ES2623932T3 - Producción de ácido succínico por fermentación a bajo pH - Google Patents

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Abstract

El procedimiento para la preparación de ácido succínico, que comprende fermentar una levadura en presencia de un sustrato que contiene carbohidratos y bajas cantidades de oxígeno a un valor de pH que está por debajo del pKa más bajo de ácido succínico, en el que el oxígeno se suministra a una tasa de absorción de oxígeno específica que oscila entre 8 y 0,2 mmoles de oxígeno/g de peso seco de biomasa/hora.

Description

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DESCRIPCION
Produccion de acido succmico por fermentacion a bajo pH.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de acido succmico. En particular, se refiere a la produccion de acido succmico por fermentacion de una levadura.
Antecedentes de la invencion
Los acidos dicarboxflicos, tales como acido fumarico y acido succmico, son compuestos importantes que se usan en la industria alimentaria para la preparacion y conservacion de los alimentos, en la industria medica para la formulacion de productos medicos y otros usos industriales, tales como monomeros para (bio)polfmeros. Para satisfacer la creciente necesidad de acidos dicarboxflicos, se estan desarrollando metodos de produccion mas eficaces y mas rentables. Tradicionalmente, los acidos dicarboxflicos se preparan por fermentacion de bacterias, lo que puede producir grandes cantidades de acidos dicarboxflicos. Esto se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.573.931 que describe un metodo para producir acido succmico en altas concentraciones empleando una cepa bacteriana. Sin embargo, una desventaja principal asociada al uso de bacterias para producir acidos dicarboxflicos es la formacion de sal de acido dicarboxflico. Si se usan bacterias, se requiere que se mantenga el pH durante la fermentacion en el intervalo de pH 6-7, que es mayor que los valores de pKa de todos los acidos dicarboxflicos. Como consecuencia, la mayona de los acidos se producira en su forma de sal y se tendran que convertir las sales en el acido. Esto no es practico o eficaz en procedimientos de produccion a gran escala y eleva los costes de produccion. Tambien se han empleado microorganismos distintos de bacterias para la produccion de acidos organicos. La patente europea EP 0 424 384 describe un procedimiento aerobio para la produccion de acidos organicos por Rhizopus en un medio que contiene carbonato de calcio. La patente europea EP 1 183 385 describe celulas de levaduras geneticamente manipuladas con un fenotipo Crabtree negativo y conteniendo una molecula acida de nucleo exogeno para la produccion de acido lactico. La patente internacional WO 2009011974 se centra en el logro genetico de celulas fungicas recombinantes para la produccion de acidos dicarboxflicos C4 tales como acido fumarico, acido malico, acido succmico y acido tartarico.
Descripcion detallada
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de acido succmico. El procedimiento comprende fermentar una levadura en presencia de un sustrato que contiene carbohidratos y bajas cantidades de oxfgeno a un valor de pH que esta por debajo del pKa de acido succmico, en el que el oxfgeno se suministra a una tasa de absorcion de oxfgeno espedfica que oscila entre 8 y 0,2 mmoles/g de peso seco de biomasa/hora.
El procedimiento de la presente invencion permite altos rendimientos del producto de acido succmico, permite un tratamiento aguas abajo mas simple y es mas rentable que los procedimientos existentes en los que se produce la sal que despues se tiene que convertir en el acido. Puesto que el acido succmico presenta mas de un valor de pKa, el pH debena estar por debajo del pKa mas bajo del acido succmico. El pH estara tfpicamente en el intervalo de pH 2,0 y pH 4,0. En una realizacion, el acido succmico se produce a un valor de pH de 3,0. Otra ventaja es que debido al bajo pH el riesgo de contaminacion se reduce.
La fase de produccion de acido va precedida preferiblemente por una fase de formacion de biomasa para la produccion optima de biomasa. En la fase de formacion de biomasa el pH esta en el intervalo de pH 2 a pH 7. Preferiblemente, el pH esta en el intervalo de pH 3 a pH 6, mas preferiblemente, el pH esta en el intervalo de pH 4 a pH 5.
El procedimiento segun la presente invencion es mas rentable y puede conducir a un precio de coste un 30% inferior. Una de las razones es que los costes de valoracion se reducen significativamente.
