ES2629952T3 - Procedimiento para controlar el tamaño de nanoporos de estado sólido - Google Patents

Procedimiento para controlar el tamaño de nanoporos de estado sólido Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para aumentar de manera precisa el tamaño de un nanoporo formado en una membrana, que comprende: a) seleccionar un valor para un potencial eléctrico que induce un campo eléctrico en un nanoporo, siendo el campo eléctrico de más de 0,1 voltios por nanómetro; b) aplicar, durante un periodo de tiempo predeterminado, un potencial eléctrico del valor seleccionado, en todo el nanoporo dispuesto en una solución iónica, aplicando, por ello, un potencial elevado de agrandamiento; c) después del periodo de tiempo predeterminado, reducir el potencial eléctrico aplicado en todo el nanoporo hasta un valor menor que el valor seleccionado, aplicando, por ello, un potencial bajo de medición, siendo el potencial bajo de medición menor que el potencial elevado de agrandamiento; d) medir la corriente que fluye a través del nanoporo mientras se aplica el potencial eléctrico al valor reducido; y e) determinar el tamaño del nanoporo en función de la corriente medida.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para controlar el tamano de nanoporos de estado solido Campo
La presente divulgacion versa sobre una tecnica para adaptar el tamano de un nanoporo de estado solido usando campos electricos potentes.
Antecedentes
Los nanoporos biologicos y de estado solido proporcionan un medio de deteccion de analitos biomoleculares en el ambito de una sola molecula. Normalmente, los nanoporos individuales estan embebidos en membranas aislantes delgadas, que proporcionan el unico conducto para que una corriente ionica pase entre dos reservorios de lfquidos. Utilizando los principios de contadores Coulter de mayor escala, los experimentos con nanoporos relacionan cambios en la corriente ionica para determinar, la longitud, el tamano, la carga y la conformacion de biomoleculas cargadas cuando son conducidas electroforeticamente a traves de un nanoporo en presencia de un campo electrico externo.
Aunque los nanoporos biologicos tales como los de la a-hemolisina normalmente ofrecen mayor sensibilidad y propiedades de bajo ruido, la bicapa lipfdica de soporte es fragil y de tamano fijo, lo que limita la aplicabilidad de los mismos. Los nanoporos de estado solido, en cambio, son normalmente fabricados en membranas aislantes delgadas (10-50 nm), tales como membranas de nitruro de silicio o de oxido de silicio, y pueden ser fabricadas de diferentes tamanos, ser facilmente integradas con tecnologfas a escala de oblea, y son mas robustas, permitiendo una gama mas amplia de condiciones experimentales. A pesar de estas ventajas, las tecnologfas de nanoporos de estado solido adolecen de varios inconvenientes practicos que limitan su utilidad para estudios biomoleculares. Aunque el control del tamano de un nanoporo es posible, es normalmente caro y laborioso de lograr, requiriendo equipo especializado y personal experto. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que los nanoporos perforados mediante un haz enfocado de iones encogen en condiciones experimentales especfficas en un microscopio electronico de barrido (SEM). En otros planteamientos, los nanoporos perforados mediante microscopfa electronica de transmision (TEM) pueden expandirse o encoger dependiendo de las condiciones del haz y de la exposicion posterior a disolventes acuosos. En estos casos, la gama obtenible de tamanos de nanoporo es limitada, diffcil de controlar e incluso poco fiables, ya que el tamano del nanoporo puede cambiar tras un tratamiento qufmico o cuando es sumergido en un entorno lfquido particular.
El documento US 2012/0103821 A1 da a conocer pasos nanoflufdicos tales como nanocanales y nanoporos que se cierran y se abren de manera controlada a traves del uso de un sistema de informacion de retorno. Se desarrolla o se elimina una capa de oxido dentro de un paso en presencia de un electrolito hasta que el paso alcance las dimensiones seleccionadas o se cierre. Durante la fabricacion se mide el cambio de dimensiones del paso nanoflufdico. El nivel de la corriente ionica a traves del paso puede ser usado para determinar las dimensiones del paso. El flujo de fluido a traves de un conjunto de elementos flufdicos puede ser controlado mediante la oxidacion selectiva de los pasos flufdicos entre elementos.
La corriente ionica a traves de nanoporos de estado solido tambien puede adolecer de un grado elevado de ruido, las fuentes del cual son un tema intensamente investigado en la bibliograffa sobre nanoporos. Aunque se han propuesto diversos procedimientos para reducir el ruido electrico, la produccion de nanoporos estables fiables de bajo ruido normalmente sigue siendo normalmente muy baja. La deposicion de residuos carbonaceos durante la perforacion y la formacion de imagenes puede tener efectos perjudiciales en la calidad de las senales electricas, haciendo a menudo un reto de la completa humectacion y causando la formacion de nanoburbujas que pueden ser diffciles de eliminar. Ademas, la obstruccion del nanoporo por las moleculas de analitos degrada la calidad de las senales, haciendo los poros inutiles para un experimento ulterior. Estos efectos reducen muchfsimo la produccion de dispositivos de nanoporos funcionales y aumentan el coste asociado con la investigacion de nanoporos de estado solido. Asf, la fabricacion reproducible y la adaptacion de nanoporos fiables siguen siendo un reto no solo para el entorno de la investigacion academica, sino para la comercializacion de cualquier tecnologfa basada en nanoporos.
Esta seccion proporciona informacion de antecedentes relacionada con la presente divulgacion que no es necesariamente tecnica anterior.
Sumario
Esta seccion proporciona un sumario general de la divulgacion, y no es una divulgacion exhaustiva de todo su alcance ni de todas sus caracterfsticas.
Se proporciona un procedimiento para la adaptacion de un nanoporo formado en una membrana de estado solido. El procedimiento incluye: aplicar un potencial electrico en todo el nanoporo, teniendo el potencial electrico una forma de onda de impulsos que oscila entre un valor elevado y un valor bajo; medir que corriente que fluye a traves del
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nanoporo; determinar el tamano del nanoporo en funcion, en parte, de la corriente medida; y eliminar el potencial electrico aplicado en todo el nanoporo cuando el tamano del nanoporo corresponde a un tamano deseado.
