempo de 12 a 48 horas aproximadamente. El medio lfquido utilizable para efectuar la incubacion de las celulas desdiferenciadas y elicitadas con el o los ingredientes activos se puede seleccionar entre los medios utilizados en la etapa 1) del procedimiento para el cultivo in vitro de las celulas, es decir para la multiplicacion celular de las celulas de buganvilla.

Al final de la incubacion, las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan el extracto de azafran se pueden recuperar en el medio lfquido, por ejemplo por filtracion.

La cantidad de extracto de azafran presente en la fase encapsulada vana generalmente del 0,01 al 5% en masa aproximadamente con respecto a la masa total de las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla, y aun mas preferiblemente del 0,1 al 3% en masa aproximadamente. De manera muy particularmente preferida, la cantidad de extracto de azafran presente en la fase encapsulada es del 1% en masa aproximadamente.

Segun la invencion, la fase encapsulada es preferentemente una fase acuosa seleccionada entre el agua y los medios de cultivo utilizados para el cultivo in vitro de dichas celulas.

Segun una forma particularmente ventajosa de la invencion, las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan el extracto de azafran se dispersan en glicerina para obtener una suspension de celulas, antes de ser incorporadas en una composicion cosmetica. Asf, segun una forma de realizacion preferida de la invencion, las celulas desdiferenciadas y elicitadas que encapsulan un extracto de azafran estan presentes en forma de una suspension de dichas celulas en la glicerina. Preferentemente, la cantidad de celulas desdiferenciadas y elicitadas que encapsulan un extracto de azafran dentro de dicha suspension vana del 15 al 30% en masa aproximadamente, y aun mas preferiblemente es del orden del 20% en masa aproximadamente con respecto a la masa total de dicha suspension.

Asf, segun esta forma particular de realizacion de la invencion, la composicion cosmetica puede entonces comprender del 0,01% al 10% en masa aproximadamente de una suspension de celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran en la glicerina y tal como se ha descrito anteriormente, con respecto a la masa total de la composicion cosmetica, preferentemente del 0,05% al 5% en masa aproximadamente, y aun mas preferiblemente del 0,1% al 3% en masa aproximadamente.

Segun la invencion, el o los oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa responden preferentemente a la formula (C-M^-iNO-i-On, en la que n es un numero entero inferior a 25 que designa el grado de polimerizacion.

Segun una forma de realizacion preferida de la invencion, n esta comprendido entre 5 y 25.

De manera ventajosa, la concentracion en oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa en la composicion cosmetica de la invencion puede variar del 0,01% al 1% aproximadamente, preferentemente del 0,05% al 0,5% aproximadamente, y aun mas preferiblemente del 0,1 al 0,3% aproximadamente en masa con respecto a la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

masa total de la composicion cosmetica.

Los oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDA utilizables en el ambito de la invencion se pueden obtener gracias a la produccion de acido hialuronico segun unos procedimientos biotecnologicos bien conocidos por el experto en la materia y tales como se describen por ejemplo por Schiraldi C. et al. («Biotechnological Production and Application of Hyaluronan», en Biopolymers, M. Elnashar, Ed., p. 387-412, InTech, Rijeka, Croatia, 2010) seguido de hidrolisis del acido hialuronico a fin de obtener unos oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa.

Los metodos de medicion del peso molecular de los oligomeros de acido hialuronico utilizables segun la invencion son los generalmente conocidos por el experto en la materia, y tales como se describen por ejemplo por Mahnoey D.J. et al («Novel methods for the preparation and characterization of hyaluronan oligosaccharides of defined lengh», Glycobiology. 2001, 11(12), 1025-1033).

Se puede citar a tftulo de ejemplo la combinacion de difusion de la luz con angulos multiples acoplada con una cromatograffa de exclusion serica (MALLS-SEC) que separa las protemas segun su volumen hidrodinamico y permite acceder a la masa molecular de las especies y a la homogeneidad de un pico a la salida de la cromatograffa de exclusion serica. El peso molecular de los oligomeros de acido hialuronico de formula (C-M^-iN-i-On, en la que n es un numero entero inferior a 25 segun la presente invencion, vana asf entre 2 kDa inclusive y 10 kDaltons exclusive.