La levadura que se usa en el procedimiento puede ser cualquier levadura adecuada. Ejemplos adecuados de levaduras incluyen: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia y Yarrowia, tales como especies de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyvermoces lactis, Candida sonorensis, Pichia stipidis y Yarrowia lipolytica. En una realizacion, el microorganismo eucariota usado en el procedimiento es un Saccharomyces cerevisiae, un microorganismo que es un microorganismo industrialmente interesante usado extensamente.
En una realizacion preferida, la levadura en el procedimiento segun la presente invencion, es una levadura geneticamente modificada. Como se usa en la presente memoria, una levadura geneticamente modificada en el procedimiento segun la presente invencion, se define como una celula de levadura que contiene, o se transforma o se modifica de manera genetica con, una secuencia de nucleotidos o polipeptido que no se encuentra en la naturaleza en la celula de la levadura o contiene copia o copias adicionales de una secuencia de acidos nucleicos endogenos. Una celula de levadura natural se define en la presente memoria como la celula parenteral de la celula recombinante.
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Preferiblemente, la levadura en el procedimiento segun la presente invencion es una levadura modificada de manera genetica que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una enzima heterologa seleccionada del grupo que consiste en una fosfoenolpiruvato carboxicinasa, fumarato reductasa y una fumarasa. Las realizaciones preferidas de las enzimas heterologas son como se definen en la presente memoria a continuacion.
El termino "homologo" cuando se usa para indicar la relacion entre una determinada molecula de acido nucleico (recombinante) o polipeptido y un determinado organismo huesped o celula huesped, se entiende que significa que por naturaleza la molecula de acido nucleico o de polipeptido es producida por una celula huesped u organismos de la misma especie, preferiblemente de la misma variedad o cepa.
El termino "heterologo" cuando se usa con respecto a un acido nucleico (ADN o ARN) o protema se refiere a un acido nucleico o protema que no se encuentra en la naturaleza como parte del organismo, celula, genoma o secuencia de ADN o ARN en la que esta presente o que se encuentra en una celula o posicion o posiciones en el genoma o secuencia de ADN o ARN que difiere de aquella en la que se encuentra en la naturaleza. Los acidos nucleicos o protemas, heterologos, no son endogenos a la celula en la que se introducen, pero han sido obtenidos a partir de otra celula o se han producido de manera sintetica o de manera recombinante.
Preferiblemente, la levadura geneticamente modificada comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una fosfoenolpiruvato carboxicinasa. La FEP carboxicinasa (EC 4.1.1.49) es preferiblemente una enzima heterologa, preferiblemente procedente de bacterias, mas preferiblemente la enzima con la actividad de la FEP carboxicinasa procede de Escherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp., o Anaerobiospirillum sp., mas preferiblemente Mannheimia succiniciproducens o Actinobacillus succinogenes. En una realizacion, la FEP carboxicinasa procede de Actinobacillus succinogenes (PCKa), en la que el PCKa ha sido modificado preferiblemente para reemplazar EGY en la posicion 120-122 con una secuencia de aminoacidos DAF. Preferiblemente, una celula de levadura en el procedimiento segun la presente invencion se modifica de manera genetica con una FEP carboxicinasa que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 99 o 100% de identidad de secuencias con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N° 6.
En otra realizacion preferida, una levadura geneticamente modificada en el procedimiento segun la presente invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una fumarato reductasa. Preferiblemente, la fumarato reductasa es una enzima heterologa, preferiblemente una fumarato reductasa dependiente de NAD(H), que puede proceder de cualquier origen adecuado, por ejemplo, bacterias, hongos, protozoos o plantas. Preferiblemente, una levadura en el procedimiento segun la invencion comprende una fumarato reductasa dependiente de NAD(H) heterologa, preferiblemente procedente de una Trypanosoma sp., por ejemplo, una Trypanosoma brucei. En una realizacion preferida, la secuencia de nucleotidos que codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD(H) se expresa en el citosol. En el caso de que la secuencia de nucleotidos que codifica una fumarato reductasa dependiente de NAD(H) comprenda una senal de localizacion peroxisomal o mitocondrial, puede ser esencial modificar o suprimir una serie de aminoacidos (y correspondientes secuencias de nucleotidos en la secuencia de nucleotidos codificadora) para evitar la localizacion peroxisomal o mitocondrial de la enzima. La presencia de una senal de localizacion peroxisomal puede determinarse, por ejemplo, por el metodo descrito por Schluter et al, Nucleic acid Research 2.007, 35, D815-D822. Preferiblemente, una celula de levadura en el procedimiento segun la presente invencion se modifica de manera genetica con una fumarato reductasa dependiente de NAD(H), que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 99 o 100% de identidad de secuencias con la SEC ID N° 7.