En un aspecto de la divulgacion, la medicion de la corriente que fluye a traves del nanoporo se produce mientras el potencial electrico esta siendo aplicado con un valor elevado, mientras que, en otro aspecto, la medicion de la corriente que fluye a traves del nanoporo se produce mientras el potencial electrico esta siendo aplicado con un valor bajo.
En un aspecto de la divulgacion, el procedimiento esta definido, ademas, incluyendo: seleccionar un valor para un potencial electrico que induce un campo electrico en un nanoporo y aplicar el potencial electrico durante un periodo de tiempo predeterminado, siendo el campo electrico de aproximadamente 0,3 voltios por nanometro. Despues del periodo de tiempo predeterminado, el potencial electrico aplicado en todo el nanoporo es reducido hasta un valor menor que el valor seleccionado y la corriente que fluye a traves del nanoporo es medida mientras el potencial electrico es aplicado al valor reducido. El tamano del nanoporo se determina en funcion, en parte, de la corriente medida.
En algunos aspectos de la divulgacion, este procedimiento se repite hasta que la corriente medida supere un umbral. Cuando se reaplica un potencial electrico relativamente elevado, la polaridad del potencial electrico puede invertirse para lograr o mantener la simetrfa en la geometrfa de los poros. Una vez la corriente medida supera el umbral, se elimina el potencial electrico.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para aumentar con precision el tamano de un nanoporo formado en una membrana, que comprende: aplicar un potencial electrico en todo el nanoporo dispuesto en una solucion ionica, teniendo el potencial electrico una forma de onda de impulsos que oscila entre un valor elevado y un valor bajo; medir la corriente que fluye a traves de un nanoporo mientras el potencial electrico esta siendo aplicado en todo el nanoporo con un valor bajo; determinar el tamano del nanoporo en funcion, en parte, de la corriente medida; y eliminar el potencial electrico aplicado al nanoporo cuando el tamano del nanoporo corresponde a un tamano deseado. El procedimiento puede comprender seleccionar el valor elevado para el potencial electrico de modo que el campo electrico se encuentre en un intervalo de 0,1 voltios por nanometro a 0,4 voltios por nanometro. Ademas, el procedimiento puede comprender seleccionar el valor bajo para el potencial electrico de modo que el campo electrico sea inferior a 0,1 voltios por nanometro. El procedimiento, puede comprender determinar el tamano del nanoporo e incluye la comparacion de la corriente medida con un umbral y la eliminacion del potencial electrico en todo el nanoporo cuando la corriente medida supera el umbral. El procedimiento puede comprender alternar la polaridad de un valor elevado entre un valor positivo y un valor negativo por cada dos impulsos.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para aumentar con precision el tamano de un nanoporo formado en una membrana, que comprende: seleccionar un valor para un potencial electrico que induce un campo electrico en un nanoporo, siendo el campo electrico de mas de 0,1 voltios por nanometro; aplicar un potencial electrico del valor seleccionado en todo un nanoporo dispuesto en una solucion ionica; medir la corriente que fluye a traves del nanoporo mientras el potencial electrico es aplicado en todo el nanoporo; estimar el tamano del nanoporo en funcion, en parte, de la corriente medida; y eliminar el potencial electrico aplicado en todo el nanoporo cuando la corriente medida supera un umbral. El procedimiento puede comprender reducir el potencial electrico aplicado en todo el nanoporo hasta un valor menor que el valor seleccionado; medir la corriente que fluye a traves del nanoporo mientras el potencial electrico es aplicado con el valor reducido; y determinar el tamano del nanoporo en funcion, en parte, de la corriente medida mientras el potencial electrico es aplicado al valor reducido. El procedimiento puede comprender seleccionar el valor del potencial electrico de modo que el campo electrico sea de aproximadamente 0,3 voltios por nanometro. El procedimiento puede comprender seleccionar el potencial electrico de modo que el campo electrico se encuentre en un intervalo de 0,10 voltios por nanometro a 0,4 voltios por nanometro.
Se haran evidentes areas adicionales de aplicabilidad a partir de la descripcion proporcionada en la presente memoria. La descripcion y los ejemplos especfficos de este sumario estan pensados unicamente con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la presente divulgacion.
Dibujos
Los dibujos descritos en la presente memoria tienen unicamente fines ilustrativos de realizaciones seleccionadas y no de todas las implementaciones posibles, y no se pretende que limiten el alcance de la presente divulgacion.
La Figura 1 es un diagrama de flujo que representa una tecnica ejemplar para adaptar el tamano de un nanoporo;
la Figura 2 es un diagrama que representa una configuracion ejemplar para adaptar nanoporos;
las Figuras 3A y 3B son graficos que ilustran trazas de corriente antes y despues de la aplicacion de campos electricos potentes, respectivamente;
la Figura 4A es un grafico que ilustra la forma de onda de impulsos del potencial electrico aplicado en todo el nanoporo, y la corriente ionica creciente a traves del nanoporo, que indica crecimiento;
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la Figura 4B es un grafico que ilustra que la tasa de crecimiento puede ser controlada variando el potencial aplicado;
la Figura 4C es un grafico que ilustra que la tasa de crecimiento puede ser controlada variando la fuerza ionica de la solucion;
la Figura 5 es un grafico que ilustra las mediciones I-V de la conductancia, que confirman que los tamanos de nanoporo han aumentado;
la Figura 6 es un grafico que ilustra trazas de corriente asociadas con la translocacion de moleculas de ADN;
las Figuras 7A y 7B son histogramas del bloqueo de corriente durante los eventos de translocacion para poros de 11 nm y 32 nm, respectivamente; y
la Figura 8 es un grafico que ilustra la efectividad del agrandamiento de nanoporos en diferentes condiciones. En este caso, el grosor de la membrana fue de 10 nm.
Los numeros de referencia correspondientes indican partes correspondientes en la totalidad de las diversas vistas de los dibujos.
Descripcion detallada
Ahora se describiran mas completamente realizaciones ejemplares con referencia a los dibujos adjuntos.
