JP2004501657A - トランスフェクション効率の改良方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、K16ペプチドを用いることによってトランスフェクション効率を向上させる方法に関する。さらに、本発明は新規K16ペプチド、特に下記ペプチド配列を有するK16−CYC、およびKKKKKKKKKKKKKKKKGGGCNEWTLELLEELKNEAVRHFのペプチド配列を有するK16mVprNに関する。
Description
【0001】
本発明は、K16ペプチドの使用によるトランスフェクション効率の改良方法に関する。さらに、本発明は、新規K16ペプチドを包含する。本出願は分子生物学および医科学分野に関するものである。
【0002】
非ウイルス性遺伝子送達システムのトランスフェクション機構は、種々の生物学的バリアを通過することを含む複雑な過程である。非ウイルス性ベクターのトランスフェクション効率を制限する1つの主要な要因は、核エンベロープである。核へのベクターの移行は結果的にトランスジーンの効率的発現を可能にする。
【0003】
プラスミドDNAに核エンベロープを通過させるための手法は、細胞の核原形質輸送機序を利用することである。1つの方法としては、NLS配列を有しかつ陽イオン性DNA結合ドメインを含むペプチドをDNAに非共有結合させることである。その結果、結合したNLS配列を核内へのDNAの核輸送を容易にする核輸送機序によって認識されると考えられる。
【0004】
非ウイルス性遺伝子送達システムでは、最もよく使用されるNLS配列の1つにシミアンウイルス40(SV40)大型T抗原(SV40−NLS)の126〜132のアミノ酸配列がある。しかし、この方法によるNLS配列特異的なトランスフェクション効率の向上は、確実に証明されているわけではない。
【0005】
本発明の目的は、プラスミドDNAの核への取り込みを向上させることであった。本発明において、合成ペプチドは、オリゴリジンDNA結合ドメインとSV40−NLSとを含むように構築された。さらに、プラスミドDNA、合成ペプチドおよび脂質からなる複合体が構築され、最適化された。
【0006】
合成ペプチドは、以下の配列を有するものを用いた:
上記全てのペプチドは、プラスミドDNAへのペプチドの結合用に16残基のリジンを有している。
【0007】
K16−NLSペプチドは、SV40−NLS配列(PKKKRKV)も含有する。K16−SLNペプチドは、K16−NLSと同じアミノ酸組成を有するコントロールぺプチドである。これは、同じDNA結合ドメインを有するがSV40NLS配列を逆向きで含んでいる。K16−Vprペプチドは、上記オリゴリジンDNA結合ドメインを有し、かつHIV I−Vprタンパク質のC末端ドメインに由来するNLS配列も有する。K16−VprNペプチドは、K16−Vprに類似しているが、HIV I−VprのN末端ドメインに由来するNLS配列を有しいる。K16−mVprNは、上記DNA結合ドメインと、3つの重要なアミノ酸残基を置換して構築したPprN−NLS−コントロール配列とを含むコントロールペプチドである。すでに述べたように、これらの改変は、カーゴの核移入を容易にする能力を欠損したペプチドをもたらす。
【0008】
さらに、16残基のリジン(K16)からなる合成ペプチドを、別のコントロールペプチドとして用いた。
【0009】
脂質混合リポフェクチンは、脂質として利用するのが好ましかった。
【0010】
プラスミドDNA、ペプチドおよび脂質を含む複合体を形成させ、ヒト結腸癌細胞(HCT 116)でのin vitroトランスフェクション実験に用いた。ルシフェラーゼリポーター遺伝子を、トランスフェクション効率を測定するために用いた。
【0011】
