ES2637280T3 - Aumento de la disponibilidad de NADPH para la producción de metionina - Google Patents
Aumento de la disponibilidad de NADPH para la producción de metionina Download PDFInfo
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Abstract
Un microorganismo modificado para una producción mejorada de metionina, en donde un microorganismo de la familia de Enterobacteriaceae optimizado para la producción de metionina se modifica para potenciar la actividad de la transhidrogenasa de PntAB por sobreexpresión de los genes que codifican PntAB.
Description
c. la actividad de serina hidroximetiltransferasa, GlyA sobreexpresando la actividad del gen glyA de metiltransferasa, MetH o MetE sobreexpresando el gen metH o metE.
En otra realización preferida de la invención, el microorganismo de la familia Enterobacteriaceae optimizado para la producción de metionina se modifica para mejorar la actividad de la transhidrogenasa de PntAB por sobreexpresión
5 de los genes que codifican PntAB, para atenuar la actividad de transhidrogenasa UdhA eliminando el gen que codifica UdhA y para incrementar el metabolismo de un carbono potenciando por lo menos una de las siguientes actividades:
a. la actividad de metilentetrahidrofolato reductasa, MetF sobreexpresando el gen metF y/u optimizando su
traducción al sobreexpresar el gen metF bajo el control del promotor fuerte que pertenece a los promotores de la 10 familia Ptrc.
b. la actividad del complejo de escisión de glicina, GcvTHP y Lpd sobreexpresando el gen gcvTHP y el gen lpd
- c.
- la actividad de serina hidroximetiltransferasa, GlyA sobreexpresando el gen glyA
- d.
- la actividad de metiltransferasa, MetH o MetE sobreexpresando el gen metH o metE.
15 Optimización de la vía de biosíntesis de metionina:
Como se indicó anteriormente, el microorganismo modificado utilizado en la presente invención puede comprender otras modificaciones en la producción de NADPH disponible y del metabolismo C1, modificaciones para una mejor producción de metionina.
Los genes implicados en la producción de metionina en un microorganismo se conocen en la técnica, y comprenden
20 genes implicados en la vía de biosíntesis específica de metionina además de genes implicados en las vías que proporcionan los precursores y genes implicados en las vías de consumo de metionina.
La producción eficiente de metionina requiere la optimización de la vía específica de metionina y varias vías que proporcionan los precursores. Las cepas que producen metionina se han descrito en las solicitudes de patente WO2005/111202, WO2007/077041 y WO2009/043803.
25 La solicitud de patente WO2005/111202 describe una cepa productora de metionina que sobreexpresa alelos de homoserina succiniltransferasa con sensibilidad de retroalimentación reducida a sus inhibidores SAM y metionina. Esta solicitud describe también la combinación de estos alelos con una eliminación del represor de metionina MetJ responsable de la reducción del regulón de metionina. Además, la solicitud describe combinaciones de las dos modificaciones con la sobreexpresión de aspartocinasa/homoserina deshidrogenasa.
30 Para mejorar la producción de metionina, el microorganismo puede exhibir:
una mayor expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste en:
cysU que codifica un componente del transportador de sulfato ABC, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
cysW que codifica una proteína de transporte de sulfato unida a una membrana, como se describe 35 en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
cysA que codifica una sulfato permeasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
cysM que codifica una O-acetil serina sulfhidralasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
40 cysI and cysJ que codifican respectivamente las subunidades alfa y beta de una sulfito reductasa descrita en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803. Preferiblemente cysI y cysJ se sobreexpresan juntos,
cysH que codifica una adenilsulfato reductasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
45 cysE que codifica una serina aciltransferasa, como se describe en el documento WO2007/077041,
serA que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
serB que codifica una fosfoserina fosfatasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
5 serC que codifica una fosfoserina aminotransferasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
alelos de metA que codifican una homoserina succinoltransferasa con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina como se describe en el documento WO2005/111202,
10 alelos de thrA o thrA que codifican aspartocinasas/homoserina deshidrogenasa con inhibición de retroalimentación reducida a treonina, como se describe en el documento WO2009/043803 y en el documento WO2005/111202,
o una inhibición de la expresión de por lo menos uno de los siguientes genes:
pykA que codifica una piruvato cinasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el 15 documento WO2009/043803,
pykF que codifica una piruvato cinasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803,
purU que codifica una formiltetrahidrofolato desformilasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en el documento WO2009/043803.
20 yncA que codifica una N-acetiltransferasa, como se describe en el documento WO 2010/020681
metJ que codifica un represor de la vía de biosíntesis de metionina, como se describe en el documento WO2005/111202.
En una realización específica de la invención, los genes pueden estar bajo el control de un promotor inducible. La solicitud de patente PCT/FR2009/052520 describe una cepa que produce metionina que expresa el alelo thrA con
25 inhibición de la retroalimentación reducida a treonina y cysE bajo el control de un promotor inducible. En particular, el gen o el alelo thrA está bajo el control de un promotor inducible de temperatura. En una realización más preferida, el promotor inducible de temperatura utilizado pertenece a la familia de promotores PR.
En una realización preferida de la invención, se potencia la actividad de la piruvato carboxilasa. Aumentar la actividad de la piruvato carboxilasa se obtiene sobreexpresando el correspondiente gen o modificando la secuencia 30 nucleica de este gen para expresar una enzima con actividad mejorada. En particular, el gen pyc se introduce en el cromosoma en una o varias copias por recombinación o es portado por un plásmido presente en por lo menos una copia en el microorganismo modificado. El gen pyc se origina de las especies Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Lactococcus lactis o Corynebacterium En particular, los genes sobreexpresados están en su posición nativa en el cromosoma, o se integran en una posición no nativa. Para una producción de metionina
35 óptima, se pueden requerir varias copias del gen, y estas múltiples copias se integran en locus específicos, cuya modificación no tiene un impacto negativo en la producción de metionina.
Los ejemplos para locus en los que se puede integrar un gen, sin alterar el metabolismo de la célula, son:
- Locus
- número acceso de función
- aaaD
-
87081759
imagen6 Pseudogén, homólogo de fago terminasa proteína A, fragmento N-terminal
- aaaE
-
1787395
imagen7 Pseudogén homólogo de fago terminasa proteína A, fragmento C-terminal
- afuB
-
1786458
imagen8 Pesudogén permeasa del transportador de la familia ABC férrica; fragmento C-terminal
- afuC
-
87081709
imagen9 pronosticó la subunidad del transportador ABC férrico (componente de unión a ATP)
- Locus
- número acceso de función
- agaA
-
48994927
imagen10 Pseudogén, fragmento C-terminal, GalNAc-6-P desacetilasa
- agaW
-
1789522
imagen11 Pseudogén, fragmento N-terminal, sistema PTS EIICGalNAc
- alpA
-
1788977
imagen12 proteasa
- appY
-
1786776
imagen13 activador de transcripción de unión al ADN
- argF
-
1786469
imagen14 ornitina carbamoiltransferasa
- argU
-
ninguno
imagen15 arginina ARNt
- argW
-
ninguno
imagen16 Arginina ARNt (CCU) 5
- arpB
-
87081959
imagen17 Reconstrucción del pseudogén, repeticiones de anquirina
- arrD
-
1786768
imagen18 lisozoma
- arrQ
-
1787836
imagen19 Homólogo de la proteína R del lisozoma del fago lambda
- arsB
-
87082277
imagen20 transportador de arsenita
- arsC
-
1789918
imagen21 arsenato reductasa
- arsR
-
1789916
imagen22 represor de transcripción de unión al ADN
- beeE
-
1787397
imagen23 Pseudogén, fragmento N-terminal, proteína portal
- borD
-
1786770
imagen24 homólogo de la proteína bacteriófago lambda Bor
- cohE
-
1787391
imagen25 Represor tipo CI
- croE
-
87081841
imagen26 Represor tipo Cro
- cspB
-
1787839
imagen27 Proteína de choque frío
- cspF
-
1787840
imagen28 Homólogo de la proteína de choque frío
- cspI
-
1787834
imagen29 Proteína de choque frío
- cybC
-
1790684
imagen30 Pseudogén, fragmento N-terminal, citocromo b562
- dicA
-
1787853
imagen31 Regulador de dicB
- dicB
-
1787857
imagen32 Control de la división celular
- dicC
-
1787852
imagen33 Regulador de dicB
- dicF
-
ninguno
imagen34 DicF ARN antisentido
- Locus
- número acceso de función
- eaeH
-
1786488
imagen35 Pseudogén, homólogo de intimin
- efeU
-
87081821
imagen36 Reconstrucción del pseudogén, permeasa de hierro ferrosa
- emrE
-
1786755
imagen37 bomba resistente a múltiples fármacos
- essD
-
1786767
imagen38 proteína de lisis de fagos pronosticada
- essQ
-
87081934
imagen39 Homólogo de la proteína de lisis del fago lambda S
- exoD
-
1786750
imagen40 Pseudogén, fragmento de exonucleasa C-terminal
- eyeA
-
ninguno
imagen41 ARNs nuevo, función desconocida
- flu
-
48994897
imagen42 Anígeno 43
- flxA
-
1787849
imagen43 Desconocida
- gapC
-
87081902
imagen44 Reconstrucción del pseudogén, GAP deshidrogenasa
- gatR
-
87082039
imagen45 Reconstrucción del pseudogén, represor del operón gat
- glvC
-
1790116
imagen46 Reconstrucción del pseudogén
- glvG
-
1790115
imagen47 Reconstrucción del pseudogén, 6-fosfo-beta-glucosidasa
- gnsB
-
87081932
imagen48 Supresor de múltiples copias de secG(Cs) y fabA6(Ts)
- gtrA
-
1788691
imagen49 Glucosa translocasa unida a bactoprenol
- gtrB
-
1788692
imagen50 Bactoprenol glucosil transferasa
- gtrS
-
1788693
imagen51 glucosil transferasa
- hokD
-
1787845
imagen52 Polipéptido tóxido de membrana pequeña
- icd
-
1787381
imagen53 Isocitrato deshidrogenasa
- icdC
-
87081844
imagen54 Pseudogén
- ilvG
-
87082328
imagen55 Reconstrucción del pseudogén, ácido acetohidroxi sintasa II
- insA
-
1786204
imagen56 ge IS1, función de transposición
- insA
-
1786204
imagen57 gen IS1, función de transposición
- insB
-
1786203
imagen58 transposasa de secuencia de inserción IS1
- insB
-
1786203
imagen59 transposasa de secuencia de inserción IS1
- Locus
- número acceso de función
- insC
-
1786557
imagen60 gen IS2, función de transposición
- insD
-
1786558
imagen61 gen IS2, función de transposición
- insD
-
1786558
imagen62 gen IS2, función de transposición
- insE
-
1786489
imagen63 gen IS3, función de transposición
- insF
-
1786490
imagen64 gen IS3, función de transposición
- insH
-
1786453
imagen65 gen IS5, función de transposición
- insH
-
1786453
imagen66 gen IS5, función de transposición
- insH
-
1786453
imagen67 gen IS5, función de transposición
