ES2572833T3

ES2572833T3 - Proceso de producción de aceite microbiano que contiene ácidos grasos poliinsaturados

Info

Publication number: ES2572833T3
Application number: ES07873362.3T
Authority: ES
Inventors: Helia Radianingtyas; Adam M. Burja; Colin James Barrow
Original assignee: DSM Nutritional Products AG
Current assignee: DSM Nutritional Products AG
Priority date: 2006-08-01
Filing date: 2007-07-30
Publication date: 2016-06-02
Anticipated expiration: 2027-07-30
Also published as: WO2008129358A3; AU2007351658B2; JP2014158482A; JP2010511377A; CA2659603C; EP2082053A4; AU2007351658A1; EP2082053A2; EP2082053B1; CN101981201A; CA2659603A1; JP5889356B2; ZA200901192B; WO2008129358A8; JP5531324B2; CN105154481A; WO2008129358A2; US9023616B2; US20100285105A1; MX2009001346A

Abstract

Un procedimiento para preparar una composición lipídica, comprendiendo el procedimiento: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterotrófico que comprende un antagonista de la producción de ácido graso, en el que el microbio productor de aceite tiene una secuencia 18S, en el que la secuencia 18S tiene una identidad de al menos un 97 % con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, y donde el antagonista de la producción de ácido graso es el ácido oleico.

Description

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producen aceite desvelados tienen la capacidad de producción ácidos grasos insaturados, tales como lípidos que contienen la serie omega-3 de DHA, EPA y DPA, y la serie omega-6 de DPA y diversos antioxidantes tales como agentes carotenoides, carotenoides y xantófilas y fenólicos .

5 [0051] También se desvelan procesos para la producción de biomasa que contiene dichos compuestos. Además se desvelan procesos para preparar compuestos omega-3, omega-6 y carotenoides usando los microbios que producen aceite. También se desvelan procesos para la producción de aceites derivados de microbios (o de una sola célula).

[0052] Además, se desvelan los ácidos grasos y carotenoides producidos por el microbio productor de

10 aceitemicrobio productor de aceite desvelado y cualquier progenie (modificada genéticamente o de otro modo), diversos piensos, agentes nutracéuticos, agentes farmacéuticos y alimentos suplementados con los lípidos y antioxidantes, así como un proceso para usar estos compuestos como un aditivo para diversos piensos y alimentos.

[0053] La Patente de Estados Unidos n.º 5.130.242 de Barclay desvelaba un proceso de recogida e identificación

15 sistemática para aislar cepas de microorganismos con las siguientes características para la producción de ácidos grasos omega-3: 1) capaz de crecimiento heterótrofo; 2) producir un alto contenido de ácidos omega-3; 3) unicelulares; 4) producir un bajo contenido de ácidos casos convencionales y ácidos grasos omega-6; 5) células no pigmentadas, de color blanco o incorporadas; 6) termotolerantes (por ejemplo, capacidad para crecer por encima de 30 ºC); y 7) eurihalinas (por ejemplo, capacidad para crecer en un amplio intervalo de salinidades, pero

20 preferentemente en salinidad baja).

[0054] La divulgación ’242 también describe un proceso para la producción heterótrofa de productos microbianos de células completas o extraídos con una concentración elevada de ácidos grasos omega-3 fatty, que posteriormente se pueden usar en productos alimenticios para animales o seres humanos. Este proceso usa microorganismos 25 identificados mediante el proceso de recogida e identificación sistemática desvelado de los mismos. Estos microorganismos, que son del orden Thaustochytriales, se cultivan en grano molido. Para aumentar la producción de ácidos grasos omega-3, se usa estrés a baja temperatura y en niveles altos de oxígeno disuelto, así como la adición de antioxidantes, factores de crecimiento, vitaminas y fósforo. Los productos extraídos contienen concentraciones elevadas de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, C20:5w3, C22:5w3; y C22:6w3) y concentraciones bajas de

30 ácidos grasos omega-6 (por ejemplo, C20:4w6 y C22:5w6). De forma específica, las proporciones de los ácidos grasos C20:5w3 con respecto a C22:6w3 varían de 1:1 a 1:30. Las proporciones de ácidos grasos C22:5w3 con respecto al C22:6w3 varían de 1:12 a solamente cantidades traza de C22:5w3. Además, los microorganismos producen de un0,6 a un0.72 %de DHA, de un 0 a un5 %de DPA, y de un 0 a un 18,9 %deEPA, en peso deácido graso total.

35 [0055] La Patente de Estados Unidos n.º 6.451.567 de Barclay desvelaba un proceso para el crecimiento de Thraustochytrium y Schizochytrium en un medio sin cloruro (< 3 g/l) que contiene sales sódicas (por ejemplo, sulfato sódico). El medio sin cloruro da como resultado tamaños de agregado celular inferiores a 150 µm. El proceso desvelado produce microorganismos y extractos que son útiles en productos alimenticios para acuicultura. Algunos

40 componentes adicionales de los productos alimenticios incluyen harina de semillas de lino, de semillas de colza, de semilla de soja, y de aguacate. Los microorganismos pueden producir hasta 1,08 g de ácidos grasos omega-3 por litro de medio al día. La divulgación ’567 describe adicionalmente diversos medios de, que incluyen agua de mar, glucosa (1, 3, 5, o 10 g/l), extracto de levadura (0,01, 0,2, 0,4 y 5 g/l), puentes de nitrógeno regionales tales como hidrolizado de proteína (1 g/l), extracto de hígado (1 g/l), glutamato (5 g/l), glutamato monosódico (MSG) (3 g/l), y

45 sales adicionales, vitaminas traza y minerales (por ejemplo, KH2PO4, MgSO4, y extracto de gelatina).

[0056] La Patente de Estados Unidos n.º 6.582.941 de Yokochi et al. desvela una especie de Schizochytrium, cepa SR21 y otra cepa de Schizochytrium que pertenece a la misma especie que tiene la capacidad de producir fracciones de ácido graso que tienen una concentración elevada de DHA omega-3 y/o DPA omega-6 y una 50 concentración baja de EPA. Además, se desvelan métodos para cultivar tales microorganismos y aislar cables ácidos grasos. El medio usado contiene sal marina, extracto de levadura (0,2, 1,0, o 10 g/l), agua de macerado de maíz (0,5, 1,0, o 10 g/l), glucosa (10-120 g/l), además de sales adicionales (por ejemplo, NH4OAC, fosfatos). Las composiciones de ácido graso contienen de aproximadamente un 15 a un 20 % de DHA en peso de biomasa (aproximadamente un 28 % en peso de ácido graso total). Las composiciones se pueden usar en productos

55 alimenticios (por ejemplo, leche infantil).

[0057] La Patente de Estados Unidos n.º 6.607.900 de Bailey et al. desvelaba un proceso para el crecimiento de microorganismos eucariotas (por ejemplo, 20888 de la ATCC de Schizochytrium sp.) que son capaces de producir al menos un 20 % su biomasa como lípidos poliinsaturados (en particular ácidos grasos omega-3 y -6). El proceso

60 implica el cultivo de los microorganismos en un medio que contiene una fuente de carbono y nitrógeno. También se desvela el uso de niveles bajos de oxígeno disuelto (inferiores a un 3 %) y bajos niveles de ión cloruro (inferiores a 3 g/l) para aumentar la producción. Los microorganismos tienen una tasa de producción de lípido de al menos 0,5 g/l/h. La fracción lipídica es de un 15 a un 20 % de DHA en peso de biomasa (aproximadamente un 35 % en peso de los ésteres de metilo del ácido graso total).

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infecciones neonatales (Eur J Pediatr 162: 122-8), y tratamiento del dolor patológico mediante la atenuación directamente de los procesos neuronales y ganglionares que subyacen al dolor neuropático e inflamatorio (Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 68: 219-24).

5 2. Thraustochytriaceae

a) ONC-T18

[0065] Un ejemplo de un microbio productor de aceitemicrobio productor de aceite es el la cepa ONC-T18 del

10 microorganismo marino. La cepa ONC-T18 del microorganismo marino, como se desvela en el presente documento, se recogió como parte de una cepa de aislamiento microbiano que produce PUFA, con más de 60 cultivos puros aislados (para detalles véase la tabla 7). Además, la cepa ONC-T18 se aisló de las hojas de hierbas de pantano salado en el área de Advocate Harbor, Bahía de Fundy, nueva Escocia, Canadá. A través de exámenes microscópicos, técnicas de purificación de cultivo en serie, y técnicas de secuenciación de ADN, se encontró que la

15 cepa era un solo microorganismo perteneciente al género Thraustochytrium. Todas las cepas y dos cultivos de comparación de la ATCC (ATCC 20891 y MYA-1381) se cultivaron en glucosa al 0,5 %, peptona al 0,2 %, extracto de levadura al 0,2 % en agua marina (SW) y se sometió a análisis de cromatografía de gases (éster de metilo del ácido graso, FAME).

20 [0066] La Figura 6 muestra un diagrama de árbol ramificado, filogenético propuesto de la relación entre ONC-T18, y otros miembros del orden Labyrinthulida, basándose en la comparación de secuencias obtenidas a través del uso del gen del ARN ribosómico de 18S altamente conservado.

[0067] La Figura 4 muestra un árbol filogenético desarrollado usando técnicas de análisis Neighbour-Joining y

25 Bootstrap para determinar la relación de ONC-T18 con otros miembros de la familia Thraustochytriidae, usando de nuevo el gen del ARN ribosómico de 18S secuenciado directamente y comparando con otras secuencias dentro del dominio público que usando similitud de matrices.

[0068] La cepa ONC-T18 se aisló originalmente usando técnicas clásicas de cebo de polen de pino, seguido de

30 cultivo en medio selectivo. De forma específica, se preparó un medio de nutrientes que contenía 5 g l-1 de glucosa, 2 g l-1 de peptona, 2 g l-1 de extracto de levadura a 1 l de agua de mar filtrada con un filtro de 0,2 µm. El perfil de ácido graso de ONC-T18 se determinó a continuación usando el método de extracción de Bligh y Dyer y técnicas de cromatografía de gases para PUFA. Los resultados de cromatografía demostraron la capacidad de esta cepa para producir cantidades crecientes de ácidos grasos totales (TFA), DHA, así como cantidades notables de EPA y DPA

35 (ácidos grasos tanto n-3 como n-6).

[0069] Los microbios que producen aceite desvelados, incluyendo ONC-T18, se pueden usar en un proceso para preparar un lípido o grasa que contiene DHA, EPA y DPA, pero no limitados a las cepas de ONC-T18 o PTA-6245 mencionadas anteriormente, ni a cualquier derivación de dicha cepa ya sea a través de modificación genética,

40 mutagénesis química, adaptación fermentativa o cualquier otro medio para producir mutantes de la cepa, con lo que el producto de estas modificaciones tiene características genéticas, morfológicas y/o funcionales tales como las de los microbios que producen aceite, como se desvela en el presente documento.

[0070] Se desvelan microbios que producen aceites que pueden producir una composición lipídica que tiene

45 propiedades de clase lipídica distintivas, y la solución al problema del mantenimiento de una fuente estable, fiable y económica para un lípido de este tipo que tiene una funcionalidad elevada y un valor adicional de acuerdo con el mismo. Por lo tanto, en el presente documento se desvelan cepas de tipo silvestre que producen la serie (n-3) de DHA y la serie (n-6) de DPA hasta un mayor grado así como cepas variantes y recombinantes diseñadas para producir estos ácidos grasos poliinsaturados hasta un mayor grado. Tales microorganismos variantes o

50 recombinantes incluyen los diseñados para que tengan un contenido más elevado de dichos lípidos que los producidos con la cepa de tipo silvestre original, cuando se cultiva usando las mismas condiciones y medios. Además, también se incluyen los microorganismos diseñados para producir un contenido de lípido con cantidades similares de la serie (n-3) de DHA, EPA y la serie (n-6) de DPA que se pueden seleccionar, en comparación con las cepas correspondientes de tipo silvestre, usando de forma eficaz sustratos que tienen un rendimiento de coste

55 superior.

[0071] También se desvelan composiciones que comprenden microbios que producen aceite del orden Thraustochytriales en las que el microbio productor de aceitemicrobio productor de aceite produce ácidos grasos insaturados. Los ácidos grasos poliinsaturados pueden ser, por ejemplo, ácidos grasos omega-3 u omega-6, tales

60 como DHA y DPA.

[0072] También se desvelan composiciones que comprenden uno o más microbios que producen aceite del orden Thraustochytriales en las que el microbio(s) que produce aceite produce ácidos grasos específicos cuando su crecimiento se suplementa con antagonistas de producción de ácido graso.

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organismos pueden ser como se describe en el presente documento. De forma específica, la comparación de la SEQ ID NO: 1 con secuencias de ácidos nucleicos encontradas en la base de datos genómica, GenBank (Centro Nacional de Información Biotecnológica, Instituto Nacional de la Salud, Bethesda, MD, USA) usando el algoritmo BLAST (Herramienta de Búsqueda Básica de Alineamiento Local) identificado en la SEQ ID NO: 1 como la más

5 relacionada (similitud de un 91 %) con varias especies de Traustoquítridos eucariotas, muy relacionados con CHN-1 [AB126669] de Thraustochytrium sp. (similitud de un 94,5 %) y N1-27 [AB073308] de Thraustochytriidae sp. (similitud de un 95,5 %), y la más relacionada con [AF265338] de Thraustochytrium striatum (similitud de un 97,5 %).

3. Plantas

[0091] Los antagonistas de producción de ácido graso también se pueden usar para influir en las proporciones de producción de aceite en plantas que producen aceite, incluyendo especies tanto transgénicos como de origen natural de incluyendo cultivos representativos tales como colza, linaza, soja y girasol. Algunos métodos de incorporación de dichos antagonistas incluyen, por ejemplo, riego en zonas que rodean a las plantas para incorporación en las plantas 15 a través de su sistema radiculares, adición como un principio activo en pulverizaciones para incorporación directa en las células de las plantas. Además también se puede considerar un método eficaz la inmersión directa, vaporización

o inyección de estos compuestos en las células de la planta a través de cualquiera de los estomas o por vía subcutánea.

4. (1) Similitudes de secuencias

[0092] Como se discute en el presente documento, se entiende que el uso de los términos homología e identidad se refieren a lo mismo que similitud. Por lo tanto, por ejemplo, si el uso del término homología se usa entre dos secuencias no naturales, se entiende que no es necesario indicar una relación evolutiva entre estas dos secuencias,

25 sino más bien buscar la similitud correlación entre secuencias de ácidos nucleicos. Muchos de los métodos para determinar la homología entre dos moléculas relacionadas en forma evolutiva se aplican de rutina a cualquiera de dos o más ácidos nucleicos o proteínas con la finalidad de medir la similitud de secuencias independientemente de de sí se relacionan o no de forma evolutiva.

