JP4530311B2 - リパーゼを用いたグリセライドの製造方法 - Google Patents
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Description
【産業の属する技術分野】
本発明はリパーゼを用いたグリセライドの製造方法に関する。より詳細には本発明は、リパーゼを用いた2−モノグリセライドまたはトリグリセライド、特にsn-2位に高度不飽和脂肪酸(PUFA)残基を有するトリグリセライド(TG)の製造方法に関する。
本発明において、「DHA」はドコサヘキサエン酸、「EPA」はエイコサペンタエン酸、「ALA」はアラキドン酸の略称として使用している。なお、DHA濃縮油脂、トリDHA−トリグリセライドという使い方の場合、ドコサヘキサエン酸残基の略称として使用している。
また、「MG」はモノグリセライド、「2−MG」は2−モノグリセライド、「TG」はトリグリセライドの略称として使用している。
また、「第一のリパーゼ」とは1、3位に選択的で、アルコリシスを行った場合に、鎖長の長い脂肪酸にも作用するリパーゼを意味する。
「第二のリパーゼ」とは1、3位に選択的で,2−MGと脂肪酸エステルまたは遊離脂肪酸を反応させた場合にTGを生成するリパーゼを意味する。
【0002】
【従来の技術】
1,3位に特異的なリパーゼを用いてTGの1,3位に任意の脂肪酸を導入する場合、一般的には目的脂肪酸でアシドリシスする、または目的脂肪酸エステルをエステル交換するなどの方法が用いられる。しかし、この場合には非常に過剰量の脂肪酸やエステルを用いなければならず、また確率論的に一部は元の1,3位の脂肪酸が残存するため目的構造脂質を高純度で得ることは比較的むづかしい。
さらにリパーゼによっては脂肪酸の鎖長に応じて活性が大きく変化し、DHAなどの長鎖脂肪酸に対する活性が著しく弱いため、目的の構造脂質を得られない場合もある。
【0003】
また、リパーゼの反応には加水分解反応、エステル交換反応、アシドリシス、エステル化反応などが挙げられるが全てのリパーゼが何れの反応に対しても同条件で同程度の活性を示すわけではなく様々な特性のリパーゼが存在する。例えば、アシドリシスに対して強い活性を持った1,3−リパーゼを利用すれば1,3位の脂肪酸の置換に有利であるが、このリパーゼがDHAなどに対して十分な活性を持っていない場合には1,3位にDHAが位置したTGから他の目的脂肪酸への置換は非常に困難となる。もちろん、アシドリシスに高活性でDHAにも活性の高いリパーゼを用いれば目的は達成できるがこのようなリパーゼは入手が困難であるか、極めて高価であるため工業的な用途に用いるのは好ましくない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、2−MGまたはTG、特にsn-2位に高度不飽和脂肪酸(PUFA)残基を有するTGを非常に高純度で高効率で製造する方法の提供を目的としている。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして2−MGを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法を要旨としている。
【0006】
2位の脂肪酸残基がDHA、EPAまたはALA残基であり、その場合、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして2位の脂肪酸残基がDHA、EPAまたはALA残基であるMGを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0007】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂がDHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂またはALA濃縮油脂であり、その場合、本発明は、DHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂またはALA濃縮油脂である原料TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして2−MGを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0008】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が魚油であり、その場合、本発明は、魚油、好ましくはDHA濃縮魚油、またはEPA濃縮魚油である原料TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして2−MGを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0009】
高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料TGがトリDHA−TG、トリEPA−TG、またはトリALA−TGであり、その場合、本発明は、トリDHA−TG、またはトリEPA−TG、またはトリALA−TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして2−MGを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0010】