- insI
-
1786450
imagen68 gen IS30, función de transposición
- insI(1)
-
1786450
imagen69 gen IS30, función de transposición
- insM
-
87082409
imagen70 Pseudogén, IS600 transposasa truncada
- insN
-
1786449
imagen71 Reconstrucción del pseudogén, IS911 transposasa ORFAB
- insO
-
ninguno
imagen72 Reconstrucción del pseudogén, IS911 transposasa ORFAB
- insX
-
87081710
imagen73 Pseudogén, transposasa de la familia IS3, fragmento N-terminal
- insZ
-
1787491
imagen74 Reconstrucción del pseudogén, familia de IS4 transposasa, en ISZ'
- intA
-
1788974
imagen75 Gen de integrasa
- intB
-
1790722
imagen76 Reconstrucción del pseudogén, integrasa de tipo P4
- intD
-
1786748
imagen77 integrasa pronosticada
- intE
-
1787386
imagen78 e14 integrasa
- intF
-
2367104
imagen79 fago integrasa pronosticada
- intG
-
1788246
imagen80 Pseudogén, homólogo de integrasa
- intK
-
1787850
imagen81 Pseudogén, fragmento de integrasa
- intQ
-
1787861
imagen82 Pseudogén, fragmento de integrasa
- intR
-
1787607
imagen83 Gen de integrasa
- Locus
- número acceso de función
- intS
-
1788690
imagen84 Integrasa
- intZ
-
1788783
imagen85 Gen putativo de integrasa
- isrC
-
ninguno
imagen86 Nuevo ARNs, función desconocida
- jayE
-
87081842
imagen87 Pseudogén, fragmento C-terminal, placa base
- kilR
-
87081884
imagen88 Función de inactivación del profago Rac
- lafU
-
ninguno
imagen89 Pseudogén, fragmento de proteína motora flagelar lateral
- 1fhA
-
87081703
imagen90 Pseudogén, fragmento de la proteína de ensamblaje flagelar lateral
- lit
-
1787385
imagen91 Peptidasa de muerte celular
- imagen92
-
imagen93 imagen94 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de lom; membrana externa
- lomR
-
1787632
imagen95 proteína interrumpida por IS5Y, término N ausente
- malS
-
1789995
imagen96 α-amilasa
- mcrA
-
1787406
imagen97 proteína de unión a AND específica de 5-metilcitosina
- mdtQ
-
87082057
imagen98 Reconstrucción del pseudogén, familia OMF de la bomba del fármaco de lipoproteína
- melB
-
1790561
imagen99 melibiosa permeasa
- mmuM
-
1786456
imagen100 homocisteína metiltransferasa
- mmuP
-
870811708
imagen101 S-metilmetionina permeasa
- mokA
-
ninguno
imagen102 Pseudogén, péptido regulador de superposición, permite hokB
- ninE
-
1786760
imagen103 desconocida
- nmpC
-
1786765
imagen104 Reconstrucción del pseudogén, OM porina, interrumpida por IS5B
- nohD
-
1786773
imagen105 Proteína de empaque de AND
- nohQ
-
1787830
imagen106 Pseudogén, homólogo del fago lambda Nul, familia de la pequeña subunidad terminasa , proteína de empaque putativa
- ogrK
-
1788398
imagen107 Regulador positivo del crecimiento de P2
- ompT
-
1786777
imagen108 proteasa de la membrana externa VII
- oweE
-
ninguno
imagen109 Pseudogén, homólogo O de la proteína de replicación lambda
- Locus
- número acceso de función
- oweS
-
1788700
imagen110 Pseudogén, homólogo O de la proteína de replicación lambda
- pauD
-
ninguno
imagen111 pseudogén argU, sitio de sujeción del profago DLP12
- pawZ
-
ninguno
imagen112 sitio de sujeción del profago CPS-53 attR, pseudogén argW
- pbl
-
87082169
imagen113 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de pilT
- peaD
-
87081754
imagen114 Pseudogén, familia P de proteína de replicación fago lambda; fragmento C-terminal
- perR
-
1786448
imagen115 porin de membrana exterior del regulador de transcripción de unión a ADN de poli-β-1,6-Nacetil-D-glucosamina
- pgaA
-
1787261
imagen116 vía de biosíntesis (PGA)
- pgaB
-
1787260
imagen117 PGA N-desacetilasa
- pgaC
-
1787259
imagen118 UDP-N-acetil-D-glucosamina β-1,6-N-acetil-D-glucosaminil transferasa
- pgaD
-
1787258
imagen119 proteína de membrana interna pronosticada
- phnE
-
87082370
imagen120 Reconstrucción del pseudogén, fosfonato permeasa
- pinE
-
1787404
imagen121 ADN invertasa
- pinH
-
1789002
imagen122 Pseudogén, ADN invertasa, recombinación específica del sito
- pinQ
-
1787827
imagen123 ADN invertasa
- pinR
-
1787638
imagen124 ADN invertasa
- prfH
-
1786431
imagen125 Pseudogén, homólogo del factor de liberación de proteínas
- psaA
-
ninguno
imagen126 pseudogén ssrA, duplicación del sitio de sujeción de CP4-57
- ptwF
-
ninguno
imagen127 pseudogén thrW, sitio de sujeción del profago CP4-6
- quuD
-
1786763
imagen128 proteína de antiterminación pronosticada
- quuQ
-
87081935
imagen129 Homólogo de la proteína de antiterminación de lambda Q
- racC
-
1787614
imagen130 Desconocido
- racR
-
1787619
imagen131 Supresor del profago de Rac, de tipo cI
- ralR
-
1787610
imagen132 Gen de alivio de restricción
- rbsA
-
1790190
imagen133 Subunidad del transportador de D-ribosa ABC (componente de unión a ATP)
- Locus
- número acceso de función
- rbsD
-
87082327
imagen134 D-ribosa piranasa
- recE
-
1787612
imagen135 RecET recombinasa
- recT
-
1787611
imagen136 RecET recombinasa
- relB
-
1787847
imagen137 Antitoxina para RelE
- relE
-
1787846
imagen138 ARN endorribonucleasa específica de secuencias
- rem
-
1787844
imagen139 desconocido
- renD
-
87081755
imagen140 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de lambda ren, ininterrumpido por IS3C; activador putativo de transcripción de lit
- rhsE
-
1787728
imagen141 Pseudogén, familia rhs, codificado dentro de la repetición de RhsE
- rnlA
-
1788983
imagen142 RNase LS, endorribonucleasa
- rph
-
1790074
imagen143 Reconstrucción del pseudogén, RNase PH
- rusA
-
1786762
imagen144 Endonucleasa
- rzoD
-
87081757
imagen145 Lipoproteína de tipo Rz1 probable
- rzoQ
-
ninguno
imagen146 Lipoproteína de tipo Rz1 probable
- rzoR
-
87081890
imagen147 Lipoproteína de tipo Rz1 probable
- rzpD
-
1786769
imagen148 Mureína endopeptidasa pronosticada
- rzpQ
-
1787835
imagen149 equivalente de tipo Rz
- rzpR
-
87081889
imagen150 Pseudogén, homólogo de Rz
- sieB
-
87081885
imagen151 Proteína de exclusión de superinfecciones
- sokA
-
ninguno
imagen152 Pseudogén, traducción de ARNs antisentido bloqueante de mokA/hokA
- stfE
-
87081843
imagen153 Cassette variable de Stf C-terminal, proteína de especificidad virión-hospedante alternativa; dominio Tail Collar, pseudogén
- stfP
-
1787400
imagen154 Proteína de la fibra terminal pronosticada
- stfR
-
87081892
imagen155 Proteína de la fibra terminal lateral
- tfaD
-
87081759
imagen156 Pseudogén, gen de ensamblaje de la fibra terminal, fragmento C
- tfaE
-
1787402
imagen157 Gen de ensamblaje de la fibra terminal pronosticada
- Locus
- número acceso de función
- tfaP
-
1787401
imagen158 Gen de ensamblaje de la fibra terminal pronosticada
- tfaQ
-
2367120
imagen159 Homólogo del gen de ensamblaje de la fibra terminal del fago lambda
- tfaR
-
1787637
imagen160 Homólogo del gen de ensamblaje de la fibra terminal del fago lambda
- tfaS
-
87082088
imagen161 Pseudogén, gen de ensamblaje de la fibra terminal, fragmento C-terminal
- tfaX
-
2367110
imagen162 Reconstrucción del pseudogén, gen de ensamblaje de la fibra terminal, fragmento Cterminal
- thrW
-
ninguno
imagen163 treonina ARNt (sitio de sujeción del profago CP4-6)
- torI
-
87082092
imagen164 CPS-53/KpLE1 excisionasa
- treB
-
2367362
imagen165 subunidad de trehalosa PTS permeasa (dominios IIB/IIC)
- treC
-
1790687
imagen166 trehalosa-6-fosfato hidrolasa
- trkG
-
1787626
imagen167 Permeasa de absorción de K+ constitutiva principal
- ttcA
-
1787607
imagen168 Gen de integrasa
- ttcC
-
ninguno
imagen169 Pseudogén, duplicación de ttcA del sitio de integración del profago Rac
- uidB
-
1787902
imagen170 Glucurónido permeasa, mutante puntual inactivo
- uxaA
-
1789475
imagen171 altronato hidrolasa
- uxaC
-
2367192
imagen172 uronato isomerasa
- wbbL
-
1788343
imagen173 Reconstrucción de pseudogén, rhamnosil transferasa
- wcaM
-
1788356
imagen174 proteína de biosíntesis de ácido colánico pronosticada
- imagen175
-
imagen176 Pseudogén, fragmento de excisionasa en profago defectuoso
- xisD
-
ninguno
imagen177 DLP12
- xisE
-
1787387
imagen178 e14 excisionasa
- yabP
-
1786242
imagen179 Reconstrucción del pseudogén
- yafF
-
87081701
imagen180 Pseudogén, fragmento C-terminal, proteína asociada a la repetición de H
- yafU
-
1786411
imagen181 Pseudogén, fragmento C-terminal
- yafW
-
1786440
imagen182 antitoxina del sistema YkfI-YafW toxina-antitoxina
- Locus
- número acceso de función
- yafX
-
1786442
imagen183 desconocido
- yafY
-
1786445
imagen184 regulador de transcripción de unión al ADN pronosticado, lipoproteína de membrana interna
- yafZ
-
87081705
imagen185 desconocido
- yagA
-
1786462
imagen186 regulador de transcripción de unión al ADN pronosticado
- yagB
-
87081711
imagen187 Pseudogén, fragmento N-terminal relacionado a la antitoxina
- yagE
-
1786463
imagen188 liasa/sintasa pronosticada
- yagF
-
1786464
imagen189 deshidratasa pronosticada
- yagG
-
1786466
imagen190 symporter de azúcar putativo
- yagH
-
1786467
imagen191 β-xilosidasa putativa
- yagI
-
1786468
imagen192 regulador de transcripción de unión al ADN pronosticado
- yagJ
-
1786472
imagen193 desconocido
- yagK
-
1786473
imagen194 desconocido
- yagL
-
1786474
imagen195 proteína de unión al ADN
- yagM
-
2367101
imagen196 desconocido
- yagN
-
2367102
imagen197 desconocido
- yagP
-
1786476
imagen198 Pseudogén, familia LysR, fragmento
- yaiT
-
1786569
imagen199 Reconstrucción del pseudogén, familia del autotransportador
- yaiX
-
87082443
imagen200 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS2A
- ybbD
-
1786709
imagen201 Reconstrucción del pseudogén, familia conservada nueva
- ybcK
-
1786756
imagen202 recombinasa pronosticada
- ybcL
-
1786757
imagen203 inhibidor de cinasa pronosticada
- ybcM
-
1786758
imagen204 regulador de transcripción de unión al ADN pronosticada
- ybcN
-
1786759
imagen205 proteína de rotación de base de ADN
- ybcO
-
1786761
imagen206 desconocido
- Locus
- número acceso de función
- ybcV
-
87081758
imagen207 desconocido
- ybcW
-
1786772
imagen208 desconocido
- ybcY
-
48994878
imagen209 Reconstrucción del pseudogén, familia metiltransferasa
- ybeM
-
1786843
imagen210 Reconstrucción del pseudogén, CN hidrolasa putativa
- ybfG
-
87081771
imagen211 Reconstrucción del pseudogén, nueva familia conservada
- ybfI
-
ninguno
imagen212 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de KdpE
- ybfL
-
87081775
imagen213 Reconstrucción del pseudogén, proteína asociada a la repetición H
- ybfO
-
1786921
imagen214 Pseudogén, copia del núcleo Rhs con extensión única
- ycgH
-
87081847
imagen215 Reconstrucción del pseudogén
- ycgI
-
1787421
imagen216 Reconstrucción del pseudogén, homólogo del autotransportador
- ycjV
-
1787577
imagen217 Reconstrucción del pseudogén, parálogo malK
- ydaC
-
1787609
imagen218 desconocido
- ydaE
-
87081883
imagen219 Metalotioneína
- ydaF
-
87081886
imagen220 desconocido
- ydaG
-
87081887
imagen221 desconocido
- ydaQ
-
87081882
imagen222 Excisionasa putativa
- ydaS
-
1787620
imagen223 desconocido
- ydaT
-
1787621
imagen224 desconocido
- ydaU
-
1787622
imagen225 desconocido
- ydaV
-
1787623
imagen226 desconocido
- ydaW
-
87081888
imagen227 Pseudogén, fragmento N-terminal
- ydaY
-
1787629
imagen228 pseudogén
- ydbA
-
87081898
imagen229 Reconstrucción del pseudogén, homólogo del autotransportador
- yddK
-
1787745
imagen230 Pseudogén, fragmento C, rico en leucina
- yddL
-
1787746
imagen231 Pseudogén, familia de porin OmpCFN, fragmento N-terminal