[0093] En general, se entiende que una forma de definir cualquier variante y derivado conocido por los que pueden aparecer, de los genes y proteínas desvelados en el presente documento, es a través de la definición de las variantes y derivados en términos de homología con respecto a secuencias conocidas específicas. Esta identificación de secuencias en particular desveladas en el presente documento también se discute en cualquier parte en el presente documento. En general, las variantes de ácidos nucleicos y proteínas desveladas en el presente

35 documento por lo general tienen una homología de aproximadamente un 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o un 99 por ciento con respecto a la secuencia o la secuencia narrativa indicadas. Los expertos en la materia entienden rápidamente como determinar la homología de dos proteínas o ácidos nucleicos, tales como genes. Por ejemplo, la homología se puede calcular después del alineamiento de las consecuencias de modo que la homología se encuentra en su nivel más elevado.

[0094] Otra forma de calcular la homología puede ser con algoritmos publicados. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación se puede realizar con el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981, con el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, con la búsqueda con el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988,

45 con implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Grupo de Informática Genética, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

[0095] Los mismos tipos de homología se pueden obtener parásitos nucleicos por ejemplo mediante los algoritmos desvelados en Zuker, M. Science 244: 48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183: 281-306, 1989. Se entiende que por lo general se puede usar cualquiera de los métodos y que, en ciertos casos, los resultados de estos diversos métodos pueden diferir, pero el experto en la materia entiende que si la identidad se encuentra con al menos uno de estos métodos, se diría que las secuencias tienen la identidad indicada, y se desvelan en el presente documento.

[0096] Por ejemplo, como se usa en el presente documento, una secuencia mencionada como con un porcentaje de homología en particular con respecto a otra secuencia se refiere a secuencias que tienen la homología mencionada tal como se calcula con uno cualquiera o más de los métodos de cálculo que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, una primera secuencia tiene una homología de un 80 por ciento, como se define en el presente documento, con respecto a una segunda secuencia si la primera secuencia se calcula para que tenga una homología de un 80 por ciento por respuesta la segunda secuencia usando el método de cálculo Zuker incluso si la primera secuencia no tiene una homología de un 80 por ciento con respecto a la segunda secuencia tal como se calcula con cualquiera de los otros métodos de cálculo. Como otro ejemplo, una primera secuencia tiene una homología de un 80 por ciento, como se define en el presente documento, con respecto a una segunda secuencia si la primera secuencia se calcula 65 para que tenga una homología de un 80 por ciento con respecto a la segunda secuencia usando tanto el método de

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diversos parámetros, como se desvela en el presente documento, las composiciones se pueden manipular para producir, por ejemplo, un mejor rendimiento de DHA, EPA o DPA. Por ejemplo, la manipulación puede no producir más gramos reales, pero la manipulación puede producir una mejor proporción de DHA o DPA con respecto a EPA y otros PUFA deseados, que debe ser deseable desde un punto de vista de la purificación. Algunas condiciones

5 variables que se pueden usar para aumentar el rendimiento de DHA, EPA o DPA también se discuten en el presente documento.

[0109] Se entiende que la composición del lípido producido por el microbio productor de aceite se pueden manipular basándose en la composición del medio de crecimiento en la que se multiplica el microbio productor de aceite. Cambiando tanto las proporciones como los tipos de fuentes de carbono con respecto a nitrógeno, la composición química de la salud usada y mediante la adición de ciertos compuestos químicos que influyen en la producción de ácido graso, se pueden producir perfiles de ácido grado específico similares a los de los aceites de pescados seleccionados. Por ejemplo, la manipulación puede no producir más gramos reales, pero la manipulación puede producir un perfil de TFA similar al de, por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceite de atún o de bonito o aceite

15 de pescado a 18:12 clásico.

[0110] En el presente documento se desvelan métodos para alterar las proporciones de ácido graso producido por microbios que producen aceite complementando la composición del medio de crecimiento en la que se multiplica el microbio productor de aceite con uno o más antagonistas de producción de ácido graso. Las proporciones de ácido graso se pueden alterar con o sin alteración del contenido total de ácido graso del microbio productor de aceite. Por ejemplo, la proporción de aceites omega n-3 y/o n-6 con respecto a aceites omega n-9 se puede aumentar complementando el medio de un microbio productor de aceite con un antagonista de producción de ácido graso.

[0111] También se desvelan métodos para alterar las proporciones de ácido graso producidas por los microbios que

25 producen aceite sin alterar el contenido total de ácido graso del microbio productor de aceite, complementando en la composición del medio de crecimiento en el que se multiplica el microbio productor de aceite con uno o más antagonistas de producción de ácido graso.

[0112] La Figura 1 nuestra un ejemplo de una ruta metabólica para los diversos PUFA producidos por el microorganismo eucariota desvelado, coherente con el seguimiento del metabolitos de éster de metilo del ácido graso. Algunas proteínas que se pueden identificar dentro de las rutas que, como se desvela en el presente documento, son la policétido sintasa, usando por ejemplo, un primer estudio degenerativo, (Metz et al. (2001) Science 293: 290-3 y Kaulmann y Hertweck (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 1866-9). También se pueden identificar algunas elongasas y desaturasas, usando por ejemplo una sonda de hibridación y/o cebadores

35 degenerativos o dirigidos. También se pueden identificar algunas ácido graso sintasas usando, por ejemplo, una sonda de hibridación y/o un cebador degenerativo.

5. Crecimiento y cultivo

[0113] Se realizó un estudio fenotípico en microplaca que incluía carbono; nitrógeno (nitrógeno peptídico); fósforo y azufre; osmolitos, y pH.

[0114] Se usó un método de matriz ortogonal (Taguchi) para determinar las configuraciones de los medios y variaciones óptimas en la concentración de nitrógeno, carbono y sal (Joseph J y Piganatiells JR (1998) IIE Trans, 20:

45 247-254).

[0115] Cuando se fermenta ONC-T18, se encontró que si se aumenta la agitación o el dO2, se aumenta la producción de biomasa y de TFA pero disminuye la de DHA. Si se disminuye la agitación o el dO2, disminuye la biomasa celular (g) y disminuye TFA pero aumenta DHA y también se reduce C16:0, C16:1 y C18:1.

[0116] Si se aumenta la temperatura, se aumenta la producción de biomasa y de TFA pero disminuye DHA. Si se disminuye la temperatura, disminuye la biomasa celular (g) y disminuye TFA pero aumenta DHA, pero se reduce C16:0, C16:1 y C18:1.

55 [0117] La biomasa celular derivada del microbio productor de aceite desvelado se puede obtener por inoculación de un medio de agua marina natural o artificial, que contiene de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 100 % de agua marina. Este microbio productor de aceite es capaz de usar diversos componentes nutricionales dentro de este medio. Algunos ejemplos de una fuente de carbono usadas dentro del medio son carbohidratos tales como glucosa, fructosa, dextrosa, lactulosa, galactosa, maltotriosa, maltosa, lactosa, glicógeno, gelatina, almidón (de maíz o trigo) así como derivados de azúcar tales como acetato, m-inositol (derivado de agua de macerado de maíz), ácido galacturónico (derivado de pectina), L-fucosa (derivada de galactosa), gentiobiosa, glucosamina, α-D-glucosa1-fosfato (derivado de glucosa), celobiosa (derivada de celulosa), dextrina (derivada de maíz) y α-ciclodextrina (derivada de almidón) y polioles tales como maltitol, eritritol, adonitol y ácidos oleicos tales como glicerol y Tween 80 y amino azúcares tales como N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glucosamina y N-acetil-β-D-manosamina. Aunque

65 algunos ejemplos de una fuente de nitrógeno son fuentes de nitrógeno natural tales como peptona, extracto de

levadura, extracto de malta y harina de pescado, o una fuente de nitrógeno orgánico tal como glutamato sódico, pero no se limitan a los mismos. Además, si fuera necesario, como nutrientes traza se pueden usar fosfatos, tales como fosfato potásico, y fosfato sódico, sales inorgánicas tales como sulfato de amonio, bicarbonato sódico, ortovanadiato sódico, bromato potásico, molibdato sódico, ácido selenioso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de cinc,

5 cloruro de cobalto, cloruro de hierro, cloruro de manganeso y cloruro cálcico, en combinación con el compuesto de quelación, ácido etilendiamintetraacético, sólo o en combinación con vitaminas tales como clorhidrato de piridoxina, clorhidrato de tiamina, pantotenato cálcico, ácido p-aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico y vitamina B12. Después de preparar el medio, el pH se ajusta entre 3,0 y 10,0 usando ácido o base para ajustar, cuando sea apropiado, por ejemplo entre pH 4,0 y 6,5, y el medio se esteriliza en autoclave, por ejemplo. El cultivo se puede realizar de 1 a 30 días, de 1 a 21 días, de 1 a 15 días, de 1 a 12 días, de 1 a 9 días, o preferentemente de 3 a 5 días a temperaturas entre 4 y 30 ºC, preferentemente de 18 a 28 ºC, mediante cultivo con aireación-agitación, cultivo con agitación, cultivo estacionario, cultivo discontinuo, cultivo continuo, cultivo discontinuo o centrifugación, o cultivo ondulatorio, o similares.

15 [0118] Las siguientes condiciones son un ejemplo de condiciones que pueden permitir la producción de un conjunto de lípidos con rendimientos que permitan su uso con comodidad. La investigación de las condiciones de cultivo para ONC-T18 revelaron que el microbio productor de aceite desvelado en el presente documento crece bien en agua de mar natural o artificial o en un medio que contiene una concentración inferior a un 5 % de agua de mar natural o artificial. Algunas fuentes de carbono y nitrógeno añadidas al medio pueden ser las usadas convencionalmente como se ha descrito anteriormente. La fuente de nitrógeno ya sea de naturaleza natural u orgánica es relativamente igual y la concentración total de nitrógeno dentro del medio se mantiene constante. Estas fuentes se añaden al medio en concentraciones estándar. Si estas condiciones se satisfacen, se produce poca influencia del contenido de lípido, proporciones o la cantidad de DHA, DPA y EPA acumulados, como se desvela en el presente documento.

25 [0119] Para fermentación de concentración elevada de ONC-T18, es posible usar varios métodos para aumentar las tasas tanto de biomasa celular como de producción de lípido. Estos incluyen, el aumento de la concentración tanto de carbono, nitrógeno en el medio (a una proporción entre 6:1 y 15:1, preferentemente entre 6:1 y 13:1 y a temperaturas entre 4 y 30 ºC, preferentemente de 18 a 28 ºC) desde el intervalo de 5 g l-1 a 60 g l-1 hasta el intervalo de 100 g l-1 y 160 g l-1 y desde el intervalo de 4 g l-1 a 10 g l-1 hasta el intervalo de 40 g l-1 a 60 g l-1, respectivamente. Usando este método, la proporción de biomasa y lípido producidos también aumenta a tasas comparables. Además, es posible aumentar la producción de lípido a través del uso de aumento de fuentes de carbono desde el intervalo de 5 g l-1 a 60 g l-1 hasta el intervalo de 100 g l-1 y 160 g l-1, mientras que la fuente de nitrógeno permanece constante. Además, es posible aumentar la producción de biomasa a la vez que se mantiene el contenido de lípido, a través del uso de cantidades crecientes de fuentes de nitrógeno desde el intervalo de 10 g l-1 a 60 g l-1 mientras que la fuente

35 de carbono permanece constante. Además, la experimentación ha determinado que la producción de biomasa y lípido aumenta en gran medida con el aumento de la agitación desde el intervalo de 100 y 1000 rpm, mejor entre 350 y 600 rpm y de forma óptima entre 350 y 450 rpm, con solamente una disminución mínima del contenido de lípido y ninguna disminución de los perfiles de ácido graso, con agitación particularmente relevante en las etapas iniciales de fermentación heterotrófica. La experimentación también ha determinado que la producción óptima del lípido se consigue cuando el contenido de oxígeno disuelto del medio de cultivo se mantiene entre 1 y 10 %, de forma óptima a un 5 % durante la etapa de acumulación del lípido de la fermentación semicontinua clásica de estos microorganismos (véase la Figura 8). Por último, la adición de acetato, elementos traza, metales y vitaminas al medio de producción (como se ha mencionado anteriormente) aumenta la producción de DHA, EPA y DPA con respecto a otros ácidos grasos sin disminuir los valores totales de lípido.

45 [0120] Realizando la fermentación heterotrófica como se ha descrito anteriormente, es posible producir biomasa celular de forma coherente que produce un lípido que contiene la serie (n-3) de DHA en un cultivo de alta concentración de no menos de 5 g y más preferentemente no menos de 20 g/l de medio (véase la Figura 8). Además, la experimentación ha mostrado que la mayoría de estos lípidos se acumulan durante las etapas exponencial/de transición posteriores de cultivo, después de que se hayan alcanzado los niveles máximos de biomasa. Además, durante el proceso de fermentación, el contenido del lípido por lo general no se incluye por debajo de un 25 % de la biomasa total, por lo general maximizándose a aproximadamente un 80 %. El cultivo en las condiciones mencionadas anteriormente se puede realizar usando un fermentador de agitación convencional. También es posible usar fermentador de columna de burbujas (cultivos discontinuos o continuos), o un fermentador

55 ondulatorio.

[0121] La recogida de biomasa celular antes de su procesamiento para separación del lípido se puede realizar usando diversos métodos convencionales tales como centrifugación (tal como centrifugas de eyección de sólido) o filtración (tal como filtración de flujo cruzado) y también pueden incluir el uso de un agente de precipitación para la recogida acelerada de la biomasa celular (tal como fosfato sódico, cloruro cálcico o poliacridamida).

a) Antagonistas de la Producción de Ácido Graso

[0122] El medio usado para cultivar los microbios que producen aceite desvelados también puede comprender 65 antagonistas de producción de ácido graso. Los antagonistas de la producción de ácido graso pueden ser

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1. Métodos para preparar lípidos

[0155] Se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite que comprende uno o más microorganismos de la familia Thraustochytriaceae, y aislar la 5 composición lipídica.

[0156] También se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso. [0157] También se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso, que comprende adicionalmente el aislamiento de la composición lipídica.

[0158] También se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso,

15 en los que la proporción de ácidos grasos omega-3 y omega-6 con respecto a ácidos grasos omega-9 aumenta.

[0159] También se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso, en los que la proporción de ácidos grasos omega-3 y omega-6 con respecto a ácidos grasos omega-9 se altera en comparación con un control como se muestra en la Figura 11.

[0160] También se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso, en los que la proporción de ácidos grasos omega-3 y omega-6 con respecto a ácidos grasos omega-9 aumenta, en

25 los que el contenido total de ácido graso no se altera.