上記K16ペプチドの構築に加えて、本発明は、DNA−ペプチド−脂質複合体の構築を含む。したがって、重要なのは、DNAに対するペプチドのチャージ比率および脂質の適量を選択することによる複合体の構成成分率である。複合体形成の方法(濃度、容量、バッファーの種類、インキュベーション時間およびさらに混合物に添加される成分の順序等、図1〜3および図4〜6を参照のこと)は、該システムのトランスフェクション効率を決定する重要な因子でもある。
【0012】
各因子の最適化の後、適切な複合体成分率ならびに適切な複合体の形成方法が得られ、HCT116細胞へのトランスフェクションにより、レポーター遺伝子発現のNLS−配列特異的な増加が得られる。
【0013】
本発明は、チャージするDNAに対するペプチドの比率を選択することにより、比較的少量の脂質を添加したペプチド/DNA複合体に比べて不安定なペプチド/DNA複合体を作製することを含む。
【0014】
その結果としての配列特異的な遺伝子発現の増大は、DNAの核輸送の増加と相関関係にある。
【0015】
本発明の他の部分は、NLS−配列の安定化のための環状ペプチドの構築および非ウイルス性遺伝子送達システムの最適化への該環状ペプチドの利用である。
【0016】
SV40−NLS配列は、塩基性残基を比較的多く含むため、生理学的条件下でかなり強い正電荷を帯びる。トランスフェクション実験並びに生化学的研究の項に示すように、SV 40−NLSは、非ウイルス性遺伝子送達システムに用いられるプラスミドDNAと強い相互作用を有するであろう。SV 40−NLSのDNAへの結合は、核移行機序との相互作用においてNLSの立体構造的な妨害となり得る。さらに、NLSの二次構造もまた変化し、対応する因子によって核移行基質として認識される可能性もある。
【0017】
本発明は、SV 40−NLSの二次構造をペプチドの環状化により安定化させることを含む。SV 40−NLSは、その受容体であるインポーチン(importin)αに相互作用する際βシート構造を有する。NLS−環状化の基本は、2つのアンチパラレルなβシート配列を含む環状ペプチドの利用であった。
【0018】
本発明は、上述の環状ペプチド内でSV 40−NLSの再構築することを含む。その結果として、環状ペプチドは、2つのアンチパラレルなβシート配列を含んで構築されるが、その一方にはSV 40−NLSが含まれている。DNAにペプチドが結合するために、16残基のリジンは、SV 40−NLSの反対側に位置するβシートに共有結合させた。結果として得られる構築物(K16−CYC)は、環状NLS配列およびオリゴリジンDNA結合ドメインを含む合成ペプチドである。
【0019】
K16−CYCは以下の配列を有する:
さらに、本発明は、以下の2つのK16ペプチドを含む。1つは以下の39アミノ酸配列を含むペプチドであり:
KKKKKKKKKKKKKKKKGGGCNEWTLELLEELKNEAVRHF
もう一つは、以下の38アミノ酸配列を含むペプチドである:
KKKKKKKKKKKKKKKKGGGNEATLELLPELKNPAVRHF。
【0020】
プラスミドDNAと組み合わせること、ならびにプラスミドDNAと脂質と組み合わせることにより、これらのペプチドはトランスフェクション実験に適している。
【0021】
以下、本発明を種々の実施例により例証する。
【0022】
非ウイルス性遺伝子送達システムにおける K16−CYC ペプチドの利用
DNA−ペプチド−脂質複合体の最適化の上述の方法に基づいて、プラスミドDNA、K16−CYCペプチドおよびリポフェクチンを含む異種複合体を作製し、HCT116細胞のトランスフェクション実験に用いた。
【0023】
K16−CYCペプチドを用いたトランスフェクション後のレポーター遺伝子の発現が、SV 40−NLS配列の直鎖型を含有するK16−NLSペプチドに比べて顕著に増加したことが認められた(図7および図8参照)。
【0024】
非ウイルス性遺伝子送達システムにおける K16−VprN ペプチドの利用
