CN112143762A

CN112143762A - 发酵方法

Info

Publication number: CN112143762A
Application number: CN202011049289.8A
Authority: CN
Inventors: 米克尔·莱纳德斯·奥古斯特·詹森; 瑞内·维尔瓦尔; 劳伦特·西格艾哈; 麦兰尼·洛查尔特; 塔尼亚·维加·多斯·伊诺森特斯
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: Roquette; Technip Energies France SAS
Priority date: 2013-07-18
Filing date: 2014-07-18
Publication date: 2020-12-29
Also published as: CN105378093A; EP3022309A1; CA2918149C; BR112016000949A2; CA2918149A1; US10280439B2; BR112016000949A8; US20160194670A1; WO2015007902A1

Abstract

本发明涉及发酵方法，特别是用于二羧酸的方法，所述方法包括在包含合适发酵培养基的容器中发酵真菌细胞，其中在维生素和/或微量元素的存在下重复利用至少部分真菌细胞。

Description

发酵方法

本申请是申请号为201480040785.3名称为发酵方法的中国专利申请的分案申请，原申请是申请日为2014年7月18日的国际申请PCT/EP2014/065552的中国国家阶段申请。

技术领域

本发明涉及用于生产二羧酸的方法。

背景技术

二羧酸(例如苹果酸、富马酸和琥珀酸)是重要的化合物，其在食品工业中用于食物制备和保存，在医药工业中用于配制医药制品，以及用于(生物)聚合物中的构建单元和其他工业用途。为了满足对二羧酸的日益增加的需要，正在开发更高效和更具成本效益的生产方法。

已知一些生产二羧酸的方法。传统上，通过在中性pH下发酵细菌来制造二羧酸，这例如描述于US 5,573,931中。另外，其它微生物如酵母已被用于在低pH下生产二羧酸，其优点为直接生产酸(WO2010/003728)。

为了实现经济上可行的方法，需要快速高效地生产二羧酸。所需效率设置了发酵方法中可使用的生物质的量的上限。这影响了生产力，其正是目前的方法所遭遇的问题。这可通过重复利用生物质从而允许较高的生物质浓度来解决。这种提高发酵速率的技术在许多应用如乙醇生产(Cyzewski等人,1977)中被充分描述。

然而，对于二羧酸的生产，在第二发酵运行中观察到了对固有活性的负面影响。这意味着：大部分重复利用的生物质不再生产，从而阻碍整合了细胞再循环的方法的实施。

本公开旨在提供经改进的发酵生产二羧酸的方法，当用于上述发酵中时，所述方法克服了不产出性(non-productive)生物质的缺点。

发明内容

本发明涉及一种生产二羧酸的方法。所述方法包括在容器(vessel)中发酵真菌菌株，所述容器包含合适的发酵培养基。进行所述方法的方式使得至少部分细胞被重复利用(即，再循环)。细胞可被再循环回原始容器或者再循环入第二容器。关键地，部分真菌细胞的重复利用在维生素和/或微量元素的存在下进行。

在经由真菌菌株发酵的标准二羧酸生产期间，通常会看到比生产力(qp)的降低。类似地，在相同培养基中生长的再循环细胞也展示出比生产力(qp)的降低。然而，出乎意料地，我们已发现：当进行重复利用时向培养基补充维生素和微量元素导致qp被完全恢复，达到了与初始发酵中相同的水平。可观察到较高的KPi：qp降低和较高Yps。

因此，根据本发明，提供了用于制备二羧酸的方法，所述方法包括在包含合适发酵培养基的容器中发酵真菌细胞，其中在维生素和/或微量元素的存在下重复利用至少部分真菌细胞。

附图说明

图1显示了不同细胞再循环之前和之后的琥珀酸生产力(按照生物质归一化)。

图2显示了具有不同起始生物质浓度的再循环培养中琥珀酸浓度的演变。

图3显示了培养基组成对再循环培养的影响的表征。生产培养被用作参照。A.所产生琥珀酸的量；B.达到的KPI。

图4显示了各发酵的KPI值及其累计值(即，考虑到之前运行的发酵)的比较。

具体实施方式

发明详述

在本说明书和附属权利要求的通篇，词语“包括”、“包含”和“具有”应被解释为包含性的。换言之，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思是：可以包括其它没有明确列举的要素或整体。

本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)语法对象。例如，“要素”可意味着一个/种要素或多于一个/种要素。

本发明涉及一种用于生产二羧酸的方法。术语“二羧酸”和“二羧酸根(dicarboxylate)”(例如“琥珀酸或苹果酸”和“琥珀酸根和苹果酸根”)在本文中具有相同含义并可交换使用，前者是后者的氢化形式。

在所述方法中，在包含合适发酵培养基的容器中发酵真菌细胞。本文所使用的术语发酵指的是化合物的微生物生产，在此处是由碳水化合物生产二羧酸。

优选地，发酵产物是二羧酸，优选地苹果酸、富马酸或琥珀酸或己二酸，优选地琥珀酸。

用于生产发酵产品的方法的一些优选实施方式在本文中被进一步限定为用于生产二羧酸的方法。

关键地，在本发明中，在维生素和/或微量元素的存在下，发酵中使用的至少部分真菌细胞被重复利用，即一部分真菌细胞被再循环。

本发明涉及一种用于生产二羧酸的方法。所述方法包括在容器中发酵真菌菌株，所述容器包含合适的发酵培养基。进行所述方法的方式使得至少部分细胞被重复利用。细胞可被再循环回原始容器或者再循环入第二容器。关键地，真菌细胞的重复利用在维生素和/或微量元素的存在下进行。

为了本发明目的，维生素是生物体(在这种情况下是真菌菌株)以有限的量需要的作为重要营养物的有机化合物。当有机化学化合物(或相关的化合物组)不能被生物体(真菌菌株)足量合成时，其可被视为维生素。

用于本发明中的维生素通常是维生素B(或者形成维生素B复合物或维生素等)。适用于本发明中的维生素B的实例包括维生素B₁例如硫胺素、维生素B₂(例如核黄素)、维生素B₃(例如烟酸或烟酰胺)、维生素B₅(例如泛酸)、维生素B₆(例如吡哆醇(pyroxidinem)、吡哆醛或吡哆胺或盐酸吡哆醇)、维生素B₇(例如生物素)、维生素B₈(例如肌醇)、维生素B₉(例如叶酸)、维生素B₁₂(例如各种钴胺素，例如氰钴胺素)或维生素B_x(例如对氨基苯甲酸)。在根据本发明的细胞重新利用中，可使用这些维生素中的任一种或其混合物。

本发明中使用的维生素的平均浓度通常低于百万分之1000(以原子计数测量)或者低于1000μg/g。本发明中使用的维生素的平均浓度通常为至少约百万分之1(以原子计数测量)或者至少约1μg/g。

为了本发明目的，微量元素是生物体(在这种情况下是真菌菌株)的恰当生长、发育和生理仅以极少量需要的矿物质。在本文中，微量元素是除了普通有机分子中存在的碳、氢、氮和氧这四种元素之外，有生命的生物体(在这种情况下是真菌菌株)所需的化学元素。

通常，微量元素不是可以被视为大量营养素或大量矿物质的化学元素。被视为大量营养素的化学元素是生物体通常大量消耗的那些，即，碳、氢、氮、氧、磷和硫。钙、盐(钠和氯、镁和钾(连同磷和硫)可被添加到大量营养素的列表中，因为相较于其它维生素和元素，它们被大量需要。

