ES2559959T3

ES2559959T3 - Enzimas inmovilizadas y métodos para usar las mismas

Info

Publication number: ES2559959T3
Application number: ES11189338.4T
Authority: ES
Inventors: Jaroslav A. Kralovec; Weijie Wang
Original assignee: DSM Nutritional Products AG
Current assignee: DSM Nutritional Products AG
Priority date: 2005-06-16
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2016-02-16
Anticipated expiration: 2026-06-13
Also published as: DK2439268T3; EP1915443A2; EP2439268A1; EP1915443A4; CA2605832A1; CA2605832C; WO2007102050A3; US20100041111A9; US20090042263A1; EP3508572A1; WO2007102050A2; US8951761B2; PL2439268T3; EP2439268B1

Abstract

Un método para esterificar un ácido graso, que comprende: hacer pasar una mezcla de reacción que comprende un ácido graso y un alcohol a través de un lecho de enzima inmovilizada, en el que la enzima inmovilizada comprende CALB inmovilizada sobre una matriz de calidad alimentaria que es un copolímero de (1) divinilbenceno y (2) etilvinilbenceno o (1) divinilbenceno y (2) estireno y en el que no se usa un tensioactivo en la preparación de la enzima inmovilizada.

Description

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DESCRIPCION

Enzimas inmovilizadas y metodos para usar las mismas Campo

El tema divulgado se refiere a metodos para esterificar un acido graso usando enzimas inmovilizadas.

Antecedentes

Los efectos beneficiosos de los acidos grasos poliinsaturados (PUFA, por sus siglas en ingles) de cadena larga que son caracteristicos de los flpidos marinos, especialmente acido cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (EPA) y acido cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico (DHA), sobre la disminucion de trigliceridos sericos estan ahora bien establecidos. Estos compuestos tambien se conocen por otros beneficios cardioprotectores y otros efectos biologicos. Entre los beneficios mas frecuentemente mencionados estan los relacionados con la prevention y el tratamiento de la inflamacion, enfermedades neurodegenerativas y anormalidades del desarrollo cognitivo. El publico es cada vez mas consciente de los beneficios para la salud del aceite de pescado y concentrados de DHA y EPA, como se evidencia a partir de las ventas mundiales de los acidos grasos poliinsaturados (PUFA). Por ejemplo, las ventas de PUFA ascendieron un 50% en 2002, y fueron los unicos de todas las categorias de productos nutriceuticos que tuvieron un incremento de ventas significativo.

Zuta y cols. describen la smtesis de acilgliceroles a partir de acidos grasos w-3 e isomeros de acido linoleico conjugados en Biotechnology and Applied Biochemistry, 2006, 43(1), 25-32. Se conocen varios metodos para producir concentrados de PUFA a partir de aceites marinos, por ejemplo, hidrolisis selectiva con lipasas, complejacion de PUFA usando urea (o estructuras moleculares huesped-hospedante mas sofisticadas que implican el control metrico), y una retirada fisica de componentes no deseados mediante fractionation. La Publication de EE. UU. N° 2004/0236128 describe la separation de EPA a partir de DHA al precipitar sal magnesica de EPA.

Una fraccionacion que implica destilacion molecular se efectua habitualmente sobre esteres etflicos preparados a partir de los trigliceridos de partida ya que son mas volatiles que los trigliceridos correspondientes. Sin embargo, hay una controversia en cuanto a si los esteres etflicos de PUFA estan tan biodisponibles como sus homologos de triglicerido. Por lo tanto, hay una necesidad de reesterificar los esteres hasta los trigliceridos correspondientes.

La reaction que describe la formation de trigliceridos a partir de los esteres etflicos de aceite de pescado es la transesterificacion. La transesterificacion es un procedimiento en el que un ester se convierte en otro ester a traves de intercambio de los restos alcoxi.

R-COOR1 + R2OH ■» ~ R-COOR2 + R!OH

La reaccion es un procedimiento de equilibrio y la transformation se produce de forma esencial simplemente mezclando los dos componentes. Sin embargo, se ha observado que la reaccion es acelerada por catalizadores de acido de Lewis (tales como BBr3, AlCh, etc., embebidos en poliestireno-divinilbenceno), catalizadores de acido de Bronsted tales como HCl, H3PO4, H2SO4, p-TosOH, o catalizadores basicos tales como alcoxidos metalicos, hidroxidos metalicos y carbonatos metalicos.

Sin embargo, se ha hecho evidente que la reaccion de transesterificacion bajo estas condiciones no cumple en muchos casos los requisitos de la qmmica sintetica moderna, es decir, condiciones de reaccion muy eficientes y regioselectivas. Asi, han continuado los esfuerzos para efectuar transesterificaciones bajo condiciones mas suaves y para controlar la aleatorizacion. Entre los catalizadores qmmicos desarrollados, se encontro que el distanoxano era eficaz para la transesterificacion de diversos tipos de esteres; sin embargo, este catalizador es dificil de preparar y no esta disponible comercialmente, al menos en grandes cantidades. El metodo de transesterificacion mediado por titanato es extremadamente suave pero no consigue ciertos tipos de transesterificaciones. De forma similar, las reacciones catalizadas por DMAP o las reacciones en presencia de superacidos basados en estano tienen diferentes perfiles de selectividad de reaccion. Tambien se han hecho intentos satisfactorios de realizar transesterificaciones usando zeolitas, alumina cromatografica neutra o caolinitas.

A pesar de los avances en la qmmica sintetica moderna, los catalizadores industriales mas populares son las bases fuertes. Son economicas, pero debido a su naturaleza generan un grado significativo de productos secundarios, particularmente a las altas temperaturas necesarias para alcanzar los rendimientos deseables. Ademas, no son regioselectivas y conducen a reacciones secundarias. Aunque pueden ser buenas elecciones para entidades qmmicas estables y estructuralmente adecuadas, no se prefieren para productos complejos tales como, por ejemplo, aceites de pescado. En el caso de los aceites de pescado, las transesterificaciones catalizadas enzimaticamente son una alternativa viable, puesto que son regioselectivas y virtualmente no generan productos secundarios. Sin embargo, generalmente, su desventaja es su coste.

El uso de enzimas inmovilizadas en metodos para la esterification de acidos grasos se divulga, por ejemplo, en los documentos WO 95/33047, US 5569594, US 6605452 y WO 01/62906

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Por lo tanto, hay una necesidad de transesterificar esteres complejos tales como, por ejemplo, esteres de acidos grasos poliinsaturados en esteres mas utiles. Tambien hay una necesidad de una esterificacion eficaz de acidos carboxflicos complejos tales como acidos grasos. Los procedimientos deben tener una alta eficacia con respecto a la transesterificacion y la esterificacion y sin embargo no producir productos secundarios no deseables. El procedimiento tambien debe ser relativamente economico para aplicaciones comerciales. Finalmente, los esteres producidos por los metodos descritos en la presente memoria deben estar listos para ser incorporados en numerosos productos alimenticios sin el requisito de retirar impurezas adicionales del procedimiento de transesterificacion. Los metodos descritos en la presente memoria satisfacen estas necesidades experimentadas desde hace mucho tiempo.

Sumario

Segun los propositos de los materiales, los compuestos, las composiciones, los artfculos y los metodos divulgados, que se incorporan y se describen ampliamente en la presente memoria, la materia divulgada se refiere a metodos para esterificar un acido graso utilizando enzimas inmovilizadas.

Ventajas adicionales se indicaran en parte en la descripcion que sigue, y en parte seran obvias a partir de la descripcion, o se pueden aprender mediante la practica de los aspectos descritos posteriormente. Las ventajas descritas posteriormente se conoceran y alcanzaran por medio de los elementos y las combinaciones apuntados particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Se debe entender que tanto la descripcion general precedente como la siguiente descripcion detallada son solamente ejemplares y explicativas y no son restrictivas.

Breve descripcion de las figuras

Las figuras adjuntas, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran varios aspectos descritos posteriormente.

La Figura 1 es un esquema de un procedimiento para la transformacion enzimatica de esteres etflicos (o acidos grasos libres) en trigliceridos. En la figura, 1 representa un recipiente de contencion calentado removido, 2 representa una bomba de cizalladura, 3 representa un reactor de lecho enzimatico fijo (FEBR, por sus siglas en ingles), 4 representa un deposito de evaporacion, y 5 representa un condensador. El reactor 3 puede ser de geometna variable (p. ej., longitud > altura o longitud < altura).

La Figura 2 es una grafica de una conversion enzimatica de acidos grasos libres en un triglicerido con una enzima CALB inmovilizada sobre una matriz de calidad alimentaria (AMBERLITE™ XAD 16HP). Se uso el mismo lecho enzimatico para 40 rondas.

Descripcion detallada

Los materiales, los compuestos, las composiciones, los artfculos y los metodos descritos en la presente memoria se pueden entender mas facilmente mediante referencia a la siguiente descripcion detallada de aspectos espedficos de la materia divulgada y los Ejemplos incluidos en la presente memoria y a las Figuras.

Antes de que se divulguen y se describan los presentes materiales, compuestos, composiciones, artfculos y metodos, se debe entender que los aspectos descritos posteriormente no estan limitados a metodos sinteticos espedficos o reactivos espedficos, ya que estos, por supuesto, pueden variar. Tambien se debe entender que la terminologfa usada en la presente memoria solamente tiene el proposito de describir aspectos particulares y no pretende ser limitativa.

Definiciones generales

En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hara referencia a un numero de terminos, que se definiran para tener los siguientes significados:

A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, la palabra "comprenden" y otras formas de la palabra, tales como "que comprende(n)" y "comprende", significa incluir, pero no se limita a, y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, numeros enteros o etapas. Segun se usan en la descripcion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" "uno/una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Asf, por ejemplo, la referencia a "un compuesto" incluye mezclas de dos o mas de tales compuestos, la referencia a "un acido graso insaturado" incluye mezclas de dos o mas de tales acidos grasos insaturados, la referencia a "la matriz" incluye mezclas de dos o mas de tales matrices, y similares. "Opcional" u "opcionalmente" significa que el suceso o la circunstancia descrito posteriormente se puede presentar o no, y que la descripcion incluye casos en los que el suceso o la circunstancia se presenta y casos en los que no. Los intervalos se pueden expresar en la presente memoria como de "aproximadamente" un valor particular y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otro aspecto incluye

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desde el valor particular y/o hasta el otro valor particular. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del precedente "aproximadamente," se entendera que el valor particular forma otro aspecto. Se entendera ademas que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relacion con el otro punto final como independientemente del otro punto final. Tambien se debe entender que hay un numero de valores divulgados en la presente memoria, y que cada valor tambien se divulga en la presente memoria como "aproximadamente" ese valor particular ademas del propio valor. Por ejemplo, si se divulga en valor "10", entonces tambien se divulga "aproximadamente 10". Tambien se debe entender que cuando se divulga un valor, entonces tambien se divulgan "menor que o igual al" valor, "mayor que o igual al valor" y posibles intervalos entre los valores, como se entiende apropiadamente por el experto en la especialidad. Por ejemplo, si se divulga el valor "10", entonces tambien se divulga "menor que o igual a l0" asf como "mayor que o igual a 10". Tambien se entiende que a lo largo de la solicitud, se proporcionan datos en un numero de formatos diferentes y que estos datos representan puntos terminales y puntos de partida e intervalos para cualquier combinacion de los puntos de datos. Por ejemplo, si se divulgan un punto de datos particular "10" y un punto de datos particular "15", se entiende que tambien se consideran divulgados mayor que, mayor que o igual a, menor que, menor que o igual a e igual a 10 y 15, asf como entre 10 y 15. Tambien se entiende que tambien se divulga cada unidad entre dos unidades particulares. Por ejemplo, si se divulgan 10 y 15, entonces tambien se divulgan 11, 12, 13 y 14.

Las referencias en la memoria descriptiva y las reivindicaciones finales a partes en peso de un elemento o componente particular en una composicion indica la relacion en peso entre el elemento o componente y cualesquiera otros elementos o componentes de la composicion o el artfculo para los que se exprese una parte en peso. Asf, en un compuesto que contiene 2 partes en peso de componente X y 5 partes en peso de componente Y, X e Y estan presentes en una relacion en peso de 2:5, y estan presentes en esta relacion independientemente de si estan contenidos en el compuesto componentes adicionales.

Un porcentaje en peso de un componente, a menos que se indique espedficamente lo contrario, se basa en el peso total de la formulacion o composicion en la que se incluye el componente.

A menos que se indique lo contrario, una formula con enlaces qmmicos mostrados solo como lmeas solidas y no como cunas o lmeas de puntos contempla todos los isomeros posibles, p. ej., todos los enantiomeros y diastereoisomeros, y una mezcla de isomeros, tales como mezclas racemicas o escalemicas.

Se hara ahora referencia con detalle a aspectos espedficos de los materiales, los compuestos, las composiciones, los artmulos y los metodos divulgados, cuyos ejemplos se ilustran en los Ejemplos y las Figuras adjuntos.