Tambien estan disponibles en el comercio unos oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDA. A tftulo de ejemplo, se pueden mencionar en particular los productos vendidos bajo las denominaciones comerciales Signal-10® (CAS Number 90004-61-9) por la comparfta Principium S.A. (Viganello, CH), o PrimaHyal 10® por la comparfta Soliance (Pomacle, FR).

Las composiciones segun la presente invencion comprenden, en asociacion, al menos un oligomero de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDA y las celulas vegetales elicitadas y desdiferenciadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran, en combinacion, llegado el caso, con los soportes y excipientes habituales en las composiciones cosmeticas y dermatologicas, cosmetica y dermatologicamente aceptables.

En el sentido de la presente invencion, se entiende por “soporte cosmetica y dermatologicamente aceptable”, los medios que comprenden agua, una mezcla de agua y uno o varios disolventes organicos, o un disolvente o una mezcla de disolventes organicos cosmetica o dermatologicamente aceptables.

Segun una forma ventajosa de realizacion, las composiciones cosmeticas conformes a la presente invencion pueden contener, ademas de las celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran y los oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa, uno o varios activos suplementarios que refuerzan o complementan ventajosamente su actividad, y compatibles, es decir no susceptibles de reaccionar los unos con los otros u ocultar o limitar sus efectos. Tales ingredientes activos se pueden seleccionar entre cualquier tipo de compuestos habitualmente utilizados en las composiciones cosmeticas. A tftulo de ejemplo, se pueden citar los extractos de plancton, los extractos de origen vegetal tales como un extracto de maca (que tiene un efecto sobre la prevencion de desajustes relacionados con una deficiencia de la microcirculacion cutanea y con el estres oxidativo que puede resultar de ella), un extracto de petalos de amapola que actua sobre la nutricion celular, una combinacion de extractos de anchusa, de amapola y de pasiflora que, en combinacion, tienen un efecto en la prevencion de los signos del envejecimiento cutaneo, un extracto de semilla de mimosa, un extracto de petalos de calendula, un extracto de barbatimao, un extracto de kigelia africana o un extracto de cebada.

Las composiciones cosmeticas conformes a la presente pueden presentarse en formas galenicas clasicamente utilizadas para una aplicacion por via topica, es decir, en forma de gel, de emulsion (en particular crema o leche), de emulsion bifasica aceite en agua o agua en aceite, de aceite corporal, de mascarilla, de pomada, de unguento, de locion, de solucion concentrada, conteniendo dichas formas galenicas ademas unos excipientes y soportes habituales y aceptables en el plano cosmetologico. Se utilizan preferentemente en forma de cremas, de suero, de locion o de gel.

Estas formas de administracion por via topica se preparan mediante las tecnicas habituales y, por ejemplo, en el caso de una crema, por dispersion de una fase grasa en una fase acuosa para obtener una emulsion aceite en agua, o a la inversa para preparar una emulsion agua en aceite en el caso de las cremas, se pueden utilizar unas emulsiones de estructura laminar obtenidas con lecitinas hidrogenadas o unos sucro-esteres, que contienen poco producto etoxilado o que no lo contienen en absoluto.

La composicion topica segun la invencion puede comprender unos excipientes apropiados para una aplicacion topica externa, en particular unos excipientes aceptables en el plano cosmetologico. Estos excipientes apropiados para la formulacion son bien conocidos por el experto en la materia y comprenden, en particular, unos agentes de penetracion tales como el fitantriol, el octildodecanol y la escina; los espesantes tales como las gomas naturales y los poftmeros de smtesis; los tensioactivos; los emolientes tales como el octanoato de cetearilo, el miristato de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

isopropilo, el isononanoato de cetearilo, la dimeticona, la ciclometicona, el 3-diisoestearato de poliglicerilo, el poliisobuteno hidrogenado, el alcohol cetilico, el palmitato cetilico, el fosfato cetilico; los emulsionantes tales como unos derivados de poliglicerol; los conservantes tales como el fenoxietanol y el acido deshidroacetico; los colorantes; los perfumes.

Como otros ingredientes utilizables en las composiciones de la invencion, se pueden citar los agentes hidratantes tales como la glicerina, el butilenglicol, la sal de sodio del acido pirrolidona carboxflico (sodium PCA), asf como asociaciones de derivados glucosicos con efecto hidratante y reestructurante como el producto Aquaxyl® (xilitil- glucosido y anhidroxilitol y xilitol), y tambien las vitaminas antioxidantes.

