ES2638188T3 - Ácidos nucleicos - Google Patents

Ácidos nucleicos Download PDF

Info

Publication number
ES2638188T3
ES2638188T3 ES08735583.0T ES08735583T ES2638188T3 ES 2638188 T3 ES2638188 T3 ES 2638188T3 ES 08735583 T ES08735583 T ES 08735583T ES 2638188 T3 ES2638188 T3 ES 2638188T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
epitope
responses
peptide
immunobody
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08735583.0T
Other languages
English (en)
Inventor
Linda Gillian Durrant
Rachael Louise Metheringham
Victoria Anne Pudney
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scancell Ltd
Original Assignee
Scancell Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scancell Ltd filed Critical Scancell Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2638188T3 publication Critical patent/ES2638188T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Un ácido nucleico que comprende (a) un promotor, (b) a secuencia que codifica una secuencia líder y una cadena pesada recombinante de un anticuerpo y (c) una secuencia que codifica una cadena ligera de un anticuerpo, en el que la cadena pesada contiene al menos un epítopo de linfocito T heterólogo en la misma que altera la cadena pesada de tal manera que la cadena pesada no puede adoptar su conformación nativa ni asociarse a una cadena ligera de anticuerpo cuando se expresa el ácido nucleico, al menos un epítopo de linfocito T citotóxico heterólogo está en la CDRH1 y/o CDRH2 de la cadena pesada del anticuerpo, al menos un epítopo de linfocito T auxiliar heterólogo está en la cadena ligera del anticuerpo o está en la cadena pesada del anticuerpo, y el promotor (i) no tiene especificidad por células en las que se promueve la expresión o (ii) causa la expresión del ácido nucleico en células dendríticas.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
vía intramuscular, vía oral o por otras vías. Se prefiere administración intradérmica o intramuscular debido a que estos tejidos contienen células dendríticas.
Como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un ser humano o animal no humano. El tratamiento puede ser de una enfermedad heredada o adquirida. Preferentemente, el tratamiento es de una afección/trastorno asociado con proliferación celular tal como cáncer o enfermedad infecciosa. Los ejemplos de tipos de cáncer que pueden tratarse con el ácido nucleico incluyendo cualquier tumor sólido, cáncer colorrectal, tumores de pulmón, mama, gástrico, ovárico, uterino, de hígado, de riñón, pancreático, melanoma, de vejiga, de cabeza y cuello, cerebral, esofágico, pancreático y de hueso, así como cánceres de tejido blando y leucemias. Como ejemplos de enfermedades infecciosas que pueden tratarse con el ácido nucleico se incluyen, infección con VIH, Hepatitis C, o cualquier infección crónica que para su eliminación requiera inmunidad de linfocitos T.
El ácido nucleico puede emplearse en combinación con un vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
Pueden emplearse adyuvantes para facilitar la estimulación de la respuesta inmunitaria del huésped y pueden incluir hidróxido de aluminio, lisolecitina, pluronic, polioles, polianiones, péptidos, proteínas y emulsiones en aceite.
Los ácidos nucleicos útiles en la invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las sustancias anteriores, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizador farmacéuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Tales materiales deberían ser no tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, vías intradérmica, oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal. La formulación es preferentemente ácido nucleico como un polvo seco estable precipitado en la superficie de partículas de oro microscópicas y es adecuada para inyección mediante una pistola génica. La formulación puede ser adecuada para administración intradérmica o intramuscular usando electroporación.
Las composiciones que comprenden, o para el suministro de, ácidos nucleicos se administran preferentemente a un individuo en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, siendo suficiente esta para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada, y la tasa y ciclo temporal de administración, dependerá de la naturaleza y gravedad de lo que se trata. La prescripción de tratamiento, por ejemplo decisiones sobre la dosificación etc., está dentro de la responsabilidad de los facultativos generales y otros doctores en medicina y típicamente tiene en cuenta el trastorno a tratar, la condición del paciente individual, el sitio de suministro, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los facultativos. Los ácidos nucleicos de la invención son particularmente relevantes para el tratamiento de cáncer existente y en la prevención de la recurrencia de cáncer después del tratamiento inicial o cirugía. Los ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden hallarse en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Oslo, A. (ed), 1980.
Preferentemente, el ácido nucleico de la invención estimula linfocitos T auxiliares y/o citotóxicos que pueden inhibir de forma significativa el crecimiento de células tumorales cuando se administran en un ser humano en una cantidad eficaz. La dosis óptima puede determinarse por los médicos basándose en varios parámetros incluyendo, por ejemplo, edad, sexo, peso, gravedad de la afección a tratar, el principio activo que se administra y la vía de administración. Por ejemplo, una dosis de 1-1000 g de ADN es suficiente para estimular respuestas de linfocitos T tanto auxiliares como citotóxicos.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden administrarse junto con ingredientes farmacéuticamente aceptables adicionales. Tales ingredientes incluyen, por ejemplo, estimuladores del sistema inmune.
Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, simultáneamente o secuencialmente dependiendo de la afección a tratar. Otros tratamientos de cáncer incluyen otros anticuerpos monoclonales, otros agentes quimioterapéuticos, otras técnicas de radioterapia u otra inmunoterapia conocida en la materia. Una aplicación particular de las composiciones de la invención es como un auxiliar para cirugía, es decir para ayudar a reducir el riesgo de reaparición de cáncer después de que se haya retirado un tumor.
Las inyecciones (id) pueden ser la vía primaria para administración terapéutica del ácido nucleico de la presente invención.
Los ácidos nucleicos pueden administrarse de una manera localizada a un sitio tumoral u otro sitio deseado o pueden suministrarse de una manera en la que se dirigen a tumor u otras células.
La dosis de ácido nucleico dependerá de las propiedades del agente empleado, por ejemplo, su actividad de unión y semivida en plasma in vivo, la concentración del polipéptido en la formulación, la vía de administración, el sitio y la tasa de dosificación, la tolerancia clínica del paciente implicado, la afección patológica de la que está aquejado el paciente y similares, como queda dentro de la experiencia del médico. Por ejemplo, se prefieren dosis de 100 g de ácido nucleico por paciente por administración, aunque las dosificaciones pueden variar de aproximadamente 10 g
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
a 1 mg por dosis. Se utilizan diferentes dosificaciones durante una serie de inoculaciones secuenciales; el facultativo puede administrar una inoculación inicial y después reforzar con dosis relativamente más pequeñas de ácido nucleico.
En el presente documento se desvela un procedimiento para obtener por ingeniería genética, epítopos de linfocitos T de antígenos diana en las regiones variables de anticuerpos y el uso de tales anticuerpos obtenidos por ingeniería genética como vacunas para estimular respuestas de linfocitos T tanto auxiliares como citotóxicos.
También se desvela en el presente documento una célula huésped que contiene un ácido nucleico como se desvela en el presente documento. El ácido nucleico de la invención puede integrarse en el genoma (por ejemplo cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma de acuerdo con técnicas convencionales. El ácido nucleico puede estar en un vector extracromosómico dentro de la célula o ser de otra forma de forma identificable heterólogo o ajeno a la célula.
También se desvela en el presente documento un procedimiento, que comprende introducir el ácido nucleico de la invención en una célula huésped. La introducción, que puede (particularmente para introducción in vitro) generalmente denominarse sin limitación “transformación”, puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección de fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposoma y transducción usando retrovirus u otro virus, por ejemplo vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro cálcico, electroporación y transfección usando bacteriófago. Como alternativa, puede emplearse inyección directa del ácido nucleico.
Pueden usarse genes marcadores tales como genes de sensibilidad o resistencia a antibióticos en la identificación de clones que contienen el ácido nucleico de interés, como se conoce bien en la técnica.
La introducción puede seguirse provocando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, por ejemplo cultivando las células huésped (que pueden incluir células de hecho transformadas aunque más probablemente las células serán descendientes de las células transformadas) en condiciones para la expresión del gen, de modo que se produce el polipéptido (o péptido) codificado. Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido líder de señal apropiado, puede secretarse de la célula al medio de cultivo. Tras la producción por expresión, puede aislarse un polipéptido o péptido y/o purificarse de la célula huésped y/o medio de cultivo, según sea el caso, y posteriormente usarse como se desee, por ejemplo en la formulación de una composición que puede incluir uno o más componentes adicionales, tal como una composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes, vehículos o transportadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo véase posteriormente).
En el presente documento se desvela un procedimiento para identificar epítopos de linfocitos T en un antígeno candidato, que comprende:
agotar los linfocitos T reguladores en un animal no humano; inmunizar al animal no humano con un antígeno candidato; y explorar para ver si se induce una respuesta de linfocitos T contra péptidos para epítopos predichos en el antígeno candidato o contra todos los péptidos solapantes posibles dentro del antígeno candidato.
El procedimiento puede llevarse a cabo en un animal no humano, tal como un ratón o una rata. Los linfocitos T reguladores pueden eliminarse en el animal no humano usando anticuerpos anti-CD25, que opcionalmente pueden conjugarse con toxinas tales como Ontak, o por quimioterapia tal como ciclofosfamida que preferentemente destruye linfocitos T reguladores. Una vez que se han agotado los linfocitos T reguladores, el animal no humano puede inmunizarse con ADN que codifica el antígeno candidato o mediante el antígeno candidato en sí mismo. Se prefiere que el antígeno candidato se proporcione como una proteína de fusión de Fc-antígeno. En la etapa de exploración, se identifica el péptido contra el que se estimuló cualquier respuesta de linfocitos T en el animal no humano. Esto puede realizarse in vitro usando una técnica tal como ELISPOT. Si se induce una respuesta de linfocitos T a un epítopo candidato, este epítopo puede usarse para inmunizar un animal no humano. Si este péptido induce una respuesta de linfocitos T, la avidez y frecuencia puede potenciarse codificando el epítopo dentro de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Este procedimiento puede permitir la identificación de epítopos de linfocitos T que se procesan por el inmunoproteasoma.
Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectos con los cambios debidos.