プラスミドDNA、K16−VprNペプチドおよびリポフェクチンを含む複合体を作製し、HCT116細胞のトランスフェクション実験に用いた。他の適用においては、プラスミドDNAおよびK16−VprNペプチドを含む複合体も作製し、HCT116細胞のトランスフェクション実験に用いた。両適用において、K16−mVprNペプチドを、K16−VprNペプチドの代わりにコントロールペプチドとして用いた。結果は、コントロールペプチドを用いた実験に比べてレポーター遺伝子の発現が有意に増大していた(図9および図10)。
【0025】
NLS配列特異的なトランスフェクション効率の向上は、ペプチド/DNA複合体に脂質を添加しなかった場合により大幅に向上するということが観察された(図10)。K16−VprNペプチドは、K16−mVprNペプチドに比べて最大10倍のレポーター遺伝子発現レベルを示した。さらに、K16−VprNの場合は、K16−mVprNに比べて12分の1の量を用いると最大の遺伝子発現が得られた。
【0026】
観察されたトランスフェクション効率の向上が、K16−VprNペプチドを用いた場合に、より優れた複合体形成が得られることに大きく関与しているという可能性を排除するために、相対的な粒子の大きさの測定(図11)および動的光散乱を用いて相対的な粒子数の測定(図12)を実施した。図11に示す通り、K16−VprNを使用すると、K16−mVprNに比べてDNA複合体の粒子サイズに有意な差は認められなかった。さらに、図12に示すように、DNAに対するペプチドの比率が高くなるに従って光散乱強度は増大する。しかし、図10と図12とを比較すると、レポーター遺伝子発現と光散乱強度は相関していないことがわかる。無論、DNAに対するペプチドのチャージ比率が3倍の時、K16−VprNペプチドは、K16−mVprNに比べて、光散乱強度の3倍の増加とレポーター遺伝子発現の少なくとも100倍の増加をもたらす。DNAに対するペプチドのチャージ比率が9倍の時、チャージ比率が3倍の時に比べて、光散乱強度は2倍増加する。しかし、かかる条件下では、レポーター遺伝子発現は、10倍増加するだけである。
【0027】
測定される光散乱強度と相対的なDNA複合体の量との間の相関関係を示すために(図13および図14)、プラスミドDNAをK16−VprNまたはK16−mVprNと一緒に用いてペプチド/DNA複合体を形成させた。続いて、複合体を16倍まで希釈して、動的光散乱測定に供した。光散乱強度が希釈率の増大につれて減少したが、複合体の相対的なサイズは、ほぼ一定に保たれていた。この観察は、光散乱強度がDNA複合体の相対的な量の測定可能な指標となることを示している。
【0028】
これらの結果は、観察されるK16−VprNペプチドによって生じる、レポーター遺伝子発現の配列特異的な増加は、粒子のサイズまたは粒子の量の増加に起因するものではないことを示唆する。したがって、特異的な因子によるVprN配列の認識に基づいてトランスフェクション過程において細胞性の機序が起こることが予測される。K16−VprN/プラスミドDNA複合体が核への移行の基質として核移行の機構によって認識されていると考えられ得る。さらに、このことは、観察されたトランスフェクション効率をもたらす核内でのDNAの蓄積の増大をもたらす。
【0029】
新規性に関して、以上の結果は以下のことを導く:
1.NLS配列に関与するトランスフェクション効率の配列特異的な増大をもたらす組成を有するDNA−ペプチド−脂質−複合体が作製された;
2.NLS配列の環状化により、DNA複合体のトランスフェクション効率がさらに増大する;
3.VprN配列の使用により、NLS配列特異的な様式で、トランスフェクションシステムの効率は劇的に増大する。
本発明は、K16ペプチドの使用によるトランスフェクション効率の改良方法に関する。さらに、本発明は、新規K16ペプチドを包含する。本出願は分子生物学および医科学分野に関するものである。
【0002】
