ES2557056T3 - Inhibición del complemento para una mejor regeneración de los nervios - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que bloquea un componente del complemento para uso en el tratamiento de la enfermedad o lesión del SNP o SNC facilitando la regeneración de los axones en un sujeto.

Description

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DESCRIPCION

Inhibicion del complemento para una mejor regeneracion de los nervios Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos y medicamentos utilizados para el tratamiento de condiciones que requieren la regeneracion de los axones, por ejemplo, en los mamlferos afectados por una lesion o enfermedad del sistema nervioso central o periferico. Los medicamentos utilizados en estos metodos promueven la regeneracion de los axones mediante la inhibicion del sistema de complemento.

Antecedentes de la invencion

La degeneracion de los axones se produce con frecuencia en muchos tipos de enfermedades neurodegenerativas cronicas y en las lesiones de los axones causadas por ataque toxico, lesiones isquemicas o traumaticas. Todo ello puede conducir a la separacion de la neurona de sus objetivos, resultando en perdida de la funcion neuronal. Un modelo de degeneracion del axon es el proceso de autodestruccion observado en la parte distal de un axon seccionado a lo largo despues de una lesion, denominada degeneracion Walleriana (WD) como lo describio por primera vez Waller (1850). En el proceso de WD, si se corta o aplasta una fibra nerviosa, la parte distal a la lesion (es decir, la parte del axon separada del nucleo de la celula de la neurona) se degenerara. Ya que la mayorla de las protelnas neuronales se sintetizan en el soma y se transportan al axon mediante sistemas especializados de transporte en el axon, la degeneracion de los axones seccionados a lo largo hace mucho tiempo se ha pensado que es el resultado de la ausencia de las protelnas necesarias y de otros materiales. Sin embargo, el descubrimiento de una cepa de raton mutante surgida espontaneamente, C57BL/Wlds, cuyos axones sobrevivieron durante un tiempo tan prolongado como semanas despues de la transeccion, sugiere que la degeneracion Walleriana implica un programa de autodestruccion activa y regulada.

De hecho una de las respuestas celulares mas llamativas durante WD en el sistema nervioso periferico (SNP) es la proliferacion e infiltracion de macrofagos (Bruck, 1997). Los macrofagos participan en una amplia variedad de respuestas celulares durante WD. Una vez activados, liberan factores que son mitogenicos para celulas de Schwann (Baichwal y colaboradores, 1988). La finalizacion de WD se basa en la capacidad fagocltica de los macrofagos para degradar los residuos de mielina y del axon (Griffin y colaboradores, 1992). Ademas, los macrofagos pueden degradar moleculas inhibidoras para la regeneracion de los axones (Bedi y colaboradores, 1992), as! como los factores de liberacion, tales como la interleuquina 1 (IL-1), que pueden promover el crecimiento del axon a traves de la induction de factores neurotroficos tales como el factor de crecimiento de nervios (FCN) (Lindholm y colaboradores, 1987).

Los mecanismos precisos responsables del reclutamiento de macrofagos durante la WD no se entienden completamente. Un grupo de factores que pueden desempenar un papel en el reclutamiento y activation de macrofagos son las protelnas del complemento en suero. La importancia de las protelnas del complemento en una lesion del nervio periferico mediada por el sistema inmunologico, ha sido investigada con anterioridad.

Mead y colaboradores (2002) demostraron que las ratas PVG/c deficientes en C6, incapaces de formar el complejo de ataque a la membrana (CAM), no exhibieron desmielinizacion ni dano del axon y se redujo significativamente la puntuacion cllnica en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) mediada por anticuerpos para la esclerosis multiple cuando se compara con ratas equivalentes con suficiente C6. Sin embargo, los niveles de infiltracion de celulas mononucleares fueron equivalentes a aquellos observados en ratas con suficiente C6. Mead y colaboradores (2002) concluyeron que se presenta desmielinizacion y dano del axon en presencia de Ab y se requiere la activacion de toda la cascada del complemento, incluyendo la deposition del CAM.

Jung y colaboradores (1995) divulgaron que el tratamiento con el receptor del complemento soluble humano recombinante tipo 1 (sCR1) suprimio marcadamente los signos cllnicos suprimidos de la neuritis autoinmune experimental inducida por mielina (NAE) en ratas Lewis (un modelo animal del slndrome de Guillain-Barre humano). Se evitaron tambien la desmielinizacion y degeneracion extendida de los axones. Estos hallazgos subrayan la importancia funcional del complemento durante la desmielinizacion inflamatoria en el sistema nervioso periferico.

En realidad, en NAE, el agotamiento del complemento disminuyo la descomposicion de la mielina y el reclutamiento de macrofagos in vivo (Feasby y colaboradores, 1987; Vriesendorp y colaboradores, 1995). Otros grupos han sugerido que la inhibicion de la cascada del complemento reduce el dano en la enfermedad neurodegenerativa del sistema nervioso central (CNS) (por ejemplo, Woodruff y colaboradores 2006; Leinhase y colaboradores, 2006).

Daily y colaboradores (1998) divulgan una reduction significativa en el reclutamiento de macrofagos en el nervio de degeneracion distal en animales con el complemento reducido. La reduccion del complemento tambien disminuyo la activacion de macrofagos, como se indica por su fracaso en volverse mayor y con multiples vacuolas y su capacidad reducida para eliminar la mielina. En situation normal, se elimina la mielina, la parte proximal del nervio forma brotes que crecen lentamente a lo largo de la trayectoria del nervio degenerado. Sin embargo, la regeneracion es lenta (2-

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2,5 mm / dla) y el entorno de un nervio degenerado esta lleno de factores que inhiben el crecimiento del axon y los factores de crecimiento necesarios puede ser limitados o incluso estar ausentes. La mielina misma ha sido propuesta como un factor inhibidor importante. Por lo tanto, la rapida eliminacion de la mielina se considera una condicion esencial para la regeneracion del axon. Por lo tanto, se espera que la eliminacion lenta de la mielina en animales con complemento reducido de como resultado una regeneracion debil del axon. Estos hallazgos indican un papel del complemento en suero, tanto en el reclutamiento como en la activacion de macrofagos durante la degeneracion de los nervios perifericos, as! como un papel activo de los macrofagos en la promocion de la regeneracion de axones.

De hecho, la patente de los Estados Unidos No. 6.267.955 divulga los metodos por medio de los cuales se administran los fagocitos mononucleares en o cerca de un sitio de la lesion o enfermedad del sistema nervioso central o periferico de un mamlfero con el fin de efectuar la eliminacion de los restos de mielina que segun se reporta, inhiben la regeneracion de los axones, y para liberacion de las citoquinas derivadas de macrofagos que promueven la modulacion de astrocitos y oligodendrocitos con el fin de apoyar la regeneracion de los axones.

La degeneracion de los axones es la principal causa de discapacidad tanto en neuropatlas desmielinizantes heredadas como adquiridas. Aunque la mayor parte de la investigacion terapeutica actual tiene por objeto la restauracion de la mielinizacion, los presentes inventores se centran en la consecuencia de la desmielinizacion: degeneracion secundaria de los axones. Como modelo, se han utilizado desmielinizacion aguda y la degeneracion de los axones despues de la lesion por aplastamiento y la posterior regeneracion del nervio. Un objetivo de la presente invention es proporcionar medios y metodos que promueven y mejoren la regeneracion de los nervios.

Description de la invencion

La invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que bloquea un componente del complemento para uso el tratamiento de una enfermedad o lesion del SNP o del SNC facilitando la regeneracion de los axones en un sujeto. Proporciona ademas el uso de acuerdo con la invencion, en donde la condicion que requiere la regeneracion de los axones es una lesion flsica de un nervio periferico. En una realization, la condicion que requiere la regeneracion de los axones es un trastorno neurodegenerativo del sistema nervioso periferico o central.

Ademas se proporciona un uso de acuerdo con la invencion, en donde el anticuerpo inhibe la formation del complejo de ataque de la membrana.

La invencion tambien proporciona un uso de acuerdo con la invencion, en donde el inhibidor bloquea la activacion de la ruta clasica de activacion del complemento. Tambien se proporciona un uso de acuerdo con la invencion, en donde el inhibidor bloquea la activacion tanto de la ruta clasica como la alternativa de activacion del complemento.

Ademas se proporciona un uso de acuerdo con la invencion, en donde el inhibidor es un anticuerpo que bloquea uno o mas de la convertasa C3, C5, C6, C7, C8, C9 y el montaje de CAM. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.

Tambien se proporciona un uso de acuerdo con la invencion, en donde el inhibidor se administra en o cerca del sitio de la lesion.

En los ejemplos en el presente documento se ha observado la activacion del sistema de complemento (C) en la rata durante la WD y en las biopsias de nervios humanos de neuropatlas desmielinizantes cronicas. La presente invencion se basa en el hallazgo sorprendente de que la regeneracion de los axones se mejora en ratas que son deficientes en el factor C6 del complemento. Este sorprendente hallazgo abre nuevas formas de promover la regeneracion de los axones mediante la manipulation del sistema de complemento y/o activacion de los macrofagos.

En un primer aspecto, por lo tanto, la invencion se refiere a un metodo para tratar una condicion que requiere la regeneracion de los axones. El metodo comprende la administration de un inhibidor de un sistema de complemento de mamlfero, o la administracion de un medicamento (por ejemplo, una composition farmaceutica) que comprende al inhibidor. Preferiblemente, se administra una cantidad eficaz del inhibidor. Por lo tanto, en este aspecto, la invencion se refiere a un inhibidor de un sistema de complemento de mamlfero, o un medicamento que comprende al inhibidor, para uso en un metodo para tratar una condicion que requiere la regeneracion de los axones. Del mismo modo, en este aspecto, la invencion se refiere al uso de un inhibidor de un sistema de complemento de mamlfero para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de una condicion que requiere la regeneracion de los axones.

En el contexto de la presente invencion "facilitar la regeneracion de los axones" se distingue de la reduction o prevention de la degeneracion de los axones. La facilitation (o promocion) de la regeneracion de los axones en el presente documento se entiende que significa que la regeneracion de un axon se mejora en los sujetos que son tratados en comparacion con sujetos no tratados. La regeneracion mejorada de un axon preferiblemente es la regeneracion que se produce en un punto anterior en el tiempo (despues de la lesion del axon o despues del inicio

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del tratamiento) en sujetos tratados en comparacion con los sujetos no tratados. La regeneracion mejorada de un axon puede comprender tambien la regeneracion que se produce a una velocidad mayor y/o en mayor medida en un sujeto tratado en comparacion con sujetos no tratados. Un medicamento de acuerdo con la invention produce por lo tanto preferiblemente una ganancia de funcion sensorial o motora.

La mejora de la regeneracion de los axones se determina preferiblemente mediante pruebas funcionales que se llevan a cabo con relativa facilidad en sujetos humanos, por ejemplo, la recuperation de la funcion sensorial o motora se determina preferiblemente en una prueba estandarizada como la que se encuentra disponible en el estado del arte (vease, por ejemplo, Wong y colaboradores, 2006; Jerosch-Herold, 2005). Las pruebas adecuadas preferiblemente son cuantitativas y estandarizadas y mas preferiblemente, han tenido sus propiedades psicometricas evaluadas y cuantificadas. Tales pruebas incluyen, por ejemplo, la prueba sensorial mejorada de Weinstein (WEST) o la prueba del monofilamento de Semmes-Weinstein (SWMT) y la prueba de identification de la forma de la textura (STl) para la gnosis tactil. La regeneracion mejorada de los axones puede ser determinada experimentalmente en animales de laboratorio mediante pruebas funcionales para la recuperacion de la funcion sensorial o motora segun lo descrito por Hare y colaboradores (1992) y De Koning y colaboradores (1986). Un medicamento de acuerdo con la invencion produce por lo tanto preferiblemente una ganancia de funcion sensorial o motora, como se puede determinar, por ejemplo, en una prueba indicada anteriormente.

Se puede determinar tambien experimentalmente una regeneracion mejora de los axones en animales de prueba mediante examen histologico. Por ejemplo, se puede determinar la remielinizacion mejorada mediante la comparacion de las mediciones de las envolturas de mielina alrededor de los axones en los animales tratados versus los animales no tratados, mediante la cual, una envoltura de mielina mas gruesa es indicativa de una remielinizacion mejorada. La regeneracion mas eficiente de los axones se puede determinar como la production de brotes de axones individuales, de gran diametro, en animales tratados en comparacion con los grupos de axones mas pequenos en animales no tratados.

La dosis apropiada del inhibidor es aquella cantidad efectiva para promover la regeneracion de los axones, como puede observarse por la mejora de la funcion sensorial o motora, como se describio anteriormente. Por "cantidad efectiva", "cantidad terapeutica", o "dosis efectiva" se entiende aquella cantidad suficiente para provocar los efectos farmacologicos o terapeuticos deseados, que dan como resultado un tratamiento efectivo de la lesion o el trastorno.

Con el fin de minimizar la lesion del nervio y/o facilitar la regeneracion de los axones tan pronto como sea posible, en los metodos de la invencion, el medicamento se administra preferiblemente poco despues de la aparicion de la lesion del nervio, es decir, en el lapso de 24, 12, 6, 3, 2, o 1 hora, mas preferiblemente en el lapso de 45, 30, 20 o 10 minutos despues de la ocurrencia de la lesion en los nervios. En una realization de la invencion, el medicamento se puede administrar (por ejemplo, como medida de precaution) antes de la cirugla con un riesgo de lesion del nervio (vease mas abajo), a fin de minimizar la lesion del nervio y/o para facilitar la regeneracion de los axones inmediatamente despues de la lesion quirurgica del nervio.