Se divulgan en la presente memoria materiales, compuestos, composiciones y componentes que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en una preparacion para o son productos de los metodos y las composiciones divulgados. Estos y otros materiales se divulgan en la presente memoria, y se entiende que cuando se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, aunque no se pueda divulgar espedficamente una referencia espedfica de cada una de diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos, cada uno se contempla y se describe espedficamente en la presente memoria. Por ejemplo, si se divulga un compuesto y se divulga un numero de modificaciones que se pueden hacer en un numero de componentes o residuos del compuesto, se contemplan espedficamente todas y cada una de las combinaciones y permutaciones que sean posibles a menos que se indique espedficamente lo contrario. Asf, si se divulga una clase de componentes o residuos A, B y C asf como una clase de componentes o residuos D, E y F y se divulga un ejemplo de un compuesto combinado A-D, entonces incluso si cada uno no se cita individualmente, cada uno se contempla individualmente y colectivamente. Asf, en este ejemplo, se contempla espedficamente cada una de las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F y se debe considerar divulgada a partir de la divulgacion de A, B y C; D, E y F; y la combinacion ejemplar A-D. Asimismo, tambien se contempla y se divulga espedficamente cualquier subconjunto o combinacion de estos. Asf, por ejemplo, se contempla espedficamente el subgrupo de A-E, B-F y C-E y se debe considerar divulgado a partir de la divulgacion de A, By C; D, E y F; y la combinacion ejemplar A-D. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta divulgacion incluyendo, pero no limitados a, etapas de los metodos para elaborar y usar las composiciones divulgadas. Asf, si hay una variedad de etapas adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estas etapas adicionales se puede realizar con cualquier aspecto espedfico o combinacion de aspectos de los metodos divulgados, y que cada una de tales combinaciones se contempla espedficamente y se debe considerar divulgada.

Ciertos materiales, compuestos, composiciones y componentes divulgados en la presente memoria se pueden obtener comercialmente o sintetizar facilmente usando tecnicas generalmente conocidas por los expertos en la especialidad. Por ejemplo, las materias primas y los reactivos usados para preparar los compuestos y las composiciones divulgados bien estan disponibles de proveedores comerciales tales como Ocean Nutrition Canada, Ltd. (Dartmouth, Canada), Aldrich Chemical Co., (Milwaukee, Wis.), Acros Organics (Morris Plains, N.J.), Fisher Scientific (Pittsburgh, Pa.) o Sigma (St. Louis, Mo.) o bien se preparan mediante metodos conocidos por los expertos en la especialidad siguiendo procedimientos indicados en referencias tales como Reagents for Organic Synthesis de Fieser and Fieser, Volumenes 1-17 (John Wiley and Sons, 1991); Chemistry of Carbon Compounds de Rodd, Volumenes 1-5 y Suplementos (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volumenes 1-40 (John Wiley and Sons, 1991); Advanced Organic Chemistry de March, (John Wiley and Sons, 4a Edicion); y Comprehensive Organic Transformations de Larock (VCH Publishers Inc., 1989).

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Enzimas inmovilizadas

En un aspecto, se divulgan en la presente memoria enzimas inmovilizadas que comprenden una enzima de esterification, transesterificacion o interesterificacion/intraesterificacion inmovilizada en una matriz de calidad alimentaria. Cada componente de las enzimas inmovilizadas divulgadas se describe posteriormente.

Enzimas

Las enzimas utiles en la presente memoria son cualesquiera enzimas naturales o sinteticas que se puedan usar para esterificar un acido carboxflico o transesterificar un ester. El termino "esterificar" se define en la presente memoria como la conversion de un acido carboxflico en el ester correspondiente al hacer reaccionar el acido carboxflico con un alcohol para producir el ester (p. ej., RCOOH + R1OH^ RCOOR1 + H2O). El termino "transesterificar" se define en la presente memoria como la conversion de un ester en otro al hacer reaccionar el ester con un alcohol para producir un ester diferente (p. ej., RCOOR1 + R2OH ^ RCOOR2 + R1OH). El termino "interesterificar" se define en la presente memoria como el intercambio de restos ester entre dos o mas esteres independientes separados. La interesterificacion entre dos esteres se representa en el esquema 1A, donde los grupos R2 y R4 se intercambian en las materias primas (es decir, R1COOR2 y R3COOR4). El esquema 1B representa la interesterificacion entre un acido carboxflico (R1COOH) y un ester (R3COOR4), que produce un nuevo acido carboxflico y ester. El termino "intraesterificar" se define en la presente memoria como el intercambio de los restos ester dentro de la misma molecula. La intraesterificacion se representa en el esquema 1C, donde los grupos R2 y R3 se intercambian en el triester. El esquema 1D representa la intraesterificacion entre un grupo acido carboxflico y un ester dentro de la misma molecula, donde el hidrogeno del acido carboxflico se intercambia por R3 del grupo ester.

R(C04<2 - RjCO?R4 -----------------R'CO:.R4+ iCcO-iC \,\

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IP

Enzimas adecuadas se pueden derivar de un microorganismo. Ejemplos de microorganismos que pueden producir enzimas utiles en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, Burkholderia sp., Candida antarctica B, Candida rugosa, Candida cylindracea, Pseudomonas sp., Candida antarctica A, Porcine pancreas, Humicola sp., Humicola Y lanuginose, Mucor miehei, Rhizopusjavan., Pseudomonas fluor, Pseudomonas cepacia, Candida cylindrcae, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Mucor jaanicus, Mucor javanicus, Rhizopus sp., Rhizopus japonicus, Rhizomucor miehi, Rhizopus niveus o penicillium camembertii (tambien Rhizopus delemar, Pseudonomas, aeruginosa).

En los metodos de la invention, la enzima inmovilizada comprende CALB, que es una lipasa (lipasa B) de Candida antarctica producida mediante la fermentation sumergida de un microorganismo Aspergillus oryzae geneticamente modificado. CALB L NOVOZYME(TM) es un catalizador muy versatil con actividad para una gran variedad de diferentes sustratos. La enzima se usa en particular como un potente catalizador enantioselectivo en la smtesis de alcoholes, aminas y acidos carboxflicos opticamente activos. Se sabe que la lipasa B de Candida antarctica convierte eficazmente esteres etflicos o acidos grasos libres en trigliceridos. Esta enzima es una protema con 317 residuos de aminoacido y un peso molecular de 33.008 daltons. Los aminoacidos se ensamblan en 14 helices [a] y 9 laminas [B]. La secuencia y la estructura secundaria de la lipasa B de Candida antarctica se proporciona en la SEq ID N°:1.

Tambien se contempla que se puedan inmovilizar y usar en los metodos descritos en la presente memoria derivados de enzimas producidas a partir de microorganismos. Se entiende que la estructura de muchas enzimas, como las

RsC02H •* R'COjR4 - • fCcO-tR4 ■ R-CO-*H

-------OCCOjR1: _____fST/Affi 1 ( ft lUIS,

—octop2 ——►: —OQ-0)!3

-------OO.OJR': L—(xxojr2

—OCCOJR*: —mow1

—ocpp ----------—►: —cecoji1

1—OC(0)EJ: -------Q€(0JB

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divulgadas en la presente memoria, se conoce y se puede encontrar, por ejemplo, en Genbank, y se incorpora en la presente memoria mediante referencia.

Como todas las lipasas microbianas, CALB pertenece a las hidrolasas a/p, cuyo pliegue comprende laminas p de ocho hebras intercaladas entre dos capas de helices a anfifflicas. El mecanismo de hidrolisis del ester de estas enzimas implica generalmente la union al sustrato de ester, la formacion del primer producto intermedio tetraedrico por ataque nucleofilo a la serina catalttica con el oxianion estabilizado por dos o tres enlaces de H, el llamado hueco del oxianion. El enlace ester se escinde y la enzima acilada se hidroliza en la etapa final. El ataque nucleofilo por la serina catalttica esta mediado por el residuo catalttico de histidina y acido aspartico o glutamico. En ciertos ejemplos, la cadena de acido graso mas larga que se une completamente dentro del bolsillo de union de CALB es C 13; asf, el sitio de acido graso escindible de esta enzima es relativamente corto (13,5 A). El sitio de union de CALB es relativamente corto y tiene una pequena area hidrofoba situada en la pared del tunel de union. La estructura de CALB ha sido publicada en el Protein Data Bank (The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. Bernstein y cols., J. Mol. Biol. 112:525-542, 1977). Tambien se entiende que las enzimas divulgadas se pueden definir por sus centros cataltticos conservados que se conocen en la especialidad y se divulgan en la presente memoria.

Similitudes de secuencia

Se entiende que segun se analiza en la presente memoria el uso de los terminos "homologfa" e "identidad" significa lo mismo que similitud. Asf, por ejemplo, si se usa la palabra homologfa entre dos secuencias no naturales, se entiende que esto no esta indicando necesariamente una relacion evolutiva entre estas dos secuencias sino que, en cambio, esta considerando la similitud o relacion entre sus secuencias. Muchos de los metodos para determinar homologfa entre dos moleculas evolutivamente relacionadas se aplican habitualmente a cualesquiera dos o mas acidos nucleicos o protemas con el proposito de medir la similitud de secuencias, independientemente de si estan evolutivamente relacionadas o no.

En general, se entiende que un modo de definir cualesquiera variantes y derivados conocidos o los que podnan surgir de los genes y las protemas divulgados en la presente memoria, tales como SEQ ID N°:1 es a traves de definir las variantes y los derivados en cuanto a la homologfa con secuencias conocidas espedficas. Esta identidad de secuencias particulares divulgadas en la presente memoria tambien se analiza en cualquier parte en la presente memoria. En general, las variantes de genes y protemas de la presente memoria divulgadas tienen tfpicamente al menos aproximadamente 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de homologfa con la secuencia indicada o la secuencia natural. Los expertos en la especialidad entienden facilmente como determinar la homologfa de dos protemas o acidos nucleicos, tales como genes. Por ejemplo, la homologfa se puede calcular despues de alinear las dos secuencias de modo que la homologfa este en su nivel mas alto.

Otro modo de calcular la homologfa se puede realizar mediante algoritmos publicados. El alineamiento optimo de las secuencias para la comparacion se puede efectuar mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante al algoritmo de alineamiento por homologfa de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el metodo de la busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988, mediante ejecuciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BeSTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion.

Se pueden obtener los mismos tipos de homologfa para acidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos divulgados en Zuker, Science 244:48-52, 1989, Jaeger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7706-7710, 1989, Jaeger y cols., Methods Enzymol. 183:281-306, 1989, que se incorporan en la presente memoria mediante referencia al menos para material relacionado con el alineamiento de acidos nucleicos. Se entiende que tfpicamente se puede usar cualquiera de los metodos y que en ciertos casos los resultados de estos diversos metodos pueden diferir, pero el experto sabe que si se encuentra identidad con al menos uno de estos metodos, se dina que las secuencias tienen la identidad indicada y se divulganan en la presente memoria.

Por ejemplo, segun se usa en la presente memoria, una secuencia que se cita que tiene un porcentaje de homologfa particular con otra secuencia se refiere a secuencias que tienen la homologfa citada segun se calcula por uno cualquiera o mas de los metodos de calculo descritos anteriormente. Por ejemplo, una primera secuencia tiene 80 por ciento de homologfa, segun se define en la presente memoria, con una segunda secuencia si se calcula que la primera secuencia tiene 80 por ciento de homologfa con la segunda secuencia usando el metodo de calculo de Zuker aunque la primera secuencia no tenga 80 por ciento de homologfa con la segunda secuencia segun se calcula mediante cualquiera de los otros metodos de calculo. Como otro ejemplo, una primera secuencia tiene 80 por ciento de homologfa, segun se define en la presente memoria, con una segunda secuencia si se calcula que la primera secuencia tiene 80 por ciento de homologfa con la segunda secuencia usando tanto el metodo de calculo de Zuker como el metodo de calculo de Pearson y Lipman aunque la primera secuencia no tenga 80 por ciento de homologfa con la segunda secuencia segun se calcula mediante el metodo de calculo de Smith y Waterman, el metodo de calculo de Needleman y Wunsch, el metodo de calculo de Jaeger o cualquiera de los otros metodos de calculo.

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Como otro ejemplo mas, una primera secuencia tiene 80 por ciento de homolog^a, segun se define en la presente memoria, con una segunda secuencia si se calcula que la primera secuencis tiene 80 por ciento de homologfa con la segunda secuencia usando cada uno de los metodos de calculo (aunque, en la practica, los diferentes metodos de calculo a menudo daran como resultado diferentes porcentajes de homologfa calculados).

