ES2601200T3 - Método para producir un compuesto de interés en una célula fúngica filamentosa - Google Patents
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Abstract
Un método para producir una secuencia de nucleótidos que comprende las etapas de: - proporcionar una secuencia codificadora de nucleótidos sinónima con frecuencia de codones optimizada de manera que un codón natural haya sido intercambiado con un codón sinónimo, codificando dicho codón sinónimo el mismo aminoácido que el codón natural y teniendo una mayor frecuencia en utilización de codones como se define en la Tabla 1 que el codón natural, en la que la frecuencia de codones optimizada es de manera que al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90% y lo más preferiblemente al menos 95% de los codones naturales ha sido intercambiado con un codón sinónimo, cambiando el codón sinónimo la frecuencia de codones de manera que el valor de la diferencia absoluta entre el porcentaje para dicho codón sinónimo en dicha frecuencia y el porcentaje óptimo enumerado llega a ser más pequeño después de la modificación, aplicando la siguiente lista de porcentajes óptimos: cisteína por TGC (100%); fenilalanina por TTC (100%); histidina por CAC (100%); lisina por AAG (100%); asparagina por AAC (100%); glutamina por CAG (100%); tirosina por TAC (100%); la alanina es codificada por GCT (38%), GCC (51%) o GCG (11%); aspartato por GAC (64%); glutamato por GAG (74%); glicina por GGT (49%), GGC (35%), GGA (16%); isoleucina por ATT (27%), ATC (73%); leucina por TTG (13%), CTT (17%), CTC (38%), CTG (32%); prolina por CCT (36%), CCC (64%); arginina por CGT (49%), CGC (51%); serina por TCT (21%), TCC (44%), TCG (14%), AGC (21%); treonina por ACT (30%), ACC (70%) y/o valina por GTT (27%), GTC (54%), GTG (19%), en la que la adecuación de codones de la secuencia codificadora de nucleótidos sinónima con frecuencia de codones optimizada presenta un valor de adecuación que es al menos 70%, 80%, 90%, 95%, preferiblemente 96%, 97%, 98% y lo más preferible >98%, en el caso de que la adecuación de los codones se calcule por medio de la siguiente función:**Fórmula** donde g simboliza una secuencia codificadora de nucleótidos, su longitud |g|, c(k) su késimo codón,**Fórmula** es una relación deseada de codón c(k) y**Fórmula** una relación real en la secuencia g codificadora de nucleótidos, y opcionalmente - ligar de manera operable dicha secuencia codificadora de nucleótidos sinónima a una secuencia de control tal como: - una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, preferiblemente TAAA, y/o - una secuencia codificadora iniciadora de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias:**Fórmula** y GCTTCCTTC, preferiblemente GCT TCC TTC. **Tabla**
Description
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Preferiblemente, dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia en la que la frecuencia de codones optimizada de dicha secuencia codificadora de nucleótidos sinónima comprendida en dicha secuencia de nucleótidos es de manera que al menos un codón natural, preferiblemente al menos dos codones naturales, más preferiblemente al menos tres codones naturales, más preferiblemente al menos cuatro codones naturales, más preferiblemente al menos cinco codones naturales, más preferiblemente al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, y lo más preferiblemente al menos 95% de los codones naturales ha sido intercambiado con un codón sinónimo, codificando dicho codón sinónimo el mismo aminoácido que el codón natural y teniendo una mayor frecuencia en utilización de codones como se define en la Tabla 1 que el codón natural.
Dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia en la que la frecuencia de codones optimizada de dicha secuencia codificadora de nucleótidos sinónima comprendida en dicha secuencia de nucleótidos es de manera que al menos un codón natural, preferiblemente al menos dos codones naturales, más preferiblemente al menos tres codones naturales, más preferiblemente al menos cuatro codones naturales, más preferiblemente al menos cinco codones naturales, más preferiblemente al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, y lo más preferiblemente al menos 95% de los codones naturales ha sido intercambiado con un codón sinónimo, cambiando el codón sinónimo la frecuencia de codones de manera que el valor de la diferencia absoluta entre el porcentaje para dicho codón sinónimo en dicha frecuencia y el porcentaje óptimo enumerado llega a ser más pequeño después de la modificación, aplicando la siguiente lista de porcentajes óptimos: cisteína por TGC (100%); fenilalanina por TTC (100%); histidina por CAC (100%); lisina por AAG (100%); asparagina por AAC (100%); glutamina por CAG (100%); tirosina por TAC (100%); alanina es codificada por GCT (38%), GCC (51%), o GCG (11%); aspartato por GAC (64%); glutamato por GAG (74%); glicina por GGT (49%), GGC (35%), GGA (16%); isoleucina por ATT (27%), ATC (73%); leucina por TTG (13%), CTT (17%), CTC (38%), CTG (32%); prolina por CCT (36%), CCC (64%); arginina por CGT (49%), CGC (51%); serina por TCT (21%), TCC (44%), TCG (14%), AGC (21%); treonina por ACT (30%), ACC (70%) y/o valina por GTT (27%), GTC (54%), GTG (19%).
Dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia en la que la adecuación de codones de dicha secuencia codificadora de nucleótidos sinónima con frecuencia de codones optimizada comprendida en dicha secuencia de nucleótidos presenta un valor de adecuación que es al menos 70%, 80%, 90%, 95%, preferiblemente 96%, 97%, 98%, y lo más preferible >98%, en el caso de que la adecuación de codones se calcule mediante la siguiente función:
késimo
donde g simboliza una secuencia codificadora de nucleótidos, su longitud |g|, c(k) su codón,
es una relación deseada de codón c(k) y
una relación real en la secuencia g codificadora de nucleótidos.
