DE60132169T2 - Humaner c1 inhibitor hergestellt in der milch transgener säugetiere - Google Patents

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Description

  • Technisches Fachgebiet
  • Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Rekombinationsgenetik und Medizin und betrifft die transgene Produktion eines C1-Inhibitors und seine Verwendung als therapeutisches Molekül z. B. in der Substitutionstherapie bei Patienten mit hereditärem Angioödem oder bei Patienten, die eine Immunsuppression benötigen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der menschliche C1-Inhibitor, der auch als C1-Esteraseinhibitor bekannt ist, ist ein bekannter und identifizierter Stoff. Der C1-Inhibitor gehört zur Superfamilie von Serinproteaseinhibitoren und ist der einzige Inhibitor von C1r und C1s des Komplementsystems und der Hauptinhibitor von Faktor XIIa und Kallikrein des Kontaktsystems. Außerdem hemmt der C1-Inhibitor auch andere Serinproteasen der Koagulations- und fibrinolytischen Systeme wie Faktor XI, Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator und Plasmin (Schapira, M., et al., 1985, Complement 2: 111; Davis, A. E., 1988, Ann. Rev. Immunol. 6: 595).
  • Der C1-Inhibitor wird durch ein einzelnes Gen auf Chromosom 11 codiert und besteht aus acht Exons und sieben Introns. Die gesamte genomische Sequenz ist bekannt und codiert ein Protein von 500 Aminosäuren, einschließlich einer 22-Aminosäure-Signalsequenz (Carter, P., et al., 1988, Eur. J. Biochem. 173: 163). Der Plasma-C1-Inhibitor ist ein Glycoprotein von etwa 105 kDa und stark glycosyliert, wobei bis zu 50% seiner Molekülmasse aus Kohlenhydrat besteht.
  • Zurzeit wird nur ein aus menschlichem Blut erhaltener C1-Inhibitor entweder hoch- oder teilweise gereinigt eingesetzt und ist in einigen europäischen Ländern für die Behandlung des hereditären Angioödems zugelassen. Dies ist eine Krankheit, die durch einen genetischen Mangel des C1-Inhibitors verursacht wird und die durch Anfälle eines genau umschriebenen, nicht-eindrückbaren, subepithelialen Ödems gekennzeichnet ist, das durch eine lokales Ansteigen der Gefäßpermeabilität zustande kommt (Cicardi, M., et al., 1998, Immunobiol. 199: 366). Die drei Stellen, die hauptsächlich beteiligt sind, sind: subkutanes Bindegewebe (Extremitäten, Gesicht, Genitalien, Gesäß), Bauchorgane und die oberen Luftwege (Kehlkopf). Die Schwellung der Darmschleimhaut kann sehr schmerzhaft sein, und eine Kehlkopfschwellung stellt eine lebensbedrohende Situation dar.
  • Eine prophylaktische Behandlung unter Verwendung von Androgenen oder Fibrinolytika wird eingesetzt, um die Zahl und die Schwere der Anfälle zu reduzieren, diese Medikamente wirken jedoch nicht gegen akute Krisen, und außerdem induzieren sie Nebenwirkungen, die mit einer langfristigen Therapie nicht zu vereinbaren sind (Zurlo, J., et al., 1990, Fertility and Sterility 54: 64).
  • Eine Substitutionstherapie mit dem C1-Inhibitor wurde als Behandlung im Fall von akuten Anfällen versucht. Jedoch besteht bei dem aus Plasma isolierten Produkt ein wesentliches Risiko einer Verunreinigung. Bei den zurzeit verwendeten Plasmapräparaten des C1-Inhibitors handelt es sich um dampfbehandelte oder pasteurisierte Produkte. Die Hitzebehandlung ist eine Vorsichtsmaßnahme, um im Blut vorliegende, infektiöse Substanzen zu eliminieren. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahmen zur Entfernung/Inaktivierung von Viren besteht immer noch ein Risiko für die Übertragung von Viren wie HIV und Hepatitis (De Filippi, F., et al., 1998, Transfusion 38: 307). Zusätzlich zu dem Sicherheitsproblem sind noch weitere Nachteile die fehlende Verfügbarkeit von gereinigtem Plasma-C1-Inhibitor sowie die hohen Kosten, die damit zusammenhängen.
  • FR-A-2 601 034 offenbart die Produktion von C1-Inhibitor in rekombinanten Bakterien. WO 96/03051 offenbart transgene nicht-menschliche Säuger, die Prokollagen oder Kollagen in ihrer Milch produzieren. EP-A-0 586 909 offenbart die Verwendung von aus Plasma hergeleitetem C1-Inhibitor für die Prophylaxe und Therapie des Kapillarleck-Syndroms („capillary leak syndrom") und von Kreislaufversagen bei den verschiedensten Leiden. WO 92/22320 offenbart die Produktion von C1-Inhibitor oder Varianten davon in CHO-Zellen und die Verwendung davon zur Behandlung systemischer Entzündungsantworten. Hack et al. (1992, Lancet 339: 378) offenbaren die Substitution von C1-Inhibitor bei Sepsis. WO 91/06650 offenbart C1-Inhibitor-Muteine mit erhöhter Resistenz gegenüber einer proteolytischen Spaltung zur Verwendung als entzündungshemmende Mittel für die Behandlung von Sepsis.
  • Die Produktion eines funktionellen C1-Inhibitors in COS- oder CHO-Zellen anhand der DNA-Rekombinationstechnik wurde beschrieben (vgl. z. B. Eldering, E., et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 11776). Jedoch ist die berichtete Ausbeute im Bereich von μg/ml für die therapeutische Anwendung zu niedrig. Man kann nicht erwarten, dass die Expression von C1-Inhibitor in Mikroorganismen zu einer korrekten posttranslationalen Modifikation und damit zu einem funktionellen Inhibitor führt, und deshalb wurde dies, soweit uns bekannt ist, auch nicht versucht.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung transgene nicht-menschliche Säuger bereit, die einen menschlichen C1-Inhibitor in ihrer Milch exprimieren. Solche Säuger weisen ein Transgen auf, umfassend ein rekombinantes DNA-Segment, welches einen C1-Inhibitor codiert und funktionell verbunden ist mit mindestens einer regulatorischen Sequenz, die wirksam ist, die Expression des DNA-Segments in Brustdrüsenzellen des transgenen nicht-menschlichen Säugers zu fördern, und einem Segment, welches ein Signalpeptid codiert, das in sekretorischen Brustdrüsenzellen des transgenen nicht-menschlichen Säugers funktionsfähig ist. Das Transgen ist in einer adulten Form des nicht-menschlichen Säugers oder einem weiblichen Nachkommen des nicht-menschlichen Säugers in der Lage, das rekombinante DNA-Segment in den Brustdrüsenzellen zu exprimieren, so dass eine Form des C1-Inhibitors produziert wird, die durch die sekretorischen Brustdrüsenzellen in die Milch des transgenen nicht-menschlichen Säugers ausgeschieden wird. Der C1-Inhibitor wird vorzugsweise in Milch in einer Konzentration von mindestens 1 mg/ml exprimiert.
  • Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zum Bereitstellen des menschlichen C1-Inhibitors. Solche Verfahren beinhalten die Gewinnung von Milch von der adulten Form des transgenen nicht-menschlichen Säugers oder seiner weiblichen Nachkommen nach Anspruch 1. Gegebenenfalls kann der C1-Inhibitor aus Milch weiter gereinigt werden. In einigen Verfahren wird der C1-Inhibitor zusammen mit einem pharmazeutischen Träger als ein Arzneimittel formuliert.
  • Weiterhin stellt die Erfindung Milch von einem nicht-menschlichen Tier bereit, die einen menschlichen C1-Inhibitor umfasst. Der C1-Inhibitor hat vorzugsweise eine Konzentration von mindestens 1 mg/ml und einen Funktionalitätsindex von mindestens 0,9.
  • Die Erfindung stellt ferner Arzneimittel bereit, die einen menschlichen C1-Inhibitor und einen pharmazeutischen Träger umfassen. Der C1-Inhibitor kann aus Milch oder anderen Quellen erhalten werden. In einigen solchen Zusammensetzungen ist der menschliche C1-Inhibitor frei von anderen menschlichen Proteinen. In einigen Zusammensetzungen ist der menschliche C1-Inhibitor mindestens zu 98% oder 99% (Gew./Gew.) rein.
  • Außerdem stellt die Erfindung Verfahren zum Behandeln eines Patienten, der an einem C1-Inhibitor-Mangel leidet oder dafür empfänglich ist, unter Verwendung der vorstehenden Zusammensetzungen bereit.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines gereinigten menschlichen C1-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der an einem C1-Inhibitor-Mangel leidet oder dafür empfänglich ist, bereit. In einigen Anwendungen ist der menschliche C1-Inhibitor frei von anderen menschlichen Proteinen, und in einigen Verfahren ist der menschliche C1-Inhibitor mindestens zu 98% oder 99% rein.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Reinigen eines menschlichen C1-Inhibitors bereit. Ein solches Verfahren beinhaltet das Auftragen einer Probe, welche einen menschlichen C1-Inhibitor umfasst, auf eine Kationenaustauscher-Säule unter Bedingungen, bei welchen der menschliche C1-Inhibitor an die Säule bindet. Danach wird der menschliche C1-Inhibitor aus der Kationenaustauscher-Säule eluiert. Das Eluat wird auf eine Anionenaustauscher-Säule unter Bedingungen aufgetragen, bei welchen der menschliche C1-Inhibitor an die Säule bindet. Danach wird der menschliche C1-Inhibitor aus der Anionenaustauscher-Säule eluiert. Das Eluat wird auf eine Metallionenaustauscher-Säule unter Bedingungen aufgetragen, bei welchen die restlichen verunreinigenden Proteine an die Säule binden. Anschließend wird das Eluat, welches den menschlichen C1-Inhibitor enthält, aus der Metallionenaustauscher-Säule gewonnen. Das vorstehend erwähnte Verfahren ist besonders für die Abtrennung eines menschlichen C1-Inhibitors von einem Kaninchen- oder anderen nicht-menschlichen C1-Inhibitor geeignet.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A: Schematische Darstellung der zwei überlappenden Fragmente, die für die Mikroinjektion verwendet wurden. Das Rinder-αS1-Casein-Promotor-Fragment ist durch einen schwarzen Balken angegeben, die C1-Inhibitor-Exons sind durch graue Balken verdeutlicht, C1-Inhibitor-Introns und flankierende Sequenz sind durch die fette schwarze Linie bezeichnet. Die Stelle der Rekombination (Überlappung) ist durch das Kreuz markiert. Es ist nicht bekannt, ob EcoRI-Stellen in den 3'-flankierenden Regionen vorliegen.
  • 1B: Schematische Darstellung des einzelnen genomischen Fragments, das für die Mikroinjektion verwendet wird.
  • Definitionen
  • Der Begriff „wesentliche Identität" oder „wesentliche Homologie" bedeutet, dass zwei Peptidsequenzen, wenn sie optimal ausgerichtet werden, wie durch die Programme GAP oder BESTFIT unter Verwendung von Standard-Leerstellen-Wichtungen („default gap weights"), eine Sequenzidentität von mindestens 65%, vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 80 oder 90% und stärker bevorzugt eine Sequenzidentität von mindestens 95% oder mehr aufweisen (z. B. eine Sequenzidentität von 99%). Vorzugsweise unterscheiden sich Restepositionen, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäuresubstitutionen.
  • Der Begriff „im Wesentlichen rein" oder „isoliert” bedeutet, dass eine betreffende Spezies identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung wie Milch, nicht-menschlichen Gewebekulturzellen oder einer natürlichen Quelle getrennt und/oder daraus gewonnen wurde. Z. B. ist ein im Wesentlichen reiner oder isolierter menschlicher C1-Inhibitor, der durch Rekombinationsverfahren in einer nicht-menschlichen Zelle produziert wurde, frei von anderen menschlichen Proteinen, mit denen zusammen er in der Natur vorliegt. Üblicherweise ist die betreffende Spezies die vorherrschende Spezies, die vorliegt (d. h. sie ist auf molarer Basis stärker verbreitet als irgendeine andere einzelne Spezies in der Zusammensetzung), und vorzugsweise ist eine wesentlich gereinigte Fraktion eine Zusammensetzung, in welcher die betreffende Spezies mindestens etwa 50% (auf molarer Basis) aller vorliegenden makromolekularen Spezies umfasst. Im Allgemeinen umfasst eine im Wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als etwa 80 bis 90 Gew.-% aller in der Zusammensetzung vorliegenden makromolekularen Spezies und stärker bevorzugt 90, 95, 99 oder 99,9%. Am stärksten bevorzugt wird die betreffende Spezies bis zu einer wesentlichen Homogenität gereinigt (in der Zusammensetzung können durch herkömmliche Nachweisverfahren keine verunreinigenden Spezies nachgewiesen werden), wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen aus Derivaten einer einzelnen makromolekularen Spezies besteht.
