ES2375463T3 - �?cidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas que portan ep�?topos de trp2 y gp100. - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico que comprende un promotor no específico y una secuencia que codifica un anticuerpo recombinante, en el que la molécula de anticuerpo tiene epítopos de linfocitos T heterólogos en la misma de modo que el anticuerpo no puede tomar su conformación nativa cuando se expresa el ácido nucleico, siendo los epítopos de linfocitos T heterólogos: GTGRAMLGTHTMEVTVYH en CDRH1 y CDRL3 SVYDFFVWL en CDRH2, y WNRQLYPEWTEAQRLD en CDRH3 y CDRL1.

Description

�?cidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas que portan epítopos de TRP2 y gp100
La presente invención se refiere a ácidos nucleicos y a su uso como vacunas, codificando los ácidos nucleicos epítopos de linfocitos T contra los que debe inducirse una respuesta inmune. Tales vacunas pueden usarse en el 5 tratamiento de tumores.
En el campo de las vacunas de cáncer e infecciones virales crónicas, se está haciendo evidente que factores distintos de la frecuencia, tales como la avidez funcional de linfocitos T específicos de tumor y vía de sensibilización, son determinantes principales en la maximización de la eficacia de la vacuna. Varios grupos han mostrado que los linfocitos T CD8+ de alta avidez demuestran actividad antitumoral superior (Alexander-Miller, Immunologic Research, 2005: 31: 13-24. Hodge y col, J Immunol 2005; 174: 5994-6004, Valmori y col, J Immunol 2002; 168: 4231-40, Zeh y col, J Immunol 1999; 162; 989-94). Se ha sugerido que los linfocitos T de alta avidez desempeñan un papel vital en la regresión tumoral en pacientes. Esto se ejemplifica en un estudio en el que se detectaron linfocitos que se infiltran en tumores (TIL) específicos de antígenos de alta avidez en un paciente con regresión tumoral drástica (Khong & Rosenberg, J Immunol 2002; 168: 951-6). También están apareciendo pruebas que demuestran que la transferencia
15 adoptiva de linfocitos T específicos de tumor autólogos estimulados in vitro es exitosa, posiblemente porque la estimulación in vitro permite la selección de los linfocitos T de alta avidez (Vignard y col., J Immunol 2005; 175: 4797-805, Dudley y col., J Immunother 2001; 24: 363-73, Morgan y col, J Immunol 2003; 171: 3287-95, Rosenberg & Dudley, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004; 101 Supl 2: 1463945).
Hasta ahora varios grupos han intentado inducir una respuesta inmune celular contra un epítopo predeterminado usando un anticuerpo como un vehículo para ese epítopo. Por ejemplo, el documento WO 96/19584 (Bona y col.) desvela anticuerpos quiméricos en los que se insertan epítopos de linfocitos T en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo y alega que tales anticuerpos quiméricos son adecuados para inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL). Sin embargo, este documento enseña que el ADN debe codificar una 25 proteína funcional. Por lo tanto en el resumen, se indica que “las capacidades funcionales del epítopo y la inmunoglobulina parental se conservan”. Además, en la página 21, se indica “que la inserción del epítopo deseado debería ser en una región del ácido nucleico que codifique la molécula de inmunoglobulina parental que no es esencial para la expresión o función de la molécula de inmunoglobulina parental”. Además, todos los ejemplos en el documento WO 96/19584 muestran que se produce inmunoglobulina intacta tras la inserción del epítopo de linfocitos
T.
La Patente de Estados Unidos Nº 7.067.110 desvela un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra un antígeno usando una proteína de fusión de anticuerpo que carece de un dominio de región variable de inmunoglobulina fusionado con el antígeno por un enlace polipeptídico. La proteína de fusión conserva la capacidad de unirse a Fc.
35 El documento EP0759944 desvela un procedimiento para incorporar epítopos de linfocitos T dentro de una molécula de anticuerpo que se secreta como una proteína de inmunoglobulina intacta y que puede dirigir epítopos de CTL a tumores para hacerlos mejores dianas para CTL.
El documento WO 00/64488 desvela que una respuesta de CTL puede inducirse por un ácido nucleico que codifica un anticuerpo quimérico que tiene epítopos de linfocitos T heterólogos insertados en las CDR pero no la región variable de los mismos, siempre que el ácido nucleico se dirija para expresión en linfocitos B. Puesto que los linfocitos B no pueden estimular respuestas de linfocitos T vírgenes, la vacuna descrita en el documento WO 00/64488 sería útil solamente en el refuerzo de respuestas de linfocitos T preexistentes.
El documento WO 02/092126 desvela que una respuesta de CTL puede inducirse por un polipéptido que comprende un epítopo de linfocitos T heterólogos y la parte de Fc humano que se une al receptor CD64 de alta afinidad. Sin
45 embargo, los presentes inventores han mostrado ahora que la interrupción de la secuencia de anticuerpo insertando un epítopo de linfocitos T, por ejemplo dentro de una CDR inapropiada o incluso dentro de la región variable de un anticuerpo, evita la asociación de cadena pesada y ligera y no se secreta anticuerpo funcional. El ADN que codifica estos anticuerpos plegados de forma errónea genera de forma inesperada respuestas de linfocitos T fuertes. Además, esto no está mediado mediante CD64 puesto que IgG2 humano, que no se une a CD64 de ratón o humano, funciona tan eficazmente como IgG1 humano.
En un aspecto de la presente invención se proporciona un ácido nucleico que comprende un promotor no específico y una secuencia que codifica un anticuerpo recombinante, en el que la molécula de anticuerpo tiene epítopos de linfocitos T heterólogos de modo que el anticuerpo no puede tomar su conformación nativa cuando el ácido nucleico se expresa, siendo los epítopos de linfocitos T heterólogos:
55 GTGRAMLGTHTMEVTVYH en CDRH1 y CDRL3
SVYDFFVWL en CDRH2, y
WNRQLYPEWTEAQRLD en CDRH3 y CDRL1.
Sin desear quedar ligado a la teoría, la presente invención se basa, al menos en parte, en el concepto de que puede generarse una respuesta a linfocitos T contra un epítopo de linfocitos T específicos (tal como un epítopo de CTL), por administración de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que incluye el epítopo de linfocitos T pero no epítopos de linfocitos T reguladores. Se cree que el ácido nucleico se capta por células presentadoras de antígenos (APC), migra a ganglios linfáticos y se presenta directamente o bien se expresa para producir un polipéptido que se secreta y que se capta después por otras APC. El primer ácido nucleico es adecuado para estimular epítopos de linfocitos T auxiliares y el segundo es adecuado para estimular respuestas de CTL. El polipéptido que se codifica por el ácido nucleico idealmente no tiene ningún epítopo de linfocitos T naturales. Los polipéptidos adecuados a este respecto son moléculas inmunes, tales como anticuerpos. Son adecuadas para la práctica de la presente invención cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que no pueden asociarse de modo que la cadena ligera permanece en las APC y de modo que la cadena pesada se secreta.
Se identificó una población de linfocitos T supresores aproximadamente hace 40 años, pero el progreso se ha visto obstaculizado por la falta de técnicas específicas para identificar las células y debido al escepticismo científico con respecto a la existencia de supresión. Sin embargo, Sakaguchi y col. resucitó el interés en las células supresoras en 1995 demostrando que la transferencia de linfocitos con linfocitos T CD4+CD25+ agotados en ratones atímicos provocó el desarrollo de diversas enfermedades autoinmunes en los ratones receptores y que la reconstitución con linfocitos T CD4+CD25+ evitó reacciones autoinmunes en estos ratones (Sakaguchi y col J. Immunol 1995; 155: 1151-1164). Posteriormente, numerosos estudios en ratones y seres humanos han mostrado que diversas poblaciones de linfocitos T con actividad reguladora desempeñan un papel importante en la supresión de respuestas inmunes (tanto innatas como adaptativas) a antígenos propios (controlando la autotolerancia) (Sakaguchi y col J Immunol 1995; 155: 1151-1184) así como ajenos (Shevach, Immunity 2006; 25: 195-201, Coleman y col, J. Cell Mot. Med 2007; 11: 1291-1325). Se ha mostrado que el agotamiento de linfocitos Treg en modelos de ratón de cáncer mejora el rechazo de tumores mediado por respuesta inmune endógena (Shimizu, y col, J. Immunol. 1999; 163: 5211-5218, Onizuka y col, Cancer Research 1999; 59: 3128-3133) y la inmunidad antitumoral específica de antígenos (Tanaka, y col, J. Immunother. 2002; 25: 207-217). Además, el agotamiento de linfocitos Treg aumenta la inmunoterapia tumoral incluyendo vacunación (Tanalca, y col, J. Immunother. 2002; 25: 207-217, Dannull y col, J. Clin. Invest. 2005: 115: 3623-3633) y bloqueo de CTLA-4 (Sutmuller y col, J. Exp. Mad. 2001; 194: 823-832). Además, se aumentan los números de linfocitos Treg en la sangre periférica (Woo y col, Cancer Research 2001; 61: 4766-4772, Curiel y col, Nature Medicine 2004; 10: 942-949, Wolf y col. Clin. Cancer Research 2003; 9: 606-612. Sasada y col, Cancer 2003; 98: 1089-1099) y pueblan el microambiente tumoral y drenan los ganglios linfáticos (Curiel y col, Nature Medicine 2004; 10: 942-949, Sasacia y col, Cancer 2003; 98: 1089-1099, Liyanage y col, J. Immunology 2002: 169: 2756-2761, Matsuura y col, Cancer 2006; 106: 1227-1236. Yang y col, Blood 2006; 107: 3639-3646, Alvaro y col, Clin. Cancer Research 2005; 11: 1467-1473) de pacientes con diferentes cánceres. En pacientes con carcinoma gástrico (Sasada y col, Cancer 2003; 98: 1089-1099, Ichihara y col, Clinical Cancer Research 2003; 9; 4404-4408) y cáncer ovárico (Curiel y col, Nature Meáicine 2004; 10: 942-949) se asociaron pronóstico negativo y tasas de supervivencia reducidas con mayores frecuencias de linfocitos Treg. También se ha mostrado que los linfocitos Treg suprimen/inhiben la proliferación, producción de citocinas (IFNy, IL-2) y actividad citolítica de linfocitos T CD8+ (Liyanage y col, J. Immunology 2002; 169: 2756-2761, Piccirillo y col. J. Immunology 2001; 167: 1137-1140, Mempel y col, Immunity 206; 25: 129-141, Annacker y col, J. Immunology 2001; 166: 30083018, Woo y col, J. Immunology 2002; 168: 4272-4276) y CD4+ (Liyanage y col, J, Immunology 2002, 169: 27562761, Ichihara y col, Clinical Cancer Research 2003; 9: 4404-4408, Nishikawa y col, Blood 2005; 106,008-1011) específicos de tumor. Además, los linfocitos Treg pueden suprimir las funciones de las células dendríticas (Romagnani y col, Eur. J. Immunol. 2005; 35: 2452-2458), linfocitos NK (Ralainirina y col, J. Loukoc Biol. 2007; 81: 144-153) y linfocitos B (Lim y col, J. Immunology 2005; 175: 4180-4183). Tomados juntos, estos estudios sugieren un papel importante de los linfocitos Treg en la inmunopatología tumoral e indican una correlación cercana entre las frecuencias de linfocitos Treg y el crecimiento tumoral.
Los linfocitos Treg se dividen en linfocitos T CD4+CD25+ naturales y diversas poblaciones de linfocitos Treg inducidos/adaptativos (Shevach, Immunity 2006; 25: 196-201, Bluestone y col, Nat. Immunol. 2005; 6: 345-352) (Tabla 1). Aproximadamente 5 %-10 % de los linfocitos T CD4+ en ratones y seres humanos son linfocitos Treg naturales (Sakaguchi y col, Nat. lmmunology 2005; 6: 345-352). Los linfocitos Treg naturales se desarrollan en el timo por interacción de TCR fuerte con péptido propio (Picca y col, Current Opinion in Immunafogy 2005; 17: 131136, Jordan y col, Nature Immunology 2001; 2(4): 301-306, Picca y col, Immunological Reviews 2006; 212: 74-85), mientras que los linfocitos Treg inducidos se desarrollan a partir de linfocitos T no reguladores en la periferia. Esta conversión extratímica requiere condiciones inmunológicas especiales tales como exposición continua a baja dosis de antígeno, exposición a un antígeno periférico sistémico o exposición a TGF1 (Shevach. Immunity 2006; 25: 195201, Akbar y col, Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 231-237). Los linfocitos Treg pueden mediar su supresión por uno o una combinación de los siguientes mecanismos: i) mecanismo dependiente de contacto célula-célula, ii) a través de la secreción de citocinas inmunosupresoras como IL-10 o TGF1 o iii) muerte directa de células diana por la ruta de perforina-grancima (von Boehmer, Nature Immunology 2005; 6(4): 338-344).
Hasta la fecha, se sabe muy poco acerca de la especificidad de antígeno de los linfocitos Treg humanos. Wang y col. notificaron la identificación de clones de linfocitos Treg funcionales CD4+CD25+GITR+ específicos de LAGE-1 en
pacientes con cáncer (Whang y col, Immunity 2004; 20: 107-118). Vence y col. demostraron la presencia de linfocitos Treg CD4+ específicos de antígeno tumoral en la sangre periférica de pacientes con melanoma metastásico (Vence y col, PNAS 2007; 104(52): 20884-20889). Estos linfocitos Treg reconocieron una amplia serie de antígenos tumorales, incluyendo TRP1, NY-ESO-1, gp100 y survivina. Además, Vence y col. fueron los primeros en demostrar la presencia de epítopos de linfocitos Treg específicos de NY-ESO-1 dentro de la molécula de NY-ESO-1. Además, se mostró que la vacunación de pacientes con melanoma con células dendríticas cargadas con péptidos sintéticos o lisados tumorales inducía el aumento de las frecuencias de linfocitos Treg, junto con la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de tumores (Chakraborty y col, Hum. Immunology 2004; 65: 794-802). Esto sugiere la posibilidad de que la vacuna contuviera epítopos de linfocitos Treg no identificados así como epítopos de linfocitos T CD8+, que conducen a la expansión de linfocitos Treg in vivo por activación específica de ligando a través del receptor de linfocitos T de linfocitos Treg (TCR). Se acepta ampliamente que los linfocitos Treg requieren activación específica de antígenos a través de unión/reconocimiento de TCR pero median en la supresión de testigo no específico de antígeno (Thorton & Shevach, J. Immunology 2000; 164: 183190). Además, Li y col. sugirieron la existencia de epítopos de Treg dominantes dentro de la proteína del núcleo del Virus de la Hepatitis C que estimulaban los linfocitos Treg específicos de VHC en pacientes infectados (Li y col, Immunol. Cell Biol. 2007; 85(3): 197-204). Colectivamente, estos estudios además del hallazgo reciente de que la inmunización de ratones transgénicos HHD con la construcción de ADN antiendotelial C200Fc, no estimulaba una respuesta inmune antitumoral específica de Tie-21-196 significativa y el aumento de la frecuencia de células secretoras de IFNy específicas de Tie-21-198 de esplenocitos de ratones HHD después de la eliminación de linfocitos Treg CD4+CD25+ (por administración de 400 !g de anticuerpo monoclonal PC61) antes de inmunización con ADN de C200Fc (Middleton, Tesis Doctoral. Universidad de Nottingham, noviembre de 2007) indican que el Tie-21-196 dentro de la vacuna de ADN contiene epítopos de linfocitos Treg no identificados así como el epítopo CD8+. Esto explicaría el fracaso de la vacuna para romper la tolerancia con el antígeno propio Tie-2 y para inducir inmunidad antitumoral en ratones HHD debido a linfocitos Treg expandidos específicos de antígeno abundantes que suprimen la respuesta inmune antitumoral mediada por células. Hay por lo tanto una ventaja para expresar epítopos efectores de T con vehículos inmunes inertes que no expresan epítopos de Treg para dirigir la respuesta inmune al epítopo efector y evitar estimulación de la respuesta de Treg dominante.
Provechosamente, el ácido nucleico de la presente invención incluye una secuencia que codifica una secuencia, tal como una secuencia líder, que permite que el polinucleótido expresado, y específicamente la cadena pesada del anticuerpo recombinante, se secrete. Esto permite que el polinucleótido se transfiera a células presentadoras de antígenos (APC). La secuencia podría ser una secuencia líder que se expresa de forma natural con el polinucleótido
o podría ser una secuencia líder heteróloga, tal como una secuencia líder de inmunoglobulina, que se añade.
La estructura de una cadena pesada de anticuerpo se conoce por los expertos en la materia y generalmente incluye regiones variables y constantes. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede ser IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, aunque se prefiere IgG. El anticuerpo de IgG puede ser cualquier subclase de IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana o IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 de ratón. El anticuerpo de IgG puede ser un anticuerpo de IgG1 humano que tiene el dominio de unión Fc de IgG2 o un anticuerpo de IgG2 humano que tiene el domino de unión de Fc de IgG1. La cadena pesada puede tener la región constante de un anticuerpo humano y la región variable o hipervariable (CDR) de un anticuerpo monoclonal de ratón en el que se han insertado epítopos de linfocitos T heterólogos. La región variable distinta de la región hipervariable también puede derivarse de la región variable de un anticuerpo humano. Cuando se aplica a anticuerpos (es decir que comprende una cadena pesada y una cadena ligera), se dice que el anticuerpo está humanizado. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar anticuerpos humanizados. Se describen procedimientos, por ejemplo, en Winter, Patente de Estados Unidos Nº
5.225.539. La región variable de la cadena pesada fuera de la región hipervariable de ratón también puede derivarse de un anticuerpo monoclonal de ratón. En tal caso, la región variable completa deriva de anticuerpo monoclonal murino y, cuando se aplica a anticuerpos, se dice que el anticuerpo está quimerizado. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar anticuerpos quimerizados. Tales procedimientos incluyen, por ejemplo, los descritos en las Patentes de Estados Unidos de Boss (Celltech) y de Cabilly (Genentech). Véase también Patente de Estados Unidos Nº 4.816.397 y 4.816.567, respectivamente.
Puede proporcionarse un ácido nucleico separado que codifica la cadena ligera del anticuerpo. El epítopo de linfocitos T puede ser tal que la cadena ligera no toma su conformación nativa cuando se expresa el ácido nucleico. La cadena ligera puede tener cualquiera de las características descritas en el presente documento con respecto a la cadena pesada. El anticuerpo de la invención puede tener la secuencia de la Figura 60.
La invención también proporciona:
•
una vacuna que comprende un ácido nucleico de la invención y un adyuvante;
•
una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de la invención y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable;
•
un ácido nucleico de la invención para su uso en medicina;
•
el uso de dicho ácido nucleico de la invención en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta
inmune contra al menos uno de los epítopos de linfocitos T; y
• un ácido nucleico de la invención para su uso en la estimulación de una respuesta inmune contra al menos uno de los epítopos de linfocitos T.
Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, que pueden ser humanos o no humanos, que tienen epítopos de linfocitos T predeterminados clonados dentro de sus regiones variables, de modo que se rompa la estructura de anticuerpo primaria, inhiben el plegamiento y/o limitan la secreción a solamente cadena pesada o cantidades muy bajas de anticuerpo intacto, estimulan respuestas de linfocitos T específicos de antígeno y auxiliares fuertes. Los inventores también han descubierto que este efecto puede conseguirse usando ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo tal. Se cree que el epítopo de linfocitos T se procesa pero no se destruye por el inmunoproteasoma. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una vacuna de ADN que presenta epítopos de linfocitos T predefinidos dentro de inmunoglobulina desnaturalizada que potencia la frecuencia y la avidez de la respuesta de linfocitos T. Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de la invención pueden denominarse en el presente documento “immunobodies”.
El hallazgo de que puede estimularse una respuesta inmune frente a un epítopo de linfocitos T por un ácido nucleico que codifica al menos la cadena pesada de una cadena de inmunoglobulina en la que se ha insertado el epítopo de linfocitos T de modo que una molécula de inmunoglobulina no puede tomar su conformación nativa va en contra de las expectativas de la técnica, en la que se enseña que el anticuerpo debe expresarse en una forma funcional. Por ejemplo, como se ha analizado anteriormente el documento WO 96/19584 enseña que, cuando un ácido nucleico codifica un anticuerpo en el que se insertan epítopos de linfocitos T en las CDR del anticuerpo, el ácido nucleico debe codificar un anticuerpo funcional. De forma similar, el documento EP0759944 describe un procedimiento para incorporar epítopos de linfocitos T dentro de una molécula de anticuerpo que se secreta como una proteína de inmunoglobulina intacta. Aunque la patente de Estados Unidos nº 7.067.110 desvela que puede inducirse una respuesta inmune contra un antígeno por una proteína de fusión de anticuerpo y el antígeno, el anticuerpo se desvela como carente de una región variable de inmunoglobulina. Además, esta proteína de fusión tendrá epítopos de linfocitos T reguladores en el antígeno. Por lo tanto, aunque la proteína puede estimular una respuesta inmune, no estimulará respuestas de linfocitos T de alta avidez debido a epítopos de linfocitos T reguladores en el antígeno.
Como se ha analizado anteriormente, el documento WO 00/64488 desvela un ácido nucleico que codifica un anticuerpo quimérico que tiene epítopos de linfocitos T heterólogos insertados en las CDR pero no la región variable de los mismos, dirigiéndose dicho ácido nucleico para expresión en linfocitos B. El ácido nucleico de la presente invención no se dirige para expresión en linfocitos B y por lo tanto no se dirigirá a linfocitos B específicamente in vitro
o in vivo. El ácido nucleico de la presente invención puede captarse por cualquier célula presentadora de antígeno, incluyendo células dendríticas, y por lo tanto puede sensibilizar respuestas de linfocitos T auxiliares y CTL vírgenes, mientras que la vacuna descrita en el documento WO 00/64488 solamente sería útil en el refuerzo de respuestas de linfocitos T preexistentes.
El análisis de la avidez funcional de respuestas inducidas por ácidos nucleicos de acuerdo con la invención demostró que puede generarse una respuesta de alta avidez en comparación con inmunización con péptido sintético. Esto se correlaciona también con una capacidad potenciada de reconocer y matar células tumorales in vitro e in vivo. Esta observación es comparable con la documentada en otros estudios en los que se muestra mejor actividad antitumoral por CTL específicos de TRP2 de alta avidez (Zeh y col, J Immunol 1999; 162: 989-94, Harada y col, Immunology 2001; 104: 67-74).
Los ácidos nucleicos de la presente invención tienen un promotor no específico; es decir un promotor que promoverá la expresión del ácido nucleico pero que no tiene especificidad para células en las que se promueve la expresión. El promotor provoca preferentemente expresión del ácido nucleico en células dendríticas y/o queratinocitos. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor de CMV, el promotor de SV40 y otros promotores no específicos conocidos por los expertos en la materia.
El ácido nucleico de ciertos aspectos de la invención codifica un anticuerpo que incluye todos los elementos principales de un anticuerpo, es decir cadenas pesadas y ligeras que incluyen regiones variables y constantes. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede ser IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, aunque se prefiere IgG. El anticuerpo de IgG puede ser de cualquier subclase de IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana o IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 de ratón. El anticuerpo de IgG puede ser un anticuerpo de IgG1 humano que tiene el dominio de unión a Fc de IgG2. El anticuerpo puede tener la región constante de un anticuerpo humano y la región variable o hipervariable de un anticuerpo monoclonal de ratón en el que se han insertado epítopos de linfocitos T heterólogos. La región variable distinta de la región hipervariable también puede derivar de la región variable de un anticuerpo humano. Un anticuerpo tal se dice que está humanizado. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar anticuerpos humanizados. Los procedimientos se describen, por ejemplo, en Winter, Patente de Estados Unidos Nº
5.225.539. La región variable del anticuerpo fuera de la región hipervariable de ratón también puede derivar de un anticuerpo monoclonal de ratón. En tal caso, la región variable completa deriva de anticuerpo monoclonal murino y se dice que el anticuerpo está quimerizado. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar anticuerpos quimerizados. Tales procedimientos incluyen, por ejemplo, los descritos en las patentes de Estados Unidos de Boss
(Celltech) y de Cabilly (Genentech). Véanse también Patentes de Estados Unidos Nº 4.816.397 y 4.816.567, respectivamente.
El ácido nucleico de ciertos aspectos de la invención es tal que la cadena pesada, cadena ligera o molécula de inmunoglobulina expresada del mismo tiene al menos un epítopo de linfocitos T heterólogo en el mismo de modo que la cadena pesada, cadena ligera o anticuerpo completo no pueda tomar su conformación nativa. El epítopo de linfocitos T puede interrumpir la proteína expresada de modo que la cadena pesada o el anticuerpo ya no pueden unirse a su antígeno, de modo que las cadenas pesadas y ligeras ya no se pueden asociar o de modo que la cadena pesada o el anticuerpo no puedan secretarse de forma apropiada, por ejemplo. La interrupción puede ser en la estructura terciaria del anticuerpo que puede evitar la formación de los enlaces disulfuro.
