CN112608911B

CN112608911B - 一种rna聚合酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112608911B
Application number: CN202011508966.8A
Authority: CN
Inventors: 徐佳琪; 蒋宇; 陶荣盛; 杨立荣; 杨晟
Original assignee: Huzhou Zhongke Industrial Biotechnology Center
Current assignee: Huzhou Zhongke Industrial Biotechnology Center
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: CN112608911A

Abstract

本发明公开了一种RNA聚合酶突变体，其为细菌RNA聚合酶β’亚基rpoC发生第457位酪氨酸突变所形成的突变体，其能够促进外源重组蛋白在需钠弧菌中的表达水平，从而增加重组蛋白质生产量，具有商业应用前景。

Description

一种RNA聚合酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种RNA聚合酶突变体及其在促进外源重组蛋白质表达中的用途。

背景技术

高效的微生物重组蛋白表达***能够降低重组蛋白的生产成本。需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种革兰氏阴性、对人类非致病的海洋细菌。其倍增周期在7～10分钟之间，传代速度比大肠杆菌快一倍，是已知代时最短的自由生活细菌，或可发展为一个特色表达***。研究发现，需钠弧菌单个细胞核糖体数量高达115000个，而大肠杆菌只有约70000～90000个，这意味着需钠弧菌具有更快的生物量合成速度和更强的蛋白表达能力。需钠弧菌的高生长和高底物摄取速率在作为宿主表达外源蛋白时，有望在前期快速生长，缩短发酵延滞期，在工业生产中节约能量和时间成本，具有经济意义。

pET***被广泛用来表达外源重组蛋白质，构建时一般将目标蛋白基因置于T7启动子下游，而T7启动子只能由T7RNA聚合酶起始转录。T7RNA聚合酶具备高催化活力，它的转录速度比大肠杆菌内源的RNA聚合酶的转录速度快约8倍。当T7RNA聚合酶被充分诱导时，能够利用细胞中的大部分材料来起始目的蛋白的转录，且在数小时后，目标蛋白能够超过细胞总蛋白的50％。

蛋白质的表达有复杂性，不容易理性设计。当缺乏足够的理论知识和经验来改造具有更高性能的蛋白质生产菌株时，可以使用进化方法分离这样的变异菌株，即通过选择或筛选具有更优生产特性的遗传突变株。通过该策略可以获得一些与外源蛋白质高表达相关的突变位点，用于构建下一代蛋白表达底盘细胞。因此，挖掘与新型表达宿主需钠弧菌蛋白质高表达相关的新靶点可以帮助科研人员优化需钠弧菌蛋白质表达***。

然而，到目前为止，尚没有研究报道使用筛选方法分离出需钠弧菌蛋白质高产突变株、以及提高pET***蛋白质表达的有效突变。

发明内容

考虑到需钠弧菌是目前生长最快的自由生活菌，有望成为下一代细胞工厂用于蛋白质高效表达，通过诱变和高通量筛选技术，或许能够强化T7RNA聚合酶的表达，这对于增加外源重组蛋白(甚至包括外源毒性蛋白)表达是有利的。出于该目的，发明人通过对需钠弧菌VnDX进行紫外诱变和流式细胞分选技术，发现几株对外源蛋白表达水平提高的突变菌株基因组中RNA聚合酶β’亚基发生了突变，在获得的诱变菌株中导入某些蛋白质的pET表达质粒后，发现重组菌株生产这些蛋白质的能力更强，获得了更高的充足蛋白质产量。这一发现构成了本发明的基础，具体而言，本发明包括如下技术方案：

一种RNA聚合酶突变体，其为细菌RNA聚合酶β’亚基rpoC发生第457位酪氨酸(Y或Tyr)突变所形成的突变体。所述的突变选自酪氨酸(Y)被其他氨基酸替换、缺失、或者化学修饰。优选是降低rpoC活性的突变体，即rpoC发生负向突变。

在一种实施方式中，上述酪氨酸(Y)突变是指酪氨酸(Y)突变为其他氨基酸(X)，该情况下该突变体可简称为rpoCY457X，所述其他氨基酸(X)选自下组：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)，从而使RNA聚合酶β’亚基rpoC成为RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体。

优选地，上述酪氨酸(Y)突变是酪氨酸(Y)突变为选自下组的氨基酸：组氨酸(H或His)、亮氨酸(L或Leu)、缬氨酸(V或Val)、丙氨酸(A或Ala)、甲硫氨酸(M或Met)、半胱氨酸(C或Cys)或者丝氨酸(S或Ser)。