  • Ein DNA-Segment ist funktionell verbunden, wenn es mit einem anderen DNA-Segment in einen funktionellen Zusammenhang gebracht wurde. Z. B. ist eine DNA für eine Signalsequenz mit einer DNA, die ein Polypeptid codiert, funktionell verbunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz stimuliert. Im Allgemeinen grenzen DNA-Sequenzen, die funktionell verbunden sind, aneinander an, und im Fall einer Signalsequenz grenzen sie aneinander an und liegen in der Lesephase vor. Jedoch müssen Enhancer nicht an die codierenden Sequenzen angrenzen, deren Transkription sie kontrollieren. Die Verbindung wird durch Ligierung an geeigneten Restriktionsstellen oder an Adaptern oder Linkern erreicht, die statt dessen inseriert wurden.
  • Ein exogenes DNA-Segment ist eines, das zu der Zelle heterolog ist (das z. B. von einer anderen Art stammt als die Zelle) oder das zu einem DNA-Segment der Zelle homolog ist, jedoch in einer unnatürlichen Position im Genom der Wirtszelle vorliegt. Wenn exogene DNA-Segmente exprimiert werden, erhält man exogene Polypeptide.
  • In einem transgenen Säuger enthalten alle oder im Wesentlichen alle der Keimbahn- oder somatischen Zellen ein Transgen, das in den Säuger oder einen Vorfahren des Säugers in einem frühen Embryonalstadium eingeführt wurde.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Arzneimittel bereit, das einen gereinigten menschlichen C1-Inhibitor umfasst. In einigen solchen Zusammensetzungen ist der menschliche C1-Inhibitor frei von anderen menschlichen Proteinen. In einigen Zusammensetzungen ist der menschliche C1-Inhibitor mindestens zu 98% oder 99% (Gew./Gew.) rein.
  • Außerdem stellt die Erfindung Verfahren zum Behandeln eines Patienten, der an einem C1-Inhibitor-Mangel leidet oder dafür empfänglich ist, unter Verwendung der vorstehenden Zusammensetzungen bereit.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines gereinigten menschlichen C1-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der an einem C1-Inhibitor-Mangel leidet oder dafür empfänglich ist, bereit. In einigen Anwendungen ist der menschliche C1-Inhibitor frei von anderen menschlichen Proteinen, und in einigen Verfahren ist der menschliche C1-Inhibitor mindestens zu 98% oder 99% rein.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine effiziente und sichere Herstellung des menschlichen C1-Inhibitors in der Milch von transgenen Tieren, die Reinigung des C1-Inhibitors aus Milch oder anderen Quellen und therapeutische Anwendungen davon. Die durch die Anmeldung bereitgestellten Ergebnisse zeigen, dass der C1-Inhibitor in der Milch in einer sehr hohen Konzentration und in einer Form hergestellt werden kann, die geeignet gefaltet und posttranslational modifiziert ist, so dass er eine (enzymatische) Hemmaktivität besitzt. Im Gegensatz zu einem aus Plasma stammenden C1-Inhibitor ist der anhand von transgenen Tieren produzierte C1-Inhibitor frei von dem Risiko für die Übertragung von hämatogenen Infektionserregern. Die für die Herstellung des transgenen Produkts verwendeten Tiere sind eine homogene Population und können besser kontrolliert werden als Plasmaspender, wodurch ein viel sicherer Ausgangspunkt für die Isolierung des C1-Inhibitors bereitgestellt wird. Dies hat zur Folge, dass die rekombinante Form des C1-Inhibitors als Produkt für die klinische Verwendung mehr Sicherheit bietet als das Plasmaprodukt.
  • Die Erfindung stellt transgene nicht-menschliche Säuger bereit, die den menschlichen C1-Inhibitor in ihre Milch ausscheiden. Die Ausscheidung wird durch den Einbau eines Transgens, welches einen C1-Inhibitor codiert, und mindestens einer regulatorischen Sequenz erreicht, die in der Lage ist, die Expression des Gens zielgerichtet zur Brustdrüse hinzusteuern. Das Transgen wird in der Brustdrüse exprimiert und posttranslational modifiziert und danach in der Milch ausgeschieden.
  • A. C1-Inhibitor-Gene
  • Es wurde gezeigt, dass die C1-Inhibitor-cDNA-Sequenz ein Protein von 500 Aminosäuren, einschließlich einer 22-Aminosäuren-Signalsequenz, codiert (Bock et al., 1986, Biochem. 25: 4292–4301). Die gesamte menschliche genomische Sequenz des C1-Inhibitors ist bekannt und zeigt, dass das Gen sieben Introns umfasst (Carter, P., et al., 1988, Eur. J. Biochem. 173: 163). Transgene Säuger, die allele, verwandte und induzierte Varianten einer beliebigen der in dieser Referenz beschriebenen Prototypen-Sequenzen exprimieren, sind in der Erfindung eingeschlossen. Solche Varianten zeigen auf Aminosäureebene eine wesentliche Sequenzidentität mit bekannten C1-Inhibitor-Genen. Solche Varianten hybridisieren üblicherweise mit einem bekannten Gen unter stringenten Bedingungen oder kreuzreagieren mit Antikörpern gegen ein durch eines der bekannten Gene codiertes Polypeptid. Andere Beispiele von genomischen und cDNA-Sequenzen sind von GenBank verfügbar. In dem Ausmaß, in dem weitere clonierte Sequenzen von C1-Inhibitor-Genen erforderlich sind, können sie aus genomischen oder cDNA-Banken (menschlichen) unter Verwendung bekannter C1-Inhibitor-Sequenzen erhalten werden.