Se puede tambien anadir a la composicion unos glucosidos seleccionados principalmente entre la glucosa, el glicogeno y la trealosa, o tambien un palmitoil pentapeptido-3 tal como el Matrixyl® o unos derivados tales como el palmitoil GHK (que posee la cadena glicil-histidil-lisina) y el palmitoil GQPR (glicil-glutamil-propil-arginina) o el palmitoil VGVAPG (valil-glicil-valil-alanil-prolil-glicina) asociado a una ceramida-2, asf como de manera general cualquier asociacion con una ceramida.

Se puede tambien anadir a la composicion unos agentes de proteccion contra los rayos ultravioletas, y por ejemplo unos filtros solares UV-A y UV-B hidrofilos o lipofilos, o unos pigmentos que forman pantalla anti-ultravioleta.

Los filtros solares se pueden seleccionar, por ejemplo, entre la benzofenona o un derivado de benzofenona tal como la 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona (Eusolex® 4360) o un ester de acido cinamico y mas particularmente el metoxicinamato de octilo (Eusolex® 2292), el metoxicinamato de etil-2-hexilo (Parsol MCX®), o tambien un ciano-p,p- difenilacrilato tal como el octocrileno (Eusolex® OCR), el 4-metilbencilideno alcanfor (Eusolex 6300®), y unos derivados del dibenzoilmetano tales como el 4-isopropildibenzoilmetano (Eusolex 8020), el t-butil-metoxi dibenzoilmetano (Parsol 1789®), y el 4-metoxi-dibenzoilmetano.

Los pigmentos se pueden seleccionar por ejemplo entre el dioxido de titanio, el oxido de zinc y el oxido de circonio.

La asociacion, segun la presente invencion, de celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran y de oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa ha hecho aparecer una excelente actividad sobre la smtesis del colageno I. Asf, a las concentraciones ensayadas, se ha podido constatar un aumento altamente significativo (+106%) de la abundancia del colageno I. Estos resultados confirman que la asociacion segun la invencion favorece la regeneracion de la dermis y permite mejorar la firmeza de la piel y reducir la aparicion de arrugas.

La utilizacion no terapeutica de la composicion cosmetica conforme a la invencion comprende todos los cuidados del cuerpo y de la piel incluyendo los productos solares, protectores y bronceadores, los productos anti-edad, anti- seborreicos, tonicos, los productos que aseguran la mejora del aspecto de la piel incluyendo el tratamiento acneico y los enrojecimientos cutaneos.

Los resultados se explican en los ejemplos siguientes y demuestran la sinergia de los efectos de cada uno de los componentes, ya que, a dosis equivalentes, los resultados proporcionados por la asociacion son superiores a la suma de los efectos que producen individualmente.

Los ejemplos siguientes ilustran la invencion son limitar su alcance.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparacion de una suspension de celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran

1. Extraccion y cultivo de las celulas desdiferenciadas de buganvilla

Se han extrafdo unos trozos de hojas de aproximadamente de 5 a 10 cm sobre unas hojas frescas de buganvilla (Bougainvillea glabra).

Los trozos de hojas se esterilizan despues, a continuacion se cultivan en cajas esteriles a temperatura ambiente sobre un medio nutritivo sintetico (medio de Murashige y Skoog gelosado), hasta la formacion, a nivel de los explantes, de cumulos celulares desdiferenciados, denominados callos o celulas madres.

Las celulas madres se extrajeron al final de 30 dfas, y despues se trasplantaron sobre un medio nutritivo nuevo en las mismas condiciones de cultivo que anteriormente, hasta la obtencion de callos friables.

Se ha obtenido asf una coleccion de cepas desdiferenciadas estables que presentan unas caractensticas de crecimiento y de produccion de metabolitos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2. Elicitacion de las celulas obtenidas antes en la etapa anterior

La elicitacion de las celulas se ha realizado por irradiacion por luz UV a 180 nm durante 2 horas, con la ayuda de una luz Wilbert-Lourmat T-30C (600 |iW/m2), posicionada a una distancia de 1 m en iluminacion directa encima de las celulas.

