CN104480533A - 一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法 - Google Patents

Abstract

一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法，它涉及一种胎盘干细胞库建立方法。本发明的干细胞库构建方法为：将至少3个部位的胎盘组织经过无菌清洗处理后，组织剥离、进一步消毒、剪细、冷冻剂保护，程序化冷冻、深低温暂存、液氮罐长期保存等步骤，长期保存了具有生物学活性的胎盘组织。此方法保存的胎盘组织可应用于胎盘干细胞库的建立，根据所需要细胞种类进行选择组织部位复苏后复苏、酶消化、培养、扩增、质量检验等，以便获得胎盘羊膜上皮细胞、胎盘羊膜间充质、胎盘绒毛膜间充质干细胞、胎盘底蜕膜间充质干细胞等。本发明的方法简化操作步骤，减少人工干预错误，提高效率、保存了多种干细胞资源、为未来个性化干细胞定制提供基础。

Description

一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法

技术领域

本发明涉及一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法。

背景技术

胎盘是宝宝赖以生存的各种营养物质输送的纽带，由羊膜、绒毛膜和底蜕膜构成。羊膜和绒毛膜来源于胎儿，底蜕膜则起源于母体。胎盘除在胎儿发育、营养支持和维持耐受中发挥重要作用外，还是一个机体的干细胞储备库。

胎盘中有多种多能干细胞，目前已知的至少有三类胎盘干细胞。胎盘中第一类多能干细胞为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs是一类能够自我更新，具有多向分化能力的多能干细胞，可以分化为骨、软骨、脂肪、神经和肝细胞等组织细胞。

胎盘MSCs能抑制免疫和促进造血重建的特性，使其在造血干细胞移植及移植后GVHD防治方面具有良好的应用前景。由于胎盘来源MSCs与骨髓来源MSCs相比具有组织来源广和细胞增殖能力强的优势，使其具有更好的临床应用前景。胎盘MSCs至少可以分为3种，绒毛膜MSCs、羊膜MSCs，还包括来自母体的底蜕膜组织的MSCs，通过对绒毛层和底蜕膜MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31。通过检测发现，绒毛膜MSCs还弱表达胚胎干细胞类表面抗原SSEA-4，而羊膜MSCs表达典型的MSCs表面抗原外，还表达胚胎干细胞类的表面标志物Oct-4。而底蜕膜作为母-胎界面的组成部分之一，为母体面，意味着来源于底蜕膜的MSCs可作为母亲来源的干细胞的一种。

胎盘中的第二类多能干细胞为羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)。人hAECs作为一种干细胞，表达多种胚胎干细胞类标志物，包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-80，hAECs表达多潜能干细胞特定的转录因子OCT-4和Nanog基因。同时具有向心肌、肝、神经细胞以及胰岛细胞等多系分化的潜力，因此人hAECs是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一个中间等级的干细胞。研究中表明，hAECs不表达HLA-A、B、C、DR等人类白细胞抗原具有免疫赦免性，移植后可以避免免疫排斥反应的发生，具有非常广泛的临床应用前景，近年来收集和保存羊膜上皮细胞也成为未来进行临床应用创造了条件。

胎盘中的第三类干细胞为胎盘造血干细胞(human placenta-derived hemopoietic stem cells,hPD-HSCs)。hPD-HSCs是通过剪切胎盘胎儿面组织成0.5mm3的组织块，经中性蛋白酶、胰蛋白酶及胶原酶等进行组织消化，或者经CXCR-4受体阻滞剂AMD3100加入灌注液灌注法获得中间层单个核细胞。其CD34、CD133等造血干细胞表明抗原表达均为阳性。与流动的脐带血相比，胎盘组织间隙中的hPD-HSCs中CD34阳性细胞是脐带血中的数倍，胎盘CD34+CD38+hPD-HSCs亚群细胞分化形成的粒细胞单核细胞集落、爆红型集落、混合型集落数均明显高于脐带血造血干细胞。hPD-HSCs的临床应用价值类似于脐带血造血干细胞，可以在治疗血液疾病，如急慢性白血病、再生障碍性贫血、地中海贫血和淋巴瘤等方面有较好的效果，是一个可以补充脐带血造血干细胞数量不足的重要干细胞资源。