  • C. Entwurf eines Transgens
  • Transgene werden so entworfen, dass sie die Expression eines rekombinanten menschlichen C1-Inhibitors zielgerichtet zur Brustdrüse eines transgenen nicht-menschlichen Säugers, welcher das Transgen enthält, hinsteuern. Die zugrundeliegende Vorgehensweise beinhaltet, dass ein exogenes DNA-Segment, welches das Protein codiert, mit einer Signalsequenz und einer regulatorischen Sequenz funktionell verbunden wird, welche die Förderung der Expression des exogenen DNA-Segments bewirkt. Typischerweise schließt die regulatorische Sequenz einen Promotor und Enhancer ein. Das DNA-Segment kann genomisch, ein Minigen (genomisch, bei dem ein oder mehrere Introns weggelassen wurden), eine cDNA, ein YAC-Fragment, eine Chimäre aus zwei unterschiedlichen C1-Inhibitor-Genen oder ein Hybrid von einem dieser Produkte sein. Die Einbeziehung genomischer Sequenzen führt im Allgemeinen zu höheren Expressionsraten.
  • Es ist nicht notwendig, dass man in genomischen Konstrukten alle Intron-Sequenzen beibehält. Z. B. können einige Intron-Sequenzen entfernt werden, um ein kleineres Transgen zu erhalten, wodurch DNA-Manipulationen und die anschließende Mikroinjektion erleichtert werden. Vgl. Archibald et al., WO 90/05188 (durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Eine Entfernung einiger Introns ist in einigen Fällen auch dafür geeignet, die Expressionsraten zu steigern. Außerdem kann eine Entfernung von einem oder mehreren Introns zum Reduzieren der Expressionsraten wünschenswert sein, um sicherzustellen, dass die posttranslationale Modifikation im Wesentlichen vollständig erfolgt ist. Ferner ist es möglich, einige oder alle der nicht-codierenden Exons zu entfernen. In einigen Transgenen werden selektierte Nucleotide in C1-Inhibitor-codierenden Sequenzen mutiert, um proteolytische Spaltstellen zu entfernen.
  • Da die vorgesehene Verwendung von C1-Inhibitoren, die durch transgene Säuger erzeugt werden, üblicherweise eine Verabreichung an Menschen ist, ist die Art, von der das DNA-Segment erhalten wird, welches eine C1-Inhibitor-Sequenz codiert, vorzugsweise ein Mensch. Wenn analog die vorgesehene Verwendung in der tiermedizinischen Therapie liegen würde (z. B. bei einem Pferd, Hund oder einer Katze), ist es bevorzugt, dass das DNA-Segment aus der gleichen Art stammt.
  • Regulatorische Sequenzen wie ein Promotor und Enhancer stammen von einem Gen, das ausschließlich oder zumindest bevorzugt in der Brustdrüse exprimiert wird (d. h. einem Brustdrüse-spezifischen Gen). Bevorzugte Gene als Quelle von Promotor und Enhancer schließen β-Casein, κ-Casein, αS1-Casein, αS2-Casein, β-Lactoglobulin, saures Molken-Protein und α-Lactalbumin ein. Der Promotor und Enhancer werden üblicherweise, jedoch nicht immer, von dem gleichen Brustdrüsen-spezifischen Gen erhalten. Vorzugsweise stammt dieses Gen aus der gleichen Säugerart wie der Säuger, in dem das Transgen exprimiert werden soll. Außerdem können Expressionsregulationssequenzen aus anderen Arten wie solche aus menschlichen Genen verwendet werden. Die Signalsequenz muss in der Lage sein, die Sekretion des C1-Inhibitors aus der Brustdrüse zu steuern. Geeignete Signalsequenzen können von Säugergenen hergeleitet werden, welche ein ausgeschiedenes Protein codieren. Die natürlichen Signalsequenzen von C1-Inibitoren sind geeignet. Zusätzlich zu solchen Signalsequenzen sind bevorzugte Quellen von Signalsequenzen die Signalsequenz aus dem gleichen Gen, aus dem der Promotor und der Enhancer erhalten werden. Gegebenenfalls werden zusätzliche regulatorische Sequenzen in das Transgen eingefügt, um die Expressionsraten zu optimieren. Solche Sequenzen schließen 5'-flankierende Regionen, 5'-transkribierte, jedoch untranslatierte Regionen, Intron-Sequenzen, 3'-transkribierte, jedoch untranslatierte Regionen, Polyadenylierungsstellen und 3'-flankierende Regionen ein. Solche Sequenzen werden üblicherweise entweder aus dem Brustdrüse-spezifischen Gen, aus dem der Promotor und der Enhancer erhalten werden, oder aus dem C1-Inhibitor-Gen, das exprimiert wird, erhalten. Die Einbeziehung solcher Sequenzen erzeugt ein genetisches Milieu, welches dasjenige eines authentischen Brustdrüse-spezifischen Gens und/oder dasjenige eines authentischen C1-Inhibitor-Gens simuliert. Dieses genetische Milieu führt in einigen Fällen (z. B. Rinder-αS1-Casein) zu einer höheren Expression des transkribierten Gens. Alternativ werden 3'-flankierende Regionen und untranslatierte Regionen aus anderen heterologen Genen wie dem β-Globin-Gen oder viralen Genen erhalten. Die Einbeziehung von untranslatierten 3'- und 5'-Regionen aus einem C1-Inhibitor-Gen oder einem anderen heterologen Gen kann auch die Stabilität des Transkripts erhöhen.
  • In einigen Ausführungsformen sind etwa 0,5, 1, 5, 10, 15, 20 oder 30 kb einer 5'-flankierenden Sequenz aus einem Brustdrüsen-spezifischen Gen in Kombination mit etwa 1, 5, 10, 15, 20 oder 30 kb einer 3'-flankierenden Sequenz aus dem C1-Inhibitor-Gen, das exprimiert wird, eingeschlossen. Wenn das Protein aus einer cDNA-Sequenz exprimiert wird, ist es von Vorteil, eine Intron-Sequenz zwischen dem Promotor und der codierenden Sequenz einzufügen. Die Intron-Sequenz ist vorzugsweise eine Hybridsequenz, die aus einem 5'-Teil aus einer intervenierenden Sequenz aus dem ersten Intron der Brustdrüsen-spezifischen Region, aus welcher der Promotor erhalten wird, und einem 3'-Teil aus einer intervenierenden Sequenz einer intervenierenden IgG-Sequenz oder einem C1-Inhibitor-Gen gebildet wird. Vgl. DeBoer et al., WO 91/08216 (durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Ein weiteres bevorzugtes Transgen für die Expression einer C1-Inhibitor-cDNA beruht auf dem pBC1-Expressionsvektor-Kit, der kommerziell verfügbar ist von Invitrogen (Carlsbad, KA). Der pBC1-Vektor umfasst den β-Casein-Promotor der Ziege und außerdem Teile des β-Casein-Gens der Ziege, die verschiedene Exons und Introns einschließen, und außerdem untranslatierte 3'-Sequenzen. Durch das Einfügen der C1-Inhibitor-cDNA in die einmalige XhoI-Insertionsstelle von pBC1 wird eine chimäre RNA produziert, die C1-Inhibitor-cDNA-Sequenzen umfasst, die durch die β-Casein-Exon- und Intronsequenzen der Ziege flankiert werden. Jedoch werden beim richtigen Spleißen dieses chimären RNA-Moleküls nur die C1-Inhibitor-cDNA-Sequenzen translatiert.
