CN1688605B - 包含辅助t细胞和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)表位的新免疫原性脂肽 - Google Patents

包含辅助t细胞和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)表位的新免疫原性脂肽 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含共线性(co-linear)辅助T细胞和CTL表位的合成的免疫原性脂肽分子、其生产方法和其在产生初级和次级免疫应答中的用途以及接种动物个体抗特定CTL表位的用途。更具体地，本发明提供了高度可溶的脂肽，其中脂质部分附着于一内部赖氨酸或赖氨酸类似物的末端侧链基团，优选地附着于一内部二氨基酸残基的末端侧链基团。优选地，所述内部赖氨酸或赖氨酸类似物位于辅助T细胞表位和CTL表位之间。

Description

包含辅助T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的新免疫原性脂肽
发明领域
本发明一般地涉及免疫学领域，更特别地涉及用于产生针对肽免疫原的细胞应答的试剂，以及使用所述试剂增强个体的免疫应答或使用所述试剂接种个体的方法。更特别地，本发明涉及具有增强的免疫原性、特别是增强的激活针对CD8+T细胞表位的T细胞应答以诱导抗一种入侵病原或肿瘤细胞的细胞介导免疫的活性的新脂肽。本发明还提供了包含例如与药物学可接受载体或赋形剂组合的所述脂肽的配制品和疫苗组合物，以及用于制备和使用本发明的配制品和疫苗组合物的方法。
发明背景
1.概要
本说明书含有用Patentln Version 3.1制作的氨基酸序列信息，见所附序列表。序列表中的每一序列用数字<210>后接序列标识符表示(例如<210>1，<210>2，等)。每一序列的长度和来源生物体分别在数字范围<211>和<213>内指示。本说明书中指示的序列用术语″SEQID NO：″加上后接的序列标识符定义(例如，SEQ ID NO：1表示标为<400>1的序列)。
本文所用术语“来自”、“衍生自”是指一特定的整体(integer)可以得自一特定来源，但不是必需直接得自该来源。
在本说明书中，除非上下文有其它含义，术语“包含”、“包括”(″comprise″，″comprises″或″comprising″)应被理解为包括所述的步骤、元件或整体或者步骤、元件或整体组，但不排除任何其它步骤或元件或整体或者元件或整体组。
本领域技术人员能够理解本文描述的本发明可以进行各种变化和修饰从而与所特异描述的有所不同。应理解的是本发明包括本说明书中单独或集中指出或指明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或多个所述步骤或特征的任意组合和全部组合。
本发明的范围不受本文描述的具体实施例的限制。很明显，功能等价的产品、组合物和方法属于本文描述的本发明范围。
本申请所引用的全部参考文献特别引入本文作参考。
除非另有说明，使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术可以无需过多实验而进行本发明。这种程序例如在引入本文作参考的下述教科书中有描述：
1.Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Second Edition(1989)，whole of Vols I，II，andIII；
2.DNA Cloning：A Practical Approach，Vols.I and II(D.N.Glover，ed.，1985)，IRL Press，Oxford，whole of text；
3.Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(M.J.Gait，ed.，1984)IRL Press，Oxford，whole of text，and particularly thepapers therein by Gait，pp1-22；Atkinson et al.，pp35-81；Sproatet al.，pp 83-115；and Wu et al.，pp 135-151；
4.Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1985)IRL Press，Oxford，whole oftext；
5.Animal Cell Culture：Practical Approach，Third Edition(JohnR.W.Masters，ed.，2000)，ISBN 0199637970，whole of text；
6.Immobilized Cells and Enzymes：A Practical Approach(1986)IRL Press，Oxford，whole of text；
7.Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；
8.Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan，eds.，Academic Press，Inc.)，whole of series；
9.J.F.Ramalho Ortig
Figure S03824145519960326D000031
o，“The Chemistry of Peptide Synthesis”In：Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva，Germany)；
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相关现有技术的描述
免疫疗法或接种对于各种疾病如某些传染病或癌症的预防和治疗是很有用的。但是这种治疗的应用和成功部分由于靶CTL表位的免疫原性差而受到限制。代表T细胞免疫原的合成肽当被单独输送时仅引发弱免疫，因此在疫苗组合物中没有效果。含有CTL表位的全长蛋白质不能有效进入MHC I类加工途径。另外，CTL表位是HLA限制的，并且人群中高程度的HLA多态性意味着基于CTL的疫苗可能不能提供对人群中所有基因型的全面覆盖。
已使用若干技术以增强个体对肽免疫原的免疫应答。
已知使用对肽免疫原而言是外来物质的佐剂配制品(即其在使用前与免疫原混合)，如完全Freund佐剂(CFA)，能增强个体对肽免疫原的免疫应答。但是，目前可应用的许多佐剂在人中应用毒性很大，或者无效。另外，这一类型的佐剂需要在即将给药前与肽免疫原预先配制在一起，这种配制品通常溶解度低或者不稳定。
脂肽中一种已知作为佐剂的脂部分与肽免疫原共价偶联，其可以增强在缺乏外来佐剂时弱免疫原性肽的免疫原性[Jung et al.，AngewChem，Int Ed Engl 10，872，(1985)；Martinon et al.，J Immunol 149，3416，(1992)；Toyokuni et al.，J Am Chem Soc 116，395，(1994)；Deprez，et al.，J Med Chem 38，459，(1995)；和Sauzet et al.，Vaccine13，1339，(1995)；BenMohamed et al.，Eur.J.Immunol.27，1242，(1997)；Wiesmuller et al.，Vaccine 7，29，(1989)；Nardin et al.，Vaccine16，590，(1998)；Benmohamed，et al.Vaccine 18，2843，(2000)；andObert，et al.，Vaccine 16，161，(1998)]。合适的脂肽显示出没有佐剂配制品相关的有害副作用，并且已观察到针对脂肽的抗体和细胞应答。
已知有几种不同脂肪酸可用作脂部分，举例性的脂肪酸包括但不限于棕榈酰、肉豆蔻酰、硬脂酰和癸酰基团，或者更一般地，任何C2至C30饱和、单不饱和或多不饱和脂肪酰基团均被认为是有用的。
脂氨基酸N-棕榈酰-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸，也称为Pam3Cys或Pam3Cys-OH(Wiesmuller et al.，Z.Physiol.Chem.364(1983)，p593)，是跨越革兰氏阴性细菌的内膜和外膜的Braun’s脂蛋白的N-末端部分的合成版本。Pam3Cys具有式(I)的结构：
Metzger等人的美国专利5,700,910(1997年12月23日授权)描述了用作制备脂肽的中间体的几种N-酰基-S-(2-羟烷基)半胱氨酸，这些脂肽用作合成佐剂、B淋巴细胞刺激剂、巨噬细胞刺激剂或合成疫苗。Metzger等人还教导了使用这些化合物作为中间体合成Pam3Cys-OH(Wiesmuller et al.，Z.Physiol.Chem.364(1983)，p593)以及合成包含这一脂氨基酸或其类似物作为N-末端的脂肽。这些脂肽通过在合成过程中将脂氨基酸部分与肽部分偶联而制备。
已经显示当Pam3Cys与一CTL表位肽偶联时可以刺激抗流感病毒感染的细胞的病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答(Deres etal.，Nature 342，561，1989)，并且当与合适的合成B细胞表位的N-末端偶联时能引发抗***的保护抗体(Wiesmuller et al.，Vaccine 7，29，1989；United States Patent No.6,024,964 to Jung et al.，February 15，2000)。
最近已合成了Pam3Cys的一种类似物，Pam2Cys(也称为二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸)(Metzger，J.W.，A.G.Beck-Sickinger，M.Loleit，M.Eckert，W.G.Bessler，andG.Jung.1995.J Pept Sci 1：184.)，并且示出其相应于MALP-2的脂质部分，MALP-2是一种分离自支原体的巨噬细胞激活脂肽(Sacht，G.，A.Marten，U.Deiters，R.Sussmuth，G.Jung，E.Wingender，and P.F.Muhlradt.1998.Eur J Immunol 28：4207：Muhlradt，P.F.，M.Kiess，H.Meyer，R.Sussmuth，and G.Jung.1998.Infect Immun 66：4804：Muhlradt，P.F.，M.Kiess，H.Meyer，R.Sussmuth，and G.Jung.1997.J Exp Med 185：1951)。Pam2Cys具有式(II)的结构：
Figure S03824145519960326D000061
据报道Pam2Cys是一种比Pam3Cys更强力的脾细胞和巨噬细胞刺激剂(Metzgeretal.，J Pept.Sci 1，184，1995；Muhlradt et al.，J ExpMed 185，1951，1997；and Muhlradt et al.，Infect Immun 66，4804，1998).。
产生针对一特定CTL表位的强CD8+T细胞应答需要产生强辅助T细胞应答。CD4+辅助T细胞通过分泌足够的细胞因子例如IL-2由此促进CD8+T细胞的扩增而在细胞介导免疫(CMI)中发挥功能，或者通过与抗原呈递细胞(APC)相互作用由此使其更易于激活CD8+T细胞而在细胞介导免疫(CMI)中发挥功能。因此，期望的是将CTL表位与至少一种辅助T细胞表位一起给予(Vitiello et al.，J.Clin.Invest.95，341-349，1995；Livingston et al.，J.Immunol.159，1383-1392，1997)。在APC表面存在MHCII类分子情况下，这些表位被辅助T细胞识别。
CTL表位或分离的表位可以与具有一系列辅助T细胞表位的大蛋白一起给予，以便适于个体群内II类分子的多样性。或者含有混杂的或允许的(promiscuous or permissive)辅助T细胞表位的肽可以与一个或多个CTL表位一起给予。含有混杂的或允许的辅助T细胞表位的肽在绝大多数MHC II类单元型中存在，从而它们在大多数远亲人群中诱导强CD4+辅助T细胞应答。混杂的或允许的辅助T细胞的例子是破伤风类毒素肽、Plasmodium falciparum pfg27、乳酸脱氢酶和HIVgp120(Contreas et al.，Infect.Immun，66，3579-3590，1998；Gaudebout et al.，J.A.I.D.S.Human Retrovirol 14，91-101，1997；Kaumaya et al.，J.Mol.Recog.6，81-94，1993；and Fern and Good J.Immunol.148，907-913，1992)。Ghosh et al.，Immunol 104，58-66，2001和国际专利申请No.PCT/AU00/00070(WO00/46390)也描述了来自犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus)的融合蛋白(CDV-F)的混杂的辅助T细胞表位。某些混杂辅助T细胞表位促进针对一特定CTL表位的强CTL应答，并且可以绕开某些单元型限制的免疫应答(Kaumaya et al.，J.Mol.Recog.6，81-94，1993)。
通常，疫苗制品包含一些多肽的混合物，这些多肽包含辅助T细胞表位和CTL表位，但是还已知其由同时包含辅助T细胞表位和CTL表位的一个单一多肽组成。
发明概述
在完成本发明的工作中，本发明人努力改进生产高免疫原性脂肽的方法，所述脂肽具有一个脂质部分(lipid moeity)和一个多肽部分(polypeptide moeity)，该多肽部分包含可以引起免疫应答的辅助T细胞表位和CTL表位。本发明人发现一种包含辅助T细胞表位和CTL表位的高免疫原性脂肽可以如下产生，即合成一个包含所述表位的具有一个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基的单一多肽分子，然后将脂质部分与所述内部赖氨基酸残基或所述内部赖氨酸类似物残基的侧链氨基基团偶联，这与先前技术相反，先前技术是脂质附着于N-末端。本发明的脂肽可以使用一个单氨基酸链而方便地合成，从而不需要合成后修饰来掺入两种表位。
通过在肽合成过程中将所述一或多个赖氨酸残基或者一或多个赖氨酸类似物残基以预定位置置于多肽内，脂质的附着位点能够容易地确定。因此可以定向将脂质部分置于脂肽中，以增强终产物在疫苗或佐剂配制品中的实用性。
本发明人发现经位于辅助T细胞表位和CTL表位的氨基酸序列之间的内部赖氨酸残基的侧链ε氨基基团或内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团附着脂质部分，当与脂质附着于肽的N-末端而获得的线性结构相比时，能够增强的树突细胞成熟。
本发明脂肽所提供的一个优点是它们有足够的免疫原性，从而通常不需要在包含这些脂肽的疫苗配制品中包括外来佐剂。
本发明当然也包括经存在于辅助T细胞表位的氨基酸序列或CTL表位的氨基酸序列中的内部赖氨酸残基的ε氨基基团或者内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团附着脂质部分，唯一的要求是脂质部分不附着于肽的N-末端或C-末端。“内部”是指在包含辅助T细胞表位和CTL表位的多肽的除N-末端或C-末端之外的一个位置。本领域技术人员能够理解含CTL表位的疫苗的溶解性对于商业规模生产疫苗配制品是非常希望的。
优选地，脂质部分经位于辅助T细胞表位和CTL表位的氨基酸序列之间的赖氨酸残基的ε氨基基团或赖氨酸类似物残基的末端侧链基团而附着。
任选地，在辅助T细胞表位和CTL表位之间加入一或多个氨基酸间隔物(spacer)，例如在位于所述表位之间的内部赖氨酸或赖氨酸类似物的任一侧加入。
在脂质部分和多肽部分之间也可以加入任何常规类型的间隔物。在此方面特别优选的间隔物有丝氨酸二聚体、三聚体、四聚体等。其它的间隔物如精氨酸二聚体、三聚体、四聚体或6-氨基己酸也可以应用。
如本文所示，本发明人通过将脂质部分偶联至合成肽部分中的一内部赖氨酸残基的暴露的ε氨基基团而产生了本发明的脂肽。任选地，在加入脂质部分之前可以将一间隔物加至暴露的ε氨基基团。
如本文所述，式(III)或(IV)的脂氨基酸可以直接加至内部赖氨酸残基的ε氨基基团或加至内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团。选自如下一组的脂氨基酸也是有用的，所述的组由(i)Pam2Cys(也称为二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸)，(ii)Ste2Cys(也称为二硬脂酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-双(硬脂酰氧基)丙基]半胱氨酸)，Lau2Cys(也称为二月桂酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-双(月桂酰氧基)丙基]半胱氨酸)，和Oct2Cys(也称为二辛酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-双(辛酰氧基)丙基]半胱氨酸)组成。
如本文所述，针对流感病毒的本发明的脂肽在不存在外来佐剂时也诱导病毒特异性CTL应答，这一点从它们诱导强CTL介导的病毒清除应答、诱导CD8+T细胞迁移至肺以及正调节MHC II类分子在幼(immature)树突细胞(DC)上的表面表达而反映出。与具有N-末端偶联的脂质的脂肽相比，在给予本发明脂肽后树突细胞的成熟增强这一点与增强的辅助T细胞表位呈递一致。
本领域技术人员清楚，辅助T细胞和CTL表位的性质在本发明中不是关键的。将脂质部分偶联至构建体的多肽部分内的一或多个赖氨酸残基或赖氨酸类似物残基的ε氨基基团的这一新途径具有广泛的应用。因此，基于本文的结果，应能理解各种辅助T细胞和CTL表位可以用于脂肽构建体。
附图简述
图1是一示意图，其显示了用于本研究的肽和脂肽构建体的一般结构。肽结构由一个CD4+辅助T细胞表位[Th]和一个CTL细胞表位[CTL]组成，它们组装成串连线性序列，具有一连接内部赖氨酸残基(即[Th]-Lys-[CTL])或者不具有任何内部赖氨酸残基(即[Th]-[CTL])。脂肽是分支结构，其中脂质部分通过在大约分子中心的位于两个表位之间的一个赖氨酸残基Lys的ε氨基基团而附着(即[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]；[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]或[Th]-Lys(Pam1Cys-Ser-Ser)-[CTL])。在分支构建体的情况中，附着脂质的位于中心的赖氨酸残基用斜体Lys表示。在一些情况中，在肽和脂质部分之间加入2个丝氨酸残基(Ser-Ser)。对于脂肽Pal2LysLys[Th]-[CTL]，两个棕榈酸残基加到N-末端赖氨酸残基的α和ε氨基基团上，[Th]附着于氨基酸序列中的倒数第2个赖氨酸的ε氨基基团上。在[Th]-Lys(Chol2Lys-Ser-Ser)-[CTL]中，两个胆固醇残基附着于N-末端赖氨酸残基。
图2示出附着于图1所示结构的脂质部分的肽部分的一级氨基酸序列。包含这些氨基酸序列的未脂化肽如下所示：
(i)[Th]由来自流感病毒血凝素轻链的CD4+辅助T细胞表位组成，如SEQ ID NO：1所示；
(ii)[CTL]由流感病毒毒株A/Puerto Rico/8/34(PR8；H1N1)的核蛋白的第147-155位氨基酸残基组成的免疫显性H-2d-限制性CTL表位组成，如SEQ ID NO：2所示；
(iii)[Th]-[CTL]由具有(i)和(ii)的多肽组成，组装的肽的序列如SEQ ID NO：3所示；
(iv)[Th]-Lys-[CTL]由具有由一个赖氨酸残基(粗体下划线残基)分隔的(i)和(ii)的多肽组成，组装的肽的序列如SEQ ID NO：4所示；
(v)[P25]-Lys-[SIINFEKL]由来自称为P25的CDV-F蛋白的一个辅助T细胞表位(SEQ ID NO：20)和来自卵清蛋白的一个CTL表位(SEQ ID NO：173)组成，这两个表位由一个赖氨酸残基(粗体下划线残基)分隔，组装的肽的序列如SEQ ID NO：174所示；
(vi)[P25]-Lys-[LLO91-99]由来自称为P25的CDV-F蛋白的一个辅助T细胞表位(SEQ ID NO：20)和来自Listeriamonocytogenes的一个CTL表位(SEQ ID NO：172)组成，这两个表位由一个赖氨酸残基(粗体下划线残基)分隔，组装的肽的序列如SEQ ID NO：175所示；
(vii)[P25]-Lys-[HCV]由来自称为P25的CDV-F蛋白的一个辅助T细胞表位(SEQ ID NO：20)和来自丙型肝炎病毒核心蛋白的一个CTL表位(SEQ ID NO：176)组成，，这两个表位由一个赖氨酸残基(粗体下划线残基)分隔，组装的肽的序列如SEQ IDNO：177所示。
包含这些氨基酸序列的脂肽如下指代：
(i)[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]由肽[Th]-Lys-[CTL](即SEQ ID NO：4)和缀合于内部赖氨酸(粗体下划线残基)的ε氨基基团的式(III)的脂质组成；