Como se analiza en más detalle posteriormente, los epítopos de linfocitos T se insertan en o sustituyen las regiones CDR1 y CDR2 del anticuerpo. CDR1 y CDR2 forman parte de la conformación en lámina 1 del anticuerpo y están sumergidas parcialmente dentro de la molécula plegada. Cualquier cambio en su longitud, composición de aminoácidos o carga romperá esta estructura y evitará el plegamiento y asociación de las cadenas pesadas y ligeras. CDRH3 se exponen en la superficie de la molécula de inmunoglobulina y es por lo tanto más permisiva para alteraciones. En ciertas realizaciones la pérdida de regiones flanqueantes en los puntos de unión de CDRH rompe completamente el plegamiento del anticuerpo pero no obstante la inserción de los epítopos en estas regiones proporciona buenas respuestas de linfocitos T. La incorporación de cualquier epítopo dentro de la CDRH1 (5 aminoácidos de longitud) o CDRH2 (17 aminoácidos de longitud) provoca suficiente interrupción para permitir la secreción de cadena pesada pero solamente cantidades muy pequeñas de anticuerpo intacto, incluso si la cadena ligera tiene su secuencia nativa. Esto muestra que la estructura secundaria es importante para emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras. La incorporación de cualquier epítopo dentro de CDRL1 de la cadena ligera da como resultado un bajo nivel de secreción de la cadena ligera, incluso si solamente hay un epítopo sencillo incorporado en la CDRH3 de la cadena pesada.
Se pretende que “epítopo de linfocitos T heterólogo” signifique un epítopo de linfocitos T que es heterólogo para el anticuerpo. Por ejemplo, un epítopo de linfocitos T heterólogo puede ser uno que no estaba previamente presente en el anticuerpo. El epítopo de linfocitos T heterólogo puede insertarse completo, aunque puede componerse de una secuencia de aminoácidos insertada, junto con aminoácidos flanqueantes de la segunda parte. Esto es para asegurar que el epítopo insertado tiene un perfil de procesamiento similar en el ácido nucleico heterólogo al del antígeno original.
Sorprendentemente los inventores han descubierto que, cuando se insertan epítopos de linfocitos T en regiones CDR o no CDR estructuralmente confinadas de la cadena pesada, proporcionan respuestas de CTL superiores. Esto parece deberse a la secreción de grandes cantidades de cadena pesada, que solamente pueden asociarse débilmente con cadena ligera debido a la inserción de epítopos voluminosos en sus regiones variables. Esto es contrario al dogma, que indica “que solamente las proteínas utilizadas de forma endógena por células presentadoras de antígenos se presentan en moléculas de MHC de clase I y ser reconocen por CTL”, documento WO 96/19584. La captación de antígeno exógeno y presentación en MHC de clase I es un procedimiento conocido como presentación cruzada y habitualmente requiere captación mediante receptores específicos. Este podría ser el receptor de CD64 para anticuerpos Fcy1 humanos. Sin embargo, se predeciría que grandes cantidades de anticuerpo intacto o complejos de antígeno-anticuerpo serían mejores en la dirección a este receptor. Por el contrario, los resultados presentados en el presente documento claramente muestran que niveles muy bajos de anticuerpo intacto y grandes cantidades de cadena pesada libre, que no deberían unirse a CD64, proporcionan respuestas de CTL superiores. De hecho, se muestran en el presente documento que las respuestas de CTL pueden estimularse cuando se insertan epítopos de CTL en anticuerpos que no se pueden unir a CD64, tales como anticuerpos IgG2 o moléculas IgG1 con su región de unión a CD64 reemplazada con la región no de unión a CD64 de IgG2.
El ácido nucleico que codifica la cadena pesada preferentemente incluye una secuencia líder para permitir que se secrete. Los presentes inventores han descubierto que, si la secuencia líder de la cadena pesada se retira para evitar la secreción y permitir que se produzca más proteína endógena, esto reduce la respuesta de CTL. Esto es completamente contrario a las expectativas. Sin desear quedar ligado a la teoría, los inventores creen que esto implica que el ácido nucleico se expresa en células no presentadoras de antígenos, que secretan altos niveles de cadena pesada y bajos niveles de proteína nativa que pueden después captarse por células presentadoras de antígenos. Como alternativa, el ácido nucleico puede transfectar directamente las células presentadoras de antígenos que migran al ganglio linfático de drenaje en el que secretan bajas cantidades de proteína nativa y grandes cantidades de cadena pesada que se capta por las mismas o adyacentes células presentadoras de antígenos y se presentan en MHC de clase I a CTL vírgenes. Por lo tanto, para que una vacuna de ácido nucleico estimule respuestas de CTL eficaces, debe codificar preferentemente epítopos de CTL dentro de una proteína que se secreta a niveles muy bajos y/o al mismo tiempo secreta grandes cantidades de proteína desnaturalizada. Sin embargo, una respuesta de CTL no puede madurar a una respuesta de memoria de alta afinidad en ausencia de respuestas auxiliares. Por lo tanto, se prefiere si se insertan epítopos auxiliares T en la cadena pesada o la molécula de inmunoglobulina, preferentemente en la región variable de cadenas ligeras de anticuerpo. De nuevo, sorprendentemente y a diferencia del dogma que indica que “solamente las proteínas captadas de forma exógena por las células diana se presentan por moléculas del MHC de clase II y se reconocen por linfocitos T auxiliares”, la cadena ligera se secretó solamente en cantidades muy bajas. La retirada de la secuencia libre para evitar la
secreción de la cadena ligera no tuvo efecto en las respuestas auxiliares. En consecuencia, el ácido nucleico de la presente invención puede o no tener una secuencia líder para la cadena ligera del anticuerpo. Estos resultados implican que el ácido nucleico se capta por las células presentadoras de antígenos que presentan los epítopos de linfocitos T en el contexto de MHC de clase II de proteína sintetizada de forma endógena, posiblemente por autofagia. Para que los linfocitos T auxiliares asistan a las respuestas de CTL, ambos epítopos de linfocitos T que reconocen deben presentarse en las mismas células presentadoras de antígenos en un proceso conocido como ayuda de linfocitos T ligados. Esto implica que la célula presentadora de antígenos que sintetiza la cadena ligera, codificada por el ácido nucleico, también debe sintetizar, secretar y presentar de forma cruzada los epítopos de CTL por sí mismas o captar cadena pesada de una APC adyacente.
Se desvelan en el presente documento células dendríticas aisladas que presentan los epítopos de linfocitos T auxiliares heterólogos en MHC de clase II de cadena ligera producida de forma endógena y epítopos de CTL heterólogos de cadena pesada presentada de forma cruzada. Tales células dendríticas pueden usarse en las terapias descritas en el presente documento.
Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden hacer a los epítopos de linfocitos T existentes más inmunogénicos codificando un anticuerpo desnaturalizado que conduce a un aumento en tanto la frecuencia como la avidez de respuestas de linfocitos T.
El ácido nucleico de la invención pueden ser ADN, ADNc o ARN tal como ARNm, obtenido por clonación o producido completamente o parcialmente por síntesis química. Para uso terapéutico, el ácido nucleico está preferentemente en una forma capaz de expresarse en el sujeto a tratar.
El ácido nucleico de la presente invención puede ser recombinante o proporcionarse como un aislado, en forma aislada y/o purificada. Puede estar sin o sustancialmente sin ácido nucleico que flanquee el gen en el genoma humano, excepto posiblemente una o más secuencias reguladoras para la expresión. Cuando el ácido nucleico de acuerdo con la invención incluye ARN, la referencia a las secuencias mostradas en el presente documento debería interpretarse como referencia al ARN equivalente, con T sustituida por U.
Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden prepararse fácilmente por el experto en la materia, por ejemplo usando la información y referencias contenidas en el presente documento y técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, “Molecular Cloning”, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. y Ausubel y col, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, 1992), dadas las secuencias de ácido nucleico y clones disponibles. Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras de dicho ácido nucleico, por ejemplo de fuentes genómicas, (ii) síntesis química o (iii) preparar secuencias de ADNc. El ADN que codifica el polipéptido puede generarse y usarse de cualquier manera adecuada conocida por los expertos en la materia, incluyendo tomando ADN codificante, identificando sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados a cualquiera de los lados de la parte a expresar y cortando dicha parte del ADN. Otro enfoque recombinante es amplificar la parte relevante del ADN con cebadores de PCR adecuados. Pueden realizarse modificaciones a las secuencias, por ejemplo usando mutagénesis dirigida, para conducir a la expresión de péptido modificado o para tener en cuenta preferencias codónicas en las células huésped usadas para expresar el ácido nucleico.
Para obtener expresión de las secuencias de ácido nucleico, las secuencias pueden incorporarse en un vector que tenga una o más secuencias de control unidas operativamente al ácido nucleico para controlar su expresión. Los vectores pueden incluir otras secuencias tales como promotores o potenciadores para conducir la expresión del ácido nucleico insertado, secuencias de ácido nucleico de modo que el polipéptido se produzca como una fusión y/o ácido nucleico que codifica señales de secreción de modo que el polipéptido producido en la célula huésped se secreta de la célula. Si se desea, puede obtenerse después el polipéptido transformando los vectores en células huésped en las que el vector es funcional, cultivando las células huésped de modo que el polipéptido se produce y recuperando el polipéptido de las células huésped o el medio circundante. Se usan células procariotas y eucariotas para este fin en la técnica, incluyendo cepas de E. coli, levadura y células eucariotas tales como células de insecto y células animales, por ejemplo, células COS, CHO, Melanoma de Bowes y otras células humanas adecuadas. Cuando la presente invención se refiere a ácido o ácido nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, los ácidos nucleicos respectivos pueden estar presentes en el mismo vector de expresión, conducidos por los mismos o diferentes promotores o vectores de expresión separados.
Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden usarse para estimular una respuesta inmune contra al menos uno de los epítopos de linfocitos T en un paciente tal como un mamífero, incluyendo ser humano. Las respuestas de linfocitos T auxiliares y/o citotóxicos pueden estimularse. La respuesta de linfocitos T contra un epítopo particular obtenido por la presente invención puede tener una mayor avidez que la obtenida por inmunización con el mismo epítopo como un péptido simple o por inmunización con el mismo epítopo codificado dentro de un antígeno como un péptido o un ácido nucleico. Los ácidos nucleicos de la invención pueden administrarse como una terapia de combinación, es decir un ácido nucleico que codifica la cadena ligera y ácido nucleico que codifica a cadena pesada. El ácido nucleico puede administrarse por vía intravenosa, vía intradérmica, vía intramuscular, vía oral o por otras vías. Se prefiere administración intradérmica o intramuscular debido a que estos tejidos contienen células dendríticas.
Como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un ser humano o animal no humano. El tratamiento puede ser de una enfermedad heredada o adquirida. Preferentemente, el tratamiento es de una afección/trastorno asociado con proliferación celular tal como cáncer o enfermedad infecciosa. Los ejemplos de tipos de cáncer que pueden tratarse con el ácido nucleico incluyendo cualquier tumor sólido, cáncer colorrectal, tumores de pulmón, mama, gástrico, ovárico, uterino, de hígado, de riñón, pancreático, melanoma, de vejiga, de cabeza y cuello, cerebral, esofágico, pancreático y de hueso, así como cánceres de tejido blando y leucemias.
El ácido nucleico puede emplearse en combinación con un vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
Pueden emplearse adyuvantes para facilitar la estimulación de la respuesta inmune del huésped y pueden incluir hidróxido de aluminio, lisolecitina, pluronic, polioles, polianiones, péptidos, proteínas y emulsiones en aceite.
Los ácidos nucleicos útiles en la invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las sustancias anteriores, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizador farmacéuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Tales materiales deberían ser no tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, vías intradérmica, oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal. La formulación es preferentemente ácido nucleico como un polvo seco estable precipitado en la superficie de partículas de oro microscópicas y adecuado para inyección mediante una pistola génica. La formulación puede ser adecuada para administración intradérmica o intramuscular usando electroporación.
Las composiciones que comprenden, o para suministro de, ácidos nucleicos se administran preferentemente a un individuo en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, siendo suficiente esta para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada, y la tasa y ciclo temporal de administración, dependerá de la naturaleza y gravedad de lo que se trata. La prescripción de tratamiento, por ejemplo decisiones sobre la dosificación etc., está dentro de la responsabilidad de los facultativos generales y otros doctores en medicina y típicamente tiene en cuenta el trastorno a tratar, la condición del paciente individual, el sitio de suministro, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los facultativos. Los ácidos nucleicos de la invención son particularmente relevantes para el tratamiento de cáncer existente y en la prevención de la recurrencia de cáncer después del tratamiento inicial o cirugía. Los ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden hallarse en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Oslo, A. (ed), 1980.
Preferentemente, el ácido nucleico de la invención estimula linfocitos T auxiliares y/o citotóxicos que pueden inhibir de forma significativa el crecimiento de células tumorales cuando se administran en un ser humano en una cantidad eficaz. La dosis óptima puede determinarse por los médicos basándose en varios parámetros incluyendo, por ejemplo, edad, sexo, peso, gravedad de la afección a tratar, el principio activo que se administra y la vía de administración. Por ejemplo, una dosis de 1-1000 !g de ADN es suficiente para estimular respuestas de linfocitos T tanto auxiliares como citotóxicos.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden administrarse junto con ingredientes farmacéuticamente aceptables adicionales. Tales ingredientes incluyen, por ejemplo, estimuladores del sistema inmune.
Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, simultáneamente o secuencialmente dependiendo de la afección a tratar. Otros tratamientos de cáncer incluyen otros anticuerpos monoclonales, otros agentes quimioterapéuticos, otras técnicas de radioterapia u otra inmunoterapia conocida en la materia. Una aplicación particular de las composiciones de la invención es como un auxiliar para cirugía, es decir para ayudar a reducir el riesgo de reaparición de cáncer después de que se haya retirado un tumor.
Las inyecciones (id) pueden ser la vía primaria para administración terapéutica del ácido nucleico de la presente invención.
Los ácidos nucleicos pueden administrarse de una manera localizada a un sitio tumoral u otro sitio deseado o pueden suministrarse de una manera en la que se dirigen a tumor u otras células.
La dosis de ácido nucleico dependerá de las propiedades del agente empleado, por ejemplo, su actividad de unión y semivida en plasma in vivo, la concentración del polipéptido en la formulación, la vía de administración, el sitio y la tasa de dosificación, la tolerancia clínica del paciente implicado, la afección patológica de la que está aquejado el paciente y similares, como queda dentro de la experiencia del médico. Por ejemplo, se prefieren dosis de 100 !g de ácido nucleico por paciente por administración, aunque las dosificaciones pueden variar de aproximadamente 10 !g a 1 mg por dosis. Se utilizan diferentes dosificaciones durante una serie de inoculaciones secuenciales; el facultativo puede administrar una inoculación inicial y después reforzar con dosis relativamente más pequeñas de ácido nucleico.
Se desvela en el presente documento un procedimiento para obtener por ingeniería genética, epítopos de linfocitos
T de antígenos diana en las regiones variables de anticuerpos y el uso de tales anticuerpos obtenidos por ingeniería genética como vacunas para estimular respuestas de linfocitos T tanto auxiliares como citotóxicos.
También se desvela en el presente documento una célula huésped que contiene un ácido nucleico como se desvela en el presente documento. El ácido nucleico de la invención puede integrarse en el genoma (por ejemplo cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma de acuerdo con técnicas convencionales. El ácido nucleico puede estar en un vector extracromosómico dentro de la célula o ser de otra forma de forma identificable heterólogo o ajeno a la célula.
También se desvela en el presente documento un procedimiento, que comprende introducir el ácido nucleico de la invención en una célula huésped. La introducción, que puede (particularmente para introducción in vitro) generalmente denominarse sin limitación “transformación”, puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección de fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposoma y transducción usando retrovirus u otro virus, por ejemplo vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro cálcico, electroporación y transfección usando bacteriófago. Como alternativa, puede emplearse inyección directa del ácido nucleico.
Pueden usarse genes marcadores tales como genes de sensibilidad o resistencia a antibióticos en la identificación de clones que contienen el ácido nucleico de interés, como se conoce bien en la técnica.
La introducción puede seguirse provocando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, por ejemplo cultivando las células huésped (que pueden incluir células de hecho transformadas aunque más probablemente las células serán descendientes de las células transformadas) en condiciones para la expresión del gen, de modo que se produce el polipéptido (o péptido) codificado. Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido líder de señal apropiado, puede secretarse de la célula al medio de cultivo. Tras la producción por expresión, puede aislarse un polipéptido o péptido y/o purificarse de la célula huésped y/o medio de cultivo, según sea el caso, y posteriormente usarse como se desee, por ejemplo en la formulación de una composición que puede incluir uno o más componentes adicionales, tal como una composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes, vehículos o transportadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo véase posteriormente).
Se desvela en el presente documento un procedimiento para identificar epítopos de linfocitos T en un antígeno candidato, que comprende:
agotar los linfocitos T reguladores en un animal no humano;
inmunizar al animal no humano con un antígeno candidato; y
explorar para ver si se induce una respuesta de linfocitos T contra péptidos para epítopos predichos en el antígeno candidato o todos los péptidos solapantes posibles dentro del antígeno candidato.
El procedimiento puede llevarse a cabo en un animal no humano, tal como un ratón o una rata. Los linfocitos T reguladores pueden eliminarse en el animal no humano usando anticuerpos anti-CD25, que opcionalmente pueden conjugares con toxinas tales como Ontak, o por quimioterapia tal como ciclofosfamida que preferentemente mata linfocitos T reguladores. Una vez que se han agotado los linfocitos T reguladores, el animal no humano puede inmunizarse con ADN que codifica el antígeno candidato o mediante el antígeno candidato en sí mismo. Se prefiere que el antígeno candidato se proporcione como una proteína de fusión de Fc-antígeno. En la etapa de exploración, se identifica el péptido contra el que se estimuló cualquier respuesta de linfocitos T en el animal no humano. Esto puede realizarse in vitro usando una técnica tal como ELISPOT. Si se induce una respuesta de linfocitos T a un epítopo candidato, este epítopo puede usarse para inmunizar un animal no humano. Si este péptido induce una respuesta de linfocitos T, la avidez y frecuencia puede potenciarse codificando el epítopo dentro de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Este procedimiento puede permitir la identificación de epítopos de linfocitos T que se procesan por el inmunoproteasoma.
La invención se describirá ahora adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes. Se hace referencia a los siguientes dibujos:
Figura 1; Mapa que representa los elementos del vector de cadena pesada pOrigHIB. La región variable pesada desinmunizada de tipo silvestre del anticuerpo SC100 se clonó usando HindIII/AfeI en fase con la región constante de Fc de IgG1 humano. La región Fc comprende los dominios CH1, CH2, CH3 y la región bisagra. La expresión a alto nivel en células de mamífero se conduce a partir del promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. La poliadenilación de BGH señaliza cadena abajo de la cadena de IgG1 humana HIB Orig para asegurar la estabilidad del ARNm y su terminación eficaz. EM7 es un promotor bacteriano que controla la expresión del gen de resistencia a zeocina que permite la selección por antibióticos en E. coli mientras que el promotor temprano de SV40 cadena arriba del gen de resistencia permite la selección en células de mamífero. La poliadenilación de SV40 señaliza cadena abajo del gen de resistencia para dirigir el procesamiento apropiado del extremo 3’ del ARNm zeo. El vector también contiene dentro de su cadena principal el origen ColE1 de replicación para propagación en bacterias. Las
secuencias de ADN determinantes de complementariedad se retiraron eficazmente y se cambiaron por sitios de restricción RE1, RE2 y RE3 (FspI, MacI y Srf I respectivamente) de forma sencilla y en combinación.
Figura 2: Mapa que representa los elementos del vector de cadena pesada pOrigLIB. La región variable ligera desinmunizada de tipo silvestre del anticuerpo SC100 se clonó usando BamHI/BsiWI en fase con la región constante kappa humana. La expresión de alto nivel en células de mamífero se conduce desde el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. La poliadenilación de BGH se analiza cadena abajo de la cadena de Orig LIB para asegurar la estabilidad del ARNm y su terminación eficaz. El vector también incluye el origen de replicación ColE1 y el gen de resistencia a antibióticos para ampicilina que permite la propagación y selección en bacterias. Las regiones determinantes de complementariedad se retiraron eficazmente y se cambiaron por los sitios de restricción RE4, RES y RE6 (EcoRV, Ssp I y Hpa I FspI, MacI y Srf I respectivamente) de forma sencilla y en combinación.
Figura 3: Secuencia de la cadena pesada quimérica de Immunobody de tipo silvestre. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos en traducción se ilustra para la cadena pesada de IgG1 quimérica de longitud completa. Las localizaciones CDR están dentro de cajas definidas por el esquema de numeración de kabat. El codón de parada se representa por un asterisco rojo. Se destacan los sitios de restricción de HindIII/Afe I utilizados en la transferencia de la región pesada variable.
Figura 4: Secuencia de la cadena kappa quimérica de Immunobody de tipo silvestre. Se ilustran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos en traducción para la cadena de kappa quimérica de longitud completa. Las localizaciones de CDR están dentro de cajas definidas por el esquema numérico de kabat. El codón de parada se representa por un asterisco. Se destacan los sitios de restricción de BamHIlBsiWI utilizados en la transferencia de la región ligera variable.
Figura 5: PCR de extensión solapante
Se retiraron las CDR y se reemplazaron con sitios de restricción únicos por PCR solapante. Los cebadores directos H1, H2, H3, L1, L2 y L3 (Tabla 2) se diseñaron para reemplazar CDR1, 2 y 3 dentro de la región variable de cadena pesada y ligera respectivamente. Cada cebador contenía, localizado de forma central, la secuencia de reconocimiento enzimático única seleccionada desprovista de la secuencia CDR a retirar (sección verde) y flanqueada por 10-20 pb de secuencia de tipo silvestre. Los cebadores directos se usaron en un primer ciclo de PCR junto con un cebador inverso general, huHeClonR o huLiClonR (Tabla 2), que hibrida con los dominios constantes pesados y ligeros humanos dentro de las construcciones de tipo silvestre pOrigHIB y pOrigLIB respectivamente. El fragmento generado no contiene secuencia CDR de tipo silvestre (sección roja), pero se intercambia eficazmente por el sitio de restricción. Para amplificar la región pesada y ligera variable completa, se requiere un segundo ciclo de PCR usando el producto de PCR generado del primer ciclo como un cebador inverso con el cebador directo de CMV general que hibrida con el promotor de CMV dentro de los plásmidos sencillos. Se subclonaron productos de PCR de segundo ciclo en pCR2.1 (Invitrogen) y, después de la confirmación de la secuencia, las regiones variables pesada/ligera (VH y VL) que contenían versiones H1, H2, H3, L1, L2 y L3 de forma sencilla, en combinación y juntas se insertaron de nuevo en las construcciones sencillas pOrigHIB y pOrigLIB, intercambiando las regiones de tipo silvestre usando HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI respectivamente.
Figura 6: Secuencia de la región variable de cadena pesada de ImmunoBody. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región variable pesada en la que se han reemplazado CDR con su sitio de enzima correspondiente H1, H2 y H3, de forma sencilla, en combinación y juntos. Se destacan los sitios de enzima de restricción únicos. CDR1, 2 y 3 se reemplazaron con FspI, MscI y SrfI respectivamente.
Figura 7: Secuencia de la región variable de cadena kappa de ImmunoBody. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región variable pesada en la que se han reemplazado las CDR con su sitio de enzima correspondiente L1, L2 y L3, de forma sencilla, en combinación y juntos. Se destacan los sitios de enzima de restricción únicos. CDR1, 2 y 3 se reemplazaron con EcoRV, SspI y HpaI respectivamente.
Figura 8: Mapa que representa los elementos del vector de expresión doble pDCOrig. Una vez que todos los epítopos se han incorporado en los sitios pesados variables y ligeros variables dentro de los vectores sencillos, se transfieren al vector de expresión doble utilizando como se destaca HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI en fase con sus regiones constantes humanas respectivas. La región Fc de la cadena pesada comprende los dominios CH1, CH2, CH3 y la región bisagra. La expresión de alto nivel de las cadenas tanto pesadas como ligeras en células de mamífero se conduce desde el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. La poliadenilación de BGH señaliza cadena debajo de ambas cadenas para asegurar la estabilidad del ARNm y su terminación eficaz. EM7 es un promotor bacteriano que controla la expresión del gen de resistencia a zeocina permitiendo la selección por antibióticos en E. coli mientras que el promotor temprano de SV40 cadena arriba del gen de resistencia permite la selección en células de mamífero. La poliadenilación de SV40 señaliza cadena abajo del gen de resistencia para dirigir el procesamiento apropiado del extremo 3’ del ARNm zeo. El vector también contiene dentro de su cadena principal el origen
ColE1 de replicación para propagación en bacterias.