La invención se describirá ahora adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes. Se hace referencia a los siguientes dibujos:
Figura 1; Mapa que representa los elementos del vector de cadena pesada pOrigHIB. La región variable pesada desinmunizada de tipo silvestre del anticuerpo SC100 se clonó usando HindIII/AfeI en fase con la región constante de Fc de IgG1 humano. La región Fc comprende los dominios CH1, CH2, CH3 y la región bisagra. La expresión a alto nivel en células de mamífero se conduce a partir del promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. La poliadenilación de BGH señaliza cadena abajo de la cadena de IgG1 humana HIB
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Orig para asegurar la estabilidad del ARNm y su terminación eficaz. EM7 es un promotor bacteriano que controla la expresión del gen de resistencia a zeocina que permite la selección por antibióticos en E. coli mientras que el promotor temprano de SV40 cadena arriba del gen de resistencia permite la selección en células de mamífero. La poliadenilación de SV40 señaliza cadena abajo del gen de resistencia para dirigir el procesamiento apropiado del extremo 3’ del ARNm zeo. El vector también contiene dentro de su cadena principal el origen ColE1 de replicación para propagación en bacterias. Las secuencias de ADN determinantes de complementariedad se retiraron eficazmente y se cambiaron por sitios de restricción RE1, RE2 y RE3 (FspI, MacI y Srf I respectivamente) de forma sencilla y en combinación.
Figura 2: Mapa que representa los elementos del vector de cadena pesada pOrigLIB. La región variable ligera desinmunizada de tipo silvestre del anticuerpo SC100 se clonó usando BamHI/BsiWI en fase con la región constante kappa humana. La expresión de alto nivel en células de mamífero se conduce desde el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. La poliadenilación de BGH se analiza cadena abajo de la cadena de Orig LIB para asegurar la estabilidad del ARNm y su terminación eficaz. El vector también incluye el origen de replicación ColE1 y el gen de resistencia a antibióticos para ampicilina que permite la propagación y selección en bacterias. Las regiones determinantes de complementariedad se retiraron eficazmente y se cambiaron por los sitios de restricción RE4, RE5 y RE6 (EcoRV, Ssp I y Hpa I FspI, MacI y Srf I respectivamente) de forma sencilla y en combinación.
Figura 3: Secuencia de la cadena pesada quimérica de Immunobody de tipo silvestre. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos en traducción se ilustra para la cadena pesada de IgG1 quimérica de longitud completa. Las localizaciones CDR están dentro de cajas definidas por el esquema de numeración de kabat. El codón de parada se representa por un asterisco rojo. Se destacan los sitios de restricción de HindIII/Afe I utilizados en la transferencia de la región pesada variable.
Figura 4: Secuencia de la cadena kappa quimérica de Immunobody de tipo silvestre. Se ilustran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos en traducción para la cadena de kappa quimérica de longitud completa. Las localizaciones de CDR están dentro de cajas definidas por el esquema numérico de kabat. El codón de parada se representa por un asterisco. Se destacan los sitios de restricción de BamHIlBsiWI utilizados en la transferencia de la región ligera variable.
Figura 5: PCR de extensión solapante
Se retiraron las CDR y se reemplazaron con sitios de restricción únicos por PCR solapante. Los cebadores directos H1, H2, H3, L1, L2 y L3 (Tabla 2) se diseñaron para reemplazar CDR1, 2 y 3 dentro de la región variable de cadena pesada y ligera respectivamente. Cada cebador contenía, localizado de forma central, la secuencia de reconocimiento enzimático única seleccionada desprovista de la secuencia CDR a retirar (sección verde) y flanqueada por 10-20 pb de secuencia de tipo silvestre. Los cebadores directos se usaron en un primer ciclo de PCR junto con un cebador inverso general, huHeClonR o huLiClonR (Tabla 2), que hibrida con los dominios constantes pesados y ligeros humanos dentro de las construcciones de tipo silvestre pOrigHIB y pOrigLIB respectivamente. El fragmento generado no contiene secuencia CDR de tipo silvestre (sección roja), pero se intercambia eficazmente por el sitio de restricción. Para amplificar la región pesada y ligera variable completa, se requiere un segundo ciclo de PCR usando el producto de PCR generado del primer ciclo como un cebador inverso con el cebador directo de CMV general que hibrida con el promotor de CMV dentro de los plásmidos sencillos. Se subclonaron productos de PCR de segundo ciclo en pCR2.1 (Invitrogen) y, después de la confirmación de la secuencia, las regiones variables pesada/ligera (VH y VL) que contenían versiones H1, H2, H3, L1, L2 y L3 de forma sencilla, en combinación y juntas se insertaron de nuevo en las construcciones sencillas pOrigHIB y pOrigLIB, intercambiando las regiones de tipo silvestre usando HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI respectivamente.
Figura 6: Secuencia de la región variable de cadena pesada de ImmunoBody. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región variable pesada en la que se han reemplazado CDR con su sitio de enzima correspondiente H1, H2 y H3, de forma sencilla, en combinación y juntos. Se destacan los sitios de enzima de restricción únicos. CDR1, 2 y 3 se reemplazaron con FspI, MscI y SrfI respectivamente.
Figura 7: Secuencia de la región variable de cadena kappa de ImmunoBody. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región variable pesada en la que se han reemplazado las CDR con su sitio de enzima correspondiente L1, L2 y L3, de forma sencilla, en combinación y juntos. Se destacan los sitios de enzima de restricción únicos. CDR1, 2 y 3 se reemplazaron con EcoRV, SspI y HpaI respectivamente.
Figura 8: Mapa que representa los elementos del vector de expresión doble pDCOrig. Una vez que todos los epítopos se han incorporado en los sitios pesados variables y ligeros variables dentro de los vectores sencillos, se transfieren al vector de expresión doble utilizando como se destaca HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI en fase con sus regiones constantes humanas respectivas. La región Fc de la cadena pesada comprende los dominios CH1, CH2, CH3 y la región bisagra. La expresión de alto nivel de las cadenas tanto pesadas como ligeras en células de mamífero se conduce desde el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. La poliadenilación de BGH señaliza cadena debajo de ambas cadenas para asegurar la estabilidad del ARNm y su terminación
10
15
20
25
30
35
40
45
50
eficaz. EM7 es un promotor bacteriano que controla la expresión del gen de resistencia a zeocina permitiendo la selección por antibióticos en E. coli mientras que el promotor temprano de SV40 cadena arriba del gen de resistencia permite la selección en células de mamífero. La poliadenilación de SV40 señaliza cadena abajo del gen de resistencia para dirigir el procesamiento apropiado del extremo 3’ del ARNm zeo. El vector también contiene dentro de su cadena principal el origen ColE1 de replicación para propagación en bacterias.
Figura 9: Secuencia de la cadena pesada de IB15 de immunobody que contiene un codón de parada que evita la síntesis de la región Fc.
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada quimérica, pDCOrig IB15 CH1 parada. Se insertó un codón de parada por mutagénesis dirigida después del dominio CH1 de la región constante de Fc de IgG1 humana como se representa por un asterisco. Los nucleótidos y aminoácidos en negrita representan el domino CH1. Los aminoácidos dentro de cajas representan el epítopo GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo TRP2 en H2 (SVYDFFVWL). Se destacan los sitios de restricción de HindIII/Afe I utilizados en la transferencia de la región pesada variable de la construcción sencilla.
Figura 10: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región variable pesada de DCIB15 sin un líder.
El líder se retira por PCR usando el cebador directo pOrig pesado sin líder con el cebador inverso huHeClonR (Tabla 2) que se une al dominio CH1 de IgG1 humana reamplificando eficazmente la región variable pesada (VH). Después de confirmación de secuencia, la región VH sin líder se clona de nuevo en la construcción de expresión doble DCIB15 usando HindII/AfeI en fase con la región constante de IgG1 humana. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo TRP2 en H2 (SVYDFFVWL). Los sitios de restricción HindIII/Afe I utilizado en la transferencia de la región variable pesada se destacan.
Figura 11: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región variable kappa de DCIB15 sin un líder.
El líder se retiró por PCR usando el cebador directo pOrig ligero sin líder, reamplificando el cebador inverso huLiClonR (Tabla 2) la región variable ligera (VL). Después de la confirmación de secuencia, la región VL sin líder se clona de nuevo en la construcción de expresión doble DCIB15 usando BamHI/BsiWI en fase con la región constante kappa humana. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción de BamHI/BsiWII utilizados en la transferencia de la región ligera variable.
Figura 12: Secuencia de región constante de IgG2 humana
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región constante de IgG2 humana pesada amplificada. Se destacan los sitios de restricción AfeI y SapI utilizados en la transferencia y reemplazo de la región constante de huigG1 en el vector de expresión doble DCIB15.
Figura 13: Secuencia de región constante de IgG3 humana
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región constante de IgG2 humana pesada amplificada. Se destacan los sitios de restricción de AfeI y SapI utilizados en la transferencia y reemplazo de la región constante de huigG1 en el vector de expresión doble DCIB15
Figura 14: Isotipos humanos del vector de expresión doble de immunobody.
A Mapa del vector de expresión doble pDCOrigIB15 huigG2. B Mapa del vector de expresión doble pDCOrigIB15huigG3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región pesada y ligera variable.
Figura 15: Secuencia de cadena pesada de DCIB66 que contiene el motivo G2. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada quimérica. Los aminoácidos E233 L234 L235 dentro de un motivo de unión crítico para la interacción con el FcyR1 de alta afinidad (CDR64) se sustituyeron con P233 V234 A235 de IgG2 humana destacada en negrita dentro de una caja. Otros aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL). Los sitios AgeI/AhdI destacados se usaron en la transferencia de la sección que contiene las sustituciones a pDCOrigIB15 huigG1. Los sitios de restricción HindIII/AfeI utilizados en la transferencia de la región pesada variable se representan en negrita.
Figura 16: Secuencia de cadena pesada de DCIB67 que contiene el motivo de unión G1. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada quimérica. Los aminoácidos P233 V234 A235 dentro de la región constante de IgG2 humana se sustituyeron con el motivo de unión crítico para interacción con el FcyR1 de alta afinidad (CDR64) E233 L234 L235 G236 de IgG1 humana destacadas en negrita dentro de una caja. Otros aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL).
imagen8
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
sencilla.