非ウイルス性遺伝子送達システムのトランスフェクション機構は、種々の生物学的バリアを通過することを含む複雑な過程である。非ウイルス性ベクターのトランスフェクション効率を制限する1つの主要な要因は、核エンベロープである。核へのベクターの移行は結果的にトランスジーンの効率的発現を可能にする。
【0003】
プラスミドDNAに核エンベロープを通過させるための手法は、細胞の核原形質輸送機序を利用することである。1つの方法としては、NLS配列を有しかつ陽イオン性DNA結合ドメインを含むペプチドをDNAに非共有結合させることである。その結果、結合したNLS配列を核内へのDNAの核輸送を容易にする核輸送機序によって認識されると考えられる。
【0004】
非ウイルス性遺伝子送達システムでは、最もよく使用されるNLS配列の1つにシミアンウイルス40(SV40)大型T抗原(SV40−NLS)の126〜132のアミノ酸配列がある。しかし、この方法によるNLS配列特異的なトランスフェクション効率の向上は、確実に証明されているわけではない。
【0005】
本発明の目的は、プラスミドDNAの核への取り込みを向上させることであった。本発明において、合成ペプチドは、オリゴリジンDNA結合ドメインとSV40−NLSとを含むように構築された。さらに、プラスミドDNA、合成ペプチドおよび脂質からなる複合体が構築され、最適化された。
【0006】
合成ペプチドは、以下の配列を有するものを用いた:
上記全てのペプチドは、プラスミドDNAへのペプチドの結合用に16残基のリジンを有している。
【0007】
K16−NLSペプチドは、SV40−NLS配列(PKKKRKV)も含有する。K16−SLNペプチドは、K16−NLSと同じアミノ酸組成を有するコントロールぺプチドである。これは、同じDNA結合ドメインを有するがSV40NLS配列を逆向きで含んでいる。K16−Vprペプチドは、上記オリゴリジンDNA結合ドメインを有し、かつHIV I−Vprタンパク質のC末端ドメインに由来するNLS配列も有する。K16−VprNペプチドは、K16−Vprに類似しているが、HIV I−VprのN末端ドメインに由来するNLS配列を有しいる。K16−mVprNは、上記DNA結合ドメインと、3つの重要なアミノ酸残基を置換して構築したPprN−NLS−コントロール配列とを含むコントロールペプチドである。すでに述べたように、これらの改変は、カーゴの核移入を容易にする能力を欠損したペプチドをもたらす。
【0008】
さらに、16残基のリジン(K16)からなる合成ペプチドを、別のコントロールペプチドとして用いた。
【0009】
脂質混合リポフェクチンは、脂質として利用するのが好ましかった。
【0010】
プラスミドDNA、ペプチドおよび脂質を含む複合体を形成させ、ヒト結腸癌細胞(HCT 116)でのin vitroトランスフェクション実験に用いた。ルシフェラーゼリポーター遺伝子を、トランスフェクション効率を測定するために用いた。
【0011】
上記K16ペプチドの構築に加えて、本発明は、DNA−ペプチド−脂質複合体の構築を含む。したがって、重要なのは、DNAに対するペプチドのチャージ比率および脂質の適量を選択することによる複合体の構成成分率である。複合体形成の方法(濃度、容量、バッファーの種類、インキュベーション時間およびさらに混合物に添加される成分の順序等、図1〜3および図4〜6を参照のこと)は、該システムのトランスフェクション効率を決定する重要な因子でもある。
【0012】
各因子の最適化の後、適切な複合体成分率ならびに適切な複合体の形成方法が得られ、HCT116細胞へのトランスフェクションにより、レポーター遺伝子発現のNLS−配列特異的な増加が得られる。
【0013】
本発明は、チャージするDNAに対するペプチドの比率を選択することにより、比較的少量の脂質を添加したペプチド/DNA複合体に比べて不安定なペプチド/DNA複合体を作製することを含む。
【0014】
その結果としての配列特異的な遺伝子発現の増大は、DNAの核輸送の増加と相関関係にある。
