ES2634227T3 - Extracto de la familia Dioscoreaceae y composición que lo comprende para prevenir o tratar neuropatía periférica - Google Patents
Extracto de la familia Dioscoreaceae y composición que lo comprende para prevenir o tratar neuropatía periférica Download PDFInfo
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Abstract
Un extracto de la familia Dioscoreaceae para su uso en el tratamiento de la neuropatía periférica, siendo la familia Dioscoreaceae al menos una especie seleccionada del grupo que consiste en Dioscorea nipponica, Dioscorea septembloba, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica, Dioscorea bulbifera, Dioscorea tokoro y Dioscorea tenuipes, en el que el extracto se obtiene llevando a cabo un procedimiento de extracción que comprende la extracción de una raíz de una especie de la familia Dioscoreaceae con un primer disolvente de extracción seleccionado del grupo que consiste en agua, alcohol de C1-C4, y una mezcla de agua y un alcohol de C1- C4, y en el que el extracto contiene el compuesto de Fórmula 1**Fórmula** en la que R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de C1-C4 o un sacárido.
Description
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Modo de realización de la invención
La presente invención quedará descrita con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Dichos ejemplos tienen un fin únicamente ilustrativo no pretendiéndose limitar con ellos el ámbito de la presente invención.
Ejemplo 1: Preparación de extracto
Se secó Dioscorea Nipponica y se cortó su raíz en pequeñas secciones. Se añadieron a 500 g de la muestra 10 litros de solución de metanol al 85 % y se extrajo tres veces (cada una de ellas durante 2 horas) a temperatura ambiente. Se repitió este procedimiento de extracción dos veces. Se recogieron los sobrenadantes resultantes y se concentraron a presión reducida, para obtener así 74 g de un extracto bruto.
Se suspendieron los 74 g del extracto bruto en 1 litro de agua destilada, se añadió 1 litro de butano saturado con agua y a continuación, se separó la capa orgánica generada; se repitió esta operación cinco veces. Se recogieron las capas orgánicas obtenidas y se secaron a presión reducida. Como resultado, se obtuvieron 17 g del extracto de
Dioscorea Nipponica
Ejemplo 2: Preparación de extracto
Se secó Dioscorea quinqueoloba y se cortó su raíz en pequeñas secciones. Se añadieron a 500 g de la muestra 5 litros de solución de etanol al 85 % y se extrajo tres veces (cada una de ellas durante 2 horas) a temperatura ambiente. Se repitió dos veces dicho procedimiento de extracción. Se recogieron los sobrenadantes resultantes y se concentraron a presión reducida, obteniendo así 90 g de un extracto bruto.
Se suspendieron los 90 g del extracto bruto en 1 litro de agua destilada, se añadió 1 litro de butanol saturado con agua y a continuación, se separó la capa orgánica generada; se repitió la operación cinco veces. Se recogieron las capas orgánicas obtenidas y se secaron a presión reducida. Como resultado, se obtuvieron 26 g del extracto de
Dioscorea quinqueoloba.
Ejemplo 3: Preparación de extracto
Se secó Dioscorea tokoro y se cortó su raíz en pequeñas secciones. Se añadieron a 300 g de la muestra 3 litros de solución de etanol al 85 % y se extrajo tres veces (cada una de ellas durante 2 horas) a temperatura ambiente. Se repitió dos veces este procedimiento de extracción. Se recogieron los sobrenadantes resultantes y se concentraron a presión reducida, obteniendo así 35 g de un extracto bruto.
Se suspendieron los 35 g del extracto bruto en 0,5 litros de agua destilada, se añadieron 0,5 litros de butanol saturado con agua y a continuación, se separó la capa orgánica generada; se repitió la operación cinco veces. Se recogieron las capas orgánicas obtenidas y se secaron a presión reducida. Como resultado, se obtuvieron 11 g del extracto de Dioscorea tokoro.
Ejemplo 4: Separación del ingrediente activo
Se hidrolizó 1 g del extracto de Dioscorea nipponica obtenido en el Ejemplo 1 a 94 °C durante cuatro horas añadiendo 10 ml de 2,5N HCl a 10 ml del mismo. A continuación, se extrajo el hidrolizado resultante con 10 ml de cloroformo durante 15 minutos. Se separó la capa de cloroformo, se filtró y después se concentró a presión reducida a una temperatura de 30-35 °C. Se recristalizó el residuo obtenido a 4 °C utilizando 5 ml de solución de etanol al 95 %. Se filtró el precipitado recristalizado, se lavó con agua, se recristalizó a 4 ºC utilizando 3 ml de acetona y a continuación, se filtró para obtener aproximadamente 100 mg del precipitado. Se identificó el precipitado 3beta, 25Respirost-5-en-3-ol representado por la Fórmula 2.