[0161] También se desvelan métodos con los que el perfil de ácido graso de dicho organismo se pueden modificar para aumentar por ejemplo la concentración de EPA a través del suplemento del medio de fermentación o tales composiciones químicas usadas en la fermentación y producción de ácidos omega-3 y omega-6, con suplementos nutricionales, estímulos químicos e inhibidores que incluyen directamente en la ruta metabólica de ONC-T18. Se describe que estas enzimas tienen de forma específica actividades de elongasa, desaturasa o ácido graso sintasa. Hasta la fecha, el conocimiento de los inventores es que este es el primer caso de compuestos químicos que se han identificado específicamente que cuando se combinan (ya sea a través de fermentación o en puntos temporales específicos) con el medio de fermentación, modifican el perfil del ácido graso. Algunos ejemplos de compuestos de

35 este tipo incluyen compuestos intermedios de ácido graso presentes dentro de la ruta de biosíntesis de lípido de estos microorganismos en particular, tales como ácido oleico (véase la Figura 14), que cuando se añaden al medio de fermentación dan como resultado un aumento del contenido de EPA dentro de las células.

[0162] Al contrario que los datos experimentales de Metz et al. (2001), en los que se documentó la incorporación de ácido oleico en una Schizochytrium sp., no se encontró que se produjera conversión de este producto en ácido graso poliinsaturado. En este caso, a través del uso de ácido oleico etiquetado con 13C, el carbono 13C que se origina en el ácido oleico enriquecido se encontró en ácidos grasos poliinsaturados posteriores y constituía el resto de la concentración de EPA elevada. Esto demuestra que la incorporación de ácidos grasos intermedios en el medio de cultivo no solamente da como resultado una incorporación satisfactoria en las células sino también una incorporación

45 satisfactoria en el sistema de síntesis activa de desaturasa, elongasa y ácido graso sintasa.

[0163] Una diversidad de procedimientos se puede usar en la recuperación de la biomasa celular resultante a partir de fermentación en diversos medios de cultivo, tales como mediante filtración o centrifugación. A continuación, las células se pueden lavar, congelar, liofilizar, o secar por pulverización y almacenar en una atmósfera no oxidante para eliminar la presencia de oxígeno, antes de su incorporación en un alimento o producto alimenticio procesado.

[0164] Los lípidos celulares que contienen los PUFA (n-3) DHA, EPA y (n-6) DPA también se pueden extraer a partir de los biomasa celular tales como extracción con fluido supercrítico, o mediante extracción con disolventes tales como cloroformo, hexano, cloruro de metileno, o metanol, y el extracto resultante se evapora en condiciones de 55 presión negativa para producir una muestra de material lipídico concentrado. Los PUFA omega-3 y omega-6 se pueden concentrar adicionalmente mediante hidrólisis de los lípidos y concentración de la fracción altamente insaturada usando métodos tradicionales tales como aducción de urea o destilación fraccionaria, cromatografía en columna, o mediante fraccionamiento con fluido supercrítico. A continuación, las células se pueden romper o lisar y los lípidos se pueden extraer en aceites vegetales o animales (por ejemplo, aceites de pescado). Los aceites extraídos se pueden refinar con procesos bien conocidos usados de forma rutinaria para refinar aceites vegetales (por ejemplo, mediante refinado químico o físico). Estos procesos de refinamiento eliminar impurezas de los aceites extraídos antes de su uso o de su venta, aceites comestibles. Después del refinado, los aceites se pueden usar directamente como aditivo alimentario o de alimento para producir productos enriquecidos en omega-3 y/o omega-6. Como alternativa, en aceite se puede procesar y purificar adicionalmente como se expone a continuación y se 65 pueden usar a continuación en las aplicaciones mencionadas anteriormente y también en aplicaciones

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análogos de nucleótidos. Tales conjugados incluyen, pero no se limitan a, restos lipídicos tales como un resto colesterol. (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556, 1989).

[0194] Una interacción de Watson-Crick es al menos una interacción con la cara de Watson-Crick de un nucleótido,

5 análogo de nucleótido, o sustituto de nucleótido. La cara de Watson-Crick de un nucleótido, análogo de nucleótido, o sustituto o nucleótido incluye las posiciones C2, N1, y C6 de un nucleótido, análogo de nucleótido, o sustituto de nucleótidos basados en purina y las posiciones C2, N3, C4 de un nucleótido, análogo de nucleótido, sustituto o nucleótidos basados en pirimidina. [0195] Una interacción de Hoogsteen es la interacción que se produce en la cara Hoogsteen de un nucleótido o análogo de nucleótido, que se expone en el surco principal del ADN de doble hélice. La cara de Hoogsteen incluye la posición N7 y grupos reactivos (NH2 u O) en la posición C6 de nucleótidos de purina.

b) Secuencias

15 [0196] Hay una diversidad de secuencias relacionadas con, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1, así como cualquier otro ácido nucleico y proteína desvelados en el presente documento que se pueden desvelar en GenBank.

[0197] En el presente documento se proporciona una diversidad de secuencias y estas y otras se pueden encontrar en GenBank, en www.pubmed.gov. Los expertos en la materia entienden cómo resolver las discrepancias y diferencias de las secuencias y cómo ajustar las composiciones y métodos relacionados con una secuencia en particular con otras secuencias relacionadas. Los cebadores y/o sondas se pueden diseñar para cualquier secuencia dada la información desvelada en el presente documento y conocida en la técnica.

c) Cebadores y sondas

25 [0198] Se desvelan composiciones que incluyen cebadores y sondas, que son capaces de interactuar con los genes que se desvelan en el presente documento. En ciertas realizaciones, los cebadores se usan para apoyar las reacciones de amplificación de ADN. Por lo general, los cebadores serán capaces de extenderse de una manera específica de secuencia. La extensión de un cebador de una manera específica de secuencia incluye cualquier método en el que la secuencia y/o la composición de la molécula de ácido nucleico a la que se hibrida el cebador se hibrida o de otra manera se asocia dirige o influye en la composición o secuencia del producto producido por la extensión del cebador. Por lo tanto, la extensión del cebador de una manera específica de secuencia incluye, pero no se limita a, PCR, secuenciación de ADN, extensión dl ADN, polimerización de ADN, transcripción de ARN, o transcripción inversa. Son preferentes las técnicas y condiciones que amplifican el cebador de una manera

35 específica de secuencia. En ciertos aspectos, los cebadores se pueden usar como sondas específicas de especies o género para el Thraustochytrium mencionado en el presente documento. En este caso, los cebadores se diseñarían para que fueran específicos para el microorganismo eucariota, con las reacciones de PCR realizadas posteriormente. La presencia de especies diana se determinarían a continuación mediante formación satisfactoria de producto de PCR. En ciertos aspectos, los cebadores también se pueden usada para reacciones de amplificación de ADN, tal como PCR o secuenciación directa. Se entiende que en ciertos aspectos los cebadores también se pueden extender usando técnicas no enzimáticas, en las que, por ejemplo, los nucleótidos u oligonucleótidos usados para extender el cebador se modifican de de un modo tal que reaccionarán químicamente para extender el cebador de una manera específica de secuencia. Por lo general, los cebadores desvelados se hibridan con el ácido nucleico o región del ácido nucleico o se hibridan con el complemento del ácido nucleico o complemento de una región del

45 ácido nucleico.

d) Suministro de Ácido Nucleico

[0199] En los métodos descritos anteriormente que incluyen la administración y captación de ADN exógeno en las células de un sujeto (es decir, transducción o transfección genética), los ácidos nucleicos desvelados pueden estar en forma de ADN o ARN desnudo, o los ácidos nucleicos pueden estar en un vector para suministro de los ácidos nucleicos a las células, con lo que el fragmento de ADN que codifica el anticuerpo está bajo la regulación transcripcional de un promotor, como entendería bien un experto habitual en la materia. El vector puede ser una preparación disponible en el mercado, tal como un vector de adenovirus (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval,

55 Quebec, Canadá). El suministro del ácido nucleico o vector a las células se puede realizar a través de una diversidad de mecanismos. Como uno ejemplo, el suministro se puede realizar a través de un liposoma, usando preparaciones de liposomas disponibles en el mercado tales como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), así como otros liposomas desarrollados de acuerdo con procedimientos convencionales en la técnica. Además, el ácido nucleico o vector desvelados se puede enviar in vivo mediante electroporación, la tecnología para la que está disponible en Genetronics, Inc. (San Diego , CA), así como por medio de una máquina de SONOPORACIÓN (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).

[0200] Como un ejemplo, el suministro del vector se puede realizar a través de un sistema viral, tal como un sistema 65 de vector retroviral que puede empaquetar un genoma retroviral recombinante (véase por ejemplo, Pastan et al.,

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determinadas construcciones de la región del promotor y/o potenciador puede ser activa en todos los tipos de células eucariotas, incluso si solamente se expresa en un tipo particular de célula en un momento en particular. Un promotor preferente de este tipo es el promotor de CMV (650 pb). Otros promotores preferentes son promotores de SV40, citomegalovirus (promotor de longitud completa), y vector retroviral LTF.

5 [0207] Se ha demostrado que todos los elementos reguladores específicos se pueden clonar y usar para construir vectores de expresión que se expresan de forma selectiva en tipos de células específicas tales como células de melanoma. El promotor de la proteína acética fibrilar glial (GFAP) se ha usado para expresar genes de forma selectiva en células de origen glial.

[0208] Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (células de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas o nucleadas) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que pueden influir en la expresión del ARNm. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la porción no traducida de la proteína del factor tisular que codifica el ARNm. Las

15 regiones sin traducir en la posición 3’ también incluyen sitios de terminación de la transcripción. Es preferente que la unidad de transcripción también contenga una región de poliadenilación. Un beneficio de esta región es que aumenta la probabilidad de que la unidad transcrita se procese y se transporte como ARNm. La identificación y uso de señales de poliadenilación en construcciones de expresión están bien establecidos. Es preferente que las señales de poliadenilación homólogas se usen en las construcciones transgénicas. En ciertas unidades de transcripción, la región de poliadenilación se deriva de la señal temprana de poliadenilación de SV40 y consta de aproximadamente 400 bases. También es preferente que las unidades de transcritas contengan otras secuencias convencionales o las

o en combinación con las secuencias anteriores para mejorar la expresión, o la estabilidad de, la construcción.

b) Marcadores

25 [0209] Los vectores virales pueden incluir secuencia de ácido nucleico que codifica un producto marcador. Este producto marcador se usa para determinar si el gen se ha suministrado a la célula y una vez suministrado si se está expresando. Algunos genes marcadores preferentes son el gen lacZ de E. coli, que codifica β-galactosidasa, y proteína fluorescente de color verde.

[0210] En algunas realizaciones el marcador puede ser un marcador seleccionable. Algunos ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina quinasa, neomicina, el análogo G418 de neomicina, hidromicina, y puromicina. Cuando tales marcadores seleccionables se transfieren de forma satisfactoria en una célula hospedadora de mamífero, la célula hospedadora

35 de mamífero transformada puede sobrevivir si se coloca bajo presión selectiva. Hay dos categorías distintas de regímenes de selección usadas ampliamente. La primera categoría se basa en el metabolismo de la célula y el uso de una línea celular mutante que carece de la capacidad de crecer independiente de un medio suplementado. Dos ejemplos son: células CHO DHFR y células LTK de ratón. Estas células carecen de la capacidad de crecer sin la adición de nutrientes tales como timidina o hipoxantina. Dado que estas células carecen de ciertos genes necesarios para una ruta de síntesis de nucleótidos completa, no pueden sobrevivir a menos que se proporcionen los nucleótidos que faltan en un medio suplementado. Una alternativa al suplemento de los medios es introducir un gen de DHFR o TK intacto en células que carecen de los respectivos genes, alterando de este modo sus requisitos de crecimiento. Las células individuales que no se transformaron con el gen DHFR o TK no serán capaces de sobrevivir en medios no suplementados.

45 [0211] La segunda categoría es la selección dominante que se refiere a un esquema de selección usado en cualquier tipo celular y no requiere el uso de una línea celular mutante. Estos esquemas por lo general usan un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Esas células que tienen un gen nuevo expresarían una proteína que confiere resistencia al fármaco y sobrevivirían a la selección. Algunos ejemplos de una selección dominante de este tipo usan los fármacos neomicina, (Southern P. y Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327,1982), ácido micofenólico, (Mulligan, R.C. y Berg, P. Science 209: 1422, 1980) o higromicina, (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413, 1985). Los tres ejemplos usan genes bacterianos bajo control eucariota para conferir resistencia al fármaco G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, apropiados, respectivamente. Otros incluyen el análogo de neomicina G418 y puramicina.

55

5. Péptidos a) Variantes de proteína

[0212] Como se discute en el presente documento hay numerosas variantes de las proteínas del organismo desvelado que se conocen y se contemplan en el presente documento. Además de la cepa de Thraustochytriales funcional conocida hay derivados de las proteínas de Thraustochytriales que también funcionan en los métodos y composiciones desvelados. Los expertos en la materia entienden bien las variantes y derivados de proteína y pueden implicar modificaciones de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, algunas modificaciones de la

65 secuencia de aminoácidos por lo general entran en una o más de tres clases: variantes de sustitución, inserción o

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Aminoácido: A breviaturas

Prolina: Pro P

Serina: Ser S

Treonina: Thr T

Triptófano: Trp W

Tirosina: Tvr Y

Valina: Val V

TABLA 2: Sustituciones de Aminoácido

Resto Original: Sustituciones Conservativas a modo de Ejemplo*

Ala: Ser

Arg: Lys; Gln

Asn: Gln; His

Asp: Glu

Cys: Ser

Gln: Asn; Lys

Glu: Asp

Gly: Pro

His: Asn; Gln

Ile: Leu; Val

Leu: Ile; Val

Lys: Arg; Gln

Met: Leu; Ile

Phe: Met; Leu; Tyr

Pro: Gly

Ser: Thr

Thr: Ser

Trp: Tyr

Tyr: Trp; Phe

Val: Ile; Leu

* En la técnica se conocen otras

[0214] Por ejemplo, los expertos en la materia conocen la sustitución de un resto de aminoácido con otro que es

5 biológica y/o químicamente similar como una sustitución conservativa. Por ejemplo, una sustitución conservativa se produciría sustituyendo un resto hidrófugo por otro, o un resto polar por otro. La sustituciones incluyen combinaciones tales como, por ejemplo, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Tales variaciones sustituidas de forma conservativas de cada secuencia desvelada de forma explícita se incluyen dentro de los polipéptidos mosaico proporcionados en el presente documento.

[0215] Para insertar sitios para N-glicosilación (Asn-X-Thr/Ser) u O-glicosilación (Ser o Thr) se puede usar mutagénesis de sustitución o de supresión. Las supresiones de cisteína u otros restos lábiles también pueden ser deseables. Las supresiones o sustituciones de sitios de proteólisis potenciales, por ejemplo Arg, se consiguen por

ejemplo mediante supresión de uno de los restos básicos o mediante sustitución de uno con restos de glutaminilo o histidilo.