Figura 24: Secuencia de DCIB32 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H3 y el epítopo de HepB CD4 en L3 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 25: Secuencia de DCIB36 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en L3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 26: Secuencia de DCIB48 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 27: Secuencia de DCIB49 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) en H3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 28: Secuencia de DCIB52 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) en H3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 29: Secuencia de DCIB54 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) en H1. El epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 30: Secuencia de DCIB18 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 31: los epítopos de CTL incorporados en el armazón de ImmunoBody se procesan y se presentan para inducir una respuesta inmunitaria in vivo.
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 con una construcción de ImmunoBody que contenía el epítopo de TRP2 en CDR H2 y el epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB18). El día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2, péptido auxiliar de HepB y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. B, se ensayaron esplenocitos de los ratones inmunizados con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración creciente de péptido en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de la función efectora máxima. C, se agotaron los linfocitos T CD8 de esplenocitos de ratones inmunizados y se analizaron frente a péptido TRP2, péptido auxiliar HepB y un control de medio con respecto a la presencia de respuestas específicas de epítopo en el ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. D, citotoxicidad de esplenocitos de ratones inmunizados en un ensayo de liberación de 51Cr de cuatro horas
15
25
35
45
55
frente a las líneas celulares de melanoma B16F10, B16F10 IFN y B16F10 siKb después de 6 días de estimulación con péptido TRP2 in vitro. E, se inmunizaron ratones transgénicos C57BI/6 o HLA-DR4 los días 0, 7 y 14 con ADN de ImmunoBody (DCIB15, DCIB31, DCIB32, DCIB36, DCIB48, DCIB52 y DOB54). El día 19 los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2 y control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. F, se ensayaron los esplenocitos de ratones inmunizados con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración creciente de péptido en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima. G, se inmunizaron ratones transgénicos C57BI/6 o HLA-DR4 los días 0, 7 y 14 con ADN de ImmunoBody (DCIB15, DCIB31, DCIB32, DCIB36, DCIB48, DCIB52 y DOB54). El día 19 los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido auxiliar HepB (DOB15, DCIB49 y DCIB52) o péptido auxiliar gp 100DR4 (DCIB48 y DCIB54) y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 32: La inmunización con ADN de ImmunoBody es mejor que la inmunización con péptidos o inmunización con antígeno completo.
A, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB18) con inmunización s.c. con epítopo peptídico en adyuvante incompleto de Freund o inmunización con un ADN que expresa antígeno de TRP2. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos mediante ensayo imagen9
de elispot de IFN frente a péptido TRP2 (■), péptido auxiliar HepB ( ) y un control de medios (□). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. B, se ensayaron los esplenocitos de ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody () y péptido (♦) con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración creciente de péptido en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima. C, citotoxicidad de esplenocitos de ratones inmunizados en un ensayo de liberación de imagen951Cr de 4 horas frente
a las líneas celulares de melanoma B16F10 (■), B16F10 IFN ( ) y B16F10 siKb (□) después de 6 días de estimulación con péptido TRP2 in vitro. D, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB18) con la inmunización con DC pulsadas con péptido TRP2. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFN frente a cantidades de titulación de péptido TRP2. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima. E, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB18) con la inmunización con DC pulsadas con péptido TRP2. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 los esplenocitos se estimularon in vitro con blastos de LPS pulsados con péptido TRP2. Seis días después de la estimulación se evaluaron las líneas de CTL mediante ensayo de liberación de cromo con respecto a la capacidad para lisar líneas de melanoma B16F10 o B16F10 siKb. Las respuestas se miden como % de citotoxicidad. F, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB24) con la inmunización con péptido SIINFEKL. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFN frente a péptido SIINFEKL y un péptido de control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. G, se comparó la inmunización por ADN de ImmunoBody (DCIB15) con la inmunización con péptido gp100 210M. Se inmunizaron ratones HHDII los días 0,7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFN frente a cantidades de titulación de péptido gp100 210M y un control. Se miden las respuestas de control como puntos/millón de esplenocitos. H, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB24) con la inmunización con péptido SIINFEKL. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFN frente a cantidades de titulación de péptido SIINFEKL. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima. I, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB15) con la inmunización con péptido gp100 210M. Se inmunizaron ratones HHDII los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFN frente a cantidades de titulación de péptido gp100 210m. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
Figura 33: Secuencia de DCIB21 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de HepB S Ag TRP2 en H2 (IPQSLDSWWTSL) y el epítopo Flu HA CD4 restringido con I-Ad en L1 (FERFEIFPLE). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI
imagen10
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Figura 39: Secuencia de DCIB37 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables ligeras y pesadas clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100 F7L en H1 (TITDQVPLSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 40: Secuencia de DCIB40 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100 F71 en H1 (TITDQVPISV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 41: Secuencia de DCIB41 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de tipo silvestre de GP100 en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 42: Secuencia de DCIB42 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100 F7Y en H1 (TITDQVPYSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 43: Secuencia de DCIB43 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100 V5L en H1 (TITDQLPFSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción de HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 44: La modificación en los restos no de anclaje puede potenciar la inmunogenicidad de epítopos. Se inmunizaron ratones HHDII los días 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían epítopos de gp100 modificados en la región CDR H1 (DCIB37, DCIB40, DCIB41, DCIB42 y DCIB43). El día 19, se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFN frente a péptido epitópico de tipo silvestre de gp100 y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 45: Secuencia de DCIB35 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV), el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL) y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en L1 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 46: Pueden procesarse múltiples respuestas auxiliares de CD4 y presentarse para inducir una respuesta inmunitaria in vivo.
A. Se inmunizaron ratones HHDII o C57B1/6 los días 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de HepB CD4 restringido con I-Ab en la región CDR L1 (DCIB15). B, se inmunizaron ratones Balb/c los días 0, 7 y 14 con construcción de ImmunoBody que contenían el epítopo de Flu HA CD4 restringido con I-Ad en la región CDR L1 (DCIB21). C, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-DR4 los días 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de gp100 CD4 restringido con HLA-DR4 en la CDR L1 (DCIB35). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente al péptido correspondiente, un péptido irrelevante y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
D. Se inmunizaron ratones transgénicos HLJ-DR4 los días 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de gp100 CD4 restringido con HLA-CD4 en la CDR L1 (DCIB35), en la CDR H3 (DCIB54) y en la CDR L3 ((DCIB50).). El día 19, se analizaron los esplenocitos por ensayo elispot de IFN frente al péptido correspondiente, un péptido irrelevante y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 47: Secuencia de DCIB50
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M (TIMDQVPFSV) en H1, el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido con HLA-DR4 (WNRQLYPEWTEAQRLD) en L3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 48: Las respuestas de linfocitos T CD8 dependen parcialmente de la cadena pesada secretada pero las respuestas auxiliares no requieren cadena ligera secretada.
A, se inmunizaron ratones HHDII el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la secuencia líder en la cadena pesada, iii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la secuencia líder en la cadena ligera. El día 19, los esplenocitos se imagen9
analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptidos gp100 (■) y HepB CD4 ( ) y un control de medio (□). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. B, determinación de cadena pesada, cadena ligera e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S mediante ELISA de tipo sándwich. Las placas se revistieron con un anticuerpo específico anti Fc humano o anticuerpo anti cadena kappa humana. Para detectar cadena pesada se usó un anticuerpo de HRP específico anti Fc de IgG humana en combinación con el anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar ImmunoBody se usó un anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana en combinación con anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar cadena ligera se usó anticuerpo de HRP específico de anti cadena kappa humana en combinación con el anticuerpo específico anti cadena kappa humana. C, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la secuencia líder en la cadena pesada. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. D, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la secuencia líder en la cadena pesada. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido auxiliar HepB. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 49: La región Fc de ImmunoBody es beneficiosa para establecer una respuesta inmunitaria eficaz.
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la región Fc. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2
), un control de medio (□), la línea de melanoma B16F10 (■) y la línea celular de control negativo B16F10
). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. B, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la región Fc. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. C, los mismos ratones se analizaron con respecto a respuestas específicas para el epítopo auxiliar HepB. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. D, los esplenocitos de ratones inmunizados con DCIB15 o DCIB15 sin la región Fc (DCIB15 FcStop) se ensayaron con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima. E, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 de IgG humana (DCIB15), ii) la misma construcción con región constante de IgG2 humana (DCIB33), iii) la misma construcción con región constante de IgG3 humana (DCIB65), iv) la misma construcción con el motivo de unión a IgG1 humana reemplazado con el motivo de unión de IgG2 humana (DCIB66) y v) DCIB33 con el motivo de unión reemplazado por el motivo de IgG1 humana (DCIB67). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNimagen9 frente a péptido TRP2 (■), un control de medio (□) y el péptido
auxiliar HepB ( ). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. F, determinación de cadena pesada, cadena ligera e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes
imagen11
15
25
35
45
55
de CHO-S (DCIB15, DCIB33, DCIB65, DCIB66 y DCIB67) por ELISA de tipo sándwich. Las placas se revistieron con un anticuerpo específico anti Fe humano o anticuerpo anti cadena kappa humana. Para detectar cadena pesada se usó un anticuerpo de HRP específico de anti Fc de IgG humana en combinación con el anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar ImmunoBody intacto se usó anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana en combinación con anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar cadena ligera se usó anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana en combinación con el anticuerpo especifico anti cadena kappa humana. G, determinación de ImmunoBody de cadena pesada de sobrenadante de CHO-S transfectadas con DCIB53 por ELISA de tipo sándwich. Las placas se revistieron con un anticuerpo específico anti Fc de ratón. Para detectar cadena pesada se usó un anticuerpo de HRP específico anti IgG2a de ratón.
Figura 50: la inmunización con ImmunoBody potencia las respuestas inmunitarias y supera la regulación observada de antígeno completo.
A, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 (HHDII) el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody DCIB15 o antígeno gp100 completo en el vector pcDNA3. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido gp100 o control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. B, en los ratones C57BI/6 se agotaron las células positivas para CD25 por inyección de 400 g i.p. de anticuerpo anti-CD25 (PC61). Tanto los ratones empobrecidos para CD25 como los animales no empobrecidos se inmunizaron posteriormente el día 4, 11 y 18 con construcciones de ADN de ImmunoBody DCIB15 o antígeno TRP2 completo en el vector pOrig. El día 23, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2 o control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. C y D, los ratones HHDII se dejaron sin tratar (c) o se trataron con 400 g de mAb PC61 i.p., (d). 4 días después, todos los ratones se inmunizaron con la construcción de ADNc Tie2 C200HFc. Las inmunizaciones de ADN se repitieron a intervalos de 7 días para un total de 3 inmunizaciones. 6 días después de la inmunización final, los esplenocitos se recogieron y se volvieron a estimular en un ensayo de ELISPOT de IFN ex vivo con 1 g/ml de cada uno de los epítopos de CTL predichos de Tie-2. Las barras indican la media de los valores por triplicado para cada ratón individual, normalizados a controles de fondo, representando las barras de error la desviación típica de la media. E y F, los ratones HHDII se dejaron sin tratar (e) (n = 3) o se trataron (f) (n = 2) con 400 g de anticuerpo PC61 i.p. Después de 4 días, todos los ratones se inmunizaron con 100 g de péptido Z12 y 100 g de péptido Z48, mezclados 1:1 en IFA (s.c). Se administraron inmunizaciones de péptidos repetidas 7 días después de la primera inmunización con péptido. Los esplenocitos se recogieron 14 días después de la inmunización final y se volvieron a estimular con péptido Z12 1 g/ml (barras negras) o solamente medio (barras abiertas) en un ensayo de elispot de IFN. Las barras indican la media de los valores por triplicado representando las barras de error la desviación típica de la media. G, se inmunizaron ratones HHDII con 100 g de péptido Z12 mezclado 1:1 en IFA (s.c). Se administraron inmunizaciones con péptidos repetidas los días 7 y 14 días después de la primera inmunización con péptido. Los esplenocitos se recogieron 7 días después de la inmunización final y se analizaron con respecto a la presencia de respuestas específicas de epítopo a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden de ratones individuales como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima. H, se inmunizaron ratones HHDII con construcción de ADN de ImmunoBody DCIB71 mediante pistola génica los días 0, 7 y 14. Se recogieron los esplenocitos 7 días después de la inmunización final y se analizaron con respecto a la presencia de respuestas específicas de epítopo a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden de ratones individuales como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
Figura 51: Secuencia de DCIB71 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de Tie-2 Z12 (ILINSLPLV) en H1 y el epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) en L1. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 52: Secuencia de DCIB72 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesada y ligera variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo Tie-2 Z12 (ILINSLPLV) en H2 y el epítopo HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) en L1. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 53: El papel de Fc xenogénico al proporcionar ayuda de linfocitos T y el requisito de ayuda de linfocitos T específica de antígeno.
15
25
35
45
55
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 o HHDII el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody de cadena pesada que contenían epítopo de gp100 en CDR H1 o epítopo de TRP2 en CDR H2 (IB17 e IB18 respectivamente). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido gp100 o péptido TRP2 y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. B, se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados con cadena pesada de ImmunoBody que contenía epítopo de TRP2 en CDR H2 con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima. C, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 de IgG1 humana (DCIB15) o epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 con región constante de IgG2a murina (DCI853). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2, péptido auxiliar HepB y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. D, se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados con DCIB15 u OCIB53 con respecto a la avidez para el epítopo TRP2 midiendo respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima. E, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-DR4 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían epítopo de gp100DR4 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de gp100DR7 en CDR H3 de IgG1 humana (DCIB54) o epítopo de gp1 GODR4 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de gp100DR7 en CDR H3 con región constante de IgG2a murina (OCIB64). El día 19, los esplenocitos se analizaron con ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2, péptido auxiliar gp100DR4 y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos. F, se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados con OCIB54 o DCIB64 con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
Figura 54: Secuencia de OCIB53 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas de longitud completa pesadas y ligeras murinas dentro del vector de expresión pDCOrig moigG2a. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV), el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL) en L1. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 55: Secuencia de DCIB64 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas de longitud completa murinas pesadas y ligeras dentro del vector de expresión pDCOrig moigG2a. El codón de parada se representa por un asterisco. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-OR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) en H1, el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 56: El procesamiento de inmunoproteasoma es importante en la generación de respuestas de epítopos dentro de construcciones de ImmunoBody. Se inmunizaron ratones HHDII el día 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de
gp100209-217
en CDR H1 (DCIB41) o la versión modificada gp100210M en CDR H1 (DCIB15). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido gp100209-217 o péptido gp10021OM y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 57: Diferentes procedimientos de inmunización son eficaces en la inducción de respuestas inmunitarias de vacuna de ImmunoBody.
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 con ADN de ImmunoBody (DCIB15) mediante pistola génica, i.m. +/electroporación o i.d. +/-electroporación los días 0, 7 y 14. El día 19, los esplenocitos se analizaron mediante ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2, péptido auxiliar HepB y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B. Se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados por diferentes vías con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración creciente de péptido en ensayo de elispot de IFN. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
Figura 58: La inmunización con ImmunoBody induce despigmentación de tipo vitíligo y protege contra presentación de tumores.
15
25
35
45
55
A, los ratones C57BI/6 inmunizados con ADN de ImmunoBody que contiene el epítopo de TRP2 en CDR H2 y el epítopo deHepB CD4 en CDR L1 (DCIB18) demuestran despigmentación en el crecimiento capilar en el sitio de inmunización. B, se presentó a ratones inmunizados C57BI/6 entre la 3ª y 4ª inmunizaciones 2x104 células B16F10 IFN i.v. Se evaluó la carga tumoral en los pulmones a los 49 días después de la presentación tumoral. La carga tumoral se expresa como un área de tumor media como un porcentaje del área pulmonar total. Se presentó a los ratones inmunizados 7 días después de la inmunización final 2x104 células B16F10 IFN s.c. El tamaño del tumor se midió a intervalos de 3-4 días y los ratones se sacrificaron una vez que el crecimiento tumoral excedió el límite. C, se evaluó el tamaño del tumor el día 46 después de la inyección de tumor. D, supervivencia.
Figura 59: La inmunización con ImmunoBody retarda significativamente el crecimiento tumoral.
A, se inyectó a ratones C57B/6 2x104 células B16F10 s.c. Cuatro días después de la inyección del tumor se inmunizó a los ratones con ADN de ImmunoBody DCIB52. Se realizaron inmunizaciones de repetición los días 11 y 18 después de la inyección del tumor. La carga tumoral se analizó a intervalos de 3-4 días y los ratones se sacrificaron una vez que el crecimiento tumoral excedió el límite máximo permitido. Se representó el volumen tumoral a lo largo del tiempo. B, se inyectó a ratones C57B/6 2x104 células B16F10 IFN s.c. Catorce días después de la inyección del tumor se inmunizó a los ratones con ADN de ImmunoBody DCIB52. Se realizaron inmunizaciones repetidas los días 21 y 28 después de la inyección del tumor. La carga tumoral se analizó a intervalos de 3-4 días y se sacrificó a los ratones una vez que el crecimiento tumoral excedía el límite máximo permitido. El volumen tumoral se muestra el día 47 después del implante del tumor. C, se inyectó a ratones C57B/6 2x104 células B16F10 s.c y anticuerpo anti-CD25 i.p. cuando fuera apropiado. Cuatro días después de la inyección de tumor se inmunizó a los ratones con ADN de ImmunoBody DCIB52 o ADN de ImmunoBody de control. Se realizaron inmunizaciones repetidas los días 11 y 18 después de la inyección del tumor. La inmunización el día 11 se combinó con la inyección de anticuerpo anti-CTLa-4 i.p. cuando fue apropiado. Se analizó la carga tumoral a intervalos de 3-4 días y se sacrificó a los ratones una vez que el crecimiento tumoral excedió el límite máximo permitido. Se representó el volumen tumoral a lo largo del tiempo.
Figura 60: Secuencia de DCIB68 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-OR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) en H1 y L3, los epítopos de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 y L1 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 61: Pueden generarse respuestas inmunitarias a partir de construcciones de ImmunoBody expresadas de diferentes cadenas principales de vector. Se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían epítopo de gp100DR4 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de gp100DR7 en CDR H3 de IgG1 humana (DCIB54, B1-3) una construcción equivalente en el vector pVax (VaxDCIB54. C1-3). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN frente a péptido TRP2 y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Ejemplos
Procedimientos
Generación de vectores de ADN
Las regiones variables pesadas y ligeras murinas desinmunizadas del clon de SC100 VHd VKb (documento WO01/88138) dentro de los vectores pSVgptHuigG1 y pSVhygHuCk (Biovation Ltd) se amplificaron por PCR. Los productos de PCR de la región VH y VL se clonaron en fase con las regiones constantes kappa e IgG1 humanas usando sitios HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI para producir las construcciones de cadena sencilla pOrigHIB y pOrigLIB (véase Figuras 1 y 2). La secuencia de la cadena kappa y pesada quimérica de longitud completa se confirmó por el procedimiento de terminación de cadena de dideoxi (Sanger y col, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1977; 74: 5463-7). Se muestran las secuencias proteicas traducidas y de ADN para la cadena pesada y ligera quimérica en las Figuras 3 y 4 respectivamente. Se representan las localizaciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDR).
Con la excepción de la región CDR2 pesada que conserva seis aminoácidos, las CDR de las cadenas pesadas y ligeras se retiraron completamente y se intercambiaron por sitios de enzima de restricción únicos. Esto se consiguió mediante examinación cuidadosa de las regiones a cada lado de la secuencia para una retirada que permitirá que se
imagen12
Las CDR dentro de la región pesada y ligera variable se han reemplazado con su sitio enzimático correspondiente H1, H2, H3, L1, L2 y L3 de forma sencilla, en combinación y juntas (Figura 6 y 7). Las diferentes versiones se insertaron después en pOrig HIB y pOrigLIB usando HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI con reemplazo directo de las regiones VH y VL de SC100 desinmunizadas de tipo silvestre parentales. Esto permite la generación de moléculas que contienen epítopos sencillos o múltiples (del mismo o diferentes antígenos).