Hibridacion/hibridacion selectiva

Tambien se entiende que las enzimas divulgadas en la presente memoria, tales como SEQ ID N°:1, se pueden clasificar por la capacidad de los acidos nucleicos que las codifican para hibridarse a otros acidos nucleicos. El termino "hibridacion" significa tipicamente una interaccion conducida por secuencia entre al menos dos moleculas de acido nucleico, tales como un cebador o una sonda y un gen. La expresion "interaccion conducida por secuencia" significa una interaccion que se produce entre dos nucleotidos o analogos de nucleotido o derivados de nucleotido de un modo espedfico para los nucleotidos. Por ejemplo, G que interactua con C o A que interactua con T son interacciones conducidas por secuencia. Tfpicamente, las interacciones conducidas por secuencia se producen sobre la cara de Watson-Crick o la cara de Hoogsteen del nucleotido. La hibridacion de dos acidos nucleicos esta afectada por un numero de condiciones y parametros conocidos por los expertos en la especialidad. Por ejemplo, las concentraciones de sales, el pH y la temperatura de la reaccion afectan todos a si dos moleculas de acido nucleico se hibridan.

Los parametros para la hibridacion selectiva entre dos moleculas de acido nucleico son muy conocidos para los expertos en la especialidad. Por ejemplo, en algunos ejemplos, las condiciones de hibridacion selectiva se pueden definir como condiciones de hibridacion restrictivas. Por ejemplo, la restriccion de la hibridacion se controla tanto mediante la temperatura como mediante la concentracion de sal de cualquiera o ambas de las etapas de hibridacion y lavado. Por ejemplo, las condiciones de hibridacion para alcanzar la hibridacion selectiva pueden implicar hibridacion en solucion de alta intensidad ionica (6X SSC o 6X SSPE) a una temperatura que esta de aproximadamente 12 a aproximadamente 25°C por debajo de la Tm (la temperatura de fusion a la que la mitad de las moleculas se disocian de sus socios de hibridacion), seguido por lavado con una combinacion de temperatura y concentracion de sal elegida de modo que la temperatura de lavado este de aproximadamente 5°C a aproximadamente 20°C por debajo de la Tm. La temperatura y las condiciones salinas se determinan de forma facil empmcamente en pruebas preliminares en las que muestras de DNA de referencia inmovilizadas sobre filtros se hibridan a un acido nucleico marcado de interes y a continuacion se lavan bajo condiciones de diferentes restricciones. Las temperaturas de hibridacion tfpicamente son superiores para hibridaciones de DNA-RNA y RNA- RNA. Las condiciones se pueden usar como se describe anteriormente para alcanzar restriccion, o como se sabe en la tecnica. (Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; Kunkel y cols. Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987, que se incorpora en la presente memoria mediante referencia al menos para material relacionado con la hibridacion de acidos nucleicos). Una condicion de hibridacion restrictiva preferible para una hibridacion de DNA:DNA puede ser a aproximadamente 68°C (en solucion acuosa) en 6X SSC o 6X SSPE seguido por lavado a 68°C. La restriccion de la hibridacion y el lavado, si se desea, se pueden reducir segun esto a medida que el grado de complementariedad se disminuye, y ademas, dependiendo de la riqueza en G-C o A-T de cualquier area en la que se busque variabilidad. Asimismo, la restriccion de la hibridacion y el lavado, si se desea, se puede incrementar segun esto a medida que se incrementa la homologfa deseada, y ademas, dependiendo de la riqueza en G-C o A-T de cualquier area en la que se desee una alta homologfa, todo segun se sabe en la especialidad.

Otro modo de definir una hibridacion selectiva es considerar la cantidad (porcentaje) de uno de los acidos nucleicos unidos al otro acido nucleico. Por ejemplo, en algunos ejemplos, las condiciones de hibridacion selectiva senan cuando al menos aproximadamente 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento del acido nucleico limitativo este unido al acido nucleico no limitativo. Tfpicamente, el cebador no limitativo esta, por ejemplo, en un exceso de 10 o 100 o 1.000 veces. Este tipo de ensayo se puede realizar bajo condiciones en las que tanto el cebador limitativo como el no limitativo estan, por ejemplo, 10 veces o 100 veces o 1.000 veces por debajo de su kd, o cuando solo una de las moleculas de acido nucleico esta 10 veces o 100 veces o 1.000 veces, o cuando una o ambas moleculas de acido nucleico estan por encima de su kd.

Otro modo de definir una hibridacion selectiva es considerar el porcentaje de cebador que queda enzimaticamente manipulado bajo condiciones en las que se requiere hibridacion para promover la manipulacion enzimatica deseada. Por ejemplo, en algunos ejemplos, las condiciones de hibridacion selectiva senan cuando al menos aproximadamente 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento del cebador este enzimaticamente manipulado bajo condiciones que promuevan la manipulacion enzimatica; por ejemplo, si la manipulacion enzimatica es extension de DNA, entonces las condiciones de hibridacion selectiva senan cuando se extiende al menos aproximadamente 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento de las moleculas de cebador. Condiciones preferidas tambien incluyen las sugeridas por el fabricante o indicadas en la tecnica como apropiadas para que la enzima realice la manipulacion.

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Igual que con la homologfa, se entiende que hay una variedad de metodos en la presente memoria divulgados para determinar el nivel de hibridacion entre dos moleculas de acido nucleico. Se entiende que estos metodos y condiciones pueden proporcionar diferentes porcentajes de hibridacion entre dos moleculas de acido nucleico, pero a menos que se indique otra cosa, sena suficiente cumplir los parametros de cualquiera de los metodos. Por ejemplo, se considera divulgado en la presente memoria que se requiere 80% hibridacion y con tal de que la hibridacion se produzca dentro de los parametros requeridos en uno cualquiera de estos metodos.

Se entiende que los expertos en la especialidad saben que si una composicion o un metodo cumple uno cualquiera de estos criterios para determinar la hibridacion bien colectivamente o bien individualmente, es una composicion o un metodo que se divulga en la presente memoria.

Peptidos

Segun se analiza en la presente memoria, hay numerosas variantes y se conocen y se contemplan en la presente memoria derivados de cepas de las enzimas divulgadas, tales como SEQ ID N°:1. Las enzimas se pueden elaborar a partir de protemas o peptidos. Variantes y derivados de protemas son muy conocidos por lo expertos en la especialidad y pueden implicar modificaciones de la secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, las modificaciones de secuencias de aminoacidos estan tfpicamente dentro de una o mas de tres clases: variantes de sustitucion, insercion o eliminacion. Las inserciones incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales asf como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoacidos individuales o multiples. Normalmente, las inserciones seran inserciones mas pequenas que las de las fusiones amino- o carboxilo-terminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro residuos. Derivados de protemas de fusion inmunogenicos, tales como los descritos en los ejemplos, se elaboran fusionando un polipeptido suficientemente grande para conferir inmunogenicidad a la secuencia diana mediante reticulacion in vitro o mediante cultivo de celulas recombinantes transformado con DNA que codifica la fusion. Las eliminaciones se caracterizan por la retirada de uno o mas residuos de aminoacido de la secuencia de protema. Tfpicamente, no mas de aproximadamente 2 a 6 residuos se eliminan en un sitio cualquiera dentro de la molecula de la protema. Estas variantes se preparan normalmente mediante mutagenesis dirigida de nucleotidos en el DNA que codifica la protema, produciendo de ese modo DNA que codifica la variante, y posteriormente expresando el DNA en un cultivo de celulas recombinantes. Se conocen bien tecnicas para elaborar mutaciones de sustitucion en sitios predeterminados en DNA que tiene una secuencia conocida, por ejemplo mutagenesis con cebador M13 y mutagenesis por PCR. Tfpicamente, las sustituciones de aminoacidos son de residuos individuales pero se pueden producir en un numero de diferentes posiciones a la vez; las inserciones seran habitualmente del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoacido; y las eliminaciones variaran de aproximadamente 1 a 30 residuos. Las eliminaciones o inserciones se realizan preferiblemente en pares adyacentes, es decir, una eliminacion de 2 residuos o una insercion de 2 residuos. Las sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinacion de las mismas se pueden combinar para llegar a la construccion final. Las mutaciones no deben situar la secuencia fuera del marco de lectura y preferiblemente no crearan regiones complementarias que puedan producir una estructura de mRNA secundaria. Las variantes de sustitucion son aquellas en las que al menos un resido se ha retirado y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Generalmente, tales sustituciones se realizan segun las siguientes Tablas A y B y se denominan sustituciones conservativas.

Tabla A: Abreviaturas de Aminoacidos

Aminoacido: Abreviaturas

alanina: Ala (A)

aloisoleucina: AIle

arginina: Arg (R)

asparagina: Asn(N)

acido aspartico: Asp(D)

cistema: Cys(C)

acido glutamico: Glu (E)

glutamina: Gln (Q)

Aminoacido: Abreviaturas

glicina: Gly (G)

histidina: His (H)

isolelucina: Ile (I)

leucina: Leu (L)

lisina: Lys (K)

fenilalanina: Phe (F)

prolina: Pro (P)

acido piroglutamico: Glu

serina: Ser (S)

treonina: Thr (T)

tirosina: Tyr(Y)

triptofano: Trp (W)

valina: Val (V)

Tabla B: Sustituciones de Aminoacidos

Sustituciones Conservativas Ejemplares de Residuos Originales, se conocen otras en la tecnica.

Ala ^ ser

Arg ^ lys o gln

Asn ^ gln o his

Asp ^ glu

Cys ^ ser

Gln ^ asn o lys

Glu ^ asp

Gly ^ pro

His ^ asn o gln

Ile ^ leu o val

Leu ^ ile o val

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Lys ^ arg o gln;

Met ^ Leu o ile

Phemet ^ leu o tyr

Ser ^ thr

Thr ^ ser

Trp ^ tyr

Tyr ^ trp o phe

Val ^ ile o leu

Se realizan cambios sustanciales en la funcion o la identidad inmunologica al seleccionar sustituciones que son menos conservativas que las de la Tabla B, es decir, seleccionar residuos que difieren mas significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: (a) la estructura de la cadena principal polipeptidica en el area de la sustitucion, por ejemplo como una conformacion laminar o helicoidal; (b) la carga o la hidrofobia de la molecula en el sitio diana; o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera generalmente que produzcan los mayores cambios en las propiedades de la protema seran aquellas en las que (a) un residuo hidrofilo, p. ej., serilo o treonilo, sustituye a (o es sustituido por) un resido hidrofobo, p. ej., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cistema o prolina sustituye a (o es sustituida por) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisilo, arginilo o histidilo sustituye a (o es sustituido por) un residuo electronegativo, p. ej., glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, sustituye a (o es sustituido por) uno que no tiene una cadena lateral, p. ej., glicina, en este caso, (e) al incrementar el numero de sitios para sulfatacion y/o glicosilacion.

Por ejemplo, la sustitucion de un residuo de aminoacido por otro que sea biologicamente y/o qmmicamente similar es conocida por los expertos en la especialidad como una sustitucion conservativa. Por ejemplo, una sustitucion conservativa sena reemplazar un residuo hidrofobo por otro o un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como, por ejemplo, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Tales variaciones sustituidas conservativamente de cada secuencia divulgada explfcitamente se incluyen dentro de los polipeptidos mosaico proporcionados en la presente memoria.

Se puede emplear mutagenesis de sustitucion o eliminacion para insertar sitios para la /V-glicosilacion (Asn-X- Thr/Ser) o la O-glicosilacion (Ser o Thr). Tambien pueden ser deseables eliminaciones de cistema u otros residuos labiles. Las eliminaciones o sustituciones de sitios de proteolisis potenciales, p. ej., Arg, se efectuan, por ejemplo, al eliminar uno de los residuos basicos o sustituir uno por residuos glutaminilo o histidilo.

Ciertas derivaciones postraduccionales son el resultado de la accion de celulas huesped recombinantes sobre el polipeptido expresado. Frecuentemente, residuos glutaminilo y asparaginilo se desamidan postraduccionalmente hasta los residuos glutamilo y asparilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan bajo condiciones suavemente acidas. Otras modificaciones postraduccionales incluyen la hidroxilacion de prolina y lisina, la fosforilacion de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilacion de los grupos amino w de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]), la acetilacion de la amina V-terminal y, en algunos casos, la amidacion del carboxilo C-terminal.

Se entiende que un modo de definir las variantes y los derivados de las protemas divulgadas en la presente memoria es a traves de la definicion de las variantes y los derivados en cuanto a la homologfa/identidad con secuencias conocidas espedficas. Por ejemplo, SEQ ID N°:1 indica una secuencia particular de una lipasa. Se divulgan espedficamente variantes de estas y otras protemas en la presente memoria divulgadas que tienen al menos aproximadamente 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 de homologfa con la secuencia indicada. Los expertos en la especialidad saben facilmente como determinar la homologfa de dos protemas. Por ejemplo, la homologfa se puede calcular despues de alinear las dos secuencias de modo que la homologfa este en su nivel mas alto.

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Otro modo de calcular la homolog^a puede ser mediante algoritmos publicados. El alineamiento optimo de secuencias para comparacion se puede efectuar mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineamiento por homologfa de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988, mediante ejecuciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTAy TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion.