因此，可被视为微量元素的元素可包括铁、钴、铜、锌、钼、碘、硒、硼、铬、砷和硅。然而，为了本发明的目的，大量营养素可被视为微量元素。在根据本发明的细胞重新利用中，可使用任一种微量元素或任何这些微量元素的任意混合物。

本发明中使用的微量元素的平均浓度通常低于百万分之1000(以原子计数测量)或者低于1000μg/g。本发明中使用的维生素的平均浓度通常为至少约百万分之1(以原子计数测量)或者至少约1μg/g。

在所述方法中，来自发酵的细胞被取出并重复利用，即，它们被再循环。这表示：它们被重新引入同一发酵容器中和/或引入第二发酵容器(含合适的发酵培养基)中。然而，在每种情况下，重复利用均在维生素和/或微量元素的存在下进行。也就是说，当真菌细胞被重复利用时，向发酵培养基补充维生素和/或微量元素。

如上所述，本发明的方法包括在维生素和/或微量元素的存在下进行的细胞重复利用。换言之，向引入再循环细胞的发酵培养基中补充维生素和/或微量元素。通常，向发酵培养基中补充维生素和微量元素的混合物。

引入再循环细胞的培养基通常至少允许再循环细胞的一些生长。引入再循环细胞的培养基可包含氮源，例如铵。还可优选地的是加入额外的铁源。

可进行多个再循环/再循环步骤。例如根据本发明所述方法的生产二羧酸的方法中可使用2个、3个、4个、5个或更多个再循环步骤。

本领域技术人员可确定再循环步骤中合适的接种浓度。合适的接种浓度可以为从约10g/L至约50g/L，例如约15g/L至约20g/L。合适的接种浓度可以与生产培养物(production culture)中的最终生物质浓度大致相同。

根据本发明的生产二羧酸的方法可以以任何合适的模式(例如，分批模式、补料分批模式、连续模式或这些发酵模式的任意合适组合)进行。优选地，根据本发明的生产二羧酸的方法以补料分批模式或连续模式进行。

以所有这些发酵模式进行细胞再循环的方法是本领域技术人员众所周知的。

基于从产物流中分离细胞的位置，重复利用细胞的方法可彼此不同。

这种生物质分离可发生在发酵容器外部或内部。如果细胞分离发生在发酵容器外部，那么这可通过重力(例如，离心或倾析)或通过机械力(例如，过滤技术)来实现。如果细胞分离发生在发酵容器内部，那么这可通过例如以下进行：细胞沉降(settling)或(自)凝聚，然后可除去清澈的上层并重复利用剩余细胞。

分批发酵在本文中被定义为这样的发酵，其中所有营养物在发酵开始时加入。

补料分批发酵是这样的分批发酵，其中营养物在发酵期间加入。分批和补料分批发酵中的产物可在合适的时机收获，例如在一种或更多种营养物耗尽时收获。

连续发酵是这样的发酵，其中营养物被连续加入到发酵中且其中产物被连续地移出发酵。

在一个实施方式中，在本发明的方法中发酵酵母是在碳水化合物限制条件下进行的。当在本文中使用时，碳水化合物限制条件被定义为维持碳水化合物浓度低于10g/l，例如约5g/l。

根据本发明的生产二羧酸的方法可以以任何合适的体积和规模进行，优选地以工业规模进行。工业规模在本文中被定义为至少10升或100升，优选地至少1m³，优选地至少10m³或100m³，优选地至少1000m³，通常低于10,000m³的体积。

在本发明的方法中发酵酵母细胞可在任何合适的发酵培养基中进行，所述发酵培养基包含合适的氮源、碳水化合物和本发明所述方法中生长和二羧酸生产所需的其它营养物。根据本发明的发酵方法中合适的碳水化合物可以是葡萄糖、半乳糖、木糖、***糖、蔗糖或麦芽糖。

在一个实施方式中，所述发酵方法在CO₂分压为5％-60％、优选地约50％下进行。

在所述生产二羧酸的方法中，pH通常在二羧酸生产期间降低。优选地，在所述生产二羧酸的方法中，pH在1和5之间、优选地1.5和4.5之间、更优选地2和4之间的范围。

在另一优选实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：在碳水化合物的存在下在需氧条件下预培养真菌细胞。优选地，在预培养期间真菌细胞的发酵在4-6之间的pH下进行。优选地，预培养期间的碳水化合物是非抑制性碳水化合物、优选半乳糖。已发现在非抑制性碳水化合物上预培养真菌细胞是有利的，因为这防止了葡萄糖抑制的发生，而葡萄糖抑制可负面影响所产生生物质的量。此外，还发现：在需氧条件下预培养真菌细胞的步骤导致较高的生物质产率和较快的生长。优选地，所述预培养以分批模式进行。

通常进行用于生产增加的生物质的增殖步骤，优选地在碳水化合物限制条件下进行。

生产二羧酸的方法可在任何合适的温度下进行。合适的温度可例如在约10℃和约40℃之间，例如在约15℃和约30℃之间。

用于本文所公开方法中的合适真菌细胞可属于任何合适的属，例如Saccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、Humicola、Issatchenkia、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、Rhizopus、Zygosaccharomyces、Pachysolen或Yamadazyma。适用于本发明所述方法的真菌细胞可以是酵母，例如属于下列属之一的酵母：Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Yarrowia、Candida、Pichia、Kluyveromyces、Issatchenkia或Zygosaccharomyces。更优选地，酵母是Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus、Yarrowia lipolytica、Candida sonorensis、Schizosaccharomyces pombe、Pichiastipidis、Kluyveromyces marxianus、K.lactis、K.thermotolerans、Issatchenkiaorientalis或Zygosaccharomyces bailii。

本文所公开方法中的真菌细胞可以是任何合适的野生型或重组的或经遗传修饰的真菌细胞，特别是重组的或经遗传修饰的酵母细胞。

经遗传修饰的真菌细胞可包含选自如下的基因的遗传修饰：编码丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、富马酸酶、富马酸还原酶、异柠檬酸裂合酶、苹果酸合酶和二羧酸转运体的基因。

因此，适用于本发明所述方法的经遗传修饰的酵母细胞可包含任何合适的遗传修饰，例如缺失或破坏，和同源或异源核苷酸序列的***。适用于本发明所述方法的酵母细胞可利用编码同源和/或异源的下述酶的核苷酸序列进行遗传修饰或者转化，所述酶在细胞中催化反应，从而导致提高的朝向二羧酸(例如，苹果酸、富马酸和/或琥珀酸)的通量。根据要生产的二羧酸，例如引入和/或过表达编码以下的核苷酸序列可以是有利的：i)催化从OAA转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶；ii)催化苹果酸转化成富马酸的富马酸酶；或iii)催化富马酸转化为琥珀酸的富马酸还原酶。

因此，本发明中可使用经遗传修饰的酵母细胞。优选地，根据本发明的方法中使用的酵母细胞包含根据如下文所述的一些优选实施方式的遗传修饰。

重组真菌细胞可包含丙酮酸羧化酶(PYC)的遗传修饰，丙酮酸羧化酶催化从丙酮酸到草酰乙酸的反应(EC 6.4.1.1)。丙酮酸羧化酶例如可在基因表达后在胞质溶胶中有活性。例如，真菌细胞过表达丙酮酸羧化酶，例如内源性或同源丙酮酸羧化酶被过表达。