En el contexto de la invención, tanto la secuencia codificadora de nucleótidos como la secuencia de control se denominan en la presente memoria natural o sin manipular cuando se hace referencia a las secuencias antes de que se haya aplicado el método de la invención. Una vez que han sido modificadas por la invención, se denominarían secuencias modificadas o sinónimas. Por consiguiente, las secuencias sinónimas se reconocerían en general como secuencias recombinantes. A propósito, una secuencia que se encuentra en la naturaleza puede ser idéntica a la secuencia sinónima.
En el contexto de la invención, una secuencia codificadora de nucleótidos y una secuencia codificadora de nucleótidos sinónima, puede codificar directamente un compuesto de interés que se tiene que producir. El término compuesto de interés se define más adelante en la sección “Producción de un compuesto de interés”. Un ejemplo de un compuesto de interés que se codifica directamente por una secuencia codificadora de nucleótidos (sinónima) es un polipéptido, preferiblemente, el polipéptido es una enzima, más preferiblemente una enzima que se segrega fuera 8
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señal puede obtenerse a partir de un gen de la glucoamilasa o uno de la amilasa de una especie de Aspergillus, un gel de la lipasa o proteinasa de una especie Rhizomucor, el gen para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, un gen de la amilasa o de una proteasa de una especie Bacillus o el gen de la preproquimiosina de ternera. Sin embargo, cualquier región codificadora de péptidos señal capaz de dirigir la proteína expresada en la ruta secretora de una célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención. Las regiones codificadoras de péptidos señal, preferidas, para células huésped fúngicas filamentosas son la región codificadora de péptidos señal obtenida de gen de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae (patente europea EP 238 023), gen de la amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, el gen de la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, el gen de la celulasa de Humicola lanuginosa, celulasa de Humicola insolens, cutinasa de Humicola insolens, el gen de la lipasa B de Candida antactica o el gen de la lipasa de Rhizomucor miehei y secuencia señal mutante, truncada e híbrida de la misma.
La secuencia codificadora de nucleótidos sinónima con frecuencia codificadora optimizada descrita más adelante comprende preferiblemente una secuencia señal. La secuencia señal descrita más adelante es más preferiblemente una secuencia señal con una frecuencia de codones optimizada en el caso de que al menos un codón natural o al menos 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90% o preferiblemente al menos 95% de los codones naturales se haya intercambiado con un codón sinónimo, codificando dicho codón sinónimo el mismo aminoácido que el codón natural y teniendo una mayor frecuencia en utilización de codones que el codón natural como se define en la Tabla 1 y se describe además en el párrafo “Cálculo de “frecuencia optimizada de codones” o "utilización de codones optimizada" usando la Tabla 1". La secuencia señal descrita más adelante comprende más preferiblemente una secuencia codificadora iniciadora de la traducción con la siguiente secuencia de ADN de consenso: 5'-GCTnCCyyC3' (es decir, SEC ID Nº 20) o incluso más preferiblemente una secuencia codificadora iniciadora de la traducción con la secuencia de ácidos nucleicos: 5'-GCT TCC TTC -3' (es decir, SEC ID Nº 21).
La secuencia codificadora de nucleótidos puede contener, antes de que se aplique una modificación de la invención, uno o más intrones que contengan nucleótidos que no sean aminoácidos codificadores en la secuencia de proteínas. Una de las etapas en la optimización de la expresión de la secuencia codificadora podía ser usar la secuencia codificadora sinónima sin intrones. En el ejemplo 2, los intrones presentes en la secuencia de nucleótidos natural no fueron reemplazados en las construcciones modificadas.
Alternativamente, en una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora de nucleótidos sinónima descrita más adelante en la que la secuencia codificadora de nucleótidos no modificada comprende originalmente uno o más intrones, se ha vuelto a introducir preferiblemente al menos un intrón en la secuencia codificadora de nucleótidos, preferiblemente, pero no necesariamente, en la posición original. En el ejemplo 1, los intrones que son parte de la secuencia de ADN pla1 de A. oryzae fueron reemplazados en la secuencia de ADN optimizada por codones (sinónima), que se usó para expresión.
Secuencias iniciadoras de traducción
La descripción también se refiere a secuencias iniciadoras de traducción. Una secuencia iniciadora de traducción es la región de ácidos nucleicos que codifica un principio de proteína y la actividad biológica de una secuencia iniciadora de traducción es para iniciar la producción mediada por ribosoma de un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es especificada por la secuencia de nucleótidos en un ARNm. En las eucariotas, la secuencia de consenso iniciadora de traducción (6-12 nucleótidos) antes del ATG se denomina con frecuencia secuencia de consenso de Kozak debido al trabajo inicial sobre este tema (Kozak, M. (1.987): an analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucl. Acid Res. 15 (20): 8.125-47). La secuencia de consenso de Kozak original CCCGCCGCCrCC(ATG)G, incluyendo un nucleótido +4 derivado por Kozak se asocia a la iniciación de traducción en eucariotas superiores. En el contexto de esta invención, el término “secuencia iniciadora de traducción” se define como los diez nucleótidos inmediatamente aguas arriba del iniciador o codón de inicio del marco de lectura abierto de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido. El iniciador o codón de inicio codifica el AA metionina. El codón iniciador es típicamente ATG, pero también puede ser cualquier codón de inicio funcional tal como GTG. Se sabe en la técnica que el uracilo, U, reemplaza al desoxinucleótido timina, T, en ARN.