Se pueden obtener los mismos tipos de homologfa para acidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos divulgados en Zuker, Science 244:48-52, 1989, Jaeger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7706-7710, 1989, Jaeger y cols., Methods Enzymol. 183:281-306, 1989, que se incorporan en la presente memoria mediante referencia al menos para su material relacionado con el alineamiento de acidos nucleicos.

Se entiende que la descripcion de las mutaciones conservativas y la homologfa se puede combinar entre sf en cualquier combinacion, tal como realizaciones que tienen al menos 70% de homologfa con una secuencia particular en la que las variantes son mutaciones conservativas.

Como esta memoria descriptiva analiza diversas protemas y secuencias de protema, se entiende que tambien se divulgan los acidos nucleicos que pueden codificar esas secuencias de protema. Esto incluira todas las secuencias degeneradas relacionadas con un secuencia de protema espedfica, es decir, todos los acidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia de protema particular asf como todos los acidos nucleicos, incluyendo acidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes y los derivados divulgados de las secuencias de protema. Asf, aunque todas las secuencias de acido nucleico particulares no se pueden escribir en la presente memoria, se entiende que todas y cada una de las secuencias se divulgan y describen de hecho en la presente memoria a traves de la secuencia de protema divulgada. Tambien se entiende que aunque ninguna secuencia de aminoacidos indique que secuencia de DNA particular codifica esa protema dentro de un organismo, cuando se divulgan en la presente memoria variantes particulares de una protema divulgada, tambien se conoce la secuencia de acido nucleico conocida que codifica esa protema en la cepa particular de la que surge esa protema y se divulga y se describe en la presente memoria.

Se entiende que hay numerosos analogos de aminoacidos y peptidos que se pueden incorporar en las composiciones divulgadas. Por ejemplo, hay numerosos D-aminoacidos o aminoacidos que tienen un sustituyente funcional diferente que los aminoacidos mostrados en la Tabla A y la Tabla B. Se divulgan los estereoisomeros opuestos de peptidos naturales, asf como los estereoisomeros y analogos peptfdicos. Estos aminoacidos se pueden incorporar facilmente en cadenas polipeptfdicas al cargar moleculas de tRNA con el aminoacido de eleccion y construcciones de manipulacion genetica que utilizan, por ejemplo, codones ambar para insertar el aminoacido analogo en una cadena peptfdica de un modo espedfico para el sitio (Thorson y cols., Meth. Mol. Biol. 77:43-73, 1991; Zoller, Curr. Opinion Biotechnol. 3:348-354, 1992; Ibba, Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 13:197-216, 1995; Cahill y cols., TIBS 14(10):400-403, 1989; Benner, TIB Tech 12:158-163, 1994; Ibba y Hennecke, Bio/technology 12:678682, 1994, todas las cuales se incorporan en la presente memoria mediante referencia al menos para su material relacionado con analogos de aminoacidos).

Se pueden producir codones que se asemejan a peptidos, pero que no estan conectados a traves de un enlace peptfdico natural. Por ejemplo, enlaces para aminoacidos o analogos de aminoacido pueden incluir, pero no se limitan a, CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CHH2SO- (Estos y otros se pueden encontrar en Spatola, en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides y Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, p. 267, 1983; Spatola, Vega Data (marzo 1983), Vol. 1, Edicion 3, Peptide Backbone Modifications (revision general); Morley, Trends Pharm. Sci. 463-468, 1980; Hudson y cols., Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185, 1979 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola y cols., Life Sci. 38:1243-1249, 1986 (-CH2-S); Hann, J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314, 1982 (-CH=CH-, cis y trans); Almquist y cols., J. Med. Chem. 23:1392-1398, 1980 (-COCH2-); Jennings-White y cols., Tetrahedron Lett. 23:2533, 1982 (-COCH2-); Szelke y cols., Solicitud Europea N° EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay y cols., Tetrahedron. Lett. 24:44014404, 1983 (-C(OH)CH2-); y Hruby, Life Sci. 31:189-199, 1982 (-CH2-S-); cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria mediante referencia. Un enlace no peptfdico particularmente preferido es -CH2NH-. Se entiende que los analogos peptfdicos pueden tener mas de un atomo entre los atomos del enlace, tales como p-alanina, acido Y-aminobutmco y similares.

Los analogos de aminoacido y los analogos peptfdicos a menudo tienen propiedades mejoradas o deseables, tales como mas produccion economica, mayor estabilidad qmmica, propiedades farmacologicas (semivida, absorcion, potencia, eficacia, etc.) mejoradas, especificidad alterada (p. ej., un amplio espectro de actividades biologicas), antigenicidad reducida, y otras. Se pueden usar D-aminoacidos para generar peptidos mas estables, debido a que los D-aminoacidos no son reconocidos por peptidasas y similares. La sustitucion sistematica de uno o mas aminoacidos de una secuencia de consenso por un D-aminoacido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar para generar peptidos mas estables. Se pueden usar residuos de cistema para ciclar o ligar dos o mas peptidos entre si. Esto puede ser beneficioso para constrenir peptidos en conformaciones particulares. (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387, 1992,).

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Matriz de calidad alimentaria

El termino "matriz de calidad alimentaria" es cualquier material que pueda formar una matriz para inmovilizar una enzima y que se acredite por the U.S. Food and Drug Administration como un Secondary Direct Food Additive bajo 21 C.F.R. § 173. Las Secciones 5-165 de 21 C.F.R. § 173 proporcionan ejemplos representativos de materiales utiles como la matriz de calidad alimentaria asf como las cantidades permisibles de impurezas a considerar en una matriz de calidad alimentaria util en la presente memoria. Por ejemplo, el material usado para producir la matriz de calidad alimentaria comprende menos de 10%, menos de 8%, menos de 6%, menos de 4% o menos de 2% en peso de impurezas no polimerizables.

La matriz de calidad alimentaria es un copolfmero de (1) divinilbenceno y (2) etilvinilbenceno o estireno. El Tttulo 21 C.F.R. § 173.65 proporciona los requisitos para el uso de copolfmeros de divinilbenceno como un aditivo alimentario directo secundario. Por ejemplo, el copolfmero de divinilbenceno debe tener al menos 79 por ciento en peso de divinilbenceno y no mas de 4 por ciento en peso de impurezas no polimerizables. Ejemplos de copolfmeros de divinilbenceno utiles en la presente memoria como matrices de calidad alimentaria incluyen, pero no se limitan a, AMBERLITE XAD 16HP, AMBERLITE FPX600, AMBERLITE tmFPX66 y DUOLITE A7, todos los cuales son fabricados por Rohm and Haas (Filadelfia, PA). AMBERLITE™ XAD1 6HP y FPX600 son copolfmeros de poliestireno/divinilbenceno macroporosos reticulados.

En un ejemplo espedfico, la enzima es lipasa B de Candida antarctica y la matriz de calidad alimentaria es AMBERLITE ™ XAD 16HP.

Produccion de enzimas inmovilizadas

La produccion de la enzima inmovilizada implica generalmente mezclar la enzima con el material usado para producir la matriz de calidad alimentaria en un disolvente tal como, por ejemplo, agua. No se usa un tensioactivo en la preparacion de la enzima inmovilizada. Parametros de inmovilizacion tales como el pH, la temperatura, la duracion de la inmovilizacion, etc. variaran dependiendo de la seleccion de la enzima y el material de la matriz de calidad alimentaria. Despues de que la inmovilizacion sea completa, la solucion se drena y la enzima-matriz resultante se puede lavar con agua u otros disolventes adecuados. La seleccion de disolventes para la preparacion de la enzima inmovilizada debe ser un material que sea compatible con el consumo humano. Asf, el agua es un disolvente preferido. Despues de que la enzima se haya inmovilizado, la enzima-matriz se puede secar bajo presion reducida y/o a temperatura elevada, o usando otro medio gaseoso o lfquido (N2, Ar, aceite, etc.).

La enzima se puede inmovilizar sobre la matriz a traves de uniones o enlaces covalentes o no covalentes (p. ej., electrostaticos, ionicos, enlace de hidrogeno, adsorcion, atrapamiento, encapsulacion, etc.) dependiendo de la seleccion de la enzima y la matriz de calidad alimentaria, asf como las condiciones de inmovilizacion. Sin querer limitarse por una teona, se cree que la inmovilizacion de la enzima sobre la matriz hace a la enzima significativamente mas estable debido a la fijacion de la conformacion de la enzima. Si es posible, la enzima no se debe filtrar de la matriz, lo que incrementara la eficacia del procedimiento de esterificacion asf como prolongara la vida de la enzima inmovilizada para uso futuro. Tambien es deseable que las enzimas ligadas a la superficie de la matriz sean tales que las enzimas expongan su centro catalttico.

La cantidad de enzima inmovilizada sobre la matriz puede variar dependiendo de la enzima y la matriz seleccionadas y el uso final de la enzima inmovilizada. En un aspecto, la cantidad de enzima inmovilizada en la matriz es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 35 KUL (kilounidades de lipasa) por gramo de matriz basado en la diferencia de concentracion de enzima en la solucion usada para interactuar con la matriz, segun se mide a 280 nm. En otros ejemplos, la cantidad de enzima inmovilizada sobre la matriz puede ser aproximadamente 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 KUL/g de matriz, donde cualquier valor puede formar un punto final de un intervalo. En otro ejemplo, la cantidad de enzima inmovilizada en la matriz es de aproximadamente 28 a aproximadamente 32 KUL/g de matriz.

La matriz inmovilizada se puede preparar mediante metodos divulgados en la presente memoria. En ciertos ejemplos, la matriz inmovilizada divulgada se puede preparar a escala de laboratorio, piloto o de fabricacion. Por ejemplo, se puede usar el sistema mostrado en las Figuras 1 y 3 para la preparacion de enzimas inmovilizadas a escala piloto y de fabricacion. Ademas, se puede usar mas de un lecho enzimatico. Esto es, se pueden usar procedimientos en los que mas de un reactor de lecho fijo enzimatico que contiene las enzimas inmovilizadas divulgadas estan conectados en serie o paralelo. El numero de reactores dependera de las cantidades de produccion y las materias primas deseadas. Tambien se pueden usar diversas geometnas de reactores enzimaticos. Ejemplos de geometnas de reactores adecuadas se muestran en la Figura 4.

Uso de enzimas inmovilizadas

Se describen en la presente memoria metodos para esterificar un acido graso que comprenden hacer pasar una mezcla de reaccion que comprende un acido graso y un alcohol a traves de un lecho de enzima inmovilizada. Por "acido graso" se entiende un acido carboxflico con al menos 10 atomos de carbono. En un aspecto, el acido graso

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puede comprender al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o al menos 20 atomos de carbono, en algunos ejemplos espedficos, el acido graso puede contener 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44 o 45 atomos de carbono, donde cualquiera de los valores indicados puede formar un punto final superior o inferior cuando sea apropiado. En otros ejemplos, el acido graso puede comprender una mezcla de acidos grasos que tienen un intervalo de atomos de carbono. Por ejemplo, el acido graso puede comprender de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 12 a aproximadamente 38, de aproximadamente 14 a aproximadamente 36, de aproximadamente 16 a aproximadamente 34, de aproximadamente 18 a aproximadamente 32 o de aproximadamente 20 a 30 atomos de carbono. Los acidos grasos pueden ser saturados, insaturados o una mezcla de acidos grasos saturados e insaturados. Por "saturado" se entiende que la molecula o residuo no contiene dobles o triples enlaces carbono- carbono. Por "insaturado" se entiende que la molecula o el residuo contiene al menos un doble o triple enlace carbono-carbono.

En un ejemplo espedfico, los acidos grasos o los esteres de los mismos se pueden derivar de aceites marinos, tales como aceite de pescado, antes de la esterificacion. Tfpicamente, tales aceites contienen mezclas de acidos grasos saturados e insaturados, pero se pueden procesar para dar como resultado una mezcla de acidos grasos particular (p. ej., que contiene todos saturados, todos insaturados, mezclas de ambos, o mezclas con acidos grasos de una cierta longitud de cadena o intervalo de longitudes de cadena). Se puede usar cualquier aceite de pescado en los compuestos y los metodos divulgados. Ejemplos de aceites de pescado adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite de pescado del Atlantico, aceite de pescado del Padfico, aceite de pescado del Mediterraneo, aceite de pescado prensado ligero, aceite de pescado tratado con alcali, aceite de pescado termotratado, aceite de pescado marron ligero y pesado, aceite de bonito, aceite de sardina europea, aceite de atun, aceite de lubina, aceite de rodaballo, aceite de marlin, aceite de barracuda, aceite de bacalao, aceite de sabalo, aceite de sardina, aceite de boqueron, aceite de capelan, aceite de bacalao del Atlantico, aceite de arenque del Atlantico, aceite de caballa del Atlantico, aceite de sabalo del Atlantico, aceite de salmonidos y aceite de tiburon, incluyendo mezclas y combinaciones de los mismos. Tambien es adecuado el aceite de pescado no tratado con alcali. Otros aceites marinos adecuados para el uso en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, aceite de calamar, aceite de sepia, aceite de pulpo, aceite de krill, aceite de foca, aceite de ballena y similares, incluyendo mezclas y combinaciones de los mismos. Cualquier aceite marino y combinacion de aceite marino se puede usar en las composiciones divulgadas y en los metodos divulgados para prepararlas. Aceites adicionales incluyen ciertos ejemplos, el ester del acido graso es un ester alqrnlico de cadena ramificada o lineal C1-C6 tal como, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y similares.