其中，RNA聚合酶β’亚基rpoC的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MKDLLNFLKAQHKTEEFDAIKIGLSSPDMIRSWSFGEVKKPETINYRTFKPERDGLFCARIFGPVKDYECLCGKYKRLKHRGVICEKCGVEVTQTKVRRDRMGHIELASPVAHIWFLKSLPSRIGLLMDIPLRDIERVLYFEMYVVTEPGMTDLEKSQMLTEEEYLDRLEEWGDEFTAKMGAEAIKDLLGSMDMHAEAEQMREELETTNSETKRKKVTKRLKLVEAFIQSGNNPEWMILTVLPVLPPDLRPLVPLDGGRFATSDLNDLYRRVINRNNRLKRLLELAAPDIIVRNEKRMLQESVDALLDNGRRGRAITGSNKRPLKSLADMIKGKQGRFRQNLLGKRVDYSGRSVITVGPYLRLHQCGLPKKMALELFKPFIYSKLETRGLATTIKAAKKMVEREEAVVWDILDEVIREHPVLLNRAPTLHRLGIQAFEPVLIEGKAIQLHPLVCAAYNADFDGDQMAVHVPLTLEAQLEARTLMMSTNNILSPASGDPIIVPSQDVVLGLYYMTREKINVKGEGMYLSGPAEAEKAYRTKQAELHARVKVRITETVVDEDGNSTTSTGMVDTTIGRAMLWQIVPAGLPYSIVNQKLGKKQISNLLNEAYRKLGLKDTVIFADQIMYAGFAYAALSGVSVGIDDMVVPPAKYTEIAEAEEEVREIQEQYQSGLVTAGERYNKVIDIWASTNDRVAKAMMENLSSETVVNRDGEEEQQESFNSIYMMADSGARGSAAQIRQLAGMRGLMARPDGSIIETPITANFKEGLNVLQYFISTHGARKGLADTALKTANSGYLTRRLVDVAQDVVVTEHDCGTHEGVDMMPHIEGGDVKVALSELALGRVVAEDVLKPGTEDVLIPRNTLIDEKWCQIMEENSVDSMKVRSVVTCDSDFGCCAQCYGRDLARGHLVNQGEAVGVIAAQSIGEPGTQLTMRTFHIGGAASTAAAENSVQAKNNGSIKLHNAKSVVADDGKIVITSRATELTIIDEFGRTKEKHKLPYGTLLSKGDGDTVQAGETVANWEAHTLPIITEVAGRIQFVDMIDGVTVSRQTDDLTGLSSSEVTDAAARPSAGKDMRPAIKLVDEQGNDVMIPGTDMPAHYFLPGKAIVNIEDGAAVGVGATLARIPQKSGGNKDITGGLPRVADLFEARKPKEPAILAEHTGTVSFGKETKGKRRLVITRDSGEAYEEMIPKHRQLNVFEGEKVERGDVIADGPESPHDILRLRGVHAVTQYIANEVQEVYRLQGVKINDKHIETIVRQMLRKCTITFAGDSEFLPGEQVEYSQVKIANRNLEAEGKEPARFERELLGITKASLATESFISAASFQETTRVLTEAAVSGKRDDLRGLKENVIVGRLIPAGTGFAYHQERQAKRTEAQEGPSAEQATDNLAALLNAGFSSEE(SEQ ID NO:1)。

相对应地，上述RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1中第457位的Tyr(或Y)分别替换为His(或H)、Leu(或L)、Val(或V)、Ala(或A)、Met(或M)、Cys(或C)或者Ser(或S)后所得到的氨基酸序列。例如突变体rpoC Y457C的氨基酸序列为SEQID NO:2：

MKDLLNFLKAQHKTEEFDAIKIGLSSPDMIRSWSFGEVKKPETINYRTFKPERDGLFCARIFGPVKDYECLCGKYKRLKHRGVICEKCGVEVTQTKVRRDRMGHIELASPVAHIWFLKSLPSRIGLLMDIPLRDIERVLYFEMYVVTEPGMTDLEKSQMLTEEEYLDRLEEWGDEFTAKMGAEAIKDLLGSMDMHAEAEQMREELETTNSETKRKKVTKRLKLVEAFIQSGNNPEWMILTVLPVLPPDLRPLVPLDGGRFATSDLNDLYRRVINRNNRLKRLLELAAPDIIVRNEKRMLQESVDALLDNGRRGRAITGSNKRPLKSLADMIKGKQGRFRQNLLGKRVDYSGRSVITVGPYLRLHQCGLPKKMALELFKPFIYSKLETRGLATTIKAAKKMVEREEAVVWDILDEVIREHPVLLNRAPTLHRLGIQAFEPVLIEGKAIQLHPLVCAACNADFDGDQMAVHVPLTLEAQLEARTLMMSTNNILSPASGDPIIVPSQDVVLGLYYMTREKINVKGEGMYLSGPAEAEKAYRTKQAELHARVKVRITETVVDEDGNSTTSTGMVDTTIGRAMLWQIVPAGLPYSIVNQKLGKKQISNLLNEAYRKLGLKDTVIFADQIMYAGFAYAALSGVSVGIDDMVVPPAKYTEIAEAEEEVREIQEQYQSGLVTAGERYNKVIDIWASTNDRVAKAMMENLSSETVVNRDGEEEQQESFNSIYMMADSGARGSAAQIRQLAGMRGLMARPDGSIIETPITANFKEGLNVLQYFISTHGARKGLADTALKTANSGYLTRRLVDVAQDVVVTEHDCGTHEGVDMMPHIEGGDVKVALSELALGRVVAEDVLKPGTEDVLIPRNTLIDEKWCQIMEENSVDSMKVRSVVTCDSDFGCCAQCYGRDLARGHLVNQGEAVGVIAAQSIGEPGTQLTMRTFHIGGAASTAAAENSVQAKNNGSIKLHNAKSVVADDGKIVITSRATELTIIDEFGRTKEKHKLPYGTLLSKGDGDTVQAGETVANWEAHTLPIITEVAGRIQFVDMIDGVTVSRQTDDLTGLSSSEVTDAAARPSAGKDMRPAIKLVDEQGNDVMIPGTDMPAHYFLPGKAIVNIEDGAAVGVGATLARIPQKSGGNKDITGGLPRVADLFEARKPKEPAILAEHTGTVSFGKETKGKRRLVITRDSGEAYEEMIPKHRQLNVFEGEKVERGDVIADGPESPHDILRLRGVHAVTQYIANEVQEVYRLQGVKINDKHIETIVRQMLRKCTITFAGDSEFLPGEQVEYSQVKIANRNLEAEGKEPARFERELLGITKASLATESFISAASFQETTRVLTEAAVSGKRDDLRGLKENVIVGRLIPAGTGFAYHQERQAKRTEAQEGPSAEQATDNLAALLNAGFSSEE(SEQ ID NO:2)。