La actividad biológica de una secuencia iniciadora de transcripción puede ser determinada de una manera cuantitativa midiendo la cantidad de producto génico transcrito del marco de lectura abierto inmediatamente aguas abajo de la secuencia iniciadora de transcripción y comparando esta cantidad con la cantidad medida del mismo marco de lectura abierto controlado por una secuencia iniciadora de transcripción de referencia. La cantidad de producto génico puede ser determinada midiendo la cantidad de ARNm o la cantidad de polipéptido codificada por el ARNm. Ejemplos de métodos conocidos para el experto para determinar la cantidad de ARNm incluyen, pero no se limitan a, ensayo Northern, PCR Cuantitativa, PCR en Tiempo Real y análisis de micro-matriz. La cantidad de polipéptido codificado por el marco de lectura abierto inmediatamente aguas abajo de la secuencia iniciadora de transcripción puede determinarse, entre otros, usando ensayos de medición de proteínas conocidos para el experto. Cuando el polipéptido codificado por el marco de lectura abierto inmediatamente aguas abajo de la secuencia iniciadora de transcripción es una enzima, la cantidad de polipéptido se puede medir usando un ensayo de actividad específico para la enzima implicada. El experto sabrá qué ensayo seleccionar para una enzima específica. Un ensayo preferido para determinar la actividad biológica de la secuencia iniciadora de transcripción es un ensayo de actividad específico para una enzima implicada.
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codificadora de nucleótidos que codifique un compuesto de interés. La secuencia codificadora de nucleótidos puede ser cualquier secuencia codificadora. Preferiblemente, la secuencia codificadora de nucleótidos es una secuencia codificadora sinónima como se definió previamente.
Además, y según otro aspecto de la descripción, se proporciona una construcción de ácidos nucleicos o vector de 5 expresión como se define en la sección “Construcciones de ácidos nucleicos”, comprendiendo dicha construcción de ácidos nucleicos o vector de expresión la secuencia iniciadora de traducción de consenso descrita más adelante.
La secuencia iniciadora de traducción de consenso descrita más adelante puede usarse en cualquier célula fúngica filamentosa para expresar cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifique un compuesto que se tenga que producir en dicha célula. Las células fúngicas filamentosas se definen en la sección “Células huésped”.
10 En la presente invención, la secuencia iniciadora de traducción de consenso es preferiblemente extraña para la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido que se tiene que producir, pero la secuencia iniciadora de traducción de consenso puede ser natural para la célula huésped fúngica.
El experto comprenderá que la descripción se refiere a varias realizaciones distintas, que se pueden usar por separado o en combinación:
15 una secuencia codificadora de nucleótidos sinónima usando frecuencia óptima de codones y/o modificación de secuencias de control tales como:
una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, preferiblemente TAAA y/o
una secuencia codificadora iniciadora de traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la lista 20 de secuencias:
y GCTTCCTTC, preferiblemente GCT TCC TTC y/o
una secuencia iniciadora de traducción, comprendiendo dicha secuencia iniciadora de traducción la secuencia de ácidos nucleicos como se define por la secuencia iniciadora de traducción de consenso: 5'
25 mwChkyCAmv-3', usando códigos ambivalentes para nucleótidos: m (A/C); r (A/G); w (A/T); s (C/G); y (C/T); k (G/T); v (A/C/G); h (A/C/T); d (A/G/T); b (C/G/T); n (A/C/G/T), preferiblemente la secuencia iniciadora de traducción es una seleccionada de la siguiente lista: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'-mwChkyCAAG-3', más preferiblemente, la secuencia iniciadora de traducción es 5'-CACCGTCAAA-3' o 5'-CGCAGTCAAG-3'.
30 El experto comprenderá que la descripción se refiere a varias realizaciones distintas, que pueden ser usadas por separado o en varias combinaciones distintas, algunas de estas combinaciones se describen a continuación.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos descrita más adelante comprende una secuencia codificadora sinónima, que presenta una frecuencia de codones optimizada como se describe en la presente memoria.
La secuencia de nucleótidos como se describe más adelante comprende más preferiblemente una secuencia
35 codificadora sinónima, que presenta una frecuencia de codones optimizada como se describe en la presente memoria, estando asociada dicha secuencia codificadora sinónima a una secuencia de control que comprende una secuencia de terminación de traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG3', 5'-TAGA-3' y 5'-TAAA-3'. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora sinónima, que presenta una frecuencia de codones optimizada como se describe en la presente
40 memoria, estando asociada dicha secuencia codificadora sinónima a una secuencia de control que comprende la siguiente secuencia de terminación de traducción 5'-TAAA-3'.
La secuencia de nucleótidos como se describe más adelante, comprende incluso más preferiblemente una secuencia codificadora sinónima, que presenta una frecuencia de codones optimizada como se describe en la presente memoria, estando asociada dicha secuencia codificadora sinónima a una secuencia de control que 45 comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'-mwChkyCAAG-3' (los códigos ambivalentes de m, w se han descrito ya anteriormente). Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora sinónima, que presenta una frecuencia de codones optimizada como se describe en la presente memoria, estando asociada dicha secuencia de codificación sinónima a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción 50 seleccionada de la lista siguiente: 5'-CACCGTCAAA-3' y 5'-CGCAGTCAAG-3'. Incluso más preferiblemente, la
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siguiente secuencia iniciadora de traducción 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'. Lo más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora sinónima, que presenta una frecuencia de codones optimizada como se describe en la presente memoria y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3'; estando asociada dicha secuencia codificadora sinónima a la siguiente secuencia iniciadora de traducción 5'-CACCGTCAAA-3' y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'.
La secuencia de nucleótidos como se describe más adelante, alternativamente y preferiblemente comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'-mwChkyCAAG-3' (los códigos ambivalentes de m, w ya se han descrito). Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-CACCGTCAAA-3' y 5'-CGCAGTCAAG-3'. Incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende la secuencia iniciadora de traducción 5'-CGCAGTCAAG-3'. Lo más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende la secuencia iniciadora de traducción 5'-CACCGTCAAA-3'.