また、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料トリグリセライドを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして得られる2−MGを経由し第二の1,3−リパーゼで1,3位に脂肪酸残基を導入することで2位に原料トリグリセライド由来の脂肪酸残基を有し、1、3位に新たに導入した同一の脂肪酸残基を有する構造のトリグリセライドを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法法を要旨としている。
【0011】
2位の脂肪酸残基がDHA、EPAまたはALA残基であり、その場合、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして得られる2位の脂肪酸残基がDHA、EPAまたはALA残基であるMGを経由し第二の1,3−リパーゼで1,3位に脂肪酸残基を導入することで目的TGを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0012】
1,3位に導入される脂肪酸残基が炭素数8,10または12の中鎖飽和脂肪酸残基であり、その場合、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして得られる2−MG、好ましくは2位の脂肪酸残基がDHA、EPAまたはALA残基であるMGを経由し第二の1,3−リパーゼで1,3位に炭素数8,10または12の中鎖飽和脂肪酸残基を導入することで目的TGを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0013】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が、DHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂またはALA濃縮油脂であり、その場合、本発明は、DHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂またはALA濃縮油脂である原料TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして得られる2−MGを経由し第二の1,3−リパーゼで1,3位に脂肪酸残基を導入することで目的TGを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0014】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が魚油であり、その場合、本発明は、魚油、好ましくはDHA濃縮魚油、またはEPA濃縮魚油である原料TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして得られる2−MGを経由し第二の1,3−リパーゼで1,3位に脂肪酸残基を導入することで目的TGを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0015】
高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料TGがトリDHA−TG、トリEPA−TG、またはトリALA−TGであり、その場合、本発明は、トリDHA−TG、トリEPA−TG、またはトリALA−TGを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして得られる2−MGを経由し第二の1,3−リパーゼで1,3位に脂肪酸残基を導入することで目的TGを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【0016】
【発明の実施の形態】
本発明のグリセライドの製造方法の好ましい態様は、原料TGを第一の1,3リパーゼでアルコリシスして得られる2−MGを経由し第二の1,3−リパーゼで1,3位に脂肪酸残基を導入することで目的TGを得ることを特徴とする。すなわち、本発明は、リパーゼの反応を二段階に分け、TGから第一の1,3−リパーゼを用いてアルコリシスによって2−MGを調製し、その後、1,3位に導入したい脂肪酸の低級アルキルエステルまたは遊離脂肪酸を用いて第二の1,3−リパーゼで2−MGのエステル化反応によってTGを調製する方法である。
【0017】
本発明者らは、ある種のリパーゼがTGとの反応でアシドリシスや加水分解では望む結果が得られない場合であっても、アルコリシスを行なうことにより、DHAなどリパーゼの作用しにくい脂肪酸が1,3位にある場合でも、ほぼ完璧に1,3位の脂肪酸を除去し2−MGを得ることができることを発見した。ついで2−MGには1,3位に導入したい脂肪酸のエステルまたは遊離脂肪酸を作用させることで目的の構造のTGを非常に高純度で高効率で得られることを発見し、これらの手順を順番に組み合わせることによって本発明を完成した。
【0018】
第一段階で使用される第一のリパーゼは、1,3位に選択的で、エタノリシス、メタノリシスなどのアルコリシスを行なった場合にDHAなどの鎖長の長い脂肪酸にも作用できるものであれば特に限定されない。この目的で利用できるリパーゼとしてCandida antarctica リパーゼ(例えばNovozym435[ノボノルディスクバイオインダストリー(株)] )が好ましいものとして例示される。
【0019】