En otros ejemplos espedficos, un acido graso o el ester del mismo se puede usar en los metodos descritos en la presente memoria. Por "acido graso" se entiende un acido carboxflico con al menos 10 atomos de carbono. En un aspecto, el acido graso o el ester del mismo puede comprender al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o al menos 20 atomos de carbono. En algunos ejemplos espedficos, el acido graso o el ester del mismo puede contener 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 atomos de carbono, donde cualquiera de los valores indicados puede formar un punto final superior o inferior cuando sea apropiado. En otros ejemplos, el acido graso o el ester del mismo puede comprender una mezcla de acidos grasos o los esteres de los mismos que tienen un intervalo de atomos de carbono. Por ejemplo, el acido graso o el ester del mismo puede comprender de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 12 a aproximadamente 38, de aproximadamente 14 a aproximadamente

36, de aproximadamente 16 a aproximadamente 34, de aproximadamente 18 a aproximadamente 32 o de aproximadamente 20 a 30 atomos de carbono.

Los acidos grasos o los esteres de los mismos pueden ser saturados, insaturados o una mezcla de acidos grasos. saturados e insaturados. Por "saturado" se entiende que la molecula o residuo no contiene dobles o triples enlaces carbono-carbono. Por "insaturado" se entiende que la molecula o el residuo contiene al menos un doble o triple enlace carbono-carbono.

En un ejemplo espedfico, los acidos grasos o los esteres de los mismos se pueden derivar de aceites marinos, tales como aceite de pescado, antes de la esterificacion. Tfpicamente, tales aceites contienen mezclas de acidos grasos saturados e insaturados, pero se pueden procesar para dar como resultado una mezcla de acidos grasos particular (p. ej., que contiene todos saturados, todos insaturados, mezclas de ambos, o mezclas con acidos grasos de una cierta longitud de cadena o intervalo de longitudes de cadena). Se puede usar cualquier aceite de pescado en los compuestos y los metodos divulgados. Ejemplos de aceites de pescado adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite de pescado del Atlantico, aceite de pescado del Padfico, aceite de pescado del Mediterraneo, aceite de pescado prensado ligero, aceite de pescado tratado con alcali, aceite de pescado termotratado, aceite de pescado marron ligero y pesado, aceite de bonito, aceite de sardina europea, aceite de atun, aceite de lubina, aceite de rodaballo, aceite de marlin, aceite de barracuda, aceite de bacalao, aceite de sabalo, aceite de sardina, aceite de boqueron, aceite de capelan, aceite de bacalao del Atlantico, aceite de arenque del Atlantico, aceite de caballa del Atlantico, aceite de sabalo del Atlantico, aceite de salmonidos y aceite de tiburon, incluyendo mezclas y combinaciones de los mismos. Tambien es adecuado el aceite de pescado no tratado con alcali. Otros aceites marinos adecuados para el uso en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, aceite de calamar, aceite de sepia, aceite de pulpo, aceite de krill, aceite de foca, aceite de ballena y similares, incluyendo mezclas y

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combinaciones de los mismos. Cualquier aceite marino y combinacion de aceite marino se puede usar en las composiciones divulgadas y en los metodos divulgados para prepararlas. Aceites adicionales incluyen aceite microbiano, aceite de algas (p. ej., aceite de un dinoflagelado tal como Crypthecodinium cohnii), aceite fungico (p. ej., aceite de Thraustochytrium, Schizochytrium o una mezcla de los mismos), y/o un aceite de planta, incluyendo mezclas y combinaciones de los mismos.

Ejemplos de acidos grasos saturados espedficos o esteres de los mismos utiles en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, acido caprico (C10), acido laurico (C12), acido minstico (C14), acido palmftico (C16), acido margarico (C17), acido estearico (C18), acido araqmdico (C20), acido behenico (C22), acido lignocerico (C24), acido cerotico (C26), acido montanico (C28) y acido meKsico (C30), incluyendo derivados ramificados y sustituidos de los mismos.

Los acidos insaturados o esteres de los mismos adecuados para los metodos divulgados en la presente memoria pueden comprender al menos un enlace insaturado (es decir, un doble o triple enlace carbono-carbono). En un ejemplo, el acido graso insaturado o el ester del mismo puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 dobles enlaces, triples enlaces carbono- carbono o cualquier combinacion de los mismos. En otro ejemplo, el acido graso insaturado o ester del miso puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 enlaces insaturados, donde cualquiera de los valores indicados puede formar un punto final superior o inferior cuando sea apropiado.

En un ejemplo, los acidos grasos insaturados o esteres de los mismos pueden comprender un doble enlace carbono-carbono (es decir, un acido o residuo monoenico). Ejemplos de acidos grasos insaturados o esteres de los mismos que son adecuados para los metodos divulgados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, los de la siguiente Tabla 1.

Tabla 1: Ejemplos Acidos Monoenicos

Numero total de atomos de carbono en la cadena de acido graso: Numero de carbono donde empieza el doble enlace.

("c" indica un doble enlace cis; "t" indica un doble enlace trans)

10: 4c

12: 4c

14: 4c y 9c

16: 3t, 4c, 5t, 6c, 6t, 9c (palmitooleico) y 11c

18: 3t, 5c, 5t, 6c (petroselmico), 6t, 9c (oleico), 10c, 11c (cis- vaccenico), 11t (vaccenico) y 13c

20: 5c, 9c (gadolenico), 11c, 13c y 15c

22: 5c, 11c (cetoleico), 13c (erucico) y 15c

24: 15c (selacoleico, nervonico)

26: 9c y 17c (ximenico)

28: 9c, 19c (lumequico)

30: 21c

En otros ejemplos, los acidos grasos insaturados o esteres de los mismos pueden comprender al menos dos enlaces insaturados (p. ej., acidos o residuos polienicos). En algunos ejemplos, los acidos grasos insaturados o esteres de los mismos pueden comprender al menos un par de enlaces insaturados interrumpidos por metileno. Por "enlace insaturado interrumpido por metileno" se entiende que un doble o triple enlace carbono-carbono esta separado de otro doble o triple enlace carbono-carbono por al menos un grupo metileno (es decir, CH2). Ejemplos espedficos de acidos grasos insaturados o esteres de los mismos que contienen al menos un par de enlaces

insaturados interrumpidos por metileno incluyen, pero no se limitan a, la familia n-1 derivada de 9, 12, 15-16:3; la familia n-2 derivada de 9, 12, 15-17:3, 15:3, 17:3, 17:4, 20:4; la familia n-3 derivada de 9, 12, 15-18:3, 15:2, 15:3, 15:4, 16:3, 16:4, 18:3 (a-linolenico), 18:4, 18:5, 20:2, 20:3, 20:4; 20:5 (EPA), 21:5, 22:3, 22:5 (DPA), 22:6 (DHA), 24:3, 24:4, 24:5, 24:6, 26:5, 26:6, 28:7, 30:5; la familia n-4 derivada de 9,12-16:2, 16:2, 16:3, 18:2, 18:3; la familia n-5 5 derivada de 9, 12-17:2, 15:2, 17:2, 17:3,19:2, 19:4, 20:3, 20:4 21:4, 21:5; la familia n-6 derivada de 9, 12-18:2, 15:2, 16:2, 18:2 (acido linoleico), 18:3 (acido Y-linolenico); 20:2, 20:3, 20:4 (acido araquidonico), 22:2, 22:3, 22:4 (acido adrenico), 22:5, 24:2, 24:4, 25:2, 26:2, 30:4; la familia n-7 derivada de 9-16:1, 15:2, 16:2, 17:2, 18:2, 19:2; la familia n-8 derivada de 9-17:1, 15:2, 16:2, 17:2, 18:2, 19:2; la familia n-9 derivada de 9-18:1, 17:2, 18:2, 20:2, 20:3, 22:3, 22:4; la familia n-11 19:2 y la familia n-12 20:2.

10 En el parrafo anterior, los compuestos se identifican haciendo referencia en primer lugar a la "familia n-x", donde x es la posicion en el acido graso en la que empieza el primer doble enlace. El esquema de numeracion empieza en el extremo terminal del acido graso donde, por ejemplo, el grupo CH3 terminal se denomina posicion 1. En este sentido, la familia n-3 sena un acido graso w-3, segun se describe en la presente memoria. El siguiente numero identifica el numero total de atomos de carbono en el acido graso. El tercer numero, que esta despues de los dos

15 puntos, indica el numero total de dobles enlaces en el acido graso. Asf, por ejemplo, en la familia n-1, 16:3 se refiere a un acido graso de 16 carbonos de longitud con 3 dobles enlaces, cada uno separado por un metileno, en donde el primer doble enlace empieza en la posicion 1, es decir, el extremo terminal del acido graso. En otro ejemplo, en la familia n-6, 18:3 se refiere a un acido graso de 18 carbonos de longitud con 3 dobles enlaces separados por metileno que empiezan en la posicion 6, es decir, el sexto carbono desde el extremo terminal del acido graso, etc.

20 Algunos otros ejemplos son acidos grasos o esteres de los mismos que contienen al menos un par de enlaces insaturados interrumpidos por mas de un grupo metileno. Ejemplos adecuados de estos acidos y esteres incluyen, pero no se limitan a, los de la siguiente Tabla 2:

Tabla 2: Ejemplos de Acidos Polienicos

Numero total de atomos de carbono en la cadena de acido graso: Numero de carbono donde empieza el doble enlace. ("c" indica un doble enlace cis; "t" indica un doble enlace trans)

18: 5, 9

: 5, 11

: 2t, 9, 12

: 3t, 9, 12

: 5t, 9, 12

: 5, 9, 12

: 5, 11, 14

: 3t, 9, 12, 15

: 5, 9, 12, 15

20: 5, 11

: 5, 13

: 7, 11

: 7, 13

: 5, 11, 14

: 7, 11, 14

: 5, 11, 14, 17

22: 5, 11

: 5, 13

: 7, 13

: 7, 15

: 7, 17

: 9, 13

: 9, 15

Otros ejemplos adicionales de acidos grasos insaturados o esteres de los mismos que son adecuados para el uso en los metodos divulgados en la presente memoria son los que contienen al menos un enlace insaturado conjugado. Por "enlace insaturado conjugado" se entiende que al menos un par de dobles y/o triples enlaces carbono-carbono 5 estan unidos entre sf, sin un grupo metileno (CH2) entre ellos (p. ej., -CH=CH-CH=CH-). Ejemplos espedficos de acidos grasos insaturados o esteres de los mismos que contienen enlaces insaturados conjugados incluyen, pero no se limitan a, los de la siguiente Tabla 3.

Tabla 3: Ejemplos de Acidos Polienicos Conjugados

10: 2t, 4t, 6c

: 2c, 4t, 6t

: 3t, 5t, 7c

: 3c, 5t, 7t

12: 3, 5, 7, 9, 11

14: 3, 5, 7, 9, 11

18: 10t, 12t

: 8c, 10t, 12c (jacarico)

: 8t, 10t, 12c (calendico)

: 8t, 10t, 12t

: 9t, 11t, 13c (catalpico)

: 9c, 11t, 13t (a-eleoestearico)

: 9c, 11t, 13c (pumcico)

: 9t, 11t, 13t (P-eleoestearico)

: 9c, 11t, 13t, 15c (a-parinarico)

: 9t, 11t, 13t, 15t (P-parinarico)

Los acidos grasos w-3 y los esteres de los mismos tambien son utiles en los metodos descritos en la presente memoria. Los acidos grasos w-3 son acidos grasos insaturados que son particularmente utiles en los compuestos y los metodos divulgados en la presente memoria. Los acidos grasos w-3 no solo exhiben efectos probados sobre la 5 disminucion de los niveles de trigliceridos, sino que tienen una fuerte relacion con la diabetes. Por ejemplo, el acido docosahexaenoico (DHA) tambien tiene un fuerte efecto mejorador de la permeabilidad a insulina y se observa como un mejorador potencial de la absorcion para el aporte intestinal de insulina (Onuki y cols., Int. J. Pharm. 198:147-56, 2000). La toma de DHA evita ciertos procesos bioqmmicos que se originan a partir de la deficiencia de insulina (Ovide-Bordeaux y Grynberg, Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 286:R5l9-27, 2003) y tanto el DHA como 10 el EPA (acido eicosapentaenoico) incrementan significativamente los niveles de insulina en ayunas (Mori y cols., Am. J. Clin. Nutr. 71:1085-94, 2000).