(ii)[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]由肽[Th]-Lys-[CTL](即SEQ ID NO：4)和缀合于内部赖氨酸(粗体下划线残基)的ε氨基基团的式(IV)的脂质组成；
(iii)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]由肽[P25]-Lys-[LLO91-99]和缀合于所述肽的内部赖氨酸(粗体下划线残基)的ε氨基基团的式(IV)的脂质组成；
(iv)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]由肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]和缀合于所述肽的内部赖氨酸(粗体下划线残基)的ε氨基基团的式(IV)的脂质组成；
(v)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV]由肽[P25]-Lys-[HCV]和缀合于所述肽的内部赖氨酸(粗体下划线残基)的ε氨基基团的式(IV)的脂质组成。
图3示出用图1所示脂肽引发并随后用流感病毒攻击的小鼠的降低的病毒负荷。小鼠用在50μl PBS中的9nmol脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]鼻内接种(第2列和第3列)，或者用50μl PBS中的[Th]-Lys-[CTL]肽(第1列)或仅用PBS(第4列)接种。肽和脂肽的代号见图2。在接种后第9天，用甲氧氟烷麻醉小鼠，并用30000噬斑形成单位的称为A/Memphis/1/71(Mem71)的流感病毒亚型H3N1鼻内攻击。5天之后，取出它们的肺，通过在MDCK细胞上的噬斑分析来分析感染性病毒的存在。每个条代表来自一组5个BALB/c小鼠的病毒效价的几何平均效价，误差杆代表平均值的标准差。条上的数字代表相对于PBS对照的肺病毒效价降低百分比。
图4a示出在接受图2所指示的脂肽的免疫小鼠中增强的脂肽诱导的病毒清除率。小鼠用在50μl PBS中的9nmole脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]接种(第2列和第3列)，或者用50μl PBS中的[Th]-Lys-[CTL]肽(第1列)或仅用PBS(第4列)接种。在接种后第28天，用30000噬斑形成单位的Mem71病毒攻击小鼠。肽和脂肽的代号见图2。数据以攻击后第5天肺病毒效价降低百分比表示。肽和脂肽的代号见图2。数据以攻击后第5天肺病毒效价降低百分比表示。数据显示，在攻击后5天，与肽(第1列)或PBS(第4列)相比，用脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL](第2列)或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](第3列)免疫的小鼠的肺中有增加的感染性病毒降低。
图4b示出在接受具有图2代号的脂肽的免疫小鼠中增强的T细胞激活。小鼠用在50μl PBS中的9n mole脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]接种(第2列和第3列)，或者用50μl PBS中的[Th]-Lys-[CTL]肽(第1列)或仅用PBS(第4列)接种。接种后9天杀死接种的小鼠并进行支气管肺泡灌洗术(BAL)。通过将BAL样品在培养皿中于37℃保温1小时除去粘附细胞。回收非粘附细胞并染色检测CD8和CD4表达。用流式细胞计量术分析细胞。基于正散射和旁散射模式识别淋巴细胞群，并且分析了10000个淋巴细胞。数据以BAL液中是CD8+淋巴细胞的非粘附细胞百分比表示。数据显示，在攻击后5天，与肽(第1列)或PBS(第4列)相比，用脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL](第2列)或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](第3列)接种的小鼠的BAL样品中有增加的病毒特异性CD8+T细胞的激活。肽和脂肽的命名见图2。
图4c示出作为对如图2命名的脂肽的应答，树突细胞的成熟增加。将将一种BALB/c脾来源树突细胞系(D1细胞)与0.45nmole/mL肽[Th]-Lys-[CTL](第1列)或脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL](第2列)或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](第3列)或者与作为阴性对照的培养基(第4列)或作为阳性对照的脂多糖(LPS；第5列)保温过夜。通过流式细胞计量术确定表达高水平MHC II类分子因而呈成熟状态的D1细胞的百分比。肽和脂肽命名见图2。数据显示与暴露于肽和培养基相比，暴露于脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]后树突细胞表面上的MHC II类分子的表达增强(即树突细胞成熟增强)。
图5示出在用x轴上指示的合成免疫原接种的小鼠中诱导的肺病毒清除应答，所述合成免疫原每个均包括SEQ ID NO：1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQ ID NO：2所示的H-2d-限制性CTL表位。各组的5只小鼠用在PBS中的9nmole脂肽鼻内接种。在接种后28天用104.5PFU的Mem71流感病毒鼻内攻击小鼠。通过在MDCK细胞单层上的噬斑形成确定在攻击5天后取样的肺匀浆液中感染性病毒的效价。每个圆圈代表一只小鼠的病毒效价，线条代表一组的几何平均效价。相对于PBS对照组的平均病毒效价降低百分比在每一列数据之上显示。
图6示出在病毒攻击期间CTL决定簇特异性CD8+-T细胞加速流入脂肽接种的小鼠的肺中。脂肽包含SEQ ID NO：1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQ ID NO：2所示的H-2d-限制性CTL表位。各由3只小鼠组成的各组鼻内用9n mole所示脂肽接种。在接种后第28天，将小鼠用104.5PFU的Mem71流感病毒进行鼻内攻击。通过胞内细胞因子产生分析对在攻击后第5天小鼠肺中的CTL决定簇特异性IFN-γ分泌细胞进行计数。每一样品分析10,000个CD8+细胞。数据代表每组小鼠的平均值和标准差。
图7示出在病毒攻击后CTL决定簇特异性CD8-T细胞加速流入脂肽接种的小鼠的肺中。脂肽包含SEQ ID NO：1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQ ID NO：2所示的H-2d限制性CTL表位。小鼠用在PBS中的9nmole指示的肽鼻内接种。接种后9天，小鼠用104.5PFU的Mem71流感病毒进行鼻内攻击。在感染后第5天，通过用抗CD8抗体和加载CTL表位的MHCI类复合物染色来自肺的淋巴细胞而计数肺中CTL决定簇特异性CD8T细胞总共分析了30,000个CD8T细胞。
图8示出在首次用于实验的小鼠中的细胞毒性T细胞活性。体内CTL决定簇特异性细胞毒性用经CTL决定簇刺激(pulsed)的并用高密度CFSE标记的同基因脾细胞测量。用低密度CFSE标记的未刺激的脾细胞用作对照。每一靶细胞群的15×106个细胞的混合物在感染后第4天静脉注射进首次用于实验的小鼠。16小时后杀死小鼠，通过流式细胞计量术分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low细胞群。每一样品总共分析1×106个淋巴细胞。
图9示出脂肽接种的小鼠中的细胞毒性T细胞活性。用在PBS中的9nmole包含SEQ ID NO：1所示CD4+辅助T细胞表位和SEQ IDNO：2所示H-2d-限制性CTL表位的[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]鼻内接种小鼠。在第28天用Mem71攻击小鼠。体内CTL决定簇特异性细胞毒性用经CTL决定簇刺激的并用高密度CFSE标记的同基因脾细胞测量。用低密度CFSE标记的未刺激的脾细胞用作对照。每一靶细胞群的15×106个细胞的混合物在感染后第4天静脉注射进脂肽接种的被攻击的小鼠。16小时后杀死小鼠，通过流式细胞计量术分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low细胞群。每一样品总共分析1×106个淋巴细胞。
图10示出基于各种肽的免疫原诱导表位特异性CTL的能力。脂肽包含SEQ ID NO：1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQ ID NO：2所示的H-2d-限制性CTL表位。用在PBS中的各种脂肽鼻内接种各由3只小鼠组成的各组，并在第28天用Mem71攻击。为了分析体内CTL决定簇特异性细胞毒性，用CTL决定簇刺激并用高密度CFSE标记同基因脾细胞。通过共注射用低密度CFSE标记的同基因脾细胞而控制抗原特异性溶解。在感染后第4天静脉注射每一靶细胞群的15×106个细胞的混合物。16小时后杀死小鼠，通过流式细胞计量术分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low细胞群。每一样品总共分析1×106个淋巴细胞。各个小鼠用实心方块代表，条代表几何平均效价。
图11示出脂肽对干扰素γ产生细胞的诱导。包含一种辅助T细胞表位和Listeria monocytogenes的CTL表位并经位于所示表位之间的一内部赖氨酸残基的ε氨基基团与Pam2Cys连接的肽(即图2列出的基于SEQ ID NO：175的肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99])或者基于这一结构且其中Pam2Cys经所述赖氨酸的ε氨基基团连接的脂肽用于免疫小鼠。如x轴所示，5只BALB/c小鼠用细菌静脉接种或者用9nmole脂化肽(lipidated peptide)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]或9nmole非脂化肽(non-lipidated peptide)[P25]-Lys-[LLO91-99](SEQ ID NO：175；图2)或磷酸缓冲盐水(PBS)皮下免疫。从接种动物获得脾细胞并用具有SEQ ID NO：172所示序列的分离的CTL表位(空心条)体外刺激或不用抗原刺激(实心条)，28天后测量存在的(IFN-γ)产生细胞数。纵坐标指示每1,000,000个脾细胞中的IFN-γ产生细胞数。数据显示用脂肽接种的小鼠的IFN-γ产生细胞数增加，表明脂肽相对于非脂化的肽具有增强的激活T细胞的能力。
图12示出用图2中命名为[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]的脂肽免疫的小鼠具有抗L.monocytogenes感染的增强的保护。如x轴所示，5只BALB/c小鼠用1000个细菌静脉接种(第1列)，或者用PBS(第2列)或9nmol[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]肽(第3列)或9nmol非脂化[P25]-Lys-[LLO91-99]肽(SEQ ID NO：175；第4列)皮下免疫。小鼠用完整细菌攻击，在攻击后28天测量肝中存在的集落形成单位数(纵坐标)。
图13示出用脂肽免疫产生的抗B16黑素瘤的保护作用。C57BL/6小鼠用20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL](空心圆)、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL](空心三角)或用PBS(空心方块)皮下免疫尾根。14天后小鼠用2×105B16-OVA细胞(每组n＝6)背部皮下攻击，如述监测肿瘤生长(Anraku，et al.，JVirol.76；3791-3799，2002)。
图14示出由免疫后保持无肿瘤的动物百分比确定的用脂肽免疫原对Lewis肺肿瘤的治疗性处理。用3×104个已用卵清蛋白转染并因此表达CTL表位SIINFEKL的Lewis Lung肿瘤细胞[Nelson et al.，JImmunol.166：5557-5566，2001]注射小鼠。接受肿瘤细胞4天后，在动物尾根皮下接种20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL](空心圆)、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL](空心三角)或PBS(空心方块)。接受肿瘤细胞后11天给予第二次类似剂量的免疫原。监测动物的肿瘤发生，当肿瘤面积超过100mm2时使动物安乐死。
图15示出由免疫后动物存活率确定的用脂肽免疫原对Lewis肺肿瘤的治疗性处理。用3×104个已用卵清蛋白转染并因此表达CTL表位SIINFEKL的Lewis肺肿瘤细胞[Nelson et al.，J Immunol.166：5557-5566，2001]注射小鼠。接受肿瘤细胞4天后，在动物尾根皮下接种20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL](空心圆)、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL](空心三角)或PBS(空心方块)。接受肿瘤细胞后11天给予第二次类似剂量的免疫原。监测动物的存活率，当肿瘤面积超过100mm2时使动物安乐死。
图16示出基于肽和脂肽的免疫原正调节人树突细胞上MHC II类、CD83和CD86的表达的能力。人单核细胞衍生的树突细胞与培养基单独、LPS(5μg/mL)、非脂化肽[P25]-Lys-[HCV](5μg/mL)或脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV](5μg/mL)保温48小时，之后在流式细胞计量术分析之前用针对HLA-DR，CD83和CD86的FITC缀合抗体染色。柱状图代表了进入正散射和旁散射点图上的活的大粒细胞(live large granular cells gated on the forward and side scatter dotplot)。柱状图灰色区域以及给出的值相应于在分析的群体内表达高水平抗原的细胞百分比。辅助T细胞表位鉴别自Mobillivirus并具有氨基酸序列KLIPNASLIENCTKAEL(SEQ ID NO：20)；具有氨基酸序列DLMGYIPLV(SEQ ID NO：176)的CTL表位是一种来自丙型肝炎病毒核心蛋白的HLA A2限制性CTL表位。
优选实施方案的详细描述
脂肽
本发明的一个方面提供了分离的脂肽，其包含与一或多个脂质部分缀合的多肽，其中：
(i)所述多肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；和
(b)一或多个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基，用于经所述赖氨酸或赖氨酸类似物的ε氨基基团或末端侧链基团附着每一个所述脂质部分；以及
(ii)所述一或多个脂质部分的每一个均直接或间接共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团或所述内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团。
本文所用术语“脂肽”是指任何非天然存在的物质组合物，其包含直接或间接缀合的一或多个脂质部分(lipid moiety)和一或多个氨基酸序列，所述物质组合物基本上不含同种非缀合脂质或蛋白质。
术语“直接“是指脂质部分和氨基酸序列并列在所述脂肽中(即它们不由一个间隔分子隔开)。
术语“间接”是指脂质部分和氨基酸序列由包含一或多个含碳分子如一或多个氨基酸残基的间隔物隔开。氨基酸序列可以是任意长度，由辅助T细胞表位和CTL表位的功能性需要而限制。
本文所用术语“内部赖氨酸残基”是指包含辅助T细胞表位和CTL表位的多肽中的赖氨酸残基，其中所述赖氨酸不是所述多肽的N-末端氨基酸残基或者C-末端残基。因此，内部赖氨酸残基可以是辅助T细胞表位或CTL表位的C-末端或N-末端残基，条件是其位于多肽的内部。这意味着用于附着脂质的赖氨酸残基是存在于辅助T细胞表位的氨基酸序列中或CTL表位的氨基酸序列中的残基。内部赖氨酸残基也可以独立于辅助T细胞表位或CTL表位之外，在这种情况下它必须连接多肽的这两个表位。
类似地，术语“内部赖氨酸类似物”是指包含辅助T细胞表位和CTL表位的多肽中的赖氨酸类似物残基，其中所述赖氨酸类似物不是所述多肽的N-末端氨基酸残基或C-末端残基。确定一个赖氨酸残基是否是“内部”的标准同样适用于确定一个赖氨酸类似物是否是内部的。
术语“赖氨酸类似物”是指能掺入到肽的内部的合成化合物，其具有合适的侧基可以偶联脂质部分，包括具有这种氨基侧基的氨基酸类似物或非天然存在的氨基酸。优选的赖氨酸类似物包括下述通式(V)的化合物：
Figure S03824145519960326D000181
其中n是从0到3的整数，X是选自NH、O和S的所述内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团。更优选地，n是具有从1到3的数值的整数。更优选地，X是氨基。在一个特别优选的实施方案中，赖氨酸类似物选自2，3-二氨基丙酸(Dpr)、2，4-二氨基丁酸(Dab)和2，5-二氨基戊酸[即鸟氨酸(Orn)]。
本领域技术人员了解术语“ε氨基基团”的含义。术语“末端侧链基团”是指在赖氨酸类似物侧链上的远离所述类似物α-碳的取代基，如Dpr的β-氨基、Dab的γ-氨基或Orn的δ-氨基。
优选地，脂质部分经赖氨酸残基的ε氨基基团附着或者附着于位于辅助T细胞表位和CTL表位的氨基酸序列之间的所述内部赖氨酸类似物的末端侧链基团上。
本发明脂肽的增强的引起T细胞应答的能力反映在它们正调节幼树突细胞(DC)、特别是D1细胞上MHC II类分子的表面表达的能力上，以及反映在增加的免疫动物的组织样品中CD8+T细胞数上。在用病毒病原体的CTL免疫的动物中，本发明脂肽引起T细胞应答的能力增强也通过免疫动物后病毒清除增强而指示。
优选地，脂肽是可溶的，更优选地是高度可溶的。
本领域技术人员已知的是，赖氨酸的ε氨基基团是这一氨基酸的侧链的末端氨基基团。使用内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物的末端侧链基团交联脂质部分便于使多肽部分作为掺入辅助T细胞表位和CTL表位的共线性氨基酸序列而合成。脂质经赖氨酸残基的ε氨基基团或赖氨酸类似物的末端侧链基团而附着的脂肽与脂质经肽中赖氨酸的α-氨基基团而附着的脂肽有明显的结构区别。
因此，特别优选的是脂质部分所附着的至少一个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物位于多肽部分内，从而分隔免疫功能表位。例如，所述内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物可以作为表位之间的间隔和/或连接残基。自然地，当内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物位于辅助T细胞表位和CTL表位之间时，脂质部分也将位于这些表位之间的一个位置，形成多肽氨基酸序列的一个分支。如本文所示，使用一个单赖氨酸残基分隔，CTL和辅助T细胞表位(例如SEQ ID No：4)。
本发明很明显包括所述内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基位于一第三种氨基酸序列内，该第三种氨基酸序列不是CTL表位或辅助T细胞表位。例如，所述内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物可以缀合于一或多个不同氨基酸残基。
内部赖氨的ε氨基基团或内部赖氨酸类似物的末端侧链基团可以用与用于保护其它氨基酸的α-氨基和侧链官能团呈正交(orthogonally)的化学基团保护。以此方式，内部赖氨酸或赖氨酸类似物的ε氨基基团或其它侧链基团可以选择性暴露以允许化学基团如含脂质部分合适地附着于ε氨基基团或侧链氨基。
为了用Fmoc化学进行肽合成，通过修饰的氨基酸残基Fmoc-Lys(Mtt)-OH(Nα-Fmoc-Nε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸)提供合适的正交保护的赖氨酸ε基团。对于本文所涉及的各种赖氨酸类似物，有类似的合适正交保护的侧链基团可以利用，例如Fmoc-Om(Mtt)-OH(Nα-Fmoc-Nδ-4-甲基三苯甲基-L-鸟氨酸)，Fmoc-Dab(Mtt)-OH(Nα-Fmoc-Nγ-4-甲基三苯甲基-L-二氨基丁酸)和Fmoc-Dpr(Mtt)-OH(Nα-Fmoc-Nβ-4-甲基三苯甲基-L-二氨基丙酸)。侧链保护基Mtt在存在于赖氨酸或赖氨酸类似物α-氨基基团上的Fmoc被除去的条件下是稳定的，但是其可以用存在于二氯甲烷中的1％三氟乙酸而选择性除去。Fmoc-Lys(Dde)-OH(Nα-Fmoc-Nε-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基-L-赖氨酸)或Fmoc-Lys(ivDde)-OH(Nα-Fmoc-Nε-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)-3-甲基丁基-L-赖氨酸)也可以如此应用，其中Dde侧链保护基在肽合成过程中通过用肼处理而选择性除去。
