ES2612252T3 - Cepa de E. coli BL21 que carece de un complejo génico funcional de los genes capsulares del grupo II - Google Patents
Cepa de E. coli BL21 que carece de un complejo génico funcional de los genes capsulares del grupo II Download PDFInfo
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Abstract
Una cepa de E. coli B BL21 caracterizada porque tiene al menos un 25% del complejo de genes capsulares del grupo II inactivado de forma permanente por deleción, y que comprende un vector de expresión con una secuencia de ADN insertada que codifica un péptido.
Description
que contenía 2 ml de medio LB con los antibióticos apropiados y se cultivó a 37°C, con agitación a 220 rpm durante 2 horas.
Para la preparación del inóculo de la fermentación, las células de una reserva en glicerol se sembraron en placas de LB con y sin adición de ampicilina. Las células después de una noche se lavaron con medio LB y se inocularon en
5 matraces de agitación de 500 ml que contenían cada uno 100 ml de medio complejo de fermentación con la concentración adecuada de antibiótico y se cultivaron a 37°C con agitación a 220 rpm durante 3-4 horas. Las células se inocularon a continuación en el reactor a una concentración de DO600 de aproximadamente 0,5.
Las fermentaciones se llevaron a cabo en condiciones aerobias en un biorreactor de 5 l con un volumen inicial de medio complejo de fermentación de 2,5 l, con los antibióticos apropiados. A tiempo cero, el reactor se inoculó a una
10 DO600 de aproximadamente 0,5. El pH se mantuvo a 7,0 con NH3 5 N y H2SO4 y un caudal de aire constante de 6 ml/min se burbujeó a través del cultivo durante el periodo de fermentación. La temperatura se mantuvo a 37°C. La agitación se controló por cascada mediante el mantenimiento del nivel de oxígeno disuelto hasta un 20% de O2 saturado.
Un experimento por lotes alimentado se realizó para comparar el crecimiento y la expresión del péptido de la cepa
15 con el grupo II eliminado, con su cepa parental en un fermentador de alta densidad. El fermentador se cargó con medio complejo complementado con 27 g/l de glicerol. A tiempo cero, el fermentador se inoculó a una DO600 de 0,5. El glicerol y el extracto de levadura se añadieron continuamente en etapas crecientes a medida que se consumía el glicerol básico, lo que estaba indicado por un incremento en el oxígeno disuelto. Las muestras para la determinación de la DO600 y la expresión de la proteína se recogieron del fermentador y se analizaron mediante espectrofotometría
20 y SDS-PAGE.
La inducción de la expresión de proteínas en bacterias es bien conocida en la técnica. En la presente invención, la inducción de la expresión de proteínas se realiza mediante adición de isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG).
Los plásmidos y las cepas utilizadas en ciertas realizaciones de la invención se enumeran en las Tablas 1 y 2, respectivamente. La construcción de los plásmidos se realizó utilizando técnicas de biología molecular convencionales,
25 como se describe en Sambrook et al. [A Laboratory Manual (1989) CSH].
Tabla 1. Plásmidos utilizados en los ejemplos
- Plásmido
- Genotipo Origen
- pKD46
- AmpR E. coli Genetic Stock Center
- pCP20
- AmpR CmR E. coli Genetic Stock Center
- pEZ-T
- Clonación del vector AmpR GenStar
- pGEM-T
- Clonación del vector AmpR Promega
- pNNC1-g (pET11d-MEAE-hGH)
- Expresión del vector AmpR que expresa MEAE-hGH Basado en pET 11 d de Novagen
- pNNC1-1h (pET11d-MEAE-hGH, alr (promotor y secuencia codificadora de alr)
- Expresión del vector alr que expresa MEAEhGH y racemasa de D,L-alanina Basado en pET 11 d de Novagen
Tabla 2. Cepas empleadas en los ejemplos
- Cepa
-
imagen7 Genotipo Referencia
- BL21 (DE3)
-
imagen8 F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm (DE3) Novagen
- BL21 (DE3)ΔalrΔdadx
-
imagen9 F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm (DE3)Δalrdadx WO2008/025744
- BL21 (DE3)Δ(kpsM-kpsF)::cat
-
imagen10 F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)Δ(kpsM-kpsF)::cat Presente invención
- BL21 (DE3)ΔdadXΔalrΔkpsMkpsF)::cat
-
imagen11 F-ompThsdSB(rB-mB-galdcm(DE3)dalrddadxd(kpsMkpsF)::cat Presente invención
- BL21 (DE3)Δ(kpsM-kpsF)
-
imagen12 F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)Δ(kpsM-kpsF) Presente invención
- BL21 (DE3) ΔdadXΔalr Δ(kpsMkpsF)