第二段階で使用される第二のリパーゼは1,3位に選択的で、2−MGと脂肪酸エステルまたは遊離脂肪酸を減圧下で反応させTGを生成できるのであれば特に限定されない。この目的で利用できるリパーゼとして Rhizomucormiehei リパーゼ(例えば LipozymeIM[ノボノルディスクバイオインダストリー(株)])が好ましいものとして例示される。脂肪酸エステルとしてエチルエステルなどの低級アルキルエステルが例示される。
【0020】
本発明の製造方法の最も好ましい態様は、原料TGをNovozym435でアルコリシスして得られる2−MGを経由しLipozyme IMで1,3位に脂肪酸残基を導入することで目的構造のTGを得ることを特徴とする。
【0021】
原料TGは、好ましくは高度不飽和脂肪酸を含有する油脂であり、高度不飽和脂肪酸はDHA、EPAまたはALAである。本発明の方法で用いられる原料TGは例えば魚油であり、好ましくはDHA濃縮油脂、またはトリDHA−TG、あるいはEPA濃縮油脂、またはトリEPA−TG、あるいはALA濃縮油脂またはトリALA−TGである。本発明の方法で用いられる1,3位に導入される脂肪酸は好ましくは炭素数8、10または12の飽和脂肪酸である。
【0022】
本発明において原料のTGとして高度に精製されたDHAのみから構成されるトリDHA−TGを用いた場合、高純度でX−DHA−X型のTGを得ることが可能であり、これは従来のアシドリシスと市販リパーゼの組み合わせでは調製が非常に困難である。また、このとき1,3位に導入する脂肪酸に炭素数8〜12の中鎖脂肪酸を選択すれば吸収性に優れたDHA含有TGを得ることができ乳児用の粉乳などに利用すれば大きな効果が期待できる。
【0023】
また、EPAを含有した構造脂質も同様に調製可能で吸収性の高いEPA含有TGを得た場合にはEPAの持つ多くの生理活性を期待した食品、医薬品などが期待できる。
【0024】
さらに魚油にはもともとsn2位にDHAが局在していることが知られており、本発明をDHA含量の比較的高いマグロ油やカツオ油に適用すれば吸収性を増大させた栄養面に優れた油脂を得ることができる。また、原料の魚油のDHA濃度をウィンタリングなどの手法で濃縮した魚油を用いればさらにDHAを高含量とした目的の構造のTGが得られる。
【0025】
【作用】
リパーゼの反応を二段階に分け、第一段階でTGから第一の1,3−リパーゼを用いてアルコリシスすることで、DHAなどリパーゼの作用しにくい脂肪酸が1,3位にある場合にも、ほぼ完ぺきに1,3位の脂肪酸を除去し2−MGを得ることができる。
その後、第二段階で1,3位に導入したい脂肪酸の低級アルキルエステルまたは遊離脂肪酸を用いて第二の1,3−リパーゼで2−MGのエステル化反応をすることで、目的の構造のTGを非常に高純度で高効率で得ることができる。
【0026】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【0027】
実施例1
カツオ油1g、エタノール3g、Novozym435 0.4gを混合し、窒素気流下35℃で2時間攪拌した。反応後、反応混合物の脂質組成をイアトロスキャンにて測定した結果、エチルエステル69.5%、ジグリセライド2.3%、MG28.3%でありTG、遊離脂肪酸は検出されなかった。薄層クロマトグラフィー分析の結果、MGは2−MGであることを確認した。またガスクロマトグラフィーにて脂肪酸組成を測定した結果、原料カツオ油のDHAは27.9%であったのに対し、MGのDHAは51.5%であった。
【0028】
実施例2
イワシ油を原料として、PUFAの濃縮を目的にアセトンを溶媒としたウインタリングを行い得られた油1g、エタノール3g、Novozym435 0.4gを混合し、窒素気流下35℃で3時間攪拌した。反応後、反応混合物の脂質組成をイアトロスキャンにて測定した結果、エチルエステル67.7%、ジグリセライド1.9%、MG30.4%でありTG、遊離脂肪酸は検出されなかった。薄層クロマトグラフィー分析の結果、MGは2−MGであることを確認した。またガスクロマトグラフィーにて脂肪酸組成を測定した結果、ウインタリング油のDHAは13.0%であったのに対し、MGのDHAは28.8%であった。
【0029】
実施例3
グリセリン0.184g、水0.184g、Novozym435 0.239gを混合し30分間攪拌後、DHA1.971gを加え、60℃、3〜5mmHgの減圧下で一夜攪拌した。酵素を濾別し、反応混合物をシリカゲルカラムで精製した結果、トリDHA−TG1.83g(純度99%、収率89%)を得た。
得られたトリDHA−TG0.102g、エタノール0.306g、Novozym435 0.046gを混合し35℃、窒素気流中で4時間攪拌した。酵素を濾別し、グリセリド画分の組成をイアトロスキャンで分析したところ、MG92.7%、ジグリセライド5.35%、TG1.96%であった。薄層クロマトグラフィーによりMGは100%2−MGであることを確認した。
【0030】
実施例4
実施例3と同様に操作して得られた反応混合物から酵素を濾別後残存するエタノールを減圧下留去したもの全量に、オクタン酸エチル0.345g、水0.010g、Lipozyme IM 0.050gを加え、窒素気流下35℃で30分間攪拌した。次いで真空ポンプで反応容器を3〜5mmHgに減圧し、35℃で3.5時間攪拌を継続した。得られた反応混合物のグリセリド画分の組成をガスクロマトグラフィーおよび銀イオンカラム高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、2位にDHA,1、3位にオクタン酸を有するTGが81.4%含まれていた。