- Locus
- número acceso de función
- ydeT
-
1787782
imagen232 Pseudogén, familia FimD, fragmento C
- ydfA
-
1787854
imagen233 desconocido
- ydfB
-
87081937
imagen234 desconocido
- ydfC
-
1787856
imagen235 desconocido
- ydfD
-
1787858
imagen236 desconocido
- ydfE
-
1787859
imagen237 Pseudogén, fragmento N-terminal
- ydfJ
-
1787824
imagen238 Reconstrucción del pseudogén, familia MFS
- ydfK
-
1787826
imagen239 Gen de choque frío
- ydfO
-
87081931
imagen240 desconocido
- ydfR
-
1787837
imagen241 desconocido
- ydfU
-
87081936
imagen242 desconocido
- ydfV
-
1787848
imagen243 desconocido
- ydfX
-
1787851
imagen244 pseudogén
- yedN
-
87082002
imagen245 Reconstrucción del pseudogén, familia IpaH/YopM
- yedS
-
87082009
imagen246 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de la proteína de membrana externa
- yeeH
-
ninguno
imagen247 Pseudogén, fragmento interno
- yeeL
-
87082016
imagen248 Reconstrucción del pseudogén, familia de glicosiltransferasa
- yeeP
-
87082019
imagen249 Pseudogén, proteína de unión a GTP putativa
- yeeR
-
87082020
imagen250 desconocido
- yeeS
-
1788312
imagen251 desconocido
- yeeT
-
1788313
imagen252 desconocido
- imagen253
-
imagen254 Componente antitoxina del par de proteínas antitoxina YeeV
- yeeU
-
1788314
imagen255 YeeU
- yeeV
-
1788315
imagen256 Componente toxina del par de proteínas toxina-antitoxina YeeV-YeeU
- yeeW
-
1788316
imagen257 pseudogén
- Locus
- número acceso de función
- yegZ
-
ninguno
imagen258 Pseudogén, proteína tipo fago P2 gpD D; fragmento C-terminal
- yehH
-
87082046
imagen259 Reconstrucción del pseudogén
- yehQ
-
87082050
imagen260 Reconstrucción del pseudogén
- yejO
-
1788516
imagen261 Reconstrucción del pseudogén, homólogo del autotransportador
- yfaH
-
1788571
imagen262 Reconstrucción del pseudogén, homólogo del fragmento C-terminal, LysR
- yfaS
-
87082066
imagen263 Reconstrucción del pseudogén
- yfcU
-
1788678
imagen264 Reconstrucción del pseudogén, familia FimD
- yfdK
-
1788696
imagen265 desconocido
- yfdL
-
1788697
imagen266 Pseudogén, proteína de la fibra terminal
- yfdM
-
87082089
imagen267 Pseudogén, gen intacto que codifica una AND adenina metiltransferasa pronosticada
- yfdN
-
1788699
imagen268 desconocido
- yfdP
-
1788701
imagen269 desconocido
- yfdQ
-
1788702
imagen270 desconocido
- yfdR
-
87082090
imagen271 desconocido
- yfdS
-
1788704
imagen272 desconocido
- yfdT
-
1788705
imagen273 desconocido
- yffL
-
1788784
imagen274 desconocido
- yffM
-
1788785
imagen275 desconocido
- yffN
-
1788786
imagen276 desconocido
- yffO
-
1788787
imagen277 desconocido
- yffP
-
1788788
imagen278 desconocido
- yffQ
-
1788790
imagen279 desconocido
- yffR
-
1788791
imagen280 desconocido
- yffS
-
1788792
imagen281 desconocido
- Locus
- número acceso de función
- yfjH
-
1788976
imagen282 desconocido
- yfjI
-
1788978
imagen283 desconocido
- yfjJ
-
1788979
imagen284 desconocido
- yfjK
-
1788980
imagen285 desconocido
- yfjL
-
1788981
imagen286 desconocido
- yfjM
-
1788982
imagen287 desconocido
- yfjO
-
87082140
imagen288 desconocido
- yfjP
-
48994902
imagen289 desconocido
- yfjQ
-
1788987
imagen290 desconocido
- yfjR
-
1788988
imagen291 desconocido
- yfjS
-
87082142
imagen292 desconocido
- yfjT
-
1788990
imagen293 desconocido
- yfjU
-
1788991
imagen294 pseudogén
- yfjV
-
1788992
imagen295 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal de tipo arsB
- yfjW
-
2367146
imagen296 desconocido
- yfjX
-
1788996
imagen297 desconocido
- yfjY
-
1788997
imagen298 desconocido
- yfjZ
-
1788998
imagen299 Componente antitoxina de toxina putativa-antitoxina YpjF-YfjZ
- ygaQ
-
1789007
imagen300 Reconstrucción del pseudogén, dominio relacionado con has alfa-amilasa
- ygaY
-
1789035
imagen301 Reconstrucción del pseudogén, familia MFS
- ygeF
-
2367169
imagen302 Reconstrucción del pseudogén, parte de T3SS PAI ETT2 remante
- ygeK
-
87082170
imagen303 Reconstrucción del pseudogén, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
- ygeN
-
1789221
imagen304 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de orgB
- ygeO
-
1789223
imagen305 Pseudogén, homólogo de orgA, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
- Locus
- número acceso de función
- ygeQ
-
1789226
imagen306 Reconstrucción del pseudogén, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
- yghE
-
1789340
imagen307 Reconstrucción del pseudogén, familia de la proteína de secreción general
- yghF
-
1789341
imagen308 Pseudogén, proteína de secreción general
- yghO
-
1789354
imagen309 Pseudogén, fragmento C-terminal
- yghX
-
1789373
imagen310 Reconstrucción del pseudogén, familia de S9 peptidasa
- yhcE
-
1789611
imagen311 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS5R
- yhdW
-
1789668
imagen312 Reconstrucción del pseudogén
- yhiL
-
87082275
imagen313 Reconstrucción del pseudogén, regulado por FliA
- yhiS
-
1789920
imagen314 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS5T
- yhjQ
-
1789955
imagen315 Reconstrucción del pseudogén
- yibJ
-
48994952
imagen316 Reconstrucción del pseudogén, familia de Rhs
- yibS
-
ninguno
imagen317 Reconstrucción del pseudogén, familia de Rhs, fragmento C-terminal
- yibU
-
ninguno
imagen318 Reconstrucción del pseudogén, proteína asociada a la repetición H
- yibW
-
ninguno
imagen319 Reconstrucción del pseudogén, unido a rhsA
- yicT
-
ninguno
imagen320 Pseudogén, fragmento N-terminal
- yifN
-
2367279
imagen321 Reconstrucción del pseudogén
- yjbI
-
1790471
imagen322 Reconstrucción del pseudogén
- yjdQ
-
ninguno
imagen323 Reconstrucción del pseudogén, integrasa de tipo P4 remanente
- yjgX
-
1790726
imagen324 Reconstrucción del pseudogén, familia de EptAB
- yjhD
-
87082406
imagen325 Pseudogén, fragmento C-terminal
- yjhE
-
87082407
imagen326 Pseudogén, transportador putativo remanente
- yjhR
-
1790762
imagen327 Reconstrucción del pseudogén, familia de helicasa, fragmento C-terminal
- yjhV
-
1790738
imagen328 Pseudogén, fragmento C-terminal
- yjhY
-
ninguno
imagen329 Reconstrucción del pseudogén, nueva familia del dedo de zinc
- yjhZ
-
ninguno
imagen330 Reconstrucción del pseudogén, parálogo de rimK, fragmento C-terminal
- Locus
- número acceso de función
- yjiP
-
1790795
imagen331 Reconstrucción del pseudogén, familia de transposasa
- yjiT
-
87082428
imagen332 Pseudogén, fragmento N-terminal
- yjiV
-
ninguno
imagen333 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal de tipo helicasa
- yjjN
-
87082432
imagen334 oxidorreductasa pronosticada
- ykfA
-
87081706
imagen335 proteína de unión a GTP putativa
- ykfB
-
1786444
imagen336 desconocido
- ykfC
-
87081707
imagen337 Pseudogén, familia de transcriptasa inversa de tipo retrón, fragmento N-terminal
- ykfF
-
1786443
imagen338 desconocido
- ykfG
-
2367100
imagen339 desconocido
- ykfH
-
87081704
imagen340 desconocido
- ykfI
-
1786439
imagen341 toxina del sistema toxina-antitoxina YkfI-YafW
- ykfJ
-
1786430
imagen342 Pseudogén, fragmento N-terminal
- ykfK
-
1786445
imagen343 Pseudogén, fragmento N-terminal
- ykfL
-
ninguno
imagen344 Pseudogén, fragmento C-terminal
- ykfN
-
ninguno
imagen345 Pseudogén, remanente N-terminal, familia YdiA
- ykgA
-
87081714
imagen346 Pseudogén, fragmento N-terminal, familia AraC
- ykgP
-
ninguno
imagen347 Pseudogén, fragmento oxidorreductasa
- ykgQ
-
ninguno
imagen348 Pseudogén, fragmento C-terminal de una deshidrogenasa putativa
- ykgS
-
ninguno
imagen349 Fragmento interno del pseudogén
- ykiA
-
1786591
imagen350 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal
- ylbE
-
1786730
imagen351 Reconstrucción del pseudogén, parálogo de yahG
- ylbG
-
87081748
imagen352 Reconstrucción del pseudogén, fragmento N-terminal discontinuo
- ylbH
-
1786708
imagen353 Pseudogén, copia del núcleo Rhs con extensión única
- ylbI
-
ninguno
imagen354 Pseudogén, fragmento interno, familia Rhs
- ylcG
-
87081756
imagen355 desconocido
- Locus
- número acceso de función
- ylcH
-
ninguno
imagen356 desconocido
- ylcI
-
ninguno
imagen357 desconocido
- ymdE
-
87081823
imagen358 Pseudogén, fragmento C-terminal
- ymfD
-
1787383
imagen359 Metiltransferasa dependiente de SAM putativa
- ymfE
-
1787384
imagen360 desconocido
- ymfI
-
87081839
imagen361 desconocido
- ymfJ
-
87081840
imagen362 desconocido
- ymfL
-
1787393
imagen363 desconocido
- ymfM
-
1787394
imagen364 desconocido
- ymfQ
-
1787399
imagen365 Placa base o proteína de la fibra terminal putativa tt
- ymfR
-
1787396
imagen366 desconocido
- ymjC
-
ninguno
imagen367 Pseudogén, fragmento N-terminal
- ymjD
-
ninguno
imagen368 Proteína remanente de fusión al pseudogén de eliminación expresado
- ynaA
-
1787631
imagen369 Pseudogén, fragmento N-terminal
- ynaE
-
1787639
imagen370 Gen de choque frío
- ynaK
-
1787628
imagen371 desconocido
- yncI
-
1787731
imagen372 Reconstrucción del pseudogén, asociado a la repetición H, unido a RhsE
- yncK
-
ninguno
imagen373 Reconstrucción del pseudogén, homólogo de transposasa,
- yneL
-
1787784
imagen374 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal, familia AraC
- yneO
-
1787788
imagen375 Reconstrucción del pseudogén, adhesión del autotransportador OM putativo
- ynfN
-
87081933
imagen376 Gen de choque frío
- ynfO
-
ninguno
imagen377 desconocido
- yoeA
-
87082018
imagen378 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS2F
- yoeD
-
ninguno
imagen379 Pseudogén, fragmento C-terminal de una transposasa putativa
- yoeF
-
87082021
imagen380 Pseudogén, fragmento C-terminal
- Locus
- número acceso de función
- yoeG
-
ninguno
imagen381 pseudogén, fragmento N-terminal
- yoeH
-
ninguno
imagen382 pseudogén, fragmento C-terminal
- ypdJ
-
87082091
imagen383 Pseudogén, fragmento de excisionasa
- ypjC
-
1789003
imagen384 Reconstrucción del pseudogén
- ypjF
-
1788999
imagen385 Componente de toxina del par toxina putativa-antitoxina YpjF-YfjZ
- ypjI
-
ninguno
imagen386 Reconstrucción del pseudogén
- ypjJ
-
87082144
imagen387 desconocido
- ypjK
-
87082141
imagen388 desconocido
- yqfE
-
1789281
imagen389 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal, familia de LysR
- yqiG
-
48994919
imagen390 Reconstrucción del pseudogén, familia FimD, interrumpido por IS2I
- yrdE
-
ninguno
imagen391 Reconstrucción del pseudogén, fragmento C-terminal, parálogo de yedZ
- yrdF
-
ninguno
imagen392 Pseudogén, fragmento N-terminal
- yrhA
-
87082266
imagen393 Reconstrucción del pseudogén, interrumpido por IS1E
- yrhC
-
87082273
imagen394 Reconstrucción del pseudogén, fragmento N-terminal
- ysaC
-
ninguno
imagen395 Pseudogén, remanente C-terminal
- ysaD
-
ninguno
imagen396 Pseudogén, remanente de la secuencia interna
- ytfA
-
1790650
imagen397 Pseudogén, fragmento C-terminal
- yzgL
-
87082264
imagen398 Pseudogén, proteína de unión al soluto periplásmico putativa
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de metionina, que comprende las etapas de:
cultivar un microorganismo de la familia Enterobacteriaceae modificado para una producción mejorada de metionina en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una 5 fuente de nitrógeno, y
recuperar la metionina o uno de sus derivados del medio de cultivo,
en donde dicho microorganismo se modifica para presentar una actividad de transhidrogenasa potenciada de PntAB por sobreexpresión de los genes que codifican PntAB.