为了用Boc化学进行肽合成，可以使用Boc-Lys(Fmoc)-OH。侧链保护基Fmoc可以通过用哌啶或DBU(1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)处理而选择性除去，但是当用三氟乙酸从α末端除去Boc基团时，Fmoc仍留在原位。
优选地，辅助T细胞表位和CTL表位通过至少一个或两个或三个或四个或五个氨基酸残基包括单个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基而隔开。
很显然本发明包括添加多个脂质部分至多肽部分上。例如，多肽可包括多个内部赖氨酸残基和/或多个内部赖氨酸类似物。如果多个内部赖氨酸或多个赖氨酸类似物更紧密地位于一起则可能在脂质添加时发生空间位阻，从而产生终产物混合物或者收率降低。
与这一点相关的是无需包含辅助T细胞表位的完整氨基酸序列或者包含CTL表位的完整氨基酸序列均具有免疫应答。因此所述氨基酸序列在包含所述表位的同时也可具有额外的不具备辅助T细胞活性或CTL表位的序列。当这种额外序列包括一或多个内部赖氨酸或赖氨酸类似物残基时，这些残基的末端侧链基团可以作为脂质部分的附着位点。自然地，必须保持辅助T细胞功能和CTL表位功能。
用于附着脂质部分的内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物的位置应该也被选择，从而脂质的附着不会干扰辅助T细胞表位或CTL表位在给予脂肽的个体中的免疫功能。例如，根据脂质部分的选择，所述脂质在CTL表位内的附着可能在空间上阻碍CTL表位呈递。
下述通式(VI)提供了本发明脂肽的一般优选形式，其中内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物位于辅助T细胞表位和CTL表位之间。
式(VI)：
其中：
表位是辅助T细胞表位或CTL表位；
A存在或不存在，由长度约1至约6个氨基酸的一种氨基酸间隔物组成；
n是值为1、2、3或4的整数；
X是选自NH，O和S的末端侧链基团，优选由NH组成；
Y存在或不存在，由长度约1至约6个氨基酸的一种氨基酸间隔物组成，其中优选的是所述氨基酸为丝氨酸；以及
Z是脂质部分，优选为Pam2Cys或Pam3Cys。
辅助T细胞表位是本领域技术人员已知能增强一特定靶个体(即人类个体，或特异的非人动物个体如大鼠、小鼠、豚鼠、狗、马、猪或山羊)中的免疫应答的任何辅助T细胞表位，优选的辅助T细胞表位长度至少约10-24个氨基酸，更通常约15至约20个氨基酸。
混杂或允许辅助T细胞表位是特别优选的，因为它们能容易地化学合成，并且无需使用包含多个辅助T细胞表位的较长多肽。
适于用于本发明脂肽中的混杂或允许辅助T细胞表位的例子选自如下一组：
(i)破伤风类毒素肽(TTP)的啮齿类或人类辅助T细胞表位，如TTP的氨基酸830-843(Panina-Bordignon et al.，Eur.J.Immun.19，2237-2242，1989)；
(ii)Plasmodium falciparum pfg27的啮齿类或人类辅助T细胞表位；
iii)乳酸脱氢酶的啮齿类或人类辅助T细胞表位；
(iv)HIV包膜蛋白或HIVgp120的啮齿类或人类辅助T细胞表位(Berzofsky et al.，J.Clin.Invest.88，876-884，1991)；
(v)从已知锚蛋白的氨基酸序列预测的合成的人类辅助T细胞表位(PADRE)(Alexander et al.，Immunity1，751-761，1994)；
(vi)麻疹病毒融合蛋白(MV-F；Muller et al.，Mol.Immunol.32，37-47，1995；Partidos et al.，J.Gen.Virol.，71，2099-2105，1990)的啮齿类或人类辅助T细胞表位；
(vii)包含犬瘟热病毒融合蛋白(CDV-F)的至少约10个氨基酸残基、例如来自CDV-F的氨基酸位置148-283的辅助T细胞表位(Ghosh etal.，Immunol.104，58-66，2001；International Patent Publication No.WO00/46390)；
(viii)衍生自MUC1粘蛋白的胞外串联重复结构域的肽序列的人类辅助T细胞表位(US Patent Application No.0020018806)；
(ix)流感病毒血凝素(IV-H)的啮齿类或人类辅助T细胞表位(Jacksonet al.Virol.198，613-623，1994)；以及
(x)***病毒VP3蛋白的牛或骆驼辅助T细胞表位，其包含***病毒(FMDV-O1Kaufbeuren株)的VP3蛋白的残基173-176或另一FMDV毒株的相应氨基酸。
如本领域技术人员已知的，一个辅助T细胞表位可以由一或多个不同物种识别。因此，本文中任何辅助T细胞表位的命名不应被视为仅限于表位被识别的该物种的免疫***。例如，一个啮齿类辅助T细胞表位可以被小鼠、大鼠、兔、豚鼠或其它啮齿类或者人或狗的免疫***识别。
更优选地，辅助T细胞表位包含选自如下一组的一个氨基酸序列：
(i)来自IV-H的ALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO：1)；
(ii)来自IV-H的GALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO：14)；
(iii)来自MV-F的LSEIKGVIVHRLEGV(SEQ ID NO：15)；
(iv)来自CDV-F的TAAQITAGIALHQSNLN(SEQ ID NO：16)；
(v)来自CDV-F的IGTDNVHYKIMTRPSHQ(SEQ ID NO：17)；
(vi)来自CDV-F的YKIMTRPSHQYLVIKLI(SEQ ID NO：18)；
(vii)来自CDV-F的SHQYLVIKLIPNASLIE(SEQ ID NO：19)；
(viii)来自CDV-F的KLIPNASLIENCTKAEL(SEQ ID NO：20)；
(ix)来自CDV-F的LIENCTKAELGEYEKLL(SEQ ID NO：21)；
(x)来自CDV-F的AELGEYEKLLNSVLEPI(SEQ ID NO：22)；
(xi)来自CDV-F的KLLNSVLEPINQALTLM(SEQ ID NO：23)；
(xii)来自CDV-F的EPINQALTLMTKNVKPL(SEQ ID NO：24)；
(xiii)来自CDV-F的TLMTKNVKPLQSLGSGR(SEQ ID NO：25)；
(xiv)来自CDV-F的KPLQSLGSGRRQRRFAG(SEQ ID NO：26)；
(xv)来自CDV-F的SGRRQRRFAGVVLAGVA(SEQ ID NO：27)；
(xvi)来自CDV-F的FAGVVLAGVALGVATAA(SEQ ID NO：28)；
(xvii)来自CDV-F的GVALGVATAAQITAGIA(SEQ ID NO：29)；
(xviii)来自CDV-F的GIALHQSNLNAQAIQSL(SEQ ID NO：30)；
(xix)来自CDV-F的NLNAQAIQSLRTSLEQS(SEQ ID NO：31)；
(xx)来自CDV-F的QSLRTSLEQSNKAIEEI(SEQ ID NO：32)；
(xxi)来自CDV-F的EQSNKAIEEIREATQET(SEQ ID NO：33)；
(xxii)来自CDV-F的SSKTQTHTQQDRPPQPS(SEQ ID NO：34)；
(xxiii)来自CDV-F的QPSTELEETRTSRARHS(SEQ ID NO：35)；
(xxiv)来自CDV-F的RHSTTSAQRSTHYDPRT(SEQ ID NO：36)；
(xxv)来自CDV-F的PRTSDRPVSYTMNRTRS(SEQ ID NO：37)；
(xxvi)来自CDV-F的TRSRKQTSHRLKNIPVH(SEQ ID NO：38)；
(xxvii)来自CDV-F的TELLSIFGPSLRDPISA(SEQ ID NO：39)；
(xxviii)来自CDV-F的PRYIATNGYLISNFDES(SEQ ID NO：40)；
(xxix)来自CDV-F的CIRGDTSSCARTLVSGT(SEQ ID NO：41)；
(xxx)来自CDV-F的DESSCVFVSESAICSQN(SEQ ID NO：42)；
(xxxi)来自CDV-F的TSTIINQSPDKLLTFIA(SEQ ID NO：43)；
(xxxii)来自CDV-F的SPDKLLTFIASDTCPLV(SEQ ID NO：44)；
(xxxiii)来自MUC-1的STAPPAHGVTSAPDTRAPGSTAPP(SEQ ID NO：45)；
(xxxiv)来自MUC-1的GVTSAPDTRPAPGSTASSL(SEQ ID NO：46)；
(xxxv) 来自MUC-1的GVTSAPDTRPAPGSTASL(SEQ ID NO：47)；
(xxxvi)来自MUC-1的TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPKKG(SEQ ID NO：48)；
(xxxvii)MUC-1的STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPK(SEQ ID NO：49)；
(xxxviii)来自FMDV-VP3蛋白的GVAE(SEQ ID NO：50)；
(xxxix)FMDV-VP3的TASGVAETTN(残基170-179)(SEQ ID NO：51)；和
(xI)来自FMDV的TAKSKKFPSYTATYQF(SEQ ID NO：52).
本文所述辅助T细胞表位仅为举例目的而包括进来。使用本领域技术人员已知的标准肽合成技术，本文所述的辅助T细胞表位可以用一不同的辅助T细胞表位取代以适应本发明脂肽在不同物种中的应用。因此，本领域技术人员已知的用于引起或增强在靶物种中的免疫应答的另外的辅助T细胞表位不被排除在外。
另外的辅助T细胞表位可以使用用于鉴别合适序列的组分蛋白、蛋白片段和肽的体外T细胞刺激技术经详细分析而鉴别(Goodman andSercarz，Ann.Rev.Immunol.，1，465，(1983)；Berzofsky，In：″The Yearin Immunology，Vol.2″page 151，Karger，Basel，1986；andLivingstone and Fathman，Ann.Rev.Immunol.，5，477，(1987))。
CTL表位方便地衍生自病毒、原核生物或真核生物的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白的氨基酸序列，包括但不限于衍生自哺乳动物个体或感染所述个体的细菌、真菌、原生动物或寄生虫的CTL表位。CTL表位的Mimotope特别包括在本发明范围内。
当CTL表位被给予哺乳动物时，其能够引起T细胞应答，优选地通过特异于所述表位或衍生所述表位的抗原的CD8+T细胞而引起T细胞应答，更优选地，通过诱导抗衍生所述表位的病原体或肿瘤细胞的细胞介导免疫而引起T细胞应答。
为便于肽合成，优选较短的CTL表位。优选地，CTL表位的长度不超过约30个氨基酸，更优选地，CTL表位序列由约25个氨基酸残基或更少残基组成，更优选地由少于20个氨基酸残基组成，甚至更优选长度约8-12个氨基酸残基。
来自寄生虫的优选的CTL表位是与利什曼原虫病(leishmania)，疟疾，锥虫病(trypanosomiasis)，巴贝虫病(babesiosis)和血吸虫病(schistosomiasis)相关的CTL表位，例如选自如下一组的一种寄生虫的抗原的CTL表位：Plasmodium falciparum；Circumsporozoa；Leishmania donovani；Toxoplasma gondii；Schistosoma mansoni；Schistosomajaponicum；Schistosoma hematobium；andTrypanosoma brucei.
P.falciparum的特别优选的CTL表位衍生自选自如下一组的一种抗原：环子孢子蛋白(CSP)，子孢子表面蛋白2(PfSSP2)，肝阶段蛋白1(LSA1)，裂殖子表面蛋白1(MSP1)，丝氨酸重复抗原(SERA)，和AMA-1抗原(Amante，et al.J.Immunol.159，5535-5544，1997；.Chaba et al.Int.J.Immunopharm.20，259-273，1998；Shi et al.，Proc.Natl Acad.Sci(USA)96，1615-1620，1999；Wang et al.Science 282，476-479，1998；and Zevering et al.Immunol.94，445-454，1998)。L.donovani的特别优选的CTL表位衍生自重复肽(Liew et al.，J.Exp.Med.172，1359(1990))。T.gondii的特别优选的CTL表位衍生自P30表面蛋白(Darcy et al.，J.Immunol.149，3636(1992))。S.mansoni特别优选的CTL表位衍生自Sm-28GST抗原(Wolowxzuk et al.，J.Immunol146：1987(1991))。
优选的病毒特异性CTL表位衍生自轮状病毒(Rotaviruses)、疱疹病毒(Herpes viruses)、冠状病毒(Corona viruses)、小RNA病毒(Picornaviruses)(例如Apthovirus)、呼吸合胞体病毒(Respiratory Synctial virus)、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、痘病毒、牛疱疹病毒I型、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、犬瘟热病毒(FMDV)、麻疹病毒(MV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人巨细胞病毒(HCMV)或肝炎病毒等。
HIV-1的特别优选的CTL表位衍生自env，gag，或pol蛋白。流感病毒的特别优选的CTL表位衍生自核蛋白(Taylor et al.，Immunogenetics 26，267(1989)；Townsend et al.，Nature 348，674(1983))，基质蛋白(Bednarek et al.，J.Immunol.147，4047(1991))或聚合酶蛋白(Jameson et al.，J.Virol.72，8682-8689，1998；andGianfrani et al.，Human Immunol.61，438-452，2000)。淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的特别优选的CTL表位衍生自糖蛋白-1抗原(Zinkernagel et al.Nature 248，701-702，1974)。巨细胞病毒的特别优选的CTL表位衍生自选自如下一组的一种抗原：pp28，pp50，pp65，pp71，pp150，gB，gH，IE-1，IE-2，US2，US3，US6，US11，和UL18(例如，Diamond，USSN 6,074,645，June 13，2000；Longmate et al.，Immunogenet.52，165-173，2000；Wills et al.，J.Virol.70，7569-7579，1996；Solache et al.，J.Immunol.163，5512-5518，1999；Diamond etal.，Blood 90，1751-1767，1997；Kern et al.，Nature Med.4，975-978，1998；Weekes et al.，J.Virol.73，2099-2108，1999；Retière et al.，J.Virol.74，3948-3952，2000；and Salquin et al.，Eur.J.Immunol.30，2531-2539，2000)。麻疹病毒特别优选的CTL表位衍生自融合糖蛋白(MV-F)，特别是来自其残基438-446(Herberts et al.J.Gen Virol.82，2131-2142，2001)。来自Epstein-Barr病毒(EBV)的特别优选的表位衍生自EBV的潜伏核蛋白(EBNA)或潜伏膜蛋白(LMP)，如来自A型EBV的EBNA2A，EBNA3A，EBNA4A或EBNA14a；；来自B型EBV的EBNA 2B，EBNA 3B，EBNA 4B或EBNA 14b；LMP1；或LMP2(国际专利申请PCT/AU95/00140，公开日1995年9月16日；国际专利申请PCT/AU97/00328，公开日1997年11月24日；国际专利申请PCT/AU98/00531，公开日1998年1月10日)。
优选的细菌特异性CTL表位衍生自Pasteurella，Actinobacillus，Haemophilus，Listeria monocytogenes，Mycobacterium tuberculosis，Staphylococcus，Neisseria gonorrhoeae，Helicobacter pylori，Streptococcus pneumoniae，Salmonella enterica，E.coli，Shigella等。
合适的细菌CTL表位包括例如衍生自如下蛋白的CTL表位，所述的蛋白为Mycobacterium tuberculosis 65Kd蛋白(Lamb et al.，EMBOJ.，6，1245(1987))；M.tuberculosis ESAT-6蛋白(Morten et al.，Infect.Immun.66，717-723，1998)；Staphylococcus aureus核酸酶蛋白(Finnegan et al.，J.Exp.Med.164，897(1986))；Escherichia coli热稳定肠毒素(Cardenas et al.，Infect.Immunity 61，4629(1993))；和Escherichia coli耐热肠毒素(Clements et al.，Infect.Immunity 53，685(1986))。
来自哺乳动物个体的优选的CTL表位衍生自肿瘤CTL抗原和/或能够产生抗肿瘤CTL抗原的T细胞应答。肿瘤特异性CTL表位通常是天然或外来CTL表位，其表达与肿瘤的发育、生长、存在或复发相关。只要这种CTL表位可用于区分异常组织和正常组织，它们即可用作治疗性介入的靶。这种CTL表位是本领域熟知的。实际上，有一些例子被充分鉴定，并且目前是引起极大兴趣的产生肿瘤特异性治疗的焦点。肿瘤CTL表位的非限制性例子衍生自癌胚抗原(CEA)，***特异性抗原(PSA)，黑素瘤抗原(MAGE，BAGE，GAGE)，和粘蛋白如MUC-1。
用于给予癌症患者的优选的CTL表位衍生自诱导癌症的蛋白，例如癌蛋白(例如p53，ras等)。
在一个特别优选的实施方案中，CTL表位包含或由选自如下一组的一种氨基酸序列组成：
(i)来自PR8病毒的NP的TYQRTRALV(SEQ ID NO：2)；
(ii)P.falciparum CSP的KPKDELDYENDIEKKICKMEKCS(SEQ ID NO：53)；
(iii)来自P.falciparum CSP的DIEKKICKMEKCSSVFNVVNS(SEQ ID NO：54)；
(iv)来自P.falciparum LSA1的KPIVQYDNF(SEQ ID NO：55)；
(v)来自P.falciparum MSP1的GISYYEKVLAKYKDDLE(SEQ ID NO：56)；
(vi)P.falcparum AMA-1的EFTYMINFGRGQNYWEHPYQKS(SEQ ID NO：57)；
(vii)来自P.falciparum AMA-1的DQPKQYEQHLTDYEKIKEG(SEQ ID NO：58)；
(viii)来自HIV-1env蛋白的NMWQEVGKAM(SEQ ID NO：59)；
(ix)来自HIV-1env蛋白的APTKAKRRVV(SEQ ID NO：60)；
(x)来自HIV-1env蛋白的CTRPNNNTRK(SEQ ID NO：61)；
(xi)来自HIV-1env蛋白的TVYYGVPVWK(SEQ ID NO：62)；
(xii)来自HIV-1env蛋白的RPVVSTQLL(SEQ ID NO：63)；
(xiii)来自HIV-1gag蛋白的SLYNTVATLY(SEQ ID NO：64)；
(xiv)来自HIV-1gag蛋白的ELRSLYNTVA(SEQ ID NO：65)；
(xv)来自HIV-1gag蛋白的KIRLRPGGKK(SEQ ID NO：66)；
(xvi)来自HIV-1gag蛋白的IRLRPGGKKK(SEQ ID NO：67)；
(xvii)来自HIV-1gag蛋白的RLRPGGKKK(SEQ ID NO：68)；