优选地，经遗传修饰的酵母细胞表达编码胞质溶胶中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶的核苷酸序列。优选地，编码磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶的核苷酸序列被过表达。PEP羧激酶(EC 4.1.1.49)优选地是异源酶，优选地来自细菌，更优选地，具有PEP羧激酶活性的酶来自Escherichia coli、Mannheimia sp.、Actinobacillus sp.或Anaerobiospirillum sp.，更优选地Mannheimia succiniciproducens。编码PEP羧激酶的基因可被过表达，并且可在真菌细胞的胞质溶胶中被表达并有活性。优选地，用与SEQ IDNO:1的氨基酸序列的序列同一性为至少80％、85％、90％、95％、99％或100％否认PEP羧激酶遗传修饰根据本发明的酵母细胞。

在一个实施方式中，用编码在基因表达之后在胞质溶胶中有活性的苹果酸脱氢酶(MDH)的基因进一步遗传修饰真菌细胞。胞质溶胶表达可以通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。苹果酸脱氢酶可被过表达。胞质溶胶MDH可以是催化从草酰乙酸到苹果酸的反应的任何合适的同源或异源苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)，例如来自S.cerevisiae。

优选地，MDH是这样的S.cerevisiae MDH2，其经修饰从而其在葡萄糖存在时不失活，并且在胞质溶胶中有活性。已知向葡萄糖-饥饿的细胞中添加葡萄糖后MDH2的转录被抑制并且Mdh2p降解。缺失最初12个氨基端氨基酸的Mdh2p对葡萄糖诱导的降解更不易感(Minard和McAlister-Henn,J.Biol Chem.1992年8月25日；267(24):17458-64)。优选地，根据本发明的酵母细胞包含编码与SEQ ID NO:4的氨基酸序列的序列同一性为至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的苹果酸脱氢酶的核苷酸序列。

在另一个实施方式中，用编码催化从苹果酸到富马酸的反应的富马酸酶(EC4.2.1.2)的基因进一步遗传修饰本文公开的真菌细胞。编码富马酸酶的基因可来自于任何合适的来源，优选地来自微生物来源，例如来自酵母(例如Saccharomyces)或丝状真菌(例如Rhizopus oryzae)或细菌(例如Escherichia coli)。本文公开的真菌细胞可过表达编码富马酸酶的核苷酸序列。在核苷酸序列表达后，富马酸酶可在胞质溶胶中有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。已发现：富马酸酶的胞质溶胶活性导致真菌细胞对二羧酸的高生产力。

优选地，根据本发明的方法中的酵母过表达编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列的序列同一性为至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的富马酸酶的核苷酸序列。

在另一个实施方式中，用编码催化从富马酸到琥珀酸的反应的NAD(H)依赖型富马酸还原酶(EC 1.3.1.6)的任何合适的同源或异源基因遗传修饰真菌细胞。NADH依赖型富马酸还原酶可以是异源酶，其可来自任何合适的来源，例如细菌、真菌、原生动物或植物。本文公开的真菌细胞包含异源NAD(H)依赖型富马酸还原酶，优选地来自Trypanosoma sp，例如Trypanosoma brucei。在一个实施方式中，NAD(H)依赖型富马酸还原酶被表达并在胞质溶胶中具有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。真菌细胞可过表达编码NAD(H)依赖型富马酸还原酶的基因。

优选地，用与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的序列同一性为至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的NAD(H)依赖型富马酸还原酶遗传修饰根据本发明的酵母细胞。

在另一个实施方式中，根据本发明的方法中经遗传修饰的酵母表达编码胞质溶胶中的二羧酸转运蛋白、优选地编码苹果酸转运蛋白(MAE)的核苷酸序列。优选地，二羧酸转运蛋白被过表达。二羧酸转运蛋白可以是任何合适的同源或异源蛋白。优选地，二羧酸转运蛋白是异源蛋白。二羧酸转运蛋白可来自任何合适的生物体，优选地来自酵母或真菌例如Schizosaccharomyces pombe或Aspergillus niger。优选地，二羧酸转运蛋白是与SEQ IDNO:5的氨基酸序列的序列同一性为至少80％、85％、90％、95％或99％或100％的苹果酸转运蛋白(MAE)。

经遗传修饰的真菌细胞还可包含编码异柠檬酸裂合酶(EC 4.1.3.1)的基因的遗传修饰，所述异柠檬酸裂合酶可以是任何合适的同源或异源酶。异柠檬酸裂合酶可例如获自Kluyveromyces lactis或Escherichia coli。

经遗传修饰的真菌细胞还可包含苹果酸合酶(EC 2.3.3.9)的遗传修饰。苹果酸合酶可被过表达和/或在胞质溶胶中有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。如果苹果酸合酶是S.cerevisiae苹果酸合酶，例如通过缺失SKL羧基端序列来改变天然苹果酸合酶。

在另一个实施方式中，本文所公开的生产二羧酸的方法中的重组真菌细胞包含编码乙醇发酵通路中的酶的基因的破坏。编码乙醇发酵通路中的酶的基因可以是丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)，其催化从丙酮酸到乙醛的反应；或者醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)，其催化从乙醛到乙醇的反应。优选地，本文所公开方法中的真菌细胞包含1个、2个或更多个编码醇脱氢酶的基因的破坏。如果真菌细胞是酵母例如S.cerevisiae，那么酵母优选地包含醇脱氢酶基因adh1和/或adh2的破坏。

替代性地或者此外，本发明所述方法中的酵母包含至少一种编码无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶的基因。无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶在本文中用于描述下述真核细胞，其中通过例如突变、破坏或缺失编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因而包含降低的甘油-3-磷酸脱氢酶活性，从而导致与野生型细胞相比降低的甘油形成。

优选地，本发明所述方法中经遗传修饰的酵母过表达编码PEP羧激酶的核苷酸序列、编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列、编码富马酸酶的核苷酸序列、编码NAD(H)依赖型富马酸还原酶的核苷酸序列和/或编码苹果酸转运蛋白的核苷酸序列，优选地，其中所述酶在胞质溶胶(cytosol)中有活性。所述酶的一些优选实施方式如上文所述。

上述酶的胞质溶胶表达可通过缺失过氧化物酶体或线粒体靶向信号来实现。过氧化物酶体或线粒体靶向信号的存在可例如通过Schlüter等人,Nucleid Acid Research2007,35,D815-D822所公开的方法来确定。

当在本文中使用时，根据本发明的经遗传修饰的酵母被定义为下述细胞，其包含或被转化有或被遗传修饰有所述酵母细胞中天然不存在的核苷酸序列或多肽，或者它包含内源核酸序列的一个或多个额外拷贝，或者它包含内源或同源核苷酸序列的缺失或破坏。野生型真核细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。

当用于表示给定的(重组)核酸或多肽分子与给定的宿主生物体或宿主细胞之间的关系时，术语“同源”应当被理解为表示：该核酸或多肽分子天然地由相同物种、优选地相同品种或株系的宿主细胞或生物体产生。

关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源”指的是下述核酸或蛋白质，其不作为其存在的生物体、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在，或其被发现于与其天然被发现的不同的细胞或位置或基因组位置或DNA或RNA序列。异源核酸或蛋白质对其被引入的细胞而言不是内源的，而是获自另一细胞或是以合成方式或重组方式产生的。

序列同一性在本文中被定义为通过比较序列确定的两条或更多条氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或更多条核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在被比较的序列的整个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，这根据情况通过这种序列串之间的匹配测定。

测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。测定同一性和相似性的方法被编码于公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其它来源(BLAST Manual,Altschul,S.,等,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)获得。使用BLASTP的氨基酸序列比较的优选参数为缺口开放11.0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。

在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，否则其包括具有天然核苷酸基本特性的已知类似物，所述基本特征在于它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或子序列。除非另有说明，该术语包括特定的序列及其互补序列。