• Condiciones de cultivo
10 Las expresiones "proceso fermentativo, 'cultivo' o 'fermentación" se emplean de modo intercambiable para indicar el crecimiento de bacterias en un medio de cultivo apropiado que contiene una fuente de carbono simple, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno.
Se añade 1 ml de LB. Se incuba 1 hora a 37°C con agitación. Se centrifuga 3 min a 7000 rpm. Se dispone en una placa de LB + Cm 30 µg/ml o Km 50 µg/ml o Gt 10µg/ml Se incuba a 37°C durante la noche. Los transductores resistentes a antibióticos se seleccionaron luego y se verificó la estructura cromosómica del locus
mutado por análisis PCR con los cebadores apropiados que se enumeran en la Tabla 2. Tabla 1: Genotipos y números correspondientes de cepas intermedias y cepas productoras que aparecen en los siguientes ejemplos.
- Número de cepa
- Genotipo
- 1 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA
- 2 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE
- 3 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm
- 4
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17
- (comparativo)
- metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
- 5 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA AmaIS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
- 6 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
- 7 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 metF::Km Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
- 8 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC:: TT02-serA-serC :: Gt ΔudhA ::Km
- Número de cepa
- Genotipo
- 9
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC:: TT02-serA-serC :: Gt Ptrc01-pntAB :: Cm ΔudhA ::Km
- 10 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC
- 11
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm
- 12
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB ::Cm pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
- 13
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE DpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB ::Cm ΔudhA ::Km
- 14
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 AtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km
- 15
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::KmpCL1920PgapA-pycRe-TT07
- 16
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::ΔudhA
- Número de cepa
- Genotipo
- 17
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::Cm ΔudhA
- 18
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapApycRe-TT07
- 19
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc97-pntAB::CmΔudhA
- 20
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc97-pntAB::Cm ΔudhApCL1920-PgapApycRe-TT07
- 21
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc55-pntAB :: CmΔudhA
- 22
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc55-pntAB::Cm ΔudhA pCL1920-PgapApycRe-TT07
- 23 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔudhA::Km
- 24 (comparativo)
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01
- Número cepa
- de Genotipo
- imagen401
- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycRe-TT07
Tabla 2: Cebadores utilizados para verificaciones PCR de las modificaciones cromosómicas anteriormente descritas 5
- Nombre del gen
- Nombre del cebador SEC ID N° Localización de la homología con la región cromosómica Secuencias
- malS
- Ome0826-malS-F 1 3734778-3734800 GGTATTCCACGGGATTTTTCGCG
- Ome0827-malS-R
-
2
3738298-3738322
imagen402
- pgaABCD
- Ome 1691DpgaABCD_verif_F 11 1093002-1093020 GGGCTGATGCTGATTGAAC
- Ome-1692DpgaABCD_verif_R
- 12 1084333-1084354 GTGTTACCGACGCCGTAAACGG
- uxaCA
- Ome 1612-uxaCA_R3 15 3238676-3238696 GGTGTGGTGGAAAATTCGTCG
- Ome 1774-DuxaCA_F
- 16 3243726-3243707 GCATTACGATTGCCCATACC
- CP4-6
- Ome 1775-DCP4-6_verif_F 22 259527-259546 GCTCGCAGATGGTTGGCAAC
- Ome 1776-DCP4-6_verif_R
- 23 297672-297691 TGGAGATGATGGGCTCAGGC
- treBC
- Ome 1595-DtreBverif_F 27 4464951-4464930 GTTGCCGAACATTTGGGAGTGC
- Ome1596-DtreB verif_R
- 28 4462115-4462136 GGAGATCAGATTCACCACATCC
- metF
-
Ome0726-PtrcmetF F
29
4130309-4130337
imagen403
- Ome0727 PtrcmetF R
-
30
4130967-4130940
imagen404
- udhA
- Oag0055-udhAF2 33 4159070-4159053 GTGAATGAACGGTAACGC
- Oag0056-udhAR2
- 34 4157088-4157107 GATGCTGGAAGATGGTCACT
- pntAB
- Ome1151-pntAF 37 1676137-1676118 CCACTATCACGGCTGAATCG
10
15
20
25
30
35
40
- Nombre del gen
- Nombre del cebador SEC ID N° Localización de la homología con la región cromosómica Secuencias
- imagen405
- Ome1152-pntAR 38 1675668-1675687 GTCCCAGGATTCAGTAACGC
- wcaM
- Ome1707-DwcaM verif_F 43 2115741-2115762 GCCGTTCAACACTGGCTGGACG
- Ome1708DwcaM_verif_R
- 44 2110888-2110907 TGCCATTGCAGGTGCATCGC
I. Ejemplo 1 (comparativo): Construcción de la cepa 7, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF::Km Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC ::Gt
I.1. Construcción de la cepa 1
La cepa 1 que produce metionina (Tabla 1) se ha descrito en la solicitud de patente WO2007/077041.
I.2. Construcción de la cepa 2
El fragmento TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE se insertó en el locus malS en dos etapas. Primero, se construyó el plásmido pUC18-DmalS::TTadc-C1857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE::Km y se introdujo en el cromosoma el segundo fragmento TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km que contenía secuencias en dirección 5’ y en dirección 3’ homólogas al locus malS. Posteriormente, se eliminó el cassette de resistencia de acuerdo con el Protocolo 1.
Todas las descripciones de las integraciones en los distintos locus en el cromosoma presentado a continuación siguen el mismo método; 1) construcción del vector de duplicación que contienen la secuencia homóloga en dirección 5’ y en dirección 3’ del locus de interés, el fragmento de ADN y un cassette de resistencia 2) construcción de cepa mínima (MG1655) que contiene la modificación cromosómica de interés y 3) transducción a la cepa del complejo (MG1655 que ya contiene varias modificaciones).
I.2.1. Construcción del plásmido pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km
El plásmido pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE deriva de los plásmidos pSCB-TTadc-cI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE y pUC18-ΔmalS::MCS::Km que se han descrito en la solicitud de patente PCT/FR2009/052520. En síntesis, el fragmento TTadc-cI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE digerido por ApaI/BamHI se clonó entre los sitios ApaI y BamHI de pUC18-ΔmalS::MCS-Km. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km.
I.2.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km (pKD46)
Para reemplazar el gen malS por el fragmento TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE::Km ADN, se digirió pUC18-DmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE::Km por ScaI y EcoRV, y el fragmento digerido remanente TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km que contenía la secuencia en dirección 5’ y en dirección 3’ homóloga al locus malS se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1. Se seleccionaron los recombinantes resistentes a la kanamicina y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km por PCR con los cebadores Ome 0826-malS-F (SEC ID N°1) y Ome 0827-malS-R (SEC ID N°2) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 pKD46 ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km.
I.2.3. Transducción de ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE::Km en la cepa 1 y eliminación del cassette de resistencia
La modificación cromosómica de ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km se transdujo en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km descrita anteriormente, de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a kanamicina y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km por PCR con los cebadores Ome 0826
5
10
15
20
25
30
35
40
malS-F (SEC ID N°1) y Ome 0827-malS-R (SEC ID N°2) (Tabla 2). La cepa resultante posee el genotipo MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km. Finalmente, la resistencia a la kanamicina de la cepa anterior se eliminó de acuerdo con el Protocolo 1. La pérdida del cassette resistente a kanamicina se verificó por PCR usando los cebadores Ome 0826-malS-F (SEC ID N°1) y Ome 0827-malS-R (SEC ID N°2) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)thrA*1-cysE se denominó cepa 2.
I.3. Construcción de la cepa 3
I.3.1. Construcción del plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm
El plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm deriva de los plásmidos pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 y pUC18-ΔpgaABCD::TT02MCS::Cm que se describen a continuación.
Construcción del plásmido pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
El plásmido pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 deriva del plásmido pCL1920TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 descrito en la solicitud de patente PCT/FR2009/052520.
Para construir el plásmido pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11, se amplió el plásmido pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 con los cebadores PR-RBS01_F (SEC ID N°3) y TTadc-pCL1920_R (SEC ID N°4). El producto de PCR se digirió por DpnI con el fin de eliminar el molde de ADN parental. El alerón cohesivo remanente se fosforiló y se introdujo en la cepa de E. coli para formar el plásmido pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11. El inserto de TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 y especialmente la presencia de la secuencia RBS01 en dirección 5’ del gen thrA se verificaron por secuenciación de ADN, usando los siguientes cebadores.
PR-RBS01_F (SEC ID N°3)
con
secuencia en letra mayúscula homóloga al promotor PR del bacteriófago lambda (PlambdaR*(-35), (Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pág 145-148 ; Tsurimoto T, Hase T, Matsubara H, Matsubara K, Mol Gen Genet. 1982;187(1):79-86).
secuencia en letra mayúscula subrayada correspondiente a la secuencia RBS01 con un sitio de restricción PsiI
secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga al extremo 5' de thrA (1-20)
con
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia del terminador de transcripción TTadc (terminador de transcripción del gen adc de Clostridium acetobutylicum, homólogo de 179847 a 179807 del megaplásmido pSLO1),.
secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga al plásmido pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
Construcción del plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm
5
10
15
20
25
30
35
40
Para construir el fragmento ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm, la región en dirección 5’ de pgaA (uppgaA), el terminador de transcripción TT02, el sitio de clonación múltiple (MCS) y la región en dirección 3’ de pgaD (downpgaD) se unieron por PCR. El cassette de cloranfenicol (Cm) se amplió posteriormente y se añadió al constructo previo.