(xviii)来自HIV-1gag蛋白的GPGHKARVLA(SEQ ID NO：69)；
(xix)来自HIV-1pol蛋白的SPIETVPVKL(SEQ ID NO：70)；
(xx)来自HIV-1pol蛋白的ILKEPVHGVY(SEQ ID NO：71)；
(xxi)来自HIV-1pol蛋白的AIFQSSMTK(SEQ ID NO：72)；
(xxii)来自HIV-1pol蛋白的SPAIFQSSMT(SEQ ID NO：73)；
(xxiii)来自HIV-1pol蛋白的QVRDQAEHLK(SEQ ID NO：74)；
(xxiv)来自HIV-1pol蛋白的GPKVKQWPLT(SEQ ID NO：75)；
(xxv)来自流感病毒核蛋白的TYQRTRALV(SEQ ID NO：76)；
(xxvi)来自流感病毒核蛋白的TYQRTRALVRTGMDP(SEQ ID NO：77)；
(xxvii)来自流感病毒核蛋白的IASNENMDAMESSTL(SEQ ID NO：78)；
(xxviii)来自LCMVgp1的KAVYNFATM(SEQ ID NO：79)；
(xxix)来自EBV的QVKWRMTTL(SEQ ID NO：80)；
(xxx)来自EBV的VFSDGRVAC(SEQ ID NO：81)；
(xxxi)来自EBV的VPAPAGPIV(SEQ ID NO：82)；
(xxxii)来自EBV的TYSAGIVQI(SEQ ID NO：83)；
(xxxiii)来自EBV的LLDFVRFMGV(SEQ ID NO：84)；
(xxxiv)来自EBV的QNGALAINTF(SEQ ID NO：85)；
(xxxv)来自EBV的VSSDGRVAC(SEQ ID NO：86)；
(xxxvi)来自EBV的VSSEGRVAC(SEQ ID NO：87)；
(xxxvii)来自EBV的VSSDGRVPC(SEQ ID NO：88)；
(xxxviii)来自EBV的VSSDGLVAC(SEQ ID NO：89)；
(xxxix)来自EBV的VSSDGQVAC(SEQ ID NO：90)；
(xl)来自EBV的VSSDGRWC(SEQ ID NO：91)；
(xli)来自EBV的VPAPPVGPIV(SEQ ID NO：92)；
(xlii)来自EBV的VEITPYEPTG(SEQ ID NO：93)；
(xliii)来自EBV的VEITPYEPTW(SEQ ID NO：94)；
(xliv)来自EBV的VELTPYKPTW(SEQ ID NO：95)；
(xlv)来自EBV的RRIYDLIKL(SEQ ID NO：96)；
(xlvi)来自EBV的RKIYDLIEL(SEQ ID NO：97)；
(xlvii)来自EBV的PYLFWLAGI.(SEQ ID NO：98)；
(xlviii)来自EBV的TSLYNLRRGTALA(SEQ ID NO：99)；
(xlix)来自EBV的DTPLIPLTIF(SEQ ID NO：100)；
(l)来自EBV的TVFYNIPPMPL(SEQ ID NO：101)；
(li)来自EBV的VEITPYKPTW(SEQ ID NO：102)；
(lii)来自EBV的VSFIEFVGW(SEQ ID NO：103)；
(liii)来自EBV的FRKAQIQGL(SEQ ID NO：104)；
(liv)来自EBV的FLRGRAYGL(SEQ ID NO：105)；
(lv)来自EBV的QAKWRLQTL(SEQ ID NO：106)；
(lvi)来自EBV的SVRDRLARL(SEQ ID NO：107)；
(lvii)来自EBV的YPLHEQHGM(SEQ ID NO：108)；
(lviii)来自EBV的HLAAQGMAY(SEQ ID NO：109)；
(lix)来自EBV的RPPIFIRRL(SEQ ID NO：110)；
(lx)来自EBV的RLRAEAGVK(SEQ ID NO：111)；
(lxi)来自EBV的IVTDFSVIK(SEQ ID NO：112)；
(lxii)来自EBV的AVFDRKSDAK(SEQ ID NO：113)；
(lxiii)来自EBV的NPTQAPVIQLVHAVY(SEQ ID NO：114)；
(lxiv)来自EBV的LPGPQVTAVLLHEES(SEQ ID NO：115)；
(lxv)来自EBV的DEPASTEPVHDQLL(SEQ ID NO：116)；
(lxvi)来自EBV的RYSIFFDY(SEQ ID NO：117)；
(lxvii)来自EBV的AVLLHEESM(SEQ ID NO：118)；
(lxviii)来自EBV的RRARSLSAERY(SEQ ID NO：119)；
(lxix)来自EBV的EENLLDFVRF(SEQ ID NO：120)；
(lxx)来自EBV的KEHVIQNAF(SEQ ID NO：121)；
(lxxi)来自EBV的RRIYDLIEL(SEQ ID NO：122)；
(lxxii)来自EBV的QPRAPIRPI(SEQ ID NO：123)；
(lxxiii)来自EBV的EGGVGWRHW(SEQ ID NO：124)；
(lxxiv)来自EBV的CLGGLLTMV(SEQ ID NO：125)；
(lxxv)来自EBV的RRRWRRLTV(SEQ ID NO：126)；
(lxxvi)来自EBV的RAKFKQLL(SEQ ID NO：127)；
(lxxvii)来自EBV的RKCCRAKFKQLLQHYR.(SEQ ID NO：128)；
(lxxviii)来自EBV的YLLEMLWRL(SEQ ID NO：129)；
(lxxix)来自EBV的YFLEILWGL(SEQ ID NO：130)；
(lxxx)来自EBV的YLLEILWRL(SEQ ID NO：131)；
(lxxxi)来自EBV的YLQQNWWTL(SEQ ID NO：132)；
(lxxxii)来自EBV的LLLALLFWL(SEQ ID NO：133)；
(lxxxiii)来自EBV的LLVDLLWLL(SEQ ID NO：134)；
(lxxxiv)来自EBV的LLLIALWNL(SEQ ID NO：135)；
(lxxxv)来自EBV的WLLLFLAIL(SEQ ID NO：136)；
(lxxxvi)来自EBV的TLLVDLLWL(SEQ ID NO：137)；
(lxxxvii)来自EBV的LLWLLLFLA(SEQ ID NO：138)；
(lxxxviii)来自EBV的ILLIIALYL(SEQ ID NO：139)；
(lxxxix)来自EBV的VLFIFGCLL(SEQ ID NO：140)；
(xc)来自EBV的RLGATIWQL(SEQ ID NO：141)；
(xci)来自EBV的ILYFIAFAL(SEQ ID NO：142)；
(xcii)来自EBV的SLVIVTTFV(SEQ ID NO：143)；
(xciii)来自EBV的LMIIPLINV(SEQ ID NO：144)；
(xciv)来自EBV的TLFIGSHVV(SEQ ID NO：145)；
(xcv)来自EBV的LIPETVPYI(SEQ ID NO：146)；
(xcvi)来自EBV的VLQWASLAV(SEQ ID NO：147)；
(xcvii)来自EBV的QLTPHTKAV(SEQ ID NO：148)；
(xcviii)来自HCMV pp65的SVLGPISGHVLK(SEQ ID NO：149)；
(xcix)来自HCMV pp65的FTSQYRIQGKL(SEQ ID NO：150)；
(c)来自HCMV pp65的FVFPTKDVALR(SEQ ID NO：151)；
(ci)来自HCMV pp65的FPTKDVAL(SEQ ID NO：152)；
(cii)来自HCMV pp65的NLVPMVATV(SEQ ID NO：153)；
(ciii)来自HCMV pp65的MLNIPSINV(SEQ ID NO：154)；
(civ)来自HCMV pp65的RIFAELEGV(SEQ ID NO：155)；
(cv)来自HCMV pp65的TPRVTGGGGAM(SEQ ID NO：156)；
(cvi)来自HCMV pp65的RPHERNGFTVL(SEQ ID NO：157)；
(cvii)来自HCMV pp65的RLLQTGIHV(SEQ ID NO：158)；
(cviii)来自HCMV pp65的VIGDQYVKV(SEQ ID NO：159)；
(cix)来自HCMV pp65的ALFFFDIDL(SEQ ID NO：160)；
(cx)来自HCMV pp65的YSEHPTFTSQY(SEQ ID NO：161)；
(cxi)来自HCMV pp65的VLCPKNMII(SEQ ID NO：162)；
(cxii)来自HCMV pp65的DIYRIFAEL(SEQ ID NO：163)；
(cxiii)来自HCMV pp65的ILARNLVPMV(SEQ ID NO：164)；
(cxiv)来自HCMV pp65的EFFWDANDIY(SEQ ID NO：165)；
(cxv)来自HCMV pp65的IPSINVHHY)(SEQ ID NO：166)；
(cxvi)来自HCMV IE-1的YILEETSVM(SEQ ID NO：167)；
(cxvii)来自HCMV IE-1的CVETMCNEY(SEQ ID NO：168)；
(cxviii)来自HCMV IE-1的RRIEEICMK(SEQ ID NO：169)；
(cxix)来自HCMV pp150的TTVYPPSSTAK(SEQ ID NO：170)；
(cxx)来自麻疹病毒融合糖蛋白的RRYPDAVYL(SEQ ID NO：171)；
(cxxi)来自Listeria monocytogenes的GYKDGNEYI(SEQ ID NO：172)；
(cxxii)SIINFEKL from ovalbumin(SEQ ID NO：173)；和
(cxxiii)来自丙型肝炎病毒核心蛋白的DLMGYIPLV(SEQ ID NO：176)。
从前述描述可以明显看出本发明脂肽的多肽部分方便地作为单氨基酸链合成，因而无需合成后修饰来掺入两个表位。如本文所示，优选的是包含选自如下一组的一个氨基酸序列的多肽部分：
(i)ALNNRFQIKGVELKSTYQRTRALV(SEQ ID NO：3)；
(ii)ALNNRFQIKGVELKSKTYQRTRALV(SEQ ID NO：4)；
(iii)KLIPNASLIENCTKAELKTYQRTRALV(SEQ ID NO：5)；
(iv)KLIPNASLIENCTKAELKNLVPMVATV(SEQ ID NO：6)；
(v)AELGEYEKLLNSVLEPIKNLVPMVATV(SEQ ID NO：7)；
(vi)TAAQITAGIALHQSNLNKNLVPMVATV(SEQ ID NO：8)；
(vii)PRYIATNGYLISNFDESKNLVPMVATV(SEQ ID NO：9)；
(viii)KLIPNASLIENCTKAELKYLLEMLWRL(SEQ ID NO：10)；
(ix)AELGEYEKLLNSVLEPIKYLLEMLWRL(SEQ ID NO：11)；
(x)TAAQITAGIALHQSNLNKYLLEMLWRL(SEQ ID NO：12)；
(xi)PRYIATNGYLISNFDESKYLLEMLWRL(SEQ ID NO：13)；
(xii)KLIPNASLIENCTKAELKSIINFEKL(SEQ ID NO：174)；
(xiii)KLIPNASLIENCTKAELKGYKDGNEYI(SEQ ID NO：175)and
(xiv)KLIPNASLIENCTKAELKDLMGYIPLV(SEQ ID NO：177).
为命名目的，SEQ ID No：3-4涉及包含来自流感病毒血凝素轻链的辅助T细胞表位(即SEQ ID NO：1)和来自流感病毒毒株PR8的核蛋白的免疫显性H-2d-限制性CTL表位(即SEQ ID NO：2)的合成肽，其中在其ε氨基基团提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体表示。在SEQ ID No：4中，在辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：4中的K16)。
SEQ ID No：5涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：20)和来自流感病毒毒株PR8的免疫显性H-2d-限制性CTL表位(即SEQ ID NO：2)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：5中的K18)。
SEQ ID No：6涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：20)和来自人巨细胞病毒的免疫显性pp65抗原(即HCMVpp65抗原)的免疫显性HLAA2-限制性CTL表位(即SEQ ID NO：153)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：6中的K18)。
SEQ ID No：7涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：22)和来自HCMVpp65抗原的免疫显性HLAA2-限制性CTL表位(即SEQ ID NO：153)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：7中的K18)。
SEQ ID No：8涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：16)和来自HCMVpp65抗原的免疫显性HLAA2-限制性CTL表位(即SEQ ID NO：153)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：8中的K18)。
SEQ ID No：9涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：40)和来自HCMV pp65抗原的免疫显性HLA A2-限制性CTL表位(即SEQ ID NO：153)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：9中的K18)。
SEQ ID No：10涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：20)和来自Epstein-Barr病毒LMP1抗原的免疫显性HLA A2-限制性CTL表位(即EBV LMP1；SEQ ID NO：129)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：10中的K18)。
SEQ ID No：11涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：22)和来自EBV LMP1的免疫显性HLA A2-限制性CTL表位(即；SEQ ID NO：129)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：11中的K18)。
SEQ ID No：12涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：16)和来自EBV LMP1的免疫显性HLA A2-限制性CTL表位(即；SEQ ID NO：129)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：12中的K18)。
SEQ ID No：13涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：40)和来自EBV LMP1的免疫显性HLA A2-限制性CTL表位(即；SEQ ID NO：129)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。在这个肽中，辅助T细胞表位和CTL表位之间有一额外内部赖氨酸残基(SEQ ID NO：13中的K18)。
SEQ ID No：174涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：20)和来自卵清蛋白的免疫显性CTL表位(即；SEQ ID NO：173)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供可能的脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。优选地，脂质经SEQ ID NO：174中的K18附着，其是***在辅助T细胞表位和CTL表位之间的一额外内部赖氨酸残基。
SEQ ID No：175涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：20)和来自Listeriamonocytogenes抗原的免疫显性CTL表位(即；SEQ ID NO：172)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供可能的脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。优选地，脂质经SEQ ID NO：175中的K18附着，其是***在辅助T细胞表位和CTL表位之间的一额外内部赖氨酸残基。
SEQ ID No：177涉及包含来自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟热病毒的辅助T细胞表位(CDV-F；SEQ ID NO：20)和来自丙型肝炎核心蛋白的免疫显性CTL表位(SEQ ID NO：176)的合成肽，其中在其ε氨基基团位点提供可能的脂质附着位点的内部赖氨酸残基以粗体示出。优选地，脂质经SEQ ID NO：177中的K18附着。
本领域技术人员能够容易地合成除了本文举例示出的之外的另外的多肽部分以用于本发明脂肽，这通过将SEQ ID No：3-13，174，175或177中的任一辅助T细胞表位和/或CTL表位用另一种辅助T细胞表位或CTL表，如SEQ ID No：14-52任一所示的一种辅助T细胞表位或SEQ ID No：53-173或176任一所示的CTL表位取代而实现。另外，本领域技术人员从说明书的描述中，根据所寻求的免疫应答针对的靶物种和CTL表位，可以很容易地选择合适的辅助T细胞表位和CTL组合。
包括SEQ ID No：3-13，174，175和177所示的举例多肽在内的本文描述的多肽部分的氨基酸序列可以根据本领域技术人员熟知的方法为特定目的进行修饰而不负面影响它们的免疫功能。例如，特定的肽残基可以被衍生化或化学修饰以增强免疫应答或允许肽与其它物质特别是脂质偶联。还可以在不干扰肽的整体结构或CTL免疫原性的情况下改变肽中的特定氨基酸。这种改变因此被称为“保守”变化，并似乎依赖于残基的亲水性或极性。侧链大小和/或变好也是确定何种取代是保守取代的相关因素。
本领域技术人员很清楚，生物学等价蛋白或肽这一定义中固有的是可在分子的规定部分进行改变的数目是受限的，以及仍能产生具有可接受水平的等价生物活性。生物学功能等价肽因此被定义为其中的特异氨基酸可被改变的肽。特别的实施方案包括在肽的氨基酸序列中有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变异的变体。当然，根据本发明可以容易地制备和使用具有不同取代的一系列不同蛋白质/肽。
本领域技术人员很明白下述取代是可允许的保守取代：(i)涉及精氨酸，赖氨酸和组氨酸的取代；(ii)涉及丙氨酸，甘氨酸和丝氨酸的取代；和(iii)涉及苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸的取代。掺入了这类保守取代的肽在本文中定义为生物学功能等价物。
本领域通常已知亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质的相互作用性生物学功能方面的重要性(Kyte & Doolittle，J.Mol.Biol.157，105-132，1982)。已知某些氨基酸可以被具有相似亲水性指数或分值的其它氨基酸取代并且仍保持相似的生物学活性。氨基酸的亲水性指数也可以在确定产生功能等价分子的保守取代中加以考虑。基于其疏水性和电荷特征赋予了每一氨基酸的亲水性指数，如下所示：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在基于亲水性指数进行变化时，优选的是进行亲水性指数在+/-0.2之间的氨基酸取代。更优选地，取代涉及亲水性指数在+/-0.1、更优选在约+/-0.05内的氨基酸。
本领域还能理解的是，基于亲水性、特别是由此产生的生物学功能等价蛋白质或肽用于如本文所示免疫学实施方案的哪一部分而有效进行类似氨基酸的取代(例如US Patent No.4,554,101)。如US Patent No.4,554,101所述，给氨基酸残基赋予了下述亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+/-0.1)；谷氨酸(+3.0+/-0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+/-0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行变化时，优选的是取代相互亲水性值在约+/-0.2内、更优选在约+/-0.1、甚至更优选在约+/-0.05内的氨基酸。
