ES2582652T3 - Anticuerpos anti-FGF19 y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-FGF19 y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo anti-FGF19 aislado que se une especificamente a FGF19 humano, en donde el anticuerpo se une a un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos GFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR (SEQ ID NO: 9), en donde el anticuerpo bloquea la union de FGF19 a FGFR4.

Description

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testículo, colangiocarcinoma, carcinoma de vesícula biliar y carcinoma hepatocelular.
En una realización, una célula usada como diana en un método es una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula cancerosa puede ser una seleccionada entre el grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, una célula de
5 cáncer colorrectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de carcinoma papilar, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de cuello de útero, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de cáncer de esófago, una célula de sarcoma osteogénico, una célula de carcinoma renal, una célula de carcinoma hepatocelular, una célula de cáncer de vejiga, una célula de carcinoma gástrico, una célula de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, una célula de melanoma, una célula de leucemia, una célula de cáncer de cerebro, una célula de cáncer de endometrio, una célula de cáncer de testículos, una célula de colangiocarcinoma, una célula de cáncer de vesícula biliar, una célula de cáncer de pulmón y/o una célula de cáncer de próstata. En una realización, una célula que se usa como diana en un método es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica. En una realización, una célula usada como diana en un método es una célula displásica. En otra realización más, una célula usada como diana en un método es una célula metastásica.
15 En una realización de la invención, la célula que se usa como diana es una célula de hígado cirrótica.
Para los usos médicos de la invención, los métodos pueden comprender además terapias de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una realización, un método comprende además una etapa en la que se expone una célula y/o tejido diana (por ejemplo, una célula cancerosa) a tratamiento de radiación o un agente quimioterapéutico.
Puede usarse cualquier anticuerpo anti-FGF19 adecuado para los métodos implicados en el tratamiento y/o prevención de un trastorno, incluyendo anticuerpos monoclonales y/o policlonales, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humanizado y/o un fragmento de
25 anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGF19 es cualquiera de los anticuerpos anti-FGF19 descritos en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un complejo de cualquiera de los anticuerpos anti-FGF19 descritos en el presente documento y FGF19. En algunas realizaciones, el complejo es in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGF19 se marca de manera detectable.
En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos para la detección de FGF19, comprendiendo los métodos detectar el complejo FGF19-anti-FGF19 en una muestra biológica. El término "detección", tal como se usa en el presente documento, incluye la detección cualitativa y/o cuantitativa (medir los niveles) con o sin referencia a un
35 control.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para detectar un trastorno asociado a la expresión y/o la actividad de FGF19, comprendiendo los métodos detectar a FGF19 en una muestra biológica de un individuo. En algunas realizaciones, la expresión de FGF19 es expresión aumentada o expresión anormal. En algunas realizaciones, el trastorno es un tumor, cáncer y/o un trastorno proliferativo celular, tal como cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama y/o cáncer pancreático. En alguna realización, la muestra biológica es suero o de un tumor.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para diagnosticar un trastorno asociado a la expresión y/o la
45 actividad de FGFR4, comprendiendo los métodos detectar a FGFR4 en una muestra biológica de un individuo. En algunas realizaciones, la expresión de FGFR4 es expresión aumentada o expresión anormal. En algunas realizaciones, el trastorno es un tumor, cáncer y/o un trastorno proliferativo celular, tal como cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama y/o cáncer pancreático. En alguna realización, la muestra biológica es suero o de un tumor.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para diagnosticar un trastorno asociado a la expresión y/o la actividad de FGF19 y FGFR4, comprendiendo los métodos detectar a FGFR4 y FGF19 en una muestra biológica de un individuo. En algunas realizaciones, la expresión de FGF19 es expresión aumentada o expresión anormal. En algunas realizaciones, la expresión de FGFR4 es expresión aumentada o expresión anormal. En algunas
55 realizaciones, el trastorno es un tumor, cáncer y/o un trastorno proliferativo celular, tal como cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama y/o cáncer pancreático. En alguna realización, la muestra biológica es suero o de un tumor. En algunas realizaciones, la expresión de FGFR4 se detecta en una primera muestra biológica y la expresión de FGF19 se detecta en una segunda muestra biológica.