[Fórmula 2]
(1) Fórmula: C27H42O3
- (2)
- Peso molecular: 414,62
- (3)
- Punto de fusión: 204-207 °C
- (4)
- [α]25D -129°
- (5)
- Datos RMN: consultar Tabla 1
Tabla 1
- 13C
- Desplazamiento químico (δ)a 1H Desplazamiento químico (δ)a
- C-1
- 37,6-37,7 H-1 1,60-1,70;0,87-0,91 (m.o)
- C-2
- 30,3-30,4 H-2 2,00-2,03;1,75-1,79 (m.o)
- C-3
- 78,1-78,7 H-3 3,81-3,90 (m, J=4,7-5,6 Hz)
- C-4
- 38,9-39,5 H-4 2,57-2,29 (m, J=13-14 Hz; J=5,0; 12,0 Hz)
- C-5
- 140,9-141,1
- C-6
- 121,9-122,0 H-6 5,23-5,26 (d, J=4,6-5,4 Hz)
- C-7
- 32,4-32,5 H-7 1,77-1,82; 1,41-1,46 (m.o)
- C-8
- 31,8-31,9 H-8 1,44-1,48 (m.o)
- C-9
- 50,4-50,5 H-9 0,80-0,83 (m)
- C-10
- 37,2-37,3
- C-11
- ∼21,3 H-11 1,35-1,38 (m.o)
- C-12
- 40,0-40,1 H-12 1,60-1,62 (m.o)
- C-13
- 40,6-40,7
- C-14
- 56,8-56,8 H-14 1,01 (m.o)
- C-15
- 32,4-32,5 H-15 1,95-1,98 (m, J=5,9-6,1 Hz); 1,31-1,35 (m.o)
- C-16
- 81,3-81,3 H-16 4,45-4,48 (m, J=7,0-7,4 Hz)
- C-17
- 63,0-63,1 H-17 1,72-1,75 (m.o)
- C-18
- 16,5-16,6 H-18 0,73-0,76 (s)
- C-19
- 19,6-19,6 H-19 0,80-1,00 (s)
- C-20
- 42,1-42,2 H-20 1,88 (m)
- C-21
- 15,2-15,2 H-21 1,05-1,07 (d, J=6,8-7,2 Hz)
- C-22
- 109,4-109,5
- C-23
- 32,0-32,0 H-23 1,57-1,63 (m.o)
- C-24
- 29,4-29,5 H-24 1,48-1,52 (m.o)
- C-25
- 30,8-30,8 H-25 1,50 (m.o)
- C-26
- 67,0-67,1 H-26 3,50-3,40 (m, J=10,5; 3,0; 10,5 Hz)
- C-27
- 17,5-17,5 H-27 0,60-0,63 (d, J=4,7-5,8 Hz)
Ejemplo Experimental 1: Medición de la extensión de las neuritas
Se cultivaron en una incubadora en condiciones de 5% de CO2 y una temperatura de 37 ºC, células PC12 (feocromocitoma, Número ATCC: CRL-1721) en un medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con suero de caballo
10 (10%, v/v), suero bovino fetal (5%, v/v), y 1% penicilina-estreptomicina.
Para averiguar el efecto del Compuesto de Fórmula 2 en la extensión de las neuritas, se añadieron los medios suplementados con suero de caballo al 2 %, suero bovino fetal al 1 % y penicilina-estreptomicina al 2 % a cada uno de los pocillos de una placa de 6 pocillos revestida con poli-d-lisina y a continuación, se inocularon 5 x 104 células PC12 en cada uno de los pocillos. Al cabo de 24 horas, se trataron estas células con 10 μl/ml de etanol, 10 μg/ml del
15 compuesto de Fórmula 2, y 50 ng/ml de factor de crecimiento nervioso (R&D System, Estados Unidos), respectivamente. A continuación, al cabo de 48 horas, se midió la longitud de los neuritas utilizando un microscopio de contraste de imagen invertida (CK-2, Olympus, Estados Unidos) (véase FIG. 1 y FIG. 2)
En lo que se refiere a las FIGS. 1 y 2, no se observó la extensión de neuritas en el grupo al que se le inyectó etanol (control), pero se provocó la extensión de neuritas tanto en el grupo tratado con el compuesto de fórmula 2 (GD)
20 como en el grupo tratado con factor de crecimiento nervioso (FCN). En consecuencia, se observó que el compuesto de Fórmula 2 provocó una diferenciación de células PC12 al provocar la extensión de las neuritas.
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que no se forma la mielina, y rodea los axones. La señal eléctrica se transmite en el espacio, los impulsos son transmitidos rápidamente a lo largo de las neuronas y la mielina aumenta la velocidad del impulso eléctrico. Por consiguiente, cuando se destruye la mielina por daño del nervio como consecuencia de la neuropatía inducida por diabetes, los axones dejan de funcionar y desciende la velocidad de transmisión nerviosa.