Tabla 2 -Cebadores
Oligonucleótido
Secuencia
H1
Fspl 5’-CCT GAG AAT GTC CTG CTG CGC AGG CTC CGG GGA AG
H2
Mscl 5’CAT TGG TAG TGG TGG CCA TTT CCA GAG AC-3’
H3
SrfI 5’CCG TGT ATT ACT GTG CCC GGG CCA AGG AAC CAC GGT C-3’
L1
EcoRV 5’-GGA GCC AGC CTC GAT ATC TGC AGA AAC CAG GC-3’
L2
SspI 5’CCA CAG CTC CTA ATA TTC AGT GGC AGT GGA TC-3’
L3
Hpal 5’-GCT GAG GAT ACC GGA GTT AAC CAA GGT GGA AAT C-3’
huHeCronR
5 CGC CTG AGT TCC ACG ACA CC-3’
huLiClonR
5’-CAG GCA CAC AAC AGA GGC-3’
Directo de CMV
5’-GGC GTG GAT AGC GGT TTG AC-3’
OrigstophuHeCH 1 Dir
5’-CCA AGG TTG ACA AGA AAG TTT GAC CCA AAT CTT GTG ACA
OrigstophuHeCH 1 Inv
5’-GAG TTT TGT CAC AAGATT TGG GTC AAA CTT TCT TGT CCA OCT TGG-3’
pOrig ligero sin líder Dir
5’-AGG ATC CAC CAT GGA TGT GTT GAT GAC CC-3’
pOrig pesado sin líder Dir
5’-AAA GCT TAT GCA GGT GCA GCT GGT G-3’
huigG3inv2
5’-ATC GAT ATC ATT TAC CCG GAG ACA GG-3’
IgG3hutor2
5’-ACT GTC TCC AGC GCT TCC ACC AAG-3’
IgG2 dir
5’-AGT CAC CGT TTC CAG CGC TTC CAC-3’
IgG2 inv
5’-AGT GGA TAT CAT TTA CCC GGA GAC AGG-3’
HIBF
5’-AAC AGT CTG AGG GOT GAG GA 3’
huigG1PVA INV
5’-A GAC TGA CGG TCC CCC CGC GAC TGG AGG TGC TGG-3’
HulgG2ELLGInv
5’-A GAC TGA CGG TCC TCC TAA CAG TTC TGG TGC TGG-3’
Sv40premDIR
5’-A GCT AGC ATC AGC ACG TGT TGA CAA TTA ATC ATC-3’
SV40precnINV
5’-ACC GAT TCC GAA GCC CAA CCT TTC ATA G-3’
migG2aC1Afe1F2
5’-TTT ACA GCG CTA AAA CAA CAG CCC CAT CGG TC-3’
(Continuación)
Oligonucleótido
Secuencia
migG2aXbaRA
5’-TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGT CCG GGA GAA GCT C-3’
MoLC1 BsiF1
5’-TTT CGT ACG GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC-3’
MoLCXhoR1
5’-TTT CTC GAG TCA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC-3’
MolgG2BamHI Dir
5’-CC TTG ACC TGG AAC TCT GGT TCC CTG TCC AGT GGT G-3’
MolgG2BamHI Inv
5’-C ACC ACT GGA CAG GGA ACC AGA GTT CCA GGT CAA GG-3’
MoigG2xhol Dir
5’-GC AGC TGA GTG ACT GTA ACT TCG AGC ACC TGG CCC AGC-3’
MaigG2Xhol Inv
5’-GCT GGG CCA GGT GCT CGA AGT TAC AGT CAC TGA GCT GC-3’
wtkappavarL1dir
5’-C TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC CTG GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TATTTA GAA TGG T-3’
wtkappavarL1inv
5’A CCA TTC TAA ATA GGT GTT TCC ATT ACT ATG TAC CAG GCT CTG ACT AGA TCT GCA AGA G-3'
Directo de TRP2 murino
5’-TTT CTA AGC TTA TGG GCC TTG TGG GAT GGG GGC TTC-3’
Inverso de TRP2 murino
5’-TTT CTG ATA TCT CAG GCT TCC TCC GTG TAT CTC TTG C-3’
Directo de GP100
5’-TTT CTG ATA TCA TGG GTG TCC AGA GAA GGA GOT TC-3’
Inverso de Gp100
5’-TTT CTC TCG AGA CAG ACC TGC TGT CCA CTG AGG AGC-3’
Inserción de epítopos antigénicos en sitios COR de vectores de cadena sencilla.
Se enumeran varios epítopos de CTL CD8 y auxiliares CD4 en la Tabla, 3, aunque puede insertarse fácilmente 5 cualquier epítopo en cualquiera de los sitios dentro de los vectores de cadena sencilla. Por ejemplo, la inserción del epítopo de TRP2 en el sitio H2 del vector pOrigHIB se consiguió como sigue.
Se diseñaron oligonucleótidos complementarios para codificar una secuencia de nucleótidos que expresa en la traducción el epítopo. La secuencia de ADN que codifica el epitomo se flanqueó por los nucleótidos de CDR correspondientes para asegurar que, al traducir, los aminoácidos se conservaran y que la secuencia permaneciera
10 en fase (véase Tabla 1). Los cebadores se enviaron para síntesis (MWG) y se fosforilaron en el extremo 5’.
imagen13
Se resuspendieron los oligonucleótidos complementarios a una concentración final de 1 mg/ml en agua doblemente destilada estéril y se ligaron entre sí preparando una reacción con 10 l de cada cebador compuesta a un volumen final de 50 l con tampón TE. La reacción se sometió a ciclo a 95 ºC durante 5 minutos (0,1 ºC/segundo), 72 ºC
15 durante 20 minutos (0,1 ºC/segundo), 55 ºC durante 20 minutos y después se mantuvo a 4 ºC.
Para inserción en el sitio H2, el vector pOrigHlB H2 y/o pOrigHlB H1H2 se linealizó preparando un producto de digestión de restricción con MseI (dependiente de CDR para utilizarse para inserción de epítopo) y se incubó durante una noche a 37 ºC. El producto de digestión se sometió a electroforesis en un gel de agarosa 1,5 % y el vector cortado se purificó por extracción en gel. Para evitar la autoligación del vector linealizado, se retiraron los grupos 20 fosfato de los extremos 5’ del vector por tratamiento e incubación durante una noche a 37 ºC con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP) 5 unidades, 10 l de tampón NEB 3 10 x compuesto a un volumen final de 100 l con agua destilada estéril. El vector desfosforilado se purificó y se prepararon ligaciones con diluciones puras, 1/100 y 1/200 de los oligonucleótidos hibridados para donar directamente en el sitio H2 usando técnicas convencionales. Las inserciones de epítopos se confirmaron secuenciando dentro de los vectores sencillos usando el cebador universal
25 de CMV directo.
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Generación de pDcOrig IB15 CH1 stop
Se incorpora un codón de parada después del dominio CH1 de la región constante de IgG1 humana dentro de la construcción pOCOrig IB15 usando el kit de mutagénesis dirigida Quik change (Stratagene) y los cebadores oligonucleotídicos complementarios directo origstophuHeCH1 e inverso OrigstophuHeCH1 (véase Tabla 2) como se indica por el fabricante. La incorporación de codón de parada se confirma por secuenciación de ADN (Figura 9).
Retirada de secuencias líder de pDCOrig IB15
Para retirar la secuencia líder de la cadena pesada y ligera del vector pDCOrig IB15, se prepararon PCR usando el molde pDCOrig IB15 con los cebadores directos ligero pOrig sin líder y pesado pOrig sin líder junto con los cebadores inversos huHeClonR y hiLiClonR respectivamente (Tabla 2). Los fragmentos amplificados se ligaron con TA TOPO en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y los clones se confirmaron por secuenciación. Las regiones de IB15 tanto VH como VL desprovistas de líder se clonaron de nuevo en pDCOrig IB15 usando sitios HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI respectivamente. La secuencia de ADN y traducción para las regiones VH y VL se muestran en las Figuras 10 y 11 respectivamente.
Construcción de isotipos IgG2 e IgG3 humanos del vector de expresión doble Immunobody™ pDCOrig
La región constante de IgG3 humana se amplificó por PCR usando los cebadores directo e inverso huigg3 (Tabla 2) incorporando un AfeI y EcoRV respectivamente con el molde pOTB7huigG3 (clon de imagen 4566267 MGC 45809). De forma similar la región constante de IgG2 humana se amplificó usando cebadores IgG2Dir e IgG2Inv (Tabla 2) con el molde pTOB7 huigG2 (clon de imagen 6281452 MGC 71314).
Ambos fragmentos se ligaron con TOPO en pCR2.1 y la secuencia se confirmó (Figuras 12 y 13). La región constante huigG1 dentro de la construcción pDCOrigIB15 se reemplazó eficazmente con tanto huigG2 como huigG3 clonados en fase con la variable pesada usando sitios Afel y Sapl para generar pDCOrigIB15 huigG2 y pDCOrigIB15 huigG3 (Figura14). Ambos vectores conservan los mismos sitios de restricción únicos en el punto de unión de la región variable/constante. Esto permite un intercambio fácil de regiones variables entre todos los vectores de Immunobody mono y bicatenarios de isotipo humano.
Mutación de IgG1 Fcy humano y dominio de unión a Receptor de IgG2 humano
Para sustituir los aminoácidos E233 L234 L235 del motivo de unión huigG1 dentro del dominio CH2 con P233 V234 A235 de huigG2, se reamplificó una sección corta por PCR incorporando la mutación. Se utilizó el cebador inverso huigG1 PVA Inv que contenía las sustituciones y el sitio de restricción constitutivo AhdI con el cebador directo HIBF (Tabla 2) y el molde pDCOrig IB15. El fragmento resultante se ligó en el vector pCR2.1 (Invitrogen). Después de confirmación de secuencia, la secuencia de tipo silvestre se reemplazó eficazmente con la sección que contenía las mutaciones insertando en los sitios de corte sencillo AgeI/AhdI del plásmido pDCOrig IB15 huigG1 (Figura 15).
Los aminoácidos P233 V234 A235 dentro del dominio constante de huigG2 de la construcción pDCOrig IB15 huigG2 también se sustituyeron con el motivo de unión a huigG1 ELLG. Como antes, se utilizó el cebador inverso huigG2ELLGInv (Tabla 2) que contenía las sustituciones y el sitio de restricción constitutivo AhdI con el cebador directo HIBF y la IgG2 humana del molde pDCOrig IB15. El fragmento se ligó con TA TOPO en el vector pCR2.1. Después de confirmación de secuencia, la secuencia de tipo silvestre se reemplazó de nuevo con la sección que contenía el motivo de unión a huigG1 usando sitios Agel/Ahdl del plásmido pDCOrig IB15 huigG2 (Figura 16).