La Figura 1 ilustra una tecnica ejemplar para adaptar el tamano de un nanoporo preformado en una membrana. Se usa la aplicacion de campos electricos potentes para agrandar con precision el tamano de los nanoporos mientras se garantiza un rendimiento optimo de bajo ruido. Se producen campos electricos potentes, segun se indica en 12, aplicando un potencial electrico en todo el nanoporo. El valor del potencial electrico es seleccionado para inducir un campo electrico que es de mas de 0,1 voltios por nanometro (normalmente entre 0,1 y 0,4 voltios por nanometro). Aunque en lo que antecede se proporcionan valores particulares, el campo electrico inducido variara dependiendo del material de la membrana y de otros factores, pero supera el intervalo ohmico del nanoporo que esta siendo acondicionado (normalmente de mas de 0,1 voltios por nanometro).
La exposicion prolongada a campos electricos potentes inicia la eliminacion del material de la membrana que constituye la pared del poro, lo que da como resultado un aumento en el diametro del nanoporo. Este aumento puede ser controlado de manera precisa adaptando la fuerza y la duracion del campo electrico. El potencial electrico relativamente elevado es aplicado en todo el nanoporo durante un periodo de tiempo predeterminado, segun se indica en 13. En una realizacion, el periodo de tiempo se encuentra en el intervalo de 100 milisegundos a 5 segundos. En otras realizaciones, el periodo de tiempo puede ser mucho menor (por ejemplo, algunos microsegundos) o mucho mayor (por ejemplo, algunos minutos). Despues de que finaliza el periodo de tiempo, el potencial electrico aplicado en todo el nanoporo es reducido, en 14, hasta un valor menor que el valor relativamente elevado. Por ejemplo, el potencial electrico puede ser reducido hasta un valor que induzca un campo electrico en el intervalo de cero a 0,1 voltios por nanometro.
Mientras el potencial electrico reducido es aplicado en todo el nanoporo, se mide la corriente que fluye a traves del nanoporo, en 15, correlacionandose la corriente medida con el tamano del nanoporo, segun se explica de forma adicional posteriormente. En algunas realizaciones, el potencial electrico es aplicado como una serie de impulsos con una medicion entre cada impulso. En otras realizaciones, la medicion de corriente sigue a un grupo de impulsos (por ejemplo, despues de cada n impulsos, siendo n mayor que 1).
En un planteamiento alternativo, la corriente que fluye a traves del nanoporo es medida mientras el potencial electrico aplicado permanece elevado. La corriente medida proporciona una estimacion menos precisa del tamano de un nanoporo, dado que el campo electrico esta por encima del intervalo ohmico del sistema de nanoporos. Asf, a medida que el tamano del nanoporo se aproxima al tamano deseado, el potencial electrico es aplicado en forma de impulsos, segun se ha descrito anteriormente, de modo que la corriente es medida con el potencial electrico reducido.
Cuando el tamano del nanoporo es equivalente a un tamano deseado, se elimina el potencial electrico aplicado al nanoporo. En una realizacion ejemplar, el tamano del nanoporo es determinado comparando, 16, la corriente medida con una corriente umbral, seleccionandose la corriente umbral para que se corresponda al tamano deseado. El potencial electrico se elimina en 17 cuando la corriente medida es igual al umbral o lo supera; si no, se repite entonces el proceso de aplicar un potencial elevado de agrandamiento seguido por un potencial menor de medicion hasta que se satisface la condicion. Mediante la aplicacion cfclica de impulsos de tension relativamente elevada, se produce una superficie de nanoporo limpia de bajo ruido ideal para estudios monomoleculares. Dado que las trazas de corriente se degradan en el curso de un experimento debido a la obstruccion del nanoporo al absorberse moleculas en la superficie del nanoporo, este procedimiento puede repetirse para recuperar dispositivo obstruidos que, en otro caso, habrfan sido descartados. Por ello, la produccion de nanoporos funcionales se ve aumentada adicionalmente por la capacidad de usar el mismo dispositivo multiples veces. Esta tecnica proporciona varias
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ventajas, ya que se lleva a cabo rapidamente en liquido en condiciones experimentales, requiere unicamente equipo estandar de laboratorio, puede ser automatizada con soporte logico y produce nanoporos funcionales de alta calidad con un rendimiento de mas del 95%.
Aunque membranas que tienen diferentes grosores se encuentran dentro del alcance de esta divulgacion, los nanoporos estudiados en esta divulgacion fueron perforados en membranas de nitruro de silicio de 30 nm o 10 nm de grosor. Tambien se encuentran dentro del alcance de esta divulgacion membranas que comprenden otros materiales dielectricos (por ejemplo, otros oxidos y nitruros), que son usados comunmente como materiales de puerta para transistores. Asimismo, las membranas pueden comprender otros materiales tales como el grafeno, el nitruro de boro y similares.
Aunque el protocolo aquf descrito puede ser aplicado a nanoporos de estado solido de diversos materiales fabricados usando cualquier procedimiento, comunmente son perforados mediante TEM usando protocolos establecidos previamente. Los nanoporos usados para los experimentos aquf descritos son perforados mediante TEM y normalmente estan entre 4 nm y 10 nm de diametro. Aunque se montaron y acondicionaron membranas tanto de 30 nm como de 10 nm de grosor usando el protocolo definido posteriormente, las polarizaciones de tension aquf descritas se refieren a las requeridas para membranas de 30 nm de grosor, a no ser que se indique otra cosa. Para membranas de grosores diferentes, la tension aplicada deberfa ser ajustada en consecuencia para generar un campo electrico en el intervalo de 0,1-0,4 voltios por nanometro (por encima del lfmite ohmico) dentro del nanoporo.
Una vez que un nanoporo existe en una membrana aislante, puede montarse directamente en la pila de liquido sin procesamiento ni limpieza adicionales. Sin embargo, si es necesario eliminar trazas de contaminantes entre experimentos, o en algunos casos de obstruccion severa, los chips con nanoporos pueden ser limpiados o usando solucion pirana (3:1 E^SC^f-hC^) o mediante exposicion a plasma de oxfgeno. Tambien se puede usar este procedimiento para eliminar cualquier contaminacion sobrante de los procesos de perforacion, formacion de imagenes y manipulacion que hacen la superficie del nanoporo hidrofila para contribuir a su humectacion o para eliminar una obstruccion particularmente persistente. No obstante, la mayorfa de dispositivos podrfa ser reacondicionada in situ tras una obstruccion, usando el procedimiento descrito en la presente memoria, reduciendo en consecuencia el tiempo de preparacion y la necesidad de manejar productos qufmicos fuertes.