  • Ein bevorzugtes Transgen zum Exprimieren eines C1-Inhibitor-Proteins aus genomischen Sequenzen umfasst eine genomische C1-Inhibitor-Sequenz, welche die gesamte codierende Sequenz und ein Signalpeptid codiert, eine 3'-UTR und eine flankierende 3'-Sequenz, funktionell verbunden mit einem 5'-alpha-S1-Casein-Fragment, das (eine) regulatorische Sequenz(en) enthält, die ausreichend ist (sind), um die Expression des C1-Inhibitor-Proteins zu steuern.
  • DNA-Sequenzinformationen sind für alle vorstehend angeführten Brustdrüsen-spezifischen Gene in mindestens einem und häufig mehreren Organismen verfügbar. Vgl. z. B. Richards et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 526–532 (α-Lactalbumin der Ratte); Campbell et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12: 8685–8697 (WAP der Ratte); Jones et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 7042–7050 (β-Casein der Ratte); Yu-Lee & Rosen, 1983, J. Biol. Chem. 258: 10794–10804 (γ-Casein der Ratte); Hall, Biochem. J., 1987, 242: 735–742 (α-Lactalbumin des Menschen); Stewart, 1984, Nucleic Acids Res. 12: 389 (αS1- und κ-Casein-cDNAs des Rindes); Gorodetsky et al., 1988, Gene 66: 87–96 (β-Casein des Rindes); Alexander et al., 1988, Eur. J. Biochem., 178: 395–401 (κ-Casein des Rindes); Brignon et al., 1977, FEBS Lett. 188: 48–55 (αS2-Casein des Rindes); Jamieson et al., 1987, Gene 61: 85–90; Ivanov et al., 1988, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369: 425–429; Alexander et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 6739 (β-Lactoglobulin des Rindes); Vilotte et al., 1987, Biochimie 69: 609–620 (α-Lactalbumin des Rindes) (durch Bezugnahme in ihrer Vollständigkeit für alle Zwecke eingeschlossen). Die Struktur und Funktion der verschiedenen Milchprotein-Gene sind als Übersichtsartikel von Mercier und Vilotte, 1993, J. Dairy Sci. 76: 3079–3098, zusammengestellt (durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Wenn zusätzliche Sequenzinformationen erforderlich wären, könnten Sequenzen, welche die bereits erhaltenen Regionen flankieren, einfach cloniert werden, indem die vorliegenden Sequenzen als Sonden eingesetzt werden. Genauso können Brustdrüsen-spezifische regulatorische Sequenzen aus anderen Organismen erhalten werden, indem Banken aus solchen Organismen unter Verwendung bekannter verwandter Nucleotidsequenzen oder von Antikörpern gegen verwandte Proteine als Sonden durchgemustert werden.
  • Allgemeine Strategien und beispielhafte Transgene, bei denen regulatorische Sequenzen des αS1-Casein verwendet werden, um die Expression eines rekombinanten Proteins zielgerichtet zur Brustdrüse hinzusteuern, sind ausführlicher beschrieben in DeBoer et al., WO 91/08216 und WO 93/25567 (durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Außerdem wurden noch Beispiele von Transgenen beschrieben, bei denen regulatorische Sequenzen aus anderen Brustdrüsen-spezifischen Genen verwendet wurden. Vgl. z. B. Simon et al., 1988, Bio/Technology 6: 179–183, und WO 88/00239 (1988) (regulatorische Sequenz des β-Lactoglobulin für die Expression in Schafen); Rosen, EP 279 582 und Lee et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 1027–1041 (regulatorische Sequenz von β-Casein für die Expression in Mäusen); Gordon, 1987, Biotechnology 5: 1183 (regulatorische Sequenz von WAP für die Expression in Mäusen); WO 88/01648 (1988) und 1989, Eur. J. Biochem. 186: 43–48 (regulatorische Sequenz von α-Lactalbumin für die Expression in Mäusen (durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen).
  • D. Transgenese
  • Die vorstehend beschriebenen Transgene werden in nicht-menschliche Säuger eingeführt. Die meisten nicht-menschlichen Säuger sind geeignet, einschließlich Nager wie Mäuse und Ratten, Kaninchen, schafartige Tiere wie Schafe, ziegenartige Tiere wie Ziegen, schweineartige Tiere wie Schweine und rinderartige Tiere wie Rind und Büffel. Rinder bieten den Vorteil von großen Milchausbeuten, wohingegen Mäuse Vorteile einer einfachen Transgenese und Züchtung bieten. Kaninchen stellen einen Kompromiss dieser Vorteile dar. Ein Kaninchen kann 100 ml Milch pro Tag mit einem Proteingehalt von etwa 14% ergeben (vgl. Buhler et al., 1990, Bio/Technology 8: 140) (durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen), und es kann auch unter Verwendung der gleichen Prinzipien und mit einer ähnlichen Einfachheit wie Mäuse manipuliert und gezüchtet werden. Nicht-lebend-gebärende Säuger wie der Ameisenigel oder das Schnabeltier werden typischerweise nicht verwendet.