目前，国内外针对胎盘干细胞储存方式为单一部位取样，然后体外培养扩增，达到一定数量后进行深低温冻存。这种方式只进行了胎盘组织中一种干细胞的扩增、培养，而大部分干细胞没有能够得到保存。本发明提供了一种胎盘干细胞库构建方法，本方法保存了至少3个胎盘组织部位(包括但不限于羊膜、绒毛膜、胎盘底蜕膜)，也保存了目前已知的多种干细胞，同时，对胎盘组织中目前未知的、将来可能发展应用潜力更大的干细胞也进行了保存，此方法简化操作步骤、提高效率、且保存了多种干细胞资源，为未来定制化干细胞分离、培养、扩增奠定了基础。

发明内容

本发明是为胎盘组织的不同部位保存提供可靠的方法，此方法用于胎盘干细胞库建立，分离不同功能的干细胞，延长胎盘组织的保存时间，保证组织内细胞不受影响，保证组织细胞的活性，操作方法简单，复苏后可直接用于干细胞分离培养。

本发明应用胎盘组织的冻存方法，将胎盘不同部位组织剥离后分别剪小至0.5～1mm³大小，加入配置好并提前遇冷的冻存液重悬后，分装于冻存管内，4℃温度下平衡30min，转入-80℃冰箱内过夜，最终置于液氮中长期保存，根据所需要细胞种类分别进行复苏用于细胞培养。

本发明的一种胎盘干细胞库构建方法，它是按照以下步骤进行：

一、胎盘采集：采集留有3～5cm脐带的完整胎盘，备用；

二、胎盘组织预处理：取步骤一至少3个部位的胎盘组织分别采用组织剪、钳进行仔细剥离、收集，收集后的组织分别用生理盐水洗净血液、剪小至0.5～1mm³大小，分别用生理盐水清洗2～3遍，其中，每次清洗后在1300rpm转速下离心6min，收集沉淀，继续下一次清洗；清洗结束后，收集沉淀备用；

三、组织块冻存液配制：所述冻存液每1mL是由0.68～0.72mL DMEM、0.07～0.12mL胎牛血清、0.01～0.02mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存；或者组织块冻存液采用无血清培养基进行配制；

四、组织程序化冻存：将步骤二预冷保存的组织块用0.5倍组织块体积的培养基重悬配成组织悬液，再加入0.5～1.5倍组织悬液体积的步骤三配制的冻存液，然后分装至冻存管内，首先在程控降温盒中4℃平衡30min，然后转入-80℃过夜暂存；

五、对每一个冻存管设低温防冻条码，进行管理；

六、对步骤二的预处理后的胎盘组织样本和步骤五复苏的胎盘组织进行厌氧菌、需氧菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒检测；将检测结果全部为阴性的胎盘组织转入-150℃～-180℃液氮罐气相中长期保存，即构建出胎盘干细胞库。

本发明的一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，它是按照以下步骤进行的：

一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；

二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；

三、将步骤二收集的固相物接种到T75培养瓶中，加入DMEM培养液后置于CO₂培养箱内培养2天后，计算贴壁组织块数量和悬浮组织块数量；

通过如下方式计算组织块贴壁成活率：

贴壁成活率＝培养瓶中贴壁成活的组织块数量/(培养瓶中贴壁成活的组织块数量+培养瓶中悬浮未贴壁组织块数量)*100％；

即完成胎盘干细胞库的胎盘组织复苏。

本发明的一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，它是按照以下步骤进行的：

一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；

二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；

三、对步骤二收集的固相物进行酶解30～50min后，在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集沉淀的细胞，经DMEM悬浮后取样测定细胞活率并通过如下方式计算复苏细胞活率：细胞活率＝活细胞数量/(活细胞数量+死细胞数量)*100％；并计算复苏后的细胞总数数量；即完成胎盘干细胞库的胎盘组织复苏。