La secuencia de nucleótidos como se describe más adelante, alternativamente y más preferiblemente comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'-mwChkyCAAG-3' (los códigos ambivalentes de m, w ya se han descrito). Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-CACCGTCAAA-3' y 5'-CGCAGTCAAG-3'. Incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende la secuencia iniciadora de traducción 5'-CGCAGTCAAG-3'. Lo más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende la secuencia iniciadora de traducción 5'-CACCGTCAAA-3'.
La secuencia de nucleótidos como se describe más adelante, alternativamente y más preferiblemente comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'-mwChkyCAAG-3' (los códigos ambivalentes de m, w ya se han descrito) y/o una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA3' y 5'-TAAA-3'. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'-mwChkyCAAG-3' (los códigos ambivalentes de m, w ya se han descrito) y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'. Incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la siguiente lista: 5'-CACCGTCAAA-3' y 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA3' y 5'-TAAA-3'. Aún incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-CACCGTCAAA-3' y 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'. Aún incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia iniciadora de traducción 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA-3' y 5'-TAAA-3'. Aún incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia iniciadora de traducción 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'. Aún incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia iniciadora de traducción 5'-CACCGTCAAA -3' y/o una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA-3' y 5'-TAAA-3'. Lo más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia iniciadora de traducción 5'-CACCGTCAAA -3' y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'.
La secuencia de nucleótidos como se describe más adelante, alternativamente y lo más preferiblemente, comprende
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una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de la traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'-mwChkyCAAG-3' (los códigos ambivalentes de m, w ya se han descrito) y/o una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' hacia 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA-3' y 5'-TAAA3'. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de la traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'-mwChkyCAAG-3' (los códigos ambivalentes de m, w ya se han descrito) y/o la siguiente secuencia de terminación de traducción 5'-TAAA-3'. Incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de la traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-CACCGTCAAA-3' y 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o una secuencia de terminación de traducción orientada en la dirección 5' hacia 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA-3' y 5'-TAAA-3'. Aún incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia iniciadora de la traducción seleccionada de la lista siguiente: 5'-CACCGTCAAA-3' y 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'. Aún incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia iniciadora de la traducción 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' hacia 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA-3' y 5'-TAAA-3'. Aún incluso más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia iniciadora de la traducción 5'-CGCAGTCAAG-3' y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'. Lo más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia iniciadora de la traducción 5'-CACCGTCAAA -3' y/o la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'.
La secuencia de nucleótidos como se describe más adelante, alternativamente y preferiblemente comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' hacia 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA-3' y 5'-TAAA-3'. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora, estando asociada dicha secuencia codificadora a la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'.
La secuencia de nucleótidos como se describe más adelante, alternativamente y preferiblemente comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a una secuencia de control que comprende una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' hacia 3' seleccionada de la lista siguiente: 5'-TAAG-3', 5'-TAGA-3' y 5'-TAAA-3'. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificadora y/o comprende la siguiente secuencia codificadora iniciadora de la traducción 5'-GCTTCCTTC-3', estando asociada dicha secuencia codificadora a la siguiente secuencia de terminación de la traducción 5'-TAAA-3'.
Además de las secuencias de control definidas más adelante, se pueden usar otras secuencias de control. Esa otra secuencia de control puede ser una secuencia activadora apropiada, una secuencia de nucleótidos, que sea reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia activadora contiene secuencias de control de transcripción, que median la expresión del polipéptido. El activador puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos, que muestre actividad transcripcional en la célula incluyendo activadores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener a partir de genes que codifiquen polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos para la célula.
La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia que una célula reconozca para terminar la transcripción. La secuencia terminadora se une de manera operable al término 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador, que sea funcional en la célula, puede usarse en la presente invención.
Los terminadores preferidos para células fúngicas filamentosas se obtienen de genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae, glucoamilasa de A. niger (glaA), antranilato sintasa de A. nidulans, alfa-glucosidasa de A. niger, gen trpC y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que sea importante para la traducción por la célula. La secuencia líder está unida de manera operable al término 5’ de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Puede usarse cualquier secuencia líder, que sea funcional en la célula, en la presente invención.
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Más preferiblemente, la secuencia iniciadora de la traducción es 5’-CACCGTCAAA-3’ o 5’-CGCAGTCAAG3’.
Según otra realización preferida, la construcción de ácidos nucleicos o el vector de expresión comprende una secuencia iniciadora de la traducción, comprendiendo dicha secuencia iniciadora de la traducción la secuencia de ácidos nucleicos como se define por la secuencia iniciadora de la traducción de consenso: 5'-mwChkyCAmv-3', usando códigos ambivalentes para nucleótidos: m (A/C); r (A/G); w (A/T); s (C/G) y (C/T); k (G/T); v (A/C/G); h (A/C/T); d (A/G/T); b (C/G/T); n (A/C/G/T), preferiblemente la secuencia iniciadora de la traducción se selecciona del grupo que consiste en: 5'-mwChkyCAAA-3', 5'-mwChkyCACA-3' y 5'
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de nucleótidos o construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para expresión. Creando el vector de expresión, la secuencia codificadora se sitúa en el vector de tal modo que la secuencia de codificación está asociada de manera operativa a las secuencias de control apropiadas para expresión y opcional secreción.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ej., un plásmido o virus), que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede conferir expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula fúngica filamentosa en la que se tiene que introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación de manera autónoma, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. Un vector de clonación mantenido de manera autónoma puede comprender la secuencia AMA1 (véase, por ej., Aleksenko y Clutterbuck (1.997), Fungal Genet. Biol. 21: 373-397).
Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula fúngica, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o los cromosomas en que se ha integrado. El vector de clonación integrador puede integrarse al azar o en un sitio objetivo predeterminado en los cromosomas de la célula huésped fúngica. En una realización preferida de la invención, el vector de clonación integrador comprende un fragmento de ADN, que es homólogo a una secuencia de ADN en un sitio objetivo predeterminado en el genoma de la célula huésped fúngica para fijar como objetivo la integración del vector de clonación a este sitio predeterminado. Para activar la integración fijada como objetivo, el vector de clonación se hace linear preferiblemente previamente a la transformación de la célula huésped. La linearización se realiza preferiblemente de tal manera que al menos uno pero preferiblemente cualquier extremo del vector de clonación esté flanqueado por secuencias homólogas en el sitio fijado como objetivo. La longitud de las secuencias homólogas que flanquean el sitio fijado como objetivo es preferiblemente al menos 30 pb, preferiblemente al menos 50 pb, preferiblemente al menos 0,1 kb, incluso preferiblemente al menos 0,2 kb, más preferiblemente al menos 0,5 kb, incluso más preferiblemente al menos 1 kb, lo más preferiblemente al menos 2 kb. Preferiblemente, la secuencia de ADN en el vector de clonación, que es homóloga para el sitio fijado como objetivo procede de un sitio altamente expresado que significa que procede de un gen, que es capaz de un alto nivel de expresión en la célula huésped fúngica filamentosa. Un gen capaz de alto nivel de expresión, es decir, un gen altamente expresado, se define en la presente memoria como un gen cuyo ARNm puede constituir al menos 0,5% (p/p) del ARNm total celular, por ejemplo, en condiciones inducidas o alternativamente, un gen cuyo producto génico pueda constituir al menos 1% (p/p) de la proteína celular total o, en el caso de un producto génico segregado, puede ser segregado a un nivel de al menos 0,1 g/l (como se describe en la patente europea EP 357 127 B1). Se proporciona una serie de genes fúngicos altamente expresados, preferidos, como ejemplo: los genes de amilasa, glucoamilasa, alcohol deshidrogenasa, xilanasa, gliceraldehído-fosfato deshidrogenasa o celobiohidrolasa (cbh) de Aspergilli o Trichoderma. Los genes altamente expresados más preferidos para estos fines son un gen de la glucoamilasa, preferiblemente un gen de la glucoamilasa de A. niger, un gen de la TAKA-amilasa de A. oryzae, un gen de gpdA de A. nidulans, un gen de cbh de Trichoderma reesei, preferiblemente cbh1. Se puede insertar más de una copia de una secuencia de ácidos nucleicos codificadora de un polipéptido en la célula huésped para aumentar la producción del producto génico. Esto se puede hacer, preferiblemente por integración en sus copias genómicas de la secuencia de ADN, más preferiblemente fijando como objetivo la integración de la secuencia de ADN en uno de los sitios altamente expresados definido en el párrafo primero. Alternativamente, esto se puede hacer incluyendo un gen marcador seleccionable multiplicable con la secuencia de ácidos nucleicos en el caso de que las células que contengan copias multiplicadas del gen marcador seleccionable, y de ese modo copias adicionales de la secuencia de ácidos nucleicos, puedan seleccionarse cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado. Para aumentar incluso más el número de copias de la secuencia de ADN que se tiene que sobreexpresar se puede usar la técnica de conversión de genes como se describe en la patente internacional WO 98/46772.
El sistema vector puede ser un vector o plásmido único o dos o más vectores o plásmidos, que contengan juntos el ADN total que se tenga que introducir en el genoma de la célula fúngica filamentosa, o un transposón.
Los vectores contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionables, lo que permite la fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona biocida o resistencia vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Un marcador seleccionable para uso en una célula fúngica filamentosa puede seleccionarse del grupo que incluye, pero no se limita a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricinacetiltransferasa), bleA (unión de fleomicina), hygB (higromicinfosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de otras especies. Se prefieren para uso en una célula de Aspergillus y Penicillium los genes de amdS (patente europea 635574 B1, patente internacional WO 97/06261) y pyrG de A. nidulans o A. oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus. Más preferiblemente, se usa un gen de amdS, incluso más preferiblemente un gen de amdS de A. nidulans o A. niger. El gen marcador de selección más preferido es la secuencia codificadora de amdS de A. nidulans fusionada al activador de gpdA de A. nidulans (véase, la patente europea 635574 B1). También se pueden usar los genes de amdS de otros hongos filamentosos (patente internacional WO 97/06261).
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Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos para un experto en la materia (véase, por ej., Sambrook et al., 1.989, supra).
Células huésped
La descripción también se refiere a una célula huésped fúngica filamentosa. La célula huésped fúngica filamentosa descrita más adelante puede ser cualquier célula huésped fúngica filamentosa, célula huésped conocida para el experto.
“Hongos filamentosos” incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1.995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared de los micelios constituida por quitina, celulosa, glucano, quitosán, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetal es por elongación de hifa y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aeróbico. Las cepas fúngicas filamentosas incluyen, pero no se limitan a, cepas de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Chrysosporum Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma.
Las cepas de Aspergillus y teleomorfos de las mismas son fácilmente accesibles al público en una serie de colecciones de cultivos, tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Colección de Cultivos de Patentes del Servicio de Investigación Agrícola, Centro de Investigación Regional Norte (NRRL, por sus siglas en inglés) Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 o ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 o ATCC 56765 o ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense ATCC44006 y derivados de las mismas.
Preferiblemente, la célula huésped fúngica filamentosa comprende al menos una copia de la construcción de ácidos nucleicos descrita más adelante.