Condiciones que requieren la regeneracion de los axones

Una variedad de condiciones que requieren la regeneracion de los axones pueden ser tratadas con los metodos y/o los medicamentos de la invencion. Las condiciones incluyen lesiones del SNP, as! como lesiones del SNC. Las condiciones incluyen trauma del nervio como resultado de lesiones flsicas, as! como el resultado de una enfermedad. Tales enfermedades incluyen trastornos o lesiones inflamatorias mediadas por el sistema inmunologico y/o trastornos neurodegenerativos progresivos que pueden ser adquiridos y/o heredados.

Las lesiones flsicas del SNP y del SNC pueden ser lesiones traumaticas, incluyendo lesiones quirurgicas o lesiones no traumaticas. Las lesiones traumaticas del SNP y del SNC que pueden ser tratadas con los metodos y/o los medicamentos de la invencion incluyen las lesiones de la medula espinal, as! como heridas traumaticas de nervios perifericos, incluyendo lesiones por colisiones, accidentes automovillsticos, heridas de bala, fracturas, luxaciones, laceraciones, o algunas otras a partir de traumas penetrantes. Los nervios perifericos lesionados por un trauma que se pueden tratar incluyen a los nervios digital, mediano, cubital, radial, facial, accesorio espinal y del plexo braquial.

Las lesiones quirurgicas del SNP en el presente documento se entienden como las lesiones a los nervios perifericos que surgen cuando se vuelve cllnicamente necesarias para remover o diseccionar un nervio durante un procedimiento quirurgico. Esto ocurre en miles de procedimientos quirurgicos cada ano. Un ejemplo de los nervios perifericos lesionados quirurgicamente que se pueden tratar con los metodos y/o medicamentos de la invencion incluyen, por ejemplo los nervios cavernosos que ayudan a la funcion erectil y el control de la vejiga; estos nervios son a menudo danados durante la extirpation quirurgica de un tumor de la prostata y el tejido circundante. Otro ejemplo de un nervio periferico lesionado quirurgicamente que puede ser tratado de acuerdo con la invencion es el nervio frenico despues de una cirugla de revascularization coronaria (CABG).

Lesiones flsicas no traumaticas del SNP que se pueden tratar con los metodos y/o los medicamentos de la invencion incluyen la compresion y/o adhesion de los nervios perifericos, tambien conocidos como slndromes de atrapamiento. El slndrome de atrapamiento mas frecuente es el slndrome del tunel carpiano.

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Ademas, se pueden tratar los trastornos o lesiones inflamatorias mediadas por el sistema inmunologico con los metodos y/o los medicamentos de la invention. Estos incluyen enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periferico que se cree que tienen una base autoinmune y dar lugar a la desmielinizacion del nervio como resultado del dano causado a los oligodendrocitos o directamente a la mielina. Tales enfermedades desmielinizantes incluyen, por ejemplo, el slndrome de Guillain-Barre (SGB, tambien conocido como polineuropatla desmielinizante inflamatoria, polirradiculoneuritis idiopatica aguda, polineuritis idiopatica aguda, polio francesa y paralisis ascendente de Landry). Preferiblemente, los metodos y/o los medicamentos de la invencion se aplican para promover la regeneration de los axones despues de la fase aguda en el SGB. Del mismo modo, la polineuropatla desmielinizante inflamatoria cronica (PDIC), considerada la contraparte cronica del SGB, se puede tratar con los metodos y/o los medicamentos de la invencion.

La esclerosis multiple (EM) es otra enfermedad desmielinizante que puede ser tratada con los metodos y/o los medicamentos de la invencion.

Otros trastornos neurodegenerativas del SNC y/o del SNP con un componente genetico que pueden ser tratados con los metodos y/o los medicamentos de la invencion incluyen la esclerosis lateral amiotrofica (ELA, a veces llamada enfermedad de Lou Gehrig), la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (neuropatla motora y sensorial hereditaria, NMSH) y la enfermedad de Huntington (EH).

El sistema de complemento

El sistema de complemento (vease McAleer y Sim, 1993; Reid y Law, 1988) se relaciona con la defensa del huesped contra una infection. Tras la activation del sistema, ocurre un conjunto catalltico de reacciones y de interacciones destinadas a la activacion de la celula, organismo o partlcula para su destruction. El sistema de complemento se compone de un conjunto de mas de 30 protelnas plasmaticas y de membrana que actuan en forma conjunta en un sistema regulado de cascada para atacar formas extracelulares de patogenos (por ejemplo, una bacteria). El sistema de complemento incluye dos cascadas distintas activacion enzimatica, las rutas clasica y alternativa que convergen en una ruta no enzimatica terminal comun, conocida como la ruta de ataque de la membrana.

La primera cascada enzimaticamente activada, conocida como la ruta clasica, comprende varios componentes, C1, C4, C2, C3 y C5 (enumerados por orden en la ruta). La initiation de la ruta clasica del sistema de complemento se produce despues del enlazamiento y activacion del primer componente del complemento (C1) tanto por el activador inmune como por el no inmune. C1 comprende un complejo que depende del calcio de los componentes C1q, C1r y C1s, y se activa mediante el enlazamiento del componente C1q. C1q contiene seis subunidades identicas y cada subunidad comprende tres cadenas (las cadenas A, B y C). Cada cadena tiene una region de cabeza globular que esta conectada a una cola de tipo colageno. El enlazamiento y la activacion de C1q por complejos antlgeno- anticuerpo se produce a traves de la region del grupo de cabeza de C1q. Numerosos activadores de C1q que no son anticuerpos, incluyendo protelnas, llpidos y acidos nucleicos, se unen y activan C1q a traves de un sitio distinto en la region del tallo de tipo colageno. Los complejos de Clqrs catalizan entonces la activacion de los componentes del complemento C4 y C2, formando el complejo C4b2a que actua como una convertasa C3.

La segunda cascada enzimaticamente activada, conocida como la ruta alternativa, es una ruta rapida, independiente del anticuerpo para la activacion y amplification del sistema de complemento. La ruta alternativa comprende varios componentes, C3, el Factor B, y el Factor D (enumerados por orden en la ruta). La activacion de la ruta alternativa se produce cuando C3b, una forma proteollticamente escindida de C3, se enlaza a un agente de superficie de activacion tal como una bacteria. El Factor B se enlaza luego a C3b, y es escindido por el Factor D para producir la enzima activa, Ba. La enzima Ba escinde luego mas C3 para generar mas C3b, produciendo una extensa deposition de complejos C3b-Ba en la superficie de activacion.

De este modo, tanto las rutas clasica como alterna del complemento producen convertasas C3 que dividen el factor C3 en C3a y C3b. En este punto, ambas convertasas C3 se ensamblan ademas en convertasas C5 (C4b2a3b y C3b3bBb). Estos complejos escinden posteriormente al componente C5 del complemento en dos componentes: el polipeptido C5a (9 kDa) y el polipeptido C5b (170 kDa). El polipeptido C5a se une a un receptor transmembrana 7 acoplado a protelna G, que se asocio originalmente con leucocitos y ahora se sabe que se expresa en una variedad de tejidos, incluyendo hepatocitos y neuronas. La molecula C5a es el componente quimiotactico primario del sistema de complemento humano y puede desencadenar una variedad de respuestas biologicas, incluyendo quimiotaxis de leucocitos, contraction del musculo liso, activacion de rutas de transduction de senales intracelulares, adhesion endotelial de neutrofilos, liberation del mediador de citoquinas y de llpidos y la formation de oxidante.

El fragmento C5b mas grande se une secuencialmente a los componentes posteriores de la cascada del complemento, C6, C7, C8 y C9 para formar el complejo de ataque de la membrana C5b-9 ("CAM"). El CAM lipofllico C5b-9 puede lisar directamente los eritrocitos, y en mayores cantidades es lltico para los leucocitos y perjudicial para tejidos tales como celulas musculares, epiteliales y endoteliales. En cantidades inferiores a las llticas, el CAM C5b-9 puede estimular la sobrerregulacion positiva de moleculas de adhesion, el aumento de calcio intracelular y la liberacion de citoquina. Ademas, en concentraciones por debajo de las llticas, el CAM C5b-9 puede estimular celulas

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tales como las celulas endoteliales y las plaquetas sin causar lisis celular. Los efectos no llticos de C5a y del CAM C5b-9 son comparables e intercambiables.

Aunque el sistema de complemento tiene un papel importante en el mantenimiento de la salud, tiene el potencial de causar o contribuir a la enfermedad.

Inhibidores del sistema de complemento

Un inhibidor de un sistema de complemento de mamlfero para uso en los metodos y/o medicamentos de la presente divulgacion puede ser un antagonista, polipeptido, peptido, anticuerpo, oligonucleotido antisentido, aptamero, ARNmi, ribozima, ARNpi, o molecula pequena. El inhibidor preferiblemente inhibe o bloquea la formacion del complejo de ataque de la membrana. El inhibidor preferiblemente bloquea la activacion del sistema de complemento a traves tanto de la ruta clasica como la alternativa del complemento. Un inhibidor preferido es un inhibidor que bloquea la convertasa C3 y montaje del CAM. Un inhibidor mas preferido es un inhibidor que bloquea uno o mas de C5, C6, C7, C8 y C9. Los siguientes compuestos pueden por lo tanto ser utilizados en los metodos y/o medicamentos de la invencion.

Un inhibidor preferido del complemento para uso en la presente divulgacion es un regulador del complemento, receptor del complemento o sus derivados. Estos incluyen todos los reguladores naturales del sistema de complemento, tales como el inhibidor de C1, CR1, DAF, MCP y CD59. Se incluyen ademas derivados de los reguladores naturales del sistema de complemento que contiene unidades estructurales comunes (UEC). CR1, MCP, DAF, C4bp, fH, todos contienen repeticiones de consenso cortas (RCC). La RCC es un motivo estructural de 60-70 aminoacidos que se repite en tandem 30 veces en el alotipo F de CR1; el numero de repeticiones puede variar entre alotipos. La secuencia de consenso de la RCC incluye 4 cistelnas, una glicina y un triptofano que son invariables entre todas las RCC. Otras dieciseis posiciones se conservan, con el mismo aminoacido o se encuentra un reemplazo conservador en mas de la mitad de las 30 RCC (Klickstein, y colaboradores, 1987, 1988; Hourcade, y colaboradores, 1988). Preferiblemente, el regulador del complemento que contiene las RCC, comprende al menos 3, 6, 12, 25 o 30 RCC. Preferiblemente, el regulador del complemento que contiene RCC es un derivado soluble de un receptor del complemento. Los ejemplos adecuados de los mismos incluyen, por ejemplo, sCR1 (TP10), que contiene 30 RCC, sMCP, sDAF, y CAB-2, que es un hlbrido de DAF/MCP. Las modificaciones de estas moleculas permiten direccionarlas a las membranas.

CR1 soluble es un inhibidor preferido de la activacion del complemento ya que solo CR1 combina la especificidad tanto para C3b como para C4b con capacidades para disociar las convertasas C3 de ambas rutas y para la actividad del cofactor en la inactivacion proteolltica de C3b y C4b por el factor I. Ademas, estas funciones de CR1 no estan restringidas por funciones de activacion de la ruta alternativa, haciendo que el receptor sea adecuado para la supresion de la activacion mediante estlmulos no inmunologicos y la inhibicion de la activacion del complemento tanto en la ruta clasica como la alternativa. Los fragmentos CR1 solubles (sCR1) han sido preparados por tecnicas de ADN recombinante, utilizando ADNc que carece de dominios transmembrana y citoplasmaticos (WO 89/09220; WO 91/05047). Las moleculas preferidas de sCR1 para uso en los metodos y/o medicamentos de la invencion son 1) una protelna CR1 soluble que tiene las caracterlsticas de la protelna expresada por una celula de ovario de hamster chino DUX B11 que porta al plasmido pBSCR1/pTCSgpt como la depositada en la ATCC y que se le asigno el numero de acceso CRL 10052; o 2) el receptor 1 soluble del complemento TP10 (Avant Immunotherapeutics, Inc.).

Un regulador adicional del complemento para uso en los metodos y/o medicamentos de la divulgacion es inhibidor de C1 (C1INH). C1INH es un miembro de la familia de inhibidores de la serina proteasa (serpinas) y se une al sitio activo tanto en C1r como en C1s inhibiendo la formacion del complejo C1. Una ventaja de C1INh derivado de plasma es su larga vida media en suero (70 horas) en humanos. Alternativamente se puede utilizar C1INH humano transgenico (WO 01/57079).