本发明包含以下有益效果：

1)在建立干细胞库时，仅仅进行高效的组织冻存，操作简便、省时、节省空间资源，却保存了大量的干细胞资源。如果是建库一开始就进行细胞扩增，将要建立多种扩增培养体系、培养并保存多种细胞，这样才能将目前已知的部分胎盘干细胞资源进行保存。

2)本发明是先将至少3个胎盘组织部位(胎盘羊膜、胎盘绒毛膜、胎盘底蜕膜)进行剥离，根据胎盘的不同部位(胎儿面，母体面)分别进行冻存，根据患者需求进行复苏不同部位的组织块；

3)本发明是将组织块分别剪小至0.5～1mm³大小，在冻存过程中，冻存保护液能够渗透组织细胞内，使细胞内的水分脱出，冻存过程中有效的减少冻存过程中冰晶的形成，降低细胞的损伤；

4)本发明冷冻保存液保护胎盘组织的不同部位，根据患者的使用需求进行复苏不同部位的胎盘组织，有效的节约了胎盘组织块，增加了患者的使用次数；

5)本发明方法可应用于新生儿出生后胎盘不同组织部位的保存，延长组织的保存时间到至少20年，于液氮中可长期保存，根据母亲、胎儿疾病选择性复苏不同部位的组织块，从而不同种类的干细胞培养应用于临床治疗。

6)本方法保存了至少3个胎盘组织部位的全部细胞，这不仅保存了目前已知的胎盘干细胞，可以在需要临床使用的时候，进行有选择性地进行扩增培养，而且，也保存了目前未知、但是将来有可能应用前景更广的胎盘细胞，这类细胞有可能由于目前我们的认知水平的限制而不知道其功用，而在10-20年以后可能其应用价值才被发现，如果采用普通的建库方法，这类细胞在最开始就会因为我们的不了解了没能扩增并保存。

7)本方法也确保了胎盘组织中的一些目前我们虽然了解其未来功用、但却没有良好的培养、扩增方法的干细胞得以完整的保存。待科技发展后，扩增和培养手段不断完善后，再从本方法建立的胎盘干细胞库中将这些细胞大量增殖，从而更好地进行临床研究或应用。

8)如果采用组织块法进行胎盘干细胞培养，本发明方法复苏后胎盘组织块贴壁成活率高达98％以上。若采用酶消化法培养干细胞，冻存组织块复苏、酶解消化后细胞活性超过90％，可成功制备得到胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、羊膜上皮细胞等干细胞。

附图说明

图1为胎盘干细胞库建立流程示意图；

图2为胎盘间充质干细胞形态图；

图3为羊膜间充质干细胞形态图；

图4为羊膜上皮细胞形态图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种胎盘干细胞库构建方法，它是按照以下步骤进行：

一、胎盘采集：采集留有3～5cm脐带的完整胎盘，备用；

二、胎盘组织预处理：取步骤一至少3个部位的胎盘组织分别采用组织剪、钳进行仔细剥离、收集，收集后的组织分别用生理盐水洗净血液、剪小至0.5～1mm³大小，分别用生理盐水清洗2～3遍，其中，每次清洗后在1300rpm转速下离心6min，收集沉淀，继续下一次清洗；清洗结束后，收集沉淀备用；

三、组织块冻存液配制：所述冻存液每1mL是由0.68～0.72mL DMEM、0.07～0.12mL胎牛血清、0.01～0.02mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存；或者组织块冻存液采用无血清培养基进行配制；

四、组织程序化冻存：将步骤二预冷保存的组织块用0.5倍组织块体积的培养基重悬配成组织悬液，再加入0.5～1.5倍组织悬液体积的步骤三配制的冻存液，然后分装至冻存管内，首先在程控降温盒中4℃平衡30min，然后转入-80℃过夜暂存；