[0216] Ciertas derivatizaciones posteriores a la traducción son el resultado de la acción de células hospedadoras

5 recombinantes en el polipéptido expresado. Los restos de glutaminilo y asparaginilo frecuentemente se desamidan después de la traducción a los correspondientes restos de glutamilo y asparilo. Como alternativa, estos restos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Otras modificaciones después de la traducción incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo, metilación de los grupos o-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86, 1983), acetilación de la amina N-terminal y, en algunos casos, amidación del carboxilo C-terminal.

[0217] Se entiende que una manera de definir las variantes y derivados de las proteínas desveladas en el presente documento es a través de la definición de las variantes y derivados en términos de homología/identidad con respecto

15 a secuencias específicas conocidas. De forma específica se desvelan variantes de proteínas desveladas en el presente documento que tienen una homología de al menos, un 60 %, 70 % o un 75 % o un 80 % o un 85 % o un 90 % o un 95 % con la secuencia indicada. Los expertos en la materia entienden fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas. Por ejemplo, la homología es recalcular después del alineamiento de las consecuencias de modo que la homología se encuentra en su nivel más elevado.

[0218] Otra forma de calcular la homología se puede realizar con algoritmos publicados. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación se puede realizar con el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981, con el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, con el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988,

25 con implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Grupo de Informática Genética, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

[0219] Los mismos tipos de homología se pueden obtener para los nucleicos por ejemplo con los algoritmos desvelados en Zuker, M. Science 244: 48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183: 281-306, 1989.

[0220] Se entiende que la descripción de mutaciones conservativas y homología se pueden combinar en conjunto en cualquier combinación, tal como las realizaciones que tienen una homología de al menos un 70 % con una

35 secuencia en particular en la que las variantes son mutaciones conservativas.

[0221] Como la presente memoria descriptiva discute diversas proteínas y secuencias de proteínas, se entiende que también se desvelan los ácidos nucleicos que codifican esas secuencias de proteínas. Estas incluirían todas las secuencias degeneradas o relacionadas con una secuencia de proteínas específicas, es decir, todos los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia de proteínas en particular así como todos los ácidos nucleicos, que incluyen ácidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes y derivados desvelados de las secuencias de proteínas. Por lo tanto, aunque cada secuencia de ácidos nucleicos en particular puede escribirse completa en el presente documento, se entiende que todas y cada una de las secuencias de hecho se desvela y se describe en el presente documento a través de la secuencia de proteínas desvelada. También se entiende aunque

45 ninguna secuencia de aminoácidos indica qué secuencia de ADN en particular codifica esa proteína dentro del organismo, en el que algunas variantes en particular de la proteína desvelada se desvelan en el presente documento, la secuencia de ácidos nucleicos conocida que codifica esa proteína en la afecta en particular a partir de la que surge esa proteína también se conoce y se desvela y se describe en el presente documento.

[0222] Se entiende que existen numerosos análogos de aminoácidos y péptidos que se pueden incorporar en las composiciones desveladas. Por ejemplo, existen numerosos D aminoácidos o aminoácidos que tienen un sustituyente funcional diferente a los de los aminoácidos mostrados en la Tabla 1 y Tabla 2. Los estereoisómeros opuestos de péptidos de origen natural se desvelan, así como los estereoisómeros de análogos de péptidos. Estos aminoácidos se pueden incorporar fácilmente en cadenas politécnicas mediante la carga de moléculas de ARNt con

55 el aminoácido de elección y construcciones de ingeniería genética que usan, por ejemplo, codones ámbar, para insertar el aminoácido análogo en una cadena peptídica de una manera específica del sitio (Thorson et al., Methods in Mol. Biol. 77: 43-73, 1991, Zoller, Curr. Opin. Biotech., 3: 348-354, 1992; Ibba, Biotechnol. Genet. Eng. 13: 197216, 1995, Cahill et al., Trends Biochem. Sci., 14: 400-403, 1989; Benner, Trends. Biotechnol., 12: 158-163, 1994).

[0223] Se pueden producir moléculas que se parecen a los péptidos, but pero que no se conectan a través de un enlace peptídico natural. Por ejemplo, los enlaces para aminoácidos o análogos de aminoácido pueden incluir CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2 --, --CH=CH--(cis y trans), --COCH2 --, --CH(OH)CH2--y --CHH2SO-( Estos y otros se pueden encontrar en Spatola, A. F. en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267, 1983; Spatola, A. F., Vega Data (marzo de 1983), Vol. 1, Artículo 65 3, Peptide Backbone Modifications (revisión general); Morley, Trends Pharm. Sci. 463-468, 1980; Hudson, D. et al.,

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polimerización interfacial de dos monómeros o técnicas de homogeneización a alta presión. El compuesto encapsulado se libera gradualmente desde el depósito mediante erosión o difusión de las partículas. Se han desarrollado algunas formulaciones satisfactorias de péptidos de acción corta, tales como los agonistas de LHRH como leuprorelina y triptorelina. Las microesferas de poli(lactida co-glicólido (PLGA) se usan en la actualidad como

5 formas de dosificación mensual y de tres meses en el tratamiento de cáncer de próstata avanzado, endometriosis, y otras afecciones sensibles a hormonas. El leuprolide, un superagonista de LHRH, se incorporó en una diversidad de matrices de PLGA usando un método de extracción/evaporación de disolvente. Como se ha indicado, todos estos dispositivos de suministro se pueden usar en los métodos desvelados en el presente documento.

[0238] Las pulmoesferas son también otros ejemplos de dispositivos de administración que se pueden usar en el presente documento. Las pulmoesferas son partículas huecas y porosas con una baja densidad (inferior a aproximadamente 0,1 m ml-1). Por lo general, las pulmoesferas tienen capacidad de redispersión excelente y por lo general se preparan con la tecnología de condensación de fluidos supercríticos. El co-secado por pulverización de ciertas matrices, tales como carbohidratos, albúmina de suero humano, etc., puede mejorar la estabilidad de las

15 proteínas y péptidos (por ejemplo, insulina) y otras biomoléculas para administración por vía pulmonar. Este tipo de administración también se podría conseguir con microemulsiones y emulsiones lipídicas, que son emulsiones ultrafinas, delgadas, de aceite en agua transparentes (W/O) formadas de forma espontánea sin entrada significativa de energía mecánica. En esta técnica, una emulsión se puede preparar a una temperatura, que debe ser superior a la temperatura de inversión de fases del sistema. A temperatura elevada, la emulsión es de tipo agua en aceite (w/o) y a medida que se enfría a la temperatura de inversión de fase, esta emulsión se invierte para convertirse en (o/w). Debido a sus fases internas muy pequeñas, que son extremadamente estables y se usan para la liberación sostenida de esteroides y vacunas. Las emulsiones lipídicas comprenden un núcleo de lípidos neutros (es decir, triglicéridos) estabilizado con una monocapa de lípido anfifílico (es decir, fosfolípido) usando tensioactivos tales como triglicéridos de lecitina de huevo y Miglyol. Son adecuados para la dirección pasiva y activa.

25 [0239] Existen otros sistemas de administración oral en investigación que se basan en la modulación de la presión osmótica, modulación del pH, modulación de la inflamación, alteración de la densidad y sistemas flotantes, capacidad de mucoadhesión, etc. Estas formulaciones y formulaciones retardadas en el tiempo para la administración de fármacos de acuerdo con el ritmo circadiano de la enfermedad que en la actualidad están en uso o investigación se puede aplicar para la administración de las composiciones desveladas en el presente documento.

[0240] En un aspecto en particular desvelado en el presente documento, los compuestos desvelados, que incluyen suplementos nutricionales y formulaciones farmacéuticas de los mismos, se pueden incorporar en microcápsulas como se describe en el presente documento.

35 [0241] En un aspecto desvelado en el presente documento, los compuestos desvelados se pueden incorporar en microcápsulas. En un aspecto, la microcápsulas comprende una aglomeración de microcápsulas primarias y los compuestos de cromo descritos en el presente documento, teniendo cada microcápsula primaria individual una cubierta primaria, en la que el compuesto de cromo está encapsulado por la cubierta primaria, en la que la aglomeración está encapsulada por una cápsula externa. En el presente documento estas microcápsulas se denominan “microcápsulas de múltiples núcleos".

[0242] En otro aspecto, en el presente documento se describen microcápsulas que comprenden un compuesto de cromo, una cubierta primaria, y una cubierta secundaria, en las que la cubierta primaria encapsula al compuesto de

45 cromo, y la cubierta secundaria encapsula a la sustancia de carga y la cubierta primaria. En el presente documento estas microcápsulas se denominan "microcápsulas de un solo núcleo".

[0243] Opcionalmente, otras sustancias de carga se pueden encapsular con el compuesto de cromo. La sustancia de carga puede ser cualquier sustancia que no sea totalmente soluble en la mezcla acuosa. En un aspecto, la sustancia de carga es un sólido, un líquido hidrófobo, o una mezcla de un sólido y un líquido hidrófobo. En otro aspecto, la sustancia de carga comprende una grasa, un aceite, un líquido, un fármaco (por ejemplo, molécula pequeña), una sustancia biológicamente activa, un suplemento nutricional (por ejemplo, vitaminas), un compuesto saborizante, o una mezcla de los mismos. Algunos ejemplos de aceites incluyen, pero no se limitan a, aceites de animales (por ejemplo, aceite de pescado, aceite de mamífero marino, etc.), aceites vegetales (por ejemplo, canola o

55 colza), aceite minerales, derivados de los mismos o mezclas de los mismos. La sustancia de carga puede ser una sustancia oleosa purificada o parcialmente purificada tal como un ácido graso, un triglicérido o éster del mismo, o una mezcla de los mismos. En otro aspecto, la sustancia de carga puede ser un carotenoide (por ejemplo, licopeno), un agente de saciedad, un compuesto saborizante, un fármaco (por ejemplo, un fármaco insoluble en agua), una partícula, un agente químico agrícola (por ejemplo, herbicidas, insecticidas, fertilizantes), o un ingrediente de acuicultura (por ejemplo, alimentos, pigmento).

[0244] En un aspecto, la sustancia de carga puede ser un ácido graso omega-3. Algunos ejemplos de ácidos grasos omega-3 incluyen, pero no se limitan a, ácido α-linolénico (18:3n3), ácido octadecatetraenoico (18:4n3), ácido eicosapentaenoico (20:5n3) (EPA), ácido docosahexaenoico (22:6n3) (DHA), ácido docosapentaenoico (22:5n3)

65 (DPA), ácido eicosatetraenoico (20:4n3), ácido uncosapentaenoico (21:5n3), ácido docosapentaenoico (22:5n3) y

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liposomas, o células). Estos se pueden dirigir a un tipo de célula en particular a través de anticuerpos, receptores, o ligandos de receptor. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas para tejido tumoral (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2: 447-451,1991; Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer,

60: 275-281,1989; Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58: 700-703,1988; Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4: 35 9,1993; Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35: 421-425,1992; Pietersz y McKenzie, Immunolog. Reviews,

129: 57-80,1992; y Roffler, et al., Biochem. Pharmacol., 42: 2062-2065,1991). Algunos vehículos tales como otros liposomas "ocultos" y otros liposomas conjugados con anticuerpo (incluyendo fármaco con medicación que se realizan dirige a carcinoma de colon), dirección mediada por receptor de ADN a través de de ligandos específicos de células, dirección al tumor dirigida por linfocitos, y dirección retroviral terapéutica altamente específica de las células glicoma murino in vivo. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas a tejido tumoral (Hughes et al., Cancer Research, 49: 6214-6220,1989); y Litzinger y Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104: 179-187, 1992). En general, los receptores están implicados en las rutas de endocitosis, ya sea constitutiva o inducida por ligando. Estos receptores se agrupan en depresiones revestidas con clatrina, entran en la célula a través de vesículas revestidas con clatrina, pasan a través de un endosoma acidificado en el

15 que se clasifica los receptores, y a continuación se reciclan a la superficie celular, se llevan a almacenar por vía intracelular, o se degradan en los lisosomas. Las vías de internalización sirven para una diversidad de funciones, tales como absorción de nutrientes, eliminación de proteínas activadas, eliminación de macromoléculas, entrada oportunista de virus y toxinas, disociación y degradación del ligando y regulación del nivel del receptor. Muchos receptores siguen más de una ruta intracelular, dependiendo del tipo de célula, concentración del receptor, tipo de ligando, valencia del ligando y concentración del ligando. Los mecanismos moleculares y celulares de la endocitosis mediada por receptor sea revisado (Brown y Greene, DNA and Cell Biology 10: 399-409, 1991).

(1) Vehículos Farmacéuticamente Aceptables

25 [0258] Las composiciones, incluyendo los anticuerpos, se pueden usar de forma terapéutica en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0259] Algunos vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19ª ed.) Ed. ARKANSAS. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Por lo general, una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable se usa en la formulación para hacer que la formulación solución sea isotónica. Algunos del vehículo farmacéuticamente aceptable ejemplos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferentemente de 5 aproximadamente a aproximadamente 8, y más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Algunos vehículos adicionales incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semipermeables

35 de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Para los expertos en la materia será evidente que ciertos vehículos pueden ser más preferentes dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y la concentración de la composición que se está administrando.

[0260] Los expertos en la materia conocen algunos vehículos farmacéuticos. Por lo general, estos serían vehículos convencionales para la administración de fármacos a los seres humanos, incluyendo soluciones tales como agua estéril, solución salina y soluciones tamponadas a pH fisiológico. Las composiciones se pueden administrar por vía intramuscular o por vía subcutánea. Otros compuestos se administrarán de acuerdo con procedimientos convencionales usados por los expertos en la materia.

45 [0261] Las composiciones farmacéuticas pueden Incluir vehículos, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos y similares, además de la molécula de elección. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más principios activos tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos, y similares.

[0262] La composición farmacéutica se puede administrar en un número de formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser por vía tópica (incluyendo por vía oftálmica, vaginal, rectal, intranasal), por vía oral, por inhalación, o por vía parenteral, por ejemplo mediante goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Los anticuerpos desvelados se pueden

55 administrar por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intracavitaria, o por vía transdérmica.

[0263] Algunas preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones, estériles acuosas o no acuosas. Algunos ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Algunos vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios tamponados. Algunos vehículos parenterales incluyen cloruro sódico en solución, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer lactada, o aceites no volátiles. Algunos vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de 65 Ringer), y similares. También pueden estar presentes algunos conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo,

imagen26

[0270] Se desvelan chips en los que al menos una dirección es de las secuencias o parte de las secuencias expuestas en cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos desveladas en el presente documento. También se desvelan chips en los que al menos una dirección es de las secuencias o secuencias expuestas en cualquiera de las

5 secuencias de péptidos desveladas en el presente documento.

[0271] También se desvelan chips en los que al menos una dirección es de una variante de las secuencias o parte de las secuencias expuestas en cualquiera de las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento. También se desvelan chips en los que al menos una dirección es de una variante de las secuencias o parte de las secuencias expuestas en cualquiera de las secuencias de péptidos desveladas en el presente documento.