La Figura 2 representa una configuracion ejemplar para adaptar nanoporos preformados en una membrana. La configuracion comprende generalmente una pila flufdica 22; un par de electrodos 24 (por ejemplo, Ag/AgCl) electricamente acoplados a un circuito amplificador 25 de corriente; y un controlador 26 interconectado con el circuito amplificador 25 de corriente. La pila flufdica 22 esta definida adicionalmente por dos reservorios 21 acoplados flufdicamente entre si mediante un paso, actuando el propio nanoporo como el unico conducto para la corriente ionica entre los dos reservorios. Los reservorios pueden ser llenados con una solucion acuosa (por ejemplo, una sal a base de cloruro), una solucion no acuosa (por ejemplo, LiCl en etanol) u otros tipos de soluciones ionicas.
El circuito amplificador 25 de corriente opera creando un potencial entre los electrodos y midiendo el flujo de corriente a traves del nanoporo. En algunas realizaciones, el controlador 26 puede ser implementado mediante un circuito 28 de adquisicion de datos acoplado a un ordenador personal 27 u otro tipo de dispositivo de calculo. Asf, la configuracion es similar a lo que se usa comunmente para la deteccion biomolecular. Esta divulgacion contempla otras configuraciones para adaptar un nanoporo.
En la configuracion ejemplar, se usa una pila nanoporosa 22 para alojar un chip 32 de silicio que, a su vez, aloja la membrana 30 que contiene un nanoporo. Un protocolo ejemplar para montar el chip 32 de silicio en la configuracion es como sigue. Limpiar la pila nanoporosa 22 poniendola en una solucion acida de acido nftrico al 20% e hirviendo durante 10 minutos. Extraer cuidadosamente la pila 22 del acido nftrico y ponerla en agua desionizada en ebullicion durante 10 minutos. Extraer la pila 22 y seguir hirviendo en agua desionizada nueva durante 10 minutos mas para garantizar la completa eliminacion del acido nftrico. Quitar el vaso de precipitados de la placa caliente y dejarlo enfriar hasta la temperatura ambiente. Extraer la pila 22 del vaso de precipitados y secar por soplado con aire filtrado o N2. Almacenar la pila 22 en una placa de Petri limpia. Desgasificar la solucion electrolftica filtrada tamponada poniendola al vacfo en un bano de ultrasonidos durante 30 minutos a 40°C. Aunque pueden usarse diversas soluciones salinas de diferentes pH para el acondicionamiento y agrandamiento del nanoporo, la mayorfa de los experimentos aquf descritos se lleva a cabo en una solucion 1 M KCl tamponada con HEPES a un pH 8. Limpiar dos juntas elastomericas de silicona para el chip 32 de silicio mediante ultrasonidos en etanol durante al menos 10 minutos. Colocar el chip 32 sobre una junta elastomerica limpia teniendo cuidado de alinear la ventana de la membrana con la abertura de la junta. Colocar y alinear una segunda junta encima del chip 32. Colocar el chip 32 y las juntas sobre la entrada del reservorio de una mitad de la pila nanoporosa 22 limpiada. Ensamblar la pila 22 atornillando la otra mitad en su sitio. Mojar el chip 32 echando en los reservorios de la pila etanol con una pipeta y poner en una camara de vacfo hasta que se vean algunas burbujas salir por las entradas. Eliminar el etanol lavando los reservorios con al menos 3 ml de una solucion electrolftica desgasificada filtrada. Tener cuidado de eliminar el rebose usando un aspirador. El chip 32 de silicio es montado entonces entre los dos reservorios 21 de la pila flufdica 22. Se entiende facilmente que una o mas de estas etapas pueden ser opcionales, dependiendo de las
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circunstancias. Ademas, tambien se encuentran dentro del alcance de esta divulgacion otras tecnicas para montar en la configuracion la membrana que contiene un nanoporo.
Opcionalmente, antes de su adaptacion, el nanoporo puede ser caracterizado. Para hacerlo, colocar la pila nanoporosa en la configuracion experimental 23 blindada electricamente y colocar los electrodos 24 en cada reservorio. Esta configuracion es similar a la mostrada en la Figura 2 con la excepcion de que el circuito amplificador y controlador de corriente es sustituido con un amplificador resistivo de bajo ruido de informacion de retorno (por ejemplo, un amplificador Axopatch 200B de fijacion de tension de Molecular Devices Inc.). Usando el amplificador en modo de fijacion de tension, aplicar potenciales que realizan un barrido de -200 mV a +200mV y registrar las caracterfsticas de I-V (corriente a tension). Ajustar la curva I-V para obtener la conductancia del nanoporo, que puede ser usada para calcular su diametro en solucion. Si el diametro calculado es mucho menor de lo esperado por la formacion de imagenes mediante TEM, es probable que el poro no se humecte completamente y/o contenga restos o contaminacion. Aplicar un potencial de 200 mV en todo el nanoporo y registrar la corriente ionica durante 30 segundos. Llevar a cabo un analisis de densidad espectral de la potencia (PSD), de la corriente ionica e integrar para cuantificar las caracterfsticas de ruido electrico del nanoporo. Si el ruido esta por encima de 15 pA RMS con un ancho de banda de 5 kHz, entonces es probable que el poro no este completamente humectado y/o que contenga contaminacion y no pueda ser usado de forma fiable en un experimento.
Si la curva I-V generada presentara asimetrfa o una conductancia menor de lo esperado, o si la traza de corriente mostrara inestabilidad y niveles de alto ruido a frecuencias bajas (<10 kHz), es necesario acondicionar el nanoporo con campos electricos potentes para eliminar cualquier contaminacion de la superficie del nanoporo y/o humectar el nanoporo. Aunque este procedimiento no afecta al ruido de alta frecuencia causado por la capacitancia de la membrana o por cualquier capacitancia parasita acoplada a la entrada del amplificador de corriente usado en las mediciones, puede reducirse muchfsimo el ruido de baja frecuencia (tambien denominado ruido 1/f). Se entiende facilmente que en algunos casos no se precisa tal acondicionamiento.