五、对每一个冻存管设低温防冻条码，进行管理；

六、对步骤二的预处理后的胎盘组织样本和步骤五复苏的胎盘组织进行厌氧菌、需氧菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒检测；将检测结果全部为阴性的胎盘组织转入-150℃～-180℃液氮罐气相中长期保存，即构建出胎盘干细胞库。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的胎盘干细胞库包含但不限于胎盘绒毛膜间充质干细胞、胎盘羊膜间充质干细胞、胎盘底蜕膜间充质干细胞和胎盘羊膜上皮细胞四种干细胞。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中采集后的胎盘用无菌生理盐水冲洗表面血液后置于无菌生物样本采样袋内，在4～25℃采集箱内运输，采集箱运输过程要求控制温度恒定，防止颠簸，采集的胎盘需在72小时内进行处理。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：采集箱的温度为4～10℃。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：采集的胎盘需在24小时内进行处理。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：采集箱的采集套装中，可以放置但不限于生理盐水、DMEM等保存液，体积以盖过胎盘为准，并要求套装密封性能良好。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中采集的胎盘的供者为无血液***病史、免疫***病史、神经***病史、内分泌***病史、HTLV、HBV、HCV、HIV、梅毒等感染史、恶性肿瘤史、吸毒史、染色体异常史、糖尿病史、性病史和其它遗传病史的供者。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述冻存液每1mL是由0.70mL DMEM、0.10mL胎牛血清、0.15mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中的培养基为DMEM、DMEM/F12、AMEM或无血清培养基。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的3个部位的胎盘组织包括羊膜、胎盘绒毛膜和胎盘底蜕膜。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十一：本实施方式一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，它是按照以下步骤进行的：

一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；

二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；

三、将步骤二收集的固相物接种到T75培养瓶中，加入DMEM培养液后置于CO₂培养箱内培养2天后，计算贴壁组织块数量和悬浮组织块数量；

通过如下方式计算组织块贴壁成活率：

贴壁成活率＝培养瓶中贴壁成活的组织块数量/(培养瓶中贴壁成活的组织块数量+培养瓶中悬浮未贴壁组织块数量)*100％；

即完成胎盘干细胞库的胎盘组织复苏。

具体实施方式十二：本实施方式一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，它是按照以下步骤进行的：

一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；

二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；

三、对步骤二收集的固相物进行酶解30～50min后，在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集沉淀的细胞，经DMEM悬浮后取样测定细胞活率并通过如下方式计算复苏细胞活率：细胞活率＝活细胞数量/(活细胞数量+死细胞数量)*100％；并计算复苏后的细胞总数数量；即完成胎盘干细胞库的胎盘组织复苏。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一

本实施例的胎盘干细胞库建立方法如下：

一、胎盘采集：采集留有3～5cm脐带的完整胎盘，采集后的胎盘用无菌生理盐水冲洗表面血液后置于无菌生物样本采样袋内，在4～25℃采集箱(最佳控制在4-10℃)内运输，采集套装中，可以放置但不限于生理盐水、DMEM等保存液，体积以盖过胎盘为准，并要求套装密封性能良好。运输过程要求控制温度、防止颠簸、运输时间在72小时内，最佳不超过24小时内进行制备；

其中，胎盘供者要求无血液***病史、免疫***病史、神经***病史、内分泌***病史、HTLV、HBV、HCV、HIV、梅毒等感染史、恶性肿瘤史、吸毒史、染色体异常史、糖尿病史、性病史和其它遗传病史；供者孕期要求在38-42周，胎儿避免为早产儿；

二、胎盘组织预处理：取步骤一至少3个部位的胎盘组织包括但不限于羊膜、绒毛膜、胎盘底蜕膜)分别采用组织剪、钳进行仔细剥离、收集，每一部分组织至少剥离、收集5～20克湿重，收集后的组织分别用生理盐水洗净血液、剪小至0.5～1mm³大小，分别用生理盐水清洗2～3遍，其中，每次清洗后在1300rpm转速下离心6min，收集沉淀，继续下一次清洗；清洗结束后，收集沉淀备用；

三、组织块冻存液配制：以10ml冻存液配制为例，其特征在于所述冻存液由6.8～7.2mLDMEM、0.7～1.2mL胎牛血清、0.1～0.2mL L-谷氨酰胺和2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存，也可采用无血清培养基进行配制。