根据本发明的第二个方面，提供了编码上述RNA聚合酶突变体或者RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体的基因。

根据本发明的第三个方面，提供了一种包含上述基因的质粒。该质粒用于在细菌比如需钠弧菌或者大肠杆菌中表达所述RNA聚合酶突变体、或者所述RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体。

根据本发明的第四个方面，提供了一种细菌工程菌，宿主基因组中RNA聚合酶的β’亚基rpoC的基因突变为如权利要求4中所述的RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体的编码基因，即RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体基因。该突变使得该细菌能够表达上述的RNA聚合酶突变体。

可替代地，细菌工程菌的宿主基因组中可以整合入上述RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体基因或者RNA聚合酶突变体的基因。其中“整合”的方法可以采用本领域熟知的方式，比如构建包含上述RNA聚合酶突变体中β’亚基rpoC基因、或者RNA聚合酶突变体的基因的重组质粒，再通过化学转化法或电转法将该重组质粒转化入宿主细胞，实现基因组整合。

上述细菌包括但不限于需钠弧菌或者大肠杆菌，优选细菌是需钠弧菌，例如是需钠弧菌ATCC14048。

根据本发明的第五个方面，提供了一种构建上述细菌工程菌的方法，其采用同源重组技术或者基因编辑技术对细菌基因组实施基因改造。

上述基因编辑技术可以采用CRISPR-Cas9***、CRISPR-Cpf1***、CRISPR-Cas相关的转座***INTEGRATE***或者CAST***。

上述INTEGRATE***是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件***)；CAST***是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase，CRISPR相关转座酶)。

根据本发明的第六个方面，提供了上述细菌工程菌在表达重组蛋白质中的应用。即，本发明提供了一种利用细菌基因组中RNA聚合酶β’亚基突变来提高外源重组蛋白质表达的方法。

具体地，构建包含T7RNA聚合酶编码基因和所述重组蛋白质的编码基因的质粒，将该重组质粒转化入上述细菌工程菌中，得到重组细菌工程菌，用于表达所述重组蛋白质。例如，通过细菌工程菌发酵进行重组蛋白质的生产。

根据本发明的另一个方面，提供了上述质粒是pET质粒，其中所述重组蛋白质的编码基因位于T7启动子下游、或者T7RNA聚合酶编码基因和所述重组蛋白的编码基因都位于T7启动子下游。

实验表明，本发明的RNA聚合酶突变体能够强化T7RNA聚合酶的表达，从而促进外源重组蛋白质比如转氨酶等在细菌尤其是需钠弧菌和大肠杆菌中的表达，具有推广应用前景。

附图说明

图1是本发明构建的pET24a-ω转氨酶-绿色荧光蛋白质粒的结构示意图。

图2是本发明构建的需钠弧菌经诱变和高通量筛选的菌株经摇瓶培养后的绿色荧光强度测定对比柱形图。其中纵坐标是绿色荧光强度(Fluoresence)，横坐标是对照菌株(OATA、OATA-EGFP、EGFP)和突变菌株编号。

图3是本发明构建的需钠弧菌基因组RNA聚合酶β’亚基rpoC发生Y457位点饱和突变菌的绿色荧光强度对比柱形图。其中纵坐标是绿色荧光强度(GFP Fluoresence)，横坐标是出发菌株(VnDX)和工程菌株(Y457位点突变为其他氨基酸)编号。

具体实施方式

为了在需钠弧菌中表达外源重组蛋白，本发明通过诱变育种技术对于对需钠弧菌VnDX进行诱变和流式细胞分选，并对于优秀的突变菌株进行基因测序和比较基因组学研究，意外地发现了RNA聚合酶β’亚基rpoC发生第457位酪氨酸(简写为rpoC Y457)的某些突变能够提高外源重组蛋白质的表达水平。在基因组改造后的工程菌中转化入常用于表达外源重组蛋白质的pET质粒后，T7RNA聚合酶和重组蛋白的表达水平都得到了提高。

根据这一发现，本发明提供了一种提高细菌比如需钠弧菌中外源重组蛋白质表达的方法，利用细菌基因组中RNA聚合酶β’亚基突变来实现。

为描述简单起见，本文中将宿主细菌基因组中RNA聚合酶β’亚基rpoC发生第457位酪氨酸(rpoC Y457)突变的菌株称为“(细菌)工程菌”，在其内转化入表达外源重组蛋白的质粒比如pET质粒后所得到的菌株称为“重组(细菌)工程菌”。本领域技术人员能够清楚地理解其目的主要是为了区分是否导入了重组质粒与否。

在本文中，为了描述简便，有时会将某种蛋白比如RNA聚合酶与其编码基因名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。

本发明的RNA聚合酶突变体中β’亚基rpoC突变体的氨基酸序列结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

为了在某些细菌比如需钠弧菌或者大肠杆菌中表达RNA聚合酶突变体，可以对其表达基因进行密码子优化，以便在不同微生物中进行RNA聚合酶突变体的最佳表达。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如需钠弧菌和大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

当宿主细菌基因组中发生上述RNA聚合酶β’亚基突变后，能够促进T7RNA聚合酶的表达，提高外源重组蛋白质在需钠弧菌中的表达水平，从而增加重组蛋白质生产量，具有商业应用前景。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。

需钠弧菌天然感受态细胞转化方法及感受态制备方法参照文献(Dalia,T.N.,etal.Multiplex Genome Editing by Natural Transformation(MuGENT)for SyntheticBiology in Vibrio natriegens.ACS Synth Biol.2017)公开方法进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

实施例中所述的含抗生素比如carb(羧苄青霉素)、spec(壮观霉素)等的LB固体培养基平板可简称为抗生素平板比如carb/spec平板。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