3. Preparacion de la suspension celular

Despues de la elicitacion, se ha extrafdo un trozo de callo y despues se ha suspendido en un medio nutritivo lfquido (medio de Murashige y Skoog sin gelosa).

Al final del cultivo (15 dfas), las celulas se han filtrado para eliminar el medio de cultivo y despues se ha aclarado con agua fna (4°C). Se ha obtenido asf una biomasa fresca de aproximadamente 250 g de celulas por litro de cultivo.

4. Obtencion del extracto de azafran

El extracto de azafran se ha obtenido a partir de flores de azafran, despues de la retirada de los estigmas y de los pistilos. Las flores sin estigmas y los pistilos se han secado, reducido en polvo y despues extrafdo con agua por maceracion.

5. Encapsulacion del extracto de azafran en las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla

Unas celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla tales como se han preparado anteriormente se pusieron en suspension en un medio nutritivo lfquido (medio de Murashige y Skoog sin gelosa) que contiene un 1% en masa de extracto de azafran. La incubacion de las celulas de buganvilla se ha realizado durante 48 horas, a una temperatura de 25°C a fin de encapsular el extracto de azafran en la fase acuosa de las celulas.

Al final del periodo de incubacion, las celulas de buganvilla se recuperaron por filtracion y despues se suspendieron en glicerina a razon del 20% en masa para un 80% en masa de glicerina.

Se ha obtenido asf una suspension que comprende un 80% en masa de glicerina y un 20% en masa de celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran.

Ejemplo 2: puesta en evidencia de la ausencia de citotoxicidad de la asociacion de las celulas vegetales de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran y de oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa

En este ejemplo, se ha ensayado la citotoxicidad eventual de las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran tales como las obtenidas en el ejemplo1, de oligomeros de acido hialuronico de formula (C14H21NO11)n, en la que n es un numero entero inferior a 25 vendido bajo la denominacion comercial Signal-10 por la companfa Principium S.A., asf como de su asociacion.

El estudio se ha realizado sobre fibroblastos de dermis humana NHDF (Normal human Dermal Fibroblatos; origen: prepucio) a aproximadamente el 40% de su potencial proliferativo y cultivado en monocapas en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) que contiene suero FBS (Fetal Bovine Serum) y antibioticos (penicilina/estreptomicina).

Los diferentes tratamientos con los activos y su asociacion se han realizado en un medio de cultivo que no contiene suero.

Las celulas se han mantenido en una atmosfera humeda a 37°C que contiene un 5% de CO2.

Las celulas se sembraron en placa de 24 pocillos, 24 horas antes del tratamiento con, respectivamente, el 0,3% de oligomeros de acido hialuronico de formula (C^H21NOn)n, en la que n es un numero entero inferior al 25,3% de celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran, y la asociacion de estos dos activos a estas dos concentraciones.

El tratamiento de los fibroblastos NHDF por los dos activos y su asociacion, aplicados a estas concentraciones y por triplicado de cultivo (n=3), se ha realizado en el medio de cultivo DMEM que contiene unos antibioticos y en ausencia de suero.

Despues, se ha analizado la viabilidad de las celulas mediante la utilizacion del ensayo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-5-3)3-carboxi-metoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) despues de 48 horas de tratamiento.

La densidad celular y la cinetica experimental corresponden a las condiciones que se han utilizado a continuacion para el analisis del efecto de los activos sobre la abundancia del colageno I.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Una solucion acuosa de dodecil sulfato de sodio al 0,08% en masa (SDS) se ha utilizado como control positivo, a fin de validar el experimento de citotoxicidad.

El ffmite de citotoxicidad se ha fijado arbitrariamente al 80% de viabilidad con respecto al control no tratado y el SDS se ha utilizado como control positivo de citotoxicidad a fin de validar el experimento.

No existe diferencia significativa en cuanto al porcentaje de viabilidad de los fibroblastos NHDF despues de 48 horas de tratamiento entre las celulas tratadas por los dos activos o su asociacion y las celulas control que no han recibido ningun tratamiento (resultados no representados).

Estos resultados son significativos de una ausencia de citotoxicidad.