La Figura 2 es una configuracion ejemplar que puede ser usada para llevar a cabo este acondicionamiento. Para hacerlo, desconectar los electrodos del amplificador de fijacion de tension. Conectar uno de los electrodos a una fuente de alimentacion controlada por ordenador capaz de generar mas de 3 voltios (fuerza de campo electrico > 0,1 V/nm para las membranas de 30 nm de grosor aquf usadas) y el otro al circuito amplificador 25 de corriente que puede ser monitorizado en tiempo real. Aplicar una diferencia de potencial de 400 mV (tension de medicion) en todo el nanoporo durante al menos 5 segundos. Calcular el valor medio de la corriente del 1 segundo final de los datos para determinar la conductancia del nanoporo. Calcular el diametro del nanoporo en funcion de esta conductancia, que puede hacerse automaticamente usando un soporte logico implementado por el controlador 26 y el modelo de eleccion de conductancia del nanoporo en funcion de la geometrfa mas probable. Deberfa corresponder al diametro medido en la curva I-V. Aplicar un impulso de 200 ms de 6 voltios (tension de humectacion) en todo el nanoporo para producir un campo electrico de 0,2 V/nm seguido por un periodo de medicion de 5 segundos a 400 mV. Calcular de nuevo el diametro del nanoporo usando el 1 segundo final de los datos y comparar con el valor previsto a partir de las mediciones TEM para garantizar que el nanoporo esta completamente mojado. Alternativamente, en esta etapa se puede realizar un aumento en rampa de la tension de -200 mV a +200 mV y el ajuste de una curva de I-V segun se ha descrito anteriormente para proporcionar una estimacion mas precisa de la conductancia y, asf, del tamano del nanoporo. Este procedimiento de aplicacion de impulsos de campos electricos potentes con tension creciente puede repetirse hasta que la senal de corriente durante el periodo de medicion sea estable y muestre la conductancia esperada. No se recomienda superar los 10 voltios (es decir, >0.3 V/nm) en esta etapa, ya que esto puede agrandar o danar el nanoporo rapida y/o incontrolablemente.
El diametro del nanoporo es crucial para determinar su funcionalidad para una aplicacion particular de deteccion biomolecular. Con este fin, un nanoporo preformado puede ser agrandado hasta un tamano deseado aplicando campos electricos potentes hasta que se logre el diametro apropiado con la misma configuracion usada para limpiar y humectar el nanoporo (es decir, la Figura 2). Usando la misma configuracion, aplicar una polarizacion de 200-500 mV en todo el poro para obtener la medicion del diametro. Aunque menos preciso que ajustar una curva de I-V, puede usarse una medicion de un solo punto para estimar aproximadamente el tamano de un nanoporo rapidamente.
Se aplica un potencial electrico que tiene una forma de onda de impulsos en todo el nanoporo (por ejemplo, un impulso de 2 segundos de 8 voltios en todo el nanoporo seguido por un periodo de medicion de aproximadamente 5 segundos a 400 mV). Normalmente, el calculo del nuevo diametro mostrara un aumento muy pequeno en el tamano de un nanoporo (es decir, < 0,1 nm). Repetir este proceso de forma cfclica, alternando entre tensiones de agrandamiento y de medicion para obtener mediciones in situ y en tiempo real del diametro creciente del nanoporo. Si resulta deseable una tasa de crecimiento mas rapida, la magnitud de la tension aplicada puede aumentar de forma incremental hasta 10 voltios. Normalmente, el crecimiento se acelerara a medida que se agrande el poro, oscilando la tasa de aumento en la conductancia de 0,03 nSs-1 a 10 nSs-1, dependiendo del tamano del nanoporo, de la fuerza del campo electrico y de las propiedades de la solucion electrolftica. Por ello, tambien se puede hacer que varfen la fuerza ionica y el pH de la solucion electrolftica para controlar la tasa de crecimiento del nanoporo.
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Cuando se alcanza el diametro deseado, detener la aplicacion de campos electricos potentes. Esta tecnica de adaptacion puede ser implementada automaticamente usando un programa informatico implementado por el controlador 26. Reconectar el amplificador de fijacion de tension a los electrodos. Obtener nuevos datos de trazas de I-V y de corriente de bajo ruido a 200 mV para confirmar el diametro del nanoporo y verificar las senales de corriente de bajo ruido como en las etapas destacadas anteriormente. Si es necesario, repetir el protocolo de acondicionamiento y agrandamiento.
La Figura 3A muestra dos trazas tfpicas de corriente ionica de un nanoporo de 10 nm en una membrana de 30 nm de grosor antes y despues del tratamiento con campos electricos potentes. Tras montar un nanoporo recien perforado, la probabilidad de obtener una senal de una corriente ionica inestable y ruidosa, que presente un alto grado de fluctuacion de baja frecuencia, suele ser alta. El nanoporo mostrado en la Figura 3A destaca este comportamiento. Su conductancia es considerablemente menor de la esperada para un nanoporo de su tamano, debiendose con suma probabilidad a una humectacion incompleta. Tras la aplicacion de campos electricos potentes de 0,27 V/nm en magnitud producidos por impulsos de 8 V (90 impulsos de 2 segundos de duracion), el nanoporo se humecta por completo. Subsiguientemente es agrandado hasta 21 nm de diametro. En este punto, el poro presenta una conductancia estable con propiedades de bajo ruido. El analisis cuantitativo del ruido en nanoporos similares es mostrado en la Figura 3B como trazas de densidad espectral de potencia. La amplitud del ruido de baja frecuencia de los poros no mojados y/u obstruidos es muy elevada (>20 pA RMS para un ancho de banda de 5 kHz), lo que los hace inutilizables en el experimento. Tras el acondicionamiento con campos electricos potentes, la potencia del ruido a bajas frecuencias (<10 kHz) disminuye en hasta 3 ordenes de magnitud y esta lista para experimentos de bajo ruido.
La Figura 4A muestra una medicion tfpica de corriente cuando el potencial aplicado experimenta impulsos entre campos electricos potentes para periodos de agrandamiento y de medicion con campos electricos bajos. En esta realizacion ejemplar, el potencial se aplicado como una serie de ondas cuadradas. En algunas realizaciones, el potencial electrico para un impulso dado puede aumentar o disminuir en rampa (por ejemplo, de forma lineal, exponencial, gradual, etc.) hasta o desde un valor pico. En otras realizaciones, el potencial electrico puede variar en el valor pico (por ejemplo, una forma sinusoidal). La presente divulgacion contempla otros tipos de formas de onda para aplicar el potencial electrico.