Las secuencias de codificación y/o de control presentes en la construcción de ácidos nucleicos descritas más adelante son preferiblemente naturales para la célula huésped fúngica filamentosa antes de la modificación de las secuencias de codificación y/o de control descritas en la presente memoria anteriormente.
Las secuencias de codificación y/o de control presentes en la construcción de ácidos nucleicos descritas más adelante son preferiblemente heterólogas para la célula huésped fúngica filamentosa antes de la modificación de las secuencias de codificación y/o de control descritas en la presente memoria anteriormente.
La célula huésped fúngica filamentosa como se describe más adelante, que comprende un número de copias determinado de la construcción de ácidos nucleicos descrita en la presente memoria anteriormente, es más preferiblemente una célula fúngica filamentosa, en la que la expresión del producto codificado por dicha construcción de ácidos nucleicos mejora cuando se compara con la producción del mismo producto codificada por la correspondiente construcción de ácidos nucleicos comprendiendo las correspondientes secuencias de nucleótidos naturales, estando presente dicha correspondiente construcción de ácidos nucleicos en el mismo número de copias en la célula huésped fúngica filamentosa correspondiente. Preferiblemente, la modificación de las secuencias de nucleótidos presentes en la construcción de ácidos nucleicos o vector de expresión descrito en la presente memoria anteriormente da como resultado un aumento por al menos 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400% más preferiblemente al menos 500% del rendimiento del compuesto de interés producido por la célula huésped fúngica filamentosa que comprende un número de copias determinado de la construcción de ácidos nucleicos descrito en la presente memoria anteriormente, cuando se compara con la producción de la correspondiente construcción de ácidos nucleicos que comprende las correspondientes secuencias de nucleótidos naturales, estando presente dicha construcción de ácidos nucleicos correspondiente en el mismo número de copias en la célula huésped fúngica filamentosa correspondiente.
El incremento en rendimiento del compuesto de interés que se tiene que producir se puede determinar midiendo la cantidad de compuesto producida por la célula huésped fúngica filamentosa descrita más adelante y comparándolo con el compuesto de interés producido por la célula huésped fúngica filamentosa correspondiente. La determinación del rendimiento de compuesto de interés producido puede realizarse midiendo, entre otros, la cantidad de ARNm transcrito de la secuencia codificadora de nucleótidos (sinónima), la cantidad de polipéptido codificada por el ARNm
o la cantidad de compuesto (por ej., metabolito) en cuya producción está implicado el polipéptido codificado por la secuencia codificadora de nucleótidos sinónima. Los ejemplos de métodos conocidos para el experto para determinar la cantidad de ARNm incluyen, pero no se limitan a, Ensayo Northern, PCR Cuantitativa, PCR de Tiempo Real y análisis de micro-matriz. La cantidad de polipéptido puede determinarse, entre otros, usando ensayos de medición de proteínas conocidos para el experto. Cuando el polipéptido es una enzima, la cantidad de polipéptido se puede medir usando un ensayo de actividad específico para la enzima referida. El experto sabrá qué ensayo
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seleccionar para una enzima específica. Un ensayo preferido para determinar el rendimiento del compuesto de interés que se tiene que producir es un ensayo de actividad específico para la enzima referida.
La célula huésped descrita más adelante es más preferiblemente una célula que pertenece a una especie seleccionada del grupo que consiste en una especie de Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Chrysosporum o Trichoderma, lo más preferiblemente una especie seleccionada del grupo que consiste en Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus terreus, Chrysosporum lucknowense, Trichoderma reesei o Penicillium chrysogenum. Una célula huésped más preferida de Aspergillus niger es CBS513.88 o derivados de la misma.
La célula huésped puede ser una célula huésped fúngica filamentosa sin modificar o una variante, un mutante o una célula huésped fúngica filamentosa modificada de manera genética. La célula huésped es preferiblemente una cepa deficiente en proteasas o baja en proteasas. Esta puede ser la cepa deficiente en proteasa JaL 125 de Aspergillus oryzae teniendo el gen de la proteasa alcalina denominado "alp" suprimido (descrito en la patente internacional WO 97/35956 o la patente europea EP 429 490) o la cepa deficiente en tripeptidil-aminopeptidasas (TPAP) de A. niger, descrita en la patente internacional WO 96/14404. Además, también se considera célula huésped con producción reducida del activador de transcripción (prtT) como se describe en la patente internacional WO 01/68864 según la descripción. Otra cepa huésped considerada de manera específica es la BECh2 de Aspergillus oryzae, donde se han inactivado los tres genes de TAKA amilasa presentes en la cepa precursora IF04177. Además, se han destruido dos proteasas, la proteasa alcalina y la metaloproteasa 11 neutra por interrupción génica. La capacidad para formar los metabolitos ácido ciclopiazónico y ácido kójico se ha destruido por mutación. Se describe BECh2 en la patente internacional WO 00/39322 y se origina de JaL228 (descrito en la patente internacional WO 98/12300), que de nuevo fue un mutante de IF04177 descrito en la patente de EE.UU. 5.766.912 como A1560.
Opcionalmente, la célula huésped fúngica filamentosa comprende una respuesta de proteínas no plegadas elevada (RPNP) comparado con la célula sin modificar para mejorar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. La RPNP puede aumentarse por técnicas descritas en la patente de EE.UU. 2004/0186070A1 y/o la patente de EE.UU. 2001/0034045A1 y/o la patente internacional WO 01/72783A2 y/o la patente internacional WO 2005/123763. Más específicamente, el nivel de proteína de HAC1 y/o IRE1 y/o PTC2 se ha modulado y/o la proteína SEC61 se ha logrado para obtener una célula huésped con una RPNP elevada.