Figura 9: Secuencia de la cadena pesada de IB15 de immunobody que contiene un codón de parada que evita la síntesis de la región Fc.
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada quimérica, pDCOrig IB15 CH1 parada. Se insertó un codón de parada por mutagénesis dirigida después del dominio CH1 de la región constante de Fc de IgG1 humana como se representa por un asterisco. Los nucleótidos y aminoácidos en negrita representan el domino CH1. Los aminoácidos dentro de cajas representan el epítopo GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo TRP2 en H2 (SVYDFFVWL). Se destacan los sitios de restricción de HindIII/Afe I utilizados en la transferencia de la región pesada variable de la construcción sencilla.
Figura 10: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región variable pesada de DCIB15 sin un líder.
El líder se retira por PCR usando el cebador directo pOrig pesado sin líder con el cebador inverso huHeClonR (Tabla 2) que se une al dominio CH1 de IgG1 humana reamplificando eficazmente la región variable pesada (VH). Después de confirmación de secuencia, la región VH sin líder se clona de nuevo en la construcción de expresión doble DCIB15 usando HindII/AfeI en fase con la región constante de IgG1 humana. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo TRP2 en H2 (SVYDFFVWL). Los sitios de restricción HindIII/Afe I utilizado en la transferencia de la región variable pesada se destacan.
Figura 11: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región variable kappa de DCIB15 sin un líder.
El líder se retiró por PCR usando el cebador directo pOrig ligero sin líder, reamplificando el cebador inverso huLiClonR (Tabla 2) la región variable ligera (VL). Después de la confirmación de secuencia, la región VL sin líder se clona de nuevo en la construcción de expresión doble DCIB15 usando BamHI/BsiWI en fase con la región constante kappa humana. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción de BamHI/BsiWII utilizados en la transferencia de la región ligera variable.
Figura 12: Secuencia de región constante de IgG2 humana
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región constante de IgG2 humana pesada amplificada. Se destacan los sitios de restricción AfeI y SapI utilizados en la transferencia y reemplazo de la región constante de huigG1 en el vector de expresión doble DCIB15.
Figura 13: Secuencia de región constante de IgG3 humana
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la región constante de IgG2 humana pesada amplificada. Se destacan los sitios de restricción de AfeI y SapI utilizados en la transferencia y reemplazo de la región constante de huigG1 en el vector de expresión doble DCIB15
Figura 14: Isotipos humanos del vector de expresión doble de immunobody.
A Mapa del vector de expresión doble pDCOrigIB15 huigG2.
B Mapa del vector de expresión doble pDCOrigIB15huigG3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región pesada y ligera variable.
Figura 15: Secuencia de cadena pesada de DCIB66 que contiene el motivo G2. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada quimérica. Los aminoácidos E233 L234 L235 dentro de un motivo de unión crítico para la interacción con el FcyR1 de alta afinidad (CDR64) se sustituyeron con P233 V234 A235 de IgG2 humana destacada en negrita dentro de una caja. Otros aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL).
Los sitios AgeI/AhdI destacados se usaron en la transferencia de la sección que contiene las sustituciones a pDCOrigIB15 huigG1. Los sitios de restricción HindIII/AfeI utilizados en la transferencia de la región pesada variable se representan en negrita.
Figura 16: Secuencia de cadena pesada de DCIB67 que contiene el motivo de unión G1. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada quimérica. Los aminoácidos P233 V234 A235 dentro de la región constante de IgG2 humana se sustituyeron con el motivo de unión crítico para interacción con el FcyR1 de alta afinidad (CDR64) E233 L234 L235 G236 de IgG1 humana destacadas en negrita dentro de una caja. Otros aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL).
Los sitios AgeI/AhdI destacados se usaron en la transferencia de la sección que contiene las sustituciones a pDCOrigIB15 huigG1. Los sitios de restricción HindIII/AfeI utilizados en la transferencia de la región variable
pesada se representan en negrita.
Figura 17: Vectores de expresión de Immunobody de IgG2a murina. Mapas de (A) vector pMoOrigHIB de cadena sencilla, (B) vector de expresión doble DCIB53 que contiene el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV), el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL) y (C) vector de expresión doble OGIB63 que contiene el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) en H1, el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 (WNRQLYPEWTEAQRLO). Se representan los sitios de restricción utilizados.
Figura 18: Diagrama esquemático para representar la construcción del plásmido conforme regulador pVAXDCIB54.
El vector de cadena sencilla pesado pVaxIB54 HIB (A) se linealizó usando Nrul. El casete de expresión de cadena ligera de pOrgLIB (B) se escindió usando Nrul y HpaI y se clonó en el plásmido linealizado para generar el vector de expresión doble pVaxDCIB54 (C). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de región variable pesada y ligera.
Figura 19: Secuencia de DCIB15
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV), el epítopo de TRP2 en H2, (SVYDFFVWL) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 20: Las construcciones de ImmunoBody producen niveles bajos de proteína intacta. A, cuantificación del nivel de cadena pesada de ImmunoBody por ELISA de tipo sándwich del sobrenadante de células CHO-S transfectadas con ImmunoBody que contienen gp100/H1, TRP2/H2 y HepB CD4/L1 (DCIB15). Se usó sobrenadante puro y se diluyó 1 en 3, 1 en 10 y 1 en 30 en medio y se comparó con un control positivo de IgG humana.
B, análisis de ImmunoBody purificado que contiene gp100/H1, TRP2/H2 y HepB help/L1 (DCIB15) por ELISA de tipo sándwich en comparación con un control positivo. C y D. Determinación de la expresión de cadena pesada e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S por ELISA de tipo sándwich. Las placas se revistieron con un anticuerpo específico anti Fc humano. Para detectar cadena pesada se usó un anticuerpo de HRP específico anti-Fc de IgG humana y para detectar ImmunoBody intacto se usó un anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana. E, determinación de cadena pesada, cadena ligera e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S (DCIB15, DCI831. DCIB32, DCIB36, DCI848, DCIB49. DCIB52, DCIB54) por ELISA de tipo sándwich. Se revistieron placas con un anticuerpo específico anti Fc humano o anticuerpo anti cadena kappa humano. Para detectar cadena pesada se usó un anticuerpo de HRP específico anti-Fc de IgG humana en combinación con el anticuerpo de revestimiento específicos anti Fc humano. Para detectar ImmunoBody intacto se usó un anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana en combinación con anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar cadena ligera se usó anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana en combinación con el anticuerpo específico anti cadena kappa humana.
Figura 21: Secuencia de DCIB24
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de ovoalbúmina en H2 (SIINFEKL) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 22 Secuencia de DCIB25
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV), el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL) y el epítopo de HepB CD4 en L3 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 23: Secuencia de DCIB31
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con
las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 24: Secuencia de DCIB32
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H3 y el epítopo de HepB CD4 en L3 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 25: Secuencia de DCIB36
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en L3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 26: Secuencia de DCIB48
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 27: Secuencia de DCIB49
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) en H3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 28: Secuencia de DCIB52
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) en H3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 29: Secuencia de DCIB54
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) en H1. El epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 30: Secuencia de DCIB18
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 31: los epítopos de CTL incorporados en el armazón de ImmunoBody se procesan y se presentan para inducir una respuesta inmune in vivo.
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 con una construcción de ImmunoBody que contenía el epítopo de TRP2 en CDR H2 y el epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB18). El día
19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2, péptido auxiliar de HepB y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, se ensayaron esplenocitos de los ratones inmunizados con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración creciente de péptido en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de la función efectora máxima.
C, se agotaron los linfocitos T CD8 de esplenocitos de ratones inmunizados y se analizaron frente a péptido TRP2, péptido auxiliar HepB y un control de medio con respecto a la presencia de respuestas específicas de epítopo en el ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
D, citotoxicidad de esplenocitos de ratones inmunizados en un ensayo de liberación de 51Cr de cuatro horas frente a las líneas celulares de melanoma B16F10, B16F10 IFNa y B16F10 siKb después de 6 días de estimulación con péptido TRP2 in vitro.
E, se inmunizaron ratones transgénicos C57BI/6 o HLA-DR4 los días 0, 7 y 14 con ADN de ImmunoBody (DCIB15, DCIB31, DCIB32, DCIB36, DCIB48, DCIB52 y DOB54). El día 19 los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2 y control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
F, se ensayaron los esplenocitos de ratones inmunizados con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración creciente de péptido en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
G, se inmunizaron ratones transgénicos C57BI/6 o HLA-DR4 los días 0, 7 y 14 con ADN de ImmunoBody (DCIB15, DCIB31, DCIB32, DCIB36, DCIB48, DCIB52 y DOB54). El día 19 los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido auxiliar HepB (DOB15, DCIB49 y DCIB52) o péptido auxiliar gp1 OODR4 (DCIB48 y DCIB54) y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 32: La inmunización con ADN de ImmunoBody es mejor que la inmunización con péptidos o inmunización con antígeno completo.
A, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (mezclas DOB18) con inmunización s.c. con epítopo peptídico en adyuvante incompleto de Freund o inmunización con un ADN que expresa antígeno de TRP2. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos mediante ensayo de elispot de IFN y frente a péptido TRP2 (.), péptido
auxiliar HepB ( ) y un control de medios (0). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, se ensayaron los esplenocitos de ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody (0) y péptido (+) con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración creciente de péptido en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
C, citotoxicidad de esplenocitos de ratones inmunizados en un ensayo de liberación de 51Cr de 4
horas frente a las líneas celulares de melanoma B16F10 (.), B16F10 IFNa ( ) y B16F10 siKb (0) después de 6 días de estimulación con péptido TRP2 in vitro.
D, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB18) con la inmunización con DC pulsadas con péptido TRP2. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFNy frente a cantidades de titulación de péptido TRP2. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
E, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB18) con la inmunización con DC pulsadas con péptido TRP2. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 los esplenocitos se estimularon in vitro con blastos de LPS pulsados con péptido TRP2. Seis días después de la estimulación se evaluaron las líneas de CTL mediante ensayo de liberación de cromo con respecto a la capacidad para lisar líneas de melanoma B16F10 o B16F10 siKb. Las respuestas se miden como % de citotoxicidad.
F, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB24) con la inmunización con péptido SIINFEKL. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido SIINFEKL y un péptido de control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
G, se comparó la inmunización por ADN de ImmunoBody (DCIB15) con la inmunización con péptido gp100 210M. Se inmunizaron ratones HHDII los días 0,7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFNy frente a cantidades de titulación de péptido gp100 210M y un control. Se miden las respuestas de control como puntos/millón de esplenocitos.
H, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB24) con la inmunización con péptido SIINFEKL. Se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFNy frente a cantidades de titulación de péptido SIINFEKL. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
I, se comparó la inmunización con ADN de ImmunoBody (DCIB15) con la inmunización con péptido gp100 210M. Se inmunizaron ratones HHDII los días 0, 7 y 14 y el día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFNy frente a cantidades de titulación de péptido gp100 210m. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
Figura 33: Secuencia de DCIB21
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de HepB S Ag TRP2 en H2 (IPQSLDSWWTSL) y el epítopo Flu HA CD4 restringido con I-Ad en L1 (FERFEIFPLE). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 34: Pueden procesarse epítopos múltiples del sitio CDR H2.
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 los días 0, 7 y 14 con construcción de ImmunoBody que contenía epítopo SIINFEKL en CDR H2 y epítopo HepB CD4 en CDR L1 (DCIB24). El día 19 se analizaron los esplenocitos en ensayo de elispot de IFNy frente a péptido SIINFEKL, un péptido irrelevante, péptido HepB CD4 y control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, se inmunizaron ratones Balb/c los días 0, 7 y 14 con construcción de ImmunoBody que contenía epítopo de HepB CDB en CDR H2 y epítopo de Flu HACD4 en CDR L1 (DCIB21). El día 19 se analizaron los esplenocitos en ensayo de elispot de IFNy frente a péptido HepB CD8, un péptido irrelevante, péptido Flu HA CD4 y control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 35: Secuencia de OCIB17
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 36: Secuencia de DCIB26
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesada y ligera variables clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de Tie-2 Z84 en H1 (FLPATLTMV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 37: Pueden procesarse múltiples epítopos de CTL de la región variable.
A, se inmunizaron ratones HHDII los días 0, 7 y 14 con construcción de ImmunoBody que contenía epítopo de gyp100 IMDQVPFSV en CDR H1 con retirada de parte del armazón y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB17). El día 19 se analizaron los esplenocitos en ensayo de elispot de IFNy frente a péptido de gp100 INlDQVPFSV, péptido HepB CD4 y control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, se inmunizaron ratones HHDII los días 0, 7 y 14 con construcción de ImmunoBody que contenía epítopo de Tie2 en CDR H1 con retirada de parte del armazón y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB26). El día 19 se analizaron los esplenocitos en ensayo de elispot de IFNy frente a péptido Tie2, péptido HepB CD4 y control de medios. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 38: Pueden generarse respuestas de CTL múltiples de diferentes epítopos dentro de la misma construcción de ImmunoBody. Se obtuvo por ingeniería genética epítopo de gp100 IMDQVPFSV restringido por HLA-A2 en el sitio CDR H1 junto con el epítopo de TRP2 SVYDFFVWL en CDR H2 y el epítopo de HepB CD4 estaba presente en el sitio CDR L1 (DCIB15).
A, se inmunizaron ratones HHDII los días 0, 7 y 14 con ADN de ImmunoBody. El día 19 se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido gp100, péptido TRP2, péptido auxiliar HepB y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados con respecto a avidez para el epítopo de gp100 modificado IMDQVPFSV (+), epítopo de gp100 wt ITDQVPFSV (.) y epítopo TRP2 (.) midiendo las respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
C, citotoxicidad de los esplenocitos de ratones inmunizados en un ensayo de liberación de 51Cr de 4 horas frente a linfocitos T2 pulsados con péptido gyp100 IMDQVPFSV, péptido TRP2 o control y las líneas celulares de melanoma B16F10 y B16F10 HHD.
D, se inmunizaron ratones HHDII los días 0, 7 y 14 con ADN de ImmunoBody que contenía 1) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15) o ii) epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB18). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN y frente a péptido gp100 (.),
péptido TRP2 ( ), péptido auxiliar HepB ( ) y un control de medio (0). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
E, se inmunizaron ratones C57BI/6 i.m. con 10 !g de solución de ADN combinada con electroporación. Se realizaron inmunizaciones tres veces a intervalos semanales en los músculos tibiales. Los ratones se inmunizaron con DCIB24 u OCIB18 solamente, ambos combinados en el mismo sitio o con ambos a la vez pero en sitios separados. El día 19 se analizaron los esplenocitos con respecto a la presencia de respuestas inmunes específicas de péptido de TRP2, SIINFEKL. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 39: Secuencia de DCIB37
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables ligeras y pesadas clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100 F7L en H1 (TITDQVPLSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 40: Secuencia de DC1840
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100 F71 en H1 (TITDQVPISV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 41: Secuencia de DGIB41
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes Fc y kappa de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de tipo silvestre de GP100 en H1 (TIMDQVPFSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 42: Secuencia de DCIB42
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con
las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100 F7Y en H1 (TITDQVPYSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 43: Secuencia de DCIB43
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100 V5L en H1 (TITDQLPFSV) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL). Se destacan los sitios de restricción de HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 44: La modificación en los restos no de anclaje puede potenciar la inmunogenicidad de epítopos.
Se inmunizaron ratones HHDII los días 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían epítopos de gp100 modificados en la región CDR H1 (DCIB37, DCIB40, DCIB41, DCIB42 y OCIB43). El día 19, se analizaron los esplenocitos por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido epitópico de tipo silvestre de gp100 y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 45: Secuencia de DCIB35
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMOAVPFSV), el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL) y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-OR4 en L1 (WPIRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 46: Pueden procesarse múltiples respuestas auxiliares de CD4 y presentarse para inducir una respuesta inmune in vivo.
A. Se inmunizaron ratones HHDII o C57B1/6 los días 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de HepB CD4 restringido con I-Ab en la región CDR L1 (DCIB15).
B, se inmunizaron ratones Balb/c los días 0, 7 y 14 con construcción de ImmunoBody que contenían el epítopo de Flu HA CD4 restringido con I-Ad en la región CDR L1 (DCIB21).
C, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-DR4 los días 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de gp100 CD4 restringido con HLA-DR4 en la CDR L1 (DCIB35). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente al péptido correspondiente, un péptido irrelevante y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
D. Se inmunizaron ratones transgénicos HLJ-DR4 los días 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de gyp100 CD4 restringido con HLA-CD4 en la CDR L1 (DCIB35), en la CDR H3 (DCIB54) y en la CDR L3 (DOISSO). El día 19, se analizaron los esplenocitos por ensayo elispot de IFNy frente al péptido correspondiente, un péptido irrelevante y un control de medio. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 47: Secuencia de DCIB50
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M (TIMDQVPFSV) en H1, el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido con HLA-DR4 (WNRQLYPEWTEAQRLD) en L3. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 48: Las respuestas de linfocitos T CD8 dependen parcialmente de la cadena pesada secretada pero las respuestas auxiliares no requieren cadena ligera secretada.
A, se inmunizaron ratones HHDII el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la secuencia líder en la cadena pesada, iii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la secuencia líder en la cadena ligera. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a
péptidos gp100 (.) y HepB CD4 ( ) y un control de medio (0). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, determinación de cadena pesada, cadena ligera e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S mediante ELISA de tipo sándwich. Las placas se revistieron con un anticuerpo específico anti Fc humano o anticuerpo anti cadena kappa humana. Para detectar cadena pesada se usó un anticuerpo de HRP específico anti Fc de IgG humana en combinación con el anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar ImmunoBody se usó un anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana en combinación con anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar cadena ligera se usó anticuerpo de HRP específico de anti cadena kappa humana en combinación con el anticuerpo específico anti cadena kappa humana.
C, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la secuencia líder en la cadena pesada. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
D, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la secuencia líder en la cadena pesada. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido auxiliar HepB. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 49: La región Fc de ImmunoBody es beneficiosa para establecer una respuesta inmune eficaz.
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la región Fc. El día 19, los esplenocitos se analizaron por
ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2 ( ), un control de medio ( 0), la línea de
melanoma B16F10 (.) y la línea celular de control negativo B16F10 siKb ( ). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 (DCIB15), ii) epítopo de gyp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 sin la región Fc. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
C, los mismos ratones se analizaron con respecto a respuestas específicas para el epítopo auxiliar HepB. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
D, los esplenocitos de ratones inmunizados con DCIB15 o DCIB15 sin la región Fc (DCIB15 FcStop) se ensayaron con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
E, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían i) epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 de IgG humana (DCIB15), ii) la misma construcción con región constante de IgG2 humana (DCIB33), iii) la misma construcción con región constante de IgG3 humana (DCIB65), iv) la misma construcción con el motivo de unión a IgG1 humana reemplazado con el motivo de unión de IgG2 humana (DCIB66) y v) DCIB33 con el motivo de unión reemplazado por el motivo de IgG1 humana (DCI867). El día 19. los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFN y frente a
péptido TRP2 (.), un control de medio (0) y el péptido auxiliar HepB ( ). Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
F, determinación de cadena pesada, cadena ligera e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S (DCIB15, DCIB33, DCIB65, DCIB66 y DCIB67) por ELISA de tipo
sándwich. Las placas se revistieron con un anticuerpo específico anti Fe humano o anticuerpo anti cadena kappa humana. Para detectar cadena pesada se usó un anticuerpo de HRP específico de anti Fc de IgG humana en combinación con el anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar ImmunoBody intacto se usó anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana en combinación con anticuerpo de revestimiento específico anti Fc humano. Para detectar cadena ligera se usó anticuerpo de HRP específico anti cadena kappa humana en combinación con el anticuerpo especifico anti cadena kappa humana.
G, determinación de ImmunoBody de cadena pesada de sobrenadante de CHO-S transfectadas con DCIB53 por ELISA de tipo sándwich. Las placas se revistieron con un anticuerpo específico anti Fc de ratón. Para detectar cadena pesada se usó un anticuerpo de HRP específico anti IgG2a de ratón.
Figura 50: la inmunización con ImmunoBody potencia las respuestas inmunes y supera la regulación observada de antígeno completo.
A, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 (HHDFII) el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody DCIB15 o antígeno gp100 completo en el vector pcDNA3. El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido gp100 o control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, en los ratones C57BI/6 se agotaron las células positivas para CD25 por inyección de 400 !g i.p. de anticuerpo anti-CD25 (PCR61). Tanto los ratones empobrecidos para CD25 como los animales no empobrecidos se inmunizaron posteriormente el día 4, 11 y 18 con construcciones de ADN de ImmunoBody DCIB15 o antígeno TRP2 completo en el vector pOrig. El día 23, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2 o control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
C y D, los ratones HHDII se dejaron sin tratar (c) o se trataron con 400 !g de mAb PC61 i.p., (d). 4 días después, todos los ratones se inmunizaron con la construcción de ADNc Tie2 C200HFc. Las inmunizaciones de ADN se repitieron a intervalos de 7 días para un total de 3 inmunizaciones. 6 días después de la inmunización final, los esplenocitos se recogieron y se volvieron a estimular en un ensayo de ELISPOT de IFNy ex vivo con 1 !g/ml de cada uno de los epítopos de CTL predichos de Tie-2. Las barras indican la media de los valores por triplicado para cada ratón individual, normalizados a controles de fondo, representando las barras de error la desviación típica de la media.
E y F, los ratones HHDII se dejaron sin tratar (e) (n = 3) o se trataron (f) (n = 2) con 400 !g de anticuerpo PC61 i.p. Después de 4 días, todos los ratones se inmunizaron con 100 !g de péptido Z12 y 100 !g de péptido Z48, mezclados 1:1 en IFA (s.c). Se administraron inmunizaciones de péptidos repetidas 7 días después de la primera inmunización con péptido. Los esplenocitos se recogieron 14 días después de la inmunización final y se volvieron a estimular con péptido 212 1 !g/ml (barras negras) o solamente medio (barras abiertas) en un ensayo de elispot de IFNy. Las barras indican la media de los valores por triplicado representando las barras de error la desviación típica de la media.
G, se inmunizaron ratones HHDII con 100 !g de péptido Z12 mezclado 1:1 en IFA (s.c). Se administraron inmunizaciones con péptidos repetidas los días 7 y 14 días después de la primera inmunización con péptido. Los esplenocitos se recogieron 7 días después de la inmunización final y se analizaron con respecto a la presencia de respuestas específicas de epítopo a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden de ratones individuales como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
H, se inmunizaron ratones HHDII con construcción de ADN de ImmunoBody DCIB71 mediante pistola génica los días 0, 7 y 14. Se recogieron los esplenocitos 7 días después de la inmunización final y se analizaron con respecto a la presencia de respuestas específicas de epítopo a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden de ratones individuales como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
Figura 51: Secuencia de DCIB71
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesadas y ligeras variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de Tie-2 Z12 (ILINSLPLV) en H1 y el epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) en L1. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI
utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 52: Secuencia de DCIB72
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones pesada y ligera variables clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo Tie-2 Z12 (ILINSLPLV) en H2 y el epítopo HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) en L1. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 53: El papel de Fc xenogénico al proporcionar ayuda de linfocitos T y el requisito de ayuda de linfocitos T específica de antígeno.
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 o HHDII el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody de cadena pesada que contenían epítopo de gp100 en CDR H1 o epítopo de TRP2 en CDR H2 (IB17 e IB18 respectivamente). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido gp100 o péptido TRP2 y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B, se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados con cadena pesada de ImmunoBody que contenía epítopo de TRP2 en CDR H2 con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
C, se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 de IgG1 humana (DCIB15) o epítopo de gp100 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de HepB CD4 en CDR L1 con región constante de IgG2a murina (DCI853). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2, péptido auxiliar HepB y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
D, se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados con DCIB15 u OCIB53 con respecto a la avidez para el epítopo TRP2 midiendo respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
E, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-DR4 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían epítopo de gp100DR4 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de gp100DR7 en CDR H3 de IgG1 humana (DCIB54) o epítopo de gp1 GODR4 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de gp100DR7 en CDR H3 con región constante de IgG2a murina (OCIB64). El día 19, los esplenocitos se analizaron con ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2, péptido auxiliar gp100DR4 y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
F, se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados con OCIB54 o DCIB64 con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo respuestas a concentración de péptido creciente en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
Figura 54: Secuencia de OCIB53
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas de longitud completa pesadas y ligeras murinas dentro del vector de expresión pDCOrig moigG2a. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de GP100210M en H1 (TIMDQVPFSV), el epítopo de TRP2 en H2 (SVYDFFVWL) y el epítopo de HepB CD4 en L1 (TPPAYRPPNAPIL) en L1. Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 55: Secuencia de DCIB64
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas de longitud completa murinas pesadas y ligeras dentro del vector de expresión pDCOrig moigG2a. El codón de parada se representa por un asterisco. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-OR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) en H1, el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 56: El procesamiento de inmunoproteasoma es importante en la generación de respuestas de epítopos dentro de construcciones de ImmunoBody.