En otra realizacion preferida, una levadura geneticamente modificada en el procedimiento segun la presente invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una fumarasa, que puede ser una enzima heterologa u homologa. Una secuencia de nucleotidos que codifique una fumarasa heterologa puede proceder de cualquier origen adecuado, preferiblemente de origen microbiano, preferiblemente de una levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o un hongo filamentoso, por ejemplo, Rhizopus oryzae. Preferiblemente, una levadura en el procedimiento segun la presente invencion sobreexpresa una secuencia de nucleotidos codificadora de una fumarasa que presenta al menos 70%, preferiblemente al menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% o 100% de identidad de secuencias con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N° 8.
En otra realizacion preferida, una levadura geneticamente modificada en el procedimiento segun la presente invencion comprende ademas una secuencia de nucleotidos que codifica una malato deshidrogenasa (MDH), que es activa en el citosol en la expresion de la secuencia de nucleotidos. Preferiblemente, la MDH carece de senal de localizacion peroxisomal o mitocondrial para localizar la enzima en el citosol. Una MDH citosolica puede ser cualquier malato deshidrogenasa homologa o heterologa, adecuada. Preferiblemente, una celula de levadura comprende una secuencia de nucleotidos codificadora de una malato deshidrogenasa que presenta al menos 70%, preferiblemente al menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencias con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N° 9.
En otra realizacion, una levadura geneticamente modificada en el procedimiento segun la invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protema transportadora de acido dicarboxflico, preferiblemente una protema transportadora de acido malico (MAE). Una protema transportadora de acido dicarboxflico puede ser una protema homologa o heterologa. Preferiblemente, la protema transportadora de acido dicarboxflico es una protema heterologa. Una protema transportadora de acido dicarboxflico puede proceder de cualquier organismo adecuado, preferiblemente de Schizosaccharomyces pombe. Preferiblemente, una protema transportadora de acido
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dicarboxflico es una protema transportadora de acido malico (MAE) que presenta al menos 80, 85, 90, 95 o 99% o 100% de identidad de secuencias con la SEC ID N° 10.
Preferiblemente, la levadura usada en el procedimiento segun la presente invencion, es una levadura geneticamente modificada que comprende una FEP-carboxicinasa heterologa, una fumarato reductasa dependiente de NAD(P)H heterologa, una fumarasa heterologa, una protema transportadora de acido malico heterologa y una malato deshidrogenasa citosolica. Las realizaciones preferidas de estas enzimas son como se definieron en la presente memoria anteriormente.
Identidad de secuencias se define en la presente memoria como una relacion entre dos o mas secuencias de aminoacidos (polipeptido o protema) o dos o mas secuencias de acidos nucleicos (polinucleotido), cuando se determina por comparacion de las secuencias. Normalmente, las identidades o similitudes de secuencias se comparan por la longitud completa de las secuencias comparadas. En la tecnica, "identidad" tambien significa el grado de relacion de las secuencias entre secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos, como puede ser el caso, cuando se determina por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias.
Los metodos preferidos para determinar la identidad se disenan para proporcionar la coincidencia mayor entre las secuencias ensayadas. Los metodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas informaticos disponibles al publico. Los metodos de programas informaticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen BLASTP y BLASTN, disponibles al publico en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Los parametros preferidos para comparacion de secuencias de aminoacidos usando BLASTP son abertura de huecos 11.0, extension de huecos 1, matriz Blosum 62.