鉴别了适用作免疫原的肽之后，还能理解的是其它空间相似化合物也可配制在一起以模拟肽结构的关键部分。这种化合物可称为肽模拟物，可以如本发明肽相同方式进行应用，因此也是功能等价物。产生结构功能等价物可以通过本领域技术人员已知的建模和化学设计技术来实现。应理解的是所有这种空间相似构建体均落入本发明范围内。
确定修饰肽的“等价性”的另一种方法涉及功能途径。例如，合适的变体肽包含如用确定MHC I类结合表位的预测算法所测定的那样以显著水平与MHC I类等位基因相互作用的氨基酸序列，所述算法如德国Tuebingen大学的SYFPEITHI算法，或美国政府国立卫生研究院的生物信息学和分子分析部门(BIMAS)的HLA肽结合预测程序的算法。这类变体序列也与APC(例如在PBMC部分中或血清的淡黄层部分中)表面上的MHC I类分子结合和/或稳定该分子，和/或诱导记忆CTL应答或引起IFN-K生成，和/或在标准细胞毒性分析中刺激CTL活性。本领域技术人员能容易地完成这类功能的测定。
脂肽的多肽部分能用标准技术容易地合成，如Merrifield合成方法(Merrifield，J Am Chem Soc，85，：2149-2154，1963)和该技术的各种改进(参见例如Synthetic Peptides：A U ser′s Guide，Grant，ed.(1992)W.H.Freeman & Co.，New York，pp.382；Jones(1994)The ChemicalSynthesis of Peptides，Clarendon Press，Oxford，pp.230.)；Barany，G.and Merrifield，R.B.(1979)in The Peptides(Gross，E.and Meienhofer，J.eds.)，vol.2，pp.1-284，Academic Press，New York；Wünsch，E.，ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Methoden derOrganischen Chemie(Müler，E.，ed.)，vol.15，4th edn.，Parts 1and 2，Thieme，Stuttgart；Bodanszky，M.(1984)Principles of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.& Bodanszky，A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.(1985)lnt.J.Peptide Protein Res.25，449-474。
脂质部分可包含任何C2-C30饱和的、单不饱和的或多不饱和的线性或支链脂酰基团，优选的是选自棕榈酰，肉豆蔻酰，硬脂酰，月桂酰，辛酰和癸酰的脂肪酸基团。脂氨基酸是本发明特别优选的脂质部分。本文所用术语“脂氨基酸”是指包含一个或两个或三个或更多个与氨基酸残基如半胱氨酸或丝氨酸、赖氨酸或其类似物共价附着的脂质的分子。在一个特别优选的实施方案中，脂氨基酸包含半胱氨酸和任选地一个或两个或更多个丝氨酸残基。
脂质部分的结构对于所产生的脂肽的活性不是关键的，并且如本文所示，可以使用棕榈酸和/或胆固醇和/或Pam1Cys和/或Pam2Cys和/或Pam3Cys。本发明清楚地包括用于脂肽中的其它脂质部分，如月桂酸、硬脂酸或辛酸，而不丧失免疫原性。因此，除非特别指明或者上下文需要，否则本发明不受脂质部分结构的限制。
类似地，除非特别指明或者上下文需要，否则本发明不限于单个脂质部分。很明显包括多个脂质部分添加至肽部分，例如添加至辅助T细胞表位内的一个位置和辅助T细胞表位和B细胞表位之间的一个位置。
脂质部分优选地是具有通式(VII)的化合物：
Figure S03824145519960326D000401
其中：
(i)X选自硫、氧、二硫键(-S-S-)、亚甲基、和氨基(-NH-)；
(ii)m是值为1或2的整数；
(iii)n是从0到5的一个整数；
(iv)R1选自氢、羰基(-CO-)和R’-CO-，其中R’选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的链烯基和具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、链烯基或炔基任选地由一个羟基、氨基、氧代、酰基或环烷基基团取代；
(v)R2选自R’-CO-O-，R’-O-，R’-O-CO-，R’-NH-CO-，和R’-CO-NH-，其中R’选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的链烯基和具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、链烯基或炔基任选地由一个羟基、氨基、氧代、酰基或环烷基基团取代；和
(vi)R3选自R’-CO-O-，R’-O-，R’-O-CO-，R’-NH-CO-，和R’-CO-NH-，其中R’选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的链烯基、具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、链烯基或炔基任选地由一个羟基、氨基、氧代、酰基或环烷基基团取代以及其中R1，R2和R3各自相同或不同。
根据取代基，通式V的脂质部分可以是手性分子，其中直接或间接共价结合于R1和R2的碳原子成不对称右旋或左旋(即R或S)构型。
优选地，X是硫；m和n均是1；R1选自氢和R’-CO-，其中R’是具有7-25个碳原子的烷基；R2和R3选自R’-CO-O-，R’-O-，R’-O-CO-，R’-NH-CO-，和R’-CO-NH-，其中R’是具有7-25个碳原子的烷基。
优选地，R’选自如下一组：棕榈酰，肉豆蔻酰，硬脂酰和癸酰。更优选地，R’是棕榈酰。
所述脂质部分中的每个整数可以相同或不同。
在一个特别优选的实施方案中，X是硫；m和n均是1；R1是氢或R’-CO-，其中R’是棕榈酰；R2和R3各自是R’-CO-O-，其中R’是棕榈酰。这些特别优选的化合物如上述式(I)和式(II)所示。
脂质部分也可以具有下述通式(VIII)：
Figure S03824145519960326D000411
其中：
(i)R4选自如下一组：(i)一种由约7至约25个碳原子组成的α酰基脂肪酸残基；(ii)一种α-烷基-β-羟基脂肪酸残基；(iii)一种α-烷基-β-羟基脂肪酸残基的β-羟基酯，其中所述酯基优选地是包含多于8个碳原子的直连或支链；以及(iv)一种脂氨基酸残基；和
(ii)R5是氢或一种氨基酸残基的侧链。
优选地，R4由约10到约20个碳原子组成，更优选地由约14到约18个碳原子组成。
任选地，当R4是一个脂氨基酸残基时，R4和R5的侧链可以形成共价键。例如，当R4包含选自由赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸衍生物、鸟氨酸衍生物、谷氨酸衍生物、天冬氨酸衍生物组成的一组的一个氨基酸时，该氨基酸或衍生物的侧链通过酰胺或脂键附着于R5。
优选地，通式VIII中的结构是选自如下一组的一种脂质部分：N，N′-二酰基赖氨酸；N，N′-二酰基鸟氨酸；谷氨酸的二(单烷基)酰胺或酯；天冬氨酸的二(单烷基)酰胺或酯；丝氨酸、高丝氨酸或苏氨酸的N，O-二酰基衍生物和半胱氨酸或高半胱氨酸的N，S-二酰基衍生物。
两亲性分子，特别是疏水性不超过Pam3Cys(式(I))的疏水性的两亲性分子也是优选的。
式(I)、式(II)、式(VI)或式(VIII)的脂质部分在合成过程中或合成后通过添加一或多个间隔分子、优选地包含碳的间隔分子、更优选地一或多个氨基酸残基而进一步修饰。这些分子在常规缩合、添加、取代或氧化反应中经末端羧基添加至脂质结构。这类间隔分子的作用是分隔脂质部分和多肽部分以及增加脂肽产物的免疫原性。
丝氨酸二聚体、三聚体、四聚体等特别优选用于此目的。
优选地，这种间隔物包括末端保护的氨基酸残基以便于稍后将修饰的脂氨基酸与多肽缀合。
根据这一实施方案产生的修饰脂氨基酸的例子如式(III)和式(IV)所示，它们容易地通过添加一个丝氨酸同二聚体而分别衍生自式(I)和式(II)。如本文所示，式(I)的Pam3Cys或式(II)的Pam2Cys方便地作为用于此目的的式(III)的脂氨基酸Pam3Cys-Ser-Ser或式(IV)的脂氨基酸Pam2Cys-Ser-Ser而合成。
式(III)：
Figure S03824145519960326D000431
式(IV)：
作为添加一间隔物至脂质部分的替代方案，间隔物可以被添加至多肽部分中的内部赖氨酸残基的ε氨基基团或赖氨酸类似物的末端侧链基团，间隔物作为短肽如丝氨酸同二聚体、同三聚体、同四聚体等而添加，或者通过依次添加氨基酸残基由此产生分支的多肽链。这一途径利用了内部赖氨酸或赖氨酸类似物上的末端侧链基团的修饰性质而实现间隔物特异性添加。很明显，为了避免依次添加间隔物，间隔物的末端氨基酸残基应优选地被保护，从而脱保护作用可便于脂质部分缀合至分支多肽。
或者，间隔物可以通过常规亲核取代反应被添加至多肽的未修饰的ε氨基基团。但是，如果多肽具有包含单个内部赖氨酸残基的氨基酸序列和封闭的N-末端，则优选采用这一途径。
脂质部分通过常规合成手段而制备，这些常规合成手段例如为美国专利5,700,910和6,024,964所述的方法，或者，如Wiesmuller et al.，Hoppe Seylers Zur Physiol.Chem.364，593(1983)，Zeng et al.，J.Pept.Sci 2，66(1996)，Jones et al.，Xenobiotica5，155(1975)，或Metzger et al.，Int.J.Pept.Protein Res.38，545(1991)所述的方法。本领域技术人员能够很容易地修改这些方法以实现用于缀合至多肽的期望脂质的合成。
不同脂质的组合也可用于本发明脂肽中。例如，含有一个或两个肉豆蔻酰的脂质或脂氨基酸经内部赖氨酸或赖氨酸类似物残基附着于多肽部分，其任选地通过一个间隔物与多肽分隔，并且有一个或两个含棕榈酰脂质或脂氨基酸分子附着于羧基末端赖氨酸残基。其它的组合没有被排除在外。
本发明的脂肽可为了诊断目的而容易地加以修饰。例如，通过添加天然或合成半抗原、抗生素、激素、类固醇、核苷、核苷酸、核酸、酶、酶底物、酶抑制剂、生物素、抗生物素蛋白、聚乙二醇、肽性多肽部分(例如tuftsin，聚赖氨酸)、荧光标记(例如FITC、RITC、丹磺酰、鲁米诺或香豆素)、生物发光标记、自旋标记、生物碱、生物胺、维生素、毒素(例如地高辛、鬼笔环肽、鹅膏毒环肽、河豚毒素)或复合物形成剂而进行修饰。
如本文所示，提供了能够诱导CTL应答的高免疫原性脂肽，所述脂肽包含经位于CD4+辅助T细胞表位和CD8+CTL表位之间的赖氨酸残基的ε氨基基团缀合的式(I)的Pam3Cys或式(II)的Pam2Cys。
脂肽的制备
本发明的第二方面提供了生产脂肽的方法，包括：
(i)产生一种多肽，该多肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；和
(b)一或多个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基；以及
(ii)将所述一或多个脂质部分的每一个直接或间接共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团或所述一或多个内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团上，以产生具有附着于所述内部赖氨酸残基的ε氨基基团的脂质部分或具有附着于所述内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团的脂质部分的脂肽。
优选地，所述方法进一步包括产生脂质部分。
本文所引述的常规化学合成是产生多肽部分和脂质部分的优选手段。
优选地，内部赖氨酸或赖氨酸类似物通过从末端侧链基团选择性除去封闭基团(例如Mtt)而使得在该位置可以添加一个氨基酸残基、间隔物或脂质部分，包括脂氨基酸。
为了将脂质附着于多肽，方便的是以肽合成领域已知的方式保护多肽的官能团，以保证在这些基团不以显著的反应速率发生不希望的反应。
通过已知的偶联方法，多肽在固相或可溶载体上如聚合物(例如Merrifield树脂)合成，并且被制备成可供与间隔物、氨基酸或脂质缀合。例如，赖氨酸或赖氨酸类似物的末端侧链基团(例如内部赖氨酸的ε氨基基团)被许多保护基中的一种加以保护。使用封闭基团(也称为保护基或掩蔽基团)保护具有参与偶联反应的活化羧基的氨基酸的氨基，或者保护具有参与偶联反应的酰化氨基的氨基酸的羧基。为了发生偶联，封闭基团必须被除去而不破坏肽键或附着于肽的另一部分的任何保护基。
为进行固相肽合成，在除去生长的肽链的氨基封闭基团和重复氨基酸偶联所需的重复处理下稳定的封闭基团用于保护氨基酸侧链。另外，保护肽的C-末端的肽-树脂固定必须在整个合成过程中被保护，直至需要从树脂上裂解下来。因此，通过小心选择正交保护的α-氨基酸，在生长的肽仍附着在树脂上时将脂质和/或氨基酸加入到生长的肽的所需位置。
优选的氨基封闭基团是可容易除去的，但足够稳定从而在偶联反应和其它操作如修饰侧链基团的条件下能够保持。优选的氨基酸封闭基团选自如下一组：(i)苄氧基羰基基团(Z或羧苯氧基)，其可以容易地通过在室温和常压下催化氢化或者用液氨中的钠和乙酸中的氢溴酸而除去；(ii)叔丁氧羰基基团(Boc)，其用叔丁氧羰基叠氮或二叔丁基二碳酸酯导入，并用温和酸如三氟乙酸(50％TFA于二氯甲烷中)或在乙酸/二噁烷/乙酸乙酯中的HCl除去；(iii)9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，其在温和碱性、非水解条件下如用伯胺或仲胺(例如20％哌啶于二甲基甲酰胺中)裂解；(iv)2-(4-联苯基)丙基(2)氧基羰基基团(Bpoc)；(v)2-硝基苯基亚磺酰(sulfenyl)(Nps)；和(vi)dithia-succionyl基团(Dts)。
侧链保护基将根据形成正在合成的肽的氨基酸从功能侧链而变化。侧链保护基通常基于Bzl基团或tBu基团。侧链中具有醇或羧酸的氨基酸作为Bzl醚、Bzl酯、cHex酯、tBu醚或tBu酯被保护。Fmoc氨基酸的侧链保护需要理想地为碱稳定和耐弱酸(TFA)的封闭基团。例如，赖氨酸的ε氨基基团用Mtt保护(例如Fmoc-赖氨酸(Mtt)-OH)。或者，如果需要增加的稳定性，则卤化苄基衍生物如CIZ用于保护赖氨酸侧链。胱氨酸的硫醇基团、组氨酸的咪唑或精氨酸的胍基通常需要特殊的保护。用于肽合成的许多不同保护基已有描述(参见The Peptides，Gross et al.eds.，Vol.3，Academic Press，New York，1981)。
两个最广泛应用的保护策略是Boc/Bzl和Fmoc/tBu策略。在Boc/Bzl中，Boc用于氨基酸保护，各种氨基酸的侧链使用基于Bzl或cHex的保护基进行保护。Boc在催化氢化条件下是稳定的，因而与Z基团正交使用以保护许多侧链基团。在F moc/tBu中，Fmoc用于氨基保护，侧链用基于tBu的保护基进行保护。
肽通过本发明熟知方法脂化。标准的缩合、添加、取代或氧化(例如在赖氨酸或赖氨酸类似物的末端氨基基团与要加入的氨基酸或肽或脂氨基酸之间形成内部二硫键或酰胺键)反应使脂质添加到多肽上。
在一替代方案，用作免疫原的本发明的肽通过化学选择性连接或活性缀合或肟化学产生。这些方法是本领域熟知的，能够使个体肽组分通过化学或重组方法产生，随后以合适的构型或构象或次序化学选择性连接(例如Nardin et al.，Vaccine 16，590(1998)；Nardin et al.，J Immunol.166，481(2001)；Rose et al.，Mol.Immunol.32，1031(1995)；Rose etal.，Bioconjug.Chem 7，552(1996)；和Zeng et al.，Vaccine18，1031(2000)，这些文献以其全文并入作参考)。
脂肽配制品
脂肽可以方便地配制在药物学可接受的赋形剂或稀释剂中，如水性溶剂、非水溶剂、无毒赋形剂如盐、防腐剂、缓冲剂等。非水溶剂的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性溶剂包括水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外载体如氯化钠、Ringer′s葡聚糖等。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。药物组合物各种组分的pH和精确浓度根据本领域常识进行调整。
尽管通常是不需要的，但是本发明也包含添加外源佐剂至脂肽配制品中。这种外源佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物如细胞因子、毒素或合成组合物。佐剂的例子包括IL-1，IL-2，BCG，氢氧化铝，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称作nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP)1983A，称作MTP-PE)，脂质A，MPL和RI BI，其含有在2％鲨烯/Tween80乳液中的提取自细菌的三种成分，即单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
希望的是共同给予生物应答修饰剂(BRM)和脂肽，以负调节抑制T细胞活性。BRM的例子包括但不限于Cimetidine(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA，USA)；Indomethacin(IND；150mg/d)(Lederle，NJ，USA)；或小剂量环磷酰胺(CYP；75，150或300mg/m.sup.2)(Johnson/Mead，NJ，USA)。
脂肽在免疫接种中的应用
本发明的新脂肽在一些关键方面与已知的CTL表位的脂肽缀合物不同，这表现在脂质部分通过一内部赖氨酸或赖氨酸类似物残基的末端侧链基团进行缀合，由此无需给予额外佐剂即可增强T细胞应答。因此，本发明脂肽的一个特别用途是下述领域：体内或离体(ex vivo)刺激T细胞应答、合成疫苗制备物、采用T细胞的诊断方法以及兽医和人类的免疫治疗。
更特别地，本发明的脂肽当给予动物个体时能增强抗CTL表位部分的CTL记忆应答，且无需佐剂来实现相似水平的CTL激活。另外，在给予疫苗后还观察到树突细胞成熟增加和其它生物学作用，包括产生IFN-γ的CD8+细胞的诱导以及病毒、细菌和肿瘤细胞清除。
因此，本发明的另一方面提供了在个体中增强抗CTL表位所来源的生物的细胞介导免疫的方法，包括在足以激活所述个体的CTL和/或CTL前体和条件下给予本发明的脂肽或所述脂肽的衍生物或功能等价变体或包含所述脂肽或变体或衍生物的疫苗组合物一段时间。
“CTL前体”是指原初T细胞(即在其表面表达一或多种T细胞受体并能增殖和分化成记忆T细胞或效应T细胞的T细胞)。
优选地，脂肽或疫苗预防性给予未携带寄生虫、细菌或病毒所致潜伏或活动感染的个体或者患癌个体，或者治疗性给予携带寄生虫、细菌或病毒所致潜伏或活动感染的个体或者患癌个体。
在本文中，术语“激活”是指T细胞识别和溶解携带衍生CTL表位的抗原的细胞的能力被增强，或者T细胞识别所述抗原的T细胞表位的能力被增强，这种增强可以是瞬时的或持续的。术语“激活”也包括在寄生虫或细菌或病毒激活潜伏感染后、或在用寄生虫或细菌或病毒再感染后、或在用本发明脂肽或组合物免疫接种先前被感染过的个体后，对T细胞群的再激活。
本领域技术人员能认识到最佳T细胞激活需要T细胞受体(TcR)对抗原/MHC的关连识别，以及涉及将T细胞上的各种细胞表面分子与抗原呈递细胞(APC)上的细胞表面分子连接起来的共刺激。共刺激作用CD28/B7，CD40L/CD40和OX40/OX40L对于T细胞激活是优选的，但不是必需的。也可进行其它共刺激途径。
为了测定CTL或前体CTL的激活或表位特异性活性水平，可以使用分析样本中CD8+T细胞数的标准方法。优选的分析方法包括细胞毒性分析，如标准铬释放分析、IFN-γ生成分析如ELISPOT分析。这些分析方法在所附实施例中有详细描述。
MHC I类四聚体分子也可以用于特别是CD8+T细胞的CTL表位特异性定量(AItman et al.，Science 274，94-96，1996；Ogg et al.，CurrOpinImmunol.10，393-396，1998)。为产生四聚体，MHC分子例如HLA A2重链的羧基末端与一种特异性肽表位或多表位结合，并对其处理以便形成结合有合适的报道分子的四聚体复合物，所述合适的报道分子优选为一种荧光染料如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白、藻蓝蛋白或别藻蓝蛋白。四聚体形成例如通过产生作为生物素化分子的MHC-肽融合蛋白然后将生物素化MHC-肽与已用荧光团标记的去糖基化抗生物素蛋白以摩尔比4∶1混合而实现。所产生的四聚体与来自一个体的一亚类CD8+T细胞(例如在全血或PBMC样品中)上的独特类别的CD8+T细胞受体(TcR)结合，所述个体为所述肽HLA限制性的个体。对于体外T细胞激活或扩充没有限制。在结合并洗涤T细胞以除去未结合的或非特异性结合的四聚体之后，特异性与HLA-肽四聚体结合的CD8+细胞数可以容易地通过标准流式细胞计数方法定量，例如使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)。四聚体也可以附着于顺磁性或磁性珠以促进除去非特异性结合的报道分子以及促进细胞分选。这类颗粒可从商业来源获得(例如Beckman Coulter，Inc.，San Diego，CA，USA)。四聚体染色不杀死标记的细胞，因此保持了细胞的完整性以用于进一步分析。MHC四聚体使得能实现对特异性细胞免疫应答的精确定量分析，即使对于发生率小于1％ CD8+T细胞的极端罕见事件也能实现精确定量分析(Bodinier et al.，Nature Med.6，707-710，2000；Ogg et al.，Curr Opin Immunol.10，393-396，1998)。