Incluso otro receptor del complemento unido a la membrana para uso en los metodos y/o medicamentos de la divulgacion es Crry-Ig (Quigg y colaboradores, 1998). Crry es un inhibidor del complemento de la membrana con actividad de aceleracion del decaimiento al nivel 3 de la convertasa, que inhibe tanto la ruta clasica como la alternativa del complemento. Tambien posee actividad de cofactor comparable a la de CR1 para la escision mediada por el factor I de C3b y C4b. Crry-Ig es una protelna soluble recombinante con mayor vida media (40 horas) debido a la fusion de Crry con la porcion Fc de un companero de IgG1 de raton que no activa al complemento. En general, Crry-Ig es un potente inhibidor del complemento.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra componentes del complemento son la clase de compuestos que se usan en los metodos y/o medicamentos de la invencion. En principio, los anticuerpos contra cualquier factor del complemento pueden ser de utilidad. Sin embargo, los anticuerpos preferidos son anticuerpos que bloquean la convertasa C3 y/o el montaje del CAM. Un anticuerpo preferido adicional es un anticuerpo que bloquea uno o mas de C5, C6, C7, C8 y C9. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal (MAb). Los MAb para los componentes del complemento se pueden preparar usando una amplia variedad de tecnicas conocidas en la tecnica, incluyendo el uso de tecnicas de hibridoma, recombinantes, y de despliegue en fagos, o una combinacion de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando tecnicas de

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hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la tecnica y las ensenadas (es decir, Harlow y colaboradores, 1998; Hammerling, y colaboradores, 1981).

Para el tratamiento de humanos, se usarlan preferiblemente los MAb anti-complemento como anticuerpos quimericos, desinmunizados, humanizados o humanos. Tales anticuerpos pueden reducir la inmunogenicidad y por lo tanto evitar la repuesta del anticuerpo humano antirraton (AHAR). Es preferible que el anticuerpo sea IgG4, IgG2, u otro IgG o IgM geneticamente mutado que no aumente la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (Canfield y Morrison, 1991) y la citolisis mediada por el complemento (Xu y colaboradores, 1994; Pulito y colaboradores, 1996). Los anticuerpos quimericos son producidos por procesos recombinantes bien conocidos en la tecnica, y tienen una region variable animal y una region constante humana. Los anticuerpos humanizados tienen un mayor grado de secuencias peptldicas humanas que los anticuerpos quimericos. En un anticuerpo humanizado, solo las regiones determinantes de complementariedad (RDC) que son responsables del enlazamiento y especificidad del antlgeno se derivan de animales y tienen una secuencia de aminoacidos que corresponde al anticuerpo del animal, y sustancialmente todas las porciones restantes de la molecula (excepto, en algunos casos, pequenas porciones de las regiones marco dentro de la region variable) se derivan de humanos y corresponden en secuencia de aminoacidos a un anticuerpo humano. Vease Riechmann y colaboradores, 1988; Winter, patente de los Estados Unidos No. 5.225.539; Queen y colaboradores, patente de los Estados Unidos No. 5.530.101. Anticuerpos desinmunizados son anticuerpos en los que se han eliminado los epltopos de celulas T y B, como se describe en el documento WO9852976. Ellos tienen inmunogenicidad reducida cuando se aplican in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden elaborarse de varias maneras diferentes, incluyendo mediante el uso de bibliotecas de expresion de inmunoglobulina humana (Stratagene Corp., La Jolla, California) para producir fragmentos de anticuerpos humanos (VH, VL, Fv, Fd, Fab, o (Fab')2, y el uso de estos fragmentos para construir anticuerpos humanos completos utilizando tecnicas similares a aquellas para producir anticuerpos quimericos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos tambien en ratones transgenicos con un genoma de inmunoglobulina humana. Tales ratones estan disponibles a traves de Abgenix, Inc., Fremont, California, y Medarex, Inc., Annandale, Nueva Jersey.

Tambien se puede crear moleculas de union de una sola cadena peptldica en las que se conectan las regiones Fv de cadena pesada y ligera. Anticuerpos de cadena sencilla ("ScFv") y el metodo de su construction se describen en la patente de los Estados Unidos No. 4.946.778. Alternativamente, se pueden construir Fab y expresarse por medios similares (Evans y colaboradores, 1995).

Otra clase de anticuerpos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invention son anticuerpos de cadena pesada y derivados de los mismos. Tal anticuerpos monocatenarios de cadena pesada se producen naturalmente, por ejemplo en camelidos y sus dominios variables aislados se denominan generalmente como "dominios VHH" o "nanocuerposMR". Los metodos para obtener anticuerpos de cadena pesada y los dominios variables se proporcionan, entre otros, en las siguientes referencias: WO 94/04678, WO 95/04079, WO 96/34103, WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231, WO 02/48193, WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016, WO 03 / 055 527, WO 03/050531, WO 01/90190, WO 03/025020, WO 04/041867, WO 04/041862, WO04 / 041865, WO 04/041863, WO 04/062551.

Todos los anticuerpos total y parcialmente humanos son menos inmunogenicos que los MAb totalmente murinos, y los fragmentos y anticuerpos de cadena sencilla son tambien menos inmunogenicos. Por lo tanto, es menos probable que todos estos tipos de anticuerpos evoquen una respuesta inmune o alergica. En consecuencia, son mas adecuados para administration in vivo en humanos que los anticuerpos totalmente animales, especialmente cuando es necesaria una administracion repetida o a largo plazo. Ademas, el tamano mas pequeno del fragmento de anticuerpo puede ayudar a mejorar la biodisponibilidad en el tejido, lo que puede ser crltico para una mejor acumulacion de la dosis en indicaciones de enfermedad aguda, tales como el tratamiento de tumores.

Los anticuerpos anti-complemento adecuados ya se encuentran disponibles. Por ejemplo, el MAb anti-C5 producido por el hibridoma 5G1.1 que tiene la designation ATCC HB-11625 (N19-8) como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6.355.245; MAb anti-C3a de Quidel, San Diego, California [catalogo No. A203]; anticuerpos C3aR anti-humanos hC3aRZ1 y hC3aRz2, como se describe en Kacani y colaboradores, (2001); anticuerpos C5a de raton anti-humanos de HyCult Biotechnology BV de los Palses Bajos [clones 557, 2942 y 2952]; el anticuerpo C5a anti-humano de Tanox, Inc. [137-26], como se describe en Fung y colaboradores (2003); anticuerpos C5a divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 5.480.974; MAb C5aR humano anti-EX1 S5/1, como se describe en Oppermann y colaboradores, (1993); MAb anti-C5aR S5/1, como se describe en Kacani y colaboradores, (2001); y MAb anti-C5a como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5.177.190.

Otro compuesto que puede ser utilizado en los metodos y/o medicamentos de la divulgation es el factor de veneno de cobra (FVC) o un derivado del mismo que agota C3 mediante la union del Factor B y la formation de una actividad de convertasa C3 que es resistente a los reguladores naturales en fase fluida. Un derivado preferido del FVC es, por ejemplo, un derivado que puede ser dirigido al sitio de la lesion.

Otros compuestos utiles incluyen inhibidores polianionicos del complemento tales como heparina, heparina N-

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acetilada y suramina. La heparina inhibe C mediante la union a C1, el bloqueo de la convertasa C3 y el montaje del CAM. La heparina N-acetilada tiene una actividad anticoagulante reducida.

Ademas se pueden utilizar una variedad de moleculas pequenas sinteticas y/o naturales que inhiben el complemento en los metodos y/o medicamentos de la divulgacion, por ejemplo, los inhibidores naturales K-76COOH (derivados de Stachybotrys complementi), que inhiben C5, y acido rosmarlnico derivado de romero, que se une e inhibe C3b y por lo tanto evita la formacion de convertasa, inhibidores sinteticos de la proteasa tales como ,por ejemplo, mesilato de nafamostat (FUT-175), que se une a C1r, C1s, al Factor D y la convertasa C3/C5, inhibidores del complejo C1, tales como, por ejemplo, C1s-INH-248 y BCX-1470 (ya probado en seres humanos por seguridad), inhibidores peptldicos, tales como moleculas que contienen partes de o derivadas de moleculas naturales que se enlazan al complemento, tales como, por ejemplo, derivados que contienen la parte del terminal carboxilo de las serpinas, compstatina (una molecula clclica de 13 a. a. que se une a C3), y los agonistas del receptor C5, PMX53 y PMX205.

Los metodos para producir inhibidores de acido nucleico del complemento tales como oligonucleotidos antisentido, aptameros, ARNmi, ribozima, ARNpi, son ya conocidos por una persona normalmente capacitada en la materia. Preferiblemente dichos inhibidores de acido nucleico comprenden uno o mas nucleotidos modificados, tales como, por ejemplo, ribonucleotidos sustituidos en 2'-O, incluyendo sustituciones de alquilo y metoxi etilo, acido nucleico peptldico (ANP), acido nucleico bloqueado (ANB) y oligonucleotidos antisentido de morfolino y nucleotidos con puentes de etileno (ENA) y combinaciones de los mismos.

En los metodos anteriores de la invencion, los compuestos se pueden administrar por cualquier via conveniente, por ejemplo por infusion o inyeccion en bolo. Se conocen varios sistemas de administracion y se pueden utilizar para la administracion de los compuestos inhibidores. Estos incluyen la encapsulacion en liposomas, micropartlculas, o microcapsulas. Aunque en los metodos de la invencion no se excluye la administracion de los compuestos por via oral y/o de las mucosas (intranasal, inhalacion, rectal), por lo general los inhibidores del complemento se administran por via parenteral, incluyendo, por ejemplo intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutanea. Los compuestos se pueden administrar sistemicamente o pueden ser utilizados para administracion local, topica o regional en o cerca al sitio de la enfermedad o lesion, por ejemplo, usando una inyeccion y/o cualquier tecnica quirurgica neuronal adecuada.

La invencion se refiere ademas a una preparacion farmaceutica que comprende como ingrediente activo un inhibidor del complemento como se definio anteriormente. La composition comprende preferiblemente al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable ademas del ingrediente activo. El vehlculo farmaceutico puede ser cualquier sustancia compatible, no toxica, adecuada para suministrar los inhibidores al paciente. Agua esteril, alcohol, grasas, ceras y solidos inertes se puede utilizar como vehlculo. Tambien se pueden incorporar adyuvantes farmaceuticamente aceptables, agentes reguladores, agentes dispersantes, y similares, en las composiciones farmaceuticas.

Para administracion oral, el inhibidor se puede administrar en formas de dosificacion solidas, tales como capsulas, tabletas y polvos, o en formas de dosificacion llquidas, tales como elixires, jarabes, y suspensiones. El(los) componente(s) activo(s) se puede(n) encapsular en capsulas de gelatina junto con los ingredientes inactivos y los vehlculos en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidon, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, acido estearico, sacarina sodica, talco, carbonato de magnesio y similares. Tanto las tabletas como las capsulas pueden fabricarse como productos de liberation continuada para proporcionar una liberation continua del medicamento durante un perlodo de varias horas. Las tabletas comprimidas pueden estar recubiertas de azucar o recubiertas de una pellcula para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger la tableta de la atmosfera, o con una cubierta enterica para desintegracion selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificacion llquidas para administracion oral pueden contener colorantes y saborizantes para aumentar la aceptacion por parte del paciente.

Los inhibidores, sin embargo, se administran preferiblemente en forma parenteral. Los vehlculos adecuados para formulaciones parenterales incluyen solution salina, solution salina regulada, dextrosa, y agua. Tlpicamente, las composiciones para administracion parenteral son soluciones en un regulador acuoso isotonico esteril. La esterilizacion se consigue facilmente mediante filtration a traves de membranas de filtration esteril, antes o despues de la liofilizacion y la reconstitution. Una composicion tlpica para infusion intravenosa puede elaborarse para contener 10 a 50 ml de NaCl esteril al 0,9% o glucosa esteril al 5% opcionalmente complementada con un solucion de albumina al 20% y una cantidad apropiada (1 a 1000 pg) del inhibidor. Una composicion farmaceutica tlpica para inyeccion intramuscular se elaborarla para contener para contener, por ejemplo, 1 - 10 ml de agua regulada esteril y de 1 a 1000 pg del inhibidor. Los metodos para preparar composiciones que pueden ser administradas en forma parenteral son bien conocidos en la tecnica y se describen con mas detalle en varias fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15a ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (incorporado por referencia en su totalidad para todos los propositos). Cuando sea necesario, la composicion tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como lidocalna para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. Generalmente, los ingredientes se suministran bien sea por separado o mezclados juntos en una forma de dosificacion unitaria, contenida en un recipiente hermeticamente sellado tal como una ampolla o una bolsita que indique la cantidad de agente activo en unidades de actividad. Cuando la composicion se va a administrar por infusion, se puede dispensar con una botella de infusion que contiene 'Agua para Inyeccion' esteril de grado

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farmaceutico o una solucion salina. Cuando la composicion se va a administrar por inyeccion, se puede proporcionar una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina para que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administracion.

En aquellos metodos en los que el inhibidor es un polipeptido o anticuerpo, puede purificarse a partir de cultivos de celulas microbianas, de mamlferos, o de insectos, a partir de leche de mamlferos transgenicos u otra fuente y ser administrado en forma purificada junto con un vehlculo farmaceutico tal como una composicion farmaceutica. Los metodos para producir composiciones farmaceuticas que comprenden polipeptidos se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.789.543 y 6.207.718. La forma preferida depende del modo pretendido de administracion y de la aplicacion terapeutica. La concentracion de los polipeptidos o anticuerpos de la invencion en la composicion farmaceutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 0,1% en peso, siendo habitualmente al menos aproximadamente 1% en peso hasta tanto como 20% en peso o mas.