El termino "acido nucleico" como se usa en la presente memoria, incluye referencia a un polfmero de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, es decir, un polinucleotido, en forma mono o bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, incluye analogos conocidos con la naturaleza esencial de nucleotidos naturales en que se hibridan a acidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a nucleotidos que se encuentran en la naturaleza (por ej., acidos nucleicos peptfdicos). Un polinucleotido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulador natural o heterologo. A menos que se indique de otro modo, el termino incluye referencia a la secuencia especificada asf como la secuencia complementaria de la misma.
En una realizacion preferida, la levadura en el procedimiento segun la invencion sobreexpresa las secuencias de nucleotidos que codifican cualquiera de las enzimas como se definio en la presente memoria anteriormente. Hay varios medios disponibles en la tecnica para la sobreexpresion de secuencias de nucleotidos que codifican enzimas en una levadura en el procedimiento de la invencion. En particular, una secuencia de nucleotidos que codifica una enzima puede sobreexpresarse aumentando el numero de copias del gen codificador de la enzima en la celula, por ej., integrando copias adicionales del gen en el genoma de la celula, expresando el gen de un vector centromerico, de un vector de expresion de multicopia episomal o introduciendo un vector de expresion (episomal) que comprende multiples copias del gen. Preferiblemente, la sobreexpresion de la enzima se consigue con un activador constitutivo (fuerte).
El sustrato que contiene carbohidrato puede ser cualquier sustrato que contenga carbohidrato que incluya melaza, jugo de cana de azucar, pentosas y hexosas, tales como glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa. Preferiblemente, el sustrato que contiene carbohidrato es un sustrato que contiene glucosa, tal como maltosa, sacarosa, glucosa o un jarabe de glucosa. El contenido en carbohidrato del sustrato que contiene carbohidrato es preferiblemente mayor que 50% p/p, mas preferiblemente mayor que 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% p/p, lo mas preferiblemente mayor que 85%, 90%, 95% o 99% p/p sobre la base de contenido en materia seca.
El procedimiento segun la presente invencion, comprende preferiblemente fermentar una levadura en condiciones limitadas de carbono (C). Condiciones limitadas de C se definen en la presente memoria como una concentracion de carbohidrato disuelto por debajo de 1 g/l, preferiblemente por debajo de 0,9 g/l, 0,8 o por debajo de 0,5 g/l de carbohidrato disuelto. Se encontro que fermentar levadura en condiciones limitadas de C daba como resultado un rendimiento aumentado de acido succmico cuando se compara con condiciones no limitadas de C.
El oxfgeno para la fermentacion puede suministrarse en cualquier forma adecuada. En una realizacion, el oxfgeno se suministra en forma de aire. El oxfgeno debena suministrarse en cantidades bajas. Esto se refleja en la tasa de absorcion de oxfgeno (TAO) y/o la tasa de absorcion de oxfgeno espedfica (qO2) del ano. La TAO en el presente procedimiento es menor que aproximadamente 8,0 mmoles de oxfgeno/l/hora, preferiblemente menor que aproximadamente 5,0; 4,0; 3,0 o 2,0 mmoles de oxfgeno/l/hora, mas preferiblemente menor que aproximadamente 1,0 o 0,5 mmoles de oxfgeno/l/hora, preferiblemente mayor que 0,01 mmoles de oxfgeno/l/hora.
La tasa de absorcion de oxfgeno espedfica (qO2) en el procedimiento de la invencion oscila entre 8 mmoles de oxfgeno/g de peso seco de biomasa /hora y 0,5 mmoles de oxfgeno/g de peso seco de biomasa /hora, preferiblemente entre 5, 4, 3 o 2 mmoles de oxfgeno/g de biomasa/hora y aproximadamente 0,4; 0,3 o 0,2 mmoles de oxfgeno/g de biomasa/hora.
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El procedimiento segun la presente invencion puede llevarse a cabo en modo discontinuo, lote alimentado o modo continuo. Estos modos de fermentacion son conocidos para el experto en la materia. Dependiendo del modo de fermentacion, la concentracion de biomasa durante la fermentacion puede variar mas o menos durante la fermentacion. En modo discontinuo y modo de lote alimentado la concentracion de biomasa normalmente aumenta. Por consiguiente, la tasa de absorcion de oxfgeno espedfica normalmente disminuye en un modo discontinuo y de lote alimentado.