  • In einigen Verfahren der Transgenese werden Transgene in die Vorkerne von befruchteten Eizellen eingeführt. Bei einigen Tiere wie Mäusen und Kaninchen wird die Befruchtung in vivo durchgeführt und befruchtete Eier werden chirurgisch entnommen. Bei anderen Tieren, insbesondere bei Rindern, ist es bevorzugt, Eier aus lebenden Tieren oder aus Schlachthof-Tieren zu entnehmen und die Eier in vitro zu befruchten. Vgl. DeBoer et al., WO 91/08216 . Die in vitro-Befruchtung macht es möglich, dass ein Transgen in im Wesentlichen synchrone Zellen bei einer für die Integration optimalen Phase des Zellzyklus (nicht später als S-Phase) eingeführt wird. Üblicherweise werden Transgene durch Mikroinjektion eingeführt. Vgl. US 4 873 292 . Die befruchteten Eizellen werden sodann in vitro so lange gezüchtet, bis ein Präimplantations-Embryo erhalten wird, der etwa 16 bis 150 Zellen enthält. Das 16- bis 32-Zell-Stadium eines Embryos wird als Morula bezeichnet. Präimplantations-Embryos, die mehr als 32 Zellen enthalten, werden als Blastocysten bezeichnet. Diese Embryos zeigen die Entwicklung einer Blastocölenhöhle, und zwar typischerweise im 64-Zell-Stadium. Verfahren zum Züchten befruchteter Eizellen bis zum Präimplantations-Stadium sind beschrieben von Gordon et al., 1984, Methods Enzymol. 101: 414; Hogan et al., 1986, Manipulation of the Mäuse Embryo: A Laboratory Manual, C. S. H. L. NY (Mausembryo); Hammer et al., 1985, Nature 315: 680 (Kaninchen- und Schweineembryos); Gandolfi et al., 1987, J. Reprod. Fert. 81: 23–28; Rexroad et al., 1988, J. Anim. Sci. 66: 947–953 (Schafembryos); und Eyestone et al., 1989, J. Reprod. Fert. 85: 715–720; Camous et al., 1984, J. Reprod. Fert. 72: 779–785; und Heyman et al., 1987, Theriogenology 27: 5968 (Rinderembryos) (durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Manchmal werden Präimplantations-Embryos für eine vom Zyklus abhängige Implantation gefroren gelagert. Präimplantations-Embryos werden in den Eileiter eines pseudoträchtigen Weibchens übertragen, dies führt zur Geburt eines transgenen oder chimären Tiers, abhängig vom Entwicklungsstadium zu dem Zeitpunkt, wenn das Transgen eingebaut wird. Chimäre Tiere können gezüchtet werden, wodurch echte Keimbahn-transgene Tiere erzeugt werden.
  • Alternativ können Transgene in embryonale Stammzellen (ES) eingeführt werden. Diese Zellen werden aus in vitro-gezüchteten Präimplantations-Embryos erhalten. Bradley et al., 1984, Nature 309: 255–258 (durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Transgene können durch Elektroporation oder Mikroinjektion in solche Zellen eingeführt werden. ES-Zellen sind für eine Einführung von Transgenen an spezifischen Chromosomenpositionen anhand von homologer Rekombination geeignet. Z. B. kann ein Transgen, das den C1-Inhibitor codiert, an einer genomischen Position eingeführt werden, an der es mit einer endogenen regulatorischen Sequenz funktionell verbunden wird, welche eine gesteuerte Expression der codierenden Sequenz in der Brustdrüse bewirken kann. Transformierte ES-Zellen werden mit Blastozysten aus einem nicht-menschlichen Tier kombiniert. Die ES-Zellen besiedeln den Embryo und bilden in einigen Embryos die Keimbahn des resultierenden chimären Tiers oder tragen dazu bei. Vgl. Jaenisch, 1988, Science 240: 1468–1474 (durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Alternativ können ES-Zellen als Quelle von Kernen für eine Transplantation in eine entkernte befruchtete Eizelle verwendet werden, wodurch ein transgener Säuger hervorgebracht wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden transgene Tiere, vorzugsweise nicht-menschliche Säuger, welche ein Transgen enthalten, das den C1-Inhibitor exprimieren kann, durch Verfahren hergestellt, bei denen eine Kernübertragung beteiligt ist. Verschiedene Typen von Zellen können als Spender für die Kerne eingesetzt werden, die in Eizellen übertragen werden sollen. Spenderzellen können aus allen Geweben von transgenen Tieren erhalten werden, die ein C1-Inhibitor-Transgen enthalten, wie erwachsene, fetale oder embryonale Zellen, in verschiedenen Stadien der Differenzierung, die von undifferenziert bis vollständig differenziert reichen, in verschiedenen Zellzylus-Stadien, z. B. sowohl ruhende als auch proliferierende Zellen, und die entweder aus somatischen oder aus Keimbahn-Geweben erhalten werden können (vgl. WO 97/07669 , WO 98/30683 und WO 98/39416 , jeweils durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Alternativ werden Spenderkerne aus in vitro-gezüchteten Zellen erhalten, in die ein C1-Inhibitor-Transgen unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie Calciumphosphat-Transfektion, Mikroinjektion oder Lipofektion eingeführt wurde und die anschließend auf das Vorliegen eines Transgens oder eines spezifischen Einbaus eines Transgens selektiert oder durchgemustert wurden (vgl. WO 98/37183 und WO 98/39416 , jeweils durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Spenderkerne werden in Eizellen mit Hilfe einer Fusion, die elektrisch oder chemisch induziert werden kann (vgl. eines von WO 97/07669 , WO 98/30683 und WO 98/39416 ), oder durch Mikroinjektion eingeführt (vgl. WO 99/37143 , durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Transplantierte Eizellen werden anschließend gezüchtet, so dass sie sich zu Embryos entwickeln, die sodann in die Eileiter von scheinträchtigen weiblichen Tieren implantiert werden, dies führt zur Geburt von transgenen Nachkommen (vgl. eines von WO 97/07669 , WO 98/30683 und WO 98/39416 ).