【0015】
本発明の他の部分は、NLS−配列の安定化のための環状ペプチドの構築および非ウイルス性遺伝子送達システムの最適化への該環状ペプチドの利用である。
【0016】
SV40−NLS配列は、塩基性残基を比較的多く含むため、生理学的条件下でかなり強い正電荷を帯びる。トランスフェクション実験並びに生化学的研究の項に示すように、SV 40−NLSは、非ウイルス性遺伝子送達システムに用いられるプラスミドDNAと強い相互作用を有するであろう。SV 40−NLSのDNAへの結合は、核移行機序との相互作用においてNLSの立体構造的な妨害となり得る。さらに、NLSの二次構造もまた変化し、対応する因子によって核移行基質として認識される可能性もある。
【0017】
本発明は、SV 40−NLSの二次構造をペプチドの環状化により安定化させることを含む。SV 40−NLSは、その受容体であるインポーチン(importin)αに相互作用する際βシート構造を有する。NLS−環状化の基本は、2つのアンチパラレルなβシート配列を含む環状ペプチドの利用であった。
【0018】
本発明は、上述の環状ペプチド内でSV 40−NLSの再構築することを含む。その結果として、環状ペプチドは、2つのアンチパラレルなβシート配列を含んで構築されるが、その一方にはSV 40−NLSが含まれている。DNAにペプチドが結合するために、16残基のリジンは、SV 40−NLSの反対側に位置するβシートに共有結合させた。結果として得られる構築物(K16−CYC)は、環状NLS配列およびオリゴリジンDNA結合ドメインを含む合成ペプチドである。
【0019】
K16−CYCは以下の配列を有する:
さらに、本発明は、以下の2つのK16ペプチドを含む。1つは以下の39アミノ酸配列を含むペプチドであり:
KKKKKKKKKKKKKKKKGGGCNEWTLELLEELKNEAVRHF
もう一つは、以下の38アミノ酸配列を含むペプチドである:
KKKKKKKKKKKKKKKKGGGNEATLELLPELKNPAVRHF。
【0020】
プラスミドDNAと組み合わせること、ならびにプラスミドDNAと脂質と組み合わせることにより、これらのペプチドはトランスフェクション実験に適している。
【0021】
以下、本発明を種々の実施例により例証する。
【0022】
非ウイルス性遺伝子送達システムにおける K16−CYC ペプチドの利用
DNA−ペプチド−脂質複合体の最適化の上述の方法に基づいて、プラスミドDNA、K16−CYCペプチドおよびリポフェクチンを含む異種複合体を作製し、HCT116細胞のトランスフェクション実験に用いた。
【0023】
K16−CYCペプチドを用いたトランスフェクション後のレポーター遺伝子の発現が、SV 40−NLS配列の直鎖型を含有するK16−NLSペプチドに比べて顕著に増加したことが認められた(図7および図8参照)。
【0024】
非ウイルス性遺伝子送達システムにおける K16−VprN ペプチドの利用
プラスミドDNA、K16−VprNペプチドおよびリポフェクチンを含む複合体を作製し、HCT116細胞のトランスフェクション実験に用いた。他の適用においては、プラスミドDNAおよびK16−VprNペプチドを含む複合体も作製し、HCT116細胞のトランスフェクション実験に用いた。両適用において、K16−mVprNペプチドを、K16−VprNペプチドの代わりにコントロールペプチドとして用いた。結果は、コントロールペプチドを用いた実験に比べてレポーター遺伝子の発現が有意に増大していた(図9および図10)。
【0025】
NLS配列特異的なトランスフェクション効率の向上は、ペプチド/DNA複合体に脂質を添加しなかった場合により大幅に向上するということが観察された(図10)。K16−VprNペプチドは、K16−mVprNペプチドに比べて最大10倍のレポーター遺伝子発現レベルを示した。さらに、K16−VprNの場合は、K16−mVprNに比べて12分の1の量を用いると最大の遺伝子発現が得られた。