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utiliza en su sentido no limitante para significar que los Items que van a continuacion de la palabra estan incluidos, pero los Items que no se mencionan especlficamente no estan excluidos. Ademas, la referencia a un elemento mediante el artlculo indefinido "un, uno, una" no excluye la posibilidad de que mas de uno de los elementos este presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artlculo indefinido "un, uno, una" por lo tanto usualmente significa "al menos uno".

Description de las figuras

Figura 1. El efecto de la deficiencia de C6 en el complemento sobre la regeneration del nervio tibial. El nervio ciatico derecho fue aplastado durante 30 segundos en ratas PVG deficientes en C6 y de tipo silvestre. Se analizo el nervio tibial 1 y 5 semanas despues de la lesion. Foto de control: nervio tibial izquierdo de una rata PVG.

Figura 2. La deficiencia de C6 conduce a una afluencia/activacion retardada de las celulas fagoclticas. Se contaron las celulas inmunorreactivas (-ir) ED1 (CD68) en las secciones no consecutivos de los nervios ciaticos de ratas TS (tipo silvestre), C6-/- (deficientes en C6) y C6+ (ratas deficientes en C6 complementadas con C6) a las 0, 24, 48 y 72 horas despues de la lesion. La significancia estadlstica indicada por el asterisco (*) se refiere a p <0,05.

Figura 3. El efecto de la reconstitution de C6 sobre la regeneracion. Analisis de los axones mielinizados durante la regeneracion. Analisis mediante microscopio de luz en las secciones semi-delgadas del sitio proximal del nervio tibial de ratas a las 5 semanas despues de la lesion. De izquierda a derecha: los nervios no aplastados; nervios de tipo silvestre (WT); nervios deficientes en C6 (C6-/-); y, nervios deficientes en C6 reconstituidos con C6 (C6+).

Figura 4. El efecto de la reconstitucion de C6 sobre la recuperation funcional. La recuperation de la funcion sensorial, tal como se mide con el aparato para medir la contraction brusca de la pata con corrientes que van desde 0,1 mA a 0,5 mA. Los valores se normalizan a los niveles de control. La flecha (^) indica el momento en que se realizo la lesion por aplastamiento. TS = ratas de tipo silvestre; C6-/- = ratas deficientes en C6; y, C6+ = reconstitucion de C6 en animales deficientes en C6. La significancia estadlstica entre C6-/- y TS (*) o C6+ (f) es para p <0,05.

Figura 5. El inhibidor de C1 humana recombinante (rhC1INH) inhibe la activation del complemento despues del aplastamiento. Inmunocoloracion con C1q, C4c y C3c de nervios ciaticos de ratas tipo silvestre tratados con rhC1INH o vehlculo (PBS) solamente.

Figura 6. El efecto de CR1 soluble sobre la regeneracion postraumatica de los nervios. La recuperacion de la funcion sensorial tal como se mide con el aparato para medir la contraccion brusca de la pata con corrientes que van desde 0,1 mA a 0,5 mA. Los valores se normalizan a los niveles de control. La flecha (^) indica el momento en que se realizo la lesion por aplastamiento. PBS = Control con vehlculo unicamente; sCR1 = CR1 soluble.

Figura 7. La activacion de los macrofagos despues del aplastamiento del nervio depende de la activacion de un componente mas adelante de la cascada del complemento. Se determinaron las celulas positivas para CD68 mediante inmunocoloracion con el anticuerpo ED1. En animales tratados con vehlculo (PBS) y de tipo silvestre (TS), el numero de celulas positivas para CD68 en la parte distal del nervio ciatico lesionado aumento 72 horas despues del aplastamiento del nervio. El tratamiento con sCR1 bloqueo esta activacion a un nivel similar como se observa en ratas deficientes en C6 (C6-). La reconstitucion de C6 en los animales con deficiencia de C6 (C6+) dio como resultado la recuperacion casi completa de este bloque en activacion.

Figura 8. Recuperacion de la funcion. (a) Indice Funcional del Nervio Ciatico (IFNC) y huellas despues de la lesion por aplastamiento del nervio ciatico (tiempo = 0) en ratas de tipo silvestre (n = 8), C6'/_ (n = 8) y C6+ (n = 8) que muestran la recuperacion de la funcion motora durante un periodo de 5 semanas despues de la lesion. Los niveles de control son cercanos a 0, mientras que valores cercanos a -140 indican la perdida completa de la funcion (semana 1). Los asteriscos (*) se refieren a diferencias significativas entre el grupo de ratas de tipo silvestre y C6'/_, mientras que la cruz (f) se refiere a las diferencias significativas entre el grupo de ratas C6'/_ y C6+ con p< 0,05

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determinadas mediante un analisis ANOVA bidireccional con correccion de Bonferroni. Cuanto mas esparcida la punta en la huella de C6-/- (semana 4) en comparacion con las huellas de C6+ y de tipo silvestre, indica una mayor fuerza muscular. (b) Analisis de contraccion brusca de la pata despues de lesion por aplastamiento del nervio ciatico (tiempo = 0) en ratas de tipo silvestre (n = 8), C6-/- (n = 8) y C6+ (n = 8) que muestra la recuperacion de la funcion sensorial en un periodo de 5 semanas despues de la lesion. Los valores se expresan como porcentaje de los niveles de control (funcion al 100%). Los asteriscos (*) se refieren a diferencias significativas entre el grupo de ratas de tipo silvestre y C6-/-, mientras que la cruz (f) se refiere a las diferencias significativas entre el grupo de ratas C6-/- y C6+ con p< 0,05 determinadas mediante un analisis ANOVA bidireccional con correccion de Bonferroni.

Figura 9. Recuperacion de la funcion sensorial de ratas inhibidas por C. El analisis de contraccion brusca de las patas despues de una lesion por aplastamiento del nervio ciatico (tiempo = 0) en ratas de tipo silvestre tratada con PBS (n = 6) y con sCR1 (n = 6) que muestran la recuperacion de la funcion sensorial en un periodo de 5 semanas despues de la lesion. Los valores se expresan como porcentaje de los niveles de control (funcion al 100%). Los asteriscos (*) se refieren a p < 0.05 determinado mediante un analisis ANOVA bidireccional con correccion de Bonferroni.

Figura 10. Patologla. Coloracion con tionina y microscopla electronica de secciones transversales de los extremos distales de los nervios tibiales de ratas sin lesiones (n = 6), de tipo silvestre (n = 5), C6-/- (n = 5) y tratadas con sCR1 (n = 6) a las 5 semanas despues de la lesion por aplastamiento. Observese la presencia de grupos de regeneracion de pequeno calibre, axones finamente mielinizados en el nervio de tipo silvestre (flechas ^), mientras que axones individuales de gran calibre estan presentes en los nervios tratados con C6-/- y los nervios tratados con sCR1, de manera similar al control no lesionado. La barra es de 50 pm (microscopla de luz, paneles de la izquierda) y 10 pm (microscopia electronica, paneles de la derecha).

Figura 11a y 11b. Inhibicion de sCR1 de activacion del complemento (A) los niveles de sCR1 en plasma en ratas tratadas con sCR1, que muestran concentracion de sCR1 en el tiempo con el tratamiento diario. (B) la actividad hemolltica en plasma de ratas tratadas con PBS y con sCR1, que muestra disminucion de la actividad en las ratas tratadas con sCR1 en comparacion con los controles tratados con PBS. (A, B) Dla 0 es el dla de la lesion por aplastamiento. Las ratas recibieron inyecciones i.p. de sCR1 (15 mg/kg/dla) o PBS (igual volumen) los dlas (-1, 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6). Se recogio sangre inmediatamente antes de cada tratamiento. Los datos representan la media ± DE. La significancia estadlstica esta determinada por ANOVA bidireccional con la correccion de Bonferroni (* es p < 0,001).

Figura 12. Inhibicion de sCR1 de activacion del complemento. La cuantificacion de la inmunorreactividad del CAM expresada como el porcentaje determinado de la superficie total. Los datos representan la media ± DE. La significancia estadlstica esta determinada por ANOVA bidireccional con la correccion de Bonferroni (* es p < 0,001).

Figura 13. Analisis de los macrofagos. Cuantificacion de las celulas CD68-ir en secciones no consecutivas de los nervios ciaticos, que muestra un alto numero de celulas en los nervios tratados con PBS y un ligero aumento en los nervios tratados con sCR1, en comparacion con el nervio no lesionado. Los datos representan la media ± DE. La significancia estadlstica esta determinada por ANOVA bidireccional con la correccion de Bonferroni.

Figura 14. Analisis de los macrofagos. Distribucion por tamano de los nervios ciaticos con celulas CD68-ir de un nervio no lesionado (a), nervios tratados con PBS (b) y tratados con sCR1 (c) nervios 3 dlas despues de la lesion. Notese el desplazamiento en el pico de distribucion de tamano de celulas CD68-ir de un tamano de 0-40 pm2 en nervios no lesionados y tratados con sCR1 hasta un tamano de 40-120 pm2 en los nervios tratados con PBS.

Figura 15. Analisis de activacion de la ruta alternativa. (a) Analisis de la transferencia tipo Western de nervios ciaticos de ratas 2 dlas despues de la lesion, mostrando una mayor cantidad de protelna fBb escindida en los nervios lesionados en comparacion con los controles no lesionados. (b) Cuantificacion relativa de bandas inmunorreactivas de fBb. La inmunorreactividad de fBb en los controles no lesionados se define como 1,0 veces la expresion relativa. Los valores se normalizan a la carga total de protelnas y representan la media ± DE de tres transferencias. La significancia estadlstica se determino mediante la prueba t no pareada.

Ejemplos

1. Ejemplo 1: Recuperacion postraumatica mejorada del nervio en ratas deficientes en el componente C6 del complemento en comparacion con ratas de tipo silvestre

1.1 Analisis por microscopla electronica

Se han explorado explorado el papel del sistema de complemento en una lesion aguda y cronica del nervio y durante la regeneracion. Como modelo se utilizo la cepa de rata PVG deficiente en C6 del complemento (Bhole y Stahl, 2004) y se comparo esta con ratas PVG de tipo silvestre. Puesto que el sistema de complemento tiene muchas funciones, se elige un modelo animal que solo sea defectuoso en la mayorla de los efectores terminales de la cascada del complemento.

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El efecto de inhibicion del complemento en la regeneracion de los nervios se estudio en el modelo agudo de aplastamiento del nervio (Glass, 2004). Se aplasto el nervio ciatico derecho durante 30 segundos en ratas de tipo silvestre, as! como en las ratas PVG deficientes en C6. Luego se analizo el nervio tibial 1 y 5 semanas despues de la lesion (vease la Figura 1).

En una semana, la microscopla electronica muestra la degeneration igualmente grave en las ratas de tipo silvestre y deficientes en C6. A las 5 semanas, las ratas deficientes en C6 ya muestran axones mielinizados, mientras que las ratas de tipo silvestre muestran una recuperation incipiente. En los animales con deficiencia de C6, la mayorla de los axones mielinizados muestran la relation normal uno a uno con las celulas de Schwann (comparar con la imagen de control del nervio tibial izquierdo de una rata PVG). Por el contrario, en las ratas de tipo silvestre hay varias fibras mielinizadas en cada grupo regenerativo.

Se encontraron dos efectos de la deficiencia de C6 en la recuperacion postraumatica del nervio:

1) La perdida de mielina durante degeneracion Walleriana se retraso en los animales con deficiencia de C6. Las ratas de tipo silvestre mostraron signos de DW (degeneracion de la mielina, activation de macrofagos) ya despues de 24 horas. En los animales deficientes en C6 se retraso este proceso. Solo despues de 72 h fue visible la degeneracion de la mielina y no se produjo activacion de los macrofagos. Despues de una semana, los dos tipos de animales mostraron degeneracion severa del nervio.

2) De forma inesperada sin embargo, la recuperacion postraumatica del nervio fue mucho mejor en ratas deficientes en el componente C6 del complemento en comparacion con la rata de tipo silvestre. La remielinizacion de los axones individuales ocurrio mucho mas rapido en los animales con deficiencia de C6 y el proceso de germination fue mas eficiente ya que se produjo un solo brote de axon, de gran diametro, en lugar de un grupo de axones mas pequenos. Vease la Figura 1.

1.2 La deficiencia de C6 conduce a una afluencia/activacion retardada de las celulas fagoclticas

En vista del importante papel de los macrofagos en la perdida de mielina, a continuation se analizo el numero y el estado de activacion de los macrofagos despues del aplastamiento.

Se contaron las celulas inmunorreactivas (-ir) ED1 (CD68) en las secciones no consecutivas de los nervios ciaticos aplastados a las 0, 24, 48 y 72 horas despues de la lesion, que se tomaron de ratas de tipo silvestre, ratas deficientes en C6 y ratas deficientes en C6 que recibieron C6, respectivamente.

Tanto en animales de tipo silvestre como deficientes en C6, se acumularon celulas positivas en CD68 (anticuerpo ED1) en el nervio aplastado. Sin embargo, los animales deficientes en C6 mostraron una aparicion retardada de celulas positivas para CD68 (Figura 2, comparar la llnea continua con la punteada). El suministro de C6 restauro la acumulacion de celulas con CD68 (vease el punto de tiempo de 72 horas). En los animales con deficiencia de C6 habla una falta de activacion de macrofagos, como se analizo mediante coloration inmunohistoqulmica con CR3 (anticuerpo ED7) tincion (no mostrado).