需钠弧菌ATCC14048购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)。

pdnsaLR-SpecR质粒、pET-24a-OATA质粒由中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心保存，任何单位和个人都可以获得该质粒及相关质粒和细菌用于验证本发明，但未经中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心允许不得用作其他用途，包括开发利用、科学研究和教学。

实施例1：整合T7RNA聚合酶表达盒

参照文献(Dalia,T.N.,et al.,Multiplex Genome Editing by NaturalTransformation(MuGENT)for Synthetic Biology in Vibrio natriegens.ACS SynthBiol.2017)公开的方法，运用天然转化和同源重组技术将大肠杆菌BL21(DE3)来源的T7RNA聚合酶表达盒整合入需钠弧菌ATCC14048菌株dns位点，命名为VnDX。基因改造后的需钠弧菌中带有了T7RNA聚合酶表达盒，能够用pET质粒来表达外源蛋白。

具体步骤包括：

1.1构建pdnsaLR-T7RNAP-SpecR质粒

以pdnsaLR-SpecR质粒为模板，采用引物对T7R(dns)-Fn和T7R(dns)-Rn进行PCR，得到长度约为4.6kb的DNA片段，采用引物对Spec(T7)-F和dnsaL-R进行PCR,得到长度约为9.7kb的DNA片段。

T7R(dns)-Fn：

5’-ggataaagtcatactttttaaagactttaactgcatgcccgagaagatgttgagcaaac-3’；

T7R(dns)-Rn：

5’-cacatgaactcgagtagggataacagggtaatcccgggcacagtatcaaggtattttat-3’；

Spec(T7)-F：

5’-agttaaagtctttaaaaagtatgactttatccattctatc-3’；

dnsaL-R：

5’-gtgcgcgcataaaataccttgatactgtgcccgggattaccctgttatccctactcgag-3’。

电泳凝胶回收2个DNA片段，然后将2个克隆片段通过DNA快速组装试剂盒(诺唯赞，C112-01)，化学转化法转入DH5α转感受态细胞中，涂布壮观霉素或氨苄青霉素抗性LB平板，37℃培养过夜，次日挑菌落接试管保菌即可。

1.2修复模板的获得

抽提pdnsaLR-T7RNAP-SpecR质粒，用限制性内切酶XbaI酶切，获得线性化片段dnsaLR-T7RNAP-SpecR。

1.3含T7RNA聚合酶表达盒的需钠弧菌获得

a.参照文献(Dalia,T.N.,et al.,ACS Synth Biol.2017)，电转质粒pTfoX(由印第安纳大学Ankur B.Dalia惠赠)至宿主菌VnDX中，涂Carb(羧苄青霉素)平板，30℃培养。

b.挑取阳性克隆子，制备天然转化感受态细胞，在试管培养天然转化感受态细胞时加入03mM IPTG诱导TFOX的表达。

c.天然转化法转入步骤1.2中所得的片段dnsaLR-T7RNAP-SpecR，30℃复苏1小时后，以carb+spec平板进行筛选。

d.过夜培养后对克隆子进行验证，得到需钠弧菌VnDX，其基因组中的DNS位点已经整合了T7RNA聚合酶表达盒。以该需钠弧菌VnDX为宿主，进行外源重组蛋白质的表达生产。

实施例2：构建含pET24a-ω转氨酶-绿色荧光蛋白质粒的需钠弧菌

参照《分子克隆实验指南》的方法，构建融合表达ω-转氨酶和绿色荧光蛋白的质粒，并将其转入大肠杆菌DH5α中，构建正确的质粒命名为pET24a-OATA-GFP。参照文献(Weinstock,M.T.,et al.Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecularbiology.Nat Methods 13(10):849-851.2016)公开的方法，将前述质粒电转入需钠弧菌VnDX，将菌株命名为VnDX/pOATA-GFP。

具体步骤包括：

2.1构建pET24a-OATA-GFP质粒

以pET-24a-OATA质粒为模板，采用引物对OATA-F和OATA-R进行PCR，得到长度约为6.6kb的DNA片段，采用引物对EGFP-F和EGFP-R进行PCR，得到长度约为7.2kb的DNA片段。

OATA-F：

5’-ggatccgaattcgagctccg-3’；

OATA-R：

5’-cctggtgaggcttgcctgaa-3’；

EGFP-F：

5’-ttcaggcaagcctcaccaggatggtgagcaagggcgag-3’；

EGFP-R：

5’-cggagctcgaattcggatccttacttgtacagctcgtccatgc-3’。

电泳凝胶回收2个DNA片段，然后将2个克隆片段通过Gibson组装，化学转化法转入DH5α转感受态细胞中，涂布Kan抗性LB平板，37℃培养过夜，次日挑菌落PCR鉴定，测序正确的克隆接试管保菌即可。

构建出的pET24a-OATA-GFP质粒能够同时表达ω-转氨酶和绿色荧光蛋白GFP，结构如图1所示。

2.2含pET24a-OATA-GFP质粒的需钠弧菌获得

参照文献(Weinstock,M.T.,et al.Nat Methods 13(10):849-851.2016)，将从DH5α中抽提的质粒pET24a-OATA-GFP电转至宿主菌VnDX中，涂Kan平板，30℃培养。挑取转化子接试管，过夜培养后保藏菌种，获得菌株VnDX/pET24a-OATA-GFP。