样品中CD8+细胞的总数也可以容易地通过将样品与缀合有与检测四聚体所用不同的报道分子的抗CD8单克隆抗体保温而测定。这类抗体是可容易获得的(例如Becton Dickinson)。来自所用两个报道分子的信号的相对强度使得可以定量CD8+细胞的总数和四聚体结合T细胞的总数，以及确定与四聚体结合的总T细胞的比例。
由于CD4+辅助T细胞在CMI中作为细胞因子如IL-2的生产者从而促进CD8+T细胞的扩充或者与APC相互作用以使其更易激活CD8+T细胞，因此细胞因子生成是T细胞激活的一个间接测量指标。因此，也可以用细胞因子分析来确定人类个体中CTL或前体CTL的激活或者细胞介导免疫的水平。在这种分析中，检测细胞因子如IL-2或细胞因子的生成作为表位特异性活性T细胞的指示。
优选地，用于确定细胞因子水平或细胞因子生成的细胞因子分析形式基本上如Petrovsky and Harrison，J.Immunol.Methods186，37-46，1995所述，该分析文献引入本文作参考。
优选地，细胞因子分析在全血或PBMC或淡黄层上进行。
优选地，脂肽或衍生物或变体或疫苗组合物在足以引起或增强CD8+T细胞扩充的条件下被给予一段时间。
更优选地，脂肽或衍生物或变体或疫苗组合物在足以增强个体中细胞介导免疫(CMI)的条件下被给予一段时间。
术语“CMI”是指激活的并克隆扩充的CTL是MHC-限制性的并特异于一个CTL表位。CTL是基于抗原特异性和MHC限制性而分类(即非特异性CTL和抗原特异性、MHC限制性CTL)。非特异性CTL由各种细胞类型组成，包括NK细胞，其可以在免疫应答非常早期起作用以降低病原体负荷，而此时抗原特异性应答仍在建立过程中。相反，MHC限制性CTL晚于非特异性CTL达到最佳活性，通常在抗体产生之前。抗原特异性CTL抑制或降低病原体的扩散并优选地终止感染。
CTL激活、克隆扩充或CMI可以***性诱导或诱导限于局部。在限于局部作用的情况下，优选的是利用配制为适合给予该局部的疫苗。另一方面，对于在个体中***性诱导CTL激活、扩充或CMI没有这种严格限制。
引起CTL激活、克隆扩充或CMI的待给药脂肽单独或在疫苗组合物中的有效量将根据免疫原性表位的性质、给药途径、免疫个体的体重、年龄、性别或总的健康状况以及所需要的CTL应答的性质而变化。所有这类变量均可通过本领域熟知手段凭经验确定。
任选地与任何合适的或期望的载体、佐剂、BRM或药物学可接受的赋形剂配制后的脂肽方便地以可注射组合物形式给药。注射可以是鼻内、肌肉内、皮下、静脉内、真皮内、腹膜内或其它已知途径。对于静脉内注射，希望的是包括一或多种液体和营养补剂。
使用动物模型建立给药最佳剂量和给药优选途径，例如用包含脂肽的配制品注射小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪，随后用任一常规分析监测CTL免疫应答。
为了测试对本发明的包含HLAA2限制性CTL表位的脂肽或包含所述脂肽的疫苗组合物的体内应答，特别优选的是使用携带由人HLAA＊0201等位基因的α1和α2结构域及小鼠H-2KbI类分子的α3结构域组成的嵌合人-小鼠I类主要组织相容性复合物(MHC)基因座的HLAA2/Kb转基因小鼠(Vitiello et al.，J.Exp.Med.173，1007，1991)。
不受任何理论或作用模式的限制，我们相信脂肽的生物学作用通过其刺激和使树突细胞成熟的能力而表现出。是树突细胞随后激活引流***中的CD4+和CD8+T细胞。为此，我们不会也不可能如设想的那样直接激活T细胞。因此以下段落被相应地修改以适应树突细胞激活的概念。
在一相关的实施方案中，本发明提供了一种增强个体的细胞介导免疫的方法，所述方法包括在足以使树突细胞成熟的条件下，将得自一个体的细胞、优选为树突细胞与本发明的免疫学活性脂肽或其衍生物或变体或者包含所述脂肽或衍生物或变体的疫苗组合物ex vivo接触一段时间。所述树突细胞随后能赋予T细胞表位特异性激活。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种增强个体的细胞介导免疫的方法，所述方法包括：
(i)在足以使树突细胞成熟的条件下，将得自一个体的树突细胞与本发明的免疫学活性脂肽或其衍生物或变体或者包含所述脂肽或衍生物或变体的疫苗组合物exvivo接触一段时间；和
(ii)将激活的树突细胞自体导入所述个体或者同基因地导入另一个个体，以便发生T细胞激活。
T细胞可以是CTL或CTL前体细胞。
用于获得树突细胞的个体可以是被治疗的个体或者是不同的个体。被治疗的个体可以是携带由病原体如寄生虫、细菌或病毒所致的潜伏或活动感染的任何个体，或者是需要获得抗这种病原体的免疫接种或希望获得抗这种免疫接种的个体。也可以对被治疗的个体携带的肿瘤进行治疗。
术语“表位特异性活性”是指如上所述使得T细胞能够被激活(即T细胞将识别和溶解携带一种衍生所述CTL表位的病原体的细胞，或者能以瞬时或持续方式识别一种病原体的抗原的T细胞表位)。因此，特别优选的是T细胞为一种CTL前体，其通过本发明的方法可以使得能识别并溶解携带病原体的细胞或者能以瞬时或持续方式识别病原体抗原的T细胞表位。
对这种ex yivo应用，优选地，树突细胞包含在得自个体的生物学样品中，如血液、PBMC或衍生自其中的淡黄层部分。
本发明的另一方面提供了在未感染的个体中增强或赋予抗一种病原体的免疫性的方法，包括在足以提供抗病原体未来感染的免疫记忆的条件下，将本发明的免疫活性脂肽或其衍生物或变体或者包含所述脂肽或衍生物或变体的疫苗组合物给予所述个体一段时间。与本文所述的其它实施方案一样，病原体可以是寄生虫、病毒或细菌，并且优选是本文上述的已鉴别了CTL表位的寄生虫、病毒或细菌。
在相关的实施方案中，本发明提供了在未感染的个体中增强或赋予抗一种病原体的免疫性的方法，包括在足以赋予T细胞以表位特异性活性的条件下，将得自所述个体的树突细胞与本发明的免疫活性脂肽或其衍生物或变体或者包含所述脂肽或衍生物或变体的疫苗组合物体外(exvivo)接触一段时间。
因此，本发明的这一方面提供了给予个体预防性疫苗的方法，其中所述疫苗的活性成分(即本发明的脂肽)在未感染的个体中诱导了经记忆T细胞产生的免疫记忆。本文描述的用于增强个体中细胞介导免疫的接种方案的优选实施方案经过必要的修正适用于在个体中诱导抗病原体的免疫记忆。
本发明进一步参照下述非限制性实施例和附图进行描述。本文提供的在小鼠中的实施例是人类中同等疾病的可接受的模型，并且本领域技术人员无需过多实验即可容易地将本文描述的关于这一模型的发现延伸至人类疾病。
实施例1
材料和方法
化学品
除非另有说明，化学品均是分析级或等价级。N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，O′苯并***-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸盐(tetramethyluronium hexafluorophosphate)(HBTU)，1-羟基苯并***(HOBt)和二异丙基乙胺(DIPEA)以及二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)得自Auspep Pty.Ltd.，Melbourne，Australia和Sigma-Aldrich Pty.Ltd.，Castle Hill，Australia。O′苯并***-N，N，N′，N′-四甲基四氟硼酸盐(tetramethyluronium tetrafluoroborate)(TBTU)得自Bachem，(Bachem AG，Switzerland)。二氯甲烷(DCM)和二***得自Merck PtyLtd.(Kilsyth，Australia)。苯酚和三异丙基硅烷(TIPS)得自Aldrich(Milwaulke，WI)，三硝基苄基磺酸(TNBSA)和二氨基吡啶(DMAP)得自Fluka；1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)得自Sigma，棕榈酸得自Fluka。
病毒
本研究使用的A型流感病毒是称为Mem71的H3N1亚型病毒，其来自A/Memphis/l/71(H3N2)×A/Bellamy/42(HIN1)的遗传重配。在10日龄含胚鸡蛋的尿囊腔中培养病毒2天。含病毒的尿囊液等份储存在-70℃。通过分析在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞单层(Tannocket al，Infect.Immun.43，457-462，1984)中的噬斑形成获得感染性病毒效价并表示为PFU/ml。
细菌
Listeria monocytogenes EGD在马血琼脂(HBA)平板上于37℃过夜培养。用无菌PBS将细菌从平板上洗下并将浓度调整至5×103Listeria细胞/ml。Balb/c小鼠用1×103Listeria细胞进行静脉内感染。通过将10倍系列稀释液在HBA平板上铺板检测剂量。
肽合成
包含流感病毒CTL表位的肽
合成了一组免疫原，这些免疫原掺入了代表均来自流感病毒的针对CD8+T细胞的最小决定簇和/或针对CD4+T细胞的决定簇的肽。具有序列TYQRTRALV(一种存在于PR8病毒的NP中的CTL决定簇；SEQ ID NO：2)的肽NP(147-155)是由BALB/c小鼠识别的主要CD8+T细胞决定簇并在所有A型流感病毒株中是共有的(Bodmer et al，Cell52，253-258，1988；和Sherman et al，J.Exp.Med.175，1221-1226，1992)。具有序列ALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO：1)的肽HA2(166-180)是存在于Mem71流感病毒血凝素的HA2链内的CD4+辅助T细胞决定簇，其激发与所有H3亚型病毒交叉反应的CD4+T细胞(Jackson et al，Virology 198，153-170，1994)。
包含L.monocytogenes CTL表位的肽
合成了一种免疫原性肽，其掺入了具有来自L.monocytogenes的氨基酸序列GYKDGNEYI(literialysin蛋白的残基91-99)的最小CTL表位(即SEQ ID NO：172)和来自CDV-F的一个辅助T细胞表位(SEQ IDNO：20)。
包含由B16-OVA肿瘤细胞系表达的CTL表位的肽
合成了一种免疫原性肽，其掺入了具有氨基酸序列SIINFEKL(SEQ ID NO：173)的一个CTL表位和来自CDV-F的一个辅助T细胞表位(SEQ ID NO：20)。
包含来自丙型肝炎病毒核心蛋白的一个CTL表位的肽
合成了一种免疫原性肽，其掺入了具有氨基酸序列DLMGYIPLV(SEQ ID NO：176)的一个CTL表位和来自CDV-F的一个辅助T细胞表位(SEQ ID NO：20)。
一般程序
用Fmoc化学经常规固相方法学组装合成免疫原。用于肽合成的一般程序如Jackson et al.，Vaccine 18，355(1999)所述。为了实现在CD4+辅助T细胞表位和CTL表位之间的脂质附着，Fmoc-赖氨酸(Mtt)-OH***到两个表位之间的位于树脂结合肽的大致中心的一个点。肽合成完成后，通过用在二氯甲烷中的1％TFA持续流动洗涤30-45分钟而除去Mtt基团。
式(I)的脂质部分的合成
根据Weismuller et al.，Hoppe Seylers Z Physiol Chem 364，593(1983)所述并根据Zeng et al.，J Pept Sci 2，：66(1996)所述方法改进的方法制备Pam3Cys。根据Zeng et al.(supra)的程序将脂氨基酸Pam3Cys偶联至赖氨酸的暴露的ε氨基基团。简而言之，将2倍过量的Pam3Cys，TBTU和HOBt溶解于DCM中并加入3倍过量的DIPEA。然后将这一溶液加到树脂结合肽以产生脂肽。
式(II)的脂质部分的合成
Pam2Cys合成适应于Jones et al.，Xenobiotica 5，155(1975)andMetzger et al.，Int J Pept Protein Res 38，545(1991)先前描述的方法，例外之处是使用3-溴-丙-1，2-二醇代替3-氯-丙-1，2-二醇，并且使用离心二非过滤回收产物。
脂肽的合成
本研究制备的脂肽具有图1所示的一般结构。包括在各种脂肽中的肽部分的氨基酸序列如图2所示。根据Jones et al.，Xenobiotica5，155(1975)和Metzger et al.，Int J Pept Protein Res 38，545(1991)等人的方法将Pam2Cys与肽偶联，但方法有如下修改：
I.S-(2，3-二羟基丙基)半胱氨酸的合成：
将三乙胺(6g，8.2ml，58mmole)加入到水中的盐酸L-半胱氨酸(3g，19mmole)和3-溴-丙-1，2-二醇(4.2g，2.36ml，27mmole)中，将这一均匀溶液在室温保持3天。将溶液在40℃真空干燥成白色残渣，残渣用甲醇(100ml)煮沸，离心并将残渣溶于水(5ml)中。将这一水溶液加入丙酮(300ml)中，离心分离沉淀。用丙酮经几次从水中沉淀而纯化所述沉淀，得到白色无定形粉末状S-(2，3-二羟基丙基)半胱氨酸(2.4g，12.3mmol，64.7％)。
II.N-芴基甲氧基羰基-S-(2，3-二羟基丙基)半胱氨酸(Fmoc-Dhc-OH) 的合成：
将S-(2，3-二羟基丙基)半胱氨酸(2.45g，12.6mmole)溶解于9％碳酸钠(20ml)中。加入在乙腈(20ml)中的芴基甲氧基羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(3.45g，10.5mmole)溶液，搅拌混合物2小时，然后用水(240ml)稀释，并用二***萃取(25ml×3)。用浓盐酸酸化水相至pH2，然后用乙酸乙酯萃取(70ml×3)。萃取物用水(50ml×2)和饱和氯化钠溶液(50ml×2)洗涤，在硫酸镁上干燥，并蒸发至干燥。用***和乙酸乙酯在-20℃重结晶，获得无色粉末(2.8g，6.7mmole，63.8％)。
III.Fmoc-Dhc-OH偶联至树脂结合的肽上：
在DCM和DMF(1∶1，v/v，3ml)中，用HOBt(36mg，0.24mmole)和DICI(37ul，0.24mmol)在0℃激活Fmoc-Dhc-OH(100mg，0.24mmole)5min。然后将混合物加入到含有树脂结合的肽(0.04mmole，0.25g氨基肽树脂)的烧瓶中。振荡2小时后，过滤除去溶液，树脂用DCM和DMF洗涤(每种各3×30ml)。用TNBSA测试检测反应是否完全。如果需要进行双重偶联。
IV.Fmoc-Dhc-肽树脂的两个羟基基团的棕榈酰化：
将棕榈酸(204mg，0.8mmole)，DICI(154ul，1mmole)和DMAP(9.76mg，0.08mmole)溶解在2ml DCM和1ml of DMF中。将树脂结合的Fmoc-Dhc-肽树脂(0.04mmole，0.25g)悬浮于这一溶液中，并在室温摇动16小时。过滤除去溶液，然后用DCM和DMF充分洗树脂以除去任何残留的脲。用2.5％DBU(2×5min)除去Fmoc基团。
用试剂B(88％TFA，5％苯酚，2％TIPS，5％水)处理2小时从固相支持物上裂解下全部树脂结合的肽构建体，如Zeng et al.，Vaccine18，1031(2000)所述经反相色谱纯化肽构建体。
用安装在Waters HPLC***中的Vydac C4柱(4.6×300mm)进行分析反相高压液相色谱(RP-HPLC)，并用于H2O中的0.1％TFA和于CH3CN中的0.1％TFA作为极限溶剂以1ml/min流速走柱。所有产物在分析RP-HPLC上均呈单主峰，并且当用在配有延迟离子萃取的Bruker BIFLEX仪器上进行的MALDI-TOF质谱分析时均具有预期质量。
在某些情况下，两个丝氨酸残(Ser-Ser)被加到肽和脂质部分之间，在这种情况下，在脂质部分被附着之前，将丝氨酸残基加到中心赖氨酸残基的ε-氨基基团。
本研究中使用的肽和脂肽的示意图如图1所示。
免疫方案
包含流感病毒CTL表位的肽
由6-8周龄的雌性BALB/c小鼠组成的各组在第0天和第28天进行接种。对于皮下(s.c.)接种，每剂将9nmole脂肽构建体在100μl盐水中制备，非脂化肽在等体积完全弗氏佐剂(CFA)中配制成乳液进行初次注射，或者在等体积部完全弗氏佐剂中配制成乳液进行第二次接种。对于鼻内(i.n.)接种，将在50μl盐水中的9nmole肽涂在吸入甲氧氟烷麻醉的小鼠的鼻孔中。
包含L.monocytogenes的CTL表位的肽
5只BALB/c小鼠用9nmole非脂化肽([P25]-Lys-[LLO91-99])或脂化肽([P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99])接种或用1000个细菌接种，所述脂化肽中脂质附着于两个表位之间的大约分子中心的位置。在肽疫苗情况下进行皮下接种，在细菌情况下进行静脉内接种。在体外用CTL表位或无抗原刺激后第28天测量脾中存在的产生干扰素-γ的细胞数。纵轴示出每1,000,000个脾细胞中产生干扰素-γ的细胞数。
包含卵清蛋白的CTL表位的肽
9只C57BL/6小鼠(8-10周龄)的每一只用在100μl盐水中的20nmole脂化的[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]或非脂化的[P25]-Lys-[SIINFEKL]肽皮下免疫。在脂化肽情况下，脂质附着于两个表位之间的大约分子中心的位置。
包含丙型肝炎病毒核心蛋白的CTL表位的肽
人单核细胞衍生的树突细胞与脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV](5μg/mL)保温48小时，之后用针对HLA-DR，CD83和CD86的FITC缀合的抗体染色以进行流式细胞计量术分析。
用流感病毒攻击免疫的小鼠
经甲氧氟烷麻醉的预先用包含流感病毒CTL表位的肽免疫的小鼠用104.5PFU的感染性Mem71流感病毒进行鼻内(i.n.)攻击。每只小鼠接受50μl用PBS稀释的尿囊液形式的病毒。攻击后5天通过颈脱节杀死小鼠，取出肺并无菌转移进含有每ml补加100U青霉素、100μg链霉素和30μg庆大霉素的1.5ml Hank′s平衡盐溶液的瓶子中。用组织匀浆机制备肺匀浆，通过在300×g离心5min沉淀细胞材料。取上清液分成等份，储存在-70℃备用。肺上清液中的感染性病毒效价用在MDCK细胞上的噬斑分析(Tannock et al，Infect.Immun.431，457-462，1984)测定。
用L.monocytogenes攻击免疫的小鼠
在致敏后28天通过静脉注射细菌攻击用9nmol肽免疫原或PBS皮下免疫的或用1000个细菌静脉内免疫的小鼠，在攻击后28天测定肝中存在的细菌的菌落形成单位数。
用肿瘤细胞攻击免疫的小鼠
黑素瘤攻击
用非脂化[P25]-Lys-[SIINFEKL]或脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]接种14天后，每组6只小鼠用2×105个表达卵清蛋白[B16-OVA]因而表达CTL表位SIINFEKL的黑素瘤细胞(Bellone，et al，J.Immunol.165：2651-2656)攻击。在注射之前用电动剃须刀去除注射部位周围的毛发以便测量出现的肿瘤。监测生长的肿瘤，当肿瘤大小达到15×15mm时杀死动物。在肿瘤攻击后指定天数计算每个处理组的平均肿瘤面积。
Lewis肺癌攻击
小鼠用3×104个已用卵清蛋白转染因而表达CTL表位的Lewis肺肿瘤细胞(Nelson et al.，J Immunol.166：5557-5566，2001)接种。接受肿瘤细胞后，在动物尾根部皮下接种20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]或PBS。接受肿瘤细胞11天后给予第2剂免疫原。监测动物中肿瘤发生和动物存活，当肿瘤面积超过100mm2时对动物实行安乐死。
肽特异性CD8+T细胞的四聚体染色
使用H-2Kd糖蛋白和结合的CTL肽(TYQRTRALV；SEQ ID NO：2)的四聚体复合物鉴别特异于脂肽免疫原中的SEQ ID N O：2所示的免疫显性H-2Kd限制性CTL表位的CD8+T细胞(Bodmer et al，Cell 52：253-258，1988；Sherman et al，J.Exp.Med.175：1221-1226，1992)，该免疫显性H-2Kd限制性CTL表位由流感病毒株A/Puerto Rico/8/34(PR8；H1N1)的核蛋白的氨基酸残基147-155组成。单体由墨尔本大学微生物学和免疫学系的Peter Doherty教授惠赠，并且是在St.JudeChildren’s Research Hospital，Memphis TN，USA制备。四聚体通过以4∶1的摩尔比将单体与链亲和素-藻红蛋白(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)保温而制备。