本领域可获得多种手段用于在本发明方法中在酵母中过表达编码酶的核苷酸序列。特别地，可以通过提高细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自着丝粒载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过引入包含多拷贝基因的(附加体)表达载体，来过表达编码酶的核苷酸序列。优选地，用(强)组成型启动子实现根据本发明的酶的过表达。

真菌细胞中合适的启动子对本领域技术人员而言是公知的。合适的启动子可以是但不限于，TDH1、TDH3、GAL7、GAL10、GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PH05、ADC1、ACT1、TRP1、URA3、LEU2、ENO1、TPI1、AOX1、PGL、GPDA和GAPDH。另一些合适的启动子包括PDC1、GPD1、PGK1和TEF1。

可将编码酶的基因连接进核酸构建体，例如质粒，比如低拷贝质粒或高拷贝质粒中。根据本发明的真菌细胞可包含单个拷贝，但是优选地包含多个拷贝的基因，这例如通过多拷贝的核苷酸构建体来实现。

核酸构建体可以保持为附加体型，并因此包含用于自主复制的序列，比如自主复制序列和着丝粒(Sikorski和Hieter，1989，Geneticsl22，19–27)。合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKDl质粒(Gleer等人,1991,Biotechnology 9:968-975)或AMA质粒(Fierro等人,1995,Curr.Genet.29:482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进真菌细胞的基因组中。整合至细胞基因组可以通过非同源重组随机发生，但优选地，可通过本领域所公知的同源重组将核酸构建体整合至细胞的基因组中。

在一个优选的实施方式中，所述生产二羧酸的方法还包括回收二羧酸。可通过任何合适的方法来回收二羧酸。

在一个实施方式中，从发酵培养基中回收在本文所公开方法中生产的二羧酸。可通过本领域已知的任何合适方法来回收二羧酸，例如通过结晶、铵沉淀、离子交换技术、离心或过滤或这些方法的任意合适组合。

在一个优选的实施方式中，回收二羧酸包括：使二羧酸结晶和形成二羧酸晶体。优选地，使二羧酸结晶包括除去部分发酵培养基，优选地通过蒸发，以获得浓缩的培养基。

在一个优选的实施方式中，根据本发明的方法包括回收二羧酸，所述二羧酸是琥珀酸，其中所述回收包括由pH为1-5且包含琥珀酸的水性溶液结晶琥珀酸，包括蒸发部分水性溶液以获得浓缩溶液、将浓缩溶液的温度降低至5-35℃之间的值，其中琥珀酸晶体形成。优选地，结晶包括：使浓缩培养基的温度达到10-30℃，优选地15-25℃的温度。优选地，发酵培养基的pH为1.5-4.5，优选地2-4。

已发现，相较于在低于10度的低温下结晶的琥珀酸晶体，使琥珀酸在较高温度(例如，10-30℃)下结晶产生杂质(例如，有机酸、蛋白质、颜色和/或气味)量较低的琥珀酸晶体。

相较于在低于10℃或5℃的温度下进行的琥珀酸结晶，在较高温度下结晶琥珀酸的另一个优点是：冷却水性溶液需要较少量的能量，从而导致更加经济和可持续的方法。

优选地，使琥珀酸结晶的方法包括洗涤琥珀酸晶体的步骤。可由pH为1-5的发酵培养基直接将琥珀酸结晶至纯度为至少90重量/重量％，优选地至少95重量/重量％、96重量/重量％、97重量/重量％、或至少98重量/重量％、或99-100重量/重量％。

优选地，回收二羧酸(优选琥珀酸)包括：从发酵培养基中除去生物质和使二羧酸结晶，优选地如上文所述进行结晶。优选地，通过过滤除去生物质。

在一个优选的实施方式中，生产二羧酸的方法还包括：在工业方法中使用二羧酸。二羧酸的工业方法可以是作为化妆品添加剂、除冰剂、食品添加剂或作为(生物)聚合物的构建单元的应用。

在一个优选的实施方式中，发酵培养基包含量为1-150g/l的琥珀酸、优选地5-100g/l、更优选地10-80g/l或者15-60g/l的琥珀酸。

在另一方面，本发明涉及由pH为1-5且包含琥珀酸的水性溶液结晶琥珀酸的方法，所述方法包括：通过蒸发除去部分水性溶液以获得浓缩溶液，和使浓缩溶液的温度达到10-30℃之间的值，其中琥珀酸晶体形成。优选地，结晶包括使浓缩溶液的温度达到15-25℃、优选地18-22℃。优选地，水性溶液的pH为1.5-4.5、优选地2-4。水性溶液可以是包含琥珀酸的任何合适溶液。水性溶液可包含可溶性组分和不溶性组分，例如微生物细胞、蛋白质、植物生物质木质纤维素、纤维素等(的片段)。优选地，水性溶液是发酵培养基，优选地是通过本文所述的二羧酸生产方法能够获得的发酵培养基。

标准的遗传学技术例如宿主细胞中酶的过表达、宿主细胞的遗传修饰或杂交技术是本领域已知的方法，例如Sambrook和Russel(2001)“Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第三版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor LaboratoryPress或F.Ausubel等编，"Current protocols in molecular biology",GreenPublishing and Wiley Interscience,New York(1987)中所述。用于真菌宿主细胞转化、遗传修饰等等的方法从例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574和US 6,265,186中已知。

本文中作为现有技术所给出的专利文件或其它材料的引用并不应被认为是承认所述文件或材料在任何一项权利要求的优先权日时是已知的或者其所包含的信息是公知常识的一部分。

本文中陈述的每个引用的公开内容通过引用以整体并入本文中。

通过实施例进一步阐释本发明：

实施例

实施例1：再循环生物质之后，不同培养基组成对通过酵母生产琥珀酸的影响

如WO2013/004670中所述构建的酵母菌株SUC-632在30℃和110rpm下在摇瓶中(150ml)培养3天。如下文所述，培养基根据Verduyn等人(Verduyn C,Postma E,ScheffersWA,Van Dijken JP.Yeast,1992 Jul；8(7):501-517)，在碳源和氮源上有修改。

表1.预培养基组成

^a微量元素溶液

组分	式	浓度(g/kg)
			EDTA	C<sub>10</sub>H<sub>14</sub>N<sub>2</sub>Na<sub>2</sub>O<sub>8</sub>.2H<sub>2</sub>O	15.00
硫酸锌.7H<sub>2</sub>O	ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	4.50
			氯化锰.2H<sub>2</sub>O	MnCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O	0.84
氯化钴(II).6H<sub>2</sub>O	CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O	0.30
			硫酸铜(II).5H<sub>2</sub>O	CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O	0.30
钼酸钠.2H<sub>2</sub>O	Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O	0.40
			氯化钙.2H<sub>2</sub>O	CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O	4.50
硫酸铁.7H<sub>2</sub>O	FeSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	3.00
			硼酸	H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	1.00
碘化钾	KI	0.10

^b维生素溶液

组分	式	浓度(g/kg)
			生物素(D-)	C<sub>10</sub>H<sub>16</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub>S	0.05
Ca D(+)泛酸	C<sub>18</sub>H<sub>32</sub>CaN<sub>2</sub>O<sub>10</sub>	1.00
			烟酸	C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>NO<sub>2</sub>	1.00
肌醇	C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub>	25.00
			盐酸氯化硫胺	C<sub>12</sub>H<sub>18</sub>Cl<sub>2</sub>N<sub>4</sub>OS.xH<sub>2</sub>O	1.00
盐酸吡哆醇	C<sub>8</sub>H<sub>12</sub>ClNO<sub>3</sub>	1.00
			对氨基苯甲酸	C<sub>7</sub>H<sub>7</sub>NO<sub>2</sub>	0.20