Despues de cada impulso subsiguiente, la corriente ionica resultante a traves del nanoporo a la tension de medicion (es decir, la conductancia del nanoporo) aumenta una cantidad finita. Esto demuestra que el nanoporo ha aumentado de tamano, ya que el diametro d puede ser inferido de su conductancia G en una solucion de conductividad a, aproximandose al nanoporo que tiene una geometrfa cilfndrica de longitud efectiva W Aunque existen diversos modelos adicionales para relacionar la conductancia del nanoporo con su geometrfa, la siguiente relacion ha sido validada para nanoporos perforados mediante TEM, en altas concentraciones salinas, en una amplia gama de diametros de interes para la translocacion biomolecular.
G = <T
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nd2
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Una vez que se alcanza el diametro deseado, el proceso es detenido automaticamente por el soporte logico. El diametro del nanoporo resultante puede ser entonces confirmado usando mediciones precisas de I-V, segun se muestra en la Figura 5. Es importante hacer notar que los nanoporos tratados usando campos electricos potentes son plenamente funcionales.
En un aspecto de esta divulgacion, la polaridad del potencial electrico puede ser invertida para impulsos alternantes para lograr o mantener la simetrfa en la geometrfa del poro. Ademas, el periodo de medicion puede ser extendido o modificado para llevar a cabo una medicion de I-V in situ para obtener tamanos de nanoporo o propiedades de ruido mas precisos.
Diversos factores pueden afectar a la tasa de crecimiento del nanoporo. Por ejemplo, aumentar la magnitud de la tension aplicada puede incrementar la tasa de crecimiento del nanoporo, segun se muestra en la Figura 4B. Variar la fuerza ionica de la solucion ionica tambien puede incrementar la tasa de crecimiento del nanoporo, segun se muestra en la Figura 4C. Otros factores que afectan a la tasa de crecimiento incluyen, sin limitacion, la temperatura, el pH de la solucion ionica, las especies de sal de la solucion, etc.
El tratamiento usando campos electricos potentes prepara a los nanoporos de estado solido para experimentos biomoleculares al proporcionar la capacidad de controlar con precision el tamano del nanoporo mientras se garantiza un ruido mfnimo en las mediciones de la corriente ionica. Este planteamiento es validado, ademas, llevando a cabo experimentos de translocacion biomolecular en ADN A (bicatenario de 48,5 kbp). Se efectua un experimento de control adquiriendo trazas de corriente bajo un potencial aplicado de +150 a +300 mV en ausencia de ninguna muestra para verificar que no se detecta ningun bloqueo de corriente despues de 2 minutos. Anadir ADN al reservorio cis para alcanzar una concentracion final de 0,5-5 ng/pL. Someter a reflujo suavemente por pipeta durante al menos 10 segundos para garantizar una distribucion homogenea de la muestra en todo el reservorio. Para un nanoporo de 30 nm de grosor, aplicar una polarizacion de potencial de +150 a +300 mV al reservorio trans y medir la
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corriente ionica que pasa a traves del nanoporo. Para eventos de translocacion muy cortos, es deseable tomar muestras a alta frecuencia (250 kHz o mayor) con una frecuencia de filtrado de paso bajo relativamente alta (100 kHz). Monitorizar la corriente ionica usando un soporte logico para detectar bloqueos transitorios de corriente mientras las moleculas se translocan a traves del nanoporo. Las trazas de la corriente ionica de la translocacion molecular pueden ser analizadas para determinar la profundidad, la duracion y la frecuencia de los bloqueos para inferir informacion sobre la muestra de interes. En cambio, si se conoce la informacion sobre las moleculas que se translocan, estos datos pueden ser usados para investigar propiedades del propio nanoporo.
La Figura 6 muestra trazas de corriente asociadas con la translocacion de moleculas de ADN A. En esta figura, se hace pasar ADNbc a traves de dos nanoporos que fueron agrandados hasta 11 nm y 32 nm usando el procedimiento descrito anteriormente. En cada caso, la corriente de referencia es sumamente estable y se observan claros bloqueos de corriente cuando las moleculas de ADNbc se translocan a traves del nanoporo, presentando eventos de translocacion monomoleculares con relacion elevada de senal-ruido. Segun se muestra en las pautas de la Figura 6, se observan multiples niveles discontinuos de bloqueo cuando se translocan moleculas individuales plegadas, como se espera para nanoporos de estos tamanos. En las Figuras 7A y 7B se muestran histogramas de la amplitud de los bloqueos de corriente durante eventos de translocacion a traves de cada poro. Las propiedades de bajo ruido de los nanoporos revelan picos diferenciados facilmente resolubles correspondientes a la referencia (sin ADN), estados de bloqueo simple (una cadena de ADN, no plegada) y doble (dos cadenas de ADN, plegadas). Cabe hacer notar el hecho de que el bloqueo absoluto de corriente correspondiente a una sola molecula de ADNbc que ocupe el poro es diferente para los nanoporos grandes y los pequenos. Esto proporciona evidencia indirecta de que la aplicacion de campos electricos potentes agranda, de hecho, los nanoporos existentes, ya que se observarfa la misma amplitud de bloqueo de la corriente si durante el proceso se estuvieran creando en la membrana otros poros u otras grietas.
De modo similar, la Figura 8 ilustra la efectividad de los campos electricos potentes para agrandar nanoporos fabricados en membranas de diferentes grosores. Aquf se agranda un nanoporo creado en una membrana de SiNx de 10 nm. Tras la aplicacion de impulsos alternantes de ±3 V (±0,3 voltios por nanometro) de 4 segundos de duracion (30 en total), el nanoporo se moja y presenta caracterfsticas ideales de I-V para un poro de 3 nanometros. A continuacion, la metodologfa se repitio para 400 impulsos subsiguientes y el nanoporo fue agrandado hasta 8 nanometros. Este agrandamiento, llevado a cabo con campos electricos comparables pero menor polarizacion de la tension aplicada que para los nanoporos fabricados en membranas de 30 nm, muestra que el proceso funciona, en parte, por los campos electricos. Dado que el bloqueo de la corriente producido por la translocacion a traves de una membrana mas delgada es mayor que el producido en poros mas gruesos, los nanoporos en membranas delgadas tratados de esta manera pueden ser usados para estudiar con mayor sensibilidad moleculas mas cortas, tales como protefnas.