-
imagen13 F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)ΔalrΔdadx Δ(kpsMkpsF) Presente invención
8 5
10
15
20
25
30
Tabla 3. Lista de cebadores empleados para llevar a cabo la invención
- NOMBRE DEL CEBADOR
- CONSENSO 5' A 3' (ADN BICATENARIO)
- LA_BL_GII_F
- SacII+LA
- imagen14
- TCCTTACCGCGGGTCAAACCCGCTTACCGGGC (SEQ ID 1)
- LA_BL_GII_R
- EcoRI+LA abajo
- imagen15
- CTACCGGAATTCTTGATGATGTGATCCTAATCTC (SEQ ID 2)
- RA1_BL_GII_F
- BamHI+RA1
- imagen16
- TTCGGATCCATCAGCTCCTTTGCACGGAA (SEQ ID 3)
- RA1_BL_GII_R
- Sacl+RA1 abajo
- imagen17
- GAACGAGCTCACACTCCCGAATCATCAATA (SEQ ID 4)
- RA_SEQ_R1
- GCACCACTAATTCTTAAGAACCCGCCCACAAG (SEQ ID 5)
- LA_SEQ_F1
- ACTGGAATTTGGACGGGGGTAGGTATTGCC (SEQ ID 6)
- LA_SEQ_F2
- TTGATGTCAGTGCTGCTGAGAAGCCTGGGATG (SEQ ID 7)
- Cat_SEQ_F
- CGACGATTTCCGGCAGTTTCTAC (SEQ ID 8)
- CAT_ID_R
- GCCAGGTTTTCACCGTAACACGCC (SEQ ID 9)
- RA6_BL_GII_F
- BamHI+RA6
- imagen18
- CCTGTGGATCCAGAACGTTGTTG (SEQ ID 10)
- RA6_BL_GII_R
- Sacl+RA6 abajo
- imagen19
- GAACGAGCTCATGTTGATAAAAGTGAAGTC (SEQ ID 11)
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Construcción del casete de sustitución
La cepa de E. coli B BL21 (DE3) se utilizó como fuente de ADN para la amplificación por PCR. Los cebadores oligonucleótidos (LA_BL_GII_F/LA_BL_GII_R) (Tabla 3) se sintetizaron, se dirigieron a una región de 1001 pb aguas arriba del extremo 5' del sitio de clonación SacII/EcoRI que contenía KpsM. Esta región se amplificó a partir del ADN genómico como brazo izquierdo (LA). Para el brazo derecho (RA), se sintetizaron cebadores oligonucleótidos (RA1_BL_GII_F/RA1_BL_GII_R) (Tabla 3), dirigidos a una región de 1108 pb aguas arriba del extremo 5' del sitio de clonación BamHI/SacI que contenía KpsF. Se generaron productos de PCR del brazo izquierdo y del brazo derecho. La reacción de amplificación del ADN se realizó en un ciclador térmico, usando un programa que incluía los siguientes parámetros: desnaturalización a 94°C durante 50 s, reasociación a 57°C durante 60 s y extensión del cebador a 72°C durante 60 s, durante un total de 30 ciclos. El producto de la amplificación con PCR con el tamaño de banda correcto, se observó por electroforesis en gel, sobre un gel de agarosa al 1%, a partir del cual se extrajeron 50 µl del producto amplificado y se utilizaron para construir un fragmento de sustitución. Una lista de secuencias de oligonucleótidos se muestra en la Tabla 3.
El brazo izquierdo amplificado se purificó en gel y se ligó en el plásmido pEZ-T, dando como resultado el plásmido pEZ-T-LA. Las enzimas de restricción EcoRI/BamHI digirieron el fragmento FRT-cat-FRT que se ligó en el sitio Eco-RI/BamHI de pEZ-T-LA, dando como resultado el plásmido pEZ-T-LA-FRT-cat-FRT. El brazo derecho amplificado se ligó en el plásmido pGEM-T y se digirió con BamHI/SacI. El fragmento de ADN digerido con BamHI/SacI, que es portador de un gen de resistencia a ampicilina, se ligó en el plásmido pEZ-T-LA-FRT-cat-FRT. El gen de resistencia al cloranfenicol proporciona un marcador seleccionable para identificar el fragmento de sustitución. El plásmido resultante pEZ-T-LA-FRT-cat-FRT-RA, se utilizó para producir una cepa BL21 (DE3) inactivada.
Ejemplo 2: Producción de una cepa BL21 (DE3) inactivada
E. coli BL21 (DE3) se cultivó en medio LB durante una noche a 37°C y las células de BL21 (DE3) competentes para choque térmico se prepararon por métodos convencionales. El plásmido pKD46 se transformó en células BL21 (DE3) competentes y las células transformadas se cultivaron hasta una DO600 nm de 0,4 en medio LB complementado con 100 μg/ml de ampicilina a 30°C. La expresión de la recombinasa Red fue inducida por L-arabinosa (concentración final de 1 mmol/l) durante una hora.
Para el complejo de genes del grupo II inactivado, 500 ng del fragmento de sustitución, amplificado a partir de pEZ-T-LA-FRT-cat-FRT-RA se transfirieron a células BL21 (DE3) competentes mediante electroporación. Las células competentes para electroporación se prepararon por métodos convencionales. La recuperación de las células se
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LB complementado con D-alanina. Se prepararon células competentes de esta cepa inactivada tres veces para la transformación, utilizando el método de choque térmico mediante procedimientos convencionales.