Ejemplo 3: evaluacion del efecto de la asociacion de las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran y de oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa sobre la regeneracion de la dermis

El ensayo se basa en la evaluacion por inmunomarcado en fluorescencia del colageno I a fin de estimar el efecto de las celulas desdiferenciadas y elicitadas que encapsulan un extracto de azafran, de un oligomero de peso molecular inferior a 10 kDa, asf como de su asociacion sobre la smtesis de colageno I.

A fin de evaluar los efectos sobre la smtesis del colageno I, los fibroblastos NHDF se han inoculado sobre laminas de vidrio (compartimiento de 0,7 cm2), 24h antes del principio de los tratamientos por los activos y su asociacion. Se han constituido cinco lotes:

Lote 1: control que no recibe ningun producto.

Lote 2: control positivo. Se ha utilizado una solucion de TGF-pi a 20 ng/ml como molecula de referencia que permite aumentar la smtesis de colageno I dentro de los fibroblastos NHDF.

Lote 3: Los fibroblastos se han tratado con un 0,3% de oligomeros de acido hialuronico de formula (Ci4H2iNOii)n, en la que n es un numero entero inferior a 25, vendido bajo la denominacion comercial de Signal-10 por la compama Principium S.A.

Lote 4: los fibroblastos se han tratado con un 3% de celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran.

Lote 5: los fibroblastos se han tratado mediante la asociacion del 3% de celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran y el 0,3% de oligomeros de acido hialuronico de formula (C14H21NOn)n, en la que n es un numero entero inferior a 25, vendido bajo la denominacion comercial de Signal-10 por la compama Principium S.A.

Los activos se han solubilizado en el medio de cultivo que no contema suero y se han puesto en contacto con unos fibroblastos durante 48 horas. Cada condicion se ha realizado en triplicado (n=3).

Al final de los tratamientos, los fibroblastos se han fijado con formol y despues aclarado con PBS. Las laminas se han conservado despues a 4°C hasta el dfa del marcado.

El inmunomarcado en fluorescencia del colageno I se ha realizado incubando las laminas con un anticuerpo primario espedfico y un anticuerpo secundario conjugado con la fluorescema. El DAPI (4',6'-diaminido-2-fenilindol), una molecula fluorescente capaz de unir el ADN, se ha utilizado para marcar los nucleos. Las laminas se montaron finalmente con alcohol polivimlico producto vendido bajo la denominacion comercial de Mowiol® por la compama Aldrich) y almacenadas a 4°C.

La cuantificacion se ha realizado en base a 3 fotograffas por replica tomadas con la ayuda de un microscopio Leica

(R)

(DM 2000, objetivo 40x), y de una camara Leica (DFC420C).

®

El marcado en inmunofluorescencia del colageno I se ha cuantificado con la ayuda del programa QWin 3 (Leica) utilizando el pixel como unidad de superficie (1 pixel = 1 |im2). Cada fotograffa esta constituida de 4751460 pixeles. La intensidad media del marcado se ha determinado para cada fotograffa. Los nucleos se contabilizan gracias al programa ImageJ a fin de relacionar la superficie marcada y la intensidad media del marcado con el numero de nucleo sobre cada fotograffa. Esta relacion, que permite determinar la intensidad del marcado, se compara con el valor que corresponde a la condicion de control no tratado. Se ha realizado un ensayo estadfstico t-student a fin de comparar el efecto de cada activo de la asociacion.

5

10

15

20

25

30

35

Los resultados se presentan en la tabla 1 siguiente:

Tabla 1

Condicion

Marcado en inmunofluorescencia del colageno I Diferencia con respecto al control (%)

Lote 1

386497 ± 5 -

Lote 2

1 833 434 ± 92 +374**

Lote 3

345 167 ± 14 -11

Lote 4

677 881 ± 9 +75

Lote 5

797 444 ± 33 + 106*

Los valores de 0,001<p<0,01 se consideran como altamente significativos (*) y p<0,001 como muy altamente significativos (**) (ensayo t-student con respecto a la condicion CTL no tratado)

Estos resultados muestran que el tratamiento de los fibroblastos NHDF por la asociacion de las celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran y unos oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa induce a un aumento altamente significativo de la smtesis del colageno I (+106% de marcado en inmunofluorescencia del colageno I con respecto al control). Estos resultados son sorprendentes en la medida en la que los oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa no tiene influencia sobre la smtesis de colageno I (marcado en inmunofluorescencia del colageno I disminuido en un 11% con respecto al control). Asf, estos resultados demuestran que los oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa potencializan los efectos de las celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran (aumento del 106% del marcado en inmunofluorescencia despues del tratamiento por la asociacion con respecto al control frente a un aumento de un 75% con respecto al control, despues del tratamiento por las celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran).