En otro aspecto, los usos médicos de la invención se refieren a métodos para seleccionar el tratamiento para un individuo, comprendiendo los métodos: (a) detectar la expresión de FGF19, en caso de haberla, en una muestra biológica de un individuo; y (b) posteriormente a la etapa (a), seleccionar el tratamiento para el individuo, en el que la selección o tratamiento se basa en la expresión de FGF19 detectada en la etapa (a). En algunas realizaciones, la expresión aumentada de FGF19 en la muestra biológica del individuo se detecta en relación a un valor de referencia 65 o una muestra de control. En algunas realizaciones, la expresión reducida de FGF19 en la muestra biológica del individuo se detecta en el individuo en relación a un valor de referencia o una muestra de control. En algunas
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El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un enlazante que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a los dominios a
5 que se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90:6444-6448 (1993).
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde con aquella de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha producido usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos tal como se divulgan en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígeno no humanos.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que dan
15 como resultado una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee dichas alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante reordenamiento de los dominios VH y VL. La mutagénesis al azar de restos de CDR y/o marco conservados se describe por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una
25 región Fc de secuencia nativa o una región Fc de secuencia de aminoácidos variante) de un anticuerpo y varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: Unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento; unión a receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B.
"la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que una Ig unida a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana que porta un antígeno y posteriormente eliminar a la célula diana con citotoxinas.
35 Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para dicha eliminación. Las células principales para mediar la ADCC, las células NK, solo expresan FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede efectuarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.500.362 o 5.821.337 o en la Patente de Estados Unidos n.º 6.737.056. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Como alternativa o adicionalmente, La actividad de ADCC de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
45 Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y llevan a cabo funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcγRIII y llevan a cabo función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose las PBMC y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre.
Un "receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores para las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores de FcγRII incluyen FcγRIIA (un 55 "activante") y FcγRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activante FcγRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Véase la revisión M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:33041 (1995). Otros FcR, incluyendo aquellos que se identifiquen en el futuro, están abarcados por el término "FcR" del presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG de la madre al feto (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y regula la homeostasia de las inmunoglobulinas. El documento WO00/42072 (Presta) describe variantes de 65 anticuerpo con unión mejorada o disminuida a los FcR. El contenido de esa publicación de patente se incorpora específicamente al presente documento por referencia. Véanse, también Shields et al. J. Biol Chem. 9(2): 6591-6604
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inmunoadhesina (véanse las definiciones más adelante), que comprende una región Fc. La lisina C-terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la purificación del polipéptido o modificando por ingeniería genética recombinante el ácido nucleico que codifica al polipéptido. Por consiguiente, una composición que comprende un polipéptido que tiene una región Fc de acuerdo
5 con la presente invención puede comprender polipéptidos con K447, con todos los K447 eliminados o una mezcla de polipéptidos con y sin el resto K447.
Composiciones de la invención y métodos para producir las mismas
La presente invención abarca composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo anti-FGF19; y polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo anti-FGF19. Tal como se usa en el presente documento, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen FGF19 y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos que se unen a FGF19. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente portadores adecuados, tales como excipientes
15 farmacéuticamente aceptables incluyendo tampones, que se conocen bien en la técnica.
La invención también abarca realizaciones de anticuerpo y polinucleótido aislado. La invención también abarca realizaciones de anticuerpo y polinucleótido sustancialmente puro.
Los anticuerpos anti-FGF19 de la invención son preferentemente monoclonales. También están comprendidos dentro del ámbito de la invención los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH y F(ab')2 de los anticuerpos anti-FGF19 proporcionados en el presente documento. Estos fragmentos de anticuerpo pueden crearse por medios convencionales, tales como digestión enzimática o pueden generarse mediante técnicas recombinantes. Dichos fragmentos de anticuerpo pueden ser quiméricos o humanizados. Estos fragmentos son útiles para los fines
25 diagnósticos y terapéuticos expuestos más adelante.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica la característica de que el anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos.
Los anticuerpos monoclonales anti-FGF19 de la invención pueden producirse usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos n.º 4.816.567).