Un acido graso w-3 es un acido graso insaturado que contiene como su extremo CH3-CH2-CH=CH-. Ejemplos espedficos de acidos grasos w-3 y esteres de los mismos que son adecuados para el uso en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, acido linolenico (i8:3w3), acido octadecatetraenoico (18:4w3), acido 15 eicosapentaenoico (20:5w3) (EPA), acido docosahexaenoico (22:6w3) (DHA), acido docosapentaenoico (22:6w3) (DPA), derivados de los mismos y mezclas de los mismos.

En otros ejemplos adicionales, los acidos grasos insaturados y los esteres de los mismos se pueden derivar de un compuesto que comprende la siguiente formula:

O

l H

CH3—CH2—CH=CH—R—C—OH

20 en la que R1 es un grupo alquilo o alquenilo C3-C40 que comprende al menos un doble enlace. El termino "alcano" o "alquilo", segun se usa en la presente memoria, es un grupo hidrocarbonado saturado. El termino "alqueno" o "alquenilo", segun se usa en la presente memoria, es un grupo hidrocarbonado de al menos 2 atomos de carbono con una formula estructural que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Se pretende que estructuras asimetricas tales como (AB)C=C(CD) incluyan los isomeros tanto E como Z (cis y trans). Esto se puede suponer en 25 formulas estructurales de la presente memoria en las que esta presente un alqueno asimetrico o se puede indicar explicitamente por el simbolo de enlace C=C. En un ejemplo adicional, R1 puede ser un grupo aquenilo C5-C38, C6- C36, C8-C34, Cio-C32, Ci2-C3o, Ci4-C28, Ci6-C26 o Ci8-C24. En otro ejemplo mas, el grupo alquenilo de R1 puede tener de 2 a 6, de 3 a 6, de 4 a 6 o de 5 a 6 dobles enlaces. Mas aun, el grupo alquenilo de R1 puede tener desde 1,2, 3, 4, 5 o 6 dobles enlaces, donde cualquiera de los valores indicados puede formar un punto final superior o inferior 30 cuando sea apropiado.

Algunos ejemplos espedficos de acidos grasos insaturados y esteres de los mismos que se pueden usar en los metodos divulgados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, acido linoleico, acido linolenico, acido y- linolenico, acido araquidonico, acido de Mead, acido estearidonico, acido a-eleoestearico, acido eleoestearico, acido pinolenico, acido docosadienico, acido docosatetraenoico, acido docosapentaenoico, acido docosahexaenoico, acido 35 octadecadienoico, acido octadecatrienoico, acido eicosatetraenoico, acido eicosapentaenoico o cualquier combinacion de los mismos. En un aspecto, el ester de acido graso insaturado se puede derivar de acido linolenico

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(18:3u>3), acido octadecatetraenoico (18:4u>3), acido eicosapentaenoico (20:5u>3) (EPA), acido eicosatetraenoico (20:4u>3), acido henicosapentaenoico (21:5w3), acido docosahexaenoico (22:6w3) (DHA), acido docosapentaenoico (22:5u>3) (DPA), incluyendo derivados y mezclas de los mismos.

Ejemplos adicionales de un acido graso insaturado adecuado y esteres del mismo que son adecuados en los metodos incluyen, pero no se limitan a, acidos alenicos y acetilenicos, tales como C14: 2, 4, 5; C18: 5, 6 (labalenico); 5, 6, 16 (lamenalenico); C18: 6a (tarmico); 9a; 9a, 11t (ximenmico); 9a, 11a; 9a, 11a, 13c (bolequico); 9a, 11a, 13a, 15e, 8a, 10t (pirulico) 9c, 12a (crepenmico); 9c, 12a, 14c (acido deshidrocrepenmico); 6a, 9c, 12c; 6a, 9c, 12c, 15c, 8a, 11c, 14c y derivados A17e, derivados 8-OH y derivados A17e, 8-OH correspondientes.

Acidos de cadena ramificada y esteres de los mismos, particularmente isoacidos y anteisoacidos, acidos ramificados polimetilicos, acidos basados en fitol (p. ej., fitanico, pristanico), acidos furanoides tambien son acidos grasos adecuados, para el uso en los metodos divulgados en la presente memoria.

Mas aun, acidos grasos adecuados y esteres de los mismos incluyen, pero no se limitan a, acidos dclicos, tales como acidos grasos de ciclopropano, acidos de ciclopropeno (p. ej., lactobadlico), esterulico, malvalico, esterculmico, 2-hidroxiesterculico, aleprolico, alepramico, aleprestico, alepnlico, aleprico, hidnocarpico, chaulmogrico, hormelico, manaoico, gorlico, oncobico, acidos ciclopentemlicos y acidos ciclohexilalcanoicos.

Hidroxiacidos y esteres de los mismos, particularmente butolico, ricinoleico, isorricinoleico, densipolico, lesquerolico y auriolico tambien son acidos grasos adecuados que con la esterificacion se pueden usar en los metodos divulgados en la presente memoria.

Epoxi-acidos y esteres, particularmente acidos C18:1 y C18:2 y furanoides epoxidados son ejemplos adicionales que se pueden usar en los metodos divulgados.

El alcohol usado en cualquiera de los metodos divulgados en la presente memoria puede ser cualquier alcohol. En un ejemplo, el alcohol es un poliol, que se define como un compuesto que tiene dos o mas grupos hidroxilo. Ejemplos de polioles utiles en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, pentaeritritol, dipentaeritritol, tripentaeritritol, tetrapentaeritritol, tris(hidroximetil)etano o tris(hidroximetil)propano. En otros ejemplos, el alcohol es un azucar tal como, por ejemplo, una glucosamina, un metilglucosido u otro azucar tal como, por ejemplo, sacarosa. En otro ejemplo, el poliol es glicerol.

La cantidad de acido carboxflico/ester y alcohol usada variara dependiendo del acido, el ester y el alcohol seleccionados. En un ejemplo, se puede usar una cantidad estequiometrica de acido carboxflico o ester con relacion al numero de grupos hidroxilo presentes en el alcohol. Por ejemplo, si el alcohol es un diol, entonces dos equivalentes molares de acido carboxflico o ester se pueden esterificar o transesterificar, respectivamente, con un equivalente molar de diol. Se puede usar un exceso de alcohol para alcanzar la esterificacion o transesterificacion maxima asf como disminuir el tiempo de reaccion global. En un aspecto, cuando el alcohol es glicerol, la relacion molar de acido carboxflico o ester a alcohol es de 1:1 a 10:1, de 1:1 a 9:1, de 1:1 a 8:1, de 1:1 a 7:1, de 1:1 a 6:1, de 1:1 a 5:1, de 1:1 a 4:1 o de 1:1 a 3:1.

La cantidad de la enzima inmovilizada (enzima y matriz juntas) tambien puede variar. En un ejemplo, la enzima inmovilizada es de 0,1% a 20% en peso del peso total de acido carboxflico/ester y alcohol. En otros ejemplos, la enzima es 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20% en peso de la reaccion total, donde cualquier valor puede formar un punto final de un intervalo.

El acido carboxflico/ester, el alcohol y la enzima inmovilizada se pueden mezclar entre sf en cualquier orden. Dependiendo de la seleccion del acido carboxflico/ester y el alcohol, puede ser deseable efectuar la esterificacion o transesterificacion mientras se remueve la mezcla de reaccion. Por ejemplo, se puede anadir una solucion de ester y alcohol una a otra bajo remocion seguido por la adicion de la enzima inmovilizada. Ademas la mezcla de reaccion se podna forzar para pasar a traves del lecho de enzima inmovilizada y esto se podna ejecutar en un procedimiento bien continuo o bien discontinuo (individual o reciclado).

En ciertos aspectos, las reacciones de esterificacion, transesterificacion y interesterificacion/intraesterificacion pueden tener lugar a temperatura elevada. La temperatura elevada precisa puede depender del acido carboxflico o ester particular que se use, el alcohol particular que se use, la cantidad o concentracion de los reaccionantes, la preferencia y similares. Temperaturas adecuadas a las que se pueden producir la esterificacion y la transesterificacion incluyen, pero no se limitan a, de aproximadamente 50°C a aproximadamente 100°C, de aproximadamente 70°C a aproximadamente 90°C, de aproximadamente 80°C a aproximadamente 90°C o aproximadamente 85°C. En otro ejemplo, la temperatura de esterificacion puede ser de aproximadamente 60°C a aproximadamente 70°C o aproximadamente 65°C. Al variar la temperatura, es posible reducir los tiempos de reaccion dependiendo de la concentracion de las materias primas. Asf, los tiempos de reaccion pueden variar de 2 horas a 72 horas, de 10 horas a 48, de 10 horas a 36, de 10 horas a 24 horas, de 15 horas a 24 horas, de 20 horas a 24 horas o 22 horas.

En otros ejemplos, el metodo implica esterificar acido eicosapentaenoico 20:5u>3 (EPA), acido docosahexaenoico 22:6u>3 (DHA), acido docosapentaenoico 22:5w3 (DPA) o cualquier mezcla de los mismos con glicerol, en donde el

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acido y el alcohol estan presentes en una relacion molar de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 5:1, en donde la reaccion se remueve en presencia de la enzima inmovilizada a una temperatura de aproximadamente 60°C a aproximadamente 90°C durante de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas, en donde la enzima inmovilizada comprende una enzima derivada de Candida antarctica inmovilizada en una matriz de calidad alimentaria que comprende un copolfmero de divinilbenceno y estireno.

En otro aspecto, el metodo implica transesterificar un ester etflico de acido eicosapentaenoico 20:5u>3 (EPA), acido docosahexaenoico 22:6w3 (DHA), acido docosapentaenoico 22:5w3 (DPA) o cualquier mezcla de los mismos con glicerol, en donde el ester y el alcohol estan presentes en una relacion molar de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 5:1, en donde la reaccion se remueve en presencia de la enzima inmovilizada a una temperatura de aproximadamente 70°C a aproximadamente 90°C durante de aproximadamente 20 horas a aproximadamente 24 horas, en donde la enzima inmovilizada comprende una enzima derivada de Candida antarctica inmovilizada en una matriz de calidad alimentaria que comprende un copolfmero de divinilbenceno y estireno.

Segun se analiza anteriormente, las enzimas de esterificacion y transesterificacion pueden ser enzimas costosas. Asf, los modos para reutilizar la enzima senan de importancia comercial. Las enzimas inmovilizadas descritas en la presente memoria se pueden reutilizar varias veces. Por ejemplo, despues de que la reaccion de esterificacion, transesterificacion o interesterificacion sea completa, la solucion se puede separar por filtracion y la enzima inmovilizada se puede reutilizar. Opcionalmente, la enzima inmovilizada se puede lavar con un disolvente adecuado y agua, lo que puede ser deseable dependiendo de la seleccion del ester y el alcohol usados. Por ejemplo, si el acido/ester y/o el alcohol obstruyen la enzima inmovilizada, entonces sena deseable separar por lavado el ester o el alcohol a fin de incrementar la eficacia de la enzima inmovilizada. En un ejemplo, se puede usar agua para lavar la enzima inmovilizada. Con propositos de almacenamiento, el producto se podna almacenar en presencia de conservantes alimentarios, p. ej., benzoato sodico, sorbato potasico, etc.

Los metodos descritos en la presente memoria son eficaces con respecto a producir esteres a partir de acidos carboxflicos u otros esteres. Por ejemplo, despues de que la reaccion de esterificacion, transesterificacion o interesterificacion/intraesterificacion sea completa, el rendimiento de ester con relacion a la materia prima es de aproximadamente 70 a aproximadamente 100%. Ademas, debido a que se usan matrices de calidad alimentaria, los transesteres resultantes producidos por los metodos de la presente memoria descritos no requieren etapas de purificacion adicionales, no producen efectos secundarios no deseados y se pueden incorporar facilmente en productos alimenticios, productos nutriceuticos y formulaciones farmaceuticas, que son ventajas adicionales de los metodos y las composiciones divulgados. Mas aun, usar los metodos enzimaticos divulgados para producir trigliceridos de acidos grasos, que a menudo estan mas biodisponibles que los esteres etflicos correspondientes, puede dar como resultado trigliceridos que tienen mejor color y niveles inferiores de isomeros trans, CD, polfmeros y productos secundarios. Los metodos divulgados tambien pueden dar como resultado productos esterificados, transesterificados, interesterificados y/o intraesterificados que tienen mejores propiedades sensoriales.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se indican posteriormente para ilustrar los metodos y los resultados segun la materia divulgada. Estos ejemplos no pretender ser inclusivos de todos los aspectos de la materia divulgada en la presente memoria, sino que en cambio ilustran metodos y resultados representativos. Estos ejemplos no pretenden excluir equivalentes y variaciones de la presente invencion, que son evidentes para un experto en la especialidad.