来自肺的淋巴细胞首先用20μL正常小鼠血清(NMS)在室温处理5分钟，然后用1∶25稀释的四聚体复合物染色60分钟。之后，用缀合有别藻蓝蛋白的抗CD8α(53-6.7)在冰上染色30分钟，洗涤2次，经荧光素激活的细胞分选仪(FACSort，Becton Dickinson，San Jose’s，USA)分析。数据用FlowJo(Tree Star，Inc，CA，USA)分析。
T细胞培养基
T细胞培养基由补加10％(vol/vol)热灭活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、30μg庆大霉素/ml、100μg链霉素/ml、100IU青霉素/ml和10-4M2-巯基乙醇的RPM1 1640(CSL Ltd.)组成。
细胞毒性T细胞分析
从预先用脂肽免疫原皮下免疫7天的小鼠的腹股沟***和腘***产生二级效应细胞，或者从预先用脂肽免疫原致敏至少28天的小鼠的脾细胞产生二级效应细胞(secondary effector cells)。简而言之，在含有15mlT细胞培养基的25-cm2组织培养瓶(Falcon)中，将4×107个通过用Tris缓冲的氯化铵(0.15M NH4Cl于17mM Tris-HCl中，pH7.2)处理而耗竭红细胞的***细胞或脾细胞与107个照射的(2,200rads，60Co源)病毒感染的或脂肽刺激的同基因脾细胞一起培养。所述病毒感染的脾细胞预先与在1ml无血清RPM1中的3000凝血单位的感染性Mem71或PR8病毒在37℃保温30min，并且在加到培养瓶中之前洗涤一次。脂肽刺激的脾细胞预先与100μgCTL脂肽/ml在37℃保温60min并且在加入培养瓶中之前也洗涤一次。在含有5％CO2的潮湿环境下于37℃培养5天后，细胞洗涤3次，用于51Cr-释放分析中。51Cr释放分析如前所述(Harling-McNabb et al，Int.Immunol.11，1431-1439，1999)使用P815母细胞瘤细胞(H-2d，DBA/2)作为靶进行，共重复3份。
体内细胞毒性T细胞分析
体内测定基于各种肽的免疫原诱导表位特异性CTL的能力。用在50μl PBS中的各种脂肽鼻内接种每组3只小鼠，在第28天用Mem71攻击。为了分析体内CTL决定簇特异性细胞毒性，用CTL决定簇刺激同基因脾细胞并用高密度CFSE(2.5μM)标记。通过共注射用低密度CFSE(0.25μM)标记的同基因脾细胞而控制抗原特异性溶解。在感染后第4天静脉内注射每个靶细胞群的15×106个细胞的混合物。16小时后杀死小鼠，通过流式细胞仪分析脾中CFSE-high和CFSE-low细胞群的存在。每一样品总共分析1×106个淋巴细胞。个体小鼠用实心方块代表，条杆代表几何平均效价。
IFN-γ分泌细胞的ELlSPOT分析
CTL特异性IFN-Y分泌细胞通过由Murali-Krishna et al，Immunity8，177-187，1998的方法改良而来的ELISPOT分析进行计数。用50μl于PBS中的5μg/ml大鼠抗(小鼠IFN-Y)抗体(clone R4-14a2)过夜包被平底聚氯乙烯微滴板(96孔：Dynatech)。孔中的未占据位点随后通过与PBS中的10mg牛血清/ml保温1小时而封闭，用含0.05％ Tween 20(PBST)的PBS洗板3次。然后向孔中加入在T细胞培养基中的脾或***细胞的2倍稀释液以及5×105照射的(2,200rads，60Co源)来自未免疫小鼠的同基因脾细胞和10U重组人白介素-2(Pharmingen，SanDiego，Calif.)/孔。在存在浓度为1μg肽/ml的CTL肽或不存在CTL肽条件下于37℃、5％CO2中培养细胞18小时。然后溶解细胞并通过首先用蒸馏水接着用PBST洗板而除去细胞。然后，加入50μl的1/500稀释的生物素化抗(小鼠IFN-γ)抗体(clone XMG 1.2；Pharmingen)，在室温保温板2小时。再次洗板，向每孔中加入50μl链亲和素-碱性磷酸酶(Pharmingen；于5mg牛血清白蛋白/ml PBST中的1/400稀释液)，混合物随后进一步保温2小时。洗板，然后向每孔中加入含有1mg BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)/ml 2-氨基-2-甲基-1-丙炔醇缓冲液(Sigma)的100μl ELISPOT底物(Sedgwick et al，J.Immunol.Methods 57，301-309，1983)。当出现蓝绿色斑点时，用水洗板并干燥，借助于倒置显微镜计数斑点。
D1树突细胞培养物
在基于完全IDDM的培养基中培养树突细胞(DC)，这一培养基由含有25mM HEPES且不含α-硫代甘油或L-谷氨酰胺(JRHBioscience，Lenexa，USA)并且补加10％(v/v)热灭活(56℃，30min)胎牛血清(CSL Ltd.，Parkville，Victoria，Australia)、庆大霉素(24μg/mL)、谷氨酰胺(2mM)丙酮酸钠(2mM)、青霉素(100IU/mL)、链霉素(180μg/mL)和2-巯基乙醇(0.1mM)的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)组成。为产生DC，完全IMDM进一步补加30％来自培养的NIH/3T3细胞的上清和5％的呈用GM-CSF基因转染的Ag8653细胞上清形式的GM-CSF(DC培养基)。
幼树突细胞的培养方法由Winzler et al.，J.Exp Med.185，317(1997)适应而来。将来自BALB/c小鼠的脾细胞在3ml DC培养基中以1.5×106细胞/55mm培养皿(Techno-Plas，S.A.，Australia)接种并在37℃、5％CO2下保温。用于培养的所有设备均是无热原的。每4天更换培养基，且全部细胞均返回培养皿中。在第12天，通过用力抽吸培养基收集悬浮的和弱粘附的细胞。用2ml PBS重复这一程序。弃去剩余的强粘附细胞。离心沉淀收集的细胞并再接种于一新的培养皿。随后细胞保持在培养基更换和传代的4天交替循环中。连续培养1个月后，漂浮的和半粘附的细胞呈现幼DC的表观和染色特征，被称为D1细胞。在这些传代条件下，大部分培养的D1细胞保持未成熟表型，其特征为细胞表面MHC II类分子呈中等表达水平。
D1细胞的流式细胞计量术分析
将D1细胞(1×105个细胞/样品)接种在具有1mL DC培养基的新Petri培养皿中并与溶解在完全IMDM培养基中的0.0045nmole脂肽保温。纯化自Lipopolysaccharide(LPS)purified from E.coli血清型O111:B4的脂多糖(LPS)(Difco，Detroit，Michigan，USA)以5μg/mL用作DC成熟的阳性对照。在保温过夜后，收获细胞并用含1％FCS的PBS洗一次。为防止与FCγRII/III的非特异性结合，细胞预先与20μL正常小鼠血清在室温保温5分钟。然后细胞在冰上与FITC缀合的单克隆抗体14-4-4S(IgG2a，anti-I-Ek，d；Ozatoetal.，J.Immunol.，124，533(1980))接触30分钟。特异于辅助T细胞表位所来源的流感病毒抗原的单克隆抗体36/1(Brown et al.，Arch Virol 114：1，1990)用作同种型对照。所有抗体均以2.5μg/mL的浓度应用。样品用含1％FCS的PBS洗一次，然后在冰上用含4％低聚甲醛的PBS固定15分钟。用FACSort(Becton Dickinson，San Jose，USA)进行流式细胞计数分析，数据用FlowJo软件(Tree Star，Inc.，San Carlos，CA，USA)分析。
人树突细胞培养物
单核细胞衍生的树突细胞的产生
外周血单核细胞(PMBC)通过Ficoll Paque(Amersham Pharmacia，Sweden)梯度分离从得自血液供体的淡黄层制备物中制备。细胞在PBS中洗三次，然后与最佳量的鼠抗CD14杂交瘤上清(3C10，American Type Culture Collection)在冰上保温45分钟。洗涤两次后，将细胞进一步根据厂商指导与山羊抗鼠IgG微珠(Miltenyi Biotech，Germany)保温。然后用磁激活细胞分选(MACS)柱经亲和层析阳性选择CD14+单核细胞。通过在补加GM-CSF和IL-4(分别为40ng/ml和20ng/ml[Schering Plough，USA])的并含有10％FCS(CSL，Australia)、2mmol/L谷氨酸、2mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、30μg/ml庆大霉素和0.1mmol/L2-巯基乙醇的RPMI-1640(Gibco，USA)中培养单核细胞而产生幼DC。细胞培养5天，之后每2天更换一半体积的培养基。
DC成熟的测量
通过将每毫升5×105个细胞在补加GM-CSF和IL-4以及LPS(5μg/mL)、非脂化肽，[Th]-Lys-[CTL](5μg/mL)或脂肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](5μg/mL)三者中任一种的培养基中保温2天而测定基于肽和脂肽的免疫原正调节人单核细胞衍生的树突细胞上MHC class II，CD83和CD86的表达的能力，共测试48小时。通过用得自Becton Dickinson(USA)的针对HLA-DR(G46-6[L243])，CD83(HB15e)，CD86(Cat.No.2331[FUN-1])的荧光素缀合的单克隆抗体以及合适的同种型匹配抗体(MOPC-21and G155-178)根据厂商指导进行染色来进行表面标记的表型分析。然后洗涤细胞，在1％甲醛中固定并在流式细胞计数仪上分析。柱状图代表在正散射和旁散射点图上的大粒细胞。柱状图的阴影区域和相关数值代表表达高水平CD83，CD86或HLA-DR的细胞群的百分比。
实施例2
包含来自流感病毒的CTL表位的脂肽的免疫原性
测试了具有来自流感病毒的CTL表位的脂肽、特别是包含SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列的脂肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]的诱导增强的CTL介导的病毒清除以及增强，树突细胞成熟的能力。在所有实验中使用具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的非脂化肽作为阴性对照。
病毒清除
与非脂化肽相比脂肽引起更高水平的病毒清除(图3，图4a)。与来自仅用PBS免疫的小鼠的样品相比，在用脂肽免疫并在9天后用感染性Mem71病毒攻击的小鼠的肺中的病毒负荷降低了95％([Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]；图3)或99％([Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]；图3)。相反，非脂化肽仅达到了病毒负荷降低65％([Th]-Lys-[CTL]；图3)。在接种了脂肽并且在初次接种后28天用Mem71病毒攻击的动物中也观察到了增加的病毒清除。相反，在用非脂化肽接种的小鼠中在此时间点清除病毒的能力明显较弱。
如图4b所示，与仅接受非脂化肽或PBS的小鼠相比，接受根据图2命名的脂肽的免疫小鼠中也存在增强的CD8+T细胞激活，这一点通过在BAL液体中发现的CD8+T细胞数可见。
树突细胞成熟
树突细胞对二级淋巴器官中原初CD4+T细胞和CD8+T细胞的引发之前是在暴露于抗原表位时DC的成熟。这一成熟的特征在于DC表面上的MHC产物和共刺激分子的正调节。因此，我们测定了各种肽和脂肽是否能差异激活树突细胞，以试图解释这些疫苗候选者的不同免疫原性。
实验中，一株幼DC细胞系D1细胞与肽接触，针对MHC II类分子的表达进行染色，随后经流式细胞计量术分析，结果证实在细胞与肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]接触后，相比于细胞与接触[Th]-Lys-[CTL]肽或培养基，树突细胞的成熟增强(图4c)。
在导致DC成熟方面，[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]是最有效的，非脂化肽[Th]-Lys-[CTL]是效果最差的，而[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]与[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]几乎一样有效(图4c)。脂化肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]正调节II类表达的能力与细菌脂多糖(LPS)相同。非脂化肽诱导D1细胞成熟不超过约26％，这一水平是培养物中自发发生的水平。这些脂肽诱导D1细胞成熟的相对能力直接反映了它们诱导CTL介导的病毒清除应答以及BAL中的CD8+T细胞的能力。
不同脂质对体外和体内细胞毒性及T细胞增殖的作用
还测定了缀合不同脂质、包括Pam1Cys，Pam2Cys，Pam3Cys，棕榈酸和胆固醇至肽免疫原的作用。
如图5所示，在用含Pam2Cys脂肽免疫的小鼠肺中的病毒负荷低于用包含所测试的其它脂质的脂肽免疫的小鼠肺中的病毒负荷，提示Pam2Cys对于赋予抗病毒的保护作用是优选的。但是所有的脂质均提供一定的抗病毒保护作用。这一作用也反映在IFN-γCD8+T细胞计数上(图6)。总之，这些数据提示如在[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]表位结构中一样将脂质附着至半胱氨酸甘油残基对于最大细胞毒性作用是重要的。
在四聚体分析中，与非脂化肽或脂质加至肽的N-末端的脂肽(例如图7中的构建体Pal2LysLys[Th]-[CTL])相比，使用脂质部分加至一内部赖氨酸残基的ε氨基基团的脂肽(例如图7中的脂肽[Th]-Lys(Pam1Cys-Ser-Ser)-[CTL]，[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]，[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]，和[Th]-Lys(Chol2Lys-Ser-Ser)-[CTL])观察每个肺四聚体阳性CD8+T细胞数最高。这些数据还证实通过附着于一内部赖氨酸残基的ε氨基基团而将脂质置于肽的内部能增强CTL表位的细胞毒性活性。
为分析体内CTL决定簇特异性细胞毒性，小鼠鼻内接种9nmole在PBS中的各种脂肽并在第28天用Mem71病毒攻击。用经CTL决定簇刺激并用高密度CFSE标记的同基因脾细胞测量体内CTL决定簇特异性细胞毒性。用低密度CFSE标记的未刺激的脾细胞用作对照。在感染后第4天静脉内注射每一靶细胞群的细胞混合物。16小时后杀死小鼠并用流式细胞计量术分析脾中CFSE-high和CFSE-low细胞群的存在。每一样品分析总共1×106个淋巴细胞。图8中的数据示出在首次用于实验的小鼠中的细胞毒性T细胞活性。图9示出包含SEQ IDNO：1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQ ID NO：2所示的H-2d-限制性CTL表位的脂肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]诱导了明显的体内细胞毒性。
如图10所示，脂肽比非脂化肽具有更高的活性，其中与非脂化肽[Th]-Lys-[CTL]和其它所测试的脂肽相比，命名为[Th]-Lys(Pam1Cys-Ser-Ser)-[CTL]，[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]的脂肽提供了显著增强的体内特异性溶解。这些数据再次证实通过附着于一内部赖氨酸残基的ε氨基基团而将脂质置于肽的内部增强了体内CTL表位的细胞毒性活性。
实施例3
包含来自L.monocytogenes的CTL表位的脂肽的免疫原性
测试了具有来自L.monocytogenes的CTL表位的脂肽、特别是包含SEQ ID NO：175所示氨基酸序列的脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]诱导CD8+T细胞应答以及抗L.monocytogenes攻击的保护作用的能力。在所有实验中使用PBS或具有SEQ ID NO：175所示氨基酸序列的非脂化肽作为阴性对照。分离的细菌用作阳性对照。
脾细胞产生IFN-γ
本研究中测试的脂肽诱导抗免疫CTL表位的特异性CD8+T细胞应答，这一点通过相对于非脂化肽在用脂化肽免疫的小鼠中存在的产生IFN-γ的脾细胞数增加而表明。每一百万个脾细胞中，用9nmole包含SEQ ID NO：175所示氨基酸序列的脂化肽疫苗[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]免疫的小鼠产生比接受非脂化肽或PBS对照的小鼠多约15倍的IFN-γ产生细胞，表明在接受脂化肽的小鼠中产生IFN-γ的CD8+T细胞的激活增加(图11)。
抗分离细菌攻击的保护作用
图12的数据显示脂化[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]肽成功地提供了抗随后的全细菌攻击的保护作用。在用脂化[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]肽免疫的小鼠中也观察到相对于用非脂化[P25]-Lys-[LLO91-99]肽或PBS(即非免疫小鼠)免疫的小鼠显著增强的保护。
实施例4
抗肿瘤细胞攻击的保护作用
抗黑素瘤细胞攻击的保护作用
评价了含有卵清蛋白CTL表位(SIINFEKL)的脂肽疫苗诱导抗表达这一CTL表位的黑素瘤细胞(B16-OVA细胞)的保护作用的能力。在用如下脂肽接种的小鼠中确定了IFN-γ生成，所述脂肽包含CDV-F辅助T细胞表位(P25)和卵清蛋白的CTL表位(SIINFEKL)，这两个表位经位于所述表位之间的一个内部赖氨酸残基的ε氨基基团与Pam2Cys连接(即图2所列的基于SEQ ID NO：174的肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL])。C57BL/6小鼠用20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]或用PBS在尾根部皮下免疫。在14天后小鼠用B16-OVA细胞在背部皮下攻击。从接种动物获得脾细胞并用具有序列SIINFEKL的CTL表位体外刺激，侧链每1,000,000个脾细胞中产生IFN-γ的细胞数。数据显示，用脂肽接种的小鼠中产生IFN-γ的细胞数增加(表1)，表明脂肽相对于非脂化肽激活T细胞的能力增强。
重要的是，与用非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]或单独PBS免疫的小鼠相比，用脂肽进行免疫引起了对肿瘤生长的控制(图13)。在用[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]免疫的小鼠中在15天期间内未观察到肿瘤生长。相反，在用[P25]-Lys-[SIINFEKL]或单独PBS免疫的小鼠中观察到直径大于75mm2的肿瘤。总之这些数据证实与非脂化肽相比脂肽在抗肿瘤保护方面具有保护能力。
表1
与接受非脂化[P25]-Lys-[SIINFEKL]肽或PBS相比在接受[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]脂肽的代表性黑素瘤样品中的分泌IFN-γ的脾细胞数
Figure S03824145519960326D000701
对用Lewis肺肿瘤细胞进行的攻击的保护作用
还测试了脂肽提供在动物体内抗Lewis肺肿瘤发育的保护作用的能力。用3×104个用卵清蛋白转染因此表达CTL表位SIINFEKL的Lewis肺肿瘤细胞(Nelson et al.，J Immunol.166：5557-5566，2001)注射小鼠。接受肿瘤细胞4天后，在动物尾根皮下接种20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]，或者非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]或PBS。接受肿瘤细胞11天后给予第二次相似剂量的免疫原。图14中的数据表明与接受非脂化肽或PBS的动物相比，接受脂肽的动物中具有较少损害发生的动物的百分数显著较高。如图15所示，接受脂肽免疫原的动物比接受非脂化肽或PBS的动物的存活时间也长。这些数据进一步证实脂肽与非脂化肽相比的抗肿瘤的保护作用的保护能力。
实施例5
在给予包含CDV-F辅助T细胞表位和来自丙型肝炎病毒的CTL表位的脂肽后人树突细胞上的MHC II类、CD83和CD86的增强表达