Generación de plásmidos de IgG2a murinos de pDCOrig DCIB53 y DCIB63
Para construir una versión de IgG2a murina del vector de doble expresión pDCOrig, se sintetizó ADNc de ARN total aislado de la línea celular de hibridoma 337. Para amplificación de la región constante de IgG2a murina, se usó el cebador directo migG2aC1 AfeF2 que contenía sitio de restricción Afe1 junto con el cebador inverso migG2aXbaRA que albergaba un sitio XbaI después del codón de parada. El fragmento de PCR se ligó con TOPO en el vector pCR2.1. Después de conformación de secuencia, la región constante de IgG2a murina se escindió y se clonó en fase con la región variable pesada murina en los sitios Afe1/XbaI del vector pOrigHIB reemplazando eficazmente IgG1 humana. Se retiró un sitio BamHI y XhoI sin alterar, en la traducción, la secuencia de aminoácidos de la región constante de IgG2a murina, secuencialmente por mutagénesis dirigida usando kit de mutagénesis dirigida Quik change (Stratagene) y los cebadores complementarios MoigG2BamHIDIR e INV, MoigG2XhoIDIR e INV respectivamente. Esto generó el vector de ImmunoBody de cadena sencilla pMoOrigHIB (Figura 17A). Se transfirió una sección de pMoOrigHIB que contenía la región constante de MoigG2a de la construcción sencilla al vector de doble expresión pDCOrig IB15 en fase con la región variable pesada murina usando AfeI y AvrII de corte sencillo localizados en el promotor de SV40 para generar el vector intermedio pDCOrigIB15MoigG2a hukappa que aún contenía una región kappa humana.
Para amplificación de la región kappa murina, se usó el ADNc como un molde con los cebadores MoLC1BsiF1 que contenía un sitio BsiWI y MoLCXhol incorporando un sitio XhoI después del codón de parada. El fragmento amplificado se clonó por TOPO en el vector pCR2.1 como antes. La región kappa murina se escindió y se ligó en el vector de ImmunoBody pOrigLIB L1 y pOrigLIB hepB auxiliar hepB/L1 reemplazando la constante kappa humana
imagen18
imagen19
imagen20
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
inmunización los esplenocitos se aislaron y analizaron in vitro con respecto a respuestas específicas por elispot de IFN. Para determinar si la respuesta específica de TRP2 estaba mediada por linfocitos T CD8, se suprimieron los linfocitos T CD8 antes del análisis en el ensayo de elispot. La supresión de linfocitos T CD8 condujo a la supresión de las respuesta específica de TRP2; sin embargo el agotamiento de CD8 no afectó a la respuesta de péptido HepB CD4, lo que sugiere que está mediada más probablemente por linfocitos T CD4 (Figura 31 c).
Para determinar si las respuestas generadas por inmunización con ADN de InmunoBody son capaces de destruir las células diana in vitro, los esplenocitos se estimularon con blastos de LPS pulsados con péptido TRP2 in vitro durante 6 días y se analizaron en un ensayo de liberación de cromo frente a células de melanoma B16F10. Los esplenocitos de ratones inmunizados con ADN de InmunoBody demostraron lisis superior de tanto células B16F10, que tienen bajos niveles de MHC de clase I en superficie, como de células B16F10 IFN, que tienen alta expresión de MHC de clase I en superficie en comparación con la de línea B16F10 que no expresa moléculas H-2Kb (B16F10 siKb). La supresión de la muerte frente a la línea celular B16F10 siKb demuestra que la muerte depende de CD8 y está restringida a través de H-2Kb (Figura 31d).
Estos resultados muestran que el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) CD8 incorporado en la región CDR H2 del armazón de InmunoBody se procesa y presenta para inducir respuestas de alta frecuencia mediadas mediante MHC de clase I. El epítopo de HepB CD4 también se procesa y presenta en el contexto de MHC de clase II para inducir buenas respuestas mediadas por CD4 de inmunización con ADN.
Las respuestas específicas de epítopo de TRP2 también se analizaron de otras construcciones que contienen epítopo de TRP2 usando metodología idéntica. La incorporación del epítopo de TRP2 en CDR dentro de la cadena pesada dio como resultado respuestas específicas de péptido de alta frecuencia (Figura 31e). Por el contrario la incorporación de epítopos de CTL dentro de la cadena ligera dio como resultado una reducción significativa de la frecuencia de CTL (DCIB36). El análisis de la avidez de las respuestas específicas de epítopo de TRP2 revela que son de alta avidez cuando se generan a partir de epítopos dentro de la cadena pesada pero esta es considerablemente menor con la expresión de epítopos de la cadena ligera (Figura 31f). Se observaron respuestas auxiliares de alta avidez de alta frecuencia para todas las construcciones (Figura 31 g), lo que sugiere que la secreción de cadena pesada era una ventaja para estimular respuestas de CTL pero no para respuestas auxiliares.
Ejemplo 3 – La inmunización de ADN de ImmunoBody es mejor que la inmunización con péptido o inmunización con antígeno completo
Para analizar la eficacia de inmunización de ADN de ImmunoBody, se comparó con inmunización s.c. con epítopo peptídico en adyuvante incompleto de Freund o inmunización con un ADN que expresa el antígeno de TRP2.
Ratones C57BI/6 recibieron tres inmunizaciones semanales con ADN o péptido que comprendía el epítopo de TRP2 ligado al epítopo auxiliar universal en IFA. Las respuestas específicas de péptido auxiliar y TRP2 generadas en ratones inmunizados con ImmunoBody fueron muy superiores en magnitud a las inducidas por inmunización con péptido o inmunización con el antígeno de TRP2 completo (Figura 32a). El análisis adicional de la avidez de estas respuestas específicas de péptido revelaron que las respuestas generadas por ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody tienen una avidez más de uno logarítmico mayor que las de individuos inmunizados con péptido (Figura 32b). Las respuestas generadas en ratones C57BI/6 se analizaron posteriormente con respecto a la capacidad citotóxica in vitro frente a la línea celular B16F10 y, como un control negativo, la línea celular B16F10 siKb. La Figura 32c muestra que los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody son capaces de actividad tumoral in vitro que está restringida por H-2Kb y tanto los ratones inmunizados con péptido como los ratones inmunizados con antígenos completos son incapaces de destruir las mismas líneas celulares de melanoma.
La administración de ImmunoBody también se comparó con inmunización con péptido DC +. Los ratones C57BI/6 recibieron tres inmunizaciones semanales con ADN o péptido DC +. Las respuestas específicas de péptido de TRP2 fueron de frecuencia comparable pero los ratones inmunizados con ImmunoBody generaron respuestas de mayor avidez en comparación con los inmunizados con péptido DC + (Figura 32d). Esto también se demostró cuando estas respuestas se analizaron con respecto a capacidad para destruir células de melanoma B16F10 in vitro (Figura 32e). Las respuestas generadas por inmunización con ImmunoBody mostraron mayores muertes de melanoma B16F10 a menor relación de efector y diana que n las respuestas de ratones inmunizados con péptido DC +. También mostraron mayor lisis específica de la línea de melanoma B16F20 siKb que tenían niveles reducidos de H-2Kb.
Las construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de Ovoalbúmina restringido por H-2Kb, SIINFEKL, y el epítopo de gp100 restringido por HLA-A2 modificado en anclaje, IMDQVPFSV (21 CM) se compararon con la inmunización con péptido epitópico correspondiente en ratones C57BI/6 o HHDII respectivamente. Los ratones recibieron tres inmunizaciones semanales con ADN o péptido en IFA. El análisis de las respuestas después de la inmunización final revela que los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody generan respuestas específicas de péptido de mayor frecuencia en comparación con ratones inmunizados con péptido (Figura 32f y g). Estas respuestas también se analizaron con respecto a avidez por titulación de péptidos. La inmunización con ImmunoBody induce respuestas de avidez significativamente mayor que la inmunización con péptido (Figuras 32h e i).
imagen21
imagen22
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 5
Antígeno
Epítopo Ensayo de estabilización de T2 (m.f.i) Puntuación de SYFPEITHI
Gp100 (210M)
IMDQVPFSV 23,1 22
Gp100 (wt)
ITDQVPFSV 18,5 18
Gp100 (F7L)
ITDQVPLSV 18 19
Gp100 (F7I)
ITDQVPISV Nd 18
TRP2
SVYDFFVWL 19 21
Control
7,29 -
Ejemplo 8-Pueden procesarse y presentarse múltiples respuestas auxiliares de CD4 para inducir una respuesta inmunitaria in vivo
Para examinar si los epítopos auxiliares de CD4 podían procesarse y presentarse para inducir una respuesta inmunitaria in vivo, se insertaron por ingeniería genética de forma independiente diferentes epítopos en el sitio de CDR L1 de la construcción de ImmunoBody. Estos incluyen el epítopo restringido por I-Ad FERFEIFPKE (DCIB21; Figura 33) de hemaglutinina de la gripe, el epítopo restringido por I-Ab TPPAYRPPNAPIL de HBcAg (DCIB15; Figura 19) y el epítopo restringido por HLA-DR4 WNRQLYPEWTEAQRLD de gp100 (DCIB35; Figura 45).
Se inmunizaron ratones transgénicos Balb/c, C57BI/6 o HHDII y DR4 tres veces a intervalos semanales por vía transdérmica con ADN de ImmunoBody mediante la pistola génica. Se analizaron posteriormente los esplenocitos mediante elispot de IFN con respecto a la presencia de respuestas de CD4 específicas de epítopo. Las Figuras 46a, b y c demuestran que los tres epítopos auxiliares de CD4 pueden procesarse y presentarse del sitio CDR L1 para inducir una respuesta inmunitaria específica de epítopo in vivo.