随后，将摇瓶的内容物转移到种子发酵罐中(起始体积为10L)，其含有以下培养基：

表2.种子发酵罐的培养基组成

通过添加氨水(28重量％)将pH控制在5.0。温度控制在30℃。通过调节搅拌器速度将pO₂控制在20％。保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料所限制(应用指数(exponent)0.1)。

发酵70小时后，将1.5L种子发酵罐中的培养液转移至生产发酵罐(起始体积为15L)，其含有下述培养基：

表3.生产发酵罐的培养基组成

原材料		浓度(g/L)
			尿素	(NH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>CO	1.0
磷酸二氢钾	KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.5
			硫酸镁	MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	0.5
硫酸铁.7H<sub>2</sub>O	FeSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	0.006
			碳酸钙	CaCO<sub>3</sub>	4
生物素	C<sub>10</sub>H<sub>16</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub>S	0.001

不应用pH控制，因为最初加入的CaCO₃使培养基的pH缓冲在5-5.5。作为自然酸化的结果，在发酵结束时，pH降至3。将温度控制在30℃。保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料所限制(0-24h：3.2g/L/h；>24h：2.1g/L/h。需要时，相应地调节这些速率)。

48小时后，从生产发酵罐中取出2.25L样品，在4500rpm下离心1分钟并再引入新的发酵罐(体积为2L)中。检测不同的培养基(表4)，其中应用与生产发酵中相同的条件且葡萄糖加料速率适应于所存在生物质的量(5.7g/L/h)。

表4.细胞再循环发酵的培养基组成(标准培养基)

在琥珀酸的标准生产期间，观察到了比生产力qp的降低，其中比生产力qp被表示为每克存在的生物质每小时生产的琥珀酸的克数(图1)。类似地，相同培养基中生长的再循环细胞展示出比生产力qp的降低。出乎意料地，向培养基补充维生素和微量元素导致qp完全恢复，达到了与生产发酵中相同的水平。

实施例2：接种浓度的影响

在该实施例中，遵循如实施例1中所述的程序，但利用在实施例末尾显示的溶液和再循环阶段的方案。

在再循环发酵罐中使用不同的接种浓度：生产培养的初始生物质浓度的相同浓度、二倍浓度或三倍浓度(分别为OD(T₀)＝30、OD(T₀)＝60和OD(T₀)＝90)。

用于生产和再循环培养的培养基相同。根据30OD按比例计算加料速率。

表5和图2中显示了结果。由获自该组实验的值可以清楚看出：15g/l(OD＝90)的初始浓度对再循环运行最有利。此外，该浓度等于生产培养中最终的生物质浓度。

表5：在SUC-632的再循环阶段培养48小时后接种浓度的影响

实施例3：培养基组成的影响

研究再循环培养中的培养基组成以验证其对细胞适应度(fitness)的影响。基于对利用不同接种浓度的再循环培养获得的数据(参见实施例2)，针对接种20g/l生物质(最适宜的条件)的培养展示本研究的结果。

表6和图3中显示了结果。当使用限定的完全培养基时(STD+完全维生素(vits)/OE溶液(参见表格)+Fe×1)，琥珀酸生产和获得的KPI更高。在这种条件下，生物质的生存力高于85％。

缺乏作为氮源的铵对琥珀酸生产有负面影响。这提示：为了使细胞在生产和再循环培养中具有相似的生理机能，可需要允许至少一些细胞生长。还针对接种较少生物质的培养进行了这种研究(数据未显示)，结果相似。

表6：在接种20g/l(OD＝90)生物质的SUC-632培养的再循环阶段48小时后培养基组成的影响

实施例4：多个再循环步骤的影响

生物质再循环培养的成功导致多个再循环步骤的实施。使用与第一个再循环中相同的方案，例外是：从之前的再循环培养(而非生产培养)中收获生物质。再次，基于关于再循环培养的接种浓度和培养基组成已显示的结果，应用最佳条件，即，20g/l接种物和限定的完全培养基(参见表7和图4)。

表7：在接种20g/l(OD＝90)生物质并在限定的完全培养基上生长的SUC-632培养的48小时后，再循环数的影响。第一行显示了标准生产培养且第四行显示了平均生产+再循环(prod+rec)

第二再循环培养中的KPI值高于生产或第一再循环步骤中的KPI值(分别0.71相比于0.67和0.69)。因此，总体过程(生产+第1步再循环+第2步再循环)中的累积KPI值随再循环步骤数增加。

实施例2-4的方案和培养基组成

再循环方案

1：取出生产阶段的无菌样品(在再循环发酵罐中，对于30OD是750ml)

2.在4200rpm下离心无菌瓶1分钟

3.从上清移除

4.利用一些无菌水重新悬浮生物质

5.向再循环发酵罐中加入悬浮的生物质

培养基组成

灭菌后

生物素溶液	母液	1ml/l
			CaCO<sub>3</sub>		4g/l

灭菌后

生物素溶液	母液	1ml/l
			CaCO<sub>3</sub>		4g/l

标准培养基+完全维生素/OE溶液+FE×1w/o尿素

灭菌后

维生素溶液<sup>＊</sup>	母液	1ml/l
			CaCO<sub>3</sub>		4g/l

标准培养基+完全维生素/OE溶液+Fe×1

灭菌后

维生素溶液<sup>＊</sup>	母液	1ml/l
			CaCO<sub>3</sub>		4g/l

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

法国罗盖特公司

<120> 发酵方法

<130> 29030-WO-PCT

<150> EP13177052.1

<151> 2013-07-18

<160> 5

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 538

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Actinobacillus succinogenes磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶氨基酸

序列，第120-122位具有EGY到DAF的修饰

<400> 1

Met Thr Asp Leu Asn Lys Leu Val Lys Glu Leu Asn Asp Leu Gly Leu

1 5 10 15

Thr Asp Val Lys Glu Ile Val Tyr Asn Pro Ser Tyr Glu Gln Leu Phe

20 25 30

Glu Glu Glu Thr Lys Pro Gly Leu Glu Gly Phe Asp Lys Gly Thr Leu

35 40 45

Thr Thr Leu Gly Ala Val Ala Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Gly Arg

50 55 60

Ser Pro Lys Asp Lys Tyr Ile Val Cys Asp Glu Thr Thr Lys Asp Thr

65 70 75 80

Val Trp Trp Asn Ser Glu Ala Ala Lys Asn Asp Asn Lys Pro Met Thr

85 90 95

Gln Glu Thr Trp Lys Ser Leu Arg Glu Leu Val Ala Lys Gln Leu Ser

100 105 110

Gly Lys Arg Leu Phe Val Val Asp Ala Phe Cys Gly Ala Ser Glu Lys

115 120 125

His Arg Ile Gly Val Arg Met Val Thr Glu Val Ala Trp Gln Ala His

130 135 140

Phe Val Lys Asn Met Phe Ile Arg Pro Thr Asp Glu Glu Leu Lys Asn

145 150 155 160

Phe Lys Ala Asp Phe Thr Val Leu Asn Gly Ala Lys Cys Thr Asn Pro

165 170 175

Asn Trp Lys Glu Gln Gly Leu Asn Ser Glu Asn Phe Val Ala Phe Asn

180 185 190

Ile Thr Glu Gly Ile Gln Leu Ile Gly Gly Thr Trp Tyr Gly Gly Glu

195 200 205

Met Lys Lys Gly Met Phe Ser Met Met Asn Tyr Phe Leu Pro Leu Lys

210 215 220

Gly Val Ala Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Lys Asp Gly Asp

225 230 235 240

Val Ala Ile Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser

245 250 255

Thr Asp Pro Lys Arg Gln Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly Trp Asp