测试具有图2中所述的命名的脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV]的正调节人树突细胞上的MHC II类、CD83和CD86的表达的能力。人单核细胞衍生的树突细胞与培养基单独、LPS(5μg/mL)，非脂化肽[P25]-Lys-[HCV](5μg/mL)或脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV](5μg/mL)保温48小时，之后在经流式细胞计量术分析之前用针对HLA-DR，CD83和CD86的FITC缀合的抗体染色。图16所示数据证实在用脂化肽处理之后与用非脂化肽或PBS单独处理之后相比，有更高百分比的在其细胞表面表达HLA-DR，CD83和CD86抗原的树突细胞群。脂肽诱导人树突细胞成熟的能力直接反映了脂肽与非脂化肽相比的免疫原性，提供了免疫原性的一个可能机制。
实施例6
讨论
在本研究中，我们描述了各种脂肽免疫原的组装，所述脂肽免疫原由CD4+T细胞表位、CD8+CTL表位以及经一内部赖氨酸残基的ε氨基基团与其连接的Pam3Cys或Pam2Cys组成。
脂质部分的精确性质未显示出对于产生免疫应答是关键的，因为一系列脂质、包括胆固醇、棕榈酸、Pam1Cys、Pam2Cys和Pam3Cys均显示出成功引起了T细胞增殖和细胞毒性。但是在保护作用和IFN-γ产生方面观察到显著不同，至少是在抗流感病毒的脂肽的情况下，由此提示脂质结构可能在体内是一个重要考虑因素。特别是至少对于掺入流感病毒CTL表位的疫苗而言，Pam2Cys与肽中的一内部赖氨酸残基的氨基基团连接能最有效地赋予保护作用，提示与半胱氨酸甘油的连接是优选的。
本发明的脂肽能有效增强免疫动物的抗细菌和病毒病原体以及抗肿瘤细胞的CD8+T细胞应答。考虑到本文表明的肽自身作为佐剂以抗病毒和细菌病原体以及肿瘤细胞的保护作用的成功，可以合理地预期这一技术可广泛地适用于各种免疫方案。
在脂质部分和肽序列之间***丝氨酸残基不负面影响所得的含Pam2Cys免疫原的效力。
脂肽可以在不含额外佐剂的情况下激发免疫应答，并可以经肠胃外和非肠胃外途径、特别是鼻内途径输送。
总之，本文提供的数据证实将各种脂质、包括但不限于Pam2Cys和Pam3Cys置于CTL表位和辅助T细胞表位之间的大约整个合成肽疫苗的中心位置增加了疫苗的免疫原性。
Figure IYZ000004141615300021
Figure IYZ000004141615300031
Figure IYZ000004141615300051
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Figure IYZ000004141615300491
Figure IYZ000004141615300501

Claims (97)

1.一种脂肽，其包含与一或多个脂质部分缀合的多肽，其中：
(i)所述多肽包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种细胞毒性T细胞(CTL)表位的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列是不同的；以及
(b)一和多个内部赖氨酸残基，用于经所述赖氨酸的ε(epsilon)氨基基团或末端侧链基团共价附着所述脂质部分的每一个；和
(ii)所述一或多个脂质部分的每一个均共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团，
其中所述脂质部分附着的内部赖氨酸残基位于Th表位和CTL表位之间。
2.权利要求1的脂肽，其中所述脂质部分具有通式(VII)的结构：
式(VII)
Figure FC20016128200380024145501C00011
其中：
(i)X选自由硫、氧、二硫键(-S-S-)、亚甲基(-CH2-)和氨基(-NH-)组成的一组；
(ii)m是整数1或2；
(iii)n是从0至5的一个整数；
(iv)R1选自由氢、羰基(-CO-)和R’-CO-组成的一组，其中R’选自由具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的链烯基和具有7-25个碳原子的炔基组成的一组，其中所述烷基、链烯基或炔基任选地由羟基、氨基、氧代(oxo)、酰基或环烷基取代；
(v)R2选自由R’-CO-O-，R’-O-，R’-O-CO-，R’-NH-CO-，和R’-CO-NH-组成的一组，其中R’选自由具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的链烯基和具有7-25个碳原子的炔基组成的一组，其中所述烷基、链烯基或炔基任选地由羟基、氨基、氧代(oxo)、酰基或环烷基取代；以及
(vi)R3选自由R’-CO-O-，R’-O-，R’O-CO-，R’-NH-CO-，和R’-CO-NH-组成的一组，其中R’选自由具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的链烯基和具有7-25个碳原子的炔基组成的一组，其中所述烷基、链烯基或炔基任选地由羟基、氨基、氧代(oxo)、酰基或环烷基取代；
并且其中R1，R2和R3各自相同或不同。
3.权利要求2的脂肽，其中X是硫；m和n均是1；R1选自由氢和R’-CO-组成的一组，其中R’是具有7-25个碳原子的烷基；R2和R3选自由R’CO-O-，R’--O--，R’O-CO-，R’-NH-CO-和R’-CO-NH-组成的一组，其中R’是具有7-25个碳原子的烷基。
4.权利要求3的脂肽，其中R’选自由棕榈酰，肉豆蔻酰，硬脂酰，月桂酰，辛酰，癸酰和胆固醇组成的一组。
5.权利要求3的脂肽，其中脂质包含在由Pam1Cys，Pam2Cys，Pam3Cys，Chol2Lys，Ste2Cys，Lau2Cys，和Oct2Cys组成的一组的一种脂氨基酸部分内。
6.权利要求5的脂肽，其中所述脂氨基酸部分是Pam2Cys。
7.权利要求1的脂肽，其中脂质部分具有下述通式(VIII)：
式(VIII)
Figure FC20016128200380024145501C00021
其中：
(i)R4选自如下一组：(i)一种由约7至约25个碳原子组成的α酰基脂肪酸残基；(ii)一种α-烷基-β-羟基脂肪酸残基；(iii)一种α-烷基-β-羟基脂肪酸残基的β-羟基酯；以及(iv)一种脂氨基酸残基；
(ii)R5是氢或一种氨基酸残基的侧链。
8.权利要求1的脂肽，其中脂质部分通过一间隔物与肽部分隔开。
9.权利要求8的脂肽，其中所述间隔物包括精氨酸、丝氨酸或6-氨基己酸。
10.权利要求8的脂肽，其中所述间隔物由一种丝氨酸同二聚体组成。
11.权利要求1的脂肽，其中所述内部赖氨酸位于一种具有低免疫原性的合成氨基酸序列内。
12.权利要求1的脂肽，其中辅助T细胞表位是流感病毒血凝素的辅助T细胞表位或者犬瘟热病毒F蛋白(CDV-F)的辅助T细胞表位。
13.权利要求12的脂肽，其中流感病毒血凝素的辅助T细胞表位由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。
14.权利要求12的脂肽，其中CDV-F蛋白的辅助T细胞表位由SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列组成。
15.权利要求1的脂肽，其中CTL表位来自一种病毒的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白。
16.权利要求15的脂肽，其中所示病毒是流感病毒。
17.权利要求16的脂肽，其中CTL表位由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。
18.权利要求15的脂肽，其中病毒是丙型肝炎病毒。
19.权利要求18的脂肽，其中CTL表位由SEQ ID NO：176所示的氨基酸序列组成。
20.权利要求1的脂肽，其中CTL表位来自一种原核生物的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白。
21.权利要求20的脂肽，其中CTL表位来自Listeriamonocytogenes。
22.权利要求21的脂肽，其中CTL表位由SEQ ID NO：172所示的氨基酸序列组成。
23.权利要求1的脂肽，其中CTL表位来自一种真核生物的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白。
24.权利要求23的脂肽，其中真核生物是一种寄生虫。
25.权利要求23的脂肽，其中真核生物是一种哺乳动物。
26.权利要求25的脂肽，其中CTL表位来自哺乳动物的卵清蛋白或来自一种肿瘤细胞。
27.权利要求26的脂肽，其中CTL表位由SEQ ID NO：173所示的氨基酸序列组成。
28.权利要求1的脂肽，其中多肽包含选自SEQ ID NO：3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：174，SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：177的一种氨基酸序列。
29.权利要求1的脂肽，其能够正调节幼树突细胞(DC)上的MHC II类分子的表面表达。
30.权利要求29的脂肽，其中DC是D1细胞。
31.一种脂肽，其包含与一或多个脂质部分缀合的多肽，其中：
(i)所述多肽包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；和
(b)一或多个内部赖氨酸残基，用于经所述一或多个赖氨酸残基的ε氨基基团共价附着所述脂质部分的每一个；
(ii)所述一或多个脂质部分的每一个均共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团；并且
(iii)所述脂肽具有通式(VI)：
式(VI)：
Figure FC20016128200380024145501C00051
其中：
表位是辅助T细胞表位或CTL表位；
A存在或不存在，由长度约1至约6个氨基酸的氨基酸间隔物组成；
n是值为1，2，3或4的整数；
X是选自NH，O和S的一个末端侧链基团；
Y存在或不存在，由长度约1至约6个氨基酸的氨基酸间隔物组成；以及
Z是一个脂质部分。
32.权利要求31的脂肽，其中A不存在。
33.权利要求31的脂肽，其中Y存在并由一个丝氨酸同二聚体组成。
34.权利要求31的脂肽，其中Z选自Pam1Cys，Pam2Cys，Pam3Cys，Chol2Lys，Ste2Cys，Lau2Cys和Oct2Cys。
35.权利要求31的脂肽，其能够正调节幼树突细胞(DC)上的MHC II类分子的表面表达。
36.权利要求35的脂肽，其中DC是D1细胞。
37.一种生产脂肽的方法，包括：
(i)产生一种多肽，该多肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；和
(b)一或多个内部赖氨酸残基；以及
(ii)将所述一或多个脂质部分的每一个直接或间接共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团，以产生具有附着于所述内部赖氨酸残基的ε氨基基团的脂质部分的脂肽，其中所述脂质部分附着的内部赖氨酸残基位于Th表位和CTL表位之间。
38.权利要求37的方法，其中所述多肽通过化学合成手段合成。
39.权利要求37的方法，进一步包括产生脂质部分。
40.权利要求39的方法，包括以脂氨基酸形式合成脂质部分。
41.权利要求40的方法，进一步包括将一间隔物加至脂氨基酸的氨基酸部分。
42.权利要求41的方法，其中间隔物包括一种精氨酸同二聚体或丝氨酸同二聚体或6-氨基己酸。
43.权利要求41的方法，包括在一包括进行缩合、添加、取代或氧化反应的方法中经末端羧基将间隔物加至脂氨酸上。
44.权利要求41的方法，其中间隔物包含一末端保护的氨基酸残基以促进脂氨基酸与多肽的缀合。
45.权利要求44的方法，进一步包括将间隔物的末端保护的氨基酸脱保护，并将脂氨基酸缀合至多肽。
46.权利要求40的方法，包括在一包括进行亲核取代反应的方法中将一个间隔物加至多肽的未修饰ε氨基基团上。
47.权利要求46的方法，其中所述多肽具有包含一单个内部赖氨酸残基的氨基酸序列和一个封闭的N-末端。
48.权利要求46的方法，其中间隔物包含一种精氨酸同二聚体或丝氨酸同二聚体或6-氨基己酸。
49.一种包含权利要求1的脂肽和一种药物学可接受赋形剂或稀释剂的组合物。
50.权利要求49的组合物，进一步包含一生物应答修饰剂(BRM)。
51.权利要求1的脂肽或权利要求49的组合物在制备用于在个体中引起免疫应答的方法的制剂中的应用，所述方法包括在足以引起抗脂肽中的CTL表位的细胞毒性T细胞应答的条件下给予所述个体权利要求1的脂肽或权利要求49的组合物一段时间。
52.权利要求51的应用，其中脂肽鼻内给予个体。
53.权利要求51的应用，其中脂肽通过注射给予个体。
54.脂肽在制备用于免疫个体抗流感病毒的方法的药物中的应用，所述方法包括给予个体一种脂肽，所述脂肽包含与一或多个脂质部分缀合的一个多肽，其中：
(i)所述多肽包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种流感病毒蛋白的CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；
(b)一或多个内部赖氨酸残基，用于经所述内部赖氨酸的ε氨基基团共价附着每一个所述脂质部分；以及
(c)所述一或多个脂质部分的每一个均直接或间接共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团，其中所述脂质部分附着的内部赖氨酸残基位于Th表位和CTL表位之间；以及
(ii)所说方法包括在足以引起对所述CTL表位的CTL应答的条件下给予所述脂肽一段时间。
55.权利要求54的应用，其中脂肽与一种药物学可接受赋形剂或稀释剂一起给予。
56.权利要求54的应用，其中针对CTL表位产生免疫记忆。
57.权利要求54的应用，其中CTL表位包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
58.权利要求54的应用，其中辅助T细胞表位包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
59.权利要求54的应用，其中所述脂质部分包含选自(i)Pam1Cys；(ii)Pam2Cys；(iii)Pam3Cys；和(iv)Chol2Lys的脂氨基酸。
60.权利要求59的应用，其中所述脂质部分包含脂氨基酸Pam2Cys。
61.权利要求54的应用，进一步包括产生所述脂肽。
62.权利要求54的应用，其中所述方法进一步包括用预先取自个体的样品确定个体的免疫应答。
63.一种包含权利要求1的脂肽的抗流感病毒的疫苗，其中CTL表位来自流感病毒蛋白。
64.权利要求1的脂肽在制备抗流感病毒的疫苗中的应用。
65.脂肽在制备用于免疫个体抗丙型肝炎病毒的方法的药物中的应用，所述方法包括给予个体一种脂肽，所述脂肽包含与一或多个脂质部分缀合的一个多肽，其中：
(i)所述多肽包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种丙型肝炎病毒蛋白的CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；
(b)一或多个内部赖氨酸残基，用于经所述内部赖氨酸的ε氨基基团共价附着每一个所述脂质部分；以及
(c)所述一或多个脂质部分的每一个均直接或间接共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团，其中所述脂质部分附着的内部赖氨酸残基位于Th表位和CTL表位之间；以及
(ii)所述方法包括在足以引起对所述CTL表位的CTL应答的条件下给予所述脂肽一段时间。
66.权利要求65的应用，其中脂肽与一种药物学可接受赋形剂或稀释剂一起给予。
67.权利要求65的应用，其中针对CTL表位产生免疫记忆。
68.权利要求65的应用，其中CTL表位包含SEQ ID NO：176所示的氨基酸序列。
69.权利要求65的应用，其中辅助T细胞表位包含SEQ IDNO：20所示的氨基酸序列。
70.权利要求65的应用，其中脂质部分包含选自(i)Pam1Cys；(ii)Pam2Cys；(iii)Pam3Cys；和(iv)Chol2Lys的脂氨基酸。
71.权利要求70的应用，其中脂质部分包含脂氨基酸Pam2Cys。
72.权利要求65的应用，进一步包括产生所述脂肽。
73.权利要求65的应用，其中所述方法进一步包括用预先取自个体的样品确定个体的免疫应答。
74.一种包含权利要求1的脂肽的抗丙型肝炎病毒的疫苗，其中CTL表位来自一种丙型肝炎病毒蛋白。
75.权利要求1的脂肽在制备抗丙型肝炎病毒的疫苗中的应用。
76.脂肽在制备用于免疫个体抗Listeria monocytogenes的方法的制剂中的应用，所述方法包括给予个体一种脂肽，所述脂肽包含与一或多个脂质部分缀合的一个多肽，其中：
(i)所述多肽包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种Listeria monocytogenes蛋白的CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；
(b)一或多个内部赖氨酸残基，用于经所述内部赖氨酸的ε氨基基团共价附着每一个所述脂质部分；以及
(c)所述一或多个脂质部分的每一个均直接或间接共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团，其中所述脂质部分附着的内部赖氨酸残基位于Th表位和CTL表位之间；以及
(ii)所述方法包括在足以引起对所述CTL表位的CTL应答的条件下给予所述脂肽一段时间。
77.权利要求76的应用，其中脂肽与一种药物学可接受赋形剂或稀释剂一起给予。
78.权利要求76的应用，其中针对CTL表位产生免疫记忆。
79.权利要求76的应用，其中CTL表位包含SEQ ID NO：172所示的氨基酸序列。
80.权利要求76的应用，其中辅助T细胞表位包含SEQ IDNO：20所示的氨基酸序列。
81.权利要求76的应用，其中脂质部分包含选自(i)Pam1Cys；(ii)Pam2Cys；(iii)Pam3Cys；和(iv)Chol2Lys的脂氨基酸。
82.权利要求81的应用，其中脂质部分包含脂氨基酸Pam2Cys。
83.权利要求76的应用，进一步包括产生所述脂肽。
84.权利要求76的应用，其中所述方法进一步包括用预先取自个体的样品确定个体的免疫应答。
85.一种包含权利要求1的脂肽的抗Listeria monocytogenes的疫苗，其中CTL表位来自一种Listeria monocytogenes蛋白。
86.权利要求1的脂肽在制备抗Listeria monocytogenes的疫苗中的应用。
87.脂肽在制备用于预防或治疗癌症的方法的药物中的应用，所述方法包括给予个体一种脂肽，所述脂肽包含与一或多个脂质部分缀合的一个多肽，其中：
(i)所述多肽包含：
(a)一种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种肿瘤特异性CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；
(b)一或多个内部赖氨酸残基，用于经所述内部赖氨酸的ε氨基基团共价附着每一个所述脂质部分；以及
(c)所述一或多个脂质部分的每一个均直接或间接共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的ε氨基基团，其中所述脂质部分附着的内部赖氨酸残基位于Th表位和CTL表位之间；以及
(ii)所述方法包括在足以引起对所述CTL表位的CTL应答的条件下给予所述脂肽一段时间。
88.权利要求87的应用，其中脂肽与一种药物学可接受赋形剂或稀释剂一起给予。
89.权利要求87的应用，其中针对CTL表位产生免疫记忆。
90.权利要求87的应用，其中肿瘤特异性CTL表位包含SEQID NO：173所示的氨基酸序列。
91.权利要求87的应用，其中辅助T细胞表位包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
92.权利要求87的应用，其中脂质部分包含选自(i)Pam1Cys；(ii)Pam2Cys；(iii)Pam3Cys；和(iv)Chol2Lys的一个脂氨基酸。
93.权利要求92的应用，其中脂质部分包含脂氨基酸Pam2Cys。
94.权利要求87的应用，进一步包括产生脂肽。
95.权利要求87的应用，其中所述方法进一步包括用预先取自个体的样品确定个体的免疫应答。
96.一种包含权利要求1的脂肽的针对癌症的预防或治疗性疫苗，其中CTL表位是肿瘤特异性CTL表位。
97.权利要求1的脂肽在制备针对癌症的预防或治疗性疫苗中的应用。
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Deliyannis Georgia等.induction of long-term memory CD8+ T cells for recall of viralclearing responses against influenza virus.Journal of Virology76 9.2002,第4212页左栏最后一段,第4213页左栏第一段至第4214页右栏最后一段,discussion部分. *

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