Primero, se amplió uppgaA-TT02 de ADN genómico de E. coli MG1655 usando los cebadores Ome 1687ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (SEC ID N°5) y Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (SEC ID N°6) por PCR. Luego, el fragmento TT02-MCS-down-pgaD se amplió a partir del ADN genómico de E. coli MG1655 usando los cebadores Ome 1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (SEC ID N°7) y Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (SEC ID N°8) por PCR. Los cebadores Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (SEC ID N°6) y Ome 1689ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (SEC ID N°7) se diseñaron para superponerse en una región de 36 nucleótidos de longitud. Finalmente, el fragmento uppgaA-TT02-MCS-downpgaD se amplió mezclando los productos de ampliación uppgaA-TT02 y TT02-MCS-down-pgaD usando los cebadores Ome 1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (SEC ID N°5) y Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (SEC ID N°8). El producto de PCR de fusión resultante se digirió por HpaI y se clonó entre HindIII y EcoRI del plásmido pUC18 que se había tratado con el Fragmento Large (Klenow) de ADN Polimerasa I de E. coli. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS.
Ome 1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (SEC ID N°5)
CGTAGTTAACGAATTCGACTAGAAAGTATGTGAGCAACTATCGGCCCCCC con
secuencia de letra mayúscula en negrita para el sitio de restricción HpaI y EcoRI y extrabases,
secuencia en letra mayúscula homóloga al gen pgaA en dirección 5’ (1092609-1092576, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (SEC ID N°6)
con secuencia en letra mayúscula en negrita para el sitio de restricción BstZ17I y extrabases,
o secuencia en letra mayúscula en negrita correspondiente al terminador de transcripción T1 de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I y Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pgaA (1091829-1091851, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Ome 1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (SEC ID N°7)
con
secuencia en letra mayúscula en negrita complementaria a la secuencia del extremo 3' del terminador de transcripción T1 de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I y Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9), secuencia en letra mayúscula subrayada que contiene un sitio de clonación múltiple MCS: BstZ17I, HindIII,
PacI, ApaI, BamHI, secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pgaD (1085325-1085304, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/) Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (SEC ID N°8)
CGTAGTTAACGAATTCAGCTGATATTCGCCACGGGC con secuencia en letra mayúscula en negrita para los sitios de restricción HpaI y EcoRI y extrabases,
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pgaD (1084714-1084733, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Finalmente, los cebadores Ome 1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (SEC ID N°9) y Ome 1604-K7_Cm_ampl HindIII_R (SEC ID N°10) se usaron para ampliar el cassette de cloranfenicol y las secuencias FRT del plásmido 5 pKD3, y el fragmento se clonó entre los sitios BstZ17I y HindIII del plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm.
Ome 1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (SEC ID N°9)
TCCCCCGGGGTATACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
Con
10 secuencia en letra mayúscula subrayada para el sitio de restricción BstZ17I y SmaI y extrabases,
secuencia en letra mayúscula correspondiente al cebador del sitio 1 del plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
Ome 1604-K7_Cm_ampl_HindIII_R (SEC ID N°10)
GCCCAAGCTTCATATGAATATCCTCCTTAG
15 con
secuencia en letra mayúscula subrayada HindIII para el sitio de restricción y extrabases,
secuencia en letra mayúscula correspondiente al cebador del sitio 2 del plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Construcción de pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11::Cm
20 Para construir pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, ApaI/BamHI, se clonó el fragmento TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 aislado de pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 anteriormente descrito, entre los sitios ApaI y BamHI del plásmido pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm anteriormente descrito. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE
25 PgapA-metA *11::Cm.
I.3.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11::Cm (pKD46)
Para reemplazar el operón pgaABCD por la región TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm, se digirió pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm
30 por las enzimas de restricción SapI y AatII y el fragmento digerido remanente ΔpgaABCD:: TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes al cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por PCR con
35 los cebadores Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (SEC ID N°11) y Ome 1692-DpgaABCD_verif_R (SEC ID N°12) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm (pKD46).
I.3.3. Transducción de ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA -metA*11::Cm en la cepa 2
40 La modificación cromosómica de ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm se transdujo a la cepa 2 (Tabla 1), previamente descrita, con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm anteriormente descrita, de conformidad con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes al cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación
45 cromosómica de ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por PCR con Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (SEC ID N°11) y Ome 1692-DpgaABCD_verif_R (SEC ID N°12) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF
5
10
15
20
25
30
35
40
45
CCCACTGGCCTGTAATATGTTCGG, homólogo a la secuencia en dirección 3’ del locus uxaCA (3239021-3239044)
Ome 1516-uxaCA F2 (SEC ID N°18)
ATGCGATATCGACCGTATAAGCAGCAGAATAGGC con
la secuencia en letra mayúscula subrayada para el sitio de restricción EcoRV y extra-bases
secuencia en letra mayúscula en cursiva homóloga a la secuencia en dirección 5’ del locus uxaCA (3243425-3243402)
Luego, el producto de PCR resultante (obtenido con una ADN polimerasa de extremo romo) se digirió por la enzima de restricción EcoRV y se clonó en el sitio SmaI de pUC18. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km.
Construcción de pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11::Km
Para construir pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11::Km, el fragmento digerido de TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11 ApaI/BamH1 de pCL1920TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 previamente descrito se clonó en los sitios ApaI y BamHI de pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km precedentemente descritos. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA *11::Km
I.4.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 (pKD46)
Para reemplazar el operón uxaCA por la región TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Km, se digirió pUC18-ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km por BamHI y AhdI, y el fragmento digerido remanente ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11::Km se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes a la kanamicina y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11::Km por PCR con los cebadores Ome 1612-uxaCA_R3 (SEC ID N°15) y Ome 1774-DuxaCA_F (SEC ID N°16) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa resultante se designó MG1655 metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km (pKD46)
I.4.3. Transducción de ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km en la cepa 3
La modificación cromosómica de ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km se transdujo a la cepa 3 (Tabla 1), precedentemente descrita, con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km anteriormente descrita, de conformidad con el Protocolo 2.
La modificación cromosómica de ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km se verificó por PCR con Ome 1612-uxaCA_R3 (SEC ID N°15) y Ome 1774-DuxaCA_F (SEC ID N°16) (Tabla 2). La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km
Finalmente, los cassettes de cloranfenicol y resistentes a la kanamicina de la cepa anteriormente mencionada se eliminaron de acuerdo con el Protocolo 1. La pérdida de los cassettes de cloranfenicol y resistencia a kanamicina se verificaron por PCR con los cebadores Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (SEC ID N°11), Ome 1692DpgaABCD_verif_R (SEC ID N°12), Ome 1612-uxaCA_R3 (SEC ID N°15) y Ome 1774-DuxaCA_F (SEC ID N°16) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11 se denominó cepa 4.
I.5. Construcción de la cepa 5
I.5.1. Construcción del plásmido pMA-DCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-thru *1-cysE-PgapA-metA *11::Km
Plásmido pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11::Km derivado de pCL1920TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 anteriormente descrito y pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Km descrito a continuación.
Construcción del plásmido pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Km
Primero se sintetizó pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS mediante GeneArt (http://www.geneart.com/). El fragmento ΔCP4-6::TT02-MCS se clonó en los sitios AscI y PacI del plásmido pMA de GeneArt y contiene la siguiente secuencia identificada como SEC ID N° 19:
PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 se denominó cepa 5.
I.6. Construcción de la cepa 6
Para insertar la región TT02-serA-serC, que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa de E. coli y una fosfoserina
5 aminotransferasa, respectivamente, en el locus treBC, se empleó un método de dos etapas. Primero, se construyó el plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt y luego el fragmento ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt que contiene las regiones en dirección 5’ y en dirección 3’ homólogas al locus treBC se recombinaron en el cromosoma de acuerdo con el Protocolo 1.
I.6.1. Construcción del plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
10 Plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt derivado de pMA-ΔtreBC::TT02-MCS::Gt descrito a continuación, p34S-Gm (Dennis et Zyltra, AEM julio 1998, pág 2710-2715), y pUC18-serA-serC, que se ha descrito en la solicitud de patente PCT/FR2009/052520.
Primero, el plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-MCS se sintetizó mediante GeneArt (http://www.geneart.com/). El fragmento ΔtreBC::TT02-MCS se clonó en los sitios AscI y PacI del plásmido pMA de GeneArt y que contiene la
15 siguiente secuencia, identificada como SEC ID N° 24:
letra minúscula correspondiente al sitio de restricción AscI letra mayúscula subrayada homóloga a la secuencia en dirección 5’ del locus treBC (4460477-4461034).
o letra mayúscula en negrita correspondiente a la secuencia del terminador de transcripción TT02
20 del terminador T1 del gen de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
o letra mayúscula en cursiva correspondiente a múltiples sitios de clonación que contienen los sitios de restricción BstZ17I, HindIII, ApaI, SmaI and BamH1
letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 3’ del locus treBC (4464294-4464787) 25 letra minúscula en cursiva correspondiente al sitio de restricción PacI
5
10
15
20
25
30
35
40
Para construir el plásmido pMA-ΔtreBC::TT02-MCS ::Gt, se amplió el cassette de resistencia FRT-Gt-FRT por PCR con los cebadores BstZ17I-FRT-Gt-F (SEC ID N°25) y HindIII-FRT-Gt-R (SEC ID N°26) usando p34S-Gm como molde.
BstZ17I-FRT-Gt-F (SEC ID N°25)
con secuencia en letra mayúscula subrayada para los sitios de restricción SmaI y BstZ17I y extrabases, secuencia en letra mayúscula en negrita correspondiente a la secuencia FRT (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L.,
2000, PNAS, 97: 6640-6645) secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia del gen de gentamicina ubicado en p34S-Gm (Dennis et Zyltra, AEM julio 1998, pág. 2710-2715). HindIII-FRT-Gt-R (SEC ID N°26)
con
secuencia en letra mayúscula subrayada para el sitio de restricción HindIII y extrabases,
secuencia en letra mayúscula en negrita correspondiente a la secuencia FRT (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia del gen de gentamicina ubicado en p34S-Gm (Dennis et Zyltra, AEM julio 1998, pág. 2710-2715).
El producto FRT-Gt-FRT PCR se clonó luego entre los sitios BstZ17I y HindIII de pMA-ΔtreB::TT02-MCS. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pMA-ΔtreBC::TT02-MCS-Gt.
Para construir el plásmido final pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt, se digirió pUC18-serA-serC por HindIII y el fragmento digerido de serA-serC se clonó en pMA-ΔtreBC::TT02-MCS-Gt que se había linealizado por HindIII. El plásmido resultante se verificó por digestión y por secuenciación de ADN y se denominó pMA-ΔtreBC::TT02-serAserC::Gt
I.6.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt
Para reemplazar el gen treBC por el fragmento TT02-serA-serC::Gt, se digirió pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt por ApaI y SalI, y el fragmento digerido remanente ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes a gentamicina y se verificó la presencia del fragmento ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt por PCR con los cebadores Ome 1595-DtreB_verif_F (SEC ID N°27) y Ome 1596DtreB_verif_R (SEC ID N°28) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 pKD46 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt.
I.6.3. Transducción de ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt en la cepa 5
La modificación cromosómica de ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt se transdujo luego a la cepa 5 (Tabla 1) con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt anteriormente descrita, de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a gentamicina y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de DtreBC::TT02-serA-serC::Gt por PCR con Ome 1595-DtreB_verif_F (SEC ID N°27) y Ome 1596DtreB_verif_R (SEC ID N°28) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA
*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA-metA *11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt se denominó cepa 6.
I.7. Construcción de la cepa 7 por transducción de Ptrc36-metF::Km en la cepa 6
La sobreexpresión del gen metF a partir del promotor artificial integrado al locus metF en el cromosoma, la cepa 5 MG1655 metA*11 ΔmetJPtrc36-metF::Km, se ha descrito en la solicitud de patente WO 2007/077041.
El constructo del promotor Ptrc36-metF::Km se transdujo a la cepa 6 (Tabla 1) con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF::Km de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a kanamicina y se verificó la presencia del constructo del promotor Ptrc36-metF::Km por PCR con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R (SEC ID
10 N°30) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc36-metF::Km se denominó cepa 7.
15 II. Ejemplo 2: Construcción de la cepa 9, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC::Gt Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km
20 II.1. Construcción de la cepa 8
II.1.1. Construcción de MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF por eliminación del cassette de resistencia a kanamicina
La resistencia a la kanamicina de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF::Km, descrita en la solicitud de patente WO2007/077041, se eliminó de acuerdo con el Protocolo 1. La pérdida del cassette resistente a kanamicina
25 se verificó por PCR usando los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R(SEC ID N°30) (Tabla 2). La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 ΔmetJPtrc36-metF.