10. Medios de lectura por ordenador

15 [0272] Se entiende que los ácidos nucleicos y proteínas desvelados se pueden representar como una secuencia que consiste en los nucleótidos de aminoácidos. Hay una variedad de maneras para mostrar estas secuencias, por ejemplo, el nucleótido guanosina se puede representar por G o g. De forma análoga, el aminoácido valina se puede representar por Val o V. Los expertos en la materia entienden cómo presentar y expresar cualquier secuencia de ácido nucleico o secuencia en cualquiera de la variedad de formas que existen, cada una de las cuales se considera desvelada en el presente documento. De forma específica, en el presente documento se contempla la visualización de estas secuencias en medios de lectura por ordenador, tales como, los discos flexibles, cintas, chips, discos duros, discos compactos y discos de video, disponibles en el mercado, u otros medios de lectura por ordenador. También se desvelan las representaciones del código binario de las secuencias desveladas. Los expertos en la materia entienden lo que son los medios de lectura por ordenador. Por lo tanto, algunos medios de lectura por ordenador

25 sobre los que se registran, almacenan o salvan las secuencias de ácidos nucleicos o proteínas.

[0273] Se desvelan medios de lectura por ordenador que comprenden las secuencias e información con respecto a las secuencias que se exponen en el presente documento.

11. Kits

[0274] En el presente documento se desvelan kits que se conciben para reactivos que se pueden usar en la práctica de los métodos desvelados en el presente documento o para el uso o mantenimiento de las composiciones desveladas en el presente documento. Los kits pueden incluir cualquier reactivo o combinación de reactivos

35 discutidos en el presente documento o que se entendería que son necesarios o beneficiosos en la práctica de los métodos desvelados. Por ejemplo, los kits pueden incluir uno o más microorganismos eucariotas desvelados en el presente documento junto con, por ejemplo, medios para su mantenimiento. Los kits también pueden incluir, por ejemplo, los lípidos o antioxidantes, junto con medios para el uso o la administración de los mismos.

12. Composiciones con funciones similares

[0275] Se entiende que las composiciones desveladas en el presente documento tienen ciertas funciones, tales como la producción de ciertas proporciones de lípidos. En el Presente documento se desvelan ciertos requisitos estructurales, genéticos y funcionales para desempeñar las funciones desveladas, y se entiende que hay una gran

45 diversidad de estructuras, antecedentes genéticos y antecedentes funcionales que pueden realizar la misma función que las relacionadas con las estructuras desveladas, y que estas estructuras por último conseguirán el mismo resultado, por ejemplo la producción de una determinada ración de lípidos.

D. Métodos para preparar las composiciones

[0276] Las composiciones desveladas en el presente documento y las composiciones necesarias para realizar los métodos desvelados se pueden preparar usando cualquier método conocido por los expertos en la materia para ese reactivo compuesto en particular a menos que se indica que de forma específica de ozono.

55 1. Síntesis de ácido nucleico

[0277] Por ejemplo, los ácidos nucleicos, tales como, los oligonucleótidos a usar como cebadores se pueden preparar usando métodos convencionales de síntesis química o se pueden producir usando métodos enzimáticos o cualquier otro método conocido. Tales métodos pueden variar de digestión enzimática convencional seguido de aislamiento de fragmento de nucleótido (véase por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Capítulos 5, 6) a métodos puramente sintéticos, por ejemplo, con el método de cianoetil fosforamidita usando un sintetizador de ADN System 1 Plus de Milligen o Beckman (por ejemplo, el Modelo 8700 de sintetizador automatizado automated de Milligen-Biosearch, Burlington, el Modelo 380B de MA o ABI). Algunos métodos de síntesis útiles para la preparación de 65 oligonucleótidos también se describen en Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356, 1984, (métodos de

fosfotriéster y fosfito-triéster), y Narang et al., Methods Enzymol., 65: 610-620, 1980, (método de fosfotriéster). Algunas moléculas de ácido nucleico proteicas se pueden preparar usando métodos conocidos tales como los que se describen en Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5: 3-7, 1994.

5 2. Síntesis de péptidos

[0278] Un método para producir las proteínas desveladas es unir dos o más péptidos o polipéptidos juntos mediante técnicas de química de proteínas. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos se pueden sintetizar de forma química usando equipo de laboratorio disponible en la actualidad que usa cualquiera de química de Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonilo) o Boc (terc-butiloxicarbonilo) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Un experto en la materia puede apreciar fácilmente que un péptido o polipéptido correspondiente a las proteínas desveladas, por ejemplo, se puede sintetizar mediante reacciones químicas convencionales. Por ejemplo, un péptido o polipéptido se puede sintetizar y no escindir de su resina de síntesis mientras que el otro fragmento de un péptido o proteína se puede sintetizar y posteriormente escindir de la resina, exponiendo de este modo un grupo terminal que se bloquea

15 funcionalmente en el otro fragmento. Por reacciones de condensación de péptidos, estos dos fragmentos se pueden unir covalentemente a través de un enlace peptídico en sus extremos de carboxilo y amino terminales, respectivamente, para formar un anticuerpo, o fragmento del mismo. (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman y Co., N.Y. (1992); Bodansky M y Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY . Como alternativa, el péptido o polipéptido se sintetiza independientemente in vivo como se describe en el presente documento. Una vez aislados, estos péptidos o polipéptidos independientes se pueden unir para formar un péptido o fragmento del mismo a través de reacciones de condensación de péptidos similares.

[0279] Por ejemplo, la ligación enzimático de segmentos peptídicos clonados o sintéticos permita fragmentos peptídicos relativamente cortos a unir para producir fragmentos de péptidos más grandes, polipéptidos o dominios de 25 proteínas completas (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30: 4151, 1991). Como alternativa, la ligación química nativa de los péptidos sintéticos se puede usar para construir de forma sintética péptidos o polipéptidos grandes a partir de fragmentos de péptidos más cortos. Este método consiste en una reacción química de dos etapas (Dawson et al. Science, 266: 776-779, 1994). La primera etapa es la reacción quimioselectiva de un péptido--tioéster sintético sin protección con otro segmento de péptido no protegido que contiene un resto de Cys amino-terminal para dar un compuesto intermedio unido a tioéster como el producto inicial covalente. Sin un cambio en las condiciones de reacción, este compuesto intermedio experimenta una reacción intramolecular rápida, espontánea, para formar un enlace peptídico nativo en el sitio de la ligación (Baggiolini M et al. FEBS Lett. 307: 97-101, 1992; Clark-Lewis I et al.,

J. Biol. Chem., 269: 16075, 1994; Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30: 3128, 1991; Rajarathnam K et al., Biochemistry 33: 6623-30, 1994).

35 [0280] Como alternativa, los segmentos peptídicos no protegidos se unen químicamente cuando el enlace formado entre los segmentos de péptido como resultado de la ligación química es un enlace no natural (no peptídico) (Schnolzer, M et al. Science, 256: 221, 1992). Esta técnica se ha usado para sintetizar análogos de dominios de proteína así como grandes cantidades de proteínas relativamente puras con actividad biológica completa (de Lisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267, 1992).

3. Procesos para preparar las composiciones

[0281] Se desvelan procesos para preparar las composiciones, así como para preparar los compuestos intermedios

45 que conducen a las composiciones. Por ejemplo, se desvelan microorganismos eucariotas que pueden producir lípidos y antioxidantes deseados así como métodos para aislar y purificar los lípidos y antioxidantes deseados. Hay una variedad de métodos que se pueden usar para la preparación de estas composiciones, tales como los métodos de síntesis química y los métodos convencionales de biología molecular. Se entiende que los métodos de preparación de estas y las otras composiciones desveladas se desvelan de forma específica.

[0282] Se desvelan células producidas con el proceso de transformación de la célula con cualquier ácido nucleico. Se desvelan células producidas con el proceso de transformación de la célula con cualquiera de los ácidos nucleicos de origen no natural desvelados.

55 [0283] Se desvela cualquiera de los lípidos producidos con los microorganismos eucarióticos desvelados. Se desvela cualquier péptido producido con el proceso de expresión del péptido en los organismos desvelados. Métodos de uso de las composiciones.

4. Métodos de uso de las composiciones como herramientas de investigación

[0284] Las composiciones desveladas se pueden usar de una diversidad de formas como herramientas de investigación y para la producción de, por ejemplo, lípidos y antioxidantes.

[0285] Las composiciones desveladas se pueden usar como se discute en el presente documento ya sea como 65 reactivos en micromatrices o como reactivos para sondear o analizar micromatrices existentes. Las composiciones

desveladas se pueden usar en cualquier método para aislar o identificar polimorfismos de un solo nucleótido. Las composiciones desveladas también se pueden usar en cualquier método para determinar el análisis alélico de, por ejemplo, las cepas de los organismos desvelados en el presente documento, en particular análisis alélico ya que se refiere a la producción de lípidos y antioxidantes. Las composiciones también se pueden usar en cualquier método

5 conocido de ensayos de identificación sistemática, relacionados con chip/micromatrices. Las composiciones desveladas también se pueden usar en cualquier forma conocida de uso de las realizaciones de lectura informática de las composiciones desveladas, por ejemplo, para relación con el estudio o para realizar análisis de modelado molecular relacionado con las composiciones desveladas.

5. Métodos de modificación genética e interrupción genética

[0286] Las composiciones y métodos desvelados se pueden usar para interrupción y modificación genética dirigida en cualquier animal que puede experimentar estos sucesos. La modificación genética y la interrupción genética se refieren a los métodos, técnicas y composiciones que rodean a la retirada o alteración selectiva de un gen o

15 estiramiento de cromosoma en un organismo, tal como los eucariotas desvelados en el presente documento, de una forma que propaga la modificación a través de la replicación del organismo. En general, por ejemplo, una célula se transforma con un vector que se diseña para que se recombine de forma homóloga con una región de un cromosoma o ácido nucleico en particular contenido dentro de la célula, como se describe por ejemplo en el presente documento. Este suceso de recombinación homóloga puede producir un cromosoma que tiene ADN exógeno introducido, por ejemplo en marco, con el ADN circundante. Este tipo de protocolo permite mutaciones muy específicas, tales como mutaciones puntuales, a introducir en el genoma contenido dentro de la célula. Algunos métodos para realizar este tipo de recombinación homóloga se desvelan en el presente documento.

V. REALIZACIONES ESPECÍFICAS

25 [0287] Se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso.

[0288] También se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso, que comprende adicionalmente el aislamiento de la composición lipídica.

[0289] También se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso,

35 en los que la proporción de ácidos grasos omega-3 y omega-6 con respecto a ácidos grasos omega-9 aumenta.

[0290] También se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, métodos que comprenden: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de ácido graso, en los que la proporción de ácidos grasos omega-3 y omega-6 con respecto a ácidos grasos omega-9 aumenta, en los que el contenido total de ácido graso está inalterado.

[0291] El microbio productor de aceite para los métodos que se describen en el presente documento puede ser una diatomea, una microalga, un hongo, una bacteria, un protista. Por ejemplo, el microbio productor de aceite tiene una secuencia 18S, en el que la secuencia 18S tiene una identidad de al menos un 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,

45 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o un 100 % identidad con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o el microbio productor de aceite tiene una secuencia 18S, en el que la secuencia 18S tiene identidad de al menos un 80 % con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1.

[0292] El microbio productor de aceite puede ser del filo Labyrinthulomycota, de la clase Labyrinthulomycetes, de la subclase Thraustochytridae, del orden Thraustochytriales, de la familia Thraustochytriaceae, o del género Thraustochytrium.

[0293] También se desvelan antagonistas de producción de ácido graso que se pueden usar en los métodos desvelados. Los antagonistas de producción de ácido graso se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en

55 ácido oleico, cerulenina, ácido toluico, curcumina, ciclopropeno, galato de alquilo, galato de propilo, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, aceite de colza, piridazinona, norflurazón, difenilamina, setoxidim, y capsaicina.

[0294] También se desvelan dispositivos de suministro que comprenden las composiciones desveladas. Los dispositivos de suministro pueden comprender una microcápsula, una microesfera, una nanoesfera o nanopartícula, un liposoma, un noisoma, un nanoeritrosoma, una nanopartícula de sólido-líquido, un leuprolide, un gel, una cápsula de gel, un comprimido, una loción, una crema, una pulverización, una emulsión o un polvo.

[0295] También se desvelan métodos para preparar una composición de carotenoide, método que comprende: cultivar un microbio productor de aceite en un medio heterótrofo que comprende un antagonista de producción de

65 ácido graso.

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combinación de los mismos en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro, microcápsulas, suplementos nutricionales o productos alimenticios descritos anteriormente.

5 [0308] También se desvela un método para suplemento de elementos traza esenciales en un sujeto, método que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro, microcápsulas, suplementos nutricionales o productos alimenticios descritos anteriormente, en el que la composición, dispositivo de suministro, microcápsula, suplemento, y producto alimenticio comprende un elemento traza esencial.

[0309] También se desvela un método para aumentar la sensibilidad a la insulina en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro, microcápsulas, suplementos nutricionales o productos alimenticios descritos anteriormente.

15 [0310] También se desvela un método para reducir la hiperglucemia en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro, microcápsulas, suplementos nutricionales o productos alimenticios descritos anteriormente.

[0311] También se desvela un método para reducir la hipercolesterolemia en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro, microcápsulas, suplementos nutricionales o productos alimenticios descritos anteriormente.

[0312] También se desvela un método para reducir la grasa corporal en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro,

25 microcápsulas, suplementos nutricionales o productos alimenticios descritos anteriormente.

[0313] También se desvela un método para estimular la pérdida de peso en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro, microcápsulas, suplementos nutricionales o productos alimenticios descritos anteriormente.

[0314] También se desvela un método para tratar o prevenir la diabetes en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro, microcápsulas, suplementos nutricionales o productos alimenticios descritos anteriormente.

35 [0315] También se desvela una formulación farmacéutica que comprende cualquiera de las composiciones, dispositivos de suministro o microcápsulas descritos anteriormente, y un vehículo farmacéutico.

VI. Ejemplos

[0316] Los siguientes ejemplos comparativos y ejemplo de trabajo 14(c) se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la materia una divulgación y excepción completas de cómo se preparan y evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en el presente documento, y pretenden ser puramente a modo de ejemplo. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a las cifras (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deberían tener en cuenta algunos errores y

45 desviaciones. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, la temperatura está en ºC o es la temperatura ambiente, y la presión es la presión atmosférica o casi atmosférica.