Durante un período de un mes de diabetes inducida, el grupo al que se administró compuesto (DM-GD) presentó una velocidad de transmisión del nervio sensorial un 25 % mayor que la del grupo de control al que se indujo diabetes (DM) al que solamente se le administró vehículo (véase FIG. 5). Durante el período de dos meses de diabetes inducida, el grupo al que se administró el compuesto (DM-GD) presentó una velocidad de transmisión del nervio sensorial un 45 % mayor que el grupo de control y presentó una velocidad de transmisión del nervio motor un 40 % más alta que el grupo de control (véase FIG. 6). Por consiguiente, se observó que el compuesto de acuerdo con la presente invención tiene un efecto terapéutico sobre el daño del nervio como consecuencia de neuropatía al aumentar la velocidad de transmisión del nervio sensorial y el nervio motor de un ratón en el que se indujo diabetes.
Ejemplo Experimental 5: Medición del nivel de factor de crecimiento nervioso en nervio ciático en ratón en el que se ha inducido diabetes
Se mantuvo en ayunas ratones ICR macho de 7 semanas de vida durante 18 horas y a continuación, se les inyectó una vez aloxana disuelto en solución salina fisiológica por inyección intraperitoneal en una cantidad de 160 mg/kg para inducir la diabetes. Se seleccionaron los ratones que mantuvieron la glucemia en ayunas en 200 mg/dl o más durante una semana, es decir, los ratones en los que se había inducido la diabetes y se dividieron en el grupo de control (n = 5), y el grupo al que se le administró el compuesto (n = 5). Se administró al grupo de control 0,2 ml de una solución de sulfóxido de dimetilo: etanol (3:1), se administró al grupo de administración de compuesto el compuesto de Fórmula 2 disuelto en una solución de sulfóxido de dimetilo: etanol (3:1) en una cantidad de 10 mg/kg. Se administró a los tres grupos por vía oral, tres veces a la semana, y el periodo de administración total fue un mes. La cantidad de factor de crecimiento nervioso en el nervio ciático fue medida por ELISA (véase FIG. 7)
En lo que se refiere a la FIG. 7, se observó que el factor de crecimiento nervioso en el nervio ciático del grupo al que se le administró compuesto (DM-GD 10 mg/kg P.O.) fue aproximadamente 30% mayor que la del grupo de control al que se le inyectó únicamente vehículo. Por consiguiente, se considera que los resultados mostrados en la FIGS. 5 y 6 confirman la protección de la función del nervio del factor de crecimiento nervioso.
Ejemplo Experimental 6: Medición del cambio en la cantidad de sorbitol en nervio ciático de ratón en el que se ha inducido diabetes
Se identificó el efecto terapéutico del compuesto de acuerdo con la presente invención en la neuropatía midiendo el cambio en la cantidad de sorbitol en el nervio ciático.
Se mantuvo en ayunas ratones ICR macho de 7 semanas de vida durante 18 horas y a continuación, se les inyectó una vez aloxana disuelto en solución salina fisiológica por inyección intraperitoneal en una cantidad de 160 mg/kg para inducir la diabetes. Se seleccionaron los ratones que mantuvieron la glucemia en ayunas en 200 mg/dl o más durante una semana, es decir, los ratones en los que se había inducido la diabetes y se dividieron en el grupo de control (n = 3), y el grupo al que se le administró el compuesto (n = 3). Se administró al grupo de control 0,2 ml de una solución de sulfóxido de dimetilo: etanol (3:1), y se administró al grupo de administración de compuesto el compuesto de Fórmula 2 disuelto en una solución de sulfóxido de dimetilo: etanol (3:1) en una cantidad de 10 mg/kg. Los ratones ICR macho de 7 semanas de vida en los que no se indujo diabetes fueron agrupados como el grupo normal (n = 3) y el grupo normal al que se le administraron 0,2 ml de solución de sulfóxido de dimetilo: etanol (3:1). Se administró al grupo normal, al grupo de control y al grupo al que se le administró el compuesto, por vía oral, tres veces a la semana y durante un período de administración de 2 semanas. Una vez completada la administración se sacrificó a los ratones por dislocación cervical y después se midió la cantidad de sorbitol en el nervio ciático por HPC (véase FIG. 8).