El control de tamano de un nanoporo es de importancia fundamental en aplicaciones de deteccion biomolecular. Los diametros de los nanoporos deben ser del orden del tamano de las moleculas objeto de sondeo; deben ser lo bastante grandes para acomodar la muestra, pero lo bastante pequenos para lograr una relacion senal-ruido optima. aunque el control de tamano usando el procedimiento presentado de aplicacion de campos electricos potentes es unidireccional, porque los diametros de los nanoporos solo son aumentados en el proceso, pueden crearse nanoporos con diametros entre 3-100 nm con precision subnanometrica. Dado que poros de 3-4 nm pueden ser fabricados facilmente usando TEM u otros procedimientos, esto permite la fabricacion fiable de nanoporos de estado solido para una amplia gama de aplicaciones, desde el sondeo de una estructura de ADNmc hasta la interaccion de complejos voluminosos de protefna-ligando. Aunque el crecimiento de nanoporos por encima de 100 nm puede ser mas rapido y menos preciso, pueden emplearse condiciones de agrandamiento mas moderadas para lograr un mejor control en el proceso. Como tal, la etapa mas importante para lograr un control efectivo del tamano es la eleccion de la intensidad y la duracion de los impulsos para equilibrar la eficacia del agrandamiento y el nivel de precision requerido para lograr un diametro deseado de poro. Dependiendo del tamano final, generalmente es posible agrandar un nanoporo hasta diametros inferiores a 100 nm en unos minutos.
De modo similar, las grandes fluctuaciones de corrientes de baja frecuencia excluyen los estudios monomoleculares, ya que es casi imposible diferenciar las senales de translocacion del ruido de fondo. La humectacion incompleta, la presencia de residuos carbonaceos que queden tras la fabricacion inicial y la adsorcion de restos en la pared del nanoporo pueden degradar la calidad de las senales, requiriendo una limpieza adicional con tratamientos qufmicos fuertes que a menudo son ineficaces. Curiosamente, es comun que los protocolos de nanoporos de estado solido recalquen la importancia de limpiar el nanoporo antes del montaje para contribuir a la humectacion, y la solucion sugerida para los intentos fallidos es llevar a cabo una limpieza adicional con solucion pirana o plasma, lo que puede llevar muchfsimo tiempo. Con la aplicacion de campos electricos potentes, estos prolongados protocolos pueden no ser necesarios, dependiendo del experimento que haya de llevarse a cabo, y la etapa mas importante para mitigar el ruido electrico es un simple aumento en la tension y/o la duracion de los impulsos para mojar completamente el poro y eliminar los restos sueltos. Los nanoporos tratados de esta manera pueden ser usados de forma fiable en experimentos de translocacion de biomoleculas, tales como el paso de ADN y protefnas. Si estas moleculas se adhieren a la pared del poro, llevando a una senal electrica obstruida y ruidosa, pueden volver a aplicarse impulsos de campos electricos potentes para eliminar la obstruccion y recuperar las propiedades de bajo ruido para la experimentacion ulterior, sin desmontar el chip del nanoporo de la pila flufdica.
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La aplicacion de campos electricos potentes usando la configuracion descrita esta actualmente limitada por el requisito de una fuente de alimentacion externa que pueda aplicar hasta 10 V y de un amplificador de corriente, que carecen de la sensibilidad y de las propiedades de bajo ruido con un ancho de banda elevado (>1kHz) para la deteccion de una sola molecula. Aunque los experimentos biomoleculares normales se valen de un amplificador de corriente de bajo ruido que esta limitado a ±1 V (tal como el Axopatch 200B), es sencillo disenar un solo sistema que pudiera lograr tanto un acondicionamiento de campos electricos potentes como una medicion sensible de corriente con una ganancia ajustable. A pesar de esta limitacion, la transicion de una configuracion a la otra es rapida y sencilla. En comparacion con las tecnicas existentes para controlar el tamano de un nanoporo, tales como el uso de SEM, oxidacion termica y reformacion de la membrana, los campos electricos potentes ofrecen una metodologfa mas rapida, mas precisa y menos costosa que puede ser llevada a cabo en el banco de laboratorio usando equipo estandar y proporcionar un intervalo mas amplio de tamanos de nanoporo. Ademas, el procedimiento se lleva a cabo in situ en condiciones experimentales, mejorando la fiabilidad y la precision del control del tamano de un nanoporo. Ademas, la capacidad de reducir de forma rapida y reproducible el ruido de baja frecuencia y de agrandar subsiguientemente un nanoporo hasta un tamano deseado, tambien hacen mas fiable la preparacion de nanoporos y prolongan la vida de los nanoporos de estado solido, ya que los poros usados previamente pueden ser rejuvenecidos y reacondicionados para experimentos ulteriores. Mas del 95% de los nanoporos de distintos grosores acondicionados con campos electricos potentes en el laboratorio de los inventores presento muy poca caracterfstica de ruido de baja frecuencia, haciendolos adecuados para la deteccion biomolecular. Estos procedimientos permiten que los experimentos sean mas accesibles para los investigadores y potencialmente permiten una via hacia la comercializacion de tecnologfas de nanoporo a traves de procesos de fabricacion mas robustos.
Las tecnicas descritas en la presente memoria pueden ser implementadas por medio de uno o mas programas informaticos ejecutados por uno o mas procesadores. Los programas informaticos incluyen instrucciones ejecutables por procesador que estan almacenadas en un soporte tangible no transitorio legible por ordenador. Los programas informaticos tambien pueden incluir datos almacenados. Ejemplos no limitantes del soporte tangible no transitorio legible por ordenador son la memoria no volatil, el almacenamiento magnetico y el almacenamiento optico.
Algunas porciones de la anterior descripcion presentan las tecnicas descritas en la presente memoria en terminos de algoritmos y representaciones simbolicas de operaciones sobre informacion. Estas descripciones algorftmicas y estas representaciones son los medios usados por los expertos en las tecnicas de procesamiento de datos para transmitir con la maxima efectividad la sustancia de su trabajo a otros expertos en la tecnica. Se entiende que estas operaciones, aunque descritas funcional o logicamente, son implementadas por programas informaticos. Ademas, tambien ha resultado conveniente en ocasiones referirse a estas disposiciones de operaciones como modulos o mediante nombres funcionales, sin perdida de generalidad.