【0031】
実施例5
実施例3と同様に操作して得られた反応混合物から分画して得られた2−DHA−MG0.040gに、オクタン酸0.289g、水0.010g、Lipozyme IM 0.050gを加え、窒素気流下35℃で30分間攪拌した。次いで真空ポンプで反応容器を3〜5mmHgに減圧し、35℃で3.5時間攪拌を継続した。得られた反応混合物のグリセリド画分の組成をガスクロマトグラフィーおよび銀イオンカラム高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、2位にDHA,1、3位にオクタン酸を有するTGが78.8%含まれていた。
【0032】
実施例6
グリセリン0.184g、水0.184g、Novozym435 0.239gを混合し30分間攪拌後、EPA1.815gを加え、60℃、3〜5mmHgの減圧下で一夜攪拌した。酵素を濾別し、反応混合物をシリカゲルカラムで精製した結果、トリEPA−TG1.74g(純度99%、収率92%)を得た。
得られたトリEPA−TG0.094g、エタノール0.283g、Novozym435 0.038gを混合し35℃で4時間攪拌した。酵素を濾別し、グリセリド画分の脂質組成をイアトロスキャンで分析したところ、MG98.5%、ジグリセライド5.35%、TG0.42%であった。薄層クロマトグラフィーによりMGは100%2−MGであることを確認した。
【0033】
実施例7
実施例6と同様に操作して得られた反応混合物から酵素を濾別後残存するエタノールを減圧下留去したもの全量に、デカン酸エチル0.400g、水0.010g、Lipozyme IM 0.050gを加え、窒素気流下35℃で30分間攪拌した。次いで真空ポンプで反応容器を3〜5mmHgに減圧し、35℃で3.5時間攪拌を継続した。反応後得られたグリセリド画分の組成をガスクロマトグラフィーおよび銀イオンカラム高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、2位にEPA,1、3位にデカン酸を有するTGが72.7%含まれていた。
【0034】
実施例8
実施例6と同様に操作して得られた反応混合物から分画して得られた2−EPA−MG0.037gに、デカン酸0.345g、水0.010g、Lipozyme IM 0.050gを加え、窒素気流下35℃で30分間攪拌した。次いで真空ポンプで反応容器を3〜5mmHgに減圧し、35℃で3.5時間攪拌を継続した。反応後得られたグリセリド画分の組成をガスクロマトグラフィーおよび銀イオンカラム高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、2位にEPA,1、3位にデカン酸を有するTGが70.6%含まれていた。
【0035】
【発明の効果】
目的の構造のTG、特にsn-2位にPUFAを有するTGを非常に高純度で高効率で製造するTGの製造方法を提供することができる。
また、目的の構造のTG製造のための中間体として特に有用な2−MGを製造する方法を提供することができる。
Claims (7)
- 高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料トリグリセライドを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして2−モノグリセライドを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法。
- 高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料トリグリセライドを第一の1,3リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼでアルコリシスして得られる2−モノグリセライドを経由し第二の1,3−リパーゼで1,3位に脂肪酸残基を導入することで2位に原料トリグリセライド由来の脂肪酸残基を有し、1、3位に新たに導入した同一の脂肪酸残基を有する構造のトリグリセライドを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法。
- 2位の脂肪酸残基がDHA、EPAまたはALA残基である請求項1または2のグリセライドの製造方法。
- 1,3位に導入される脂肪酸残基が炭素数8、10または12の中鎖飽和脂肪酸残基である請求項2または3のグリセライドの製造方法。
- 上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂がDHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂またはALA濃縮油脂である請求項1ないし4のいずれかのグリセライドの製造方法。
- 上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が魚油である請求項1ないし5のいずれかのグリセライドの製造方法。
- 高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料トリグリセライドがトリDHA−トリグリセライド、トリEPA−トリグリセライド、またはトリALA−トリグリセライドである請求項1ないし4のいずれかのグリセライドの製造方法。
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