II.1.2. Construcción de MG1655 metA*11 ΔmetJPtrc36-metF ΔudhA::Km pKD46
Para eliminar el gen udhA en la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF, se utilizó el Protocolo 1, excepto que se usaron los cebadores Ome0032-DUdhAF (SEC ID N°31) y Ome0034-DUdhAR (SEC ID N°32) para ampliar el
30 cassette de resistencia a la kanamicina del plásmido pKD4.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes a kanamicina. La inserción del cassette de resistencia se verificó por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 ΔmetJPtrc36-metF ΔudhA::Km pKD46.
Ome0032-DUdhAF (SEC ID N°31)
con: secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen udhA (4158729-4158650, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/) secuencia en letra mayúscula subrayada correspondiente al sitio del cebador 1 del plásmido pKD4 (Datsenko, K.A. & 40 Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645) Ome0034-DUdhAR (SEC ID N°32)
con
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 3’ del gen udhA (4157588-4157667, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
secuencia en letra mayúscula subrayada correspondiente al sito del cebador 2 del plásmido pKD4 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
5 II.1.3. Co-transducción de Ptrc36-metF ΔudhA:: Km a la cepa 6
Los genes udhA y metF están cercanos en el cromosoma de E. coli, 89,61 min y 89,03 min respectivamente y, dado que el fago P1 puede empaquetar 2 min del cromosoma de E. coli, los genes udhA y metF son co-transducibles. En consecuencia, la modificación del promotor Ptrc36-metF y la eliminación de ΔudhA::Km anteriormente descrito, se co-transdujeron a la cepa 6 (Tabla 1) usando un lisado del fago PI de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF
10 ΔudhA::Km pKD46, anteriormente descrito, de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a la kanamicina. La presencia de la modificación del promotor Ptrc36metF se verificó por PCR con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R (SEC ID N°30) seguida de secuenciación de ADN. La presencia de la eliminación de DudhA::Km se verificó por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2). La cepa resultante
15 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt ΔudhA ::Km se denominó cepa 8.
20 II.2. Construcción de la cepa 9
II.2.1. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc01-pntAB::Cm
Para aumentar el nivel de expresión de piridina nucleótido transhidrogenasa y subunidades alfa y beta, PntA y PntB, un promotor trc01 constitutivo artificial se añadió en dirección 5’ del operón pntAB a la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1, excepto que se usaron los cebadores Ome1149-Ptrc-pntAF (SEC ID
25 N°35) y Ome 1150-Ptrc-pntAR (SEC ID N°36) para ampliar el cassette de resistencia a cloranfenicol del plásmido pKD3. Se seleccionaron los recombinantes resistentes a cloranfenicol. La presencia del promotor artificial Ptrc01 y la inserción del cassette de resistencia se verificaron por PCR con los cebadores Ome1151-pntAF (SEC ID N°37) y Ome1152-pntAR (SEC ID N°38) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc01-pntAB:: Cm.
30 Ome 1149-Ptrc-pntAF (SEC ID N°35)
con secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pntA (1676002-1675941, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
35 secuencia en letra mayúscula subrayada para la secuencia del terminador de transcripción T7Te del fago T7 (Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Natl Acad Sci EE. UU.. 2001 Abr 24;98(9):5019-24.), secuencia en letra mayúscula en cursiva correspondiente al sitio del cebador 1 del plásmido pKD3
(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645) Ome 1150-Ptrc-pntAR (SEC ID N°36)
con secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pntA (1675875-1675940, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/) 43
5
10
15
20
25
30
35
40
con secuencia en letra mayúscula negrita para el sitio de restricción BstZ17I y extrabases,
o secuencia en letra mayúscula subrayada correspondiente al terminador de transcripción T1 de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I y Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 3’ del gen wcaM (2113921-2113950, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/).
Ome 1705 (DwcaM-MCS-BstZ17I-F) (SEC ID N°41)
con
secuencia en letra mayúscula en negrita complementaria a la secuencia del extremo 3' del terminador de transcripción T1 de E. coli rrnB (Orosz A, Boros I y Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9),
secuencia en letra mayúscula subrayada que contiene un sitio de clonación múltiple: BstZ17I, HindIII, PacI, ApaI, BamHI,
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen wcaM (2112496-2112525, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Ome 1706 (DwcaM-EcoRI-R) (SEC ID N°42)
CGTAGTTAACGAATTCCGCCCCTTCTTTCAGGTTGCGTAGGCCATAC
con
secuencia en letra mayúscula en negrita para los sitios de restricción HpaI y EcoRI y extrabases,
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen wcaM (2111497-2111527, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Finalmente, los cebadores Ome 1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (SEC ID N°9) y Ome 1604K7_Cm_ampl_HindIII_R (SEC ID N°10), descritos anteriormente, se usaron para ampliar el cassette de cloranfenicol del plásmido pKD3. El cassette se clonó luego entre los sitios BstZ17I y HindIII del plásmido pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS-Cm.
III.1.2. Construcción del plásmido pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm
Para construir pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ApaIlBamHI se clonó el fragmento digerido de pCL1920TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 anteriormente descrito entre los sitios ApaI y BamHI de pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS-Cm anteriormente descritos. El plásmido obtenido se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm
III.2. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:: Cm pKD46
Para reemplazar el gen wcaM por la región, TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, se digirió el plásmido pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por BspHI y el fragmento digerido remanente ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de acuerdo con el Protocolo 1.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes a cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por PCR con los cebadores Ome1707-DwcaM_verif_F (SEC ID N°43) y Ome1708-DwcaM_verif_R (SEC ID N°44) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm (pKD46)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
III.3. Transducción de DwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm a la cepa 6 y eliminación del cassette de resistencia.
La modificación cromosómica de ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm se transdujo a la cepa 6 (Tabla 1) anteriormente descrita con un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm anteriormente descrita, de acuerdo con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes al cloranfenicol y se verificó la modificación cromosómica de ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm por PCR con Ome1707DwcaM_verif_F (SEC ID N°43) y Ome1708-DwcaM_verif_R (SEC ID N°44) (Tabla 2). La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11::Cm.
Los cassettes de gentamicina y cloranfenicol de la cepa anterior se eliminaron luego de acuerdo con el Protocolo 1. La pérdida de los cassettes de gentamicina y cloranfenicol se verificó por PCR usando los cebadores Ome 1595DtreB_verif_F (SEC ID N°27) and Ome 1596-DtreB_verif_R (SEC ID N°28) y los Ome1707-DwcaM_verif_F (SEC ID N°43) and Ome1708-DwcaM_verif_R (SEC ID N°44) (Tabla 2) respectivamente. La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC se denominó cepa 10.
IV. Ejemplo 4 : Construcción de la cepa 12, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm pCL1920-PgapA-pycre-TT07
IV.1. Construcción de la cepa 11 por transducción de Ptrc01-pntAB::Cm a la cepa 10
La modificación del promotor Ptrc01-pntAB::Cm anteriormente descrito se transdujo a la cepa 10 (Tabla 1) de conformidad con el Protocolo 2, usando un lisado del fago PI de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc01-pntAB::Cm anteriormente descrita.
Se seleccionaron los transductores resistentes a cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de Ptrc01-pntAB::Cm por PCR con los cebadores Ome1151-pntAF (SEC ID N°37) y Ome1152-pntAR (SEC ID N°38) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm se denominó cepa 11.
IV.2. Construcción de pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 e introducción a la cepa 11
Con el fin de sobreexpresar el gen de piruvato carboxilasa de Rhizobium etli, se construyó el plásmido pCL1920PgapA-pycRe-TT07, que derivó del plásmido pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 pág. 4631).
Para construir el inserto PgapA-pycRe-TT07, se empleó PCR de superposición entre el promotor gapA, su sitio de unión al ribosoma (RBS) y el gen pycRe de Rhizobium etli.
Primero, el promotor gapA y la región RBS (correspondiente a la región en dirección 5’ -156 a -1 del codón de inicio de gapA) se amplió a partir de ADN genómico de E. coli MG1655 por PCR usando los cebadores PgapA-SalI-F (SEC ID N°45) y PgapA-pycRe-R (SEC ID N°46). Después, el gen pycRe se amplió a partir de ADN genómico de Rhizobium etli CFN 42 usando los cebadores PgapA-pycRe F (SEC ID N°47) y pycRe-TT07-SmaI-R (SEC ID N°48). Los cebadores PgapA-pycRe-R (SEC ID N°46) y PgapA-pycRe F (SEC ID N°47) se diseñaron para superponer una región de 42 nucleótidos de longitud. Finalmente, se amplió el fragmento PgapA-RBSgapA-pycRe-TT07 mezclando el promotor gapA-RBS y los amplicones pycRe usando los cebadores PgapA-SalI-F (SEC ID N°45) y pycRe-TT07
5
10
15
20
25
30
35
SmaI-R (SEC ID N°48).El producto resultante de la fusión PCR se clonó entre los sitios SalI y SmaI del plásmido pCL1920. El plásmido resultante se verificó por secuenciación de ADN y se denominó pCL1920-PgapA-pycRe-TT07.
PgapA-SalI-F (SEC ID N°45)
secuencia en letra mayúscula subrayada para los sitios de restricción SalI, ClaI, HindIII y PmeI y extrabases,
secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga a la secuencia del promotor gapA (1860640-1860658, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/) PgapA-pycRe-R (SEC ID N°46) GTATCTTGGATATGGGCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTAG con
secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga al promotor del gen gapA (1860772-1860791, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
secuencia en letra mayúscula homóloga al gen pycRe, excepto que el codón de inicio GTG del gen pycRe se reemplazó con ATG (4236889-4236906, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). PgapA-pycRe F (SEC ID N°47) CTAACAAATAGCTGGTGGAACATATGCCCATATCCAAGATAC con
secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga al promotor del gen gapA (1860772-1860791, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
secuencia en letra mayúscula homóloga al gen pycRe, excepto que el codón de inicio GTG del gen pycRe se reemplazó con ATG (4236889-4236906, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
pycRe-TT07-SmaI-R (SEC ID N°48)
con
secuencia en letra mayúscula subrayada para los sitios de restricción SmaI, BamHI y EcoRI y extrabases,
secuencia en letra mayúscula correspondiente a la secuencia del terminador de transcripción T7Te del fago T7 (Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2001 Abr 24;98(9):5019-24.),
secuencia en letra mayúscula cursiva para el sitio de restricción XhoI y extrabases,
secuencia en letra mayúscula en negrita homóloga a la secuencia en dirección 3’ del gen pycRe (42403324240388, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Luego, se introdujo pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 por electroporación en la cepa 11 (Tabla 1). Se verificó la presencia del plásmido pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 y la cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcFcysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 se denominó cepa 12.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
V. Ejemplo 5 : Construcción de la cepa 13, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02serA-serC Ptrc01-pntAB ::Cm ΔudhA::Km
La eliminación de ΔudhA::Km descrita previamente se transdujo a la cepa 11 (Tabla 1) usando un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF ΔudhA::Km pKD46 anteriormente descrita de conformidad con el Protocolo 2
Se seleccionaron los transductores resistentes a la kanamicina. Se verificó la presencia de la modificación del promotor Ptrc36-ARNmst17-metF por PCR con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727PtrcmetF-R (SEC ID N°30) seguida de secuenciación de ADN, y la presencia de la eliminación de ΔudhA::Km se verificó por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA *11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km se denominó cepa 13.
VI. Ejemplo 6 : Construcción de la cepa 14 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serAserC Ptrc01-pntAB ::Cm ΔudhA ::Km
Los genes udhA y metF están próximos en el cromosoma de E. coli, 89,61 min y 89,03 min respectivamente y, dado que el fago P1 puede empaquetar 2 min del cromosoma de E. coli, los genes udhA y metF son co-transducibles. En consecuencia, la modificación del promotor Ptrc36-metF y la eliminación de ΔudhA::Km anteriormente descrita, se co-transdujeron a la cepa 11 (Tabla 1) usando un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36metF ΔudhA::Km pKD46, anteriormente descrita, de conformidad con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a la kanamicina. La presencia de la modificación del promotor Ptrc36metF se verificó por PCR con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R (SEC ID N°30) seguida de secuenciación de ADN. La presencia de la eliminación de ΔudhA::Km se verificó por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km se denominó cepa 14.