1. Ejemplo 1 Aislamiento de la cepa ONC-T18 de Thraustochytrium sp.

[0317] Se usaron técnicas clásicas de purificación de cepa bacteriológica para aislar ONC-T18 de hojas de mangle recogidas en Advocate Harbor, Nueva Escocia. ONC-T18 se cultivó en serie a 25 ºC en un medio nutriente de agar que contenía 5 g l-1 de glucosa, 2 g l-1 de peptona, 2 g l-1 de extracto de levadura y 15,0 g l-1 de agar hasta 1 l de 0,2 µm agua de mar filtrada hasta se aseguró que la pureza. Posteriormente, se preparó un medio líquido que contenía un 15 % de agua de mar artificial (marina trófica), complementado con una fuente de nitrógeno y carbono,

55 con 60 g l-1 de glucosa y 10 g l-1 de extracto de levadura, respectivamente. Este medio (50 ml de medio en matraces de 250 ml) se incubó con ONC-T18, a continuación se incubó a 25 ºC y se aireó con agitación a 120 rpm.

[0318] La cepa ONC-T18 se separó del medio a partir de centrifugación, con biomasa celular y a continuación se lavó, se volvió a centrifugar y se liofilizó hasta finalización. A continuación, la biomasa celular se pesó para determinar las eficacias del cultivo con los valores de biomasa por litro de medio registrados. La extracción de la fracción lipídica de biomasa y posterior separación del éster de metilo del ácido graso se realizó usando el método de Bligh y Dyer. La transesterificación se realizó mediante transferencia de material celular liofilizado a un tubo de ensayo de 10 ml con la parte superior de rosca y añadiendo HCl metanólico al 10 % y diclorometano al tubo, dejando que la mezcla reaccionará durante 2 horas a 90 ºC. Los ésteres de metilo del ácido graso se extrajeron a 65 continuación mediante la adición de hexano:cloroformo, y el componente de éster de metilo se midió a través de

cromatografía de gases (FID) para determinar el perfil de ácido graso en cada microorganismo y la comunidad simbiótica (ONC-T18). Las concentraciones de cada éster de metilo del ácido graso (C14:0 a C22:6) se determinaron por comparación de las áreas máximas de GC de dos patrones internos (C19:0 y C23:0) añadidos en cantidades definidas tanto al comienzo (C23:0) como al final (C19:0) del proceso de transesterificación. La cantidad 5 total de ácidos grasos por gramo de biomasa celular seca y el porcentaje del contenido de cada ácido graso, se calculó usando este método, y se muestran en la figura 2.

[0319] A partir del análisis de estos resultados, en conjunto con los que se muestran en la Figura 1, se puede observar que ONC-T18 demostraba la capacidad para producir cantidades crecientes de DHA, así como cantidades

10 notables de EPA y DPA. ONC-T18, produce aproximadamente un 25 % de DHA, un 8,0 % de DPA (n-6) y un 1,0 % de EPA dentro de este medio de fermentación no optimizado. Posteriormente, se eligió ONC-T18 sobre la base de la combinación de características económicamente deseables: (1) capaz de crecimiento heterótrofo máximo (en comparación con las cepas de control); (2) contiene un porcentaje elevado de ácidos grasos omega-3 altamente insaturados; (3) capaz de crecimiento en nutrientes baratos; (4) termotolerancia, y son (5) eurihalinos.

15 [0320] Además, se compararon múltiples cepas de microbios diferentes que producen aceite con respecto a ONC-T18. Se cree que cada uno de estos microbios comprende un Traustoquítrido, y produce aceite en las cantidades mostradas en la Tabla 3.

20 Tabla 3, [ ] = mg/g

[ ] DHA [ ] EPA: Total Lípido Peso (g)

MYA-1381: 127,96 5,52 216,37 1,80

ATCC-20891: 37,97 7,14 67,34 1,30

ONC-T01: 5,18 7,76 50,82 0,40

ONC-T02: 31,84 4,20 52,88 0,50

ONC-T03: 24,87 6,97 75,00 0,60

ONC-T04: 14,39 4,49 41,74 0,90

ONC-T05: 11,37 3,97 34,89 0,10

ONC-T06: 27,80 6,71 63,87 0,10

ONC-T07: 33,02 5,49 61,81 0,50

ONC-T08: 24,48 4,83 53,35 0,80

ONC-T09: 63,82 4,25 109,12 0,80

ONC-T10: 22,22 4,93 40,99 0,10

ONC-T11: 18,37 21,25 214,98 0,80

ONC-T12: 57,96 9,03 96,26 0,60

ONC-T13: 12,90 4,57 39,52 1,30

ONC-T14: 15,99 5,16 36,46 0,50

ONC-T15: 15,53 5,11 37,72 0,50

ONC-T16: 18,02 5,55 42,12 0,50

ONC-T17: 36,43 4,34 94,26 0,30

ONC-T18: 83,63 2,76 321,14 2,30

ONC-T19: 34,71 8,07 66,14 0,60

ONC-T20: 19,28 6,94 66,74 0,10

ONC-T21: imagen28 imagen29 imagen30

ONC-T22: 22,72 3,26 47,58 0,60

ONC-T23: imagen31 imagen32 imagen33

ONC-T24: 11,73 3,56 33,56 0,70

ONC-T25: 26,99 6,11 45,67 0,60

ONC-T26: 14,50 6,43 39,22 0,60

ONC-T27: 26,83 7,75 61,87 0,70

ONC-T28: 16,62 6,02 38,28 0,90

[ ] DHA [ ] EPA: Total Lípido Peso (g)

ONC-T29: 14,67 4,91 34,48 0,80

ONC-T30: 16,56 5,42 81,88 0,80

ONC-T31: 13,36 5,74 44,86 0,30

ONC-T32: 19,12 6,56 53,29 0,20

ONC-T33: imagen34 imagen35 imagen36

ONC-T34: 18,92 5,98 53,36 0,66

ONC-T35: imagen37 imagen38 imagen39

ONC-T36: imagen40 imagen41 imagen42

ONC-T37: 35,69 11,06 82,73 0,10

ONC-T38: 22,73 10,94 51,56 0,10

ONC-T39: imagen43 imagen44 imagen45

ONC-T40: 26,87 8,83 67,87 0,80

ONC-T41: 22,85 6,65 52,63 050

ONC-T42: 33,65 9,22 83,93 0,80

ONC-T43: 12,49 3,25 37,93 0,80

ONC-T44: 11,71 2,93 55,05 1,10

ONC-T45: 26,08 7,95 70,45 0,70

ONC-T46: 33,34 6,27 63,76 0,30

ONC-T47: 10,01 4,77 68,02 0,70

ONC-T48: 26,23 3,95 69,06 0,60

ONC-T49: 16,64 4,89 39,76 0,30

ONC-T50: 13,64 4,56 40,30 1,00

ONC-T51: imagen46 imagen47 imagen48

ONC-T52: 26,57 4,55 41,36 0,60

ONC-T53: 11,40 3,56 29,20 0,70

ONC-T54: 10,34 3,18 29,31 0,70

ONC-T55: imagen49 imagen50 imagen51

ONC-T56: imagen52 imagen53 imagen54

ONC-T57: imagen55 imagen56 imagen57

ONC-T58: 10,30 3,13 27,10 0,70

ONC-T59: imagen58 imagen59 imagen60

ONC-T60: 27,71 7,01 66,84 0,30

ONC-T61: 15,72 5,62 52,56 0,40

ONC-T62: imagen61 imagen62 imagen63

ONC-T63: 20,17 8,25 62,58 0,60

ONC-T64: 12,16 2,97 44,73 1,10

ONC-T65: imagen64 imagen65 imagen66

ONC-T66: imagen67 imagen68 imagen69

ONC-T67: 23,71 5,63 43,24 0,50

ONC-T68: 22,72 6,10 41,37 0,50

[0321] Se entiende que así como para ONC-T18, como se describe en el presente documento, se desvela un conjunto de microbios que producen aceite como se representa mediante las capacidades de producción de aceite desveladas en el presente documento, tal como mediante un porcentaje de DHA con respecto a la producción total 5 de aceite, o mediante la producción total de DHA, por ejemplo.

2. Ejemplo 2 Identificación de especies de Thraustochytrium eucariotas de ONC-T18 usando técnicas genéticas

[0322] Usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cebadores que se dirigen al gen del ARN

5 ribosómico de 18S, que son universales para todas las especies eucariotas, fue posible generar productos de PCR de los genes estructurales del microbio productor de aceite aislado a partir de ONC-T18 (como en el ejemplo 1). Los productos de PCR sé secuenciar una continuación y se denominaron SEQ ID NO: 1 para las especies eucariotas (véase la figura 2).

10 [0323] La comparación de la SEQ ID NO: 1 con las secuencias de ácidos nucleicos encontradas en la base de datos genómica, GenBank (Centro Nacional de Información Biotecnológica, Instituto Nacional de la Salud, Bethesda, MD, USA) usando el algoritmo BLAST (Herramienta de Búsqueda Básica de Alineamiento Local) identificado en la SEQ ID NO: 1 como la más relacionada con Thraustochytrium striatum [AF265338] (similitud de un 97,5 %).

15 [0324] Los resultados de BLAST para ONC-T18 de Thraustochytrium sp. se muestran a continuación.

Secuencias que producen alineamientos significativos:: Puntuación Valor de E

(bits)

gi|14279326|gb|AF265338.1| Thraustochytrium striatum small subun...: 2126 0,0

gi|50508012|dbj|AB183657.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11072 gen...: 2121 0,0

gi|54778780|gb|AY773276.1| Thraustochytriidae sp. FJN-10 18S rib...: 1857 0,0

gi|50508019|dbj|AB183664.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11093 gen...: 1828 0,0

gi|38524571|dbj|AB1,26669.1| Thraustochytrium sp. CHN-1 gen for...: 1748 0,0

gi|24817740|dbj|AB073308.2| Thraustochytriidae sp. N1-27 gene fo...: 1628 0,0

gi|50508018|dbj|AB183663.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11092 gen...: 1257 0,0

gi|50508017|dbj|AB183662.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11091 gen...: 1257 0,0

gi|50508015|dbj|AB183660.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11084 gen...: 1255 0,0

gi|50508011 |dbj|AB183656.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11070 gen...: 1255 0,0

gi|50508016|dbj|AB183661.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11086 gen...: 1249 0:0

gi|15823623|dbj|AB052555.1| Schizochytrium sp. KH105 gene for 18...: 1245 0,0

gi|50508013|dbj|AB183658.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11075 gen...: 1227 0,0

gi|50508010|dbj|AB183655.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11067 gen...: 1213 0,0

gi|54303872|gb|AY758384.1| Schizochytrium sp. FJU-512 18S riboso...: 1158 0,0

gi|14279326|gb|AF265338.1|AF265338 Thraustochytrium striatum: 1106 0,0

gi|6492308|gb|AF155209.1|AF155209 Labyrinthulid quahog parasite ...: 765 0,0

gi|16209570|gb|AY052644.| Labyrinthulid quahog parasite QPX sma...: 757 0,0

gi|9755031|gb|AF261664.1|AF261664 Labyrinthulid quahog parasite ...: 757 0,0

gi|58176547|gb|AY870336.1| Thraustochytriidae sp. Fngl 18S ribos...: 735 0,0

gi|67624914|dbj|AB191425.1| Uncultured eukaryote gene for small ...: 724 0,0

gi|5509891|dbj|AB022112.1| Thraustochytrium striatum gene for 18...: 724 0,0

gi|561884|gb|L34454.1|ULKRRE Ulkenia profunda 18S ribosomal RNA: 702 0,0

gi|50508014|dbj|AB183659.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11077 gen...: 686 0,0

gi|50508008|dbj|AB183653.1| Thraustochytriidae sp. MBIC1060 gen...: 686 0,0

gi|50508009|dbj|AB183654.1| Thraustochytriidae sp. MBIC11063 gen...: 658 0,0

gi|41391986|emb|AJ535188.1| Pleurosira cf. laevis 18S rRNA gene,...: 634 e-178

gi|28316562|gb|AF525670.1| Pleurosira laevis small subunit ribos...: 634 e-178

gi|5509889|dbj|AB022110.1| Thraustochytrium aureum gene for 18S ...: 634 e-178

gi|561883|gb|L34668.1|TUKRRE Thraustochytrium kinnei 18S: 628 e-176

ribosom...

gi|5509894|dbj|AB022115.1| Ulkenia radiata gene for 18S rRNA: 624 e-175

gi|5509893|dbj|AB022114.1| Ulkenia profunda gene for 18S rRNA: 624 e-175

gi|5509895|dbj|AB022116.1| Ulkenia visurgensis gene for 18S rRNA: 603 e-169

gi|9027563|gb|AF257315.2| Thraustochytriidae sp. BS2 1,85 ribosom...: 589 e-164

imagen70

imagen71

producción de biomasa eran extracto de levadura, a continuación peptona, seguido de L-glutamato. Además, a través del uso de experimentos similares con variaciones de glucosa y salinidad (concentración de sal marina), el medio óptimo y más barato, la composición para la producción de biomasa de ONC-T18 estaba dentro de un medio que comprendía 2 g l-1 de extracto de levadura, 8 g l-1 de MSG, 60 g l-1 de glucosa y 6 g l-1 de sal marina.

5

4. Ejemplo 4: Producción optimizada de ácido docosahexaenoico (DHA) con la cepa ONC-T18

[0327] Se prepararon medios que consistían en una fuente de nitrógeno (cualquiera de peptona, extracto de levadura, L-glutamato (MSG) o combinaciones de estos) y una fuente de carbono (glucosa), en una solución salina 10 (agua de mar artificial), para determinar la composición del mejor medio para una producción óptima de biomasa y de DHA de una manera similar a la que se describe en el Ejemplo 3 (mostrado en la Tabla 4). Después de cultivo a 25 ºC y 130 rpm durante 3 días, biomasa, ácido graso total por litro de medio, porcentaje del contenido de ácidos grasos en peso, porcentaje del contenido de DHA en ácidos grasos totales y la cantidad de DHA por litro de medio se determinaron mediante cromatografía de gases al igual que en el método que se describe en el ejemplo 1, y en el

15 presente documento, y como se muestra en la Tabla 4 que sigue a continuación.

[0328] En este caso, DHA se confirmó por comparación con patrones conocidos de DHA usando espectrometría de masas y cromatografía de gases y métodos de bloqueo máximo. Los hallazgos a partir del paquete experimental imagen72

, en el que se investigaron variaciones en formas tanto naturales como orgánicas de nitrógeno, mostraban que la 20 composición óptima del medio debería contener entre 4,0 y 6,0 g l-1 tanto de extracto de levadura como de Limagen73

glutamato para una producción óptima de biomasa y de DHA. Por otro lado, el paquete experimental , que investigaba cambios en la composición de sodio añadido al medio mostraba una producción máxima de DHA y imagen74

producción de biomasa cuando se usa sal marina artificial. Además, el paquete experimental , en el que la concentración de sodio dentro del medio variaba, representaba el máximo para la producción de DHA y biomasa

25 entre un 5 y un 15 % de agua marina artificial por l-1 de dH2O. Los resultados a partir del paquete experimental en el que se evaluaron las variaciones en los niveles de glucosa, demostraban que el intervalo de 40 a inferior a 160 g l-1 de glucosa se traducía en una producción óptima de biomasa y de DHA. Por último, los resultados del imagen75

paquete experimental indican que ONC-T18 producía valores equivalentes tanto para concentración de biomasa

celular como para concentración de DHA, cuando se usaban glucosa o glicerol como fuentes de carbono. 30

imagen76

imagen77

imagen78

imagen79

ATCC 34304, Thraustochytrium sp. ATCC 20891, Thraustochytrium sp. ATCC 20892, Thraustochytrium roseum ATCC 28210, Thraustochytrium sp. ATCC 26185, Schizochytrium sp. ATCC 20888, Schizochytrium aggregatum ATCC 28209 y Schizochytrium limacinum MYA-1381, así como cuando DHA, EPA y DPA se producen mediante cultivo de ONC-T18.