实施例3：诱变和高通量筛选绿色荧光蛋白增强的需钠弧菌

3.1紫外诱变：

菌株VnDX/pET24a-OATA-GFP接入丰富培养基(BHIv2，Kan200μg/mL)试管，30℃过夜生长，转接丰富培养基(BHIv2，Kan200μg/mL)生长至OD＝0.6。离心，菌体用预热30℃的生理盐水(0.9％氯化钠溶液)洗涤离心，并用生理盐水悬浮至OD＝0.2。取10毫升菌液，倒入装2克玻璃珠的三角瓶中，30度240rpm处理10分钟。菌液移入60厘米无菌培养皿中，加入无菌搅拌子搅拌，置于紫外诱变仪(北京赛百奥科技有限公司，CB10-UV8A型)的诱变箱中用紫外线照射2秒，红光下将菌液涂布于BHIv2(Kan200μg/mL)固体平板，30℃培养直至形成足够大小的单菌落(～8h)。

3.2诱变体库高通量筛选

刮取平板上的诱变菌，转移至试管，过夜培养。第二天转接于含有0.3mM IPTG的BHIv2培养基中，30℃诱导OATA和GFP表达约6h。离心收菌后，用无菌PBS重悬菌体至OD600约0.4。流式细胞仪分选荧光增强的菌。并收集单菌于固体平板上。挑取平板上的克隆，接种于含有400ulBHIv2(Kan200μg/mL，0.3mM IPTG)培养基的96深孔板中，30℃，250rpm培养24小时。取200μl发酵液转移至96孔板中，酶标仪检测荧光强度。

3.3实验结果

酶标仪检测ω-转氨酶和绿色荧光蛋白融合表达时，绿色荧光蛋白强度，其中菌株1-5-C，1-6-E，1-6-F，1-7-E，1-8-E，1-8-G，1-11-C，2-3-E，2-4-E，2-5-F，2-6-F，2-8-D，2-8-F获得比诱变前菌株更强的绿色荧光蛋白强度，这表明在前述诱变菌中，pET质粒上的外源基因具有更强的表达。参见图2。

3.4分析突变位点

对于步骤3.3中筛选出的突变菌株，进行OATA酶活复筛、基因组测序和比较基因组学研究。发现了六个突变菌株1-6-F、1-8-G、1-11-C、2-3-E、2-5-F和2-8-D的基因组中发生了RNA聚合酶β’亚基rpoC第457位酪氨酸突变。据分析，该突变有可能降低rpoC活性。该结果提示β’亚基rpoC第457位酪氨酸的突变可能会引起RNA聚合酶活性的变化，因此决定对该靶点进行饱和突变。

实施例4：rpoC Y457位点饱和突变

参照文献(Dalia,T.N.,et al.Multiplex Genome Editing by NaturalTransformation(MuGENT)for Synthetic Biology in Vibrio natriegens.ACS SynthBiol.2017)公开的方法，运用天然转化和同源重组技术将需钠弧菌VnDX的RNA聚合酶β’亚基第457位氨基酸从酪氨酸突变为其他氨基酸。

具体步骤包括：

2.1构建用于饱和突变的同源重组片段

以需钠弧菌基因组为模板，采用引物对22263u-F和22263u-R进行PCR，得到长度为3kb的DNA片段，采用引物对A-22263d-F，C-22263d-F，D-22263d-F，E-22263d-F，F-22263d-F，G-22263d-F，H-22263d-F，I-22263d-F，K-22263d-F，L-22263d-F，M-22263d-F，N-22263d-F，P-22263d-F，Q-22263d-F，R-22263d-F，S-22263d-F，T-22263d-F，V-22263d-F，W-22263d-F，Y-22263d-F或stop-22263d-F和22263d-R进行PCR,得到长度为3kb的DNA片段22263A、22263C、22263D、22263E、22263F、22263G、22263H、22263I、22263K、22263L、22263M、22263N、22263P、22263Q、22263R、22263S、22263T、22263V、22263W、22263Y或22263stop，采用引物对22263u-F和22263d-R进行重叠延伸PCR，得到长度为6kb的同源重组修复模板DNA片段。

22263u-F：

5’-acgacaatccacattcaagaactgacttgtgtggcacg-3’；

22263u-R：

5’-cgccgcacacacaagtgggtgtagctgaatcgctttac-3’；

A-22263d-F：

5’-cacttgtgtgtgcggcgGCAaacgcggacttcgatggtg-3’；

C-22263d-F：

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D-22263d-F：

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E-22263d-F：

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F-22263d-F：

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G-22263d-F

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H-22263d-F

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I-22263d-F

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K-22263d-F

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L-22263d-F

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M-22263d-F

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N-22263d-F

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P-22263d-F

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Q-22263d-F

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R-22263d-F

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S-22263d-F

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T-22263d-F

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V-22263d-F

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W-22263d-F

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Y-22263d-F

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stop-22263d-F

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22263d-R：

5’-caatgccaccaggggcttaaacgaactctggctaatct-3’

2.2修复模板的获得

抽提pdnsaLR-T7RNAP-CmR质粒，用限制性内切酶XbaI酶切，获得线性化片段dnsaLR-T7RNAP-CmR。

2.3 rpoC Y457位点突变的需钠弧菌获得

a.参照文献(Dalia,T.N.,et al.,ACS Synth Biol.2017)，电转质粒pTfoX至宿主菌VnDX中，涂Carb平板，30℃培养。

b.挑取阳性克隆子，制备天然转化感受态细胞，在试管培养天然转化感受态细胞时加入0.3mM IPTG诱导TFOX的表达。

c.天然转化法转入步骤2.1和2.2中所得的片段22263A、22263C、22263D、22263E、22263F、22263G、22263H、22263I、22263K、22263L、22263M、22263N、22263P、22263Q、22263R、22263S、22263T、22263V、22263W、22263Y或22263stop和dnsaLR-T7RNAP-CmR，30℃复苏1小时后，以carb+cm平板进行筛选。

d.过夜培养后对克隆子进行测序验证，得到rpoCY457位点突变的需钠弧菌，其基因组中rpoC第457位氨基酸已经突变为各个氨基酸。以这些需钠弧菌为宿主，进行外源重组蛋白质的表达生产。