四、组织程序化冻存：将步骤二预冷保存的组织块用0.5倍体积的培养基(培养基可以是但不限于DMEM、DMEM/F12、AMEM或者无血清培养基)重悬配成组织悬液(1ml组织：0.5mlDMEM培养基)，然后向重悬液中加入步骤三配制的冻存液0.5～1.5倍(1ml组织悬液：0.5ml～1.5ml冻存液)，然后按每管1mL分装到冻存管中，每部位组织冻存10-30管。冻存管放置在程控降温盒中4℃平衡30min后转入-80度超低温冰箱过夜暂存，待各项检测结果合格后转入液氮中长期保存；

五、样本条码管理：

胎盘干细胞库建立过程会按照条码进行管理，每个部位的胎盘组织都会有唯一的条码相对应，相应的冻存管上的条码为低温防冻条码；

六、对步骤二的胎盘组织样本和步骤五的复苏的胎盘组织进行厌氧菌、需氧菌、霉菌检测和乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒检测；对检测结果为全部阴性的胎盘组织转入-150℃～-180℃液氮罐气相中长期保存，即构建出胎盘干细胞库。

本实施例胎盘干细胞库的建立主要包含胎盘绒毛膜间充质干细胞，胎盘羊膜间充质干细胞，胎盘底蜕膜间充质干细胞，胎盘羊膜上皮细胞四种干细胞，通过对每种细胞的免疫表型进行检测，通过流式细胞仪检测胎盘干细胞的表面标志物表达和骨髓干细胞类似，阳性表达间充质干细胞表面标志物：CD90、CD105、CD166、CD29、CD44和CD73，羊膜来源的干细胞还表达胚胎干细胞类的表面标志物SSEA-4，通过免疫荧光检测羊膜来源的干细胞发现其高表达胚胎干细胞特有的蛋白成分OCT-4，这些因子的阳性表达说明羊膜来源的干细胞是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的具有多能性的类胚胎干细胞。另外，可以从形态学进行细胞鉴定，胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞均具有纺锤状并漩涡状生长形态，羊膜上皮细胞具有鹅卵石状细胞形态。

对实施例一构建的胎盘干细胞库中的胎盘组织进行复苏处理：

解冻时，先将冻存管从液氮中取出，放在37℃～40℃水浴中1～2min内迅速完成解冻；用移液管将复苏的组织块吸入放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM轻轻混匀，然后离心(4℃，1300转/分钟、6分钟)去掉上清液，反复清洗2-3次，并去掉上清液；将组织块直接接种到T75培养瓶中，加入培养液后置于CO₂培养箱内培养，培养2天后，在每一个培养瓶中，计算贴壁组织块数量和悬浮组织块数量，计算组织块贴壁成活率(贴壁成活率＝培养瓶中贴壁成活的组织块数量/(培养瓶中贴壁成活的组织块数量+培养瓶中悬浮未贴壁组织块数量)*100％)；或者采用酶解法，采用但不限于胶原酶I、II、IV、胰酶、胰酶替代物等消化酶进行消化30-50分钟后，4℃，1300转/分钟、6分钟离心，去掉上清液，收集单细胞颗粒。台盼蓝染色后计算复苏细胞活率(细胞活率＝活细胞数量/(活细胞数量+死细胞数量)*100％)和细胞总数，并进行干细胞鉴定。鉴定结果如表1和表2所示，

表格1：复苏培养、扩增后流式细胞仪及免疫荧光检测鉴定

注：(“+”:代表阳性表达,“-”：代表阴性表达)

表格2：胎盘组织复苏后细胞、组织培养结果

实施例一建库后，对胎盘组织复苏后胎盘组织块贴壁成活率高达98％以上。若采用酶消化法分离培养细胞，冻存组织块复苏、酶解消化后细胞活性超过90％。

由此可以看出，采用此方法建立的胎盘干细胞库方法简单，组织贴壁扩增率高道98％、如果消化法培养细胞，消化后细胞活率超过90％，说明大部分组织、细胞经过本发明的组织剪细、冻存液渗透、程序化冻存、快速复苏等过程后后，保持了原有的细胞活性，其原有的细胞生长趋势未受到任何改变，是一个可靠的、且简易的胎盘干细胞储存方法。