Tabla 5: Comparación de la producción lipídica y características de biomasa de varias cepas representativas de Traustoquítridos

Microorganismo: Cantidad de biomasa celular (g l-1) Porcentaje de contenido lipídico (% g-1) Porcentaje de contenido de DHA (% g-1) Porcentaje de contenido de EPA ( % g-1) Porcentaje de contenido de DPA ( % g-1) DHA Total (g l-1) EPA Total (mg l-1) DPA Total (mg l-1)

Thraustochytrium sp ATCC 20891 Thraustochytrium sp ATCC 20892 Thraustochytrium sp (ATCC 26185 T. aureum ATCC 34304 T. roseum ATCC 28210 Schizochytrium sp. ATCC 20888 S. aggregatum ATCC 28209 S. limacinum SR21 MYA-1381: 1,8 3 2,3 4-5 8-17 10,5 1,4 23-40 sin datos 7 sin datos 8-20 18-25 50 1,7 40-53,5 12 35 41,9 24-51 50 25-37 6,0 29,7-34 sin datos sin datos 3,1 3,6-9,3 sin datos 1,2 6,1 0,2-0,4 sin datos sin datos 10 sin datos sin datos 16,8 sin datos sin datos sin datos 0,07 sin datos 0,1-0,5 0,6-2,1 1,95 1 3,0-7,2 sin datos sin datos sin datos 0,0001 sin datos 12,3 1 0,08 sin datos sin datos sin datos sin datos sin datos 1,68,46 sin datos sin datos

ONC-T18: 25-55 45-80 24-34,2 0,1-2 6-10 4,6-13 0,2-0,8 0,9-3,8

[0335] Como se muestra en la Tabla 5, es evidente que, cuando el cultivo se realiza usando ONC-T18, los valores

10 de biomasa celular por litro de medio eran extremadamente elevados en comparación con las otras cepas sometidas a ensayo. Además, la cepa ONC-T18 tiene un porcentaje muy elevado de contenido de lípidos en comparación con las otras cepas mencionadas anteriormente. Además, el porcentaje del contenido de DHA y DPA dentro de ONC-T18 es extremadamente elevado, con niveles de EPA que se muestra que son comparables con todas las cepas identificadas sistemáticamente. Por lo tanto, parece que ONC-T18 tienen la capacidad de producir grandes

15 cantidades de DHA, EPA y DPA en condiciones de fermentación como se menciona dentro del ejemplo 1.

9. Ejemplo 9: Información de la fuente de carbono alternativa

[0336] Se ha mostrado que ONC-T18 crece preferentemente en medios en los que las fuentes principales de

20 nitrógeno son extracto de levadura, glutamato sódico y/o peptona y la fuente principal de carbono es D-glucosa. Como resultado de la formación detallada de perfiles metabólicos de ONC-T18 se observó que el glicerol (fuente de carbono) también era una alternativa viable. Además, las corrientes residuales de procesamiento de aceite de pescado que contienen glicerol también se sometió un ensayo para aplicabilidad como alternativas de nutrientes de bajo coste. Se realizaron experimentos usando 200 ml de medios en matraces de 500 ml, cultivados a 25 ºC durante

25 3 días, 120 rpm en el caso del glicerol. El contenido de glicerol de dos productos residuales de procesamiento de aceite de pescado, GWW (lavado con glicerol agua) y GAW (lavado con glicerol ácido), constituían un 40 % en vol:vol del medio de 200 ml (ajustado a pH 6,5), aunque se añadió glicerol al 6 % a un medio de 200 ml (p:vol) como control.

30 [0337] El análisis de estos resultados ha determinado que el uso de componentes de corriente residual de aceite de pescado, tales como productos secundarios de glicerol, como fuentes de carbono en fermentación de ONC-T18 a gran escala a la vez que da resultado una cantidad reducida de ácido graso total, representa un contenido de DHA mantenido dentro de las células microbianas (figura 10).

35

Tabla 6: Contenido de ácido graso, biomasa y glicerol para estudio de fuente de carbono alternativa

Porcentaje (%) de contenido de ácido graso con respecto a lípido total en peso: TFA (mg g-1) Glicerol (g l-1) Biomasa (g l-1)

AA: EPA DHA DPA n3 DPA n6

Glicerol al 6 % (p:vol): 0,29 0,52 26,31 0,24 9,49 426,12 76,00 9,13

GAW al 40 % (vol:vol): 0,37 1,32 19,69 0,42 6,36 294,55 68,59 5,94

GWW al 40 % (vol:vol): 0,46 5,55 12,46 1,01 3,82 274,33 2,70 3,08

10. Ejemplo 10: Multiplicador de peso de célula seca

5 [0338] La cepa ONC-T18 de Thraustochytrium sp. se puede cultivar para la producción de aceites omega-3 en una diversidad de configuraciones de reactor hasta 100.000 l. Todas las fragmentaciones comienzan con la preparación de un inóculo con un volumen final de un 10-20 %, que se usa para establecer el cultivo de fermentación. Las configuraciones iniciales del medio comprenden hasta 6 g/l de sal marina, 10 g/l de fuente de nitrógeno y 60 g/l de fuente de carbono, con adición semicontinua de otros 75 g/l de fuente de carbono después de 24 a 36 horas de

10 fermentación inicial durante un periodo adicional de 72 a 96 horas y se produce dentro del intervalo de temperaturas de 18-25 ºC. Por ejemplo, usando el medio de 6 g/l de sal marina, 2 g/l de extracto de levadura, 8 g/l de L-glutamato y 60 g/l de D-glucosa (con una adición de 75 g/l añadidos después de 36 horas), creciendo a 25 ºC durante 96 horas, la cepa ONC-T18 fue capaz de producir 40 g/l de peso celular seco (dcw), un 80 % (dcw) de fracción total de ácido graso (TFA)/lipídica (entre C14:0 y C24:0) y un 30 % (TFA) de DHA. De forma análoga, es posible aumentar el

15 peso celular seco multiplicando los componentes de los medios, tanto de nitrógeno como de carbono, hasta un efecto de multiplicación de biomasa similar exacto sin influir en los contenidos TFA ni de DHA. Por ejemplo, usando el medio de 24 g/l de sal marina, 8 g/l de extracto de levadura, 32 g/l de L-glutamato y 300 g/l de D-glucosa, creciendo 25 ºC durante 312 horas, la cepa ONC-T18 fue capaz de producir 80 g/l de peso celular seco (dcw), 60 % (dew) de fracción total de ácido graso total (TFA)/lipídica (entre C14:0 y C24:0) y un 38 % (TFA) de DHA.

20

11. Ejemplo 11: Crecimiento de la cepa ONC-T18 de Thraustochytrium sp. en diversas fuentes alternativas, de carbono (C) y de nitrógeno (N),y el efecto en el peso celular seco y lípidos

[0339] El crecimiento de la cepa ONC-T18 de Thraustochytrium sp. en una diversidad de fuentes de nitrógeno y de

25 carbono de bajo coste se investigó. De forma específica, se cultivaron, 50 ml de ONC-T18 en matraces de 250 ml que contenían 6 g/l de sales marinas artificiales, durante 72 horas a 25 ºC. Las concentraciones de la fuente de carbono y nitrógeno se muestran a continuación con 2 g/l de cada fuente de nitrógeno enumerada, usada en conjunto con 8 g/l de L-glutamato (con la excepción de harina de pescado cuando se usaban 4 g). Las fuentes de carbono se intercambiaron según se ha indicado. Todos los experimentos se realizaron por triplicado; todas las

30 extracciones para análisis de éster de metilo de ácido graso se realizaron por triplicado junto con inyecciones de GC por triplicado.

[0340] Los resultados indican que ONC-T18 de Thraustochytrium sp. produce una cantidad óptima de biomasa celular seca (es decir, una cantidad superior a la de las dos medidas de control) cuando se cultiva en el extracto de

35 levadura y la harina de pescado de EMD como fuentes de nitrógeno. Por el contrario, se encontró que la cantidad de lípido era inferior a la de control, aunque la cantidad de DHA era óptima usando agua de macerado de maíz y peptona de EMD. Por último, se encontró que la fuente de carbono, dextrosa, aumentaba el contenido lipídico, aunque la fructosa y la dextrosa producían un contenido más elevado de DHA que los controles.

40

Tabla 7: Crecimiento de ONC-T18 de Thraustochytrium sp.

Medio (6 g/l de sal, crecimiento 72hrs, cultivos de 50 ml): C (g/l) N (g/l) dew/l medio (g) Lípido (mg/g) Lípido (g/l) DHA (mg/g) DHA (g/l) DHA (% delípido)

Fuentes deNitrógeno: Agua de Macerado de Maíz-Semilla de Algodón-MSG EMD™ YE-MSG EMD™ YE 60 60 60 60 10 10 10 10 11,36 9,99 15,49 35,79 371,97 297,08 343,90 189,01 4,33 2,70 5,02 6,76 111,64 45,20 70,68 37,14 1,244 0,500 0,786 0,448 29,72 16,94 20,70 19,65

Fuentes de Nitrógeno: EMD™ Peptona-MSG Sigma™ YE-MSG Sigma™ YE Fermtech™ YE-MSG Fermtech™ YE Harina de pescado (62 % de proteína) 60 60 60 60 60 60 10 10 10 10 10 12 11,70 9,77 10,39 13,99 17,07 19,53 379,48 257,86 341,98 269,53 243,23 290,72 4,19 3,28 3,53 3,82 4,15 5,68 83,50 54,60 58,30 56, 97 48,01 73,59 0,926 0,618 0,629 0,664 0,530 0,828 "23,33 19,69 17,01 21,10 19,74 25,31

Fuentes de Carbono: Fructosa Dextrosa Dextrina de maíz Gelatina 60 60 60 60 10 10 10 10 14,57 14,98 4,65 7,09 498,54 623,91 89,69 31,87 8,09 9,87 0,39 0,13 96,97 113,69 25,69 11,86 1,070 1,232 0,278 0,127 21,55 18,94 26,75 27,70

Almidón (maíz) Almidón (trigo): 5 30 5 30 10 10 10 10 4,85 3,13 8,03 18,16 94,04 90,07 86,96 18,59 0,46 0,28 0,47 0,34 19,49 23,78 17,62 3,83 0,206 0,256 0,185 0,042 20,72 26,40 17,76 20,58

Medio de control (1) Medio de control (2): 60 60 10 10 16,92 10,88 487,59 483,06 8,25 6,06 70,87 74,64 0,768 0,818 13,25 16,19

Abreviaturas:

MSG = L-glutamato YE = Extracto de levadura (sódico)

12. Ejemplo 12: Técnicas de Extracción para aislamiento de lípidos totales y fracciones

5 [0341] Se sometieron a ensayo una diversidad de métodos para el aislamiento de aceites omega-3 seleccionados para determinar la eficacia óptima del aislamiento. Estos métodos incluían: el método convencional de Bligh y Dyer (Bligh y Dyer, Can J. Biochem. Physiol., 37: 912-917, 1959); el método de extracción y transesterificación combinadas usado de forma específica con especies de Traustoquitridos que permite el procesamiento de muestras para análisis de GC FAME rápido (Lewis et al., J. Microbiol. Methods, 43: 107-116, 2000); extracción mediante

10 saponificación simultánea (Cartens et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 73: 1025-1031, 1996); y extracción en fase sólida usando columnas sobre gel de sílice que pueden aislar triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos de forma selectiva (Pinkart et al., J. Microbiol. Methods, 34: 9-15, 1998; Bateman y Jenkins, J. Agric. Food Chem., 45: 132-135, 1997).

[0342] De forma específica, 40 gramos de peso celular seco de biomasa de la cepa ONC-T18 de Thraustochytrium

15 sp. producida en una sola realización de fermentación (véase el ejemplo 1) se dividieron en lotes de 0,44 g y se usaron para cada técnica. Todas las técnicas se realizaron por triplicado con eficaces analizadas usando determinación de éster de metilo del ácido graso a través de FID-GC, de nuevo por triplicado con realizaciones por triplicado por muestra. Los resultados demuestran que el contenido total de ácido graso total podía variar entre métodos individuales con fluctuaciones lo más probablemente debidas a la saturación de disolvente:compuesto,

20 consideraciones de alteración de biomasa y otras consideraciones de condiciones físicas (por ejemplo, temperatura y tiempo).

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12, variando en un 97,5-91,0 % de similitud entre ellos. Además con estas especies se destruyen de forma global, con dos tercios aislados a partir de las aguas costeras tropicales de Japón, China e Israel y el resto de las aguas templadas de América, Europa y Canadá.

5 [0354] El perfil de ácido graso de ONC-T18 incluía contenidos elevados de PUFA C22, niveles muy bajos de FA C18 y C20, y la aparición de ácidos grasos saturados de cadena impar (15:0 y 17:0), similares a los de KH105 de Schizochytrium sp. o SR21 de S. limacinum. Además, el análisis de los perfiles de uso de carbono y nitrógeno para las cepas ONC-T18, SR21 y KH105 mostraba un patrón de asimilación similar. El contenido de DPA n-6 en la cepa ONC-T18 variaba de un 6-10 %, que parece que es extremadamente elevado considerando la aparición limitada de

10 DPA n-6 en la biosfera. Sin embargo, se informó de niveles de DPA n-6 similares en Nakahara et al. (JAm Oil Chem Soc 73: 1421-1426 (1996)) en SR21 de Schizochytrium sp. (6-10 %) y Ellenbogen et al. (Comp Biochem Physiol 29: 805-81 (1969)) en T. aureum (9,5 %) y T. roseum (6,6 %).