Para eliminar el gen de la β-lactamasa que codificaba la resistencia a ampicilina, el plásmido pNNC1a.23 (pET11dMEAE-hGH(L101C)) que codificaba MEAE-hGH(L101C) y que contenía alrP-alrCD para complementar la carencia de D-alanina de la célula hospedadora, se digirió con AatII/PsiI, seguido de formación de extremos romos y autoligación para eliminar el gen de la β-lactamasa. El plásmido resultante, pNNC1a.23 (pET11d-MEAE-hGH, alr, bla-), se transformó en la célula hospedadora, BL21(DE3)ΔdadXΔalrΔ(kpsM-kpsF) mediante un método de choque térmico. Una sola colonia que creció en la placa LB sin complemento de D-alanina, se seleccionó para preparar las reservas en glicerol para almacenamiento a -80°C.
Dos lotes de fermentación con densidad celular elevada se llevaron a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 5. El crecimiento celular se controló durante el proceso y los resultados se muestran en la Fig. 9.
La expresión de MEAE-hGH(L101C) a través de la cepa de E. coli B BL21 (DE3) ΔdadXΔalrΔ(kpsM-kpsF) que albergaba el plásmido pNNC1a.23, se evaluó en fermentación con densidad celular elevada. El resultado mostraba que la densidad celular en la recogida puede alcanzar hasta aproximadamente 100 medida a DO600 nm, y el nivel de expresión de la proteína diana, MEAE-hGH(L101C), alcanzaba aproximadamente 7 g/l después de 8 horas de inducción, como se muestra en la Fig. 10.
Ejemplo 8: Expresión de sialidasa de Arthrobacter ureafaciens en E. coli BL21 (DE3)Δ(kpsM-kpsF)
La sialidasa de Arthrobacter ureafaciens (AUS, 53,4 kDa de masa teórica) fue producida en Escherichia coli BL21 (DE3)Δ(kpsM-kpsF) con un marcador His C-terminal. El gen de la sialidasa de Arthrobacter ureafaciens, con un marcador His6 en el extremo C-terminal, se clonó en el vector de expresión pET-24a (Novagen) bajo el control del promotor T7. Con el fin de producir la enzima sialidasa de Arthrobacter ureafaciens, se generó un gen optimizado con un codón sintético que codificaba la siguiente secuencia de proteína (SEQ ID 12):
El gen sintético se introdujo en el vector de expresión pET-24a como un fragmento XbaI-XhoI para producir el vector de expresión de AUS, pLLC028. El vector resultante se transformó en BL21 (DE3)Δ(kpsM-kpsF) competente y los transformantes se conservaron en glicerol a -80°C.
Un criotubo del clon de la célula inicial congelada (ICC) se utilizó para inocular dos matraces de agar con medio de extracto de levadura (5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de glucosa, 20 g/l de agar). El medio de agar contenía kanamicina para la selección. La incubación fue a 30°C durante 25 horas. Después de la incubación, las células se retiraron por lavado de la superficie de agar, usando solución estéril de NaCl al 0,9%. Una fermentación de 10 l se inoculó empleando un precultivo procedente de dos matraces de agar. El volumen del inóculo obtenido era de 75 m, y la DO600 nm era 4,3, lo que daba lugar a una DO600 nm inicial en el fermentador de aproximadamente 0,03. La fermentación se llevó a cabo en un recipiente de acero inoxidable de 20 l con un volumen de trabajo inicial de 10 l. La fermentación se inicia con una fase por lotes de 8 horas de duración en un medio complejo que contiene 40 g/l de extracto de levadura, 15 g/l de glicerol (87%), sales y metales traza, seguida de alimentación de glicerol hasta un perfil predeterminado. Durante las primeras 17 horas, la temperatura de fermentación era de 37°C. Después de ello, la temperatura se redujo a 30°C. Después de 18 horas transcurridas de tiempo de fermentación, se añadió el inductor IPTG a 0,1 mM, con el fin de inducir la expresión de la proteína. La duración de la inducción puede ser de hasta 22 horas. El proceso de recuperación consiste en centrifugación, homogeneización a alta presión y microfiltración de flujo cruzado empleando casetes Sartocon Slice con un tamaño de poro de 0,2 µm.
La fermentación de AUS se analizó utilizando SDS-PAGE y un ensayo de la actividad enzimática. El análisis por SDS-PAGE reveló que la sialidasa expresada aparece tanto en la fracción soluble como en el sedimento después de una molienda con perlas. La Figura 11 muestra una fermentación típica, resultado de una ejecución por lotes de 10 L a 30°C de temperatura de inducción e IPTG 0,1 mM.
Ejemplo 9: Expresión del factor de crecimiento de fibroblastos humano 21 (FGF21) en BL21 DE3 y BL21 DE3
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