  • In einem weiteren Verfahren der Transgenese werden (Retro-)Virus-basierte Vektoren eingesetzt, um die gewünschten Transgene einzuführen. Beispiel solcher Vektoren schließen den vom vesikulären Stomatitis Virus G-Glycoprotein (VSG-G)-MoMLV stammenden Retrovirus-Vektor (VSV-G-Pseudotyp) ein, wie von Yee et al. beschrieben (1994, Meth. Cell. Biol. 43: 99–112, durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen). Eizellen eines nicht-menschlichen Säugers, vorzugsweise eines Rindes, angehalten in der Metaphase II der zweiten meiotischen Teilung vor der Befruchtung, werden mit einem solchen VSV-G-Pseudotyp-Vektor, wie von Chan et al. beschrieben (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14028–14033, durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen) infiziert, so dass transgene Nachkommen erzeugt werden. Alternativ wird, anstatt ein genetisch modifiziertes Tier zu erzeugen, ein eingegrenztes Organ, vorzugsweise eine Brustdrüse, für den Zweck zur Herstellung pharmazeutischer Proteine durch eine Retrovirus-Infektion transformiert. Durch das Infundieren von Retrovirus-Vektoren, welche C1-Inhibitor-codierende Sequenzen tragen, in nicht-menschlichen Brustdrüsen, um die Brustdrüsenepithelzellen zu infizieren, wird die Produktion des C1-Inhibitor-Proteins in der Milch dieser Tiere möglich gemacht (Archer et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6840–6844, durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen).
  • Für die Herstellung transgener Tiere, die zwei oder mehr Transgene enthalten, können die Transgene gleichzeitig unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie bei einem einzelnen Transgen eingeführt werden. Alternativ können die Transgene anfangs in getrennte Tiere eingeführt werden und dann durch Züchten der Tiere in dasselbe Genom kombiniert werden. Alternativ wird ein erstes transgenes Tier hergestellt, das eines der Transgene enthält. Danach wird ein zweites Transgen in befruchtete Eier oder embryonale Stammzellen aus diesem Tier eingeführt. In einigen Ausführungsformen werden Transgene, deren Länge ansonsten etwa 50 kb übersteigen würde, als überlappende Fragmente konstruiert. Solche überlappenden Fragmente werden in eine befruchtete Eizelle oder embryonale Stammzelle gleichzeitig eingeführt und durchlaufen in vivo eine homologe Rekombination. Vgl. Kay et al., WO 92/03917 (durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen).
  • E. Eigenschaften von transgenen Säugern
  • Transgene Säuger der Erfindung bauen mindestens ein Transgen in ihrem Genom, wie vorstehend beschrieben, ein. Die Einführung eines Transgens im Ein-Zell-Stadium führt üblicherweise zu transgenen Tieren und ihren Nachkommen, von denen im Wesentlichen alle Keimbahn- und somatischen Zellen (mit der möglichen Ausnahme von einigen wenigen Zellen, die somatische Mutationen durchlaufen haben) das Transgen in ihren Genomen enthalten. Die Einführung eines Transgens in einem späteren Stadium führt zu Mosaik- oder chimären Tieren. Jedoch können einige solche Tiere, die ein Transgen in ihre Keimbahn eingebaut haben, gezüchtet werden, wobei sie transgene Tiere erzeugen, von denen im Wesentlichen alle somatischen und Keimbahn-Zellen ein Transgen enthalten. Eine virale Transgenese von Brustdrüsenzellen führt üblicherweise zu einem transgenen Säuger, in dem das Transgen nur in Brustdrüsenzellen vorliegt. Ein solcher Säuger überträgt seine Keimbahn nicht auf zukünftige Generationen. Das Transgen steuert die Expression eines DNA-Segments, das ein C1-Inhibitor-Protein codiert, mindestens hauptsächlich zur Brustdrüse hin. Der C1-Inhibitor kann in hohen Spiegeln von mindestens 100, 500, 1000, 2000, 5000 oder 10 000, 20 000 oder 50 000 μg/ml ausgeschieden werden. Erstaunlicherweise zeigen die transgenen Säuger der Erfindung einen im Wesentlichen normalen Gesundheitszustand. Es erfolgt keine sekundäre Expression von C1-Inhibitor-Proteinen in anderen Geweben als der Brustdrüse in einem ausreichenden Ausmaß, um schädliche Effekte zu bewirken. Außerdem wird exogenes C1-Inhibitor-Protein aus der Brustdrüse mit einer ausreichenden Effizienz ausgeschieden, so dass keine Probleme durch Ablagerungen entstehen, welche den sekretorischen Apparat verstopfen würden.
  • Das Alter, in dem transgene Säuger mit der Produktion von Milch beginnen, variiert natürlich damit, um welches Tier es sich handelt. Für transgene Rinder beträgt das Alter von Natur aus etwa zweieinhalb Jahre oder mit Hormonstimulation sechs Monate, wohingegen für transgene Mäuse das Alter etwa 9 bis 11 Wochen beträgt. Natürlich sind nur die weiblichen Mitglieder einer Art für die Produktion von Milch geeignet. Jedoch haben auch transgene Männchen für die Züchtung weiblicher Nachkommen einen Wert. Das Sperma aus transgenen Männchen kann für eine anschließende in vitro-Befruchtung und Erzeugung weiblicher Nachkommen eingefroren werden.
  • F. Gewinnung von Proteinen aus Milch oder anderen Quellen
  • Transgene erwachsene weibliche nicht-menschliche Säuger erzeugen Milch, die hohe Konzentrationen eines exogenen menschlichen C1-Inhibitor-Proteins enthält. Die Reinigung des C1-Inhibitors aus der Milch kann durchgeführt werden, indem die transgene Milch durch Zentrifugation und Entfernung des Fetts entfettet wird, worauf die Entfernung von Casein durch Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation folgt, hierauf folgt sodann eine dead-end-Filtration (d. h. eine dead-end-Filtration, indem nacheinander immer kleinere Filtergrößen eingesetzt werden) oder eine Durchfluss-Filtration, oder eine Entfernung von Casein direkt durch Querstromfiltration („cross filtration"). Das Protein kann aus Milch anhand seiner unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften gereinigt werden, sofern dies gewünscht wird (vgl. allgemein Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)); Prograis et al., 1985, J. Medicine 16 (1–3): 303–350; Pilatte et al., 1989, J. Immunol. Methods 120: 37–43; Reboul et al., 1977, FEBS Lett. 79: 45–50; Alsenz et al., 1987, J. Immunol. Methods 96: 107–114; Ishizaki et al., 1977, J. Biochem. 82: 1155–1160. Die Reinigungsbedingungen sollten vorzugsweise den menschlichen C1-Inhibitor von dem endogenen C1-Inhibitor des transgenen nicht-menschlichen Säugers abtrennen.