Ya que los ganglios linfaticos de estos animales contienen celulas positivas para CR3 podrlamos descartar que los animales deficientes en C6 son defectuosos en la activacion misma de los macrofagos. Ademas, despues de la reconstitution de C6, se restablecio la acumulacion de celulas positivas para CD68 y la expresion de CR3 en los macrofagos y, posteriormente, se produjo la degeneracion de la mielina. Esto vincula directamente las etapas en la ruta del complemento mas abajo de C6, es decir, la formation del complejo de ataque de la membrana (CAM) en la DW.

Despues de 7 dlas, se encontraron igual numero de celulas positivas para CD68 en las celulas de tipo silvestres y deficientes en C6. Estas celulas no muestran ED7 (CR3) en los animales deficientes en c6 y son mas probablemente macrofagos no activados (datos no mostrados).

1.3 Ensayos neuropatologicos y funcionales de la deficiencia y reconstitucion de C6

La Figura 3 muestra el analisis a traves del microscopio de luz de axones mielinizados durante la regeneracion. Las secciones casi delgadas del sitio proximal del nervio tibial de rata se analizaron a las 5 semanas despues de la lesion de las ratas de tipo silvestre, ratas deficientes en C6 y ratas deficientes en C6 reconstituidas con C6. Pocos axones mielinizados finamente estan presentes en el nervio de tipo silvestre (TS), mientras que muchos axones mielinizados densamente estan presentes en el nervio deficiente en C6 (C6-/-). El nervio de la rata que se reconstituyo con C6 (C6+) muestra axones menos mielinizados que el nervio deficiente en C6.

La Figura 4 muestra el efecto de la reconstitucion de C6 en la recuperacion funcional del nervio. La recuperacion de la funcion sensorial se midio con el aparato de ensayo de contracciones bruscas de la pata con corrientes que van desde 0,1 mA a 0,5 mA. Los valores se normalizaron a los niveles de control. La flecha (^) indica el momento en el que se realizo la lesion por aplastamiento. A las ratas de tipo silvestre les tomo 4 semanas para recuperarse por completo, mientras que las ratas deficientes en C6 ya estan recuperadas a las 3 semanas despues del

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aplastamiento. La reconstitucion de C6 en animales con deficiencia de C6 da lugar al fenotipo de regeneracion de tipo silvestre (lento) despues del aplastamiento. La significancia estadlstica entre C6-/- y TS (*) o C6+ (f) es para p < 0,05.ES

Se concluye que el efecto observado en la regeneracion del SNP despues del aplastamiento se debe a la deficiencia de C6 ya que la reconstitucion de las ratas deficientes en C6 con C6 humana purificada restaura el fenotipo silvestre en ensayos neuropatologicos y funcionales (Figura 3 y 4).

Ejemplo 2: Inhibicion de la activacion del complemento despues del aplastamiento del nervio por el inhibidor de C1 humano

Se analizo si el inhibidor de C1 humano recombinante (rhClINH; obtenido a traves de Pharming, Leiden, Palses Bajos) es capaz de inhibir la activacion rapida del complemento (1 h) despues del aplastamiento del nervio. La Figura 5 muestra la inmunocoloracion con C1q, C4c y C3c de los nervios ciaticos lesionados de ratas de tipo silvestre tratadas con rhC1INH o vehlculo (PBS) solo 1 hora despues del aplastamiento del nervio. Esta presenta una alta inmunoreactividad para C1q en todos los nervios aplastados, confirmando la sobrerregulacion de C1q despues de la lesion por aplastamiento. Se detecto la inmunoreactividad de C4c y C3c en los nervios tratados con PBS como se esperaba, pero no se detecto inmunoreactividad de C4c y C3c en los nervios de las ratas tratadas con rhC1INH, sacrificadas 1 hora despues de la lesion. Esto demuestra el bloqueo efectivo de la cascada del complemento por rhC1INH despues de aplastar y sugerir que la ruta alternativa de activacion del complemento no esta involucrada en el modelo de lesion por aplastamiento de la degeneracion Walleriana. Por lo tanto, la activacion de la cascada del complemento despues del aplastamiento del nervio se produce a traves de la ruta clasica. Hay una advertencia sin embargo: debido a la corta vida media de rhC1INH en ratas, solo se pudo hacer seguimiento a la escision de C3 y C4, 1 hora despues del aplastamiento. Por lo tanto no se puede excluir que ocurra la activacion a traves de la ruta alternativa en un instante posterior.

Ejemplo 3: El efecto de CR1 soluble sobre la regeneracion postraumatica del nervio

A continuacion, se probo el efecto de CR1 soluble (sCR1) sobre la regeneracion postraumatica del nervio. sCR1 inhibe la convertasa C3/C5, y por lo tanto afecta tanto a la ruta clasica como alternativa del sistema de complemento.

Se trataron las ratas PVG de tipo silvestre con CR1 soluble (TP10 de Avant Immunotherapeutics, Inc.) con una dosis de 15 mg/kg/dla (se obtuvo CR1 soluble TP10 a traves del Prof. P. Morgan, Cardiff, Reino Unido). Se trataron las ratas de control con el mismo volumen (600 pl) de vehlculo solo (PBS). Se suministro CR1 soluble o PBS por via intraperitoneal 24 horas antes del aplastamiento y cada dla para un maximo de 8 inyecciones (hasta 6 dlas despues del aplastamiento). El nervio ciatico de la pata derecha fue aplastado y la pata izquierda sirvio como control. Se analizaron tanto la funcion histologla como la sensorial.

La Figura 6 muestra que en un analisis funcional con el ensayo de contraccion brusca de la pata, se observa una recuperacion mas rapida de la funcion sensorial en los animales tratados con sCR1 en comparacion con los tratados con PBS. Se realizo el ensayo de contraccion brusca de la pata como se describio anteriormente en el Ejemplo 1.3.

El analisis histologico de los nervios a las 72 horas despues del aplastamiento muestra que sCR1 inhibe fuertemente la afluencia y activacion de macrofagos (vease la Figura 7). El tratamiento con sCR1 resulto en niveles similares de inhibicion de la activacion de los macrofagos, medida por la presencia positiva de CD68 en comparacion con la deficiencia de C6.

Ejemplo 4: La inhibicion de la activacion del complemento facilita la regeneracion del axon y la recuperacion en un modelo de lesion de lesion periferica del nervio

4.1 Metodos

4.1.1 Animales

Este estudio fue aprobado por el Comite de Etica del Centro Medico Academico de Animales y cumple con las directrices para el cuidado de los animales de experimentacion. Se obtuvieron ratas PVG/c macho de 12 semanas de edad (de tipo silvestre) a traves de Harlan (Reino Unido) y se criaron las ratas PVG/c- (C6-/-) en nuestras instalaciones. Los animales pesaban entre 200 g y 250 g y se les permitio aclimatarse durante al menos dos semanas antes del comienzo del estudio. Los animales se mantuvieron en las mismas instalaciones para los animales durante todo el curso del experimento y se les hizo seguimiento del estado microbiologico de acuerdo con las recomendaciones de FELASA. Los animales fueron alojados en pares en jaulas de plastico. Se les suministro comida para ratas y agua a voluntad y se mantuvieron a temperatura ambiente de 20°C en un ciclo de luz:oscuridad de 12 horas: 12 horas.

4.1.2 Determinacion del genotipo de las ratas PVG/c- (C6-/-)

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Las ratas C6'/_ portan una delecion de 31 pares de bases (pb) en el gen C6 (Bhole y Stahl, 2004). La determinacion del genotipo se realizo de acuerdo con Ramaglia y colaboradores (2007).

4.1.3 Administracion de C6 humano para estudios de reconstitucion

Se purifico C6 a partir de suero humano (Mead y colaboradores, 2002). Se administro en forma i.v. en ocho ratas C6- /- con una dosis de 4 mg/kg/dla en PBS un dla antes de la lesion por aplastamiento (dla -1) y cada dla despues de eso durante 1 semana (dlas 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6). Se trataron ocho ratas de tipo silvestre y ocho C6-/- con un volumen igual de vehlculo (PBS) solamente. Las ratas C6-/- reconstituidas con C6 humano purificado se indicaran en el texto como C6+.

4.1.4 Administracion de sCR1 para estudios de inhibicion

El receptor 1 soluble recombinante del complemento (sCR1) se obtuvo como se describio previamente (Piddlesden y colaboradores, 1994). Se administro sCR1 en forma i.p. en seis ratas con una dosis de 15 mg/kg/dla. Se trataron seis ratas con volumenes iguales de vehlculo (PBS) unicamente. El tratamiento se administro un dla antes de la lesion por aplastamiento (dla -1) y cada dla despues de eso durante 1 semana (dlas 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6).

4.1.5 Ensayo hemolltico y ELISA

Se recolectaron muestras de sangre de las ratas de tipo silvestre tratadas con PBS, tratadas con C6-/- PBS, tratadas con C6+ y sCR1 de la vena de la cola un dla antes de la lesion por aplastamiento (dla -1) y cada siguiente dla hasta 1 semana despues de la lesion (dlas 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Todas las muestras se recogieron inmediatamente antes de cada inyeccion de tratamiento. Se separo el plasma y se almaceno a -80°C hasta su uso para controlar la actividad de C6 y el efecto inhibidor de sCR1 a traves del ensayo hemolltico estandar del complemento (Morgan, 2000). Los niveles en plasma de sCR1 se midieron usando un ensayo de ELISA como se describio previamente (Mulligan y colaboradores, 1992) utilizando diluciones seriadas ensayadas por duplicado.

4.1.6 Ensayos motrices y sensorial

Todos los experimentos fueron realizados por el mismo investigador que desconocla el genotipo y los grupos de tratamiento. Tanto los ensayos motrices como sensoriales se realizaron en el mismo momento durante el dla, cada semana hasta 5 semanas despues de la lesion. La recuperacion de la funcion motora se evaluo mediante un analisis estandarizado de caminata en pista y el Indice funcional del nervio ciatico (IFNC) derivado de acuerdo con Hare y colaboradores (1992). En resumen, a las ratas se les permitio caminar a traves de una plataforma de plexiglas, mientras se registraba su golpeteo al caminar mediante una camara colocada debajo de la plataforma. Se calculo un Indice de la funcion del nervio ciatico a partir de las huellas grabadas utilizando el programa de analisis de ImagePro (Media Cybernatics, Palses Bajos). Se registraron la longitud de la impresion (LI), la extension del dedo del pie (EDP) (1ro a 5to) y la extension de los dedos intermedios del pie (EDIP) (2do a 4to) a partir del pie normal no lesionado (NPL, NTs, NIT) y el pie contralateral en el lado experimental lesionado (EPL, ETS, EIT). El IFNC se obtiene con la formula: -38,3*[(EPL-NPL)/NPL]+109,5* [(ETS-NTS)/NTS]+13,3* [(EIT-NIT)/NIT]. En caso de no producirse una impresion por parte de los animales, se usaron los valores estandar de EPL = 60 mm, ETS = 6 mm y EIT = 6 mm de acuerdo con De Koning y colaboradores (1986). La recuperacion de la funcion sensorial se evaluo con el ensayo de contraction brusca de la pata de acuerdo con De Koning y colaboradores (1986). En resumen, se uso una fuente de choque con una corriente variable de 0,1-0,5 mA. Los registros se realizaron un dla antes de la lesion y cada semana hasta 5 semanas despues de la lesion. Se inmovilizaron las ratas y se colocaron dos electrodos de estimulacion en el mismo punto en la planta del pie de la rata para cada animal y estimulacion. Se registro una respuesta como positiva si la rata retrajo su pata. Se registro la corriente (mA) a la cual se produjo la retraction. Los valores se expresan como porcentaje de la funcion normal.

4.1.7 Lesion por aplastamiento del nervio

Se realizaron todos los procedimientos quirurgicos en forma aseptica bajo anestesia profunda con isoflurano (isoflurano al 2,5 % en vol, 1 L/min de O2 y 1 L/min de N2O). Se afeito el muslo izquierdo y se expuso el nervio ciatico a traves de una incision en la parte superior del muslo. Se aplasto el nervio durante tres perlodos de 10 s a nivel de la escotadura ciatica utilizando pinzas lisas y curvas (No. 7). Se marco el sitio de aplastamiento mediante una sutura que no apreto el nervio. En el lado derecho, se realizo una cirugla simulada que expuso el nervio ciatico pero no se lo perturbo. Tambien se coloco una sutura. Se cerraron luego el musculo y la piel con puntos de sutura. La pata derecha sirvio como control. Luego del aplastamiento, se les permitio a las ratas recuperarse durante 1 (de tipo silvestre n = 5; C6'/_ n = 5; C6+ n = 2), 3 (tipo silvestre n = 6; C6'/_ n = 6; C6+ n = 3) y 5 (de tipo silvestre n = 5; C6- /- n = 5; C6+ n = 3; de tipo silvestre tratadas con sCR1 n = 6; de tipo silvestre tratadas con PBS n = 6) semanas.