260 265 270

Glu Ser Gly Val Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Thr Ile

275 280 285

Asn Leu Ser Gln Glu Asn Glu Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Arg Arg

290 295 300

Asp Ala Leu Leu Glu Asn Val Val Val Arg Ala Asp Gly Ser Val Asp

305 310 315 320

Phe Asp Asp Gly Ser Lys Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr Pro Ile

325 330 335

Tyr His Ile Asp Asn Ile Val Arg Pro Val Ser Lys Ala Gly His Ala

340 345 350

Thr Lys Val Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu Pro Pro

355 360 365

Val Ser Lys Leu Thr Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Gly

370 375 380

Phe Thr Ala Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Val Thr Glu Pro Thr

385 390 395 400

Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu His Pro

405 410 415

Ile Gln Tyr Ala Asp Val Leu Val Glu Arg Met Lys Ala Ser Gly Ala

420 425 430

Glu Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys Arg Ile

435 440 445

Ser Ile Lys Asp Thr Arg Gly Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asp Gly Ser

450 455 460

Ile Glu Lys Ala Glu Met Gly Glu Leu Pro Ile Phe Asn Leu Ala Ile

465 470 475 480

Pro Lys Ala Leu Pro Gly Val Asp Pro Ala Ile Leu Asp Pro Arg Asp

485 490 495

Thr Tyr Ala Asp Lys Ala Gln Trp Gln Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala

500 505 510

Asn Arg Phe Val Lys Asn Phe Val Lys Tyr Thr Ala Asn Pro Glu Ala

515 520 525

Ala Lys Leu Val Gly Ala Gly Pro Lys Ala

530 535

<210> 2

<211> 1139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Glycosomal Trypanosoma brucei富马酸还原酶（FRDg）氨基酸

序列，缺乏3aa的C-端靶向信号

<400> 2

Met Val Asp Gly Arg Ser Ser Ala Ser Ile Val Ala Val Asp Pro Glu

1 5 10 15

Arg Ala Ala Arg Glu Arg Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu Leu Gln Asp

20 25 30

Ser Pro Leu His Thr Thr Met Gln Tyr Ala Thr Ser Gly Leu Glu Leu

35 40 45

Thr Val Pro Tyr Ala Leu Lys Val Val Ala Ser Ala Asp Thr Phe Asp

50 55 60

Arg Ala Lys Glu Val Ala Asp Glu Val Leu Arg Cys Ala Trp Gln Leu

65 70 75 80

Ala Asp Thr Val Leu Asn Ser Phe Asn Pro Asn Ser Glu Val Ser Leu

85 90 95

Val Gly Arg Leu Pro Val Gly Gln Lys His Gln Met Ser Ala Pro Leu

100 105 110

Lys Arg Val Met Ala Cys Cys Gln Arg Val Tyr Asn Ser Ser Ala Gly

115 120 125

Cys Phe Asp Pro Ser Thr Ala Pro Val Ala Lys Ala Leu Arg Glu Ile

130 135 140

Ala Leu Gly Lys Glu Arg Asn Asn Ala Cys Leu Glu Ala Leu Thr Gln

145 150 155 160

Ala Cys Thr Leu Pro Asn Ser Phe Val Ile Asp Phe Glu Ala Gly Thr

165 170 175

Ile Ser Arg Lys His Glu His Ala Ser Leu Asp Leu Gly Gly Val Ser

180 185 190

Lys Gly Tyr Ile Val Asp Tyr Val Ile Asp Asn Ile Asn Ala Ala Gly

195 200 205

Phe Gln Asn Val Phe Phe Asp Trp Gly Gly Asp Cys Arg Ala Ser Gly

210 215 220

Met Asn Ala Arg Asn Thr Pro Trp Val Val Gly Ile Thr Arg Pro Pro

225 230 235 240

Ser Leu Asp Met Leu Pro Asn Pro Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Ile Ser

245 250 255

Val Ile Ser Leu Asp Asn Glu Ala Leu Ala Thr Ser Gly Asp Tyr Glu

260 265 270

Asn Leu Ile Tyr Thr Ala Asp Asp Lys Pro Leu Thr Cys Thr Tyr Asp

275 280 285

Trp Lys Gly Lys Glu Leu Met Lys Pro Ser Gln Ser Asn Ile Ala Gln

290 295 300

Val Ser Val Lys Cys Tyr Ser Ala Met Tyr Ala Asp Ala Leu Ala Thr

305 310 315 320

Ala Cys Phe Ile Lys Arg Asp Pro Ala Lys Val Arg Gln Leu Leu Asp

325 330 335

Gly Trp Arg Tyr Val Arg Asp Thr Val Arg Asp Tyr Arg Val Tyr Val

340 345 350

Arg Glu Asn Glu Arg Val Ala Lys Met Phe Glu Ile Ala Thr Glu Asp

355 360 365

Ala Glu Met Arg Lys Arg Arg Ile Ser Asn Thr Leu Pro Ala Arg Val

370 375 380

Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ala Gly Leu Ser Ala Ala Ile Glu Ala

385 390 395 400

Ala Gly Cys Gly Ala Gln Val Val Leu Met Glu Lys Glu Ala Lys Leu

405 410 415

Gly Gly Asn Ser Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ile Asn Gly Trp Gly Thr

420 425 430

Arg Ala Gln Ala Lys Ala Ser Ile Val Asp Gly Gly Lys Tyr Phe Glu

435 440 445

Arg Asp Thr Tyr Lys Ser Gly Ile Gly Gly Asn Thr Asp Pro Ala Leu

450 455 460

Val Lys Thr Leu Ser Met Lys Ser Ala Asp Ala Ile Gly Trp Leu Thr

465 470 475 480

Ser Leu Gly Val Pro Leu Thr Val Leu Ser Gln Leu Gly Gly His Ser

485 490 495

Arg Lys Arg Thr His Arg Ala Pro Asp Lys Lys Asp Gly Thr Pro Leu

500 505 510

Pro Ile Gly Phe Thr Ile Met Lys Thr Leu Glu Asp His Val Arg Gly

515 520 525

Asn Leu Ser Gly Arg Ile Thr Ile Met Glu Asn Cys Ser Val Thr Ser

530 535 540

Leu Leu Ser Glu Thr Lys Glu Arg Pro Asp Gly Thr Lys Gln Ile Arg

545 550 555 560

Val Thr Gly Val Glu Phe Thr Gln Ala Gly Ser Gly Lys Thr Thr Ile

565 570 575

Leu Ala Asp Ala Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Phe Ser Asn Asp Lys

580 585 590

Thr Ala Asp Ser Leu Leu Arg Glu His Ala Pro His Leu Val Asn Phe

595 600 605

Pro Thr Thr Asn Gly Pro Trp Ala Thr Gly Asp Gly Val Lys Leu Ala

610 615 620

Gln Arg Leu Gly Ala Gln Leu Val Asp Met Asp Lys Val Gln Leu His

625 630 635 640

Pro Thr Gly Leu Ile Asn Pro Lys Asp Pro Ala Asn Pro Thr Lys Phe

645 650 655

Leu Gly Pro Glu Ala Leu Arg Gly Ser Gly Gly Val Leu Leu Asn Lys

660 665 670

Gln Gly Lys Arg Phe Val Asn Glu Leu Asp Leu Arg Ser Val Val Ser

675 680 685

Lys Ala Ile Met Glu Gln Gly Ala Glu Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Ser