Asf, la asociacion de celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran y de oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa tiene un efecto superior sobre la smtesis de colageno I.

Ejemplo 4: crema para el cuidado de la piel

Mediante las tecnicas habituales, se ha preparado una crema para el cuidado de la piel que tiene la composicion masica indicada a continuacion:

- Gluconato de sodio 0,2 g

- Copolfmero hidroxietil acrilato / acriloildimetil taurato de sodio vendido bajo la denominacion de 1,65 g Sepinov® EMT10 por Seppic

- Glicerina pura al 99,8% 2,0 g

- Hidroxido de sodio 0,25 g

- Acido cftrico, monohidratado 0,3 g

- Filtros solares 15,5 g

- Benzoato de alquilo de C12-C15 vendido bajo la denominacion de Cetiol AB par BASF 11,0 g

- Mezcla de alcohol araquidflico, de alcohol behemlico y de glucosido araquidflico vendido bajo la 3,0 g

denominacion de Montanov ® 202 par Seppic

- Dimeticona vendida bajo la denominacion de Abil® 350 por Evonik Industries 2,0 g

- Aceite virgen de almendra dulce 3,0 g

- DL a-tocoferol 0,5 g

- Hidroxietilurea vendida bajo la denominacion de Hydrovance por AkzoNobel 3,0 g

- Celulas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran tales como se preparan en el ejemplo 1 1,0 g

-Agente tensor 1,0 g

- Extracto hidroglicolico de Crocus decolorado vendido por GREENTECH 0,3 g

- Celulas de cacao trituradas vendidas bajo la denominacion de Ground Cacao cells por DIANA PLANT 0,01 g

- Oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa vendidos bajo la denominacion de 0,1 g Signal-10® por Principium B.S.I.

- Conservantes cs

- Perfumes cs

- Agua desmineralizada 1 csp 100,0

g

Esta crema antiedad puede utilizarse una a dos veces al dfa por aplicacion sobre las zonas de la piel a tratar. Ejemplo 5: suero para el cuidado de la piel

Mediante las tecnicas habituales, se ha preparado un suero para el cuidado de la piel que tiene la composicion masica indicada a continuacion.

- Gluconato de sodio

- Goma xantana vendida bajo la denominacion

- Glicerina pura al 99,8 %

- Acrilatos/Polfmero reticulado de acrilato de C10-30 alquilo vendido bajo la denominacion Pemulen® TR-1 por Lubrizol

- Mezcla de alcoholes de C14-C20 y de alquilglicosidos de C14-C20 vendida bajo la denominacion Montanov® L por Seppic

- Estearoilglutamato de sodio vendido bajo la denominacion Eumulgin® SG por BASF

- Trigliceridos de acidos caprico y capnlico vendidos bajo la denominacion Myritol® 318 por BASF

- aceite virgen de almendra dulce

- DL a-tocoferol

- Oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa vendidos bajo la denominacion Signal-10® por Principium B.S.I.

- Celulas de cacao trituradas vendidas bajo la denominacion Ground cells Cacao por DIANA PLANT

- Hidroxietilurea vendida bajo la denominacion Hydrovance® por AkzoNobel

- Extracto hidroglicolico de Crocus decolorado por la companfa GREENTECH

- Celulas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran tales como se han preparado en el ejemplo 1

- Hidroxido de sodio

- conservantes

- Perfumes

- Agua desmineralizada 5

Este suero se destina a fortalecer la piel y se puede utilizar una a dos veces al dfa.

Ejemplo 6: emulsion para el cuidado de la piel

10 Mediante las tecnicas habituales, se ha preparado una emulsion para el cuidado de las pieles normales a mixtas que tiene la composicion masica indicada a continuacion.