El epítopo restringido por HLA-DR4 de gp100 también se ensayó con respecto a procesamiento y presentación de diferentes CDR. Las construcciones que incorporan el epítopo en CDRL1 (DCIB35; Figura 45), CDRH3 (DCIB54; Figura 29) o CDRL3 (DCIB50; Figura 47) se usaron para inmunizar ratones transgénicos HLA-DR4 tres veces a intervalos semanales. La Figura 46d muestra que el epítopo auxiliar puede procesarse eficazmente de diferentes CDR para inducir respuestas auxiliares de alta frecuencia.
Ejemplo 9 – las respuestas de CTL son parcialmente dependientes de la cadena pesada secretada pero las respuestas auxiliares no requieren cadena ligera secretada
Clásicamente se procesan epítopos de linfocitos T CD4 de proteínas que se adquieren de forma exógena y epítopos de linfocitos T CD8 de proteínas producidas de forma endógena. Existen pruebas ahora de que la presentación cruzada de epítopos de antígenos adquiridos de forma exógena induce una respuesta mediada por linfocitos T CD8. También se ha propuesto que esta vía de sensibilización es más eficaz en el desarrollo de respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T CD8. Recientemente ha habido hallazgos similares para respuestas mediadas por CD4. Las pruebas crecientes sugieren que los epítopos de linfocitos T CD4 derivados de proteínas intracelulares pueden procesarse y presentarse en el contexto de MHC de clase II.
Para determinar si se requiere ImmunoBody secretado para la inducción de respuestas de linfocitos T CD8 y CD4, se prepararon construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de gp100 restringido por HLA-A2 IMDQVPFSV en el sitio CDR H1 y el epítopo auxiliar de HepB restringido por I-Ab TPPAYRPPNAPIL en el sitio de CDR L1 sin secuencias líder en la cadena pesada o cadena ligera (Figuras 10 y 11).
Se inmunizaron ratones HHDII tres veces en intervalos semanales por vía intradérmica con ADN de ImmunoBody mediante la pistola génica. Los esplenocitos se analizaron posteriormente mediante elispot de IFN con respecto a la presencia de respuestas de linfocitos T CD8 y CD4 específicas de epítopo. Cuando las respuestas se analizaron con respecto a respuesta de CD8 específica de gp100, se observó que la retirada de la secuencia líder de la cadena pesada de la construcción de ImmunoBody dio como resultado una reducción de las respuestas específicas de epítopo, sin embargo las respuestas de CD4 no se vieron afectadas (Figura 48a). La retirada de la secuencia líder de la cadena pesada afectó a la secreción de cadena pesada por las células CHO-S transfectadas (Figura 48b). La retirada de la secuencia líder de la cadena ligera, evitando de este modo secreción de cadena ligera, no pareció afectar a las respuestas de CD8 o CD4 específicas de epítopo (Figura 48c). Las respuestas de CD8 se redujeron significativamente en ausencia de una secuencia líder en la cadena pesada pero las respuestas de CD4 no se vieron afectadas (Figuras 48c y d).
imagen23
imagen24
(cont.)
Nombre1
Comienzo2 Péptido3 EpiJen4 NetCTL5 Sytpeithi6 MHCPred7
Puntuación (CI50 nM)
Rango Puntuación Rango Puntuación Rango Puntuación (CI50 nM) Rango
Z284
64 LMNQHQD PL 0,98 3 (7) 0,88* 3 (11) 21 9 (32) 113 11 (51)
Z285
8 VLCGVSLLL 1,19 4 (10) 0,94* 2 (9) 24 4 (10) 242 21 (125)
Z286
34 LVSDAETSL -- -- 0,74 8 (26) 19 15 (52) 887 65 (349)
Z287
26 LILINSLPL -- -- 0,88* 4 (12) 23 7 (16) 607 57 (271)
Z18
(flu) GILGFVFTL 0,19 (1) 1,29 (2) 30 419 (87)
1Nombre del péptido.2 Posición de comienzo del resto aminoacídico dentro de la molécula de Tie-2. 3 Secuencia peptídica. 4 Predicción usando el servidor web EpiJen. La puntuación se proporciona en unidades de CI50 nM, representando las puntuaciones inferiores péptidos de mayor afinidad.5 Predicción usando el servidor web NetCTL 1.2. La puntuación representa la suma ponderada de tres procedimientos de predicción individuales, indicando una ponderación relativa de unión a MHC de 1 una puntuación por encima del valor de umbral de 0,75 identificado como el punto de corte para epítopos de CTL del conjunto de datos obtenido para epítopos conocidos.6 Predicción usando el programa SYFPEITHI. La puntuación máxima para péptidos de unión a HLA-A*0201 es 36. 7 Predicción usando el procedimiento aditivo de MHCPred para predecir la afinidad de los péptidos por MHC y TAP. La puntuación se proporciona de nuevo en unidades de CI50 nM, representando las puntuaciones inferiores péptidos de mayor afinidad. Los valores de CI50 sugeridos están entre 0,01 y 5000 nM. Para todos los procedimientos de predicción, los valores de rango indican el orden en el que los epítopos se predicen del fragmento de 196 aminoácidos, representando los valores entre paréntesis las predicciones de rango de la molécula de Tie-2 completa. Los valores obtenidos para el epítopo de Z18 CTL conocido derivado de la proteína de matriz del virus de la gripe A se incluyen para comparación.

Ejemplo 12 – El papel de Fc xenogénico al proporcionar ayuda de linfocitos T y el requisito de ayuda de linfocitos T específica de antígeno
5 La estimulación de respuestas de linfocitos T de alta avidez habitualmente requiere ayuda de linfocitos T durante la sensibilización. Se concibió originalmente que esta se proporcionaría por el epítopo auxiliar ajeno Hep B codificado dentro de la cadena ligera. De hecho se generaron respuestas auxiliares fuertes para este epítopo. Sin embargo a medida que se secretaba la cadena pesada y no la cadena ligera aunque el epítopo de hep B podría haber proporcionado ayuda para la presentación directa cuando se produjeran ambas cadenas por la misma APC es poco
10 probable que pudiera proporcionar ayuda para la cadena pesada presentada de forma indirecta puesto que es poco probable que esta se capte por la misma célula presentadora de antígenos. Se inmunizaron por lo tanto ratones con un vector de ADN que codifica solamente la cadena pesada. Se generaron aún respuestas de CTL de alta avidez y alta frecuencia (Figura 53 a y b). Esto implica que no se requiere ayuda o que el Fc humano que es xenogénico en ratones está proporcionando ayuda ajena ligada. Se evaluó por lo tanto una construcción de IgG2a de ratón con
15 respecto a secreción de cadenas pesadas y ligeras (Figura 49g) y se exploró con respecto a generación de respuestas inmunitarias (DCIB53 Figura 54). Aunque aún proporcione respuesta de linfocitos T de alta avidez y alta frecuencia estas no fueron tan fuertes como la construcción humana equivalente lo que sugiere que el Fc xenogénico estaba proporcionando ayuda ligada (Figura 53c y d). Se incorporó después un epítopo de gp100 HLA-DR4 en la construcción de IgG2a de ratón (DCIB64, Figura 55) para proporcionar ayuda ligada para generación de
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CTL pero también ayuda de linfocitos T específicos de antígeno para estimular la inflamación dentro del ambiente tumoral. Estas construcciones estimulan respuestas auxiliares y de CTL de alta avidez y alta frecuencia (Figura 53e y f). Puede usarse una construcción de hIgG1 que exprese el mismo epítopo en pacientes humanos.
Ejemplo 13 – El procesamiento de inmunoproteasoma es importante en la generación de respuestas de epítopos dentro de construcciones de ImmunoBody
Se ha sugerido que el inmunoproteasoma tiene la capacidad de alterar la disposición de los epítopos generados de antígenos propios puesto que posee un patrón diferente de escisión. En algunos casos, se generan nuevos epítopos tras la regulación positiva del inmunoproteasoma y en otros se destruyen los epítopos. Existen pruebas de que el inmunoproteasoma es incapaz de generar varios epítopos derivados de antígenos de melanoma concretamente
209-217 369-377
MelanA/MART-1, gp100 y Tirosinasa (Chapiro y col 2006. J Immunol; 176:1053-61). Chapiro y colaboradores han sugerido que la capacidad para procesar y presentar el epítopo de gp100 está relacionada con la regulación positiva del inmunoproteasoma. Se cree que las DC maduras son responsables de la sensibilización de respuestas inmunitarias y se sabe que expresan constitutivamente el inmunoproteasoma (Macagno y col. 2001. Eur J Immunol; 31: 3271-80). El epítopo de gp100209-217 se introdujo por lo tanto por ingeniería genética en el sitio de CDRH1 de una construcción de ImmunoBody y se ensayó con respecto a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias específicas de péptido en ratones transgénicos HLA-A2. No se observaron respuestas específicas de péptidos de esta construcción (Figura 56). Sin embargo cuando el epítopo se modificó para poseer una metionina en la posición 210 (210M) en lugar de treonina esto evitó su escisión por el inmunoproteasoma y se observaron respuestas específicas de epítopo (Figura 56).
También se ensayaron un péptido restringido por HLA-A2 derivado de VEGFR2 (aa 773-781 VIAMFFWLL) y dos péptidos de hTERT modificados (aa 572-580 YLFFYRKSV y aa 988-997 YLQVNSLQTV) con respecto a generación de respuestas de construcciones de ImmunoBody. Estos epítopos se descubrieron inicialmente por predicción de epítopos in silico e inmunización por péptido negando por lo tanto el requisito de procesamiento proteasómico. Sin embargo se presentaron en la superficie de células tumorales/endoteliales huésped lo que sugiere que se procesan de antígeno completo mediante el proteasoma constitutivo. Ninguno de estos epítopos generó respuestas cuando se introdujo por ingeniería genética en la construcción de ImmunoBody lo que sugiere que puede requerirse procesamiento mediante el inmunoproteasoma para generación eficaz de respuestas inmunitarias.
Ejemplo 14-Diferentes procedimientos de inmunización son eficaces en la inducción de respuestas inmunitarias de vacuna de ImmunoBody
Se ha mostrado que la vacuna de ImmunoBody es eficaz en la inducción de respuestas de CD8 y CD4 de alta frecuencia y avidez cuando se administran mediante pistola génica. La vacuna de ImmunoBody se ensayó posteriormente con respecto a generación de respuestas de linfocitos T usando otros procedimientos de inmunización.