[0355] El análisis del perfil de ácido graso de ONC-T18 en tres configuraciones de cultivo diferentes: (1) placa de

15 agar; (2) matraz cónico y (3) biorreactor y cultivando en el mismo medio (Fig. 13), muestra una disminución de la diversidad de los PUFA presentes y un aumento total de TFA a partir de placa de agar con respecto a biorreactor. De forma específica, las placas de agar presentaban una matriz de los PUFA, mientras que los cultivos en matraz y biorreactor estaban dominados por uno o dos compuestos intermedios (Fig. 13). En comparación con Thraustochytrium aureum, que decía mejor en cultivo en matraz que en un fermentador de tanque agitado (Ilda et al.,

20 J Ferment Bioeng 81: 76-78 (1996))la cepa ONC-T18 crecía mejor en un biorreactor. Esto está de acuerdo con lo que considera (Nakahara et al., J Am Oil Chem Soc 73: 1421-1426 (1996)), se encuentra que SR21 de Schizochytrium sp. presentaba alta resistencia a la agitación mecánica, y por lo tanto se desarrollaba en condiciones de biorreactor.

25 [0356] Además, se encontró que algunos pigmentos carotenoides a producir en fermentaciones en placa, matraz y biorreactor de la cepa ONC-T18 de Thraustochytrium sp. daba como resultado una decoloración de color naranja pálido. La producción de estos antioxidantes es máxima dentro de fermentaciones en biorreactor de forma simultánea con la producción de ácido graso. Además, a través del uso de espectrometría de masas con HPLC, se determinó que estos compuestos antioxidantes se identificaban como astaxantina, zeaxantina, cantaxantina,

30 equineona y β-caroteno (Fig. 14), estando conjugados con diversos PUFA. Se informó de resultados similares entre miembros del grupo de los Traustoquítidos de protistas. De forma específica, se mostró que el agregado de Schizochytrium producía equinenona y cantaxantina (Valadon, Trans Br Mycol Soc 67: 1-15 (1976)), mientras que Carmona et al. (Biosci Biotechnol Bioehem 67: 884-888 (2003) y Huang et al. (Mar Biotechnol 5: 450-457 (2003)) demostraban la producción de astaxantina, equinenona, cantaxantina, foenicoxantina (no zeaxantina como en la

35 cepa ONC-T18) y β-caroteno por la cepa CHN-1 de Thraustochytrium sp., un pariente cercano de la cepa ONC-T18 (Fig. 12). En este estudio, se encontró que algunas concentraciones de los carotenoides eran de un orden de magnitud inferior a los de CHN-1 con el costo principal siendo β-caroteno, en lugar de astaxantina. Por lo tanto, dentro de Thraustochytrium spp., la producción de PUFA y carotenoide se puede unir de modo que no almacena dentro de las grasas que se están produciendo se puede proteger de la oxidación.

40 [0357] Anteriormente, se ha determinado que las cantidades relativas de los componentes el ácido graso principal (ácidos mirístico, palmítico y oleico) se pueden alterar en cierto modo cambiando las condiciones de crecimiento del cultivo (Ilda et al., J Ferment Bioeng 81: 76-78 (1996)). De esta manera, se puede manipular la composición final del ácido graso y por lo tanto, las propiedades físicas del PUFA deseado de una manera controlada durante la

45 fermentación (Sijtsma et al., Recent Res Devel Microbiol 2: 219-232 (1998)). En un intento para limitar los factores que inhiben la producción tanto de biomasa como de PUFA omega-3 en la cepa ONC-T18, los componentes de carbono, nitrógeno y sal marina en medios de nutrientes se manipularon (Tabla 9), junto con la duración del cultivo (Fig. 15).

50 Tabla 9: Producción media de biomasa (SD < 15 %), contenido de ácido graso total (TFA) y DHA de la cepa ONC-T18 de Thranstochytrium sp.

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5 12,13

5,21

29,18 0,18

20 13,73 29,59 24,01 0,98

40 16,69 59,39 23,88 2,37

60 21,08 51,01 26,17 2,81 100 18,40 69,49 31,55 4,03 160

10,68

9,40

30,01 0,30

YE (g l-1): MSG (g l-1) Biomasa (g l-1) TFA (% de biomasa) DHA (% deTFA) DHA (g l-1)

10: 0 22,33 34,53 20,20 1,56

8: 2 22,81 44,00 17,52 1,72

6: 4 22,64 50,69 16,23 1,86

4: 6 24,46 69,07 24,19 4,09

2: 8 26,09 81,73 20,99 4,47

0: 10 7,50 1,97 28,81 0,04

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2 24,70

59,23

31,44 4,60

6 21,08 51,01 26,17 2,81 15 22,90 69,32 25,32 4,02 30 17,76 61,02 25,25 2,74 40 17,27 68,21 24,02 2,83 50

18,77

59,63

22,56 2,53

[0358] Dentro de este estudio, a medida que la concentración de nitrógeno disminuía, el contenido total de ácido graso aumentaba, con el contenido total de ácido graso más elevado (aproximadamente un 80 %) obtenido a una 5 concentración de un 1 % de extracto de levadura y/o glutamato monosódico (p/v). Sin embargo, los cultivos con una concentración de nitrógeno baja también imitaban el crecimiento celular y por lo tanto la producción total de ácido graso total. En este experimento, la producción óptima se obtuvo usando 8 g l-1 de glutamato monosódico y 2 g l-1 de extracto de levadura, produciendo 26,1 g l-1 de biomasa y 4,5 g l-1 de DHA (Tabla 9). Además, los aumentos de carbono hasta 100 g l-1 aumentaban de forma eficaz el rendimiento de DHA, y esto está de acuerdo con los 10 resultados obtenidos para la cepa SR21 de Schizochytrium sp. (Yokochi et al., Appl Microbiol Biotechnol 49: 72-76, (2003)) y al contrario que los mostrados para T. aureum en los que las concentraciones de glucosa superiores a 10 g l-1 eran inhibitorias (Ilda et al., J Ferment Bioeng 81: 76-78 (1996)). Los rendimientos máximos de DHA de más de 4,0 g l-1 se obtuvieron en medio de glucosa, con rendimientos superiores a más de 5 veces los de T. aureum (Bajpai et al., J Am Oil Chem Soc 68: 509-514 (1991)) y T. roseum (Li y Ward, J Ind Microbiol 13: 238-241 (1994)) y

15 comparables con los de las cepas SR21 y KH105 de Schizochytrium sp. (Aki et al., J Am Oil Chem Soc 80: 789-794 (2003)). Por último, la cepa ONC-T18 presentaba capacidades eurihalinas clásicas, siendo capaces de resistir salinidad es que variaban de 2,0 a 50,0 g l-1 , dando como resultado una productividad de biomasa de una variabilidad de un 25-30 % (Tabla 9). En el mismo experimento, se encontró que los valores de DHA en g l-1 variaban hasta un 45 % entre la cantidad óptima de 4,6 g l-1 y mínima de 2,5 g l-1 (Tabla 9).

20 [0359] La biomasa, TFA y DHA producidos por la cepa ONC-T18 durante un periodo de 168 h en un biorreactor de 5 l se presentan en la Figura 15. La curva de crecimiento representada es habitual para varios crecimientos conseguidos en condiciones idénticas. La producción máxima de biomasa se alcanzó después de 120 h, cerca del punto de supresión de fuente de carbono (es decir, glucosa). Esté también en el punto en el que el contenido total de

25 ácido graso de la biomasa alcanzaba un máximo aproximadamente un 70 % de biomasa. De forma interesante, solamente después de 24 h de cultivo, el contenido de DHA alcanzó un máximo de un 30 % de ácido graso total, permaneciendo constante en lo sucesivo a un 20-25 %. Estos resultados son coherentes con los de otras cepas de Traustoquítidos que producen ácido graso, aunque existe una disparidad con respecto a la tasa a la que se producen estas reacciones.

30

c) Discusión

[0360] Anteriormente, la mayoría de los estudios identificaban cepas de Labyrinturomycota que son incapaces de almacenar ácido graso total en cantidades superiores a un 20 % de biomasa. Por ejemplo, antes del aislamiento de

35 la cepa SR 21 de Schizochytrium sp. que es capaz de acumular hasta un 50 % de biomasa como grasa, T. aureum era el mejor acumulador a un 20 % (Bajpai et al., J Am Oil Chem Soc 68: 509-514 (1991)). La cepa de ONC-T18, por otro lado, es capaz de acumular hasta un 80 % de su biomasa como lípido.

[0361] Para microorganismos oleaginosos tales como ONC-T18 para acumular aceite, por lo general se debería

40 cultivar en medio de cultivo con una cantidad limitada de nitrógeno (normalmente agotado después de 24 a 36 h) y cantidades abundantes de una fuente de carbono. Una vez que el nitrógeno se suprime, los microbios oleaginosos

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c) Ejemplo 3: Suplemento de ácido oleico (ejemplo de trabajo)

[0366] Los medios que contenían 6 g/l de sal marina, 2 g/l de extracto de levadura, y 8 g/l de hidrato de sal monosódica del ácido L-glutámico se trataron en autoclave a 120 ºC durante 20 minutos. A continuación, se añadió D(+)-glucosa esterilizada a una concentración de 5 g/l o no se añadió a los medios. Se añadió ácido oleico a los medios para representar una concentración final de 2 ml/l. La cepa ONC-T18 se añadió a continuación a los medios a partir de un inóculo de un día que se había cultivado en medio de Windust (5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de peptona, 40 g/l de D(+)-glucosa, 1,25 ml/l de elementos traza de Windust, 1,25 m/l de vitaminas de Windust, 40 g/l de sal marina; (elementos traza de Windust: 5 g/l de NaH2PO4.H2O, 3,15 g/l de FeCl3.6H2O, 4,36 g/l de Na2EDTA.2H2O, 0,6125 mg/l de CuSO4.5H2O, 0,0597g/l de Na2MoO4.2H2O, 0,022 g/l de ZnSO4.7H2O, 0,01 g/l de CoCl2.6H2O, 0,18 g/l de MnCl2.4H2O, 13 µg/l de H2SeO3, 2,7 mg/l de NiSO4.6H2O, 1,84 mg/l de Na3VO4, 1,94 mg/l de K2CrO4), (vitaminas de Windust: 1 mg/l de vitamina B12, 1 mg/l de biotina, 0,20 g/l de tiamina HCl)). El cultivo se produjo en un agitador (130 rpm) durante 3 días a temperatura ambiente. Después del periodo de incubación, las células se cosecharon mediante centrifugación a 4300 rpm durante 10 minutos, se lavaron una vez con agua destilada, y a continuación se centrifugaron de Novoa 4300 rpm durante 10 minutos. A continuación, los sedimentos celulares se liofilizaron, se pesaron y el aceite se extrajo de las células.

[0367] Los lípidos se extrajeron y se derivatizaron a ésteres dimetilo de ácido graso (FAME) para análisis de cromatografía de gas (GC). La transesterificación y la extracción se realizaron usando 200 mg de células liofilizadas, con C19:0 como patrón interno, se añadió a la mezcla de reacción de transesterificación (metanol: ácido clorhídrico: cloroformo, 10:1:1) se mezcló y se calentó a 90 ºC durante 2 horas, a continuación se permitió que se enfriara a temperatura ambiente. Los FAME se extrajeron mediante adición de 1 ml de agua, y 2 ml de hexano:cloroformo (4:1), y se permitió que las fases orgánica y acuosa se separaran. La fase orgánica se extrajo y se trató con 0,5 g de sulfato sódico anhidro para retirar partículas y agua residual. Los disolventes orgánicos se evaporaron en una corriente de argón. Los FAME se volvieron a suspender en 5 ml de iso-octano y se analizaron mediante GC-FID. El porcentaje de conversión se calculó dividiendo el producto producido entre la suma de (el producto producido + el sustrato añadido) y a continuación multiplicando por 100. Los resultados se muestran en la Figura 11. Los resultados también muestran que el suplemento de ácido oleico daba como resultado un aumento del contenido y proporción de DHA acumulado en la cepa ONC-T18.

d) Ejemplo 4: Suplemento de Capsaicina

[0368] Los medios que contenían 6 g/l de sal marina y 10 g/l de extracto de levadura se trataron en autoclave a 120 ºC durante 20 minutos. A continuación, se añadió D(+)-glucosa esterilizada a los medios a una concentración de 40 g/l. A continuación, se pusieron 50 ml de este medio en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. La capsaicina (Sigma) se disolvió en etanol a una concentración de 10 g/l y se añadió al medio para representar una concentración final de 0,1 g/l. La cepa ONC-T18 se añadió al medio desde un cultivo en placa y se cultivó en un agitador (130 rpm) a temperatura ambiente durante cuatro días. Después del periodo de incubación, las células se cosecharon mediante centrifugación a 4300 rpm durante 10 minutos, se lavaron una vez con agua destilada, and y a continuación se centrifugaron de nuevo a 4300 rpm durante 10 minutos. A continuación, los sedimentos celulares se liofilizaron, se pesaron y el aceite se extrajo de las células.

[0369] Los lípidos se extrajeron y se derivatizaron a ésteres dimetilo de ácido graso (FAME) para análisis de cromatografía de gas (GC). La transesterificación y la extracción se realizaron usando 200 mg de células liofilizadas, con C19:0 como patrón interno, se añadió a la mezcla de reacción de transesterificación (metanol: ácido clorhídrico: cloroformo, 10:1:1) se mezcló y se calentó a 90 ºC durante 2 horas, a continuación se permitió que se enfriara a temperatura ambiente. Los FAME se extrajeron mediante adición de 1 ml de agua, y 2 ml de hexano: cloroformo (4:1), y se permitió que las fases orgánica y acuosa se separaran. La fase orgánica se extrajo y se trató con 0,5 g de sulfato sódico anhidro para retirar partículas y agua residual. Los disolventes orgánicos se evaporaron en una corriente de argón. Los FAME se volvieron a suspender en 5 ml de iso-octano y se analizaron mediante GC-FID. El porcentaje de conversión se calculó dividiendo el producto producido entre la suma de (el producto producido + el sustrato añadido) y a continuación multiplicando por 100. Los resultados se muestran en la Figura 11. Los resultados también muestran que la exposición a capsaicina daban como resultado una disminución del contenido de C16:0 y un aumento del contenido de C16:1 en la cepa ONC-T18.

e) Ejemplo 5: Adición de Ácido Toluico

[0370] Los medios que contenían 20 g/l de sal marina y 10 g/l de extracto de levadura se trataron en autoclave a 120 ºC durante 20 minutos. A continuación, se añadió D(+)-glucosa esterilizada a los medios a una concentración de 20 g/l. A continuación, se pusieron 50 ml de este medio en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se añadió ácido toluico (Sigma) disuelto en etanol a una concentración de 20 g/l al medio para representar una concentración final de 0,2 g/l. La cepa ONC-T18 se añadió en el medio desde un cultivo en placa y se cultivó en un agitado (130 rpm) a temperatura ambiente durante cuatro días. Después del periodo de incubación, las células cultivadas se recuperaron mediante centrifugación a 4300 rpm durante 10 minutos, se lavaron una vez con agua destilada, y se volvieron a centrifugar. Los sedimentos celulares se liofilizaron, se pesaron y el aceite se extrajo de las células. (Ejemplo 19)

Claims

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