Se inmunizaron ratones HHDII el día 0, 7 y 14 con construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de gp100209-217 en CDR H1 (DCIB41) o la versión modificada gp100210M en CDR H1 (DCI815). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido gp100209-217 o péptido gp10021OM y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Figura 57: Diferentes procedimientos de inmunización son eficaces en la inducción de respuestas inmunes de vacuna de ImmunoBody.
A, se inmunizaron ratones C57BI/6 con ADN de ImmunoBody (OCIB15) mediante pistola génica,
i.m.
+/- electroporación o i.d. +/- electroporación los días 0, 7 y 14. El día 19, los esplenocitos se analizaron mediante ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2, péptido auxiliar HepB y control. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
B.
Se ensayaron esplenocitos de ratones inmunizados por diferentes vías con respecto a avidez para el epítopo de TRP2 midiendo las respuestas a concentración creciente de péptido en ensayo de elispot de IFNy. Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos y la avidez se asigna como la concentración que proporciona 50 % de función efectora máxima.
Figura 58: La inmunización con ImmunoBody induce despigmentación de tipo vitíligo y protege contra presentación de tumores.
A, los ratones C57BI/6 inmunizados con ADN de ImmunoBody que contiene el epítopo de TRP2 en CDR H2 y el epítopo deHepB CD4 en CDR L1 (DCIB18) demuestran despigmentación en el crecimiento capilar en el sitio de inmunización.
B, se presentó a ratones inmunizados C57BI/6 entre la 3ª y 4ª inmunizaciones 2x104 células B16F10 IFNa i.v. Se evaluó la carga tumoral en los pulmones a los 49 días después de la presentación tumoral. La carga tumoral se expresa como un área de tumor media como un porcentaje del área pulmonar total. Se presentó a los ratones inmunizados 7 días después de la inmunización final 2x104 células B16F10 IFNa s.c. El tamaño del tumor se midió a intervalos de 3-4 días y los ratones se sacrificaron una vez que el crecimiento tumoral excedió el límite.
C, se evaluó el tamaño del tumor el día 46 después de la inyección de tumor.
D, supervivencia.
Figura 59: La inmunización con ImmunoBody retarda significativamente el crecimiento tumoral.
A, se inyectó a ratones C57BI6 2x104 células 816F10 s.c. Cuatro días después de la inyección del tumor se inmunizó a los ratones con ADN de ImmunoBody DCIB52. Se realizaron inmunizaciones de repetición los días 11 y 18 después de la inyección del tumor. La carga tumoral se analizó a intervalos de 3-4 días y los ratones se sacrificaron una vez que el crecimiento tumoral excedió el límite máximo permitido. Se representó el volumen tumoral a lo largo del tiempo.
B, se inyectó a ratones C57BI6 2x104 células 816F10 IFNa s.c. Catorce días después de la inyección del tumor se inmunizó a los ratones con ADN de ImmunoBody DCIB52. Se realizaron inmunizaciones repetidas los días 21 y 28 después de la inyección del tumor. La carga tumoral se analizó a intervalos de 3-4 días y se sacrificó a los ratones una vez que el crecimiento tumoral excedía el límite máximo permitido. El volumen tumoral se muestra el día 47 después del implante del tumor.
C, se inyectó a ratones C57BI6 2x104 células B16F10 s.c y anticuerpo anti-CD25 i.p. cuando fuera apropiado. Cuatro días después de la inyección de tumor se inmunizó a los ratones con ADN de ImmunoBody DCIB52 o ADN de ImmunoBody de control. Se realizaron inmunizaciones repetidas los días 11 y 18 después de la inyección del tumor. La inmunización el día 11 se combinó con la inyección de anticuerpo anti-CTLa-4 i.p. cuando fue apropiado. Se analizó la carga tumoral a intervalos de 3-4 días y se sacrificó a los ratones una vez que el crecimiento tumoral excedió el límite máximo permitido. Se representó el volumen tumoral a lo largo del tiempo.
Figura 60: Secuencia de DGIB68
Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig. Los aminoácidos dentro de las cajas representan el epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-OR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) en H1 y L3, los epítopos de TRP2 (SVYDFFVWL) en H2 y el epítopo de
gp100 CD4 restringido por HLA-DR4 en H3 y L1 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Se destacan los sitios de restricción HindIII/Afe I y BamHI/BsiWI utilizados en la transferencia de la región variable pesada y ligera de la construcción sencilla.
Figura 61: Pueden generarse respuestas inmunes a partir de construcciones de ImmunoBody expresadas 5 de diferentes cadenas principales de vector.
Se inmunizaron ratones C57BI/6 el día 0, 7 y 14 con construcciones de ADN de ImmunoBody que contenían epítopo de gp100DR4 en CDR H1, epítopo de TRP2 en CDR H2 y epítopo de gp100DR7 en CDR H3 de IgG1 humana (DCIB54, B1-3) una construcción equivalente en el vector pVax (VaxDCIB54. C13). El día 19, los esplenocitos se analizaron por ensayo de elispot de IFNy frente a péptido TRP2 y control.
10 Las respuestas se miden como puntos/millón de esplenocitos.
Ejemplos
Procedimientos
Generación de vectores de ADN
Las regiones variables pesadas y ligeras murinas desinmunizadas del clon de SC100 VHd VKb (documento
15 WO01/88138) dentro de los vectores pSVgptHuigG1 y pSVhygHuCk (Biovation Ltd) se amplificaron por PCR. Los productos de PCR de la región VH y VL se clonaron en fase con las regiones constantes kappa e IgG1 humanas usando sitios HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI para producir las construcciones de cadena sencilla pOrigHIB y pOrigLIB (véase Figuras 1 y 2). La secuencia de la cadena kappa y pesada quimérica de longitud completa se confirmó por el procedimiento de terminación de cadena de dideoxi (Sanger y col, Proceedings of the National Academy of Sciences
20 of the United States of America 1977; 74: 5463-7). Se muestran las secuencias proteicas traducidas y de ADN para la cadena pesada y ligera quimérica en las Figuras 3 y 4 respectivamente. Se representan las localizaciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDR).
Con la excepción de la región CDR2 pesada que conserva seis aminoácidos, las CDR de las cadenas pesadas y ligeras se retiraron completamente y se intercambiaron por sitios de enzima de restricción únicos. Esto se consiguió 25 mediante examinación cuidadosa de las regiones a cada lado de la secuencia para una retirada que permitirá que se genere un sitio de enzima de restricción. Estos sitios de restricción únicos se usan para abrir el ADN de modo que pueda insertarse un oligonucleótido que codifique un epítopo antigénico. La mayoría de las secuencias flanqueantes que se pierden en la generación de sitio de restricción se reemplazan por inclusión en los cebadores de epítopos para asegurar que, al traducir, los aminoácidos se conserven y que las secuencias se mantengan en fase. La Tabla
30 1 enumera sitios enzimáticos seleccionados y secuencias oligonucleotídicas epitópicas para todas las CDR.
Las regiones CDR se retiraron y se reemplazaron con sitios de restricción únicos por PCR de extensión de solapamiento como se muestra en la Figura 5. Para la región variable pesada, los oligonucleótidos H1, H2 y H3 (véase Tabla 2) se diseñaron para reemplazar cada una de las tres CDR. Cada cebador específico contiene 10-20 pb de secuencia a cada lado del sitio enzimático a incorporar. Usadas junto con el cebador inverso general 35 huHeClonR (véase Tabla 2) que se une a la región constante de IgG1 humana se prepararon PCR de primer ciclo consistentes en 1 !l del plásmido molde pOrigHIB, 2 !l de dNTP (2,5 mM), 5 !l de tampón de taq polimerasa 10x, 1 !l de cebador directo e inverso (25 pmoles), 5 unidades de taq polimerasa (New England Biolabs) compuesto a un volumen final de 50 !l con agua destilada estéril. Las reacciones se sometieron a una desnaturalización inicial de 5 minutos a 95 ºC seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 1 minuto a 55 ºC (hibridación) y 1 minuto a 72 ºC 40 (extensión). El ciclo final contenía una extensión de 10 minutos usando un reactor cíclico programable Techne PHC
1. De forma similar, para la región variable ligera, los oligonucleótidos L1, L2 y L3 se diseñaron para reemplazar cada una de las tres CDR (véase Tabla 2). Se prepararon PCR de primer ciclo como se ha descrito anteriormente pero con el cebador inverso huLiClonR (véase Tabla 2) que se une a la región constante de la cadena kappa humana y el molde porigLIB.
45 Tabla 1. Lista de enzimas de reemplazo de CDR y secuencias oligonucleotídicas epitópicas
COR Sitio de RE Oligo epitópico
H1 Fsp I 5’NNNNNNTGGGTTCG3’
3’NNNNNNACCCAAGC5’
H2 Msc I 5’TNNNNNNCGATTCA3’ 3’ANNNNNNGCTAAGT5’
COR Sitio de RE Oligo epitópico H3 Srf I 5’GANNNNNNTG3’ 3’CTNNNNNNAC5’
L1 Eco RV 5’CTCTTGCNNNNNNTGGT3’ 3’GAGAACGNMNNNNACCA5’
L2 Ssp I 5’CTACNNNNNNAG3’ 3’GATGNNNNNNTC5’
L3 Hpa I 5TATTACTGCNNNNNNTTCGGTGGAGG3’
’ATAATGACGNNNNNNAAGCCACCTCC5’
N representa secuencia de ADN epitópica
El resto de las letras representan nucleótidos flanqueantes que necesitan incorporarse
Se usó después 1 !l de los productos de PCR resultantes en una PCR posterior como un cebador inverso junto con el cebador directo de CMV preparado como se ha descrito anteriormente. El fragmento de ADN amplificado de 450 pb se clonó directamente en el vector de TA TOPO pCR2.1 (Invitrogen) y los clones se secuenciaron para confirmar la amplificación de la región VH y VL desprovistas de las CDR y reemplazo de sitio de restricción.
5 Las CDR dentro de la región pesada y ligera variable se han reemplazado con su sitio enzimático correspondiente H1, H2, H3, L1, L2 y L3 de forma sencilla, en combinación y juntas (Figura 6 y 7). Las diferentes versiones se insertaron después en pOrig HIB y pOrigLIB usando HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI con reemplazo directo de las regiones VH y VL de SC100 desinmunizadas de tipo silvestre parentales. Esto permite la generación de moléculas que contienen epítopos sencillos o múltiples (del mismo o diferentes antígenos).
10 Tabla 2 - Cebadores
Oligonucleótido
Secuencia
H1
Fspl 5’-CCT GAG AAT GTC CTG CTG CGC AGG CTC CGG GGA AG-
H2
Mscl 5’CAT TGG TAG TGG TGG CCA TTT CCA GAG AC-3’
H3
SrfI 5’CCG TGT ATT ACT GTG CCC GGG CCA AGG AAC CAC GGT C-3’
L1
EcoRV 5’-GGA GCC AGC CTC GAT ATC TGC AGA AAC CAG GC-3’
L2
SspI 5’CCA CAG CTC CTA ATA TTC AGT GGC AGT GGA TC-3’
L3
Hpal 5’-GCT GAG GAT ACC GGA GTT AAC CAA GGT GGA AAT C-3’
huHeCronR
5 CGC CTG AGT TCC ACG ACA CC-3’
Oligonucleótido
Secuencia
huLiClonR
5’-CAG GCA CAC AAC AGA GGC-3’
Directo de CMV
5’-GGC GTG GAT AGC GGT TTG AC-3’
OrigstophuHeCH 1 Dir
5’-CCA AGG TTG ACA AGA AAG TTT GAC CCA AAT CTT GTG ACA
OrigstophuHeCH 1 Inv
5’-GAG TTT TGT CAC AAGATT TGG GTC AAA CTT TCT TGT CCA OCT TGG-3’
pOrig ligero sin líder Dir
5’-AGG ATC CAC CAT GGA TGT GTT GAT GAC CC-3’
pOrig pesado sin líder Dir
5’-AAA GCT TAT GCA GGT GCA GCT GGT G-3’
huigG3inv2
5’-ATC GAT ATC ATT TAC CCG GAG ACA GG-3’
IgG3hutor2
5’-ACT GTC TCC AGC GCT TCC ACC AAG-3’
IgG2 dir
5’-AGT CAC CGT TTC CAG CGC TTC CAC-3’
IgG2 inv
5’-AGT GGA TAT CAT TTA CCC GGA GAC AGG-3’
HIBF
5’-AAC AGT CTG AGG GOT GAG GA 3’
huigG1PVA INV
5’-A GAC TGA CGG TCC CCC CGC GAC TGG AGG TGC TGG-3’
HulgG2ELLGInv
5’-A GAC TGA CGG TCC TCC TAA CAG TTC TGG TGC TGG-3’
Sv40premDIR
5’-A GCT AGC ATC AGC ACG TGT TGA CAA TTA ATC ATC-3’
SV40precnINV
5’-ACC GAT TCC GAA GCC CAA CCT TTC ATA G-3’
migG2aC1Afe1F2
5’-TTT ACA GCG CTA AAA CAA CAG CCC CAT CGG TC-3’
migG2aXbaRA
5’-TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGT CCG GGA GAA GCT C-3’
MoLC1 BsiF1
5’-TTT CGT ACG GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC-3’
MoLCXhoR1
5’-TTT CTC GAG TCA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC-3’
MolgG2BamHI Dir
5’-CC TTG ACC TGG AAC TCT GGT TCC CTG TCC AGT GGT G-3’
MolgG2BamHI Inv
5’-C ACC ACT GGA CAG GGA ACC AGA GTT CCA GGT CAA GG-3’
MoigG2xhol Dir
5’-GC AGC TGA GTG ACT GTA ACT TCG AGC ACC TGG CCC AGC-3’
MaigG2Xhol Inv
5’-GCT GGG CCA GGT GCT CGA AGT TAC AGT CAC TGA GCT GC-3’
wtkappavarL1dir
5’-C TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC CTG GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TATTTA GAA TGG T-3’
wtkappavarL1inv
5’A CCA TTC TAA ATA GGT GTT TCC ATT ACT ATG TAC CAG GCT CTG ACT AGA TCT GCA AGA G-3'
Directo de TRP2 murino
5’-TTT CTA AGC TTA TGG GCC TTG TGG GAT GGG GGC TTC-3’
Inverso de TRP2 murino
5’-TTT CTG ATA TCT CAG GCT TCC TCC GTG TAT CTC TTG C-3’
Directo de GP100
5’-TTT CTG ATA TCA TGG GTG TCC AGA GAA GGA GOT TC-3’
Oligonucleótido
Secuencia
Inverso de Gp100
5’-TTT CTC TCG AGA CAG ACC TGC TGT CCA CTG AGG AGC-3’
Inserción de epítopos antigénicos en sitios COR de vectores de cadena sencilla.
Se enumeran varios epítopos de CTL CD8 y auxiliares CD4 en la Tabla, 3, aunque puede insertarse fácilmente cualquier epítopo en cualquiera de los sitios dentro de los vectores de cadena sencilla. Por ejemplo, la inserción del epítopo de TRP2 en el sitio H2 del vector pOrigHIB se consiguió como sigue.
Se diseñaron oligonucleótidos complementarios para codificar una secuencia de nucleótidos que expresa en la traducción el epítopo. La secuencia de ADN que codifica el epitomo se flanqueó por los nucleótidos de CDR correspondientes para asegurar que, al traducir, los aminoácidos se conservaran y que la secuencia permaneciera en fase (véase Tabla 1). Los cebadores se enviaron para síntesis (MWG) y se fosforilaron en el extremo 5’.
Se resuspendieron los oligonucleótidos complementarios a una concentración final de 1 mg/ml en agua doblemente destilada estéril y se ligaron entre sí preparando una reacción con 10 !l de cada cebador compuesta a un volumen final de 50 !l con tampón TE. La reacción se sometió a ciclo a 95 ºC durante 5 minutos (0,1 ºC/segundo), 72 ºC durante 20 minutos (0,1 ºC/segundo), 55 ºC durante 20 minutos y después se mantuvo a 4 ºC.
15 Para inserción en el sitio H2, el vector pOrigHlB H2 y/o pOrigHlB H1H2 se linealizó preparando un producto de digestión de restricción con MseI (dependiente de CDR para utilizarse para inserción de epítopo) y se incubó durante una noche a 37 ºC. El producto de digestión se sometió a electroforesis en un gel de agarosa 1,5 % y el vector cortado se purificó por extracción en gel. Para evitar la autoligación del vector linealizado, se retiraron los grupos fosfato de los extremos 5’ del vector por tratamiento e incubación durante una noche a 37 ºC con fosfatasa alcalina
20 intestinal de ternero (CIAP) 5 unidades, 10 !l de tampón NEB 3 10 x compuesto a un volumen final de 100 !l con agua destilada estéril. El vector desfosforilado se purificó y se prepararon ligaciones con diluciones puras, 1/100 y 1/200 de los oligonucleótidos hibridados para donar directamente en el sitio H2 usando técnicas convencionales. Las inserciones de epítopos se confirmaron secuenciando dentro de los vectores sencillos usando el cebador universal de CMV directo.
Tabla 3 Epítopos auxiliares y de CTL
PROTE�?NA
COORDENADAS SECUENCIA RESTRICCIÓN POR HLA
TRP2
180-188 SVYDFFVWLagtgtttatgattttttgtgtggctc A2, Kb
GP100
209-217 ITDQVPFSV accattactgaccggtgcctttctccgtg A2
GP100 (210M)
209-217(M) IMDQVPFSVaccattatggaccaggtgcctttctccgtg A2
GP100 (F7L)
209-217 ITDQVPLSV accattactgaccaggtgcctttgtccgtg A2
GP100
44-59 WNRQLYPEWTEAQRLD tggaacaggcacctgtatccagagtggacagaaocccagagacttoac DR0401
HEPB S AG
28-39 IPQSLDSWWTSLataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctc Ld(CTL)
Nucleoproteína HepB
128-140 TPPAYRPPNAPIL actcctccagcttatagaccaccaaalaccctatccta I-Ab(auxiliar)
MAGE3
271-279 FLWGPRALVttcctgtggggtccaagggccctcgtt A2
Tie2 (Z83)
124-132 FLPATLTMT ttcctaccagctactttaactatgact A2
Tie2 (ZB4)
124-132 FLPATLTMV ttcctaccaactactttaactatggtt A2
PROTE�?NA
COORDENADAS SECUENCIA RESTRICCIÓN POR HLA
Tre2 (Z9)
431-439 GMVEKPFNIgggatggtggaaaaqcccttcaacatt A2
Tie2 (mZ9)
431-439 GMVEKPFNVggatggtggaaaagcccttcaacgtt A2
FLU HA
111-120 FERFEIFPKEtttgaaaggtttgagatattccccaaggaa I-Ad(auxiliar)
ovoalbúmina
258-265 SIINFEKLagtataatcaactttgaaaaacta Kb
Triosafosfato isomerasa (wt)
23-37 GELIGTLNAAKVPAD ggggagctcatcggcattctgaacgcggccaaggtgccggccgac DR0101
Triosafosfato isomerasa (ml)
23-37 GELIGILNAAKVPADggggagctcatcggcactctvaacgcggccaaggtgccggccgac DR0101
VEGFR2
773-781 VIAMFFWLLgtgattoccatgttcttctggclactt A2
mVEGFH2
773-781 VLAMFFWLLgtgcttaccatggttcttctggctactt A2
Transferencia al vector de expresión doble pDCOrig
Una vez que se han incorporado todos los epítopos en los sitios VH y VL dentro de los vectores sencillos, se transfieren al vector de expresión doble pDCOrig usando HindIII/Afe1 y BamHI/BsiWI en fase con sus regiones constantes humanas respectivas. Para generar el vector de expresión de ImmunoBody™ pDCOrig, se linealizó 5 pOrigHIB usando la endonucleasa de restricción de extremos romos Nrul localizada adyacente al promotor de CMV. pOrigLIB se digirió con las endonucleasas de extremos romos NruI y HpaI para escindir el casete de expresión de cadena ligera completo que consiste en el promotor de CMV, cadena kappa humana desinmunizada y la señal de poli A de BGH. Después de electroforesis en gel, aislamiento y extracción en gel del vector linealizado pOrigHIB y del casete de expresión de cadena ligera el vector se desfosforiló y el casete de expresión de cadena ligera se ligó
10 para formar la construcción pDCOrig (Figura 8). La orientación del casete de cadena ligera dentro de pDCOrig se confirmó por análisis de restricción.
pDCOrig contiene las secuencias codificantes el gen tanto de cadena ligera como de cadena pesada combinadas dentro de la misma construcción, eliminando secuencias intrónicas y el sistema de dos vectores. La expresión se conduce por los promotores tempranos inmediatos de CMV de alto nivel y otros elementos de control de ADN, tales
15 como señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina. El marcador de selección zeocina también se ha incluido para maximizar la expresión y eficacia de producción. El diseño cuidadoso de este vector ha conservado los sitios de enzimas de restricción únicos en los puntos de unión de las regiones variables y constantes y proporciona un procedimiento fácil y rápido para crear diferentes combinaciones de las regiones variables (inserciones de epítopos, véase Figura 8). La Tabla 4 enumera algunas de las construcciones de pDcOrig IB generadas.
Tabla 4. Construcciones de pDCOrig
H1
H2 H3 L1 L3
DCIB15
Gp100 210M TIMDQVPFSV TRP2SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB17
Gp100 210M TIMDOVPFSV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB18
TRP2SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB21
Ag S de HepBIPOSLDSWWTSL Fiu HA FERFEIFPKE
OCIB24
OVOALBÚMINASHNFEKL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB25
Gp100 210M TMDOVPFSV TRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepBTPPAYRPPNAPIL
DCIB26
Tie-2 Z54 FLPATLTMV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB30
Gp100 F7LTITDCVPLSV TRF2SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB31
TRP2 SVYDFFVWL
DCIB32
TRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB33huigG2
Gp100 F7L TITDCVPLSV TRP2SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB35
Gp100 210M TRP2 Gp100
H1
H2 H3 L1 L3
TMDOVPFSV
SVYDFFVWL WNROLYPEWTEAQPLD
DCIB36
TRP2 SVVDFFVWL
DCIB37
Gp100 F7LTITDOVFLSV Nucleoproteína Hep9 TPPAYRPPNAPIL
DCIB40
Gp100 F7ITITDOVFISV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB41
Gp100 wt TITCOVPFSV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB42
Gp100 F7Y TITDOVPYSV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPHAPIL
DCIB43
Gp100 V5L TITDOLPFSV Nucleoproteína HspB TPPAYRPFNAPIL
DCIB48
TRP2GVYDFFVWL Gp100WNROLYFEWTEAQRLD
DCIB49
Nucleoproteína HepB TPPAVRPPNAPIL
DCIB50
Gp100 210M TIMDOVPFSV TRP2SVYDFFVWL Gp100 WNROLYPEW TEACALD
DCIB52
TRP2SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAVRPPNAPIL
DCIB53
Gp100 210M TRP2 Nucleoproteína HepB
H1
H2 H3 L1 L3
MolgG2a
TIMCOVFFSV SVYDFFVWL TPPAVRPPNAPIL
DCIB54
Gp100GTGRAMLGTHTMEVTVYH TRF2SVYDFFVWL Gp100WNRQLYPEWTEAQRLD
DCIB64MoigG2a
Gp100GTGRAMLGFTMTMEVTVYH TRP2SVYDFFVWL
CIB65huigG3
Gp100 210M TIMDQVPFSV TRP2SVYDFFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
Motivohuig G1 + G2 deDCIB66
Gp100 210M TIMDOVPFSV TRP2SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRFPNAPIL
Motivohuig G2 + G1 deDCIB87
Gp100 210M TIMDQVPFSV TRP2SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
DCIB68
Gp100GTGRAMLGTHEMEVITVYH TRP2SVYDFFVWL Gp100WNROLYPEWTEAORLD Gp100WNRQLYPEWTEACRLD Gp100GTGRAMLGTHTMEVIVYH
DCIB69MoigG2a
Gp100GTGRAMLGTHTMEVTVYR TRP2SVYDFFVWL Gp100WNRQLYPEWTEAQRLD Gp100WNRQLYPEWTEAQRLD Gp100GTGRAMLGTHTMEVTVVH
OCIB71
Tie-2 Z12 ILINSLPLV Nucleoproteína HepB
H1
H2 H3 L1 L3
TPPAYRPPNAPIL
DCIB72
Tie-2 Z12 ILINSLPLV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL
Generación de pDcOrig IB15 CH1 stop
Se incorpora un codón de parada después del dominio CH1 de la región constante de IgG1 humana dentro de la construcción pOCOrig IB15 usando el kit de mutagénesis dirigida Quik change (Stratagene) y los cebadores oligonucleotídicos complementarios directo origstophuHeCH1 e inverso OrigstophuHeCH1 (véase Tabla 2) como se indica por el fabricante. La incorporación de codón de parada se confirma por secuenciación de ADN (Figura 9).