Se han hecho esfuerzos para asegurar exactitud con respecto a los numeros (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones. A menos que se indique otra cosa, las partes son en peso, la temperatura es en °C o es a temperatura ambiente y la presion es o esta cerca de la atmosferica. Hay numerosas variaciones y combinaciones de condiciones de reaccion, p. ej., concentraciones de componentes, disolventes deseados, mezclas de disolventes, temperaturas, presiones y otros intervalo y condiciones de reaccion que se pueden usar para optimizar la pureza y el rendimiento del producto obtenidos a partir del procedimiento deseado. Solamente se requerira experimentacion razonable y habitual para optimizar tales condiciones de procedimiento.

X03020EE (30% de EPA / 20% de DHA, esteres etflicos), XO0355EE (3% de EPA / 55% de DHA, esteres etflicos), EE4020 (40% de EPA / 20% de DHA, esteres etflicos), FFA4020 (40% EPA / 20% DHA, acidos grasos libres) se obtuvieron de Ocean Nutrition Canada, Mulgrave Nova Scotia. Los esteres etflicos de partida X03020EE y XO0355EE se deben almacenar en un recipiente hermetico con revestimiento de Teflon bajo nitrogeno. El glicerol tema una pureza de 99,5%. En los Ejemplos 2-5, se uso NOVOZYME™435 fabricada por NOVOZYMES (Bagsvaerd, Dinamarca). En los siguientes ejemplos, las reacciones con NOVAZYM™435 se consideran comparativas.

Ejemplo 1: Preparacion de enzima inmovilizada

La matriz de calidad alimentaria AMBERLITE™ XAD16HP (10 g, aproximadamente 60% de humedad) fabricada por Rohm and Haas se lavo con agua y se suspendio en 15 ml de solucion que contema 0,1% de acido sorbico y 0,1%

de acido benzoico, pH 4,8 (preparada mezclando 1 g de acido benzoico, 1 g de acido sorbico, hidroxido sodico y agua destilada (998 g)). Se anadio una solucion de lipasa B de Candida antarctica (30 ml en una relacion 4,5:1 p/p con la matriz) y la mezcla se removio suavemente durante 18 h a 20°C. El Kquido se dreno, el material solido se lavo con agua y finalmente se seco a temperatura ambiente bajo vado a una presion de menos de 1 torr durante 16 5 horas.

Se prepararon enzimas inmovilizadas adicionales como se acaba de describir, excepto que se uso AMBERLITE™ FPX66 como la matriz de calidad alimentaria.

Ejemplo 2: Analisis de la esterificacion/transesterificacion

Estas enzimas inmovilizadas producidas en el Ejemplo 1 se probaron para determinar su capacidad para esterificar 10 acidos grasos y para transesterificar esteres etflicos en trigliceridos. Las enzimas inmovilizadas se colocaron en un recipiente de reaccion a escala de laboratorio y el acido graso o el ester etflico y el alcohol se anadieron a la enzima inmovilizada. Se analizaron las cantidades de triglicerido (TG) asf como di- y monoglicerido (DG y MG, respectivamente) producidas. La clase de lfpido se midio mediante cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento (HPLC) acoplada con un detector de dispersion de luz evaporativo (ELSD, por sus siglas en ingles) usando una 15 columna YMC pack PVA-Sil (150 x 4,6 mm, 5 p) o una columna Waters Spherisorb S3CN (150 x 2 mm). Estos resultados se muestran en las Tablas 4-7.

Tabla 4: Conversion de FFA en TG con enzima inmovilizada sobre AMBERLITE™ XAD16HP a 65-70°C durante 22 h.

Prueba: FFA Componentes despues de la reaccion (%) TG DG MG

1: 4,3 91,0 4,7 0,0

2: 4,8 91,7 3,5 0,0

3: 3,5 93,1 3,5 0,0

4: 3,7 92,9 3,4 0,0

Tabla 5: Conversion de EE en TG con enzima inmovilizada sobre AMBERLITE™ XAD16HP durante 24 horas

Prueba: Temp. Componentes despues de la reaccion (%)


: EE TG DG MG

1: 65-70°C 9,9 77,0 12,5 0,6

2: 75-80°C 10,0 78,0 11,5 0,5

3: 75-80°C 8,1 83,8 7,7 0,4

4: 75-80°C 10,0 82,8 7,0 0,2

5

10

15

20

25

30

Tabla 6: Conversion de FFA en TG con enzima inmovilizada sobre AMBERLITE™ FPX66 a 65-70°C durante 22

horas

Prueba: FFA Componentes despues de la reaccion (%) TG DG MG

1: 11,9 78,6 9,6 0,0

2: 9,0 86,7 4,3 0,0

3: 8,5 87,0 4,6 0,0

Tabla 7: Conversion de EE en TG con enzima inmovilizada sobre AMBERLITE™ FPX66 a 75-80°C durante 23-24

horas

Prueba: Componentes despues de la reaccion (%)

: EE TG DG MG

1: 1,7 96,9 1,4 0,0

2: 2,4 96,1 1,4 0,0

3: 0,8 98,5 0,7 0,0

4: 2,3 96,1 1,6 0,0

En un ejemplo a escala de fabricacion adicional, las enzimas inmovilizadas se cargaron en un reactor de lecho de enzima fijo y el acido graso o el ester etilico y el alcohol se bombearon en la enzima inmovilizada.

Ejemplo 3: Preparacion a gran escala de enzima inmovilizada

Se uso un sistema de reactor a gran escala como el mostrado en la Figura 1. Se anadieron CALB LIPOZYME™ y agua destilada al recipiente de contencion. Se anadio al reactor o los reactores enzimaticos de lecho fijo matriz de calidad alimentaria AMBERLITE™ FPX66 (se pusieron en marcha una partida de 4.000 kg y partidas de 8.000 kg). La mezcla enzimatica lfquida se recirculo a traves del lecho de matriz en el reactor enzimatico 24 horas o hasta que las muestras de protema se nivelaran y se hicieran constantes. La solucion enzimatica restante se devolvio al recipiente de contencion. A continuacion, el agua filtrada se bombeo a traves de los reactores enzimaticos para lavar las enzimas inmovilizadas. La enzima lfquida restante se retiro del recipiente de contencion.

Ejemplo 4: Conversion a gran escala de FFA en trigliceridos

Se anadio aceite de pescado con FFA al recipiente de contencion del sistema descrito en el Ejemplo 3. El recipiente de contencion se calento hasta 70°C ± 5°C. Mientras se calentaba el recipiente, se inicio la agitacion y se anadio glicerol. Una vez que la adicion de glicerol era completa, el contenido del recipiente de contencion se agito durante 15 minutos. El reactor o los reactores enzimaticos que conteman la solucion de enzima inmovilizada se prepararon como en el Ejemplo 3 y estos se pueden reutilizar para varias conversiones enzimaticas. La secuencia del ciclo de conversion comenzo en este punto a lo largo de 24 horas. Durante este penodo, se tomaron muestras y se probo el % de FFA cada 3 horas. La conversion era completa cuando el % de FFA era 15% max. A continuacion, el aceite se extrajo por bombeo y se transfirio a un deposito de alimentacion donde se espero a que sufriera separacion por arrastre de FFA en un deposito de evaporacion.

Ejemplo 5: Ensayos de comportamiento de enzimas inmovilizadas

Se prepararon otras enzimas inmovilizadas diversas como se describe en los Ejemplos 1 y 3. Estas enzimas inmovilizadas, asf como la enzima inmovilizada producida en los Ejemplos 1 y 3, se probaron para determinar su capacidad para esterificar acidos grasos. La enzima inmovilizada se cargo en un reactor de lecho enzimatico fijo y el

10

acido graso y el alcohol se bombearon a traves de la enzima inmovilizada. Se analizaron las cantidades de trigMcerido (TG) as^ como di- y monoglicerido (DG y MG, respectivamente) producidas. Los resultados se muestran en las Tablas 8-10.

Tabla 8: (Ejemplo Comparativo) Conversion de FFA 4020 en triglicerido (TG) con 2% de CALB L NOVOZYME™

inmovilizada sobre XAD-1180

Condiciones de reaccion: FFA 4020 a glicerol ~3 : 1 a 65-70°C durante 21 horas

N° de Pruebas: Enzima inmovilizada (enzima : matriz) Componentes despues de la reaccion % (media)


: FFA TG DG MG

2: 3 : 1 liofilizada 21,0 73,5 3,60 2,00

2: 3: 1 secada a 50°C 11,6 85,6 2,35 0,55

2: 1,5 : 1 secada 17,8 65,9 16,3 0,00

2: 1 : 1 secada 12,9 78,5 8,60 0,00

7: 3 : 1 7,63 86,4 5,34 0,16

11: 5 : 1 6,69 87,3 5,01 1,41

Tabla 9: (Ejemplo Comparativo) Conversion de EE4020 en triglicerido (TG) con 2% de CALB L NOVOZYME™

inmovilizada sobre XAD-1180

Condiciones de reaccion: EE4020 a glicerol: ~3 : 1 a 80-85°C durante 22 horas

N° de of Pruebas: Enzima inmovilizada (enzima : matriz) Componentes despues de la reaccion % (media)


: FFA TG DG MG

1: 5 : 1 11,7 62,4 25,4 0,5

4: 1,5 : 1 39,3 6,03 43,8 10,7

Tabla 10: Conversion de FFA 4020 en triglicerido (TG) con 2% de CALB L NOVOZYME™ inmovilizada sobre

diversas matrices

: Condiciones de reaccion: FFA4020 a glicerol ~3 1 a 65-70°C durante 22 horas

Matriz: Enzima / agua (p/p) Enzima / cuentas humedas (p/p) N° de Pruebas Componentes despues de la reaccion % (media)






: FFA TG DG MG

Q_ X CD Q: 1,5 : 1 3 : 1 4 6,9 87,88 4,78 0,00

XAD761: 2 : 1 3 : 1 2 18,2 59,8 22,1 0,05

XAD4: 2,25 : 1 3 : 1 1 76,0 0,9 10,4 10,5

Ejemplos Comparativos

XAD16: 2 : 1 3,5 : 1 1 4,3 94,5 1,2 0

XAD16: 2,25 : 1 3 : 1 4 19,7 63,6 16,0 0,56

XAD16: 2 : 1 2,67 : 1 2 23,7 49,9 24,7 0,95

XAD16: 2,5 : 1 3,33 : 1 2 27,3 41,1 28,9 2,30

XAD16: 3 : 1 3,33 : 1 1 18,8 71,8 9,40 0,00

XAD16 (5% de KCl lavado): 2,3 : 1 3 : 1 2 91,0 0,15 6,55 2,60

XAD16 (1% de KCl lavado): 2,3:1 3:1 2 73,0 0,50 19,2 7,40

XAD1180: 2,25:1 3:1 2 7,7 92,4 1,65 0,2

KO2CCH3: 20% 1 51,3 0,5 38,0 10,1

NOVOZYME™: 435 1 8,00 90,7 1,20 0,00

Ejemplo 6: (Ejemplo Comparativo) Transesterificacion usando NOVOZYM™435

El aceite XO0355 EE (55 g), junto con glicerol (5 g), se puso en un recipiente de reaccion y se anadio NOVOZYME™435 (1,2 g). Se aplico un vado (< 1 mbar) y la temperatura se elevo hasta 85°C. La mezcla de 5 reaccion se agito a esta temperatura y presion durante 22 horas, a continuacion el producto se separo de la enzima inmovilizada y la enzima inmovilizada residual estaba lista para ser usada en la siguiente partida.

Ejemplo 7: Efecto de variar las condiciones de reaccion

Se investigo la reactividad de aceite de pescado de ester etflico bajo condiciones de reaccion variables (Tabla 11). Se probaron las relaciones superiores de ester etflico a glicerol (p. ej., 4,5 - 1) para confirmar los hallazgos previos. 10 La reaccion se repitio con relaciones de EE / glicerol de 3,5 : 1 pero solo a temperaturas alrededor de 60°C con 61% de rendimiento de TG y quedando 25% de EE de media. Una relacion molar: 2,8 : 1 despues de 22 horas a 70°C condujo a que la mezcla final consistiera en 6,3% de EE, 78,6% de TG, 12,2% de DG, 2,8% de MG, a 60-65°C. Sin embargo, los rendimientos eran considerablemente inferiores en otros dos experimentos separados, cuando la temperatura era inferior.

15 Tabla 11: (Comparativa) Transesterificacion de concentrados de ester etilico en los trigliceridos correspondientes

con 2% de NOVOZYME™435.