La temperatura del procedimiento esta tfpicamente entre 10 y 40 grados C, preferiblemente entre 20 y 35 grados C, mas preferiblemente entre 30 y 35 grados C.
En una realizacion del procedimiento segun la invencion, esta presente un donador de electrones extra ademas del sustrato que contiene carbohidrato. El donador de electrones extra es preferiblemente un donador de electrones organico. Ejemplos adecuados de donadores de electrones organicos incluyen glicerol, formiato y polioles, tales como manitol, sorbitol y xilitol.
Figuras
Figura 1. Efecto de la TAO aplicada en la produccion de acido sucdnico despues de 90 h a pH 3.
Ejemplos
Ejemplo 1. Produccion de acido sucdnico por Saccharomyces cerevisiae.
1.1. Construccion cepa de levadura.
1.1.1. Construccion de construcciones de expresion.
Se creo la construccion de expresion pGBS414PPK-3 despues de una restriccion BamHI/Notl del vector de expresion pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R. S. y Hieter P, Genetics, 1.989, 122 (1): 19-27) y ligando con posterioridad en este vector un fragmento de restriccion BamHI/Notl que consiste en la construccion genica sintetica de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (origen Actinobacillus succinogenes) (SEC ID N° 1). Se uso la mezcla de ligadura para transformacion de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construccion de expresion de levadura pGBS414PPK-1. Con posterioridad, se restringio pGBK414PPK-1 con AscI y NotI. Para crear pGBS414pPK-3, se ligo un fragmento de restriccion AscI/NotI que consistfa en fumarato reductasa glicosomal de construccion genica sintetica T. brucei (FRDg) (SEC ID N° 2) al vector pGBS414PPK-1 restringido. Se uso la mezcla de ligadura para transformacion de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construccion de expresion de levadura pGBS414PPK-3.
Se creo la construccion de expresion pGBS415FUM-3 despues de una restriccion BamHI/NotI del vector de expresion pRS415 de S. cerevisiae (Sirkoski R. S. y Hieter P, Genetics, 1.989, 122 (1): 19-27) y ligando con posterioridad en este vector un fragmento de restriccion BamHI/NotI que consistfa en la construccion genica sintetica de fumarasa (origen Rhizopus oryzae) (SEC ID N° 3). Se uso la mezcla de ligadura para transformacion de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construccion de expresion de levadura pGBS415FUM-1. Con posterioridad, se restringio pGBK415FUM-1 con AscI y NotI. Para crear pGBS415FUM-3, se ligo un fragmento de restriccion AscI/NotI que consistfa en malato deshidrogenasa peroxisomal de construccion genica sintetica S. cerevisiae (MDH3) (SEC ID N° 4) al vector pGBS415FUM-1 restringido. Se uso la mezcla de ligadura para transformacion de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construccion de expresion de levadura pGBS415FUM-3.
Se creo la construccion de expresion pGBS416MAE-1 despues de una restriccion BamHI/NotI del vector de expresion pRS416 de S. cerevisiae (Sirkoski R. S. y Hieter P, Genetics, 1.989, 122 (1): 19-27) y ligando con posterioridad en este vector un fragmento de restriccion BamHI/NotI que consistfa en la construccion genica sintetica de transportador de malato de Schizosaccharomyces pombe (SEC ID N° 5). Se uso la mezcla de ligadura para transformacion de TOP10 de E. coli (Invitrogen) dando como resultado la construccion de expresion de levadura pGBS416MAE-1.
1.1.2. Construccion cepa de S. cerevisiae.
Se transformaron los plasmidos pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-3 y pGBS416MAE-1 (descritos en 1.1.) por electroporacion en cepa RWB064 de S. cerevisiae (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox) para crear cepa SUC-200, sobreexpresando PCKa, MDH3, FUMR, FRDg y SpMAE1. Se optimizaron los pares de codones de todos los genes para expresion en S. cerevisiae segun la patente internacional WO2008/000632.
1.2. Produccion de acido sucdnico S. cerevisiae a pH bajo y condiciones limitadas de oxfgeno.
Se cultivo la cepa de levadura SUC-200 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox, que sobreexpresaba PCKa, MDH3, FUMR, FRDg y SpMAE1), en un matraz para agitacion (2 x 300 ml) durante 3 dfas a
30°C y 23 rad/s (220 rpm). El medio se basaba en Verduyn (Verduyn et. al., 1.992, Yeast 8, 501-517), pero se hicieron modificaciones en la fuente de carbono y nitrogeno como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Composicion del medio de matraz para agitacion de precultivo.