4.1.8 Histologla del nervio tibial

Todos los animales fueron perfundidos en forma intracardiaca con paraformaldehldo al 4% en regulador de piperazina-N-N'-bis(acido 2-etano sulfonico) (PIPES) (pH 7,6), bajo anestesia profunda con isoflurano. Se

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removieron los nervios tibiales izquierdo y derecho de cada animal y se fijaron posteriormente con giutaraidehldo al 1%, paraformaldehldo al 1% y dextrano al 1% (MW 20.000) en regulador PIPES 0,1 M (pH 7,6). Se dividieron en un segmento proximal y uno distal de 10 mm de longitud. Cada segmento se proceso convencionalmente en resina epoxica. Se tineron secciones de resina cuasi delgadas de 0,5 pm con tionina y acridina naranja y se capturaron las imagenes con un microscopio optico (Leica DM5000B, Palses Bajos) conectado a una camara digital (Leica DFC500, Palses Bajos). Se realizo la microscopla electronica en secciones ultra finas del nervio tibial de ratas tipo silvestre y C6-/- 5 semanas despues de la lesion por aplastamiento. Las secciones se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo como se describio previamente (King, 1999). Las imagenes fueron capturadas con una camara digital conectada a un microscopio electronico (FEO 10, Philips, Palses Bajos). El numero de grupos de axones que se regeneraron 5 semanas despues de la lesion se determino en secciones cuasi finas de resina. Se le dio puntaje a toda la seccion por cada animal en cada grupo. La relacion g es la relacion numerica del diametro del axon sin mielina con respecto al diametro del axon mielinizado y se calculo sobre la seccion completa del nervio. Se calculo la frecuencia de las fibras mielinizadas de gran calibre (> 8 pm) sobre la seccion completa del nervio.

4.1.9 Analisis estadlstico

Se realizaron ANOVA bidireccionales con correccion de Bonferroni para determinar diferencias estadlsticamente significativas en el ensayo hemolltico (p <0,001), ensayo de ELISA (p <0,001), IFNC (p < 0,05), ensayo de contraccion brusca de la pata (p < 0,05).

4.2 Resultados y discusion

Para probar los efectos de la activacion de C en la regeneracion de los nervios despues de un trauma agudo, se determino el efecto de C en la recuperacion de la lesion por aplastamiento del nervio ciatico en el modelo de rata de dos maneras complementarias, primero mediante el examen de los efectos de la deficiencia de C6 (C6-/-) y segundo mediante la inhibicion de la activacion de C.

El estudio se preparo de acuerdo con un esquema que se extiende durante un periodo de 5 semanas. El tiempo 0 es el momento de la lesion por aplastamiento. Cada grupo de animales fue tratado ya sea con un placebo (PBS) o con protelna C6 purificada o sCR1 el dla antes de la lesion (dla -1) y cada dla a partir de entonces hasta 1 semana despues de la lesion. Se recolecto sangre de cada animal el dla antes de la lesion (dla-1) y en los dlas 0, 1, 2, 3, 5 y 7 despues de la lesion para determinar la actividad hemolltica del complemento en suero. El analisis funcional, para determinar la recuperacion de la funcion motora mediante el Indice funcional del nervio ciatico (IFNC) y la recuperacion de la funcion sensorial mediante el ensayo de contraccion brusca de la pata, se llevo a cabo el 1 dla antes de la lesion para los valores de llnea de base y cada semana a partir de entonces hasta 5 semanas despues de la lesion. El analisis patologico de los nervios tibiales distales del sitio de la lesion se llevo a cabo en las semanas 1, 3 y 5 despues de la lesion para determinar la regeneracion del nervio.

Se determinaron tanto la recuperacion funcional como los efectos sobre la histologla. Como controles para la deficiencia de C6 se reconstituyeron ratas C6-/- con protelna C6 purificada (4 mg/kg/dla; n = 8) (C6+), que restauro la actividad hemolltica en plasma (CH50) a niveles de tipo silvestre (> 80%; p <0,001, ANOVA bidireccional) (Tabla 1). La inhibicion de la activacion de C se logro mediante el tratamiento sistemico con el receptor 1 de C soluble (sCR1) (15 mg/kg/dla; n = 6), una forma soluble recombinante del regulador C de la membrana humana, CR1, que inhibe todas las tres rutas de activacion de C (Weisman y colaboradores, 1990). Este tratamiento redujo la actividad hemolltica de C hasta aproximadamente el 30% del de los controles tratados con vehlculo PBS (n = 6; p <0,001, ANOVA bidireccional) a lo largo de todo el transcurso del tratamiento (Tabla 1). Se encontro que este nivel de inhibicion de C en el plasma anulo completamente la deposicion de C activado en el nervio a los 3 dlas despues de la lesion.

La recuperacion de la funcion motora se controlo cada semana despues de la lesion mediante la medicion del Indice funcional del nervio ciatico (IFNC) calculado a partir del patron de caminata de las ratas (Hare y colaboradores, 1992). Una semana despues de la lesion, ninguno de los animales utilizo la pata de la extremidad lesionada para caminar, no pudiendo producir una huella en la plataforma para caminar, lo que sugiere la perdida completa de la inervacion muscular en la extremidad. Dos semanas despues de la lesion y durante todo el estudio, las ratas C6-/- (n = 16) produjeron un IFNC significativamente mas alto que los animales de tipo silvestre (n = 16; p < 0.05, ANOVA bidireccional) (Figura 8a). Un IFNC mayor es el resultado de un aumento en la longitud de la impresion y los parametros de extension del dedo del pie e indica una nueva inervacion de los musculos de la pantorrilla y pequenos del pie, respectivamente. La reconstitucion de las ratas C6-/- con protelna purificada C6 (C6+) redujo significativamente el IFNC (n = 8; p < 0.05, ANOVA bidireccional) a niveles de tipo silvestre en la semana 4 y 5 despues de la lesion. Estos datos demuestran que la deficiencia de C6 en las ratas da lugar a una recuperacion mas rapida de la funcion motora en comparacion con las de tipo silvestre. La recuperacion de la funcion sensorial se analizo con el ensayo de contraccion brusca de la pata. En la primera semana despues de la lesion, ninguno de los animales retrae su pata cuando se estimulo la planta de la pata mediante una descarga electrica de 0,5 mA, lo que sugiere una perdida completa de la inervacion sensorial. Desde la semana 2 hasta la semana 3 despues de la lesion, las ratas C6-/- mostraron un 20-50% de mayor recuperacion de la funcion sensorial en comparacion con las ratas de tipo silvestre (n = 16) y C6+ (n = 8) (p < 0.05, ANOVA bidireccional). La funcion sensorial no difirio entre los

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grupos en las semanas 4 y 5 despues de la lesion (Figura 8b). Del mismo modo, los animales tratados con sCR1 mostraron una recuperacion mas rapida (aumento de 10-30%, n = 6; p < 0,05, ANOVA bidireccional) de la funcion sensorial que las ratas tratadas con PBS (n = 6) entre las semanas 2 y 4 despues de la lesion (Figura 9). Estos datos indican que tanto la deficiencia de C como la inhibicion de la activacion C aceleran y mejoran el retorno de la inervacion sensorial a la planta de la pata despues de la lesion por aplastamiento ciatico.

Para seguir la regeneracion histologica del nervio danado, se analizo el nervio tibial en diferentes instantes de tiempo. El proceso de regeneracion se caracteriza por la aparicion de agrupaciones de axones regenerativos que son brotes del axon lesionado originalmente. Inicialmente, los brotes de axones residen dentro del citoplasma de una sola celula de Schwann pero mas tarde se separan mediante un arreglo radial. Una vez se establece la relacion 1:1 entre la celula de Schwann y el axon, se inicia la promielinizacion de las CS para envolver el axon para formar la mielina y el tubo de lamina basal. En esta etapa, aparecen los grupos regenerativos como grupos de pequeno calibre, de axones mielinizados finamente dentro de las celulas adyacentes de Schwann (Figura 10, flechas). Una vez que un axon ha alcanzado su objetivo, el resto de los brotes de los axones se eliminan mientras que el axon restante aumenta de tamano. En las secciones histologicas a las 5 semanas despues de la lesion, los tipos silvestres no tratados y los controles tratados con vehlculo PBS mostraron racimos regenerativos de axones mielinizados finamente de pequeno calibre en contraste con los animales tratados con C6-/- y con sCR1 donde los racimos regenerativos estaban ausentes confirmando una recuperacion mas rapida cuando se inhibe C o esta ausente (Figura 10). La frecuencia de fibras mielinizadas de mayor calibre (> 8 pm) se incremento en los animales tratados con C6-/- (0,59 ± 0,20%, n = 5) y con sCR1 (0,58 ± 0,11%, n = 6) en comparacion con los animales de tipo silvestre no tratados (0,05 ± 0,02; n = 5), los controles tratados con C6+ (0,06 ± 0,01; n = 3) y los tratados con vehlculo PBS (ninguno; n = 6) a las 5 semanas despues de la lesion, mientras que no se encontro ninguna diferencia en la frecuencia de fibras mielinizadas de bajo calibre (<4 pm) y de calibre intermedio (4-8 pm). El grosor de la mielina no se altero entre los grupos de animales (relacion g de 0,69 ± 0,01, n = 5, de tipo silvestre; 0,65 ± 0,02, n = 5, C6-/-; 0,65 ± 0,01, n = 3, C6+; 0,70 ± 0,01, n = 6, tratados con sCR1; 0,66 ± 0,003, n = 6, tratados con vehlculo PBS) (datos no mostrados).

Tomados en conjunto, estos datos muestran que la regeneracion de los axones y la recuperacion funcional despues de una lesion de los nervios perifericos se mejoran en ausencia de C6 o cuando la activacion de C es inhibida por sCR1. Por lo tanto, la capacidad de formar CAM es un determinante negativo de la recuperacion del nervio.

La recuperacion funcional despues de una lesion por aplastamiento de los axones requiere que los axones entren nuevamente a los tubos de las celulas de Schwann en el lugar del aplastamiento. Una vez en el cabo distal, los axones necesitan volver a incorporarse por los caminos seguidos antes de la lesion y generar una sinapsis especlfica con exactamente la misma fibra muscular que hablan inervado previamente. En esta tarea, se gulan por senales de atraccion y repulsion moleculares (Tessier-Lavigne y Goodman, 1996; Yu y Bargmann, 2001), pero la evidencia reciente mostro que los factores flsicos tambien juegan un papel clave (Nguyen y colaboradores, 2002). Por lo tanto, el mantenimiento de los tubos endoneurales intactos podrla ser de gran importancia para la regeneracion del nervio periferico adulto.

El bloqueo de la activacion de C, y en particular la formation de CAM, reduce el dano del tejido durante la degeneration del nervio, parece rescatar la arquitectura necesaria para la gula del axon y da como resultado una regeneracion mas eficiente y la recuperacion de la funcion. La mejora funcional en ausencia de aumento del grosor de la envoltura de mielina puede ser explicada por el aumento en el numero de fibras de gran calibre.

Una gran cantidad de evidencia en la ultima decada apunta a un posible papel beneficioso de los macrofagos durante la recuperacion (Kiefer y colaboradores, 2001). Un tiempo despues de la lesion, los macrofagos secretan citoquinas anti-inflamatorias que estan implicadas en la resolution del proceso inflamatorio. Una vez que termina la inflamacion, los macrofagos contribuyen a la proliferation y supervivencia de las celulas de Schwann, la remielinizacion y recuperacion a traves de la secretion de factores de crecimiento y diferenciacion. Hemos demostrado que, justo despues de la lesion, la inhibicion de C reduce notablemente la infiltration de los macrofagos endoneurales (aumento de 5 veces, en comparacion con 25 veces en ausencia de inhibicion de C) (Ramaglia y colaboradores, 2007). Hemos postulado que esto es debido a la proliferacion de la poblacion de macrofagos residentes mientras que una pequena contribution proviene de los macrofagos hematogenos. Es posible que separamos el efecto perjudicial de los macrofagos hematogenos del efecto beneficioso que puede ser ejercido por la poblacion endoneural.

Nuestros hallazgos abren la puerta a un nuevo enfoque terapeutico en el que el bloqueo de la cascada de C, o la inhibicion selectiva de CAM, favorece la regeneracion despues de una lesion traumatica y en las neuropatlas perifericas y enfermedades neurodegenerativas, donde se ha reportado dano a los nervios que depende de C.

Tabla 1. Actividad hemolitica del plasma (%CH50)

Dla -1 Dla 0 (aplastamiento) Dla 1 Dla 2 Dla 3 Dla 4 Dla 5 Dla 7

Tipo silvestre tratado con

91,6±1,0 91,7±1,1 81,2±1,7 89,5±1,5 86,1±1,4 n.d. 82,1±1,7 90,8±4,1

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Deficiente en C6 tratado con PBS

14,0±0,1 n.d. n.d. 12,8±0,2 n.d. 13,5±0,3 n.d. 15,7±0,4

Deficiente en C6 tratado con C6 (C6+)

14,0±0,1 n.d. n.d. 78,5±0,9* n.d. 76,9±0,8* n.d. 78,5±1,6*

Tipo silvestre tratado con sCR1

87,4±0,6 36,8±1,1* 27,2±0,9* 27,2±3,6* 27,9±0,3* n.d. 29,6±1,7* 33,4±2,9*

Hemolisis dependiente de C en el suero de ratas de tipo silvestre tratadas con PBS, tratadas con C6-/" PBS y reconstituidas con C6-/" con C6 (C6+) humano purificado y ratas tratadas con sCR1. El tratamiento se inicio 1 dia (dia -1) antes de la lesion (dia 0) y se repitio todos los dias hasta 1 semana. Se recogio plasma los dias -1, 2, 4, y 7 inmediatamente antes del tratamiento. Los valores son la media ± DE de seis a ocho animales por grupo por cada punto de tiempo. La significancia estadistica (*) se refiere a p <0,001 determinada por una prueba ANOVA bidireccional con la correccion de Bonferroni. n.d., no determinado.