实施例5：rpoC Y457位点饱和突变菌绿色荧光蛋白强度测试

5.1菌体培养

固体平板划线活化rpoCY457饱和突变菌株，挑取单克隆接种于5ml含有200μg/ml的BHIv2培养基的试管，30℃，250rpm培养过夜。各取0.5ml过夜培养，接种至50ml含有200μg/ml硫酸卡那霉素的BHIv2培养基中，30℃，220rpm摇床培养24小时。

5.2绿色荧光蛋白检测

将上述发酵的每个摇瓶取200μl的菌液置于96孔板(黑色)用于酶标仪检测绿色荧光蛋白强度。将上述发酵液对应的每个摇瓶取20μl的菌液置于96孔板(透明)，再加180μl无菌水稀释并混匀，用于酶标仪检测发酵液浓度。酶标仪读取OD600和绿色荧光蛋白强度，检测结果见图3。

5.3实验结果

从图3所示的绿色荧光检测结果可知，当原本为极性芳香族氨基酸酪氨酸的rpoC457位点突变成亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、组氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、谷氨酸和异亮氨酸时，pET质粒上的绿色荧光蛋白都比Y457未突变菌株VnDX强，这说明将rpoC的第457位突变为前述几种氨基酸时，能增强需钠弧菌重组蛋白质的表达量。

以上实施例表明，本发明通过紫外诱变和高通量筛选获得需钠弧菌RNA聚合酶β’亚基rpoC的第457位点突变体，借助该突变体在宿主细菌中的表达，使得外源重组蛋白质比如绿色荧光蛋白、转氨酶在突变株中的表达水平有了一定程度的提高，具有很高的商业应用推广价值。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心

<120> 一种RNA聚合酶突变体及其应用

<130> SHPI2010669

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1400

<212> PRT

<213> Vibrio natriegens

<400> 1

Met Lys Asp Leu Leu Asn Phe Leu Lys Ala Gln His Lys Thr Glu Glu

1 5 10 15

Phe Asp Ala Ile Lys Ile Gly Leu Ser Ser Pro Asp Met Ile Arg Ser

20 25 30

Trp Ser Phe Gly Glu Val Lys Lys Pro Glu Thr Ile Asn Tyr Arg Thr

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Phe Lys Pro Glu Arg Asp Gly Leu Phe Cys Ala Arg Ile Phe Gly Pro

50 55 60

Val Lys Asp Tyr Glu Cys Leu Cys Gly Lys Tyr Lys Arg Leu Lys His

65 70 75 80

Arg Gly Val Ile Cys Glu Lys Cys Gly Val Glu Val Thr Gln Thr Lys

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Val Arg Arg Asp Arg Met Gly His Ile Glu Leu Ala Ser Pro Val Ala

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His Ile Trp Phe Leu Lys Ser Leu Pro Ser Arg Ile Gly Leu Leu Met

115 120 125

Asp Ile Pro Leu Arg Asp Ile Glu Arg Val Leu Tyr Phe Glu Met Tyr

130 135 140

Val Val Thr Glu Pro Gly Met Thr Asp Leu Glu Lys Ser Gln Met Leu

145 150 155 160

Thr Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Arg Leu Glu Glu Trp Gly Asp Glu Phe

165 170 175

Thr Ala Lys Met Gly Ala Glu Ala Ile Lys Asp Leu Leu Gly Ser Met

180 185 190

Asp Met His Ala Glu Ala Glu Gln Met Arg Glu Glu Leu Glu Thr Thr

195 200 205

Asn Ser Glu Thr Lys Arg Lys Lys Val Thr Lys Arg Leu Lys Leu Val

210 215 220

Glu Ala Phe Ile Gln Ser Gly Asn Asn Pro Glu Trp Met Ile Leu Thr

225 230 235 240

Val Leu Pro Val Leu Pro Pro Asp Leu Arg Pro Leu Val Pro Leu Asp

245 250 255

Gly Gly Arg Phe Ala Thr Ser Asp Leu Asn Asp Leu Tyr Arg Arg Val

260 265 270

Ile Asn Arg Asn Asn Arg Leu Lys Arg Leu Leu Glu Leu Ala Ala Pro

275 280 285

Asp Ile Ile Val Arg Asn Glu Lys Arg Met Leu Gln Glu Ser Val Asp

290 295 300

Ala Leu Leu Asp Asn Gly Arg Arg Gly Arg Ala Ile Thr Gly Ser Asn

305 310 315 320

Lys Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Gln Gly

325 330 335

Arg Phe Arg Gln Asn Leu Leu Gly Lys Arg Val Asp Tyr Ser Gly Arg

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Ser Val Ile Thr Val Gly Pro Tyr Leu Arg Leu His Gln Cys Gly Leu

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Pro Lys Lys Met Ala Leu Glu Leu Phe Lys Pro Phe Ile Tyr Ser Lys