VII. Ejemplo 7 : Construcción de la cepa 15, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC ::TT02serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07
pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, previamente descrito se introdujo por electroporación en la cepa 13 (Tabla 1). Se verificó la presencia del plásmido pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 y la cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA-serC Ptrc01-pntAB::Cm ΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07 se denominó cepa 15.
VIII. Ejemplo 8 : Construcción de la cepa 18, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1
5
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20
25
30
35
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45
X. Ejemplo 10 : Construcción de la cepa 22, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC ::TT02serA-serC Ptrc55-pntAB::Cm ΔudhA pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
X.1. Construcción de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc55 pntAB::Cm
Para aumentar el nivel de expresión de las subunidades alfa y beta de piridina nucleótido transhidrogenasa, PntA y PntB, se añadió un promotor artificial constitutivo de trc55 en dirección 5’ del operón pntA-pntB en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 de conformidad con el Protocolo 1, excepto que se usaron los cebadores Oag 0699-Ptrc55-pntAB R (SEC ID N°51) y Ome 1150-Ptrc-pntAF (SEC ID N°36) para ampliar el cassette de resistencia a cloranfenicol del plásmido pKD3.
Se seleccionaron los recombinantes resistentes al cloranfenicol. Se verificaron la presencia del promotor artificial trc55 y la inserción del cassette de resistencia por PCR con los cebadores Ome1151-pntAF (SEC ID N°37) y Ome1152-pntAR (SEC ID N°38) (Tabla 2) y por secuenciación de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 pKD46 Ptr55-pntAB::Cm.
Oag 0699-Ptrc55-pntAB R (SEC ID N°51)
con
secuencia en letra mayúscula homóloga a la secuencia en dirección 5’ del gen pntA (1675875-1675940, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
secuencia en letra mayúscula subrayada para la secuencia del promotor trc55
secuencia en letra mayúscula cursiva correspondiente al sitio del cebador 2 del plásmido pKD3 (Datsenko,
K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
X.2. Transducción de Ptrc55 pntAB::Cm a la cepa 16
La modificación del promotor Ptrc55-pntAB::Cm se transdujo a la cepa 16 (Tabla 1) usando un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 Ptrc55-pntAB::Cm anteriormente descrita de conformidad con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes al cloranfenicol y se verificó la presencia de la modificación cromosómica de Ptrc55-pntAB::Cm por PCR con Ome1151-pntAF (SEC ID N°37) y Ome1152-pntAR (SEC ID N°38) (Tabla 2). La cepa verificada y seleccionada MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02serA-serC::Gt Ptrc55-pntAB::Cm ΔudhA se denominó cepa 21.
X.3. Construcción de la cepa 22 por introducción de pCL1920-PgapA-pycre-TT07 en la cepa 21
pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, previamente descrito, se introdujo por electroporación en la cepa 21 (Tabla 1). Se verificó la presencia del plásmido pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, y la cepa resultante MG1655 metA*11 PtrcmetHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP46::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc55-pntAB::Cm ΔudhA pCL1920-PgapA-pycre-TT07 se denominó cepa 22.
XI. Ejemplo 11 : Construcción de la cepa 24, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-C1857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1
5
10
15
20
25
30
35
cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02serA-serC ΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
XI.1. Construcción de la cepa 23 por transducción de ΔudhA::Km a la cepa 10
La eliminación de ΔudhA::Km anteriormente descrita se transdujo a la cepa 10 (Tabla 1) usando un lisado del fago P1 de la cepa MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36-metF ΔudhA::Km pKD46 anteriormente descrita de conformidad con el Protocolo 2.
Se seleccionaron los transductores resistentes a kanamicina. Se verificó la presencia de la modificación del promotor Ptrc36-ARNmst17-metF por PCR (los motivos se explican en el ejemplo 6) con los cebadores Ome0726-PtrcmetF-F (SEC ID N°29) y Ome0727-PtrcmetF-R (SEC ID N°30) seguida de secuenciación de ADN, y se verificó la presencia de la eliminación de ΔudhA::Km por PCR con los cebadores Oag0055-udhAF2 (SEC ID N°33) y Oag0056-udhAR2 (SEC ID N°34) (Tabla 2). La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02serA-serC ΔudhA::Km se denominó cepa 23.
XI.2. Construcción de la cepa 24: introducción de pCL1920-PgapA-pycre-TT07 a la cepa 23
pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, previamente descrito, se introdujo por electroporación en la cepa 23 (Tabla 1). Se verificó la presencia del plásmido pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, y la cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔudhA::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07 se denominó cepa 24.
XII. Ejemplo 12: Producción de L-metionina por fermentación en matraces de agitación
La producción de cepas se evaluó en matraces Erlenmeyer pequeños. Se desarrolló un precultivo de 5,5 ml a 30°C durante 21 horas en un medio mixto (10% medio LB (Caldo LB Miller 25 g/l) con 2,5 g.l-1 glucosa y 90% medio mínimo PC1). Se usó para inocular un cultivo de 50 ml de medio PC1 hasta un valor OD600 de 0,2. Si fue necesario, se añadieron antibióticos en concentraciones de 50 mg.l-1 para kanamicina y espectinomicina, 30 mg.l-1 para cloranfenicol y 10 mg.l-1 para gentamicina. La temperatura del cultivo se mantuvo a 37°C durante dos horas, 42°C durante dos horas y luego 37°C hasta el final del cultivo. Cuando el cultivo había alcanzado un valor OD600 de 5 a 7, se cuantificaron los aminoácidos extracelulares por HPLC. Después de la derivación de OPA/Fmoc se analizaron otros metabolitos relevantes usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de la sililación. Para cada cepa, se efectuaron varias repeticiones.
Tabla 3: Composición en medio mínimo (PC1).
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- ZnSO4.7H2O
- 0,0040
- CuCl2.2H2O
- 0,0020
- MnSO4.H2O
- 0,0200
- CoCl2.6H2O
- 0,0080
- H3BO3
- 0,0010
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0004
- MgSO4.7H2O
- 1,00
- Ácido cítrico
- 6,00
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- CaCl2.2H2O
- 0,04
- K2HPO4
- 8,00
- Na2HPO4
- 2,00
- (NH4)2HPO4
- 8,00
- NH4Cl
- 0,13
- NaOH 4M
- Ajustado a pH 6,8
- FeSO4.7H2O
- 0,04
- Tiamina
- 0,01
- Glucosa
- 15,00
- Tiosulfato de amonio
- 5,60
- Vitamina B12
- 0,01
- MOPS
- 15,00
Tabla 4: Rendimiento de metionina (Ymet), en % g de metionina por g de glucosa producida en cultivo en lotes por las distintas cepas. Para la definición de rendimiento de metionina/glucosa, ver a continuación. SD indica la desviación estándar para los rendimientos que se calculó en base a varias repeticiones (N = número de repeticiones).
- Cepa
- Ymet SD
- Cepa 7 N = 3 (comparativa)
- 7,27 0,12
- Cepa 9 N = 6
- 9,94 0,90
- Cepa 14 N = 6
- 10,25 0,51
- Cepa 10 N = 110 (comparativa)
- 9,75 1,29
- Cepa 13 N = 9
- 12,09 0,71
- Cepa 15 N = 6
- 12,88 0,54
- Cepa 24 N = 3
- 11,41 0,18
- Cepa 12 N = 3
- 12,65 0,10
La concentración de metionina extracelular se cuantificó por HPLC después de la derivación de OPA/FMOC. La concentración de glucosa residual se analizó usando HPLC con detección refractomérica. El rendimiento de metionina se expresa de la siguiente manera:
Como se puede observar en la tabla 4, el rendimiento de metionina/glucosa (Ymet) aumenta tras la sobreexpresión de pntAB y/o la eliminación de udhA (cepas 9 y 14 comparadas con la cepa 7, y cepas 12, 13, 15 y 24 comparadas con la cepa 10).
5 La mejora del rendimiento es incluso mejor tras las sobreexpresión fuerte del gen metF. La cepa 13 que contiene tanto una secuencia de estabilización de ARNm frente al gen de metF y la sobreexpresión de pntAB y la eliminación de udhA exhibe un rendimiento superior que la cepa 14 sin una sobreexpresión fuerte de la vía C1.
XIII. Ejemplo 13: Actividades de transhidrogenasa y 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa
Los resultados descritos en el ejemplo 12, tabla 4 se confirmaron por análisis de las actividades de transhidrogenasa
10 y 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa llevados a cabo por PntAB y MetF, respectivamente (Tabla 5). En los cultivos de matraces Erlenmeyer pequeños, ambas actividades aumentan tras la sobreexpresión.
Tabla 5: Las actividades de transhidrogenasa (TH, PntAB) y 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR, MetF) se determinaron en las cepas anteriormente descritas y se exponen en mUI/mg de proteínas (N = número de cultivos de matraces Erlenmeyer independientes).
- Cepa
- TH MTHFR
- Cepa 7 (N=3) (comparativa)
- 48 ± 2 8 ± 4
- Cepa 9 (N=3)
- 802 ± 43 15 ± 5
- Cepa 14 (N=3)
- 799 ± 75 5 ± 1
- Cepa 10 (N=3) (comparativa)
- 36 ± 4 69 ± 3
- Cepa 13 (N=9)
- 665 ± 35 94 ± 7
- Cepa 15 (N=3)
- 629 ± 37 75 ± 8
- Cepa 24 (N=3) (comparativa)
- 29 ± 4 ND
- Cepa 12 (N=3)
- 582 ± 27 ND
15
Para la determinación in vitro de las actividades enzimáticas, se cultivaron cepas de E. coli en medio mínimo como se describió anteriormente. En el método de extracción precedente, las células se cosecharon a partir de caldo de cultivo por centrifugación. El sedimento se resuspendió en tampón de fosfato de potasio frío 20 mM (pH 7.2) y las células se lisaron por batido de esferas con un aparato Precellys (Bertin Technologies; 2x10s a 5000rpm, 2 minutos
20 entre las dos etapas) seguido de centrifugación a 12000g (4°C) durante 30 minutos. El sobrenadante se desaló y se usó para análisis. Se determinaron las concentraciones de proteínas usando reactivo de ensayo Bradford.
Se ensayaron las actividades de la transhidrogenasa (TH) como se describió previamente (Yamagushi y Stout, 2003). La actividad de la transhidrogenasa cíclica se ensayó de manera espectrofotométrica durante 30 minutos a 375nm en una mezcla de reacción a 37°C que contenía MES-KOH 50mM (pH 6,0), NADH 0,2 mM, AcPyAD 0,2 mM
25 con o sin NADPH 10 µM y 6 µg de extracto celular bruto. Todos los resultados son el promedio de por lo menos tres mediciones.
Se ensayaron las actividades de 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) como se describió previamente (Matthews, 1986) con algunas modificaciones. El método se muestra en la ecuación (1).
(1) Metil-THF + Menadiona → Metileno-THF + Menadiol
30 Se usa metil-THF como el sustrato y la formación de metileno-THF se mide por descomposición de ácido de metileno-THF que produce formaldehído. El formaldehído producido reacciona con el NBDH indicador para formar
un derivado de hidrazona fluorescente a 530 nm. Se ensayó la actividad de 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa durante 30 minutos a 37°C en una mezcla de reacción que contenía tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 6,7), EDTA 0,3 mM, 0,2 % (p/v) albúmina de suero bovino, disolución saturada de menadiona en 20% metanol/80% H2O y 20 µg de extracto celular bruto. Después de la incubación, la reacción finaliza por adición de tampón de acetato de
5 sodio (pH 4,7) y disponiendo el tubo en un bloque calentador a 100°C durante 2 minutos. Después de la centrifugación durante 5 minutos a 10000 g, el formaldehído producido se mide por adición de 0,001% NBDH en 95% etanol/6% ácido fosfórico con una lectora de microplacas de fluorescencia FLx800 (Biotek).