Alternativamente, o en asociación con una RPNP elevada, la célula huésped se modifica de manera genética para obtener un fenotipo que muestre menor expresión de proteasas y/o secreción de proteasas comparado con la célula sin modificar para mejorar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. Dicho fenotipo puede obtenerse por supresión y/o modificación y/o inactivación de un regulador de la transcripción de expresión de proteasas. Dicho regulador de la transcripción es, por ej., prtT. Disminuir la expresión de las proteasas por modulación de prtT puede realizarse por técnicas descritas en la patente de EE.UU. 2004/0191864A1.
Alternativamente, o en asociación con una RPNP elevada y/o un fenotipo que presente menor expresión de proteasas y/o secreción de proteasas, la célula huésped muestra un fenotipo deficiente en oxalatos para mejorar el rendimiento de producción de un polipéptido de interés. Se puede obtener un fenotipo deficiente en oxalato por técnicas descritas en la patente internacional WO 2004/070022A2.
Alternativamente, o en asociación con una RPNP elevada y/o un fenotipo que presente menor expresión de proteasas y/o secreción de proteasas, y/o deficiencia en oxalatos, la célula huésped muestra una combinación de diferencias fenotípicas comparado con la célula sin modificar para mejorar el rendimiento de producción del polipéptido de interés. Estas diferencias pueden incluir, pero no estar limitadas a, expresión disminuida de glucoamilasa y/o alfa-amilasa A neutra y/o alfa-amilasa B neutra, alfa-1, 6transglucosidasa, proteasa y ácido oxálico hidrolasa. Dichas diferencias fenotípicas mostradas por la célula huésped se pueden obtener por modificación genética según las técnicas descritas en la patente de EE.UU. 2004/0191864A1.
Alternativamente o junto con fenotipos descritos en la presente memoria anteriormente, la eficacia de la integración fijada como objetivo de una construcción de ácidos nucleicos en el genoma de la célula huésped por recombinación homóloga, es decir, integración en un sitio fijado como objetivo predeterminado, aumenta preferiblemente por capacidades de recombinación homóloga aumentadas de la célula huésped. Dicho fenotipo de la célula implica preferiblemente un gen de hdfA o hdfB deficiente como se describe en la patente internacional WO 2005/095624. La patente internacional WO 2005/095624 describe un método preferido para obtener una célula fúngica filamentosa que comprende eficacia aumentada de integración fijada como objetivo.
La introducción de un vector de expresión o una construcción de ácidos nucleicos en una célula fúngica filamentosa puede implicar un procedimiento que consiste en formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida de por sí. Los procedimientos adecuados para transformación de células de Aspergillus se describen en la patente europea EP 238 023 y Yelton et al., 1.984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1.470-1.474. Se describe un método adecuado para transformar especies de Fusarium por Malardier et al., 1.989, Gene 78: 147156 o en la patente internacional WO 96/00787. El vector de expresión o la construcción de ácidos nucleicos que se pueden usar ya se describieron en las secciones correspondientes.
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Ejemplo 4. Construcción de vectores de expresión modificados y sus ensayos en A. niger.
4.1. Construcción de vectores de expresión de pla1 modificados que expresan fosfolipasa A1 de A. oryzae según el ejemplo 2.1 -2.5.
La secuencia de ADN del fragmento EcoRI -SnaBI clonado de pGBFINPLA-1a se muestra como SEC ID Nº 8. Las secuencias de ADN de fragmentos EcoRI que comprenden variantes para la secuencia de iniciación de la traducción del activador de la glucoamilasa se muestran como SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 10. Estos fragmentos génicos modificados se sintetizaron completamente y se confirmó la secuencia por análisis de secuencias.
Para clonar estas variantes de secuencias modificadas en un vector de expresión, todos los fragmentos génicos sintéticos fueron digeridos con EcoRI e introducidos en el fragmento grande de un vector pGBFINPLA-1a digerido con EcoRI (Figura 2), generando vectores de expresión variantes de pGBFINPLA-1a. Después de comprobar la orientación apropiada del fragmento EcoRI, las construcciones de expresión variantes se denominaron pGBFINPLA1b y pGBFINPLA-1c como se describe a continuación en la Tabla 8. La Figura 3 también proporciona un mapa representativo para plásmido pGBFINPLA-1b y pGBFINPLA-1c.
La secuencia de ADN de otras 5 variantes de secuencias sintéticas comprendiendo parte del activador de glucoamilasa, la secuencia señal de pla1, el péptido maduro de fosfolipasa A1 y la secuencia de terminación de la traducción alrededor del codón de parada se muestran como SEC ID Nº 11 hasta SEC ID Nº 14 y SEC ID Nº 35. Estos 5 fragmentos génicos modificados se sintetizaron completamente por diseño y síntesis de polinucleótidos de solapamiento y conjunto posterior de la secuencia bicatenaria de una serie de polinucleótidos de solapamiento. La secuencia se confirmó por análisis de secuencias.
Para clonar estas variantes de secuencias modificadas en un vector de expresión, todos los fragmentos génicos sintéticos fueron digeridos con EcoRI y SnaBI e introducidos en el fragmento grande de un vector pGBFINPLA-1a digerido con EcoRI y Nrul (Figura 2), generando vectores de expresión variantes pGBFINPLA-1d hasta pGBFINPLA-1h como se describe a continuación en la Tabla 8. Se proporciona un mapa representativo para los plásmidos pGBFINPLA-1d hasta pGBFINPLA-1h en la figura 3.