A no ser que se afirme especfficamente algo distinto, como es evidente por la anterior exposicion, se aprecia que en toda la descripcion, las explicaciones que utilicen terminos tales como “procesamiento” o “calculo” o “calcular” o “determinar” o “mostrar” o similares, se refieren a la accion y los procesos de un sistema informatico o un dispositivo de calculo electronico similar, que manipule y transforme los datos representados como cantidades ffsicas (electronicas) dentro de las memorias y los registros de un sistema informatico, u otros dispositivos de almacenamiento, transmision o visualizacion de informacion de ese tipo.
Ciertos aspectos de las tecnicas descritas incluyen etapas de procedimientos e instrucciones descritas en la presente memoria en la forma de un algoritmo. Deberfa hacerse notar que las etapas y las instrucciones de procedimiento descritas podrfan ser implementadas en soporte logico, en soporte logico inalterable o en soporte fisico, y que, cuando estan implementadas en soporte logico, podrfan ser descargadas para que residieran en diferentes plataformas usadas por sistemas operativos de red en tiempo real y fueran operadas desde las mismas.
La presente divulgacion tambien versa sobre un aparato para llevar a cabo las operaciones de la presente memoria. Este aparato puede ser construido especialmente para los fines requeridos, o puede comprender un ordenador de uso general activado selectivamente o reconfigurado por un programa informatico almacenado en un soporte legible por ordenador al que el ordenador puede acceder. Tal programa informatico puede ser almacenado en un soporte tangible de almacenamiento legible por ordenador, tal como, sin limitacion, cualquier tipo de disco, incluyendo disquetes, discos opticos, CD-ROM, discos magneto-opticos, memorias de solo lectura (ROM), memorias de acceso aleatorio (RAM), EPROM, EEPROM, tarjetas magneticas u opticas, circuitos integrados para aplicaciones especfficas (ASIC) o cualquier tipo de soporte adecuado para almacenar instrucciones electronicas, y cada uno acoplado a un bus de un sistema informatico. Ademas, los ordenadores a los que se alude en la memoria pueden incluir un solo procesador o tener arquitecturas que empleen disenos de procesadores multiples para una mayor capacidad de calculo.
La anterior descripcion de las realizaciones ha sido proporcionada con fines de ilustracion y de descripcion. No se pretende que sea exhaustiva ni que limite la divulgacion. Los elementos o caracterfsticas individuales de una realizacion particular generalmente no estan limitados a esa realizacion particular, sino que, cuando sean aplicables, son intercambiables y pueden ser usados en una realizacion seleccionada, aunque no sean mostrados o descritos especfficamente. Los mismos tambien pueden ser variados de muchas maneras. No se ha de considerar que tales
variaciones sean un alejamiento de la divulgacion, y se pretende que todas las modificaciones de ese tipo esten incluidas dentro del alcance de la divulgacion.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para aumentar de manera precisa el tamano de un nanoporo formado en una membrana, que comprende:
    a) seleccionar un valor para un potencial electrico que induce un campo electrico en un nanoporo, siendo el campo electrico de mas de 0,1 voltios por nanometro;
    b) aplicar, durante un periodo de tiempo predeterminado, un potencial electrico del valor seleccionado, en todo el nanoporo dispuesto en una solucion ionica, aplicando, por ello, un potencial elevado de agrandamiento;
    c) despues del periodo de tiempo predeterminado, reducir el potencial electrico aplicado en todo el nanoporo hasta un valor menor que el valor seleccionado, aplicando, por ello, un potencial bajo de medicion, siendo el potencial bajo de medicion menor que el potencial elevado de agrandamiento;
    d) medir la corriente que fluye a traves del nanoporo mientras se aplica el potencial electrico al valor reducido; y
    e) determinar el tamano del nanoporo en funcion de la corriente medida.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la determinacion del tamano del nanoporo comprende, ademas, eliminar el potencial electrico aplicado en todo el nanoporo cuando la corriente medida es igual o mayor que una corriente umbral seleccionada para que se corresponda con un tamano deseado de nanoporo.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1 que, ademas, comprende:
    f) aumentar el potencial electrico aplicado en todo el nanoporo hasta el valor seleccionado cuando la corriente medida es menor que una corriente umbral seleccionada para que se corresponda con un tamano deseado de nanoporo, y
    g) repetir las etapas (b) - (f) hasta que la corriente medida sea igual o mayor que el umbral.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la seleccion del valor para el potencial electrico comprende, ademas, seleccionar el valor del potencial electrico de modo que el campo electrico sea aproximadamente 0,3 voltios por nanometro.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la seleccion del valor para el potencial electrico comprende, ademas, seleccionar el valor del potencial electrico de modo que el campo electrico se encuentre en un intervalo de 0,10 voltios por nanometro a 0,4 voltios por nanometro.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1 que, ademas, comprende aplicar el potencial electrico al valor reducido durante un periodo de tiempo que permite que la corriente ionica ohmica se estabilice.
  7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 2 en el que la determinacion del tamano del nanoporo comprende, ademas, reaplicar el potencial electrico del valor seleccionado en todo el nanoporo cuando la corriente medida es menor que la corriente umbral, en la que la polaridad del potencial electrico se invierte.
  8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la aplicacion del potencial electrico comprende, ademas, aumentar el valor del potencial elevado de agrandamiento para aumentar la tasa de crecimiento del nanoporo.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la aplicacion del potencial electrico comprende, ademas, aumentar la fuerza ionica de la solucion ionica para aumentar la tasa de crecimiento del nanoporo.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 1 que, ademas, comprende aplicar el potencial electrico como una forma de onda de impulsos que oscila entre el potencial elevado de agrandamiento y el potencial bajo de medicion, produciendose la medicion de la corriente que fluye a traves del nanoporo mientras se esta aplicando el potencial bajo de medicion.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 9 en el que la aplicacion del potencial electrico comprende, ademas, alternar la polaridad del potencial electrico entre un valor positivo y un valor negativo por cada dos impulsos.
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