Retirada de secuencias líder de pDCOrig IB15
Para retirar la secuencia líder de la cadena pesada y ligera del vector pDCOrig IB15, se prepararon PCR usando el molde pDCOrig IB15 con los cebadores directos ligero pOrig sin líder y pesado pOrig sin líder junto con los cebadores inversos huHeClonR y hiLiClonR respectivamente (Tabla 2). Los fragmentos amplificados se ligaron con TA TOPO en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y los clones se confirmaron por secuenciación. Las regiones de IB15 tanto VH como VL desprovistas de líder se clonaron de nuevo en pDCOrig IB15 usando sitios HindIII/AfeI y BamHI/BsiWI respectivamente. La secuencia de ADN y traducción para las regiones VH y VL se muestran en las Figuras 10 y 11 respectivamente.
Construcción de isotipos IgG2 e IgG3 humanos del vector de expresión doble Immunobody™ pDCOrig
La región constante de IgG3 humana se amplificó por PCR usando los cebadores directo e inverso huigg3 (Tabla 2) incorporando un AfeI y EcoRV respectivamente con el molde pOTB7huigG3 (clon de imagen 4566267 MGC 45809). De forma similar la región constante de IgG2 humana se amplificó usando cebadores IgG2Dir e IgG2Inv (Tabla 2) con el molde pTOB7 huigG2 (clon de imagen 6281452 MGC 71314).
Ambos fragmentos se ligaron con TOPO en pCR2.1 y la secuencia se confirmó (Figuras 12 y 13). La región constante huigG1 dentro de la construcción pDCOrigIB15 se reemplazó eficazmente con tanto huigG2 como huigG3 clonados en fase con la variable pesada usando sitios Atel y Sapl para generar pDCOrigIB15 huigG2 y pDCOrigIB15 huigG3 (Figura14). Ambos vectores conservan los mismos sitios de restricción únicos en el punto de unión de la región variable/constante. Esto permite un intercambio fácil de regiones variables entre todos los vectores de Immunobody mono y bicatenarios de isotipo humano.
Mutación de IgG1 Fcy humano y dominio de unión a Receptor de IgG2 humano
Para sustituir los aminoácidos E233 L234 L235 del motivo de unión huigG1 dentro del dominio CH2 con P233 V234 A235 de huigG2, se reamplificó una sección corta por PCR incorporando la mutación. Se utilizó el cebador inverso huigG1 PVA Inv que contenía las sustituciones y el sitio de restricción constitutivo AhdI con el cebador directo HIBF (Tabla 2) y el molde pDCOrig IB15. El fragmento resultante se ligó en el vector pCR2.1 (Invitrogen). Después de confirmación de secuencia, la secuencia de tipo silvestre se reemplazó eficazmente con la sección que contenía las mutaciones insertando en los sitios de corte sencillo AgeI/AhdI del plásmido pDCOrig IB15 huigG1 (Figura 15).
Los aminoácidos P233 V234 A235 dentro del dominio constante de huigG2 de la construcción pDCOrig IB15 huigG2 también se sustituyeron con el motivo de unión a huigG1 ELLG. Como antes, se utilizó el cebador inverso huigG2ELLGInv (Tabla 2) que contenía las sustituciones y el sitio de restricción constitutivo AhdI con el cebador directo HIBF y la IgG2 humana del molde pDCOrig IB15. El fragmento se ligó con TA TOPO en el vector pCR2.1. Después de confirmación de secuencia, la secuencia de tipo silvestre se reemplazó de nuevo con la sección que contenía el motivo de unión a huigG1 usando sitios Agel/Ahdl del plásmido pDCOrig IB15 huigG2 (Figura 16).
Generación de plásmidos de IgG2a murinos de pDCOrig DCIB53 y DCIB63
Para construir una versión de IgG2a murina del vector de doble expresión pDCOrig, se sintetizó ADNc de ARN total aislado de la línea celular de hibridoma 337. Para amplificación de la región constante de IgG2a murina, se usó el cebador directo migG2aC1 AfeF2 que contenía sitio de restricción Afe1 junto con el cebador inverso migG2aXbaRA que albergaba un sitio XbaI después del codón de parada. El fragmento de PCR se ligó con TOPO en el vector pCR2.1. Después de conformación de secuencia, la región constante de IgG2a murina se escindió y se clonó en fase con la región variable pesada murina en los sitios Afe1/XbaI del vector pOrigHIB reemplazando eficazmente IgG1 humana. Se retiró un sitio BamHI y XhoI sin alterar, en la traducción, la secuencia de aminoácidos de la región constante de IgG2a murina, secuencialmente por mutagénesis dirigida usando kit de mutagénesis dirigida Quik change (Stratagene) y los cebadores complementarios MoigG2BamHIDIR e INV, MoigG2XhoIDIR e INV respectivamente. Esto generó el vector de ImmunoBody de cadena sencilla pMoOrigHIB (Figura 17A). Se transfirió una sección de pMoOrigHIB que contenía la región constante de McigG2a de la construcción sencilla al vector de doble expresión pDCOrig IB15 en fase con la región variable pesada murina usando AfeI y AvrII de corte sencillo localizados en el promotor de SV40 para generar el vector intermedio pDCOrigIB15MoigG2a hukappa que aún contenía una región kappa humana.
Para amplificación de la región kappa murina, se usó el ADNc como un molde con los cebadores MoLC1BslF1 que contenía un sitio BsiWI y MoLCXhoI incorporando un sitio XhoI después del codón de parada. El fragmento amplificado se clonó por TOPO en el vector pCR2.1 como antes. La región kappa murina se escindió y se ligó en el vector de ImmunoBody pOrigLIB L1 y pOrigLIB hepB auxiliar hepB/L1 reemplazando la constante kappa humana
usando BsiWI/XhoI generando el vector intermedio pMoLIBL1Bsi y pMoLIB HepB auxiliar hepB/L1 Bsi. El sistema de Inmunobody implica la transferencia de regiones variables usando un sitio de restricción único en el punto de unión de las regiones variables y constantes mientras que el punto de unión entre la variable pesada murina y la constante moigG2a pueden acomodar un sitio AfeI (presente dentro de todos los vectores de Inmunobody humanos) y no alterar la secuencia de aminoácidos en la traducción, la región entre la kappa y variable murina es problemática. En el análisis de secuencia en este punto de unión no se podría incorporar sitio de restricción único que no alterara la secuencia de aminoácidos. El sitio BsiWI en el punto de unión se retiró para volver a la secuencia de tipo silvestre. Esto se consiguió amplificando la cadena de longitud completa murina entera mediante PCR solapante. Se preparó una primera PCR usando el cebador directo MoKappaSDMdir que contenía secuencia de tipo silvestre en el punto de unión y región flanqueante retirando eficazmente BsiWI, el cebador inverso BGH y los vectores de cadena ligera intermedios pMoLIBL1 Bsi y pMoLIB hepB auxiliar hepB/L1 Bsi como molde respectivamente. Se usó un fragmento amplificado de aproximadamente 430 pb del primer ciclo de PCR como un cebador inverso conteniendo el cebador directo Immuno-LikozDir un sitio BamHI. Las cadenas kappa murinas de longitud completa amplificadas se ligaron por TOPO en pCR2.1 y se confirmó su secuencia. La cadena kappa murina de longitud completa que contenía ayuda de hepB en el sitio de L1 en pCR2.1 se escindió y se clonó en los sitios BamHI/XhoI del vector de expresión doble intermedio pCCCrigIB15MoigG2a hukappa reemplazando la cadena kappa humana para generar el vector de expresión doble murino pDCOrigIB GP100210m/H1 TRP2/H2 HepB auxiliar/L1 molgG2a (DCIB 53, Figura 17 B y 54).
De forma similar, la cadena kappa murina de longitud completa que contenía un sitio L1 se escindió y se clonó en los sitios BamHI/XhoI del vector de expresión doble intermedio pDCOrigIB15MoigG2a hukappa reemplazando la cadena kappa humana para generar el vector de expresión doble murino intermedio pDCOrigIB15molgG2a con un sitio L1 vacío. Para generar la construcción con una región variable ligera de tipo silvestre, los cebadores fosforilados 5’ complementarios wtkappavarL1 dir e inv (Tabla 2) se hibridaron e insertaron en el sitio L1 después de linealización con EcoRV como se ha descrito anteriormente. Finalmente la región variable pesada de DCIB 54 que contenía GP100DR7/H14 TRP2/H2 y GP100DR4/H3 se transfirió usando HindIII/AfeI para generar pDCOrigGP100DR7/H1TRP2/H2GP100DR4/H3moigG2a kappa de tipo silvestre (DCIB68 Figura 17C y 60).
Retirada del promotor de SV40 eucariota del vector de expresión doble de Inmunobody pDCOrig para requisitos de vacuna de ADN reguladora
El promotor bacteriano EM7 y gen de zeocina se amplificaron usando el cebador directo SV40PremDIR incorporando un sitio Nhe1 y cebador inverso SV40remINV (Tabla 2) con el molde pOrigHIB. El fragmento de PCR de 511 pb resultante se ligó por TOPO en pCR2.1 y se confirmó por secuenciación. El promotor EM7 y una sección del gen de zeocina se escindieron usando NheI y FseI de pCR2.1 y se clonaron directamente en pOrigHIB H1 retirando eficazmente el promotor de SV40. El sitio NheI reside antes del promotor de SV40 mientras que en la secuencia de reconocimiento de FseI es un cortador sencillo dentro del gen de zeocina del vector. Después de confirmación de secuencia se transfirió una sección mayor del vector sencillo al vector pDCOrig IB68 que codifica el extremo de cola de huigG1, poliA de BGH, EM7 y parte del gen de zeocina digiriendo con SapI y Frei retirando eficazmente el promotor de SV40 del vector de expresión doble.
Alteración de la cadena principal de pDCOrig para una pVax1 (Invitrogen) compatible con la regulación de la FDA
La cadena pesada de IgG1 humana de longitud completa de InmunoBody se escindió de la construcción DCIB54 usando Hindlll y XbaI y se insertó en estos sitios dentro del MCS del vector pVax1 (Figura 18 A). Para generar la versión pVax del vector de expresión de doble cadena, pVaxIB54HIB se linealizó usando la endonucleasa de restricción de extremo romo Nrul localizada adyacente al promotor de CMV. pOrigLIB (Figura 18 B), se digirió con las endonucleasas NruI y HpaI de extremos romos para escindir el casete de expresión de cadena ligera completo consistente en el promotor de CMV, cadena kappa humana de Inmunobody y la señal poliA de BGH. Después de electroforesis en gel, aislamiento y extracción de gel del vector linealizado pVaxIB54HIB y el casete de expresión de cadena ligera el vector se desfosforiló y el casete de expresión de cadena ligera se ligó para formar la construcción pVaxDCIB54 (Figura 18C). La orientación del casete de cadena ligera dentro de pVaxDCIB54 se confirmó por análisis de restricción. pVaxOCIB54 conserva los mismos sitios de restricción únicos en el punto de unión de región constante/variable permitiendo el intercambio fácil de regiones variables entre todos los vectores de Inmunobody de cadena doble y sencilla de isotipo humano. Por ejemplo para generar pVaxDCIB68 (Figura 60) la región variable ligera murina que contenía Gp100DR4/L1 y Gp100D37/L3 se escindió de DCIB68 usando BamHI/BsiWI y se clonó en pVaxDCIB54 remplazando eficazmente la región variable de tipo silvestre ligera.
Generación de TRP2 murino de pOrig y GP100 de pCDNA3
Para construir TRP2 murino de pOrig, se usó ADNc sintetizado de 5 !g de ARN total aislado de la línea celular B16F10 como un molde para la amplificación de proteína relacionada con tirosinasa 2 (TRP2) murina de longitud completa usando los cebadores murinos de TRP2 directo e inverso (Tabla 2) con incorporación de un sitio Hindlll o EcoRV respectivamente. Se ligó TRP2 de longitud completa en el sitio de clonación múltiple HindIII/EcoRV del vector pOrigHIB. También se amplificó GP100 murino de longitud completa del ADNc usando los cebadores murinos de GP100 diseñados directo e inverso que contenían sitios EcoRV y XhoI respectivamente. (Tabla 1). El producto de PCR se clonó en los sitios EcoRV/XhoI del vector de expresión de mamíferos pCDNA3 (Invitrogen). Ambos
plásmidos se identificaron por análisis de restricción y se confirmaron por secuenciación de ADN.
ELISA de tipo sándwich
Se revistieron placas flexibles de 96 pocillos Falcon, durante una noche a 4 ºC, con 50 ul de anticuerpo específico anti Fc de IgG humana (Sigma 12136) o anticuerpo de anti cadena ligera kappa humana (Dako A0191) a 10 !g/ml en PBS. Las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween 20 (0,05 %) 200 !l/pocillo, usando un Skan Washer 400 (Molecular Devices), y los pocillos se bloquearon con gelatina de piel de pescado 1 % (Sigma) en PBS (FSG/PBS 1 %). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron con FSG/PBS 1 %. El sobrenadante de cultivo tisular que contenía InmunoBody expresado o proteína de InmunoBody purificada (50 !l) se añadió a los pocillos, por triplicado, y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con FSG/PBS 1 % y se detectó InmunoBody unido añadiendo 50 !l/pocillo de anticuerpo específico anti Fc de IgG humana conjugado con peroxidasa (Sigma A0170) o anticuerpo anti cadena ligera kappa humana (Sigma A7164), diluido 1/2000 en FSG/PBS 1 %, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con FSG/PBS 1 % y se desarrollaron añadiendo sustrato TMB (R&D Systems) a 50 !l/pocillo. La absorbancia se midió a 650 nm en un lector de microplacas VERSA max (Molecular Devices).
Ratones e inmunizaciones
El trabajo con los animales se llevó a cabo bajo una licencia de proyecto aprobada por el Ministerio del Interior. Se usaron machos y hembras transgénicos HLA-A2 (HHDII) o C57BI/6 (Harian) (Instituto Pasteur, París) entre 6 y 12 semanas de edad. Se emulsionaron péptidos sintéticos (fabricados por John Keyte, Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Nottingham, Reino Unido) con adyuvante incompleto de Freund y se inyectaron por una vía subcutánea. Cada ratón recibió 10 !g de péptido/inmunización. Se revistieron partículas de oro de 1,0 !m con ADN (BioRad, Homel Hempstead, Reino Unido) usando las instrucciones del fabricante y se administraron por vía intradérmica por la pistola génica Helios (BioRad). Cada ratón recibió 1 !g de ADN/inmunización. También se administró solución de ADN desnudo i.d. o i.m. (10 !g/inmunización) combinada inmediatamente después de la inyección con un pulso eléctrico corto. Los ratones se inmunizaron a 0, 1 y 2 semanas y los bazos se retiraron la semana 3. El agotamiento del subconjunto de linfocitos T in vivo se realizó por inyección de 400 !g de anticuerpo anti-CD25 (PCR61) i.p. cuatro días antes de la inmunización o 200 !g de anticuerpo anti-CTLa-4 i.p. simultáneamente con la inmunización secundaria.
Reestimulaciones in vitro
Cinco días después de la inmunización final, se cocultivaron esplenocitos (5x106/ml) a 37 ºC con blastos con lipopolisacáridos (LPS) pulsados con péptidos singénicos irradiados (20 Gy) (0,5 a 1x106 células/ml) en 2 ml de RPMI-1644 con FBS 10 %, glutamina 2 mM, tampón HEPES 20 M, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 !g/ml-1 y 2-mercaptoetanol 10-5 M en placas de 24 pocillos. Los blastos con LPS se obtuvieron activando esplenocitos (1,5 x 105 células/ml) con LPS 25 !g/ml (Sigma) y dextrán sulfato 7 !g/ml (Pharmacia, Mitton Keynes, Reino Unido) durante 3 días a 37 ºC. Antes de su uso, se cultivaron 2 x 107 blastos de LPS con péptido sintético 100 !g/ml durante 1 hora. Los cultivos se ensayaron con respecto a actividad citotóxica el día 6 en un ensayo de liberación de 51Cr.
Ensayo de liberación de 51Cr
Las células diana se marcaron durante 1 hora con cromato (51Cr) sódico 1,85 MBq (Amersham, Essex, Reino Unido) con o sin péptido 100 !g/ml. Después de la incubación se lavaron 3 veces en RPMI y se incubaron durante 1 hora adicional con péptido 100 !g/ml. Se prepararon 5 x 103 dianas/pocillo de placas de fondo en V de 96 pocillos y se coincubaron con diferentes densidades de células efectoras en un volumen final de 200 !l. Después de 4 horas a 37 ºC, se retiraron 50 !l de los sobrenadantes de cada pocillo y se transfirieron a una Lumaplate (Packard, Rigaweg, Países Bajos). Las placas se leyeron en un Contador de Centelleo de Microplaca Topcount (Packard). El porcentaje de lisis específica se calculó usando la siguiente fórmula:
Lisis específica = 100 x [(liberación experimental – liberación espontánea)/(liberación máxima – liberación espontánea)]
Ensayo de Elispot ex vivo
Se realizaron ensayos de elispot usando reactivos de captura y detección de IFNy murino de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mabtech, Suecia). Brevemente, se revistieron pocillos de la placa de Inmobilina P de 96 pocillos con anticuerpos anti-IFNy y se sembraron pocillos repetidos con 5 x 105 esplenocitos. Se añadieron péptidos sintéticos (a una diversidad de concentraciones) o 5 x 104 células de melanoma diana a estos pocillos y se incubaron durante 40 horas a 37 ºC. Después de la incubación, el IFNy capturado se detectó mediante un anticuerpo anti-IFNy biotinilado y desarrollo con una fosfatasa alcalina de estreptavidina y sustrato cromogénico. Los puntos se analizaron y se contaron usando un lector de placa automático (CTL). La avidez funcional se calculó como la concentración que media 50 % de la función efectora máxima usando un gráfico de función efectora frente a concentración de péptido. El agotamiento de linfocitos CD8 de poblaciones de esplenocitos se realizó usando
Dynabeads CD* (Dynal) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y después se añadieron a ensayo de elispot ex vivo.
Estudio de tumores
Se seleccionaron aleatoriamente ratones C57BI/6 en grupos de tratamiento y se inmunizaron a intervalos semanales durante cinco semanas. Entre la tercera y cuarta inmunización se les presentó por inyección i.v. en la vena de la cola 1 x 104 células de melanoma B16F10 IFNa. Cuando se inyectan i.v., las células B16F10 migran a los pulmones para formar metástasis. Los ratones se controlaron con respecto a señales de crecimiento tumoral y distrés. El día 49 después de la presentación de tumor, se sacrificó a los ratones y los pulmones se analizaron con respecto a la presencia de metástasis. Los bazos se analizaron con respecto a la presencia de epítopo y respuestas inmunes específicas de tumor en ensayo de elispot ex vivo.
Se inmunizaron ratones HHDII a intervalos semanales durante tres semanas y 7 días después de la inmunización final se aplicaron s.c. en el flanco derecho 2 x 104 células de melanoma B16F10 HHD. El crecimiento tumoral se controló a intervalos de 3-4 días y el tamaño del tumor se midió usando un calibrador.
Ejemplo 1 – Las construcciones de InmunoBody producen bajos niveles de anticuerpo intacto
Se prepararon transfectantes de células CHO-S estables con una construcción de InmunoBody que contenía el epítopo de gp100 IMDQVPFSV y el epítopo de TRP2 SVYDFFVWL en CDR H1 y CDR H2 respectivamente con el epítopo de HepB CD4 TPPAYRPPNAPIL en CDR L1 (DCIB15; Figura 19).
El sobrenadante de estos transfectantes se analizó con respecto a expresión de proteína de InmunoBody por ELISA de tipo sándwich. Se revistieron placas con anticuerpo específico anti Fc de IgG humana y se añadió sobrenadante. Se detectó InmunoBody unido usando un anticuerpo de HRP específico anti Fc humano para detectar cadena pesada. La cadena pesada se detectó en el sobrenadante a una concentración de aproximadamente 1 !g/ml en comparación con el control (Figura 20a). Se purificó InmunoBody del sobrenadante usando una columna de afinidad de proteína A y se analizó con respecto a la presencia de InmunoBody. La purificación de InmunoBody produjo cantidades mucho más bajas de proteína de lo que se esperaba previamente en comparación con el control (Figura 20b). Puesto que tales rendimientos bajos de proteína intacta podían purificarse, las construcciones de InmunoBody se analizaron con respecto a la expresión de tanto cadena pesada como anticuerpo intacto en el sobrenadante de células transfectadas por ELISA de tipo sándwich. Las construcciones con el epítopo de HepB CD4 en CDR L1 y el epítopo de SIINFEKL en CDR H2 (GCIB24; Figura 21) o el epítopo de gp100 IMDQVPFSV y el epítopo de TRP2 SVYDFFVWL en CDRH1 y CDRH2 respectivamente con el epítopo de HepB CD4 TPPAYRPPNAPIL en CDR L3 (DCIB25; Figura 22) también se ensayaron. Las placas se revistieron con anticuerpo específico anti Fc de IgG humana y se añadió el sobrenadante. El InmunoBody unido se detectó usando un anticuerpo de HRP específico anti Fc humano para detectar cadena pesada o un anticuerpo de HRP específico de anti cadena kappa humana para detectar InmunoBody intacto. Los transfectantes de InmunoBody muestran alto nivel de secreción de cadena pesada pero muy bajos niveles de InmunoBody intacto (Figura 20c y d).
Estos datos indican que la incorporación de epítopos de linfocitos T CD8 y CD4 en las regiones variables de cadena pesada y ligera ha roto la estructura global del InmunoBody evitando la formación de anticuerpo intacto.
Los datos adicionales sobre el análisis de sobrenadante de células CHO-S transfectadas demuestran que solamente las construcciones con epítopos de CTL incorporados en la CDRH3 o CDRL3 se secretan como anticuerpo intacto (Figura 20e). Por el contrario, la incorporación de cualquier epítopo dentro de la CDRH1 o CDRH2 permitió la secreción de cantidades pesadas pero bajas de anticuerpo intacto incluso si no se incorporaba nada dentro de la cadena ligera y se secretaba. La incorporación de cualquier epítopo dentro de CDRL1 de cualquiera de las cadenas ligeras dio como resultado secreción de nivel bajo de cadena ligera incluso si sólo había un epítopo incorporado en la CDRH3 de la cadena pesada.
Ejemplo 2 – los epítopos de CTL incorporados en el armazón de InmunoBody se procesan y presentan para inducir una respuesta inmune in vivo
El epítopo de CTL anteriormente publicado de TRP2, aa280-288 (Bloom y col, The Journal of Experimental Medicine 1997; 185: 453-9), se obtuvo por ingeniería genética en la región CDR H2 de la construcción de InmunoBody junto con un epítopo de CD4 universal de Hepatitis B en CDR L1 (DCIB18; Figura 30). Los ratones C57BI/6 se inmunizaron tres veces a intervalos semanales por vía intradérmica con ADN de InmunoBody mediante la pistola génica. Los esplenocitos se analizaron posteriormente por elispot de IFNy con respecto a respuestas específicas de TRP2. Los ratones inmunizados con ADN de InmunoBody demostraron respuestas específicas de péptido de TRP2 considerables en comparación con el control pero respuestas de nivel más bajo específicas para el péptido de HepB CD4 (Figura 31a). La avidez de las respuestas específicas de TRP2 también se estudió por titulación de péptido en elispot de IFNy. En los quince ratones ensayados dentro de cinco experimentos diferentes, la avidez de las respuestas varía de péptido 10-9 M a 10-11 M. Se muestra un ejemplo representativo en la Figura 31 b.