Compuesto
Concentracion (g/l)
C6H12O6. H2O
20,0
(NH2)2CO
2,3
KH2PO4
3,0
MgSO4.7 H2O
0,5
1
1
5
aDisolucion de vitamina
Componente
Formula Concentracion (g/kg)
Biotina (D-)
C10H16N2O3S 0,05
D(+) Pantotenato de Ca
C18H32CaN2O-i0 1,00
Acido nicotmico
C6H5NO2 1,00
Mio-inositol
C6H12O6 25,00
Cloruro hidrocloruro de tiamina
C12H18Cl2N4OS. XH2O 1,00
Hidrocloruro de piridoxol
C8H12ClNO3 1,00
acido p-aminobenzoico
C7H7NO2 0,20
bDisolucion de elementos traza
Formula
Concentracion (g/kg)
C10H14N2Na2Oa.2 H2O (EDTA)
15,00
ZnSO4.7H2O
4,50
MnCl2.2 H2O
0,84
CoCl2.6 H2O
0,30
CuSO4.5 H2O
0,30
Na2MoO4.2 H2O
0,40
CaCl2.2 H2O
4,50
FeSO4.7H2O
3,00
H3BO3
1,00
KI
0,10
Con posterioridad, se transfirio el contenido de los matraces para agitacion a un fermentador de 10 l (Peso de partida 6 kg), que contema el medio siguiente:
5 Tabla 2. Composicion del medio de fermentacion principal.
Materia prima
Formula Concentracion (g/l)
Sulfato de amonio
(NH4)2SO4 2,5
Dihidrogenofosfato de potasio
KH2PO4 3,0
Sulfato de magnesio
MgSO4.7 H2O 0,5
Disolucion de elementos traza
1
Disolucion de vitamina
1
Se controlo el pH a 3,0 por adicion de KOH 6 N. Se controlo la temperatura a 30°C. Se mantuvo limitada la concentracion de glucosa (< 1 g/l) controlando la adicion de alimentacion al fermentador. Se aplicaron diferentes tasas de absorcion de oxfgeno (TAO) a la fermentacion, que dio como resultado limitacion de oxfgeno (Figura 1). Se
10 aplicaron 0,33 vvm de flujo de gas total, incluyendo CO2 al 10% para suministrar suficiente CO2 para la produccion eficaz de acido succmico.
Los resultados de diferentes TAO aplicadas en la produccion de acido succmico se muestran en la Figura 1. Se requirio una cantidad minima de aireacion para mantener la produccion de acido succmico a un pH de 3. Una TAO por encima de 5 mmoles/l/h dio como resultado una produccion de acido succmico inferior.
15 Durante el cultivo de 90 horas, tuvo lugar crecimiento para una concentracion de biomasa tfpica de 8 g de peso seco/l. Por consiguiente, la tasa de absorcion de oxfgeno espedfica (qO2) disminuyo de manera constante durante la fermentacion. Una TAO de 10 mmoles/l/h aplicada en una fermentacion se correlaciona con una disminucion de qO2 de 10 a 1,25 mmoles/g de peso seco de biomasa/h y una TAO de 1 mmol/l/h correlacionado con una disminucion de qO2 de 1 a 0,1 mmoles/g de peso seco de biomasa/h.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. El procedimiento para la preparacion de acido succmico, que comprende fermentar una levadura en presencia de un sustrato que contiene carbohidratos y bajas cantidades de ox^geno a un valor de pH que esta por debajo del pKa mas bajo de acido succmico, en el que el oxfgeno se suministra a una tasa de absorcion de ox^geno espedfica que
    5 oscila entre 8 y 0,2 mmoles de oxfgeno/g de peso seco de biomasa/hora.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el pH esta en el intervalo de pH 2,0 a pH 4,0.
  3. 3. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 o 2, en el que el pH es 3,0.
  4. 4. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende fermentar la levadura en condiciones de carbono limitadas.