690 695 700

Met Phe Ala Tyr Cys Val Leu Asn Ala Ala Ala Gln Lys Leu Phe Gly

705 710 715 720

Val Ser Ser His Glu Phe Tyr Trp Lys Lys Met Gly Leu Phe Val Lys

725 730 735

Ala Asp Thr Met Arg Asp Leu Ala Ala Leu Ile Gly Cys Pro Val Glu

740 745 750

Ser Val Gln Gln Thr Leu Glu Glu Tyr Glu Arg Leu Ser Ile Ser Gln

755 760 765

Arg Ser Cys Pro Ile Thr Arg Lys Ser Val Tyr Pro Cys Val Leu Gly

770 775 780

Thr Lys Gly Pro Tyr Tyr Val Ala Phe Val Thr Pro Ser Ile His Tyr

785 790 795 800

Thr Met Gly Gly Cys Leu Ile Ser Pro Ser Ala Glu Ile Gln Met Lys

805 810 815

Asn Thr Ser Ser Arg Ala Pro Leu Ser His Ser Asn Pro Ile Leu Gly

820 825 830

Leu Phe Gly Ala Gly Glu Val Thr Gly Gly Val His Gly Gly Asn Arg

835 840 845

Leu Gly Gly Asn Ser Leu Leu Glu Cys Val Val Phe Gly Arg Ile Ala

850 855 860

Gly Asp Arg Ala Ser Thr Ile Leu Gln Arg Lys Ser Ser Ala Leu Ser

865 870 875 880

Phe Lys Val Trp Thr Thr Val Val Leu Arg Glu Val Arg Glu Gly Gly

885 890 895

Val Tyr Gly Ala Gly Ser Arg Val Leu Arg Phe Asn Leu Pro Gly Ala

900 905 910

Leu Gln Arg Ser Gly Leu Ser Leu Gly Gln Phe Ile Ala Ile Arg Gly

915 920 925

Asp Trp Asp Gly Gln Gln Leu Ile Gly Tyr Tyr Ser Pro Ile Thr Leu

930 935 940

Pro Asp Asp Leu Gly Met Ile Asp Ile Leu Ala Arg Ser Asp Lys Gly

945 950 955 960

Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Ala Leu Glu Pro Gly Asp Ala Val Glu

965 970 975

Met Lys Ala Cys Gly Gly Leu Val Ile Glu Arg Arg Leu Ser Asp Lys

980 985 990

His Phe Val Phe Met Gly His Ile Ile Asn Lys Leu Cys Leu Ile Ala

995 1000 1005

Gly Gly Thr Gly Val Ala Pro Met Leu Gln Ile Ile Lys Ala Ala

1010 1015 1020

Phe Met Lys Pro Phe Ile Asp Thr Leu Glu Ser Val His Leu Ile

1025 1030 1035

Tyr Ala Ala Glu Asp Val Thr Glu Leu Thr Tyr Arg Glu Val Leu

1040 1045 1050

Glu Glu Arg Arg Arg Glu Ser Arg Gly Lys Phe Lys Lys Thr Phe

1055 1060 1065

Val Leu Asn Arg Pro Pro Pro Leu Trp Thr Asp Gly Val Gly Phe

1070 1075 1080

Ile Asp Arg Gly Ile Leu Thr Asn His Val Gln Pro Pro Ser Asp

1085 1090 1095

Asn Leu Leu Val Ala Ile Cys Gly Pro Pro Val Met Gln Arg Ile

1100 1105 1110

Val Lys Ala Thr Leu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Met Asn Leu Val

1115 1120 1125

Arg Thr Val Asp Glu Thr Glu Pro Ser Gly Ser

1130 1135

<210> 3

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Rhizopus oryzae富马酸酶氨基酸序列，缺乏最初23个

N-端氨基酸

<400> 3

Met Ser Ser Ala Ser Ala Ala Leu Gln Lys Phe Arg Ala Glu Arg Asp

1 5 10 15

Thr Phe Gly Asp Leu Gln Val Pro Ala Asp Arg Tyr Trp Gly Ala Gln

20 25 30

Thr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Phe Asp Ile Gly Gly Pro Thr Glu Arg

35 40 45

Met Pro Glu Pro Leu Ile Arg Ala Phe Gly Val Leu Lys Lys Ala Ala

50 55 60

Ala Thr Val Asn Met Thr Tyr Gly Leu Asp Pro Lys Val Gly Glu Ala

65 70 75 80

Ile Gln Lys Ala Ala Asp Glu Val Ile Asp Gly Ser Leu Ile Asp His

85 90 95

Phe Pro Leu Val Val Trp Gln Thr Gly Ser Gly Thr Gln Thr Lys Met

100 105 110

Asn Val Asn Glu Val Ile Ser Asn Arg Ala Ile Glu Leu Leu Gly Gly

115 120 125

Glu Leu Gly Ser Lys Ala Pro Val His Pro Asn Asp His Val Asn Met

130 135 140

Ser Gln Ser Ser Asn Asp Thr Phe Pro Thr Ala Met His Val Ala Ala

145 150 155 160

Val Val Glu Ile His Gly Arg Leu Ile Pro Ala Leu Thr Thr Leu Arg

165 170 175

Asp Ala Leu Gln Ala Lys Ser Ala Glu Phe Glu His Ile Ile Lys Ile

180 185 190

Gly Arg Thr His Leu Gln Asp Ala Thr Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu

195 200 205

Phe Ser Gly Tyr Thr Gln Gln Leu Thr Tyr Gly Ile Ala Arg Val Gln

210 215 220

Gly Thr Leu Glu Arg Leu Tyr Asn Leu Ala Gln Gly Gly Thr Ala Val

225 230 235 240

Gly Thr Gly Leu Asn Thr Arg Lys Gly Phe Asp Ala Lys Val Ala Glu

245 250 255

Ala Ile Ala Ser Ile Thr Gly Leu Pro Phe Lys Thr Ala Pro Asn Lys

260 265 270

Phe Glu Ala Leu Ala Ala His Asp Ala Leu Val Glu Ala His Gly Ala

275 280 285

Leu Asn Thr Val Ala Cys Ser Leu Met Lys Ile Ala Asn Asp Ile Arg

290 295 300

Tyr Leu Gly Ser Gly Pro Arg Cys Gly Leu Gly Glu Leu Ser Leu Pro

305 310 315 320

Glu Asn Glu Pro Gly Ser Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Thr

325 330 335

Gln Cys Glu Ala Met Thr Met Val Cys Ala Gln Val Met Gly Asn Asn

340 345 350

Thr Ala Ile Ser Val Ala Gly Ser Asn Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val

355 360 365

Phe Lys Pro Val Met Ile Lys Asn Leu Ile Gln Ser Ile Arg Leu Ile

370 375 380

Ser Asp Ala Ser Ile Ser Phe Thr Lys Asn Cys Val Val Gly Ile Glu

385 390 395 400

Ala Asn Glu Lys Lys Ile Ser Ser Ile Met Asn Glu Ser Leu Met Leu

405 410 415

Val Thr Ala Leu Asn Pro His Ile Gly Tyr Asp Lys Ala Ala Lys Cys

420 425 430

Ala Lys Lys Ala His Lys Glu Gly Thr Thr Leu Lys Glu Ala Ala Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Tyr Leu Thr Ser Glu Glu Phe Asp Gln Trp Val Arg Pro

450 455 460

Glu Asp Met Ile Ser Ala Lys Asp

465 470

<210> 4

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Saccharomyces cerevisiae过氧化物酶体苹果酸脱氢酶（Mdh3）