Para confirmar que esta respuesta específica de TRP2 estaba mediada por linfocitos T CD8, los ratones C57BI/6 se inmunizaron tres veces con ADN de InmunoBody a intervalos semanales. Seis días después de la última
inmunización los esplenocitos se aislaron y analizaron in vitro con respecto a respuestas específicas por elispot de IFNy. Para determinar si la respuesta específica de TRP2 estaba mediada por linfocitos T CD8, se suprimieron los linfocitos T CD8 antes del análisis en el ensayo de elispot. La supresión de linfocitos T CD8 condujo a la supresión de las respuesta específica de TRP2; sin embargo el agotamiento de CD8 no afectó a la respuesta de péptido HepB CD4, lo que sugiere que está mediada más probablemente por linfocitos T CD4 (Figura 31 c).
Para determinar si las respuestas generadas por inmunización con ADN de InmunoBody son capaces de matar las células diana in vitro, los esplenocitos se estimularon con blastos de LPS pulsados con péptido TRP2 in vitro durante 6 días y se analizaron en un ensayo de liberación de cromo frente a células de melanoma B16F10. Los esplenocitos de ratones inmunizados con ADN de InmunoBody demostraron lisis superior de tanto células B16F10, que tienen bajos niveles de MHC de clase I en superficie, como de células B16F10 IFNa, que tienen alta expresión de MHC de clase I en superficie en comparación con la de línea B16F10 que no expresa moléculas H-2Kb (B16F10 siKb). La supresión de la muerte frente a la línea celular B16F10 siKb demuestra que la muerte depende de CD8 y está restringida a través de H-2Kb (Figura 31d).
Estos resultados muestran que el epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) CD8 incorporado en la región CDR H2 del armazón de InmunoBody se procesa y presenta para inducir respuestas de alta frecuencia mediadas mediante MHC de clase I. El epítopo de HepB CD4 también se procesa y presenta en el contexto de MHC de clase II para inducir buenas respuestas mediadas por CD4 de inmunización con ADN.
Las respuestas específicas de epítopo de TRP2 también se analizaron de otras construcciones que contienen epítopo de TRP2 usando metodología idéntica. La incorporación del epítopo de TRP2 en CDR dentro de la cadena pesada dio como resultado respuestas específicas de péptido de alta frecuencia (Figura 31e). Por el contrario la incorporación de epítopos de CTL dentro de la cadena ligera dio como resultado una reducción significativa de la frecuencia de CTL (DCIB36). El análisis de la avidez de las respuestas específicas de epítopo de TRP2 revela que son de alta avidez cuando se generan a partir de epítopos dentro de la cadena pesada pero esta es considerablemente menor con la expresión de epítopos de la cadena ligera (Figura 31f). Se observaron respuestas auxiliares de alta avidez de alta frecuencia para todas las construcciones (Figura 31 g), lo que sugiere que la secreción de cadena pesada era una ventaja para estimular respuestas de CTL pero no para respuestas auxiliares.
Ejemplo 3 – La inmunización de ADN de ImmunoBody es mejor que la inmunización con péptido o inmunización con antígeno completo
Para analizar la eficacia de inmunización de ADN de ImmunoBody, se comparó con inmunización s.c. con epítopo peptídico en adyuvante incompleto de Freund o inmunización con un ADN que expresa el antígeno de TRP2.
Ratones C57BI/6 recibieron tres inmunizaciones semanales con ADN o péptido que comprendía el epítopo de TRP2 ligado al epítopo auxiliar universal en IFA. Las respuestas específicas de péptido auxiliar y TRP2 generadas en ratones inmunizados con ImmunoBody fueron muy superiores en magnitud a las inducidas por inmunización con péptido o inmunización con el antígeno de TRP2 completo (Figura 32a). El análisis adicional de la avidez de estas respuestas específicas de péptido revelaron que las respuestas generadas por ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody tienen una avidez más de uno logarítmico mayor que las de individuos inmunizados con péptido (Figura 32b). Las respuestas generadas en ratones C57BI/6 se analizaron posteriormente con respecto a la capacidad citotóxica in vitro frente a la línea celular B16F10 y, como un control negativo, la línea celular B16F10 siKb. La Figura 32c muestra que los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody son capaces de actividad tumoral in vitro que está restringida por H-2Kb y tanto los ratones inmunizados con péptido como los ratones inmunizados con antígenos completos son incapaces de matar las mismas líneas celulares de melanoma.
La administración de ImmunoBody también se comparó con inmunización con péptido DC +. Los ratones C57BI/6 recibieron tres inmunizaciones semanales con ADN o péptido DC +. Las respuestas específicas de péptido de TRP2 fueron de frecuencia comparable pero los ratones inmunizados con ImmunoBody generaron respuestas de mayor avidez en comparación con los inmunizados con péptido DC + (Figura 32d). Esto también se demostró cuando estas respuestas se analizaron con respecto a capacidad para matar células de melanoma B16F10 in vitro (Figura 32e). Las respuestas generadas por inmunización con ImmunoBody mostraron mayores muertes de melanoma B16F10 a menor relación de efector y diana que n las respuestas de ratones inmunizados con péptido DC +. También mostraron mayor lisis específica de la línea de melanoma B16F20 siKb que tenían niveles reducidos de H-2Kb.
Las construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de Ovoalbúmina restringido por H-2Kb, SIINFEKL, y el epítopo de gp100 restringido por HLA-A2 modificado en anclaje, IMDQVPFSV (21 CM) se compararon con la inmunización con péptido epitópico correspondiente en ratones C57BI/6 o HHDII respectivamente. Los ratones recibieron tres inmunizaciones semanales con ADN o péptido en IFA. El análisis de las respuestas después de la inmunización final revela que los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody generan respuestas específicas de péptido de mayor frecuencia en comparación con ratones inmunizados con péptido (Figura 32f y g). Estas respuestas también se analizaron con respecto a avidez por titulación de péptidos. La inmunización con ImmunoBody induce respuestas de avidez significativamente mayor que la inmunización con péptido (Figuras 32h e i).
La magnitud de la respuesta específica de TRP2 generada por la vacuna de ADN de ImmunoBody es muy superior a la generada por péptido sintético o antígeno de TRP2 completo. Sin embargo, las pruebas de ensayos clínicos sugieren que la presencia de una frecuencia alta de linfocitos T CD8 específicos de tumor no conduce necesariamente a la regresión tumoral y generalmente en ensayos de vacuna la tasa de respuesta clínica objetiva es muy baja (Rosenberg y col, J Immunol 2005; 175: 6169-76; Rosenberg y col, Nature Medicine 2004; 10: 909-15). Está resultando evidente ahora que factores distintos de la frecuencia tales como avidez funcional de los linfocitos T específicos de tumor y la vía de sensibilización son determinantes importantes en la maximización de la eficacia de vacuna. Varios grupos han mostrado que los linfocitos T CD8 de alta avidez demuestran actividad antitumoral superior (Alexander-Miller, Immunologic research, 2005; 31: 13-24; Hodge y col, J Immunol 2005; 174: 5994-6004; Valmori y col, J Immunol 2002; 168: 4231-40; Zeh y col, J Immunol 1999; 162: 989-94; Alexander-Miller y col, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996; 93: 4102-7). En el estudio de los investigadores, el análisis de la avidez funcional de respuestas específicas de TRP2 inducidas por ImmunoBody demostró que puede generarse una respuesta de alta avidez en comparación con inmunización con péptido sintético. Esta respuesta de alta avidez también se correlaciona con la capacidad mejorada para reconocer y matar células tumorales in vitro. La señal de la APC o vía de sensibilización de la respuesta también es crucial para la inducción de respuestas inmunes de alta avidez (Oh y col, J Immunol 2003; 170: 2523-30).
Ejemplo 4 – Pueden procesarse múltiples epítopos del sitio CDR H2
Para demostrar que múltiples epítopos pueden procesarse y presentarse de CDR H2 para inducir una respuesta inmune, el epítopo restringido por H-2Kb SIINFEKL (DCIB24; Figura 21) de ovoalbúmina y el epítopo de Hepatitis B restringido por H-2Kd IPQSLDSWWTSL (DCIB21; Figura 33) se insertaron por ingeniería genética en el sitio H2 en la región variable pesada. Estas construcciones de ImmunoBody también contenían un epítopo de Hepatitis B CD4 restringido por I-Ab (TPPAYRPPNAPIL) o epítopo de hemaglutinina de gripe restringido por I-Ad (FERFEIFPKE) en el sitio CDR L1 en la región variable ligera.
Se inmunizaron ratones C57BI/6 o Balb/c tres veces a intervalos semanales por vía intradérmica con ADN de ImmunoBody mediante la pistola génica. Los esplenocitos se analizaron posteriormente por elispot de IFNy con respecto a la presencia de respuestas de CD8 y CD4 específicas de epítopo.
Los ratones inmunizados C57BI/6 demostraron respuestas específicas de SIINFEKL de alta frecuencia pero menores respuestas específicas para el epítopo auxiliar (Figura 34a). Los ratones Balb/c también crearon respuestas de CD8 específicas de epítopo de Hepatitis B de alta frecuencia con niveles de respuesta similares al epítopo auxiliar (Figura 34b).
Estos datos sugieren que el procesamiento y presentación de epítopos de CD8 del sitio CDR H2 no están restringidos por secuencia o longitud de epítopo específica.
Ejemplo 5 – Pueden procesarse múltiples epítopos de CTL de la región variable
Para demostrar que pueden procesarse y presentarse epítopos de la región variable y no solamente las regiones CDR, se incorporaron epítopos en el sitio CDR H1 con la retirada de parte de la región flanqueante.
Los epítopos ejemplares son los epítopos restringidos por HLA-A2 modificados IMDQVPFSV (DCIB17; Figura 35) de gp100 y FLPATLTMV de Tie-2 (DCIB26; Figura 36). Las construcciones de ImmunoBody también contenían el epítopo de Hepatitis B CD4 en el sitio CDR L1.
Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 (HHDII) tres veces a intervalos semanales por vía intradérmica con ADN de ImmunoBody mediante la pistola génica. Los esplenocitos se analizaron posteriormente por elispot de IFNy con respecto a la presencia de respuestas de CD8 y CD4 específicas de epítopo.
Los ratones HHDII indujeron respuestas específicas de epítopo de gp100 210M de alta frecuencia con respuestas razonables para el epítopo de HepB CD4 (Figura 37a). Las respuestas en ratones HHDII inmunizados con la construcción que contenía el epítopo de Tie2 no eran de frecuencia tan alta pero se generaron respuestas considerables específicas para tanto el epítopo de Tie2 como el epítopo de HepB CD4 (Figura 37b).
Los datos en este ejemplo indican que los epítopos insertados dentro de la región variable pueden procesarse y presentarse para inducir una respuesta inmune in vivo. También resulta evidente que esto no se restringe a una secuencia de epítopo.
Ejemplo 6 – Pueden generarse múltiples respuestas de CTL de diferentes epítopos dentro de la misma construcción de ImmunoBody
El epítopo de gp100 restringido por HLA-A2 previamente mencionado IMDQVPFSV se insertó por ingeniería genética en el sitio CDR H1 junto con el epítopo de TRP2 SVYDFFVWL que también está restringido a través de HLA-A2 en el sitio CDR H2 de la misma construcción. El epítopo de HepB CD4 estaba presente en el sitio CDR L1 (DCIB15; Figura 19).
Los ratones HHDII se inmunizaron tres veces a intervalos semanales por vía intradérmica con ADN de ImmunoBody mediante la pistola génica. Los esplenocitos se analizaron posteriormente por elispot de IFNy con respecto a la presencia de respuestas de CD8 y CD4 específicas de epítopo.
La Figura 38a muestra que se generan respuestas específicas para los epítopos tanto de gp100 como de TRP2, aunque la frecuencia de las respuestas específicas de TRP2 son menores. También se generan respuestas de péptido de HepB CD4. La avidez de las respuestas específicas de TRP2 también se estudió por titulación peptídica en elispot de IFNy. La avidez de las respuestas varía de péptido 10-10 M a 10-11 M para el epítopo de gp 100 y péptido 10-9 M a 10-10 M para el epítopo de TRP2. Se muestran ejemplos representativos en la Figura 38b. Para determinar si las respuestas son capaces de matar las células diana in vitro, se estimularon esplenocitos con blastos de LPS pulsados con péptido TRP2 y gp100 in vitro durante 6 días y se analizaron en un ensayo de liberación de cromo frente a células T2 marcadas con péptido y células de melanoma B16F10 HHD. La muerte específica de línea de melanoma B16F10 HHD era comparable a la de la línea de melanoma B16F10 de control. Las respuestas también demostraron lisis específica de células T2 marcadas con péptido en comparación con el control (Figura 38c).
La combinación de dos epítopos de CD8 en una construcción de ImmunoBody sencilla parece dar como resultado un grado de inmunodominancia entre los epítopos. El epítopos inmunodominante es el epítopo con la mayor afinidad por el MHC de clase I. Cuando los ratones inmunizados con la construcción que contiene epítopos tanto de gp100 como de TRP2 CD8 se comparan con los inmunizados con una construcción que contiene solamente el epítopo de TRP2 CD8, la frecuencia de la respuesta de TRP2 disminuye (Figura 38d).
Estos datos demuestran que pueden generarse respuestas inmunes específicas de epítopo de la misma construcción de ADN específica para dos epítopos de CD8 diferentes. Estos también son capaces de actividad antitumoral in vitro. Sin embargo, existe un grado de inmunodominancia que gobierna la frecuencia de la respuesta al epítopo subdominante.
Se realizó un estudio similar con construcciones de ImmunoBody separadas que contenían el epítopo de TRP2 en CDRH2 (DCIB18) o el epítopo SIINFEKL en CDRH2 (DCIB24). Los ratones se inmunizaron con DCIB18 o DCIB24 solamente, DCIB18 y DCIB24 combinados en el mismo sitio o DCIB18 y DCIB24 a la vez pero en sitios separados. Se realizaron inmunizaciones tres veces a intervalos semanales y se inyectó ADN i.m. en el músculo tibial en combinación con electroporación. El análisis de las respuestas inmunes generadas muestra que pueden inducirse respuestas específicas de péptido de alta frecuencia cuando los ratones se inmunizaron con DCIB18 o DCIB24 solamente (Figura 38e). La inmunización de ratones con estas construcciones en el mismo sitio da como resultado pérdida significativa de la respuesta específica de péptido TRP2. Esto sugiere que el epítopo SIINFEKL es dominante sobre el epítopo de TRP2. La respuesta específica de TRP2 puede recuperarse si se inmunizan ratones con construcciones en sitios separados (p=0,0026). Estos datos sugieren que la inmunodominancia influye en las respuestas inmunes generadas por inmunización con IB pero esto puede resolverse por inmunización en sitios separados espacialmente.
Ejemplo 7 – Las modificaciones de restos no de anclaje pueden potenciar el reconocimiento de linfocitos T
El ejemplo anterior muestra que el epítopo de gp100 modificado IMDQVPFSV es inmunodominante y tiene una alta afinidad por HLA-A2 (predicho usando el algoritmo de SYFPEITHI y demostrado en el ensayo de estabilización de T2 -Tabla 5). Puesto que el epítopo de gp100 de tipo silvestre ITDQVPFSV no es inmunogénico, se realizaron modificaciones en restos no de anclaje que tendrían una afinidad de unión a HLA-A2 similar a la del epítopo de tipo silvestre pero también potenciaría la inmunogenicidad. Estos epítopos modificados se insertaron por ingeniería genética en el sitio CDR H1 de la construcción de ImmunoBody y se ensayaron junto con el epítopo de tipo silvestre (DCIB37, DCIB40, DCIB41, DCIB42, DCIB43; Figuras 39-43).
Se inmunizaron ratones HHDII tres veces a intervalos semanales por vía intradérmica con ADN de cadena pesada de ImmunoBody solamente mediante la pistola génica. Los esplenocitos se analizaron posteriormente por elispot de IFNy con respecto a la presencia de respuestas de CD8 específicas de epítopo. Dos modificaciones (F7L y F7I; DCIB37; Figura 39, DCIB40; Figura 40) del epítopo de gp100 de tipo silvestre que conservaban la afinidad por HLA-A2 (Tabla 5) demostraron una capacidad superior para inducir respuestas inmunes específicas de epítopos en comparación con el epítopo de tipo silvestre (Figura 44a).
Tabla 5
Antígeno
Epítopo Ensayo de estabilización de T2 (m.f.i) Puntuación de SYFPEITHI
Gp100 (210M)
IMDQVPFSV 23,1 22
Gp100 (wt)
ITDQVPFSV 18,5 18
Gp100 (F7L)
ITDQVPLSV 18 19
Gp100 (F7I)
ITDQVPISV Nd 18
TRP2
SVYDFFVWL 19 21
Control
7,29 -
Ejemplo8- Pueden procesarse y presentarse múltiples respuestas auxiliares de CD4 para inducir una respuesta inmune in vivo
5 Para examinar si los epítopos auxiliares de CD4 podían procesarse y presentarse para inducir una respuesta inmune in vivo, se insertaron por ingeniería genética de forma independiente diferentes epítopos en el sitio de CDR L1 de la construcción de ImmunoBody. Estos incluyen el epítopo restringido por I-Ad FERFEIFPKE (DCIB21; Figura 33) de hemaglutinina de la gripe, el epítopo restringido por I-Ab TPPAYRPPNAPIL de HBcAg (DCIB15; Figura 19) y el epítopo restringido por HLA-DR4 WNRQLYPEWTEAQRLD de gp100 (DCIB35; Figura 45).
10 Se inmunizaron ratones transgénicos Balb/c, C57BI/6 o HHDII y DR4 tres veces a intervalos semanales por vía transdérmica con ADN de ImmunoBody mediante la pistola génica. Se analizaron posteriormente los esplenocitos mediante elispot de IFNy con respecto a la presencia de respuestas de CD4 específicas de epítopo. Las Figuras 46a, b y c demuestran que los tres epítopos auxiliares de CD4 pueden procesarse y presentarse del sitio CDR L1 para inducir una respuesta inmune específica de epítopo in vivo.
15 El epítopo restringido por HLA-DR4 de gp100 también se ensayó con respecto a procesamiento y presentación de diferentes CDR. Las construcciones que incorporan el epítopo en CDRL1 (DCIB35; Figura 45), CDRH3 (DCIB54; Figura 29) o CDRL3 (QCIB50; Figura 47) se usaron para inmunizar ratones transgénicos HLA-DR4 tres veces a intervalos semanales. La Figura 46d muestra que el epítopo auxiliar puede procesarse eficazmente de diferentes CDR para inducir respuestas auxiliares de alta frecuencia.
20 Ejemplo 9 – las respuestas de CTL son parcialmente dependientes de la cadena pesada secretada pero las respuestas auxiliares no requieren cadena ligera secretada
Clásicamente se procesan epítopos de linfocitos T CD4 de proteínas que se adquieren de forma exógena y epítopos de linfocitos T CD8 de proteínas producidas de forma endógena. Existen pruebas ahora de que la presentación cruzada de epítopos de antígenos adquiridos de forma exógena induce una respuesta mediada por linfocitos T CD8.
25 También se ha propuesto que esta vía de sensibilización es más eficaz en el desarrollo de respuestas inmunes mediadas por linfocitos T CD8. Recientemente ha habido hallazgos similares para respuestas mediadas por CD4. Las pruebas crecientes sugieren que los epítopos de linfocitos T CD4 derivados de proteínas intracelulares pueden procesarse y presentarse en el contexto de MHC de clase II.
Para determinar si se requiere ImmunoBody secretado para la inducción de respuestas de linfocitos T CD8 y CD4,
30 se prepararon construcciones de ImmunoBody que contenían el epítopo de gp100 restringido por HLA-A2 IMDQVPFSV en el sitio CDR H1 y el epítopo auxiliar de HepB restringido por I-Ab TPPAYRPPNAPIL en el sitio de CDR L1 sin secuencias líder en la cadena pesada o cadena ligera (Figuras 10 y 11).
Se inmunizaron ratones HHDII tres veces en intervalos semanales por vía intradérmica con ADN de ImmunoBody mediante la pistola génica. Los esplenocitos se analizaron posteriormente mediante elispot de IFNy con respecto a la 35 presencia de respuestas de linfocitos T CD8 y CD4 específicas de epítopo. Cuando las respuestas se analizaron con respecto a respuesta de CD8 específica de gp100, se observó que la retirada de la secuencia líder de la cadena pesada de la construcción de ImmunoBody dio como resultado una reducción de las respuestas específicas de epítopo, sin embargo las respuestas de CD4 no se vieron afectadas (Figura 48a). La retirada de la secuencia líder de la cadena pesada afectó a la secreción de cadena pesada por las células CHO-S transfectadas (Figura 48b). La
40 retirada de la secuencia líder de la cadena ligera, evitando de este modo secreción de cadena ligera, no pareció afectar a las respuestas de CD8 o CD4 específicas de epítopo (Figura 48c). Las respuestas de CD8 se redujeron significativamente en ausencia de una secuencia líder en la cadena pesada pero las respuestas de CD4 no se vieron afectadas (Figuras 48c y d).
Estos datos implican que la secreción de cadena pesada es importante para la inducción eficaz de una respuesta de linfocitos T CD8, lo que sugiere que los epítopos de CD8 experimentan presentación cruzada. En segundo lugar, implica que los epítopos de CD4 derivan de ImmunoBody intracelular para inducir una respuesta inmune.
Ejemplo 10 – Respuestas de CTL reducidas sin Fc debido a falta de secreción de proteína
Este experimento examina si la presencia de la región Fc es beneficiosa para establecer una respuesta inmune eficaz. La región Fc se ha retirado de la construcción de ImmunoBody, que contiene el epítopo de TRP2 restringido por H-2Kb SVYDFFVWL en CDR H2 y el epítopo de HepB CD4 restringido por I-Ab TPPAYRPPNAPIL en CDR L1 (OCIB15), incorporando un codón de parada antes del Fc para evitar la transcripción y traducción (Figura 9).
Se inmunizaron ratones C57BI/6 tres veces a intervalos semanales por vía intradérmica con ADN de ImmunoBody mediante la pistola génica. Los esplenocitos se analizaron posteriormente por elispot de IFNy con respecto a la presencia de respuestas de linfocitos T CD8 y CD4 específicas de epítopo.
Los ratones inmunizados con la construcción de ImmunoBody sin la región Fc generaron un nivel bajo de respuesta específica de péptido TRP2 que era capaz de reconocimiento de nivel muy bajo de la línea celular tumoral B16F10 en comparación con una construcción con la región Fc (Figura 49a). El análisis de las respuestas específicas de péptido auxiliar HepB y TRP2 de varios experimentos demuestra que las construcciones sin la región Fc generan respuestas específicas de péptido TRP2 significativamente más bajas (Figura 49b). Sin embargo, las respuestas auxiliares de HepB no se ven afectadas por la retirada de la región Fc (Figura 49c). Esto es coherente con los resultados anteriores de los investigadores que muestran que la ayuda funciona mejor en la cadena ligera cuando no se secreta y funciona por lo tanto por presentación directa. Por el contrario las respuestas de CTL se estimulan por presentación tanto directa como indirecta y la segunda puede beneficiarse de la dirección a Fc. Como alternativa la construcción sin Fc da como resultado menor secreción de la cadena pesada truncada lo que puede explicar la respuesta reducida. Se obtuvo por ingeniería genética por lo tanto un ImmunoBody que codificaba TRP-2 con una IgG2 (DGIB33) y una región constante de IgG3 (DCIB65). La primera no debería unirse a CD64 pero puede unirse a CD32 y también puede unirse al receptor IV de Fc en ratones. La IgG3 humana puede unirse a tanto CD32 como CD64. Ambos ImmunoBodies estimularon respuestas de CTL fuertes (Figura 49e). Esto sugiere que la dirección de Fc no es un componente fuerte de la presentación indirecta. Para verificar adicionalmente esta cuestión, el domino de dirección Fc de IgGt se reemplazó con el dominio de IgG2 equivalente y viceversa (DCIB56, 67, Figuras 15 y 16). Ambas construcciones estimularon respuestas de CTL fuertes (Figura 49e). Esto puede deberse a que las vacunas de ImmunoBody™ solamente secretan cadena pesada que puede no asociarse y permitir la unión de Fc (Figura 49f y g).
Ejemplo 11- La inmunización con ImmunoBody potencia las respuestas inmunes y supera la regulación observada del antígeno completo. También permite la identificación de nuevos epítopos de linfocitos T heterólogos.
Esto puede conducir al segundo beneficio de inmunización con un epítopo de linfocitos T que codifican anticuerpo humano que es, a diferencia de la mayoría de los antígenos propios, un vehículo inerte que no expresa epítopos reguladores. Un ImmunoBody™ que expresa un epítopo de gp100 o un epítopo de TRP-2 estimuló una respuesta de linfocitos T de alta avidez de alta frecuencia (frecuencia 1/103 avidez 10-10 M) mientras que la inmunización con el antígeno de gp100 o TRP-2 completo estimuló linfocitos T con baja frecuencia y avidez (frecuencia 1/105 avidez 10-7 M). El agotamiento de CD25 restauró parcialmente la respuesta al antígeno pero el ImmunoBody aún era 100 veces superior (Figura 50a y b).