    10 5. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en presencia de un donador de electrones
    extra.
  5. 6. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la levadura es una Saccharomyces cerevisiae.
  6. 7. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la levadura es una levadura 15 geneticamente modificada.
  7. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que la levadura modificada de manera genetica comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una enzima heterologa seleccionada del grupo que consiste en una fosfoenolpiruvato carboxicinasa, fumarato reductasa y una fumarasa.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0915534B1 (pt) * 2008-07-08 2021-04-20 Dsm Ip Assets B.V. produção de ácido succínico de ph baixo
US9353387B2 (en) * 2009-04-15 2016-05-31 Dsm Ip Assets B.V. Dicarboxylic acid production process
SG176970A1 (en) 2009-07-02 2012-02-28 Verdezyne Inc Biological methods for preparing adipic acid
EP2473600B1 (en) 2009-09-01 2016-06-29 Novozymes Inc. Methods for improving malic acid production in filamentous fungi
WO2014043720A1 (en) * 2012-09-17 2014-03-20 Ndsu Research Foundation Blocked bio-based carboxylic acids and their use in thermosetting materials
CN102812127B (zh) * 2010-03-09 2014-12-03 三菱化学株式会社 琥珀酸的制造方法
JP5754785B2 (ja) 2010-03-26 2015-07-29 バイオアンバー インコーポレイテッド コハク酸二アンモニウム、コハク酸一アンモニウム及び／又はコハク酸を含む発酵培地からコハク酸一アンモニウムの製造、及びコハク酸一アンモニウムからコハク酸への変換方法
US8399687B2 (en) 2010-04-01 2013-03-19 Bioamber International S.A.R.L. Processes for the production of hydrogenated products
WO2011123270A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Bioamber S.A.S. Processes for the production of tetrahydrofuran, gamma - butyrolactone and/or butanediol from salts of succinic acid
US20110269993A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Bioamber S.A.S. Processes for producing adipic acid from fermentation broths containing diammonium adipate
US8895779B2 (en) 2010-04-30 2014-11-25 Bioamber Inc. Processes for producing monoammonium adipate and conversion of monoammonium adipate to adipic acid
EP2576606B1 (en) 2010-06-04 2014-12-10 Novozymes, Inc. C4 dicarboxylic acid production in filamentous fungi
ES2645004T3 (es) 2010-06-16 2017-12-01 Bioamber Inc. Procesos para la producción de caprolactama y derivados de la misma a partir de caldos de fermentación que contienen adipato de diamonio, adipato de monoamonio y/o ácido adípico
CN103003245A (zh) 2010-06-16 2013-03-27 生物琥珀酸有限公司 氢化产物及其衍生物的制备方法
BR112012031877A2 (pt) 2010-06-16 2015-09-22 Bioamber Sas processo para produzir caprolactam e derivados do mesmo de caldos de fermentação contendo adipato de diamônio ou adipato de monomônio.
CA2800708A1 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Bioamber S.A.S. Processes for producing hexamethylenediamine (hmd), adiponitrile (adn), adipamide (adm) and derivatives thereof
EP2582653A1 (en) 2010-06-16 2013-04-24 Bioamber, S.A.S. Processes for producing hexamethylenediamine (hmd), adiponitrile (adn), adipamide (adm) and derivatives thereof
BR112012031822A2 (pt) 2010-06-16 2015-09-22 Bioamber Sas processos para a produção de produtos hidrogenados e seus derivados.
WO2011163270A1 (en) 2010-06-21 2011-12-29 Novozymes, Inc. Methods for improved c4-dicarboxylic acid production in filamentous fungi
KR20130113937A (ko) 2010-06-21 2013-10-16 노보자임스 인코포레이티드 Ｃ4―디카르복실산 수송체 활성을 가진 아스페르질루스 아쿨레아투스 유래한 폴리펩티드 및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
US20130171704A1 (en) * 2010-09-24 2013-07-04 Roquette Freres Sa Dicarboxylic acid production process
US9605285B2 (en) 2011-01-25 2017-03-28 Cargill, Incorporated Compositions and methods for succinate production
BR112013019036A2 (pt) 2011-02-28 2017-04-04 Novozymes Inc célula hospedeira recombinante, e, método para produzir um ácido dicarboxílico.