冻存、复苏后的细胞培养后，可以和正常培养出各类胎盘多能干细胞，包括羊膜上皮细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞等，从形态上和新鲜组织培养出来的结果一致，从流式细胞分析和荧光免疫学分析结果看，各类多能干细胞也表达相应的表面抗原和特异性蛋白标志物，说明此种建立干细胞库方法也从确保的胎盘组织中多种干细胞的基本性能和未来应用的前景，通过此种干细胞库建立方法，可以获得多种形态、功能优异的多能干细胞，是目前其他建库方法所不具备的。

Claims (8)

1.一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于它是按照以下步骤进行：

一、胎盘采集：采集留有3～5cm脐带的完整胎盘，备用；

二、胎盘组织预处理：取步骤一至少3个部位的胎盘组织分别采用组织剪、钳进行仔细剥离、收集，收集后的组织分别用生理盐水洗净血液、剪小至0.5～1mm³大小，分别用生理盐水清洗2～3遍，其中，每次清洗后在1300rpm转速下离心6min，收集沉淀，继续下一次清洗；清洗结束后，收集沉淀备用；

三、组织块冻存液配制：所述冻存液每1mL是由0.68～0.72mL DMEM、0.07～0.12mL胎牛血清、0.01～0.02mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存；或者组织块冻存液采用无血清培养基进行配制；

四、组织程序化冻存：将步骤二预冷保存的组织块用0.5倍组织块体积的培养基重悬配成组织悬液，再加入0.5～1.5倍组织悬液体积的步骤三配制的冻存液，然后分装至冻存管内，首先在程控降温盒中4℃平衡30min，然后转入-80℃过夜暂存；

五、对每一个冻存管设低温防冻条码，进行管理；

六、对步骤二的预处理后的胎盘组织样本和步骤五复苏的胎盘组织进行厌氧菌、需氧菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒检测；将检测结果全部为阴性的胎盘组织转入-150℃～-180℃液氮罐气相中长期保存，即构建出胎盘干细胞库。

2.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于所述的胎盘干细胞库包含胎盘绒毛膜间充质干细胞、胎盘羊膜间充质干细胞、胎盘底蜕膜间充质干细胞和胎盘羊膜上皮细胞四种干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于步骤一中采集后的胎盘用无菌生理盐水冲洗表面血液后置于无菌生物样本采样袋内，在4～25℃采集箱内运输，采集箱运输过程要求控制温度恒定，防止颠簸，采集的胎盘需在72小时内进行处理。

4.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于所述冻存液每1mL是由0.70mL DMEM、0.10mL胎牛血清、0.15mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成。

5.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于步骤四中的培养基为DMEM、DMEM/F12、AMEM或无血清培养基。

6.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于所述的3个部位的胎盘组织包括羊膜、胎盘绒毛膜和胎盘底蜕膜。

7.一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；

二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；

三、将步骤二收集的固相物接种到T75培养瓶中，加入DMEM培养液后置于CO₂培养箱内培养2天后，计算贴壁组织块数量和悬浮组织块数量；

通过如下方式计算组织块贴壁成活率：

贴壁成活率＝培养瓶中贴壁成活的组织块数量/(培养瓶中贴壁成活的组织块数量+培养瓶中悬浮未贴壁组织块数量)*100％；

即完成胎盘干细胞库的胎盘组织复苏。

8.一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；

二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；

三、对步骤二收集的固相物进行酶解30～50min后，在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集沉淀的细胞，经DMEM悬浮后取样测定细胞活率并通过如下方式计算复苏细胞活率：细胞活率＝活细胞数量/(活细胞数量+死细胞数量)*100％；并计算复苏后的细胞总数数量；即完成胎盘干细胞库的胎盘组织复苏。