De forma similar la inmunización con ADN que codifica los primeros 200 aminoácidos de Tie-2 ligado a Fc, no estimuló una respuesta inmune a los 10 epítopos predichos superiores. La secuencia de los primeros 196 aminoácidos de Tie-2 se introdujo en los algoritmos de predicción en línea EpiJen y NetCTL. Ambos de estos procedimientos tienen en cuenta escisión proteasómica y transporte de TAP además de predecir la afinidad de unión a HLA-A*0201. Los algoritmos MHCpred y Syfpeithi se usaron también como ejemplos de los algoritmos de predicción más antiguos que solamente tienen en cuenta afinidad de unión al MHC predicha. La molécula de Tie-2 completa podría contener epítopos de CTL adicionales que pueden ejercer un efecto inmunodominante sobre los presentes en los primeros 196 aminoácidos. La secuencia completa de Tie-2 se introdujo también por lo tanto en los mismos algoritmos para obtener los rangos de cada epítopo predicho de la molécula completa. Los péptidos que no eran homólogos en ratones y hombres se descontaron. Se seleccionaron seis de los péptidos restantes que se predecía consistentemente que representaban buenos epítopos de CTL por varios algoritmos diferentes de predicción. Las puntuaciones relativas obtenidas con los diferentes algoritmos para cada uno de estos péptidos, junto con resultados para Z83 (un epítopo previamente identificado), se resumen en la Tabla 6.
Datos adicionales del análisis de sobrenadante de células CHO-S transfectadas demuestran que solamente las construcciones con epítopos de CTL incorporados en la CDRH3 o CDRL3 se secretan como anticuerpo intacto (Figura 20e). Por el contrario, la incorporación de cualquier epítopo dentro de la CDRH1 o CDRH2 permitió la secreción de cantidades pesadas pero bajas de anticuerpo intacto incluso si no se incorporó nada dentro de la cadena ligera y se secretó. La incorporación de cualquier epítopo dentro de CDRL1 de la cadena ligera dio como resultado secreción de nivel bajo de la cadena ligera incluso si solamente había un epítopo incorporado en la
CDRH3 de la cadena pesada.
Para determinar si existe un repertorio de linfocitos T en ratones transgénicos HLA-A*0201 que reconozca cualquiera de los epítopos de CTL predichos de Te-2, los animales se inmunizaron con la construcción de ADN de Tie2 C200hFc nativa (Ramage y col. Int. J. Cancer 2004; 110: 245-250) y los esplenocitos se exploraron con
5 respecto a respuestas de IFNy específicas de péptido en un ensayo de ELISPOT. Se inmunizó un grupo separado de ratones con C200hFc después de tratamiento con PC61, como antes, 4 días antes de la inmunización con ADN.
Los ratones que se inmunizaron con la construcción de C200HFc nativa no montaron una respuesta de IFNy que reconociera Z83, independientemente de si se agotaron los linfocitos T reguladores CD25+ de los animales antes de la inmunización o no. No hubo respuestas de IFNy significativas para ninguno de los nuevos péptidos ensayados de 10 animales en los que no se habían agotado los linfocitos T reguladores antes de la inmunización, con la excepción de Z284 que parecía estimular una respuesta en un animal (M3) con una media de 69 SFC/millón de esplenocitos (Figura 50c y d). De los animales en los que se agotaron los linfocitos T reguladores antes de la inmunización de ADN, 213 animales (my y M3) demostraron una respuesta de IFNy a la reestimulación con péptido Z282, con valores medios de 320 y 94 SFC/millón de esplenocitos respectivamente. M1 también demostró una respuesta parcial a la
15 reestimulación con Z285, con una media de 85 SFC/millón de esplenocitos.
Los resultados aparentemente conflictivos de la exploración in vivo de los epítopos de CD8+ predichos de Tie-2 podrían ser el resultado de inmunodominancia, puesto que las respuestas de IFNy de los ratones que se inmunizaron con la construcción de C200HFc nativa en ausencia de células CD25+ parecían sesgarse hacia un péptido predominante. Para investigar adicionalmente el repertorio de linfocitos T que está disponible para responder 20 al epítopo Z282, en ausencia de competición de otros epítopos de CD8+ potenciales, se inmunizó a un grupo de ratones HHD con el péptido de Z282 en IFA en presencia o ausencia de linfocitos T reguladores CD25+. Todos los ratones inmunizados con Z282 montaron respuestas de IFNy específicas de péptido, incluso cuando se inmunizaron en presencia de linfocitos T reguladores CD25+. El ratón 3 de los animales no empobrecidos montó la respuesta más alta, con un valor medio de 215 SFC/millón de células. La respuesta más alta de los animales empobrecidos se
25 observó del ratón 2 con un valor medio de 137 SFC/millón de células (Figuras 50e y f).
Las respuestas inducidas por inmunización con péptido siguen siendo de baja frecuencia. Para examinar si pueden generarse respuestas de mayor frecuencia si el epítopo se retira de cualquier influencia reguladora generada por el antígeno completo, el epítopo de z282 (también conocido como z12) se introdujo por ingeniería genética en el sitio H1 de una construcción de ImmunoBody junto con Hep B CD4 en L1 (DCIB71, Figura 51). Se inmunizaron después 30 ratones transgénicos HLA-A2 con péptido z12 o ADN de ImmunoBody (mediante pistola génica) tres veces a intervalos semanales y después se analizaron con respecto a la presencia de respuestas inmunes específicas de epítopo. Todos los ratones inmunizados con péptido z12 muestran respuestas específicas de epítopo de baja frecuencia y avidez (Figura 50g). Sin embargo cuando el epítopo z12 se introduce por ingeniería genética en la construcción de ImmunoBody se inducen respuestas de mayor frecuencia y avidez en todos los ratones (Figura
35 50h).
Para resumir, si se empobrecieron las células CD25 antes de la inmunización se estimuló una respuesta inmune a 3/10 de los epítopos de Tie2. De forma similar si uno de estos epítopos se presentaba como un péptido, podrían generarse respuestas inmunes débiles. Sin embargo si este epítopo se presentaba dentro de una construcción de ImmunoBody™ se generaron respuestas de linfocitos T de alta frecuencia y alta avidez. Estos resultados sugieren
40 que existen epítopos de T-reg dentro de los primeros 200 aminoácidos de Tie-2 que inhiben respuestas de CTL. Si estos T-reg o sus epítopos se retiran es posible revelar una respuesta a antígenos propios que pueda potenciarse adicionalmente por presentación dentro de un ImmunoBody.
Nombre1
Comienzo2 Péptido3 EpiJen4 NetCTL5 Sytpeithi6 MHCPred7
Puntuación (CI50 nM)
Rango Puntuación Rango Puntuación Rango Puntuación (CI50 nM) Rango
Z83
124 FLPATLTMT --- --- 0,73 9 (27) 19 18 (55) 2978 96 (55)
Z282
27 ILINSLPLV 0,05 1 1,39* 1 29 1 (2) 16 2 (6)
Z283
146 VLIKEEDAV 0,23 2 (5) 0,7 10 (31) 24 5 (11) 89 9 (34)
(cont.)
Nombre1
Comienzo2 Péptido3 EpiJen4 NetCTL5 Sytpeithi6 MHCPred7
Puntuación (CI50 nM)
Rango Puntuación Rango Puntuación Rango Puntuación (CI50 nM) Rango
Z284
64 LMNQHQD PL 0,98 3 (7) 0,88* 3 (11) 21 9 (32) 113 11 (51)
Z285
8 VLCGVSLLL 1,19 4 (10) 0,94* 2 (9) 24 4 (10) 242 21 (125)
Z286
34 LVSDAETSL --- --- 0,74 8 (26) 19 15 (52) 887 65 (349)
Z287
26 LILINSLPL --- --- 0,88* 4 (12) 23 7 (16) 607 57 (271)
Z18
(flu) GILGFVFTL 0,19 (1) 1,29 (2) 30 419 (87)
Tabla 6. Epítopos de CTL restringidos por HLA-A*0201 predichos de Tie-2, 1Nombre del péptido. 2 Posición de comienzo del resto aminoacídico dentro de la molécula de Tie-2. 3 Secuencia peptídica. 4 Predicción usando el 5 servidor web EpiJen. La puntuación se proporciona en unidades de CI50 nM, representando las puntuaciones inferiores péptidos de mayor afinidad. 6 Predicción usando el servidor web NotCTL 1.2. La puntuación representa la suma ponderada de tres procedimientos de predicción individuales, indicando una ponderación relativa de unión a MHC de 1 una puntuación por encima del valor de umbral de 0,75 identificado como el punto de corte para epítopos de CTL del conjunto de datos obtenido para epítopos conocidos. Predicción usando el programa SYFPEITHI. La 10 puntuación máxima para péptidos de unión a HLA-A*0201 es 36. 7 Predicción usando el procedimiento aditivo de MHCPred para predecir la afinidad de los péptidos por MHC y TAP. La puntuación se proporciona de nuevo en unidades de CI50 nM, representando las puntuaciones inferiores péptidos de mayor afinidad. Los valores de CI50 sugeridos están entre 0,01 y 5000 nM. Para todos los procedimientos de predicción, los valores de rango indican el orden en el que los epítopos se predicen del fragmento de 196 aminoácidos, representando los valores entre
15 paréntesis las predicciones de rango de la molécula de Tie-2 completa. Los valores obtenidos para el epítopo de Z18 CTL conocido derivado de la proteína de matriz del virus de la gripe A se incluyen para comparación.
Ejemplo 12 – El papel de Fc xenogénico al proporcionar ayuda de linfocitos T y el requisito de ayuda de linfocitos T específica de antígeno
La estimulación de respuestas de linfocitos T de alta avidez habitualmente requiere ayuda de linfocitos T durante la
20 sensibilización. Se concibió originalmente que esta se proporcionaría por el epítopo auxiliar ajeno Hep B codificado dentro de la cadena ligera. De hecho se generaron respuestas auxiliares fuertes para este epítopo. Sin embargo a medida que se secretaba la cadena pesada y no la cadena ligera aunque el epítopo de hep B podría haber proporcionado ayuda para la presentación directa cuando se produjeran ambas cadenas por la misma APC es poco probable que pudiera proporcionar ayuda para la cadena pesada presentada de forma indirecta puesto que es poco
25 probable que esta se capte por la misma célula presentadora de antígenos. Se inmunizaron por lo tanto ratones con un vector de ADN que codifica solamente la cadena pesada. Se generaron aún respuestas de CTL de alta avidez y alta frecuencia (Figura 53 a y b). Esto implica que no se requiere ayuda o que el Fc humano que es xenogénico en ratones está proporcionando ayuda ajena ligada. Se evaluó por lo tanto una construcción de IgG2a de ratón con respecto a secreción de cadenas pesadas y ligeras (Figura 49g) y se exploró con respecto a generación de
30 respuestas inmunes (OCIB53 Figura 54). Aunque aún proporcione respuesta de linfocitos T de alta avidez y alta frecuencia estas no fueron tan fuertes como la construcción humana equivalente lo que sugiere que el Fc xenogénico estaba proporcionando ayuda ligada (Figura 53c y d). Se incorporó después un epítopo de gyp100 HLA-DR4 en la construcción de IgG2a de ratón (DCIB64, Figura 55) para proporcionar ayuda ligada para generación de CTL pero también ayuda de linfocitos T específicos de antígeno para estimular la inflamación dentro del ambiente
35 tumoral. Estas construcciones estimulan respuestas auxiliares y de CTL de alta avidez y alta frecuencia (Figura 53e y f). Puede usarse una construcción de hIgG1 que exprese el mismo epítopo en pacientes humanos.
Ejemplo 13 – El procesamiento de inmunoproteasoma es importante en la generación de respuestas de epítopos dentro de construcciones de ImmunoBody
Se ha sugerido que el inmunoproteasoma tiene la capacidad de alterar la disposición de los epítopos generados de antígenos propios puesto que posee un patrón diferente de escisión. En algunos casos, se generan nuevos epítopos tras la regulación positiva del inmunoproteasoma y en otros se destruyen los epítopos. Existen pruebas de que el inmunoproteasoma es incapaz de generar varios epítopos derivados de antígenos de melanoma concretamente
209-217369-377
MelanA/MART-1, gp100 y Tirosinasa (Chapiro y col 2006. J Immunol; 176:1053-61). Chapiro y colaboradores han sugerido que la capacidad para procesar y presentar el epítopo de gp100 está relacionada con la regulación positiva del inmunoproteasoma. Se cree que las DC maduras son responsables de la sensibilización de respuestas inmunes y se sabe que expresan constitutivamente el inmunoproteasoma (Macagno y col. 2001. Eur J Immunol; 31: 3271-80). El epítopo de gp100209-217 se introdujo por lo tanto por ingeniería genética en el sitio de CDRH1 de una construcción de ImmunoBody y se ensayó con respecto a su capacidad para inducir respuestas inmunes específicas de péptido en ratones transgénicos HLA-A2. No se observaron respuestas específicas de péptidos de esta construcción (Figura 56). Sin embargo cuando el epítopo se modificó para poseer una metionina en la posición 210 (210M) en lugar de treonina esto evitó su escisión por el inmunoproteasoma y se observaron respuestas específicas de epítopo (Figura 56).
También se ensayaron un péptido restringido por HLA-A2 derivado de VEG32 (aa 773-781 VIAMFFWLL) y dos péptidos de hTERT modificados (aa 572-580 YLFFYRKSV y aa 988-997 YLQVNSLOTV) con respecto a generación de respuestas de construcciones de ImmunoBody. Estos epítopos se descubrieron inicialmente por predicción de epítopos in silico e inmunización por péptido negando por lo tanto el requisito de procesamiento proteasómico. Sin embargo se presentaron en la superficie de células tumorales/endoteliales huésped lo que sugiere que se procesan de antígeno completo mediante el proteasoma constitutivo. Ninguno de estos epítopos generó respuestas cuando se introdujo por ingeniería genética en la construcción de ImmunoBody lo que sugiere que puede requerirse procesamiento mediante el inmunoproteasoma para generación eficaz de respuestas inmunes.
Ejemplo 14- Diferentes procedimientos de inmunización son eficaces en la inducción de respuestas inmunes de vacuna de ImmunoBody
Se ha mostrado que la vacuna de ImmunoBody es eficaz en la inducción de respuestas de CD8 y CD4 de alta frecuencia y avidez cuando se administran mediante pistola génica. La vacuna de ImmunoBody se ensayó posteriormente con respecto a generación de respuestas de linfocitos T usando otros procedimientos de inmunización.
Se inmunizaron ratones C57Bl-6 con ADN de ImmunoBody que contenía el epítopo de TRP2 en CDRH2 mediante la vía i.d. o i.m. Las inmunizaciones se combinaron con y sin electroporación y se realizaron tres veces a intervalos semanales.
Los ratones inmunizados con pistola génica muestran respuestas específicas de péptido TRP2 de alta frecuencia. Estas son comparables en ratones inmunizados mediante vía i.m. o i.d. combinada con electroporación. La inmunización, mediante vía i.m. o i.d. en ausencia de electroporación generó respuestas específicas de péptido TRP2 de frecuencia menor (Figura 57a). Todas las respuestas específicas de péptido TRP2 son de alta avidez según se mide por titulación de péptidos (Figura 57b).
Ejemplo 15 – La inmunización con ImmunoBody induce despigmentación de tipo vitíligo y protege frente a presentación tumoral
Puesto que los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody generan respuestas inmunes capaces de actividad citotóxica frente a la línea celular tumoral altamente metastásica y escasamente inmunogénica B16Fl0, la vacuna se ensayó con respecto a eficacia protectora in vivo.
Se inmunizaron ratones con ADN de IB (DCIB1B; Figura 30) mediante pistola génica en la piel afeitada del abdomen a intervalos de cinco semanas. A mitad del programa de inmunizaciones, se inyectó a los ratones i.v. 1 x 104 células B16F10 que expresaban IFNa que forma tumores metastásicos en el pulmón. Cuando se permitió que el pelo creciera de nuevo después de la última inmunización, se observó que los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody tenían crecimiento de pelo blanco en el sitio de inmunización (Figura 58a). Siete semanas después de la inyección de células tumorales, los ratones se sacrificaron y se analizó el número de metástasis de pulmón internas y externas. Los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody mostraron una reducción significativa en el número de metástasis de pulmón en comparación con ratones de control no tratados (Figura 58b).
También se inmunizó a los ratones con ADN de IB (DCIB18) mediante pistola génica a tres intervalos semanales. Siete días después de la inmunización final se presentó a los ratones 2 x 104 células B16F10 que expresaban IFNa de forma subcutánea. Se controló a los ratones con respecto al crecimiento tumoral y supervivencia. Los ratones se sacrificaron una vez que los tumores alcanzaron el límite máximo de acuerdo con las regulaciones del Ministerio del Interior. Los ratones inmunizados con ADN de ImmunoBody mostraron crecimiento tumoral subcutáneo significativamente más lento y supervivencia prolongada (Figura 58c y d).
La respuesta específica de TRP2 está mediada por CD8 puesto que el agotamiento de las células CD8+ suprime la respuesta. Se han identificado los linfocitos T CD8 como un factor importante en la inmunización antitumoral y los resultados de los investigadores muestran que la inmunización con ADN de ImmunoBody induce inmunidad antitumoral in vivo en un modelo de ratón. Todos los ratones inmunizados sin señales de enfermedad mostraron despigmentación de tipo vitíligo del pelaje en el sitio de inmunización. Anteriormente el vitíligo se ha asociado con frecuencia con la protección tumoral en ratones y se ha correlacionado en gran medida con inmunoterapia de IL-2 exitosa en pacientes con melanoma metastásico (Overwijk y col. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1999; 96: 2982-7; Lance y col, Cancer Research 2004; 64: 1509-14; Steitz y col, Cancer Immunol Immunother 2006, 55: 246-53; Rosenberg & White, J Immunother Emphasis Tumor Immunol 1996;19: 81-4).
Ejemplo 16 – La inmunización con ImmunoBody retarda significativamente el crecimiento tumoral.
Se ha mostrado previamente que la inmunización con ImmunoBody protege significativamente contra la presentación de tumor. La vacuna se ensayó posteriormente con respecto a eficacia en un ambiente terapéutico.
Se inyectó a ratones C57BI/6 s.c. 2 x 104 células tumorales B16F1C. Cuatro días después de la inyección se inmunizó a los ratones con ADN de ImmunoBody que contenía epítopo de TRP2 en CORH2 o ADN de ImmunoBody de control. Se realizaron inmunizaciones repetidas los días 11 y 18 después de la inyección del tumor. El crecimiento tumoral se controló a intervalos de 3-4 días. Los ratones inmunizados con ImmunoBody demuestran un retardo significativo del crecimiento del melanoma B16F10 agresivo en comparación con ratones inmunizados con el control (Figura 59a).
Se realizó también un estudio similar usando la línea tumoral de IFNalfa B16F10 menos agresiva. Se inyectó a ratones C57BI/6 2 x 104 células tumorales s.c. y se inmunizaron el día 14 con ADN de ImmunoBody o ADN de control. Se realizaron inmunizaciones repetidas los días 21 y 28 después de la inyección del tumor. Los ratones inmunizados con ImmunoBody mostraron crecimiento tumoral significativamente menor que los ratones inmunizados con control el día 47 después de la inyección tumoral (Figura 59b). Los datos anteriores han sugerido que el agotamiento de linfocitos T reguladores potencia la generación de respuestas inmunes, por lo tanto se realizó un estudio antitumoral. En este estudio se inyectó a ratones 2 x 104 células tumorales B16F10 s.c. y se inmunizaron el día 4, 11 y 18 con ADN de ImmunoBody o ADN de control. El día 0 se agotaron los linfocitos T reguladores de los ratones mediante inyección de anticuerpo anti-CD25 (PC61). Simultáneamente con la segunda inmunización también se inyectó a los ratones anticuerpo anti-CTLA4 ya que se ha mostrado también que el bloqueo de CTLA-4 es beneficioso en la inhibición de linfocitos T reguladores. El crecimiento tumoral se controló y aunque la inmunización con ImmunoBody retarda significativamente el crecimiento tumoral (p=0,0188) esto se mejoró adicionalmente por tratamiento con anticuerpos anti-CD25 y anti-CTLA-4 (p=0,001) (Figura 59c). El tratamiento con anticuerpo anti-CD25 no pareció retardar significativamente el crecimiento tumoral observado en ratones inmunizados con ImmunoBody.
Ejemplo 17 – Pueden generarse respuestas inmunes de construcciones de ImmunoBody expresadas de diferentes cadenas principales de vector.
Se analizaron las respuestas cuando las construcciones de ImmunoBody se expresaron de diferentes cadenas principales de vector. Se introdujo por ingeniería genética una construcción de ImmunoBody que contenía epítopo de gp100DR7 en CDRH1, epítopo de TRP2 en CDRH2 y epítopo de gp100DR4 en CDRH3 con cadena ligera de tipo silvestre en los vectores de expresión doble OCOrig y DCVax (DCIB54, Figuras 18 y 29). Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-DR4 mediante pistola génica tres veces a intervalos semanales y las respuestas se analizaron ex vivo por ensayo de elispot de IFNy.
Se realizaron experimentos similares usando una construcción de ImmunoBody que contenía epítopo de gp100DR7 en CDRH1 y CDRL3, epítopo de TRP2 en CDRH2, epítopo de gp100DR4 en CDRH3 y CDRL1 (DCIB68, Figura 60). Esta construcción se insertó por ingeniería genética en las cadenas principales de vector tanto OCOrig, DCOrig desprovisto del promotor de SV40, como DCVax.
Los ratones inmunizados con la construcción de ImmunoBody en el vector Orig (B1-3) demuestran respuestas de epítopo de frecuencia similar en comparación con la construcción de Immunobody en el vector pVax (C1 -3) (Figura 61).