Tabla 8: Construcciones de expresión modificadas para expresión de pla1 en A. niger
- Nombre del plásmido
- SEC ID Nº Región de inicio de la traducción Codón Parada de la traducción
- PGBFINPLA-1a
- 8 CACCTCAGCA ATG TTT AGT CTC s. m. TAG TAC
- PGBFINPLA-1b
- 9 CACCGTCAAA ATG TTT AGT CTC s. m. TAG TAC
- PGBFINPLA-1c
- 10 CGCAGTCAAG ATG TTT AGT CTC s. m. TAG TAC
- PGBFINPLA-1d
- 11 CACCTCAGCA ATG TTC TCT CTC modificado Modificado (TAA ATA)
- PGBFINPLA-1e
- 12 CACCGTCAAA ATG TTC TCT CTC modificado Modificado (TAA ATA)
- PGBFINPLA-1f
- 13 CGCAGTCAAG ATG TTC TCT CTC modificado Modificado (TAA ATA)
- PGBFINPLA-1g
- 14 CACCGTCAAA ATG GCT TCC TTC modificado Modificado (TAA ATA)
- pGBFINPLA-1h
- 35 CTCCTTCACC ATG TTC TCT CTC modificado Modificado (TAA ATA)
Las secuencias traducidas de las secuencias codificadoras de pla1 de plásmido pGBFINPLA-1a hasta pGBFINPLA1f y pGBFINPLA-1h son según la secuencia de aminoácidos como se identifica en la SEC ID Nº: 3, que representa la fosfolipasa A1 de A. oryzae sin modificar. La secuencia traducida de la secuencia codificadora de pla1 de plásmido pGBFINPLA-1g es según la secuencia de aminoácidos como se identifica en la SEC ID Nº: 15, que representa una fosfolipasa A1 de A. oryzae con una secuencia señal modificada.
4.2. Construcción de vectores de expresión de amyA modificados que expresan alfa-amilasa de A. niger según el ejemplo 3.1 -3.3.
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pGBFINPLA-1h estuvo intacto y que se expresaron los genes de pla1 sintéticos.
De una manera similar, se midió la sobreexpresión de amyA de las construcciones natural y modificada por análisis por Ensayo Northern de los transformantes FUA referidos de WT 3 de A. niger y el propio WT3, usando una sonda (universal) situada en la región no traducida 3' del terminador de la glucoamilasa usado las tres construcciones de
5 expresión. Para todos los transformantes de construcciones amyA se detectó una señal de hibridación fuerte y comparable (datos no mostrados). Esto indica que el control de la transcripción de los genes amyA optimizados por el activador de la alfa-amilasa en todas las cepas transformadas pGBFINFUA-1 hasta pGBFINFUA-3 estuvo intacto y que se expresaron los genes de mayA sintéticos.
Se midió la producción de polipéptido de fosfolipasa A1 en todos los transformantes PLA de A. niger. Como se
10 puede observar en la Figura 7, se puede observar un efecto positivo del uso de un sitio de iniciación de la traducción modificada (variante 1 y variante 2) en la producción de fosfolipasa usando el activador de glucoamilasa. De manera similar, se observó un efecto positivo de modificación de la utilización de codones y la secuencia de parada de la traducción en la producción de fosfolipasa. Un resumen de los resultados se presenta en la Tabla 10 a continuación. Esto indica claramente cómo se puede usar una sola modificación o una combinación de modificaciones de la
15 invención, por ejemplo, una secuencia de iniciación de la traducción modificada, tal como variante 1, 2 o la variante descrita en la patente de EE.UU. 6.461.837 B1 y/o una utilización de codones modificada y/o una secuencia de parada de la traducción modificada, para mejorar el rendimiento de producción de la fosfolipasa A1 en A. niger.
Tabla 10. Actividades de la fosfolipasa promedio relativas comparado con construcción sin modificar para secuencias de control y de codificación de pla1 modificadas (como se concluye de la Figura 7).
- Nombre del plásmido
- SEC ID Nº Secuencia iniciadora de la traducción Secuencia codificadora iniciadora de la traducción Frecuencia de codones optimizada Secuencia de terminación de la traducción Producción promedio Fig 7 Producción promedio Fig 8
- PGBFINPLA1a
- 8 CACCTCAGCA s. m. s. m. s. m. 100% 100%
- PGBFINPLA1b
- 9 CACCGTCAAA s. m. s. m. s. m. 170% 130%
- PGBFINPLA1c
- 10 CGCAGTCAAG s. m. s. m. s. m. 130%
- PGBFINPLA1d
- 11 CACCTCAGCA TTCTCTCTC modificada TAAATA 170%
- PGBFINPLA1e
- 12 CACCGTCAAA TTCTCTCTC modificada TAAATA 230 % 240 %
- PGBFINPLA1f
- 13 CGCAGTCAAG TTCTCTCTC modificada TAAATA 260 %
- PGBFINPLA1g
- 14 CACCGTCAAA GCTTCCTTC modificada TAAATA 230 %
- pGBFINPLA1h
- 35 Patente de EE.UU. 6.461.837 B1 TTCTCTCTC modificada TAAATA 230%
20
Como se puede observar en la Figura 8, se puede encontrar claramente mejora también en una situación multicopia (2). Esto indica claramente cómo se puede usar una sola modificación o una combinación de modificaciones de la invención, por ejemplo, una secuencia de iniciación de la traducción modificada y/o una utilización de codones modificada y/o una secuencia de parada de la traducción modificada, para mejorar la producción de la fosfolipasa A1
25 en A. niger.
Se midió la producción de alfa-amilasa en los tres diferentes transformantes FUA de A. niger. Como se puede observar en la Figura 9, se puede observar un efecto positivo del uso de un sitio de iniciación de la traducción modificada (variante 1) en la producción de alfa-amilasa usando el activador de alfa-amilasa. De manera similar, se
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