- Gluconato de sodio 0,2 g

- Copolfmero hidroxietil acrilato / acriloildimetil taurato de sodio vendido bajo la denominacion Sepinov 1,2 g EMT10 por Seppic

-Glicerina pura al 99,8% 1,0 g

- Hidroxido de sodio 0,3 g

- Mezcla de alcohol araquidflico, de alcohol behemlico y de glucosido araquidflico vendido bajo la 1,5 g denominacion Montanov® 202 por Seppic

- Estearoilglutamato de sodio vendido bajo la denominacion Eumulgin® SG por BASF 0,25 g

- Palmitato de glicol vendido bajo la denominacion Lanol® P por Seppic 1,0 g

- Trigliceridos caprico y capnlico vendidos bajo la denominacion Myritol® 318 por BASF 3,0 g

- Polifenilmetilsiloxano vendido bajo la denominacion Dow Corning® 556 por Dow Corning 1,0 g

- aceite virgen de almendra dulce 2,0 g

- aceite de Limnanthes 2,0 g

- DL a-tocoferol 0,7 g

- Hidroxietilurea vendida bajo la denominacion Hydrovance por AkzoNobel 3,0 g

- Extracto acuoso de petalos de amapola 0,5 g

- Mezcla de butilenglicol, de extracto de corteza de Enantia Chlorantha y de acido oleanolico vendido 1,0 g

bajo la denominacion comercial de Evermat® por Sederma

- Celulas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran tales como se preparan en el ejemplo 1 1,0 g

- Celulas de cacao trituradas vendidas bajo la denominacion Ground Cacao Cells por DIANA PLANT 0,01 g

- Oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa vendidos bajo la denominacion 0,1 g Signal-10® por Principium B.S.I.

- Conservantes cs

- Perfumes cs

- Agua desmineralizada csp

100,0 g

0,2g

1,0g

0,3g

1,5g

0,2g 4,0 g 3,0g 0,5g 0,1 g

0,01 g 3,0g 0,3g 1,0g

0,07g

cs

cs

csp 100,0 g

Esta emulsion se puede utilizar una a dos veces por dfa por aplicacion sobre las zonas de la piel a tratar. 15

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Composicion cosmetica que comprende unas celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que se presenta en forma de vesfculas, comprendiendo dichas vesfculas una membrana vegetal formada de una bicapa iipfdica que delimita un volumen interno que contiene una fase encapsulada, caracterizandose dicha composicion por que comprende ademas al menos un oligomero de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa y por que un extracto de azafran esta presente en la fase encapsulada de las vesfculas.
2. 2. Composicion segun la reivindicacion 1, caracterizada por que es una composicion cosmetica para aplicacion topica.
3. 3. Composicion cosmetica segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizada por que la cantidad de extracto de azafran presente en la fase encapsulada vana del 0,01 al 5% en masa con respecto a la masa total de las celulas desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla.
4. 4. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende del 0,01% al 10% en masa de una suspension de celulas vegetales desdiferenciadas y elicitadas de buganvilla que encapsulan un extracto de azafran en la glicerina, con respecto a la masa total de dicha composicion.
5. 5. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que el o los oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDA responden a la formula (C-m^-iNO-h^, en la que n es un numero entero inferior a 25 que designa el grado de polimerizacion.
6. 6. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la concentracion en oligomeros de acido hialuronico de peso molecular inferior a 10 kDa vana del 0,01% al 1% en masa con respecto a la masa total de dicha composicion.
7. 7. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende ademas uno o varios ingredientes activos seleccionados entre los extractos de plancton, un extracto de maca, un extracto de petalos de amapola, una combinacion de extractos de anchusa, de amapola y de pasiflora, un extracto de semillas de mimosa, un extracto de petalos de calendula, un extracto de barbatimao, un extracto de kigelia africana, y un extracto de cebada.
8. 8. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que se presenta en forma de gel, de emulsion, de emulsion bifasica aceite en agua o agua en aceite, de aceite corporal, de mascarilla, de pomada, de unguento o de solucion concentrada.
9. 9. Procedimiento cosmetico no terapeutico para los cuidados de la piel, caracterizado por que consiste en aplicar sobre las zonas de la piel en cuestion al menos una composicion cosmetica tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. Utilizacion no terapeutica de una composicion cosmetica tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para los cuidados de la piel.
11. 11. Utilizacion no terapeutica de una composicion cosmetica tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para mejorar la firmeza de la piel y reducir las arrugas cutaneas.