Ejemplo 5:

5.1 Materiales y metodos

5.1.1 Animales

Este estudio fue aprobado por el Comite de Etica del Centro Medico Academico de Animales y cumple con las directrices para el cuidado de los animales de experimentacion.

Se obtuvieron ratas PVG/c macho de 12 semanas de edad a traves de Harlan (Reino Unido). Los animales pesaban entre 200 g y 250 g y se les permitio aclimatarse durante al menos dos semanas antes del comienzo del estudio. Los animales se mantuvieron en las mismas instalaciones para los animales durante todo el curso del experimento y se les hizo seguimiento del estado microbiologico de acuerdo con las recomendaciones de FELASA. Los animales fueron alojados en pares en jaulas de plastico. Se les suministro comida para ratas y agua a voluntad y se mantuvieron a temperatura ambiente de 20°C en un ciclo de luz:oscuridad de 12 horas: 12 horas.

5.1.2 Administracion de sCR1 o Cetor para estudios de inhibicion

El receptor 1 soluble recombinante del complemento (sCR1) se obtuvo como se describio previamente (Piddlesden y colaboradores, 1994). El inhibidor C1 del complemento (Cetor) fue gentilmente suministrado por Sanquin (Amsterdam, Paises Bajos). Se administro sCR1 en forma i.p. en doce (12) ratas con una dosis de 15 mg/kg/dia. Se administro Cetor en forma i.v. en seis (6) ratas con una dosis de 50 U/rata/dia. Se trataron doce (12) ratas con volumenes iguales de vehiculo (PBS) unicamente. El tratamiento se administro un dia antes de la lesion por aplastamiento (dia -1) y cada 24 horas (dia 0, 1, 2) hasta que se removieron los nervios 3 dias despues de la lesion. Se trataron diez (10) ratas ya sea con sCR1 (6) o con PBS (4) hasta seis (6) dias despues de la lesion (dias -1, 0, 1,

2, 3, 4, 5, 6) y se removieron los nervios 1 dia despues del final del tratamiento (dia 7).

5.1.3 Ensayo hemolitico y ELISA

Se recolectaron muestras de sangre de las ratas tratadas con PBS y con sCR1 de la vena de la cola un dia antes de la lesion por aplastamiento (dia -1) y cada siguiente dia hasta (dia 0, 1, 2) hasta que se sacrificaron los animales 3 dias despues de la lesion. En el grupo tratado hasta 6 dias, se recolectaron muestras adicionales de sangre los dias

3, 5 y 7 despues de la lesion. Todas las muestras se recogieron inmediatamente antes de cada inyeccion de tratamiento. Se separo el plasma y se almaceno a -80°C hasta su uso para controlar la actividad inhibidora de sCR1 a traves del ensayo hemolitico estandar del complemento (Morgan, 2000).

Los niveles en plasma de sCR1 se midieron usando un ensayo de ELISA como se describio previamente (Mulligan y colaboradores, 1992) utilizando diluciones seriadas ensayadas por duplicado.

5.1.4 Lesion de aplastamiento del nervio y procesamiento del tejido

Se realizaron todos los procedimientos quirurgicos en forma aseptica bajo anestesia profunda con isoflurano (isoflurano al 2,5% en vol, 1 L/min de O2 y 1 L/min de N2O). Se afeito el muslo izquierdo y se expuso el nervio ciatico a traves de una incision en la parte superior del muslo. Se aplasto el nervio durante tres periodos de 10 s a nivel de la escotadura ciatica utilizando pinzas lisas y curvas (No. 7). Se marco el sitio de aplastamiento mediante una sutura que no apreto el nervio. En el lado derecho, se realizo una cirugia simulada que expuso el nervio ciatico pero no se lo perturbo. Tambien se coloco una sutura. Se cerraron luego el musculo y la piel con puntos de sutura. Luego del aplastamiento, se les permitio a las ratas recuperarse durante 3 dias (tratadas con PBS n = 8; tratadas con sCR1 n =

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6; tratadas con Cetor n = 6) y 7 dlas (tratadas con PBS n = 4; tratadas con sCR1 n = 6).

Todos los animales fueron perfundidos en forma intracardiaca con paraformaidehldo al 4% en regulador de piperazina-N-N'-bis(acido 2-etano sulfonico) (PIPES) (pH 7,6). Se removieron los nervios ciaticos izquierdo y derecho de cada animal y se recolecto un segmento distal de 5 mm de longitud del sitio del aplastamiento. Cada segmento fue procesado convencionalmente en cera de parafina para inmunohistoqulmica.

5.1.5 Inmunohistoqulmica

Se tineron secciones cera de parafina utilizando un metodo de inmunoperoxidasa de tres etapas. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente (TA). Despues de la eliminacion de la parafina y rehidratacion, se bloqueo la actividad de la peroxidasa endogena con H2O2 al 1% en metanol durante 20 min. En todos los casos, se utilizo la recuperacion del antlgeno en microondas (800 W durante 3 min seguido por 10 min a 440 W en Tris 10 mM / EDTA 1 mM, pH 6,5). Para bloquear los sitios de union no especlficos, se incubaron los portaobjetos en suero normal de cabra al 10% (SCN) en solucion salina regulada con Tris (SSRT) durante 20 min. Despues de la incubacion en el anticuerpo primario apropiado diluido en BSA al 1% (vease la Tabla 2) durante 90 min, se incubaron las secciones durante 30 min en IgG de cabra biotinilado anticonejo o IgG de cabra antirraton de DakoCytomation (Glostrup, DK) diluido 1:200 en BSA al 1% y 30 min en poliestreptavidina marcada con peroxidasa de rabano (complejo ABC, DAKO). Para visualizar la actividad de la peroxidasa, se incubaron los portaobjetos en 3-amino-9- etilcarbazol al 0,05% en regulador de acetato (pH 5) durante 5 min seguido de una coloracion de contraste durante 30 s con hematoxilina y se montaron en gelatina. Las secciones inmunotenidas solo con el conjugado secundario se incluyeron con cada experimento como controles negativos mientras que las secciones de la medula espinal de rata y los ganglios linfaticos sirvieron como controles positivos.

Las imagenes fueron capturadas con una camara digital (Olympus, DP12, Palses Bajos) unida a un microscopio optico (Olympus, BX41, Palses Bajos).

Tabla 2: Anticuerpos, fuente y diluciones para inmunohistoqulmica.

Anticuerpos

Fuente Diluciones

Neurofilamento monoclonal fosforilado de raton antihumano (clon SMI31)

Stemberger (Lutherville, RU) 1:1000

MBP policlonal de conejo antihumano

DakoCytomation (Glostrup, Dina.) 1:100

CD68 monoclonal de raton antirrata (clon ED1)

Serotec (Oxford, RU) 1:100

C9 policlonal de conejo antirrata

B.P. Morgan 1:300

C3c policlonal de conejo antihumano

DakoCytomation (Glostrup, Dina.) 1:750

C4c policlonal de conejo antihumano

DakoCytomation (Glostrup, Dina.) 1:100

5.1.6 Analisis cuantitativo de inmunohistoqulmica

Todos los analisis se realizaron con el software Image Pro Plus version 5.02 (Media Cybernatics, Palses Bajos). Las celulas inmunorreactivas a CD68 (clon ED1) se calificaron como positivas cuando la senal positiva para CD68 se asocio con los nucleos. Se puntuaron treinta secciones no consecutivas de nervio ciatico por rata. Se tomaron un promedio de 3 campos de vison no superpuestos incluyendo > 90% de toda el area del nervio para cada seccion. La cuantificacion de la inmunocoloracion de CAM y MBP se realizo a 40 aumentos en dos campos que no se superponen por seccion examinada. Se le dio puntaje a diez secciones por rata. El area de superficie tenida se expresa como porcentaje del area total examinada.

5.1.7 Extraction de protelna y analisis de transferencia tipo Western

Los nervios ciaticos congelados de 2 ratas no tratadas sacrificadas a los 2 dlas siguientes a la lesion por aplastamiento, se homogeneizaron usando un mortero y pistilo en nitrogeno llquido en Tris 20 mmol l-1 (pH 7,4), 5 mmol l-1 de 1, 4-ditio-DL-treitol (DTT) y SDS al 0,4% y glicerol al 6%. Los homogeneizados se centrifugaron a 10.000 x g, a 2°C durante 10 min. La fraction sobrenadante se recogio y se utilizo para el analisis de protelnas. Las concentraciones de protelnas se determinaron con un kit de ensayo de protelnas DC (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.), utilizando albumina de suero bovino (BSA) como estandar.

Los extractos de protelna (20 |jg/muestra) se sometieron a ebullition durante 5 min, se separaron mediante SDS- PAGE al 10% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa durante la noche a 4°C. Antes de la transferencia, se tineron las membranas de nitrocelulosa con Ponseau rojo durante 30 segundos para verificar la carga de protelnas. Se incubaron previamente las membranas en 50 mmol l-1 de Tris-HCl que contiene Tween 20 al 0,5% (TBST) y 5% de leche en polvo desgrasada durante 1 hora a TA. Las transferencias se incubaron durante 2 horas en Bb policlonal de cabra anti-factor (fBb) (Quidel, San Diego, CA) diluido en TBST que contiene 5% de leche en polvo

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desgrasada. Tras el lavado en TBST, se incubaron las membranas durante 1 hora en anticuerpo policlonal secundario de conejo anti-cabra conjugado con peroxidasa de rabano diluido 1:2000 en TBST que contiene 5% de leche en polvo desgrasada. Se lavaron las membranas en TBST durante 30 min y se detectaron las bandas inmunorreactivas usando quimioluminiscencia potenciada (ECL, Amersham, Piscataway, NJ, EE.UU.). La cuantificacion de las bandas inmunorreactivas se realizo a traves del software Advanced Image Data Analyzer v. 3.4 (Raytest, Alemania).

5.1.7 Analisis estadlstico

Se realizo un ANOVA bidireccional con correccion de Bonferroni para determinar diferencias estadlsticamente significativas (p < 0,001). El analisis estadlstico de la cuantificacion de inmunotransferencias se determino mediante la prueba t no pareada (p < 0,05).

5.2 Resultados

5.2.1 sCR1 bloquea la activacion del complemento despues de un trauma nervioso agudo

Para determinar los efectos de la inhibicion de todas las rutas de activacion del complemento en degeneracion Walleriana (DW), se trataron los animales con sCR1. Se inicio el tratamiento 1 dla antes de una lesion por aplastamiento del nervio ciatico. Se midieron los niveles en plasma de sCR1 y CH50 despues de inyecciones i.p. diarias ya sea de sCR1 en una dosis de 15 mg/kg/dla o un volumen igual de vehlculo. Los niveles de sCR1 aumentaron despues del primer dla de la inyeccion y la actividad hemolltica del complemento se redujo hasta aproximadamente 30% de los controles (Figura 11).

Los animales tratados con sCR1 mostraron la inhibicion de la activacion del complemento en el nervio aplastado (Figura 12). Los nervios tratados con sCR1 no mostraron practicamente depositos de CAM (0,8 ± 0,9%), mientras que la inmunorreactividad de CAM cubrio 31.4 ± 7.8% de la superficie total examinada en los nervios de las ratas tratadas con PBS. La inmunorreactividad de CAM era indetectable en los nervios de control no lesionados. La deposition de C4c y C3c tambien se impidio en los nervios tratados con sCR1 mientras se detecto una alta cantidad de inmunorreactividad en los nervios tratados con PBS (no mostrado). Estos resultados demuestran que sCR1 es un inhibidor eficaz de la activacion del complemento despues de un traumatismo agudo del nervio.

5.2.2 sCR1 protege los nervios de la perdida de los axones a los 3 dlas despues de la lesion

Para determinar los efectos de la inhibicion del complemento mediada por sCR1 sobre los cambios morfologicos de DW de los axones y la mielina, se analizaron a los 3 dlas despues de la lesion.

La coloration del neurofilamento (SMI31) mostro que el nervio ciatico de ratas tratadas con PBS tenia espacios vacios y agrandados en los axones, delimitada por un axolema inmunorreactiva delgada y restos dispersos de los axones dentro del nervio que son signos de la hinchazon y degradation de los axones (datos no mostrados). Por el contrario, las ratas tratadas con sCR1 todavia mostraron la apariencia tipica de puntos de los axones, de manera similar a la del nervio de control no lesionado, lo que demuestra el rompimiento del axon rescatado a los 3 dias despues de la lesion. La inmunocoloracion de la mielina (MBP) revelo signos de descomposicion de la mielina en los nervios de ratas tratadas con PBS a los 3 dias despues de la lesion, mientras que los nervios de las ratas tratadas con sCR1 mostraron la tincion anular tipica de la mielina similar a los nervios de control no lesionados, lo que demuestra la degradacion de la mielina rescatada en este momento despues de la lesion (datos no mostrados). Estas observaciones demuestran que sCR1 protege los nervios de la degradacion de los axones y la mielina a los 3 dias despues de la lesion.

El analisis de los nervios ciaticos de ratas tratadas tanto con sCR1 como con PBS a los 7 dlas despues de la lesion muestra el rompimiento de los axones y la mielina en ambos grupos de animales, lo que demuestra que la DW se retraso pero no se evito en los nervios tratados con sCR1 despues de la lesion por aplastamiento (datos no mostrados).