370 375 380

Leu Glu Thr Arg Gly Leu Ala Thr Thr Ile Lys Ala Ala Lys Lys Met

385 390 395 400

Val Glu Arg Glu Glu Ala Val Val Trp Asp Ile Leu Asp Glu Val Ile

405 410 415

Arg Glu His Pro Val Leu Leu Asn Arg Ala Pro Thr Leu His Arg Leu

420 425 430

Gly Ile Gln Ala Phe Glu Pro Val Leu Ile Glu Gly Lys Ala Ile Gln

435 440 445

Leu His Pro Leu Val Cys Ala Ala Tyr Asn Ala Asp Phe Asp Gly Asp

450 455 460

Gln Met Ala Val His Val Pro Leu Thr Leu Glu Ala Gln Leu Glu Ala

465 470 475 480

Arg Thr Leu Met Met Ser Thr Asn Asn Ile Leu Ser Pro Ala Ser Gly

485 490 495

Asp Pro Ile Ile Val Pro Ser Gln Asp Val Val Leu Gly Leu Tyr Tyr

500 505 510

Met Thr Arg Glu Lys Ile Asn Val Lys Gly Glu Gly Met Tyr Leu Ser

515 520 525

Gly Pro Ala Glu Ala Glu Lys Ala Tyr Arg Thr Lys Gln Ala Glu Leu

530 535 540

His Ala Arg Val Lys Val Arg Ile Thr Glu Thr Val Val Asp Glu Asp

545 550 555 560

Gly Asn Ser Thr Thr Ser Thr Gly Met Val Asp Thr Thr Ile Gly Arg

565 570 575

Ala Met Leu Trp Gln Ile Val Pro Ala Gly Leu Pro Tyr Ser Ile Val

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Asn Gln Lys Leu Gly Lys Lys Gln Ile Ser Asn Leu Leu Asn Glu Ala

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Tyr Arg Lys Leu Gly Leu Lys Asp Thr Val Ile Phe Ala Asp Gln Ile

610 615 620

Met Tyr Ala Gly Phe Ala Tyr Ala Ala Leu Ser Gly Val Ser Val Gly

625 630 635 640

Ile Asp Asp Met Val Val Pro Pro Ala Lys Tyr Thr Glu Ile Ala Glu

645 650 655

Ala Glu Glu Glu Val Arg Glu Ile Gln Glu Gln Tyr Gln Ser Gly Leu

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675 680 685

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Thr Val Val Asn Arg Asp Gly Glu Glu Glu Gln Gln Glu Ser Phe Asn

705 710 715 720

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740 745 750

Ser Ile Ile Glu Thr Pro Ile Thr Ala Asn Phe Lys Glu Gly Leu Asn

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Val Leu Gln Tyr Phe Ile Ser Thr His Gly Ala Arg Lys Gly Leu Ala

770 775 780

Asp Thr Ala Leu Lys Thr Ala Asn Ser Gly Tyr Leu Thr Arg Arg Leu

785 790 795 800

Val Asp Val Ala Gln Asp Val Val Val Thr Glu His Asp Cys Gly Thr

805 810 815

His Glu Gly Val Asp Met Met Pro His Ile Glu Gly Gly Asp Val Lys

820 825 830

Val Ala Leu Ser Glu Leu Ala Leu Gly Arg Val Val Ala Glu Asp Val

835 840 845

Leu Lys Pro Gly Thr Glu Asp Val Leu Ile Pro Arg Asn Thr Leu Ile

850 855 860

Asp Glu Lys Trp Cys Gln Ile Met Glu Glu Asn Ser Val Asp Ser Met

865 870 875 880

Lys Val Arg Ser Val Val Thr Cys Asp Ser Asp Phe Gly Cys Cys Ala

885 890 895

Gln Cys Tyr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Gly His Leu Val Asn Gln Gly

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Glu Ala Val Gly Val Ile Ala Ala Gln Ser Ile Gly Glu Pro Gly Thr

915 920 925

Gln Leu Thr Met Arg Thr Phe His Ile Gly Gly Ala Ala Ser Thr Ala

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Ala Ala Glu Asn Ser Val Gln Ala Lys Asn Asn Gly Ser Ile Lys Leu

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His Asn Ala Lys Ser Val Val Ala Asp Asp Gly Lys Ile Val Ile Thr

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Ser Arg Ala Thr Glu Leu Thr Ile Ile Asp Glu Phe Gly Arg Thr Lys

980 985 990

Glu Lys His Lys Leu Pro Tyr Gly Thr Leu Leu Ser Lys Gly Asp Gly

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Asp Thr Val Gln Ala Gly Glu Thr Val Ala Asn Trp Glu Ala His Thr

1010 1015 1020

Leu Pro Ile Ile Thr Glu Val Ala Gly Arg Ile Gln Phe Val Asp Met

1025 1030 1035 1040

Ile Asp Gly Val Thr Val Ser Arg Gln Thr Asp Asp Leu Thr Gly Leu

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Ser Ser Ser Glu Val Thr Asp Ala Ala Ala Arg Pro Ser Ala Gly Lys

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Met Ile Pro Gly Thr Asp Met Pro Ala His Tyr Phe Leu Pro Gly Lys

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Ala Ile Val Asn Ile Glu Asp Gly Ala Ala Val Gly Val Gly Ala Thr

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Leu Ala Arg Ile Pro Gln Lys Ser Gly Gly Asn Lys Asp Ile Thr Gly

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Gly Leu Pro Arg Val Ala Asp Leu Phe Glu Ala Arg Lys Pro Lys Glu

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Pro Ala Ile Leu Ala Glu His Thr Gly Thr Val Ser Phe Gly Lys Glu

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Thr Lys Gly Lys Arg Arg Leu Val Ile Thr Arg Asp Ser Gly Glu Ala

1170 1175 1180

Tyr Glu Glu Met Ile Pro Lys His Arg Gln Leu Asn Val Phe Glu Gly

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Glu Lys Val Glu Arg Gly Asp Val Ile Ala Asp Gly Pro Glu Ser Pro

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His Asp Ile Leu Arg Leu Arg Gly Val His Ala Val Thr Gln Tyr Ile

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Tyr Ser Gln Val Lys Ile Ala Asn Arg Asn Leu Glu Ala Glu Gly Lys

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Glu Pro Ala Arg Phe Glu Arg Glu Leu Leu Gly Ile Thr Lys Ala Ser