氨基酸序列，缺乏3个C-端过氧化物酶体靶向序列（SKL）

<400> 4

Met Val Lys Val Ala Ile Leu Gly Ala Ser Gly Gly Val Gly Gln Pro

1 5 10 15

Leu Ser Leu Leu Leu Lys Leu Ser Pro Tyr Val Ser Glu Leu Ala Leu

20 25 30

Tyr Asp Ile Arg Ala Ala Glu Gly Ile Gly Lys Asp Leu Ser His Ile

35 40 45

Asn Thr Asn Ser Ser Cys Val Gly Tyr Asp Lys Asp Ser Ile Glu Asn

50 55 60

Thr Leu Ser Asn Ala Gln Val Val Leu Ile Pro Ala Gly Val Pro Arg

65 70 75 80

Lys Pro Gly Leu Thr Arg Asp Asp Leu Phe Lys Met Asn Ala Gly Ile

85 90 95

Val Lys Ser Leu Val Thr Ala Val Gly Lys Phe Ala Pro Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Leu Val Ile Ser Asn Pro Val Asn Ser Leu Val Pro Ile Ala Val

115 120 125

Glu Thr Leu Lys Lys Met Gly Lys Phe Lys Pro Gly Asn Val Met Gly

130 135 140

Val Thr Asn Leu Asp Leu Val Arg Ala Glu Thr Phe Leu Val Asp Tyr

145 150 155 160

Leu Met Leu Lys Asn Pro Lys Ile Gly Gln Glu Gln Asp Lys Thr Thr

165 170 175

Met His Arg Lys Val Thr Val Ile Gly Gly His Ser Gly Glu Thr Ile

180 185 190

Ile Pro Ile Ile Thr Asp Lys Ser Leu Val Phe Gln Leu Asp Lys Gln

195 200 205

Tyr Glu His Phe Ile His Arg Val Gln Phe Gly Gly Asp Glu Ile Val

210 215 220

Lys Ala Lys Gln Gly Ala Gly Ser Ala Thr Leu Ser Met Ala Phe Ala

225 230 235 240

Gly Ala Lys Phe Ala Glu Glu Val Leu Arg Ser Phe His Asn Glu Lys

245 250 255

Pro Glu Thr Glu Ser Leu Ser Ala Phe Val Tyr Leu Pro Gly Leu Lys

260 265 270

Asn Gly Lys Lys Ala Gln Gln Leu Val Gly Asp Asn Ser Ile Glu Tyr

275 280 285

Phe Ser Leu Pro Ile Val Leu Arg Asn Gly Ser Val Val Ser Ile Asp

290 295 300

Thr Ser Val Leu Glu Lys Leu Ser Pro Arg Glu Glu Gln Leu Val Asn

305 310 315 320

Thr Ala Val Lys Glu Leu Arg Lys Asn Ile Glu Lys Gly Lys Ser Phe

325 330 335

Ile Leu Asp Ser

340

<210> 5

<211> 438

<212> PRT

<213> Schizosaccharomyces pombe苹果酸通透酶氨基酸序列

<400> 5

Met Gly Glu Leu Lys Glu Ile Leu Lys Gln Arg Tyr His Glu Leu Leu

1 5 10 15

Asp Trp Asn Val Lys Ala Pro His Val Pro Leu Ser Gln Arg Leu Lys

20 25 30

His Phe Thr Trp Ser Trp Phe Ala Cys Thr Met Ala Thr Gly Gly Val

35 40 45

Gly Leu Ile Ile Gly Ser Phe Pro Phe Arg Phe Tyr Gly Leu Asn Thr

50 55 60

Ile Gly Lys Ile Val Tyr Ile Leu Gln Ile Phe Leu Phe Ser Leu Phe

65 70 75 80

Gly Ser Cys Met Leu Phe Arg Phe Ile Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Lys

85 90 95

Asp Ser Trp Asn His His Leu Glu Lys Leu Phe Ile Ala Thr Cys Leu

100 105 110

Leu Ser Ile Ser Thr Phe Ile Asp Met Leu Ala Ile Tyr Ala Tyr Pro

115 120 125

Asp Thr Gly Glu Trp Met Val Trp Val Ile Arg Ile Leu Tyr Tyr Ile

130 135 140

Tyr Val Ala Val Ser Phe Ile Tyr Cys Val Met Ala Phe Phe Thr Ile

145 150 155 160

Phe Asn Asn His Val Tyr Thr Ile Glu Thr Ala Ser Pro Ala Trp Ile

165 170 175

Leu Pro Ile Phe Pro Pro Met Ile Cys Gly Val Ile Ala Gly Ala Val

180 185 190

Asn Ser Thr Gln Pro Ala His Gln Leu Lys Asn Met Val Ile Phe Gly

195 200 205

Ile Leu Phe Gln Gly Leu Gly Phe Trp Val Tyr Leu Leu Leu Phe Ala

210 215 220

Val Asn Val Leu Arg Phe Phe Thr Val Gly Leu Ala Lys Pro Gln Asp

225 230 235 240

Arg Pro Gly Met Phe Met Phe Val Gly Pro Pro Ala Phe Ser Gly Leu

245 250 255

Ala Leu Ile Asn Ile Ala Arg Gly Ala Met Gly Ser Arg Pro Tyr Ile

260 265 270

Phe Val Gly Ala Asn Ser Ser Glu Tyr Leu Gly Phe Val Ser Thr Phe

275 280 285

Met Ala Ile Phe Ile Trp Gly Leu Ala Ala Trp Cys Tyr Cys Leu Ala

290 295 300

Met Val Ser Phe Leu Ala Gly Phe Phe Thr Arg Ala Pro Leu Lys Phe

305 310 315 320

Ala Cys Gly Trp Phe Ala Phe Ile Phe Pro Asn Val Gly Phe Val Asn

325 330 335

Cys Thr Ile Glu Ile Gly Lys Met Ile Asp Ser Lys Ala Phe Gln Met

340 345 350

Phe Gly His Ile Ile Gly Val Ile Leu Cys Ile Gln Trp Ile Leu Leu

355 360 365

Met Tyr Leu Met Val Arg Ala Phe Leu Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro

370 375 380

Gly Lys Asp Glu Asp Ala His Pro Pro Pro Lys Pro Asn Thr Gly Val

385 390 395 400

Leu Asn Pro Thr Phe Pro Pro Glu Lys Ala Pro Ala Ser Leu Glu Lys

405 410 415

Val Asp Thr His Val Thr Ser Thr Gly Gly Glu Ser Asp Pro Pro Ser

420 425 430

Ser Glu His Glu Ser Val

435

Claims

1.一种用于生产二羧酸的方法，所述方法包括在包含合适发酵培养基的容器中发酵真菌细胞，其中在维生素和/或微量元素的存在下重复利用至少部分所述真菌细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重复利用包括：从所述容器中取出真菌细胞和将所述细胞添加回相同容器或添加至包含合适发酵培养基的第二容器。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述维生素是B复合维生素。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述维生素是B₁、B₂、B₃、B₅、B₆、B₇、B₈、B₉、B₁₂或B_x维生素。

5.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述微量元素是铁、钴、铜、锌、锰、钼、碘、硒、硼、铬、砷或硅。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述重复利用在锌、锰、钴、铜、钼、铁或硼的存在下进行。

7.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述真菌细胞是酵母，例如属于Saccharomyces cerevisiae的酵母。

8.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述真菌细胞是经遗传修饰的真菌细胞，其包含选自以下的基因的遗传修饰：编码丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、富马酸酶、富马酸还原酶、异柠檬酸裂合酶、苹果酸合酶和二羧酸转运体的基因。

9.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述二羧酸是琥珀酸、富马酸、苹果酸或己二酸。

10.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中从所述发酵培养基中回收二羧酸。

11.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中进行多个再循环步骤，例如2个或3个再循环步骤。