La cuantificacion de la tincion MBP mostro una inmunorreactividad significativamente menor en los nervios aplastados en comparacion con los nervios no lesionados (21,7 ± 3,5%). La cantidad de residuos inmunorreactivos de MBP difiere entre los nervios de las ratas tratadas con PBS y las tratadas con sCR1. Los nervios tratados con PBS mostraron un porcentaje significativamente menor del area inmunorreactiva de MBP (2,1 ± 1,3%) en comparacion con los nervios tratados con sCR1 (7,6 ± 1,0%). Esto demuestra que la perdida de los residuos de mielina se retrasa en los nervios tratados con sCR1.

5.2.3 sCR1 evita la acumulacion de macrofagos y la activacion a los 3 dlas despues de la lesion

Se hizo seguimiento a la acumulacion y los cambios morfologicos de los macrofagos ya que la activacion del complemento media el reclutamiento y activacion de los macrofagos. Se utilizo el anticuerpo CD68 (clon ED1), un marcador lisosomal, como marcador para su estado metabolico. Se encontraron una pocas celulas inmunorreactivas

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a CD68 en el nervio de control no lesionado (5,3 ± 1,7 celulas/mm2). El numero aumento a 261,2 ± 10,7 celulas/mm2 en los nervios de las ratas tratadas con PBS a 3 dias despues de la lesion, mientras que los nervios de las ratas tratadas con sCR1 mostraron un aumento leve (63,1 ± 4,7 celulas/mm2) (Figura 13).

Los nervios de las ratas tratadas con PBS mostraron celulas grandes y asimetricas inmunorreactivas a CD68 (tamano promedio de 103,6 ± 71,8 pm2) a los 3 dias despues de la lesion, mientras que se detectaron celulas pequenas y redondas (tamano promedio de 22,8 ± 14,1 pm2) en los nervios de las ratas tratadas con sCR1, un tamano y forma similares a las observadas en los nervios de control no lesionados (tamano promedio de 18,8 ± 6,6 pm2) (datos no mostrados).

Determinacion de la distribucion del tamano de celulas inmunorreactivas a CD68 se realizo en 11 celulas en los nervios no lesionados, 778 celulas en los nervios tratados con PBS y 294 celulas en los nervios tratados con sCR1. La distribucion por tamano de las celulas mostro una alta variabilidad en los nervios tratados con PBS con una dimension de las celulas que van desde 20 a mas de 400 pm2, con una gran poblacion de celulas de aproximadamente 60 pm2. Por el contrario, los nervios tratados con sCR1 mostraron una dimension de las celulas que va de 0 a 40 pm2, similar al tamano de las celulas que se encuentran en los nervios de control no lesionados (Figura 14). La colocalizacion de MBP y CD68 mostro macrofagos que engullen mielina en los nervios tratados con PBS mientras que los macrofagos pequenos en reposo son visibles entre las envolturas de mielina morfologicamente intactas de los nervios no lesionados y tratados con sCR1 (datos no mostrados). Estos resultados muestran que los macrofagos se activan en los nervios tratados con PBS pero no en aquellos tratados con sCR1.

5.2.4 Activacion de la ruta alternativa despues de un trauma agudo del nervio

Se ha encontrado que la ruta clasica del sistema de complemento se activa despues de un traumatismo agudo del nervio. Para determinar si la ruta alternativa tambien se activa por una lesion por aplastamiento del nervio ciatico, se midio el nivel de expresion de Bb, el fragmento de proteina de 60 kD que resulta de la escision del factor B. Los bajos niveles de inmunorreactividad de Bb fueron detectados en los extractos de proteinas de los nervios no lesionados de rata, mientras que un aumento de cerca de dos veces (1,8 ± 0,2) fue observado a los 2 dias siguientes a la lesion por aplastamiento (Figura 15 A, B). Estos resultados indican que el bucle de la ruta alternativa se activa despues de un traumatismo nervioso agudo, que genera mas fB escindido.

5.2.5 Efectos del inhibidor de C1 de DW

Para determinar si la ruta alternativa es suficiente para causar la patologia se trataron las ratas con el inhibidor de C1 (Cetor). La inhibicion de las rutas clasica y de lectina con el inhibidor de C1 del complemento, Cetor, permitiria determinar la contribucion de las diferentes rutas del complemento. La dosis de Cetor se extrapolo a partir del trabajo de Smet y colaboradores. La inmunocoloracion de los nervios aplastados tratados con Cetor para los productos de activacion de la ruta clasica (C4c) fue negativa y por lo tanto sugiere la inhibicion de la ruta clasica.

Bajas cantidades de inmunorreactividad del CAM (7,3 ± 2,7% de la superficie total examinada) fueron visibles en los nervios de los animales tratados con Cetor a los 3 dias despues de la lesion y la tincion se localizo principalmente en el compartimiento de los axones de algunas fibras (datos no mostrado). La coloracion del neurofilamento (clon SMI31) mostro fibras con inmunorreactividad normal de puntos de los axones y fibras con inmunorreactividad anular atipica delineando espacios agrandados de los axones. Esto demuestra la distribucion anormal del epitopo del neurofilamento fosforilado, compatible con el rompimiento del neurofilamento (datos no mostrados). Estas observaciones sugieren un vinculo intimo entre la deposicion de CAM y la perdida del axon. La coloracion de la mielina (MBP) mostro una morfologia normal anular de la mielina (datos no mostrados) y la tincion de CD68 revelo un numero de celulas (59,8 ± 28,3 celulas/mm2) similar a la observada en los nervios tratados con sCR1. Ademas, el tamano promedio de las celulas inmunorreactiva a CD68 (19,1 ± 10,5 pm2) y la distribucion por tamano determinada en 218 celulas no difirio de los nervios tratados con sCR1 o los controles no lesionados (datos no mostrados). La colocalizacion de MBP y CD68 muestra pequenos macrofagos en descanso entre las envolturas de mielina morfologicamente intactas (datos no mostrados). Estos resultados sugieren un vinculo entre la falta de activacion de los macrofagos y la morfologia preservada de la mielina a los 3 dias despues de la lesion.

5.3 Discusion

La presente invention demuestra que el tratamiento sistemico con sCR1, un inhibidor de las rutas clasica, de lectina y alternativa de activacion del complemento, protege de la perdida temprana del axon y la descomposicion de la mielina despues de la lesion del nervio periferico.

La administration diaria de sCR1 a ratas lesionadas impidio tanto la activacion sistemica como local del complemento, lo que resulta en el bloqueo de la deposicion de CAM en el nervio. En los animales no tratados, la lesion por aplastamiento conduce a un rapido aumento de las celulas positivas para CD68 que aumentan y fagocitan la mielina. En los nervios tratados con inhibidor solo se pudo detectar un ligero aumento de las celulas positivas para CD68 pero fracasaron en agrandarlas. Esto parece ser debido a la proliferation y diferenciacion de la poblacion de macrofagos endoneurales que se presenta ya a los 2 dias despues de la lesion (Mueller y colaboradores, 2001).

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Tanto los macrofagos residentes a largo plazo como a corto plazo, recien expresan el antlgeno ED1 lisosomal y tienen el potencial para fagocitar mielina (Leonhard y colaboradores, 2002). Sin embargo, este es un evento mediado por el complemento (Bruck W y Friede, 1991). Ya que la activacion del complemento se inhibe en los nervios tratados con sCR1, las opsoninas del complemento no se depositan sobre el tejido nervioso impidiendo el reconocimiento del objetivo y previniendo la fagocitosis de la mielina. Ademas, la inhibicion del complemento tambien resulta en una quimiotaxis ineficiente, que previene el reclutamiento de macrofagos derivados de la sangre lo que probablemente explica el aumento adicional observado de 4 veces en el nervio tratado con PBS.

A pesar de la disminucion del reclutamiento y activacion de los macrofagos, sCR1 no puede proteger el nervio de la degradation de los axones y la descomposicion de la mielina a los 7 dlas despues de la lesion, incluso cuando la actividad del complemento hemolltico se mantiene baja. Concluimos, por lo tanto, que la inhibicion de la activacion del complemento solo afecta a los primeros eventos de DW. La falta de deposition de C4c en los nervios tratados con sCR1 es un hallazgo notable porque sCR1 inhibe la convertasa C3 que esta mas adelante de la escision de C4, por lo tanto se esperarla un pequeno efecto sobre la deposicion de C4c. Sin embargo, como tambien se observa en los estudios previos (Piddlesden y colaboradores, 1994), el bloqueo del dano mediado por C por sCR1 tambien inhibe toda la deposicion de C en el tejido danado, lo que resulta tambien en niveles indetectables de C4c.

Hemos demostrado que, ademas de la ruta clasica, tambien se activa la ruta alternativa despues de una lesion por aplastamiento del nervio periferico. El bloqueo de la ruta clasica (y de lectina) del complemento con inhibidor de C1 (Cetor), un inhibidor de la serina proteasa que bloquea la activacion del complejo C1q-C1r-C1s (y MBL-MASP), 6,10 disminuyo pero no reduce la deposicion de CAM en el nervio. Ya que se produce una baja tasa de activacion de la ruta alternativa bajo condiciones fisiologicas y esta regulada negativamente por inhibidores del complemento, la ruptura de los componentes reguladores del complemento unido a la membrana en el sitio de la lesion podrla establecer la ruta alternativa fuera de control, generando mas convertasa C3 y conduciendo a la deposicion de CAM. Ademas, no podemos descartar que los bajos niveles de C3b, que se acumularlan durante la activacion de la ruta clasica, podrlan escapar a la inhibicion por Cetor formando bajos niveles de convertasa C5 y actuando como sustrato para la ruta alternativa para amplificar aun mas la activacion. El bloqueo parcial de la activacion del complemento da como resultado la deposicion reducida de C3 que reduce la acumulacion de macrofagos y previene su activacion, mientras que aun se depositan bajas cantidades de CAM en el nervio. Curiosamente, esto es suficiente para causar una marcada lesion de los axones (pero no mucha degradacion de la mielina), haciendo hincapie en la sensibilidad de los axones al dano inducido por CAM. Esto tambien sugiere que la perdida de la mielina es un efecto indirecto de la perdida de axones y requiere que los macrofagos se dirijan a la superficie opsonizada, se activen, despojen y degraden la mielina.

Nuestros datos muestran que incluso niveles bajos de deposicion de CAM, que se producen con el tratamiento inhibidor de C1, son suficientes para causar dano marcado a los axones.

La presente invencion demuestra que los inhibidores de C protegen los nervios perifericos de la degradacion temprana de los axones y descomposicion de la mielina debido a una lesion mecanica. Estudios previos sobre enfermedades desmielinizantes del SNP, tales como el slndrome de Guillan-Barre, han sido realizados en los modelos animales inmunizados con mielina del nervio periferico para inducir el fenotipo de la enfermedad, haciendo que sus hallazgos sean directamente aplicables a las enfermedades en las que es probable que un complejo antlgeno-anticuerpo medie la activacion del complemento. En la DW del nervio periferico despues de una lesion por aplastamiento, se produce la activacion del complemento de una forma independiente del anticuerpo, dirigiendo directamente los epltopos sobre los axones y la mielina danados. Por lo tanto, los datos muestran que los inhibidores de C tambien son prometedores herramientas en el tratamiento de enfermedades no autoinmunes, tales como neuropatlas perifericas hereditarias, donde ha emergido recientemente un papel secundario del sistema inmune superpuesto al defecto genetico primario (revisado en Martini R y Toyka, 2004).

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   Reivindicaciones

   1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que bloquea un componente del complemento para uso en el tratamiento de la enfermedad o lesion del SNP o SNC facilitando la regeneration de los axones en un sujeto.
2. 2. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

   - un anticuerpo que bloquea uno o mas de C6, C5, C7, C8 y C9, y

   - un anticuerpo que bloquea la convertasa C3 y/o el montaje de CAM.
3. 3. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde dicho anticuerpo bloquea a C6.
4. 4. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde dicho anticuerpo bloquea a C5.
5. 5. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimerico, desinmunizado, humano o humanizado.
6. 6. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
7. 7. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, un anticuerpo de cadena pesada, o un dominio VHH.
8. 8. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es para uso en la obtencion de la funcion sensorial o motora.
9. 9. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es para uso en la promotion de la regeneracion de los nervios que han sido degenerados debido a un trastorno neurodegenerativo del sistema nervioso periferico o central.
10. 10. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es para uso en la promocion de la regeneracion de los nervios despues de una lesion flsica de un nervio periferico.
11. 11. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es para uso en la promocion de la regeneracion de los nervios despues de la lesion del SNC o SNP.
12. 12. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es para uso en la promocion de la regeneracion de los nervios despues de un trauma del nervio como resultado de un trastorno o lesion inflamatoria mediada por el sistema inmunologico y/o un trastorno neurodegenerativo progresivo.
13. 13. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde dicha lesion incluye lesiones quirurgicas, lesiones de la medula espinal, lesiones traumaticas de nervios perifericos, incluyendo lesiones por colisiones, accidentes de vehlculos de motor, heridas por armas de fuego, fracturas, luxaciones y laceraciones.
14. 14. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es para uso dentro de 24, 12, 6, 3, 2, o 1 horas, mas preferiblemente dentro de 45, 30, 20 o 10 minutos despues de la ocurrencia de una lesion nerviosa.