En resumen la tecnología de ImmunoBody tiene capacidad superior para inducir respuestas inmunes de CD8 y CD4 de alta frecuencia y avidez de un armazón de anticuerpo no inmunogénico que puede evitar eficazmente el crecimiento tumoral in vivo. Tiene la capacidad de dirigirse hasta a seis antígenos diferentes simultáneamente y tiene la capacidad de evitar el problema de los linfocitos T reguladores que con frecuencia aparece cuando se usan inmunógenos de antígeno completo. Esta tecnología presenta un enfoque nuevo para la vacunación y demuestra el potencial para que los sistemas de ImmunoBody se usen como una vacuna multivalente para muchos otros tipos de cáncer y enfermedades relacionadas con microorganismos.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> SCANCELL LIMITED
<120> �?CIDOS NUCLEICOS
<130> P42394WO/NJL
<140> PCT/EP2008/053761
<141>
<150> GB0706070.0
<151>
<160> 247
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo restringido por I-Ad de hemaglutinina de gripe
<400> 1
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Tie-2 z84
<400> 2
10 <210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
15 <220>
<223> Epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR7
<400> 3
<210> 4
<211> 9
<212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Tie-2 Z12
30 <400> 4 <210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo gp100 restringido por HLA-A2
<400> 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de HepB S Ag
<400> 6
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de gp100 wt ITDQVPFSV
<400> 7
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de ovoalbúmina
<400> 8
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de TRP2
<400> 9
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de GP100 de tipo silvestre/GP100210M
<400> 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de GP100 F71
<400> 11
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de GP100 F7L
<400> 12
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de GP100 F7Y
<400> 13
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo restringido por I-Ab/epítopo de HepB CD4
<400> 14
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de gp100 CD4 restringido por HLA-DR4
<400> 15
<210> 16
<211> 14
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sitio enzimático seleccionado (Fsp 1) y secuencia oligonucleotídica epitópica para CDR H1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> Secuencia de ADN epitópica
<400> 16 nnnnnntggg ttcg 14
<210> 17
<211> 14
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sitio enzimático seleccionado (Msc I) y secuencia oligonucleotídica epitópica para CDR H2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(7)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 17 tnnnnnncga ttca 14
<210> 18
<211> 10
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sitio enzimático seleccionado (Srf I) y secuencia oligonucleotídica epitópica para CDR H3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 18 gannnnnntg 10
<210> 19
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sitio enzimático seleccionado (Eco RV) y secuencia oligonucleotídica epitópica para CDR L1
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(13)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 19 ctcttgcnnn nnntggt 17
<210> 20
<211> 12
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sitio enzimático seleccionado (Ssp I) y secuencia oligonucleotídica epitópica para CDR L2
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 20 ctacnnnnnn ag 12
<210> 21
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sitio enzimático seleccionado (Hpa I) y secuencia oligonucleotídica epitópica para CDR L3
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(15)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 21 tattactgcn nnnnnttcgg tggagg 26
<210> 22
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador H1
<400> 22 cctgagaatg tcctgctgcg caggctccgg ggaag 35
<210> 23
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador H2
<400> 23 cattggtagt ggtggccatt tccagagac 29
<210> 24
<211> 37
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador H3
<400> 24 ccgtgtatta ctgtgcccgg gccaaggaac cacggtc 37
<210> 25
<211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador L1
<400> 25 ggagccagcc tcgatatctg cagaaaccag gc 32
<210> 26
<211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador L2
<400> 26 ccacagctcc taatattcag tggcagtgga tc 32
<210> 27
<211> 33
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador L3
<400> 27 gctgaggata ccggagttaa ccaaggtgga aat 33
<210> 28
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador huHeClonR
<400> 28 cgcctgagtt ccacgacacc 20
<210> 29
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador huLidonR
<400> 29 caggcacaca acagaggc 18
<210> 30
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador CMV Directo
<400> 30 ggcgtggata gcggtttgac 20
<210> 31
<211> 39
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador OrigstophuHeCH1 Dir
<400> 31 ccaaggtgga caagaaagtt tgacccaaat cttgtgaca 39
<210> 32
<211> 45
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador origstophuHeCH1 Inv
<400> 32 gagttttgtc acaagatttg ggtcaaactt tcttgtccac cttgg 45
<210> 33
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador pOrig ligero sin líder Dir
<400> 33 aggatccacc atggatgtgt tgatgaccc 29
<210> 34
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador pOrig pesado sin líder Dir
<400> 34 aaagcttatg caggtgcagc tggtg 25
<210> 35
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador huigG3Inv2#
<400> 35 atcgatatca tttacccgga gacagg 26
<210> 36
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador IgG3hudir2 <400> 36 actgtctcca gcgcttccac caag 24
<210> 37
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador IgG2 dir
<400> 37 agtcaccgtt tccagcgctt ccac 24
<210> 38
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador IgG2 Inv
<400> 38 agtggatatc atttacccgg agacagg 27
<210> 39
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador HIBF
<400> 39 aacagtctga gggctgagga 20
<210> 40
<211> 34
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador huigGlPVA INV
<400> 40 agactgacgg tccccccgcg actggaggtg ctgg 34
<210> 41
<211> 34
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador HuigG2ELLGInv
<400> 41 agactgacgg tcctcctaac agttctggtg ctgg 34
<210> 42
<211> 34
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador SV40premDIR
<400> 42 agctagcatc agcacgtgtt gacaattaat catc 34
<210> 43
<211> 28
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador Sv40premInv
<400> 43 aacgattccg aagcccaacc tttcatag 28
<210> 44
<211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador migG2aClAfelF2
<400> 44 tttacagcgc taaaacaaca gccccatcgg tc 32
<210> 45
<211> 34
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador migG2axbaRA
<400> 45 tctagatcat ttacccggag tccgggagaa gctc 34
<210> 46
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador MoLCIBsiF1
<400> 46
tttcgtacgg atgctgcacc aactgtatcc 30
<210> 47
<211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador MoLCxhoR1
<400> 47 tttctcgagt caacactcat tcctgttgaa gc 32
<210> 48
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador MOIgG2BamHI Dir
<400> 48 ccttgacctg gaactctggt tccctgtcca gtggtg 36
<210> 49
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador MoigG2BamHI Inv
<400> 49
caccactgga cagggaacca gagttccagg tcaagg 36
<210> 50
<211> 38
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador MoigG2XhoI Dir
<400> 50 gcagctcagt gactgtaact tcgagcacct ggcccagc 38
<210> 51
<211> 38
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador MoigG2xhoI Inv
<400> 51 gctgggccag gtgctcgaag ttacagtcac tgagctgc 38
<210> 52
<211> 59
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador wtkappavarLlDir
<400> 52 ctcttgcaga tctagtcaga gcctggtaca tagtaatgga aacacctatt tagaatggt 59
<210> 53
<211> 59
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador wtkappavarL1 Inv
<400> 53 accattctaa ataggtgttt ccattactat gtaccaggct ctgactagat ctgcaagag 59
<210> 54
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador TRP2 Murino Directo
<400> 54 tttctaagct tatgggcctt gtgggatggg ggcttc 36
<210> 55
<211> 37
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador TRP2 Murino Inverso
<400> 55 tttctgatat ctcaggcttc ctccgtgtat ctcttgc 37
<210> 56
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador GP100 Directo
<400> 56 tttctgatat catgggtgtc cagagaagga gcttc 35
<210> 57
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador Gp100 Inverso
<400> 57 tttctctcga gtcagacctg ctgtccactg aggagc 36
<210> 58
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador Fosforilado (ejemplo de epítopo de TRP2)
<400> 58 tagtgtttat gatttttttg tgtggctccg attca 35
<210> 59
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de auxiliar CD4 o CTL CD8 (TRP2, A2 con restricción por HLA, Kb)
<400> 59 agtgtttatg atttttttgt gtggctc 27
<210> 60
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (GP100, A2 con restricción por HLA)
<400> 60 accattactg accaggtgcc tttctccgtg 30
<210> 61
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (GP100 (210M), A2 con restricción por HLA)
<400> 61 accattatgg accaggtgcc tttctccgtg 30
<210> 62
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (GP100 (F7L))
<400> 62 accattactg accaggtgcc tttgtccgtg 30
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de GP100 (F7L), A2 con restricción por HLA
<400> 63
<210> 64
<211> 48
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (GP100, DR0401 restricción por HLA)
<400> 64 tggaacaggc agctgtatcc agagtggaca gaagcccaga gacttgac 48
<210> 65
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (HEPB S AG, Kd(CTL) con restricción por HLA)
<400> 65 ataccgcaga gtctagactc gtggtggact tctctc 36
<210> 66
<211> 39
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (nucleoproteína Hep8, I-Ab con restricción por HLA (auxiliar))
<400> 66 actcctccag cttatagacc accaaatgcc cctatccta 39
<210> 67
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (MAGE3, A2 con restricción por HLA)
<400> 67 ttcctgtggg gtccaagggc cctcgtt 27
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (MAGE3, A2 con restricción por HLA)
<400> 68
<210> 69
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Tie2 (Z83), A2 con restricción por HLA)
<400> 69 ttcctaccag ctactttaac tatgact 27
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Tie2 (z83), A2 con restricción por HLA)
<400> 70
<210> 71
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Tie2 (z84), A2 con restricción por HLA)
<400> 71 ttcctaccag ctactttaac tatggtt 27
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Tie2 (Z84), A2 con restricción por HLA)
<400> 72
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Tie2 (z9), A2 con restricción por HLA)
<400> 73 gggatggtgg aaaagccctt caacatt 27
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Tie2 (29), A2 con restricción por HLA)
<400> 74
<210> 75
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Tie2 (mZ9), A2 con restricción por HLA)
<400> 75 gggatggtgg aaaagccctt caacgtt 27
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Tie2 (mZ9), A2 con restricción por HLA)
<400> 76
<210> 77
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (FLU HA, I-Ad con restricción por HLA (auxiliar))
<400> 77 tttgaaaggt ttgagatatt ccccaaggaa 30
<210> 78
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (ovoalbúmina,Kb con restricción por HLA)
<400> 78 agtataatca actttgaaaa actg 24
<210> 79
<211> 45
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Triosefosfato isomerasa (wt), DR0101 con restricción por HLA)
<400> 79 ggggagctca tcggcattct gaacgcggcc aaggtgccgg ccgac 45
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Triosefosfato isomerasa (wt), DR0101 con restricción por HLA)
<400> 80
<210> 81
<211> 45
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Triosefosfato isomerasa (mI), DR0101 con restricción por HLA)
<400> 81 ggggagctca tcggcactct gaacgcggcc aaggtgccgg ccgac 45
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (Triosefosfato isomerasa (mI), DR0101 con restricción por HLA)
<400> 82
<210> 83
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (VEGFR2, A2 con restricción por HLA)
<400> 83 gtgattgcca tgttcttctg gctactt 27
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (VEGFR2, A2 con restricción por HLA)
<400> 84
<210> 85
<211> 28
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (mVEGFR2, A2 con restricción por HLA)
<400> 85 gtgcttgcca tggttcttct ggctactt 28
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Auxiliar CD4 o CTL CD8 (mVEGFR2, A2 con restricción por HLA)
<400> 86
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de Gp100 v5L
<400> 87
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predicho de Tie-2 (Z282)
<400> 88
<210> 89
<211> 9
<212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predicho de Tie-2 (Z283)
<400> 89
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predicho de Tie-2 (z284)
<400> 90
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predicho de Tie-2 (z285)
<400> 91
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predicho de Tie-2 (z286)
<400> 92
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predicho de Tie-2 (z287)
<400> 93
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predicho de Tie-2 (Z18)
<400> 94
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Péptido restringido por HLA-A2 derivado de VEGFR2
<400> 95
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> péptidos hTERT modificados
<400> 96
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> péptidos hTERTmodificados
<400> 97
<210> 98
<211> 1489
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Cadena pesada quimérica de immunobody
<400> 98
<210> 99
<211> 467 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Cadena pesada quimérica de immunobody 10
<400> 99
<210> 100
<211> 732
<212> ADN
<213> Desconocido
5
<220>
<223> Cadena kappa quimérica de immunobody
<400> 100
10
<210> 101
<211> 238 15 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Cadena kappa quimérica de immunobody 20
<400> 101
<210> 102
<211> 376
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H1)
<400> 102
10 <210> 103
<211> 125
<212> PRT
<213> Desconocido
15 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H1)
<400> 103
<210> 104
<211> 382 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H2) 10
<400> 104
<210> 105
<211> 126
<212> PRT
<213> Desconocido 5
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H2)
<400> 105 10
<210> 106
<211> 383 15 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H3)
<400> 106
<212> PRT
<213> Desconocido
<220> 10 <223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H3)
<400> 107 <210> 108
<211> 335 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H1/H2) 10
<400> 108
<210> 109
<211> 110
<212> PRT
<213> Desconocido 5
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H1/H2)
<400> 109 10
<210> 110 15 <211> 336
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
20 <223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H1/H3)
<400> 110
<210> 111
<211> 111 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H1/H3) 10
<400> 111
15 <210> 112
<211> 342
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H2/H3)
<400> 112
10 <210> 113
<211> 112
<212> PRT
<213> Desconocido
15 <220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H2/H3)
<400> 113
<210> 114
<211> 295 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H1/H2/H3) 10
<400> 114
<210> 115 15 <211> 96
<212> PRT
<213> Desconocido <220>
<223> Región variable de cadena pesada de immunobody (H1/H2/H3)
<400> 115
<210> 116
<211> 340 10 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L1) 15
<400> 116
<210> 117
<211> 110
<212> PRT
<213> Desconocido 5
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L1)
<400> 117 10
<210> 118
<211> 360 15 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L2) 20
<400> 118
<210> 119 5 <211> 117
<212> PRT
<213> Desconocido
<220> 10 <223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L2)
<400> 119
<210> 120
<211> 352
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L3)
<400> 120
<210> 121
<211> 115
<212> PRT 15 <213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L3)
20 <400> 121
<210> 122
<211> 301 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L1/L3) 10
<400> 122
15 <210> 123
<211> 96
<212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L1/L3)
<400> 123
<210> 124
<211> 313
<212> ADN
<213> Desconocido 15
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L2/L3)
<400> 124 20
<210> 125
<211> 101 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L2/L3) 10
<400> 125
15 <210> 126
<211> 254
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L1/L2/L3)
<400> 126
<210> 127
<211> 80
<212> PRT
<213>
Desconocido 15
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L1/L2/L3)
<210> 128
<211> 293
<212> ADN
<213>
Desconocido 5
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L1/L3)
<400> 128 10
<210> 129
<211> 94 15 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable de cadena kappa de immunobody (L1/L3) 20
<400> 129 <210> 130
<211> 720 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Cadena pesada de immunobody IB15 10
<400> 130
<210> 131
<211> 236
<212> PRT 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Cadena pesada de immunobody IB15
10 <400> 131 <210> 132
<211> 363 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable pesada de DCIB15 sin un líder (cadena pesada) 10
<400> 132
<210> 133
<211> 117
<212> PRT
<213> Desconocido 5 <220>
<223> Región variable pesada de DCIB15 sin un líder (cadena pesada)
<400> 133 10
<210> 134
<211> 345 15 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Región variable kappa de DCIB15 sin un líder (cadena ligera)
<400> 134
5 <210> 135
<211> 110
<212> PRT
<213> Desconocido
10 <220>
<223> Región variable kappa de DCIB15 sin un líder (cadena ligera)
<400> 135
<210> 136
<211> 857
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 136
<210> 137
<211> 654 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
<210> 138
<211> 1164
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 138
<210> 139 5 <211> 377
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139 10
<210> 140
<211> 1440 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Cadena pesada de DCIB66 10
<400> 140
<210> 141 5 <211> 465
<212> PRT
<213> Desconocido
<220> 10 <223> Cadena pesada de DCIB66
<400> 141
<210> 142
<211> 1440 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Cadena pesada de DCIB67 que contiene motivo de unión a G1 10
<400> 142
<210> 143
<211> 462 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Cadena pesada de DCIB67 que contiene motivo de unión a G1 10
<400> 143
<210> 144
<211> 417 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las 10 regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada)
<400> 144
<210> 145
<211> 135
<212> PRT
<213> Desconocido 20
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig
25 <400> 145 <210> 146
<211> 309 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las 10 regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCorig (variable ligera)
<400> 146
<210> 147
<211> 128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las 10 regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDcorig (variable ligera)
<400> 147
<210> 148
<211> 422
<212> ADN
<213> Desconocido 5
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCorig (variable pesada) (secuencia de DCIB24)
<400> 148
15 <210> 149
<211> 137
<212> PRT
<213> Desconocido
20 <220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDcorig (variable pesada) (secuencia de DCIB24)
25 <400> 149
<210> 150
<211> 398 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDcorig (variable ligera) (secuencia de DCIB24)
<400> 150
<210> 151
<211> 128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB24)
<400> 151
<210> 152
<211> 417
<212> ADN 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) 10 (secuencia de DCIB25)
<400> 152
<210> 153
<211> 420
<212> ADN
<213> Desconocido 20
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB25)
<400> 153
<210> 154
<211> 135 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCorig (variable ligera) (secuencia de DCIB25)
<400> 154
<210> 155
<211> 135 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCorig (variable pesada) (secuencia de DCIB25)
<400> 155
<210> 156
<211> 423 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa y Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCorig (variable pesada) (secuencia de DCIB31)
<400> 156
<210> 157
<211> 137 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCorig (variable pesada) (secuencia de DCIB31)
<400> 157
<210> 158
<211> 407 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DC1831)
<400> 158
<210> 159
<211> 131 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB31)
<400> 159
<210> 160
<211> 423
<212> ADN 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) 10 (secuencia de DCIB32)
<400> 160
<210> 161
<211> 137
<212> PRT
<213> Desconocido 20
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (Secuencia de DCIB32)
<400> 161
<210> 162
<211> 420 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB32)
<400> 162
<210> 163
<211> 432 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pocorig (variable pesada) (secuencia de DCIB36)
<400> 163
<210> 164
<211> 140
<212> PRT 20 <213> Desconocido
<220> <223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (Secuencia de DCIB36)
<400> 164
<210> 165
<211> 408 10 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
15 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDcorig (variable ligera) (secuencia de DCIB36)
<400> 165
<210> 166
<211> 131 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (Secuencia de DCIB36)
<400> 166
<210> 167
<211> 438 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (Secuencia de DCIB48)
<400> 167
<210> 168
<211> 142 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (Secuencia de DCIB48)
<400> 168
<210> 169
<211> 317
<212> ADN
<213> Desconocido
5 <220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB48)
10 <400> 169
<210> 170 15 <211> 435
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
20 <223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (secuencia de DCIB49)
<400> 170 25
<210> 171
<211> 141 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (Secuencia de DCIB49)
<400> 171
<210> 172
<211> 408 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (Secuencia de DCIB49)
<400> 172
<210> 173
<211> 429
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (secuencia de DCIB52)
<400> 173
<210> 174
<211> 139
<212> PRT
<213> Desconocido 15
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (secuencia de DCIB52)
<400> 174
<210> 175
<211> 407 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB52)
<400> 175
<210> 176
<211> 453 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (secuencia de DCIB54)
<400> 176
<210> 177
<211> 147
<212> PRT 20 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada)
(secuencia de DCIB54)
<400> 177
<210> 178
<211> 131
<212> PRT
<213> Desconocido 10
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB52)
<400> 178
<210> 179
<211> 408 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB54)
<400> 179
<210> 180
<211> 131 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB54)
<400> 180
<210> 181
<211> 426 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (secuencia de DCIB18)
<400> 181
<210> 182
<211> 138 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable pesada) (secuencia de DCIB18)
<400> 182
<210> 183
<211> 398 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB18)
<400> 183
<210> 184
<211> 128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB18)
<400> 184
<210> 185
<211> 135
<212> PRT 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia 10 de DCIB32)
<400> 185
<210> 186 5 <211> 131
<212> PRT
<213> Desconocido
<220>
10 <223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB48)
<400> 186
<210> 187
<211> 131 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables pesadas y ligeras clonadas en fase con las
10 regiones constantes kappa Fc de IgG1 humana dentro del vector de expresión pDCOrig (variable ligera) (secuencia de DCIB49)
<400> 187
<210> 188
<211> 435 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB21 - Variable pesada 10
<400> 188 <210> 189
<211> 141 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB21 - Variable pesada 10
<400> 189 <210> 190
<211> 390 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB21 - Variable ligera 10
<400> 190
<210> 191
<211> 125
<212>
PRT 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB21 - Variable ligera
<210> 192
<211> 423
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB26 - Variable pesada
<400> 192
<210> 193
<211> 137
<212>
PRT 15 <213> Desconocido
10 <400> 191 <220>
<223> Secuencia de DCIB26 - Variable pesada
20 <400> 193 <210> 194
<211>
399 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB26 - Variable ligera
<210> 195
<211> 128
<212> PRT
<213> Desconocido
<400> 195
<210> 196
<211> 420
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB26 - Variable pesada
<400> 196
<210> 198
<211>
399 5 <212> ADN
10 <400> 194
10
<210> 197
<211> 136
<212> PRT
<213> Desconocido
15
<220>
<223> Secuencia de DCIB26 - Variable pesada
<400> 197
20
<213> Desconocido
<220>
<223> secuencia de DCIB26 - Variable ligera 10
<400> 198
<210> 199
<211> 128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB26 - Variable ligera 10
<400> 199
15 <210> 200
<211> 423
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB37 - variable pesada
<400> 200
10 <210> 201
<211> 137
<212> PRT
<213> Desconocido
15 <220>
<223> Secuencia de DCIB37 - variable pesada
<400> 201
<210> 202
<211> 399 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB37 - variable ligera 10
<400> 202
<210> 203
<211> 128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB37 - variable ligera 10
<400> 203
15 <210> 204
<211> 423
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB40 - variable pesada
<400> 204
<210> 205
<211> 137
<212> PRT 15 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB40 - variable pesada
20 <400> 205 <210> 206
<211> 399 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB40 - variable ligera 10
<400> 206
<210> 207
<211>
128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB40 - variable ligera
<210> 208
<211> 423
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB41 - variable pesada
<400> 208
<210> 209
<211>
399 15 <212> ADN
10 <400> 207 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB41 - variable ligera
20 <400> 209
<210> 210
<211> 128
<212> PRT 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB41 - variable ligera
10 <400> 210
<210> 211 15 <211> 423
<212> ADN
<213> Desconocido
<220> 20 <223> Secuencia de DCIB42 - variable pesada
<400> 211
5
<210> 212
<211> 137
<212> PRT
<213> Desconocido
10
<220>
<223> Secuencia de DCIB42 - variable pesada
<400> 212
15
<210> 213
<211> 399 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB42 - variable ligera 10
<400> 213
15 <210> 214
<211> 128
<212> PRT
<213> Desconocido
20 <220>
<223> secuencia de DCIB42 - variable ligera
<400> 214
5
<210> 215
<211> 423
<212> ADN
<213> Desconocido
10
<220>
<223> Secuencia de DCIB43 - variable pesada
<400> 215
15
<210> 216
<211> 136 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> secuencia de DCIB43 - variable pesada 10
<400> 216
<210> 217
<211> 128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB43 - variable ligera 10
<400> 217
<210> 218
<211> 137 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB41 - variable pesada 10
<400> 218 <210> 219
<211> 399 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB43 - variable ligera 10
<400> 219
<210> 220
<211> 417 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB35 - variable pesada 10
<400> 220
15 <210> 221
<211> 135
<212> PRT
<213> Desconocido
20 <220>
<223> Secuencia de DCIB35 - variable pesada
<400> 221
<212> ADN
<213> Desconocido
<220> 10 <223> Secuencia de DCIB35 - variable ligera
<400> 222 <210> 223
<211> 131 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB35 - variable ligera 10
<400> 223 <210> 224
<211> 417 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB50 - variable pesada 10
<400> 224 <210> 225
<211> 135 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB50 - variable pesada 10
<400> 225
<210> 226
<211> 431
<212> ADN 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB50 - variable ligera
10 <400> 226
<210> 227 15 <211> 138
<212> PRT
<213> Desconocido
<220> 20 <223> Secuencia de DCIB50 - variable ligera
<400> 227 <210> 228
<211> 420 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB71 - Variable pesada 10
<400> 228 <210> 229
<211> 136 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB71 - Variable pesada 10
<400> 229 <210> 230
<211> 399 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB71 - Variable ligera 10
<400> 230 <210> 231
<211> 128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB71 - Variable ligera 10
<400> 231
<210> 232
<211> 426
<212> ADN 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB72 - variable pesada
10 <400> 232
<210> 233 15 <211> 138
<212> PRT
<213> Desconocido
<220>
20 <223> Secuencia de DCIB72 - variable pesada
<400> 233
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
10 <223> Secuencia de DCIB72 - variable ligera
<400> 234 <210> 235
<211> 128 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB72 - variable ligera 10
<400> 235
<210> 236
<211> 1413
<212>
ADN 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIBS3 - variable pesada
<210> 237
<211> 465
<212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB53 - variable pesada
<400> 237
<210> 238
<211> 729
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB53 - variable ligera
<400> 238
<210> 239
<211> 235
<212>
PRT 10 <213> Desconocido
10 <400> 236
<220>
<223> Secuencia de DCIB53 - variable ligera
15 <400> 239
<210> 240
<211> 1449
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB64 - Variable pesada
<400> 240
<210> 241
<211> 476
<212> PRT 10 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB64 - Variable pesada
<400> 241
<210> 242
<211> 738 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB64 - variable ligera 10
<400> 242
15 <210> 243
<211> 238
<212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB64 - variable ligera
<400> 243
<210> 244
<211> 453
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB68 - variable pesada
<400> 244
<210> 245
<211> 147
<212> PRT 15 <213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB68 - variable pesada
20 <400> 245 <210> 246
<211> 435 5 <212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> secuencia de DCIB68 - variable ligera 10
<400> 246
<210> 247
<211> 140 5 <212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Secuencia de DCIB68 - variable ligera 10
<400> 247

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un ácido nucleico que comprende un promotor no específico y una secuencia que codifica un anticuerpo recombinante, en el que la molécula de anticuerpo tiene epítopos de linfocitos T heterólogos en la misma de modo que el anticuerpo no puede tomar su conformación nativa cuando se expresa el ácido nucleico, siendo los epítopos de linfocitos T heterólogos:
    GTGRAMLGTHTMEVTVYH en CDRH1 y CDRL3
    SVYDFFVWL en CDRH2, y
    WNRQLYPEWTEAQRLD en CDRH3 y CDRL1.
  2. 2.
    Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los epítopos de linfocitos T se insertan en el anticuerpo.
  3. 3.
    Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los epítopos de linfocitos T se sustituyen en el anticuerpo.
  4. 4.
    Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  5. 5.
    Un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo está humanizado o quimerizado.
  6. 6.
    Un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo recombinante comprende adicionalmente una secuencia líder.
  7. 7.
    Un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo tiene la secuencia de la Figura 60.
  8. 8.
    Una vacuna que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente y un adyuvante.
  9. 9.
    Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  10. 10.
    Un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en medicina.
  11. 11.
    Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en la estimulación de una respuesta inmune frente a al menos uno de los epítopos de linfocitos T.
  12. 12.
    El uso de un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmune contra al menos uno de los epítopos de linfocitos T.
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