XIV. Ejemplo 14: Producción de L-metionina por fermentación en un biorreactor
Las cepas que produjeron cantidades sustanciales de metabolitos de interés se ensayaron prácticamente bajo las
10 condiciones de producción en fermentadores de 2,5 l (Pierre Guerin) usando una estrategia de lote alimentado (fedbatch).
En síntesis, se usó un cultivo de 24 horas desarrollado en 10 ml de medio LB con 2,5 g.l-1 glucosa para inocular un precultivo de 24 horas en medio mínimo (B1a). Estas incubaciones se llevaron a cabo en matraces muescados de 500 ml que contenían 50 ml de medio mínimo (B1a) en un agitador rotatorio (200 RPM). El primer cultivo se efectuó
15 a una temperatura de 30°C, el segundo a una temperatura de 34°C.
Se llevó a cabo un tercer precultivo en biorreactores (Sixfors) rellenos con 200 ml de medio mínimo (B1b) inoculado hasta una concentración de biomasas de 1,2 g.l-1 con 5 ml de precultivo concentrado. La temperatura del precultivo se mantuvo constante a 34°C y el pH se ajustó automáticamente hasta un valor de 6,8 usando una disolución al 10% de NH4OH. La concentración de oxígeno disuelto se ajustó continuamente hasta un valor de 30 % de la saturación 20 de aire parcial con suministro de aire y/o agitación. Después del agotamiento de la glucosa del medio del lote, se inició el lote alimentado con un caudal inicial de 0,7 ml.h-1, aumentado en forma exponencial durante 24 horas con un índice de crecimiento de 0,13 h-1 con el fin de obtener una concentración celular final de aproximadamente 18 g.l
1
.
Tabla 6: Composición en medio mineral de lotes de precultivo (B1a y B1b).
- Compuesto
- Concentración de B1a (g.l-1) Concentración de B1b (g.l-1)
- Zn(CH3COO)2.2H2O
- 0,0130 0,0130
- CuCl2.2H2O
- 0,0015 0,0015
- MnCl2.4H2O
- 0,0150 0,0150
- CoCl2.6H2O
- 0,0025 0,0025
- H3BO3
- 0,0030 0,0030
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0025 0,0025
- Citrato de Fe(III) H2O
- 0,1064 0,1064
- EDTA
- 0,0084 0,0084
- MgSO4.7H2O
- 1,00 1,00
- CaCl2.2H2O
- 0,08 0,08
- Ácido cítrico
- 1,70 1,70
- KH2PO4
- 4,57 4,57
- K2HPO4.3H2O
- 2,50 2,50
- (NH4)2HPO4
- 1,10 1,10
- (NH4)2SO4
- 4,90 4,90
- (NH4)2S2O3
- 1,00 1,00
- Tiamina
- 0,01 0,01
- Vitamina B 12
- 0,01 0,01
- Glucosa
- 30,00 5,00
- Compuesto
- Concentración de B1a (g.l-1) Concentración de B1b (g.l-1)
- MOPS
- 30,00 0,00
- NH4OH 28%
- Ajustada hasta pH 6,8 Ajustada hasta pH 6,8
Tabla 7: Composición del medio mineral del lote alimentado de precultivo (F1)
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- Zn(CH3COO)2.H2O
- 0,0104
- CuCl2.2H2O
- 0,0012
- MnCl2.4H2O
- 0,0120
- CoCl2.6H2O
- 0,0020
- H3BO3
- 0,0024
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0020
- Citrato de Fe(III) H2O
- 0,0424
- EDTA
- 0,0067
- MgSO4
- 5,00
- (NH4)2SO4
- 8,30
- Na2SO4
- 8,90
- (NH4)2S2O3
- 24,80
- Tiamina
- 0,01
- Glucosa
- 500,00
- Vitamina B 12
- 0,01
- NH4OH 28%
- Ajustada hasta pH 6,8
Tabla 8: Composición del medio mineral del lote de cultivo (B2).
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- Zn(CH3COO)2.2H2O
- 0,0130
- CuCl2.2H2O
- 0,0015
- MnCl2.4H2O
- 0,0150
- CoCl2.6H2O
- 0,0025
- H3BO3
- 0,0030
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0025
- Citrato de Fe(III) H2O
- 0,1064
- EDTA
- 0,0084
- MgS2O3.6H2O
- 1,00
- CaCl2.2H2O
- 0,08
- Ácido cítrico
- 1,70
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- KH2PO4
- 2,97
- K2HPO4.3H2O
- 1,65
- (NH4)2HPO4
- 0,72
- (NH4)2S2O3
- 3,74
- Tiamina
- 0,01
- Vitamina B12
- 0,01
- Biotina
- 0,10
- Glucosa
- 10
- NH4OH 28%
- Ajustada hasta pH 6,8
Tabla 9: Composición del medio del lote alimentado de cultivo (F2)
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- Zn(CH3COO)2.2H2O
- 0,0104
- CuCl2.2H2O
- 0,0012
- MnCl2.4H2O
- 0,0120
- CoCl2.6H2O
- 0,0020
- H3BO3
- 0,0024
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0020
- Citrato de Fe(III) H2O
- 0,0524
- EDTA
- 0,0067
- MgS2O3.6H2O
- 10,20
- (NH4)2S2O3
- 55,50
- Tiamina
- 0,01
- Vitamina B 12
- 0,01
- Biotina
- 0,10
- Glucosa
- 500
Posteriormente, se llenaron fermentadores de 2,5 l (Pierre Guerin) con 600 ml de medio mineral (B2) y se inocularon 5 hasta una concentración de biomasa de 2,1 g.l-1 con un volumen de precultivo que osciló entre 55 y 70 ml.
La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 37 °C y el pH se mantuvo al valor del tratamiento (6,8) por adición automática de disoluciones de NH4OH (NH4OH 10% durante 9 horas y NH4OH 28% hasta el final del cultivo). La velocidad de agitación inicial se estableció a 200 RPM durante la fase del lote y se aumentó hasta 1000 RPM durante la fase del lote alimentado. La tasa de flujo de aire inicial se fijó a 40 NL.h-1 durante la fase del lote y se
10 aumentó hasta 100 NL.h-1 al comienzo de la fase del lote alimentado. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en valores entre 20 y 40%, preferiblemente 30% de saturación aumentando la agitación.
Cuando la masa celular alcanzó una concentración cercana a 5 g.l-1, se inició el lote alimentado con un caudal inicial de 5 ml.h-1. La disolución de alimentación se inyectó a un perfil sigmoidal con un caudal en aumento que alcanzó 24 ml.h-1 después de 26 horas de crecimiento. Las condiciones precisas de alimentación se calcularon con la siguiente
ecuación:
en donde Q(t) es el caudal de alimentación en ml.h-1 para un volumen de lote de 600 ml con p1 = 1,80, p2 = 22,40, p3 = 0,270, p4 = 6,5.
5 Después de 26 horas, la bomba de disolución de alimentación del lote alimentado se detuvo y el cultivo finalizó después del agotamiento de la glucosa.
Se cuantificaron aminoácidos extracelulares por HPLC después de la derivación de OPA/Fmoc, y se analizaron otros metabolitos relevantes usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de la sililación.
10 Tabla 10: Rendimiento máximo de metionina (Ymet max) en % g de metionina por g de glucosa producido en un cultivo de lote alimentado por las distintas cepas. Para la definición de rendimiento de metionina/glucosa, véase a continuación. SD indica la desviación estándar para los rendimientos que se calculó en base a varias repeticiones (N = número de repeticiones).
- Cepa
- Ymet max SD
- Cepa 10* N=5 (comparativa)
- 16,94 0,86
- Cepa 13* N=3
- 20,72 0,60
- Cepa 12 N=2
- 22,39 0,46
- Cepa 15 N=1
- 22,27 Nd
- Cepa 22 N=1
- 23,68 Nd
- Cepa 18 N=3
- 23,69 0,52
- Cepa 20 N=1
- 22,57 Nd
- * Las cepas 10 y 13 se cultivaron respectivamente con 49,1 y 55,5 g.l-1 de tiosulfato de amonio y con 5 g.l-1 de sulfato de magnesio en lugar de tiosulfato de sodio en el medio del lote alimentado. El medio del lote contenía 1 g.l-1 de sulfato de magnesio en lugar de tiosulfato de magnesio para las dos cepas.
15 Como se observó previamente en los experimentos en matraces, de la misma manera, en un biorreactor, el rendimiento de metionina/glucosa (Ymet max) aumenta tras la sobreexpresión de pntAB y la eliminación de udhA (comparar cepas 10 y 13 de la tabla 10).
Asimismo, demostramos que una regulación ajustada de sobreexpresión de pntAB mejoró la producción de metionina, como se puede observar con las cepas 12, 15, 18, 20 y 22 de la tabla 10 anterior. La producción de
20 metionina se modula por el nivel de expresión de los genes pntAB, y demostramos que es mejor con una sobreexpresión moderada de pntAB.
El volumen del fermentador se calculó añadiendo al volumen inicial la cantidad de disoluciones añadidas para regular el pH y para alimentar el cultivo, y restando el volumen utilizado para muestreo y que se perdió por evaporación.
25 El volumen del lote alimentado se siguió continuamente pesando la carga de alimentación. La cantidad de glucosa inyectada se calculó luego en base al peso inyectado, la densidad de la disolución y la concentración de glucosa determinada por el método de Brix ([Glucosa]). El rendimiento de metionina se expresó de la siguiente manera:
El rendimiento máximo obtenido durante el cultivo se presentó aquí para cada cepa.
30 Con metionina0 y metioninat respectivamente, las concentraciones de metionina iniciales y finales y V0 y Vt, los volúmenes t iniciales e instantáneos. La glucosa consumida se calculó de la siguiente manera:
Glucosa consumidat = [Glucosa]0 * V0 + Glucosa inyectada -[Glucosa]residual * Vt con [Glucosa]0, [Glucosa], [Glucosa]residual respectivamente, las concentraciones de glucosa inicial, alimentada y residual.
XV. Ejemplo 15: Actividad de transhidrogenasa
5 Los resultados descritos en el ejemplo 14, tabla 10 se confirman por el análisis de las actividades de transhidrogenasa llevadas a cabo por PntAB (Tabla 11). Como se observó previamente en los experimentos en matraces, las actividades de la transhidrogenasa aumentan tras la sobreexpresión de pntAB (véanse las cepas 10 y 13 de la tabla 11). Asimismo, una regulación ajustada de la sobreexpresión de pntAB redujo aproximadamente 10 veces las actividades de la transhidrogenasa, como se puede observar con la cepa 18 de la tabla 11.
10 Tabla 11: Las actividades de transhidrogenasa (TH, PntAB) se determinaron en las cepas anteriormente descritas y se exponen en mUI/mg de proteínas (N = dos puntos mínimos de cultivos de fermentadores independientes).
Las actividades de la transhidrogenasa (TH) se ensayaron como se describió previamente en el Ejemplo 13. Todos los resultados son el promedio de por lo menos tres mediciones. 15 Referencias Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633 Ouzonis, C. A., and Karp, P. D. (2000) Genome Res. 10, 568-576 Verho et al., (2003) Applied and Environmental Microbiology 69, 5892-5897 Chemler et al., (2007) Applied and Environmental Microbiology 77, 797-807 20 Alper, H. et al., (2005) Metab. Eng. 7, 155-164 Kelle T et al., (2005) L-lysine production; In: Eggeling L, Bott M (eds) Handbook of corynebacterium glutamicum. CRC, Boca Raton, pp467-490 Sauer U, Canonaco F, Heri S, Perrenoud A, Fischer E., "The soluble and membrane-bound transhydrogenases UdhA and PntAB have divergent functions in NADPH metabolism of Escherichia coli. ", 25 2004, JBC, 279: 6613-6619 Jackson JB, "Proton translocation by transhydrogenase.", 2003, FEBS Lett 545:18-24
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