Se inmunizaron ratones C57BI/6 con ADN de ImmunoBody que contenía el epítopo de TRP2 en CDRH2 por vía i.d.
o i.m. Las inmunizaciones se combinaron con y sin electroporación y se realizaron tres veces a intervalos semanales.
Los ratones inmunizados con pistola génica muestran respuestas específicas de péptido TRP2 de alta frecuencia. Estas son comparables en ratones inmunizados mediante vía i.m. o i.d. combinada con electroporación. La inmunización, mediante vía i.m. o i.d. en ausencia de electroporación generó respuestas específicas de péptido TRP2 de frecuencia menor (Figura 57a). Todas las respuestas específicas de péptido TRP2 son de alta avidez según se mide por titulación de péptidos (Figura 57b).
Ejemplo 15 – La inmunización con ImmunoBody induce despigmentación de tipo vitíligo y protege frente a presentación tumoral
Puesto que los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody generan respuestas inmunitarias capaces de actividad citotóxica frente a la línea celular tumoral altamente metastásica y escasamente inmunogénica B16Fl0, la vacuna se ensayó con respecto a eficacia protectora in vivo.
Se inmunizaron ratones con ADN de IB (DCIB1B; Figura 30) mediante pistola génica en la piel afeitada del abdomen a intervalos de cinco semanas. A mitad del programa de inmunizaciones, se inyectó a los ratones i.v. 1 x 104 células B16F10 que expresaban IFN que forma tumores metastásicos en el pulmón. Cuando se permitió que el pelo creciera de nuevo después de la última inmunización, se observó que los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody tenían crecimiento de pelo blanco en el sitio de inmunización (Figura 58a). Siete semanas después de la inyección de células tumorales, los ratones se sacrificaron y se analizó el número de metástasis de pulmón internas y externas. Los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody mostraron una reducción significativa en el número de metástasis de pulmón en comparación con ratones de control no tratados (Figura 58b).
También se inmunizó a los ratones con ADN de IB (DCIB18) mediante pistola génica a tres intervalos semanales. Siete días después de la inmunización final se presentó a los ratones 2 x 104 células B16F10 que expresaban IFNa de forma subcutánea. Se controló a los ratones con respecto al crecimiento tumoral y supervivencia. Los ratones se
imagen25
imagen26

Claims (1)

  1. imagen1
ES08735583.0T 2007-03-28 2008-03-28 Ácidos nucleicos Active ES2638188T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0706070 2007-03-28
GBGB0706070.0A GB0706070D0 (en) 2007-03-28 2007-03-28 Nucleic acids
PCT/EP2008/053761 WO2008116937A2 (en) 2007-03-28 2008-03-28 Nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2638188T3 true ES2638188T3 (es) 2017-10-19

Family

ID=38050410

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10152624T Active ES2375463T3 (es) 2007-03-28 2008-03-28 �?cidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas que portan ep�?topos de trp2 y gp100.
ES08735583.0T Active ES2638188T3 (es) 2007-03-28 2008-03-28 Ácidos nucleicos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10152624T Active ES2375463T3 (es) 2007-03-28 2008-03-28 �?cidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas que portan ep�?topos de trp2 y gp100.

Country Status (16)

Country Link
US (1) US8742088B2 (es)
EP (2) EP2134357B1 (es)
JP (1) JP5415399B2 (es)
KR (4) KR20170040387A (es)
CN (2) CN103667304B (es)
AT (1) ATE529128T1 (es)
AU (1) AU2008231723B2 (es)
BR (1) BRPI0808599A2 (es)
CA (1) CA2681531C (es)
DK (2) DK2193803T3 (es)
ES (2) ES2375463T3 (es)
GB (1) GB0706070D0 (es)
PL (1) PL2134357T3 (es)
PT (2) PT2193803E (es)
WO (1) WO2008116937A2 (es)
ZA (1) ZA200907242B (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0706070D0 (en) 2007-03-28 2007-05-09 Scancell Ltd Nucleic acids
EP3253419A1 (en) 2015-02-02 2017-12-13 The University of Birmingham Targeting moiety peptide epitope complexes having a plurality of t-cell epitopes
WO2017210149A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-07 Igc Bio, Inc. Compositions and methods for generating an antibody library
US11419928B2 (en) 2017-10-25 2022-08-23 The Johns Hopkins University Methods and compositions for treating cancer
WO2021195089A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Sorrento Therapeutics, Inc. Fc-coronavirus antigen fusion proteins, and nucleic acids, vectors, compositions and methods of use thereof
CN111423504B (zh) * 2020-04-17 2021-03-26 安徽高安生物医学科技有限公司 黑色素瘤特异性抗原肽、肽复合物以及人工抗原呈递细胞
CA3189358A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Scancell Limited Nucleic acids encoding a polypeptide comprising a modified fc region of a human igg1 and at least one heterologous antigen

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5969109A (en) * 1990-02-28 1999-10-19 Bona; Constantin Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes
WO1995031483A1 (en) 1994-05-13 1995-11-23 Eclagen Limited Improvements in or relating to peptide delivery
JPH10506004A (ja) * 1994-07-27 1998-06-16 ザ カウンシル オブ ザ クィーンズランド インスティテュート オブ メディカル リサーチ ポリエピトープワクチン
US5698679A (en) * 1994-09-19 1997-12-16 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for targeting an immune response
AUPO784197A0 (en) * 1997-07-10 1997-08-07 Csl Limited Treatment of nasopharyngeal carcinoma
IL136113A0 (en) * 1997-11-14 2001-05-20 Euro Celtique Sa Modified antibodies with enhanced ability to elicit an anti-idiotype response
WO2000064488A2 (en) 1999-04-27 2000-11-02 Eurogen Holding, S.A. Somatic transgene immunization and related methods
US7067110B1 (en) * 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
GB0102145D0 (en) * 2001-01-26 2001-03-14 Scancell Ltd Substances
GB0111628D0 (en) 2001-05-11 2001-07-04 Scancell Ltd Binding member
WO2003018610A2 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Peptides of melanoma antigen and their use in diagnostic, prophylactic and therapeutic methods
WO2004030616A2 (en) * 2002-09-17 2004-04-15 Antigen Express, Inc. Ii-KEY/ANTIGENIC EPITOPE HYBRID PEPTIDE VACCINES
GB0706070D0 (en) 2007-03-28 2007-05-09 Scancell Ltd Nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
PT2134357T (pt) 2017-08-29
KR101729458B1 (ko) 2017-04-21
EP2134357B1 (en) 2017-05-31
CN103667304B (zh) 2018-02-02
CA2681531A1 (en) 2008-10-02
EP2134357A2 (en) 2009-12-23
BRPI0808599A2 (pt) 2019-01-08
ES2375463T3 (es) 2012-03-01
CN103667304A (zh) 2014-03-26
KR20100015699A (ko) 2010-02-12
US20100260806A1 (en) 2010-10-14
KR20160091458A (ko) 2016-08-02
PT2193803E (pt) 2012-01-16
CN101678092A (zh) 2010-03-24
CN101678092B (zh) 2014-04-02
DK2134357T3 (en) 2017-09-11
JP2010522550A (ja) 2010-07-08
AU2008231723B2 (en) 2013-05-16
EP2193803A1 (en) 2010-06-09
ZA200907242B (en) 2010-11-24
US8742088B2 (en) 2014-06-03
JP5415399B2 (ja) 2014-02-12
GB0706070D0 (en) 2007-05-09
WO2008116937A2 (en) 2008-10-02
KR20150013357A (ko) 2015-02-04
ATE529128T1 (de) 2011-11-15
CA2681531C (en) 2017-11-28
WO2008116937A3 (en) 2009-01-22
KR20170040387A (ko) 2017-04-12
DK2193803T3 (da) 2012-02-13
EP2193803B1 (en) 2011-10-19
PL2134357T3 (pl) 2018-03-30
AU2008231723A1 (en) 2008-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2638188T3 (es) Ácidos nucleicos
ES2249907T3 (es) Anticuerpos de union cd40 y peptidos ctl para el tratamiento de tumores.
ES2719832T3 (es) Proteínas de fusión LLO no hemolíticas y usos de las mismas
TWI364294B (en) Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
ES2659376T3 (es) Proteínas de fusión del receptor de linfocitos T y conjugados y procedimientos de uso de las mismas
US20240124889A1 (en) Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
ES2614901T3 (es) Anticuerpo codificado por un ARN
ES2427147T3 (es) Anticuerpo sHlgM12 útil para tratar esclerosis múltiple
ES2675825T3 (es) Vacunación tumoral que involucra una respuesta inmunitaria contra la proteína propia CLDN18.2
CN108473950A (zh) 靶向癌症治疗
UA126384C2 (uk) Антитіло, яке зв'язує cd3
AU2016207099A1 (en) Virus-like particle with efficient epitope display
KR20160105452A (ko) Pd1 및 pdl1 항체 및 백신 조합 및 면역요법을 위한 이들의 사용
ES2304398T3 (es) Antigeno de tumores.
Pudney et al. DNA vaccination with T‐cell epitopes encoded within Ab molecules induces high‐avidity anti‐tumor CD8+ T cells
KR20220093103A (ko) 항종양용해 바이러스 항원 항체 및 이의 사용 방법
ES2290072T3 (es) Anticuerpos frente a la proteina semp1, metodos para su produccion y usos de los mismos.
WO2019101062A1 (zh) 重组疫苗及其应用
RU2385163C2 (ru) Профилактическая противораковая вакцина
JP2023528017A (ja) 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）ポリペプチドおよびワクチン目的でのその使用
KR20220024035A (ko) Muc16 및 cd3에 결합하는 이중 특이적 항원 결합 분자와 4-1bb 공동 자극의 병용
ES2634256T3 (es) Composiciones innovadoras y usos de las mismas
Meshkat et al. Strong immune responses induced by a DNA vaccine containing HPV16 truncated E7 C-terminal linked to HSP70 gene
JP5597346B2 (ja) ｐ１８５ｎｅｕタンパク質配列バリアントをコードするプラスミドおよびその治療的使用
KR20230008162A (ko) 암 및 감염성 질환에 대한 면역요법을 위한 융합 단백질