La vía del poliol se refiere a un proceso en el que se convierte la glucosa en sorbitol mediante aldosa reductasa y el sorbitol cambia a fructosa mediante sorbitol deshidrogenasa. En un estado hiperglucémico, como la diabetes, el exceso de glucosa entra en las células y se genera y se acumula sorbitol a través de la vía del poliol. Llegado el caso, se pueden dañar los nervios por un fenómeno osmótico en el que entra agua en las células. Por tanto, tal como muestran los resultados de la medición del efecto del compuesto según la presente invención en la acumulación de sorbitol en el nervio ciático del ratón en el que se ha inducido diabetes, y tal como se muestra en la FIG. 8, se observó que el sorbitol en el nervio ciático del grupo de control en el que se había inducido diabetes (DM-CON) fue aproximadamente 40% más alta que en el grupo normal, pero el sorbitol en el nervio ciático del grupo al que se administró el compuesto (DMGD) fue 10% más baja que el del grupo de control en el que se había inducido diabetes (DM-CON). Dichos resultados demuestran que el compuesto según la presente invención puede disminuir parcialmente factores agresivos que causan daños en el nervio.
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Ejemplo Experimental 7: Comparación histológica del nervio ciático de ratón en el que se ha inducido diabetes
Se identificó el efecto terapéutico del compuesto según la presente invención sobre neuropatía midiendo los cambios histológicos del nervio ciático.
Se mantuvo en ayunas ratones ICR macho de 7 semanas de vida durante 18 horas y a continuación, se les inyectó una vez aloxana disuelto en solución salina fisiológica por inyección intraperitoneal en una cantidad de 160 mg/kg para inducir la diabetes. Se seleccionaron los ratones que mantuvieron la glucemia en ayunas en 200 mg/dl o más durante una semana, es decir, los ratones en los que se había inducido la diabetes y se dividieron en el grupo de control (n = 5), el grupo al que se le administró el extracto (n = 5) y el grupo al que se le administró el compuesto (n = 3). Se administró al grupo de control 0,2 ml de una solución de sulfóxido de dimetilo: etanol (3:1), se administró al grupo de administración de extracto, el extracto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 disuelto en una solución de sulfóxido de dimetilo: etanol (3:1) en una cantidad de 100 mg/kg y al grupo de administración de compuesto el compuesto de Fórmula 2 disuelto en una solución de sulfóxido de dimetilo: etanol (3:1) en una cantidad de 10 mg/kg. Se trató a los tres grupos con la administración por vía oral tres veces a la semana, y el periodo de administración total fue dos meses. Una vez completada la administración, se sacrificó a los ratones por dislocación cervical y a continuación, se separó el nervio ciático, se secó en las siguientes condiciones y después se observó con un microscopio confocal de 600x, 1200x.
- (1)
- pre-fijación: 2,5% glutaraldehído, 12 o más horas
- (2)
- lavado: pH 7,4, 0.1 M solución de tampón fosfato, 15 minutos/dos veces
- (3)
- post-fijación: 1% OsO4 tetróxido de osmio, 60 minutos
- (4)
- lavado: pH 7,4, 0,1 M solución de tampón fosfato, 5 minutos/dos veces
- (5)
- deshidratación:
50, 70, 80, 90 % alcohol: 10 minutos/cada uno 100 % alcohol: 15 minutos/dos veces
- (6)
- sustitución: óxido de propileno, 15 minutos/dos veces
- (7)
- permeación: óxido de propileno (1), EPOK 812 (2), 12 o más horas
- (8)
- embebido: EPOK 812 refinado (80 °C polimerización): 12 o más horas
- (9)
- seccionado: sección semi-delgada, 35-95 μm
- (10)
- teñido: 1% azul de toluidina
Las FIG. 9A y 9B presentan los resultados obtenidos con un aumento de 600 (9A) y un aumento de 12000 (9B), respectivamente. En el grupo en el que se indujo la diabetes (DM), el axón y la mielina de la parte central del nervio ciático quedaron significativamente destruidos. Sin embargo, en el grupo al que se le administró el compuesto (DM-DG) y el grupo al que se administró extracto (DM-DN), se observaron claramente el axón y la mielina en la parte central del nervio ciático. Estos resultados demuestran que el extracto o el compuesto de acuerdo con la presente invención pueden proteger y tratar los nervios dañados por la neuropatía.
Se formuló el compuesto de acuerdo con la presente invención tal como se muestra a continuación. Sin embargo estos ejemplos de formulación tienen un fin únicamente ilustrativo y no se pretende limitar con ellos el ámbito de la presente invención.
Ejemplo de Formulación 1: Formulación de comprimido
Compuesto de Fórmula 2 200 mg Lactosa 100 mg Almidón 100 mg Estearato de magnesio cantidad adecuada
Se mezclaron estos componentes y se comprimieron en comprimidos de acuerdo con un procedimiento de formulación de comprimidos convencional.
Ejemplo de Formulación 2: Formulación líquida
Compuesto de Fórmula 2 1000 mg CMC-Na 20 g Azúcar isomerizada 20 g Aroma de limón cantidad adecuada
Se añadió agua purificada para que el volumen de toda la solución fuera 1000 ml. Se mezclaron estos componentes según un procedimiento de formulación de líquidos convencional, se cargó en un frasco marrón y se esterilizó produciendo así la formulación líquida.
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-
imagen1
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