US8728798B2 (en) 2011-05-03 2014-05-20 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
US8343752B2 (en) 2011-05-03 2013-01-01 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
WO2012170060A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Bioamber S.A.S. Processes for producing hexanediol (hdo), hexamethylenediamine (hmd), and derivatives thereof
US8663956B2 (en) 2011-08-19 2014-03-04 Novozymes, Inc. Recombinant microorganisms for production C4-dicarboxylic acids
DE102011056297A1 (de) * 2011-12-12 2013-06-13 Thyssenkrupp Uhde Gmbh Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Dicarbonsäuren
US9885065B2 (en) * 2012-01-25 2018-02-06 Bioamber Inc. Methods for succinate production
EP3901248A1 (en) 2012-07-25 2021-10-27 Cargill, Incorporated Yeast cells having reductive tca pathway from pyruvate to succinate and overexpressing an exogenous nad(p)+ transhydrogenase enzyme
CN104812889B (zh) 2012-09-14 2018-08-28 麦兰特公司 通过在低ph下发酵产生有机酸
CN112143762A (zh) 2013-07-18 2020-12-29 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 发酵方法
US9944905B2 (en) * 2013-12-12 2018-04-17 Dsm Ip Assets B.V. Fumarate reductases
US10801050B2 (en) 2015-10-23 2020-10-13 Metabolic Explorer Microorganism modified for the assimilation of levulinic acid
DK3485004T3 (da) 2016-07-13 2021-12-13 Dsm Ip Assets Bv Malatdehyrogenaser
JP2020525026A (ja) 2017-06-30 2020-08-27 ピーティーティー グローバル ケミカル パブリック カンパニー リミテッド コハク酸産生が増加した遺伝子組換え酵母
CN110218746A (zh) * 2018-03-01 2019-09-10 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 发酵生产长链二元酸的方法及发酵液、发酵处理液、污水
KR102129379B1 (ko) 2018-10-10 2020-07-02 한국과학기술원 고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4877731A (en) 1988-06-27 1989-10-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fermentation process for carboxylic acids
US5573931A (en) 1995-08-28 1996-11-12 Michigan Biotechnology Institute Method for making succinic acid, bacterial variants for use in the process, and methods for obtaining variants
US5869301A (en) 1995-11-02 1999-02-09 Lockhead Martin Energy Research Corporation Method for the production of dicarboxylic acids
US6475759B1 (en) * 1997-10-14 2002-11-05 Cargill, Inc. Low PH lactic acid fermentation
CZ299320B6 (cs) * 1999-05-21 2008-06-18 Cargill Dow Llc Zpusoby a látky pro syntézu organických produktu
ES2290466T3 (es) 2002-05-30 2008-02-16 Natureworks Llc Metodos y materiales para la produccion de acido d-lactico en levadura.
JP4647391B2 (ja) * 2005-05-20 2011-03-09 財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌による高効率なジカルボン酸の製造方法
DE102005052338A1 (de) * 2005-07-19 2007-05-16 Leibniz Inst Naturstoff Forsch Verfahren zur Herstellung von methylierten Malonsäuren durch mikrobielle Fermentation
US20080090273A1 (en) 2005-11-21 2008-04-17 Aaron Adriaan Winkler Malic Acid Production in Recombinant Yeast
US20090053782A1 (en) * 2006-03-13 2009-02-26 Catherine Asleson Dundon Yeast cells having disrupted pathway from dihydroxyacetone phosphate to glycerol
DK2423315T3 (en) 2006-06-29 2015-04-13 Dsm Ip Assets Bv A method for obtaining enhanced polypeptide expression
EP2158323A4 (en) 2007-05-18 2011-06-22 Microbia Prec Engineering Inc PRODUCTION OF ORGANIC ACID BY PILZ CELLS
WO2008144626A1 (en) * 2007-05-18 2008-11-27 Microbia Precision Engineering, Inc. Malic acid production in recombinant yeast
CN101903522B (zh) 2007-11-20 2015-08-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 在真核生物中生产二羧酸
BRPI0915534B1 (pt) * 2008-07-08 2021-04-20 Dsm Ip Assets B.V. produção de ácido succínico de ph baixo

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