【0026】
観察されたトランスフェクション効率の向上が、K16−VprNペプチドを用いた場合に、より優れた複合体形成が得られることに大きく関与しているという可能性を排除するために、相対的な粒子の大きさの測定(図11)および動的光散乱を用いて相対的な粒子数の測定(図12)を実施した。図11に示す通り、K16−VprNを使用すると、K16−mVprNに比べてDNA複合体の粒子サイズに有意な差は認められなかった。さらに、図12に示すように、DNAに対するペプチドの比率が高くなるに従って光散乱強度は増大する。しかし、図10と図12とを比較すると、レポーター遺伝子発現と光散乱強度は相関していないことがわかる。無論、DNAに対するペプチドのチャージ比率が3倍の時、K16−VprNペプチドは、K16−mVprNに比べて、光散乱強度の3倍の増加とレポーター遺伝子発現の少なくとも100倍の増加をもたらす。DNAに対するペプチドのチャージ比率が9倍の時、チャージ比率が3倍の時に比べて、光散乱強度は2倍増加する。しかし、かかる条件下では、レポーター遺伝子発現は、10倍増加するだけである。
【0027】
測定される光散乱強度と相対的なDNA複合体の量との間の相関関係を示すために(図13および図14)、プラスミドDNAをK16−VprNまたはK16−mVprNと一緒に用いてペプチド/DNA複合体を形成させた。続いて、複合体を16倍まで希釈して、動的光散乱測定に供した。光散乱強度が希釈率の増大につれて減少したが、複合体の相対的なサイズは、ほぼ一定に保たれていた。この観察は、光散乱強度がDNA複合体の相対的な量の測定可能な指標となることを示している。
【0028】
これらの結果は、観察されるK16−VprNペプチドによって生じる、レポーター遺伝子発現の配列特異的な増加は、粒子のサイズまたは粒子の量の増加に起因するものではないことを示唆する。したがって、特異的な因子によるVprN配列の認識に基づいてトランスフェクション過程において細胞性の機序が起こることが予測される。K16−VprN/プラスミドDNA複合体が核への移行の基質として核移行の機構によって認識されていると考えられ得る。さらに、このことは、観察されたトランスフェクション効率をもたらす核内でのDNAの蓄積の増大をもたらす。
【0029】
新規性に関して、以上の結果は以下のことを導く:
1.NLS配列に関与するトランスフェクション効率の配列特異的な増大をもたらす組成を有するDNA−ペプチド−脂質−複合体が作製された;
2.NLS配列の環状化により、DNA複合体のトランスフェクション効率がさらに増大する;
3.VprN配列の使用により、NLS配列特異的な様式で、トランスフェクションシステムの効率は劇的に増大する。
Claims (10)
- 以下の、
プラスミドDNA、
合成ペプチド、
脂質、
を含む複合体を用いる、トランスフェクション方法。 - リポフェクチンを脂質として用いる、請求項1〜3のいずれか1項記載のトランスフェクション方法。
- DNAに対するペプチドのチャージ比率が0.7〜1.0である、請求項1〜4のいずれか1項記載のトランスフェクション方法。
- 脂質に対するプラスミドDNAの重量比が1〜2倍である、請求項1〜5のいずれか1項記載のトランスフェクション方法。
- 環状ペプチドである、上記のK16−CYCペプチド。
- 以下の配列、
KKKKKKKKKKKKKKKKGGGCNEWTLELLEELKNEAVRHF
を有する、K16−VprNペプチド。 - 以下の配列、
KKKKKKKKKKKKKKKKGGGNEATLELLPELKNPAVRHF
を有する、K16−mVprNペプチド。 - 請求項7〜9のいずれか1項記載のペプチドとプラスミドDNAとの、トランスフェクションへの使用。
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