1300 1305 1310

Leu Ala Thr Glu Ser Phe Ile Ser Ala Ala Ser Phe Gln Glu Thr Thr

1315 1320 1325

Arg Val Leu Thr Glu Ala Ala Val Ser Gly Lys Arg Asp Asp Leu Arg

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Gly Leu Lys Glu Asn Val Ile Val Gly Arg Leu Ile Pro Ala Gly Thr

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Gly Phe Ala Tyr His Gln Glu Arg Gln Ala Lys Arg Thr Glu Ala Gln

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Glu Gly Pro Ser Ala Glu Gln Ala Thr Asp Asn Leu Ala Ala Leu Leu

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Asn Ala Gly Phe Ser Ser Glu Glu

1395 1400

<210> 2

<211> 1400

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Lys Asp Leu Leu Asn Phe Leu Lys Ala Gln His Lys Thr Glu Glu

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Phe Asp Ala Ile Lys Ile Gly Leu Ser Ser Pro Asp Met Ile Arg Ser

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Trp Ser Phe Gly Glu Val Lys Lys Pro Glu Thr Ile Asn Tyr Arg Thr

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Asp Met His Ala Glu Ala Glu Gln Met Arg Glu Glu Leu Glu Thr Thr

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Ile Asn Arg Asn Asn Arg Leu Lys Arg Leu Leu Glu Leu Ala Ala Pro

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Lys Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Gln Gly

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Gly Ile Gln Ala Phe Glu Pro Val Leu Ile Glu Gly Lys Ala Ile Gln

435 440 445

Leu His Pro Leu Val Cys Ala Ala Cys Asn Ala Asp Phe Asp Gly Asp

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Arg Thr Leu Met Met Ser Thr Asn Asn Ile Leu Ser Pro Ala Ser Gly

485 490 495

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565 570 575

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Ala Glu Glu Glu Val Arg Glu Ile Gln Glu Gln Tyr Gln Ser Gly Leu

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675 680 685

Thr Asn Asp Arg Val Ala Lys Ala Met Met Glu Asn Leu Ser Ser Glu

690 695 700

Thr Val Val Asn Arg Asp Gly Glu Glu Glu Gln Gln Glu Ser Phe Asn

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Ser Ile Tyr Met Met Ala Asp Ser Gly Ala Arg Gly Ser Ala Ala Gln

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Ile Arg Gln Leu Ala Gly Met Arg Gly Leu Met Ala Arg Pro Asp Gly

740 745 750

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Val Leu Gln Tyr Phe Ile Ser Thr His Gly Ala Arg Lys Gly Leu Ala

770 775 780

Asp Thr Ala Leu Lys Thr Ala Asn Ser Gly Tyr Leu Thr Arg Arg Leu

785 790 795 800

Val Asp Val Ala Gln Asp Val Val Val Thr Glu His Asp Cys Gly Thr

805 810 815

His Glu Gly Val Asp Met Met Pro His Ile Glu Gly Gly Asp Val Lys

820 825 830

Val Ala Leu Ser Glu Leu Ala Leu Gly Arg Val Val Ala Glu Asp Val

835 840 845

Leu Lys Pro Gly Thr Glu Asp Val Leu Ile Pro Arg Asn Thr Leu Ile

850 855 860

Asp Glu Lys Trp Cys Gln Ile Met Glu Glu Asn Ser Val Asp Ser Met

865 870 875 880

Lys Val Arg Ser Val Val Thr Cys Asp Ser Asp Phe Gly Cys Cys Ala

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Glu Lys His Lys Leu Pro Tyr Gly Thr Leu Leu Ser Lys Gly Asp Gly

995 1000 1005

Asp Thr Val Gln Ala Gly Glu Thr Val Ala Asn Trp Glu Ala His Thr

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Leu Pro Ile Ile Thr Glu Val Ala Gly Arg Ile Gln Phe Val Asp Met

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His Asp Ile Leu Arg Leu Arg Gly Val His Ala Val Thr Gln Tyr Ile

1220 1225 1230

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1285 1290 1295

Glu Pro Ala Arg Phe Glu Arg Glu Leu Leu Gly Ile Thr Lys Ala Ser

1300 1305 1310

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Glu Gly Pro Ser Ala Glu Gln Ala Thr Asp Asn Leu Ala Ala Leu Leu

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Asn Ala Gly Phe Ser Ser Glu Glu

1395 1400

Claims

1.一种RNA聚合酶突变体，其为细菌RNA聚合酶β’亚基rpoC发生第457位酪氨酸突变所形成的突变体，其中RNA聚合酶β’亚基rpoC的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述酪氨酸突变是酪氨酸突变为选自下组的氨基酸：组氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸或者丝氨酸，从而使RNA聚合酶β’亚基rpoC成为RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体。

2.编码如权利要求1中所述RNA聚合酶突变体的基因。

3.包含如权利要求2中所述基因的质粒，该质粒用于在细菌中表达所述RNA聚合酶突变体。

4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述细菌是需钠弧菌或者大肠杆菌。

5.一种细菌工程菌，其特征在于，宿主基因组中RNA聚合酶突变体的基因突变为如权利要求2中所述的RNA聚合酶突变体的基因；或者

宿主基因组中整合了如权利要求2中所述的RNA聚合酶突变体的基因。

6.如权利要求5所述的细菌工程菌，所述细菌是需钠弧菌或者大肠杆菌。

7.一种构建如权利要求5或6所述细菌工程菌的方法，其特征在于，采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术对细菌基因组实施基因改造。

8.如权利要求5或6所述的细菌工程菌在表达重组蛋白质中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，构建包含T7RNA聚合酶编码基因和所述重组蛋白质的编码基因的质粒，将该重组质粒转化入如权利要求5或6所述的细菌工程菌中，用于表达所述重组蛋白质。