Relacion molar EE /Glicerol: Temperatura de incubacion Tiempo (total) Componentes despues de la reaccion % (media)




: TG DG MG EE %TG*

R1-3,5: sj ** 56-60°C 56°) (principalmente 22 h 59,1 12,6 1,5 26,8 80,7

R2-3,5: 1 65°C 22 h 67,1 4,9 0,6 27,4 92,4

R4-3,5: 1 58-60°C 58°) (principalmente 22 h 44,1 19,4 3,7 32,8 65,6

R5-3,5: 1 6-65°C 65°) (principalmente 22 h 63,2 15,9 1,9 19,1 78,0




: TG DG MG EE %TG*

2,3 :: 1 62-64°C 22 h 53,6 34,6 10,4 1,3 54,4

2,8 :: 1 60-65°C 22 h 70,3 20,5 3,8 5,4 74,3

2,8 :: 1 70°C 22 h 78,6 12,2 2,8 6,3 84,0

2,8 :: 1 58-60°C 22 h 37,2 23,3 5,2 34,3 56,1

3,2 :: 1 52-62°C (D8-10 h a 52°C) 22 h 51,0 20,6 2,0 26,4 69,3

3,3 :: 1 60°C 22 h 35,6 1,3 0 63,2 96,4

3,3 :: 1 60-65°C 7 h 22,7 9,2 1,0 67,1 69,0

3,5 :: 1 ~65-70°C 22 h 70,6 7,1 1,9 20,4 88,6

3,8 :: 1 48-63°C 48°) (principalmente 22 h 59,4 4,7 1,6 34,3 90,4

4,5 :: 1 ~55°C 22 h 43,5 14,1 2,0 39,9 72,9

4,5 :: 1 58-60°C 22 h 56,3 8,5 0,9 34,4 85,7

4,5 :: 1 60-62°C 22 h 65,9 2,5 0,5 31,1 95,6

4,5 :: 1 62-64°C 22 h 67,7 2,1 0,5 29,7 96,3

4,5 :: 1 60-63°C 22 h 40,5 13,2 1,6 44.6 73,2

4,5 :: 1 58-60°C 22 h 1,2 0,6 3,1 95,1 24,5

4,5 :: 1 59-64°C 59°) (principalmente 20 h 51,7 8,0 0,9 39,4 85,3

4,5 :: 1 65°C 22 h 69,2 1,5 0,3 29,1 97,5

4,5 :: 1 60-62°C 22 h 58,0 27,5 5,1 9,4 64,0

4,5 :: 1 60-65°C 8 h 43,6 7,3 1,0 48,2 84,0

5,5 :: 1 52-62°C 52°) (principalmente 22 h 46,4 5,4 0,9 47,3 88,0

6,2 :: 1 60,5°C 22 h 26,0 13,1 1,2 59,7 64,5

6,7 :: 1 60°C 5 h 15,2 25,7 7,5 51,6 31,4

7 : 1: 55-60°C 55°) (principalmente 22 h 1,3 1,1 2,8 94,9 25,0

9,0 :: 1 60-62°C 22 h 45,4 12,4 2,0 40,2 75,9

TG: DG MG EE %TG*

~ 2,8: 1 55-67 22 h 66,3 19,6 4,1 10,1

~2,8 :: 1 70-75 22 h 69,5 21,5 4,1 4,9

~2,8 :: 1 70-75 7 h 14,0 25,6 8,1 52,3

~ 2,8: 1 70-75 7 h 5,9 26,5 12,8 54,8

~ 2,8: 1 50-62 22 h 53,3 22,3 5,6 18,7

~ 2,8: 1 55-63 22 h 50,7 27,1 7,0 15,2

~ 2,8: 1 55-65 22 h 47,3 29,8 6,9 16,0

~ 2,8: 1 55-67 22 h 53,3 27,9 6,4 12,3

~ 2,8: 1 50-65 22 h 40,1 29,3 9,2 21,4

~ 2,8: 1 55-67 22 h 59,6 25,8 5,9 8,7

~ 2,8: 1 55-65 22 h 45,6 29,7 7,2 17,5

~ 2,8: 1 55-65 22 h 42,0 32,6 8,1 17,3

~ 2,8: 1 55-65 22 h 47,6 29,7 6,5 16,2

~ 2,8: 1 55-65 22 h 51,8 28,4 5,2 14,6

~ 2,8: 1 55-65 22 h 54,3 29,1 6,0 10,6

~ 2,8: 1 55-65 22 h 51,3 28,2 6,3 14,2

~ 2,8: 1 55-65 22 h 46,1 29,2 6,2 18,5

~ 2,8: 1 55-65 22 h 46,7 27,5 6,3 19,4

~ 2,8: 1 70-75 3 h 7,7 28,2 7,9 56,2

~ 2,8: 1 70-75 22 h 79,2 15,8 2,2 2,8

~ 2,8: 1 70-75 27 h 76,6 18,1 2,4 2,9

~ 2,8: 1 70-75 44 h 79,2 16,9 1,9 2,1

~ 2,8: 1 70-75 48 h 79,2 16,7 1,8 2,3

~ 2,8: 1 70-75 51 h 79,7 16,9 1,6 1,8

~ 2,8: 1 70-75 3 h 18,9 38,6 9,9 32,6

~ 2,8: 1 70-75 22 h 70,1 19,4 3,4 7,1

TG: DG MG EE %TG*

~ 2,8: 1 70-75 27 h 70,4 19,8 3,3 6,5

~ 2,8: 1 70-75 44 h 75,4 16,8 3,7 4,1

~ 2,8: 1 70-75 48 h 74,6 18,8 2,6 4,0

~ 2,8: 1 70-75 51 h 74,6 19,0 2,5 3,9

~ 2,8: 1 75-80 22 h 80,5 13,0 2,8 3,7

~ 2,8: 1 75-80 27 h 78,8 14,2 3,9 3,1

~ 2,8: 1 75-80 45 h 80,7 13,9 3,0 2,5

~ 2,8: 1 75-80 48 h 79,3 16,6 1,6 2,5

~ 3,0: 1 70-75 22 h 78,8 12,5 1,0 7,6

~ 3,0: 1 70-80 22 h 84,1 11,6 0,7 3,6

~ 3,0: 1 70-80 22 h 74,1 15,9 1,9 8,1

~ 3,0: 1 70-80 22 h 70,3 18,6 2,4 8,6

~ 3,0: 1 70-80 22 h 72,5 19,5 2,3 5,7

~ 3,0: 1 70-80 22 h 81,2 15,7 1,4 1,7

~ 3,0: 1 75 3 h 29,0 30,9 2,5 35,2

~ 3,0: 1 75 22 h 74,7 13,9 2,5 8,9

~ 3,0: 1 75 27 h 75,4 14,8 2,1 7,7

~ 3,0: 1 75 44 h 82,9 11,5 1,3 4,3

~ 3,0: 1 75 48 h 83,5 11,7 0,7 4,0

~ 3,0: 1 75 3 h 46,7 26,8 6,2 20,2

~ 3,0: 1 75 22 h 69,9 18,9 2,9 8,2

~ 3,0: 1 75 27 h 71,2 19,4 2,4 7,0

~ 3,0: 1 75-95 17 h 83,5 11,6 0,9 4,1

~ 3,0: 1 75-80 17 h 64,5 17,9 2,0 15,5

~ 3,0: 1 75-80 17 h 60,4 25,1 3,0 11,5

~ 3,0: 1 75-80 17 h 42,6 30,8 4,3 22,3

TG: DG MG EE %TG*

~ 3,0: 1 75-80 17 h 58,4 25,3 3,1 13,3

~ 3,0: 1 80-95 17 h 80,9 12,9 2,1 4,1

~ 3,0: 1 80-95 22 h 81,8 13,8 0,8 3,6

~ 3,0: 1 80-85 17 h 75,2 15,2 1,8 7,8

~ 3,0: 1 80-85 17 h 71,4 20,1 1,9 6,5

~3,0 :: 1 80-85 17 h 71,3 20,9 1,8 6,0

~ 3,0: 1 80-85 17 h 62,9 23,2 2,3 11,7

~ 3,0: 1 80-85 17 h 11,1 0,0 0,0 88,9

~ 3,0: 1 80-85 17 h 47,3 30,9 3,6 18,1

~ 3,0: 1 80-85 22 h 74,5 17,7 1,3 6,6

~ 3,0: 1 90-95 20 h 52,3 28,6 3,8 15,3

~ 3,0: 1 80-95 17 h 73,1 17,1 1,1 8,7

~ 3,0: 1 80-95 17 h 75,2 21,9 1,7 1,3

~ 3,0: 1 80-95 17 h 78,4 18,6 1,1 1,9

~ 3,0: 1 80-90 17 h 65,3 22,1 1,6 11,0

~ 3,0: 1 80-95 17 h 72,4 28,6 3,8 3,2

~ 3,0: 1 80-95 17 h 73,9 22,2 1,3 2,6

~ 3,0: 1 80-112 17 h 73,3 23,2 1,5 2,0

~ 3,0: 1 75-90 17 h 58,8 27,9 3,0 10,3

~ 3,0: 1 80-95 17 h 73,5 18,4 0,8 7,3

~ 3,0: 1 80-104 17 h 49,6 31,5 2,5 16,4

~ 3,0: 1 80-90 17 h 32,1 40,0 3,1 24,8

~ 3,0: 1 78-90 17 h 12,4 49,9 3,7 34,0

~ 3,0: : 1 (EE40/20) 80-90 17 h 4,9 56,9 1,8 36,5

~ 3,0: : 1 (EE40/20) 80-90 17 h 1,4 32,6 17,9 48,0

~ 3,0: : 1 (EE40/20) 80-92 17 h 1,3 19,5 21,9 57,3

Relacion molar EE Temperatura de incubacion Tiempo /Glicerol (total): Componentes despues de la reaccion % (media)

TG DG MG EE %TG*

~3,0: 1 (EE40/20) 80-90 17 h: 1,4 5,9 10,3 82,4

Sumario de resultados

La temperatura de reaccion recomendada es 85°C. La cantidad de 2% de la enzima de la masa de la mezcla de reaccion proporciono buenos resultados y se recomienda. Sin embargo, varios experimentos indicaron que incluso 5 1% se podfa usar satisfactoriamente. Experimentos previos indicaron que los tiempos de reaccion largos

(aproximadamente 22 h) proporcionaban mejores resultados, aunque los penodos mas cortos (p. ej., 7 h) paredan conducir a conversiones mas pobres. Las conversiones a las temperaturas superiores pueden requerir menos tiempo. Se observo que las temperaturas inferiores produdan grados de conversion inferiores, p. ej., cuando la temperatura cafa durante la noche hasta 50°C (probablemente debido a las fluctuaciones en la red electrica y la 10 temperatura ambiente nocturna en disminucion). Inicialmente, se emplearon temperaturas de alrededor de 60°C. Hubo fluctuaciones de temperatura durante la noche y en muchos casos la temperatura se redujo al menos hasta 55°C. Las conversiones eran claramente mejores a temperaturas entre 70-75°C. Se debe tener en cuenta que la actividad inicial de la enzima alcanza un maximo alrededor de 75°C.

La enzima inmovilizada se reutilizo 5 veces cuando se uso una relacion de EE/glicerol 3,5 : 1 en presencia de 2% de 15 la enzima. No se uso disolvente (p. ej., hexano) para lavar la enzima para cada reaccion. Puesto que la enzima no se lavo, puede darse el caso de que la enzima sea bloqueada por un componente de la mezcla de reaccion.

A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones.

Sera evidente para los expertos en la especialidad que se pueden hacer diversas modificaciones y variaciones en la presente invencion sin apartarse del alcance de la invencion. Otras realizaciones de la invencion seran evidentes 20 para los expertos en la especialidad considerando la memoria descriptiva y la practica de la invencion divulgada en la presente. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren solamente ejemplares, siendo indicado un alcance abierto de la invencion por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para esterificar un acido graso, que comprende: hacer pasar una mezcla de reaccion que comprende un acido graso y un alcohol a traves de un lecho de enzima inmovilizada, en el que la enzima inmovilizada comprende CALB inmovilizada sobre una matriz de calidad alimentaria que es un copolfmero de (1) divinilbenceno y

5 (2) etilvinilbenceno o (1) divinilbenceno y (2) estireno y en el que no se usa un tensioactivo en la preparacion de la

enzima inmovilizada.
2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el acido graso comprende un acido graso insaturado.
3. El metodo segun la reivindicacion 2, en el que el acido graso insaturado es un acido graso w-3.
4. El metodo segun la reivindicacion 2, en el que el acido graso insaturado es acido linoleico, acido linolenico, acido 10 Y-linolenico, acido araquidonico, acido de Mead, acido estearidonico, acido a-eleoestearico, acido eleoestearico,

acido pinolenico, acido docosadienico, acido docosatetraenoico, acido octadecadienoico, acido octadecatrienoico, acido eicosatetraenoico o cualquier combinacion de los mismos.
5. El metodo segun la reivindicacion 2, en el que el acido graso insaturado comprende acido eicosapentaenoico 20:5u>3 (EPA), acido docosahexaenoico 22:6u>3 (DHA), acido docosapentaenoico 22:5w3 (DPA) o cualquier mezcla

15 de los mismos.
6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que el alcohol comprende un poliol y/o glicerol.
7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que el acido graso y el alcohol estan presentes en

una relacion molar de 1:1 a 10:1.
8. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en el que la CALB es de 0,1% a 20% en peso de la

20 reaccion.
9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en el que la reaccion se efectua a una temperatura de 70°C a 90°C.
10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que, despues de la esterificacion del acido carboxflico, se filtra la solucion que comprende el ester y se afsla la enzima inmovilizada.