35 En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedador adecuado, tal como un hámster, se inmuniza para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Los anticuerpos para FGF19 se generan normalmente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de FGF19 y un adyuvante. Puede prepararse el FGF19 usando métodos bien conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen adicionalmente en el presente documento. Por ejemplo, se describe más adelante la producción recombinante de FGF19. En una realización, se inmuniza a los animales con un derivado de FGF19 que contiene el dominio extracelular (ECD) de FGF19 fusionado a la porción Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, se inmuniza a los animales con una proteína de fusión FGF19-IgG1. Normalmente se inmuniza a los animales frente a conjugados inmunogénicos o derivados de
45 FGF19 con lípido A de monofosforilo (MPL)/dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) y se inyecta por vía intradérmica la solución en múltiples sitios. Dos semanas después se refuerza a los animales. De 7 a 14 días después, se extrae sangre de los animales y se ensaya el suero respecto del título de anti-FGF19. Se refuerza a los animales hasta que alcanzan un máximo.
Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Entonces se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que
55 contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma no fusionadas parentales. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), evitando estas sustancias el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficaz, soportan altos niveles de producción estable de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas y que sean sensibles a un medio, tal como medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma son líneas de mieloma murinas, tales como aquellas derivadas de tumores murinos MOPC-21 y MPC-11 disponibles a través del Salk 65 Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE.UU. y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles a través de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EE.UU. También se han descrito líneas de mieloma
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GAPDH
FGF19
FGFR4
RPL19
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Hibridación in situ
Se generaron sondas sentido o antisentido marcadas con 33P-UTP correspondientes a FGFR4 humano (nucleótidos
5 435 a 1183 de NM_022963) o a FGF19 (nucleótidos 495 a 1132 de NM_005117) mediante reacción en cadena de la polimerasa (Mauad et al. (1994) Am J Pathol 145, 1237-1245). Se desparafinaron las secciones, se desproteinaron en 4 mg/ml de proteinasa K durante 30 min a 37 °C y se procesaron adicionalmente para hibridación in situ (Holcomb et al. (2000) Embo J 19, 4046-4055). Las sondas se hibridaron a las secciones a 55 °C durante toda la noche y las sondas no hibridadas se retiraron mediante tratamientos con RNAsa A. Se mojaron los portaobjetos en
10 emulsión NBT2 (Eastman Kodak), se expusieron durante 4 semanas a 4 °C, se revelaron y se contratiñeron con hematoxilina y eosina.
Inmunoprecipitación e inmunotransferencia
15 Se homogenizaron las muestras de tejido (50 mg) en 500 ml de tampón de extracción (Tris 20 mM, pH 8, NaCl 137 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1 %, glicerol al 10 %, MgCl2 1,5 mM, cóctel inhibidor completo de proteasa (Roche Applied Sciences)). Se extrajeron las proteínas totales de células cultivadas sobre hielo durante 30 min con el tampón de extracción. Los lisados se centrifugaron (10.000 x g, 15 min) y después se aclararon con agarosa Cibacron Blue y proteína G-agarosa (GE Healthcare Life Sciences) durante toda la noche a 4 °C. Los lisados (100
20 µg de proteína) se incubaron en 1 ml de PBS/Triton al 0,1 % con 2 µg de los anticuerpos acoplados a agarosa de interés durante 1 h a 4 °C. Se lavó la lechada del gel con el mismo tampón con el mismo tampón y se eluyó con 10 µl de tampón de elución (Pierce Biotechnology). Las muestras se analizaron mediante transferencia de Western usando 2 µg de anticuerpo para FGF19 biotinilado (BA969; R&D systems), de anticuerpo para FGFR4 (Genentech, Inc.) y reactivos secundarios conjugados a IRDye 800 y visualizados usando el escáner Odyssey (Li-Cor
25 Biotechnology).
Inmunohistoquímica
Las secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina se trataron para la recuperación de antígeno
30 usando Trilogy (Cell Marque) y después se incubaron con 10 µg/ml de anticuerpo para FGF19 (1D1; Genentech Inc). La inmunotinción se logró usando un anticuerpo secundario biotinilado, un reactivo ABC-HRP (Vector Labs) y un sustrato de peroxidasa colorimétrico DAB potenciado por metal (Pierce Laboratories).
Ensayo de migración celular
35 Se recubrió la superficie de filtros de membrana de PET en formato de 24 pocillos con una porosidad de 8 µm (BD Biosciences) durante toda la noche a 4 °C con 50 µl de colágeno de tipo 1 (50 µg/ml; Sigma) en ácido acético 0,02
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