  • Kationen-, Anionen- und Metall-Affinitäts-Chromatographie können alle für die Reinigung des menschlichen C1-Inhibitor-Proteins aus Milch oder anderen Quellen wie rekombinanten Zellkulturen oder natürlichen Quellen verwendet werden. Bei einigen Verfahren werden mehr als einer dieser Schritte eingesetzt, und bei einigen Verfahren werden alle drei Schritte eingesetzt. Obwohl die Schritte in jeder beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden können, besteht eine bevorzugte Reihenfolge darin, eine Kationen-Chromatographie durchzuführen, gefolgt von einer Anionen-Chromatographie, gefolgt von einer Metallionen-Affinitäts-Chromatographie.
  • Eine Kationen-Chromatographie kann z. B. unter Verwendung von großen SepharoseTM-Perlen oder Carboxymethylcellulose durchgeführt werden. Ein Auftragepuffer mit niedrigem Salzgehalt (z. B. 20 mM Natriumcitrat, 0,02 M Natriumchlorid) wird verwendet. Der menschliche C1-Inhibitor kann bei hoher Salzkonzentration (z. B. 20 mM Natriumcitrat, 0,2 M Natriumchlorid) eluiert werden. Danach wird das den menschlichen C1-Inhibitor enthaltende Eluat einer Anionen-Chromatographie unterworfen.
  • Die Matrix einer Anionen-Säule kann ein Material wie Cellulose, Dextrane, Agarose oder Polystyrol sein. Der Ligand kann z. B. Diethylaminoethyl (DEAE), Polyethylenimin (PEI) oder eine funktionelle quartäre Ammoniumgruppe sein. Die Stärke einer Anionenaustauscher-Säule bezieht sich auf den Ionisierungszustand des Liganden. Säulen mit einem starken Ionenaustauscher wie diejenigen, die einen quartären Ammoniumliganden enthalten, weisen eine permanente positive Ladung auf. In Säulen mit einem schwachen Anionenaustauscher wie DEAE und PEI hängt das Vorliegen der positiven Ladung vom pH-Wert der Säule ab.
  • Anionenaustauscher-Säulen werden im Allgemeinen mit einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt bei einem pH-Wert über dem pI-Wert des menschlichen C1-Inhibitors ( ) beladen. Die Säulen werden mehrmals mit dem Puffer mit niedrigem Salzgehalt gewaschen, um die Proteine, die nicht binden, zu eluieren. Anschließend werden die gebundenen Proteine unter Verwendung eines Puffers mit steigender Salzkonzentration eluiert. Q Sepharose FF ist eine bevorzugte Anionenaustauscher-Säule, da dieses Material im Vergleich zu anderen Anionenaustauscher-Säulen relativ billig ist und eine relativ große Perlengröße aufweist, die für eine Reinigung im großen Maßstab geeignet ist. Unter den angegebenen Bedingungen kann der menschliche C1-Inhibitor aus der Q Sepharose FF eluiert werden, ohne dass der C1-Inhibitor des Kaninchens oder andere Proteine, die in Kaninchenmilch gefunden werden, eluiert werden. Um eine gute Bindung der menschlichen sauren α-Glucosidase an die Q Sepharose FF zu erhalten, wird die Säule in einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt voräquilibriert (d. h. weniger als 50 mM, etwa Natriumphosphatpuffer). Der pH-Wert des Puffers sollte etwa 7,0 ± 1,0 betragen, um eine gute Bindung des menschlichen C1-Inhibitors an die Säule zu erhalten. Danach wird der menschliche C1-Inhibitor durch eine schrittweise oder Gradienten-Elution bei erhöhter Salzkonzentration eluiert. Die schrittweise Elution ist für eine Reinigung im großen Maßstab besser geeignet. Der größte Teil des aufgetragenen menschlichen C1-Inhibitors kann aus einer Q-FF-Säule in einem Schritt (bei etwa 0,25 M Salz) mit einer relativ hohen Reinheit eluiert werden.
  • Eine Metall-Affinitäts-Chromatographie wird unter Verwendung einer Matrix wie SepharoseTM und eines gebundenen Metallions wie Kupfer, Zink, Nickel, Kobalt oder Calcium durchgeführt. Auch können organische chelatbildende Gruppen wie Iminodiessigsäure verwendet werden. Die Säule wird bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 mit einem nicht-chelatbildenden Salz (z. B. Natriumchlorid), das bei einer relativ hohen Konzentration vorliegt, z. B. größer als 0,2 M, äquilibriert. Unter diesen Bedingungen binden restliche verunreinigende Proteine an die Säule, während der menschliche C1-Inhibitor dies nicht tut und einfach eluiert werden kann.
  • Ein beispielhaftes Reinigungsverfahren wird im Abschnitt Beispiele beschrieben. Dieses Verfahren stellt ein C1-Inhibitor-Präparat bereit, das zu mindestens 98% oder 99% (Gew./Gew.) in Bezug auf alle verunreinigenden Stoffe rein ist und weniger als 0,5%, 0,1% oder 0,05% (Gew./Gew.) Kaninchen-C1-Inhibitor enthält. Vorzugsweise wird eine zusätzliche Reinigung durchgeführt, um C1-Inhibitor-Präparate mit einer Reinheit von mindestens 99%, vorzugsweise von mindestens 99,5%, stärker bevorzugt von 99,8% und am stärksten bevorzugt von 99,9% zu erhalten.
  • G. Verwendungen eines rekombinanten menschlichen C1-Inhibitors
  • Ein aus Milch oder aus anderen Quellen gereinigter menschlicher C1-Inhibitor findet Verwendung, wobei er den endogenen C1-Inhibitor in Patienten ersetzt oder ergänzt, die an dem hereditären Angioödem leiden, einer Krankheit, die durch das Fehlen oder den Mangel eines funktionellen endogenen C1-Inhibitors gekennzeichnet ist. Ein Patient, der einen genetischen oder anderen Mangel aufweist, der zu einer Insuffizienz des funktionellen C1-Inhibitors führt, kann durch Verabreichen eines exogenen C1-Inhibitors an den Patienten behandelt werden. Patienten, die eine solche Behandlung benötigen, können durch ein nicht-eindrückbares subepitheliales Ödem identifiziert werden, das durch einen lokalen Anstieg der Gefäßpermeabilität zustande kommt (Cicardi, M., et al., 1998, Immunobiol. 199: 366). Die drei Stellen, die hauptsächlich beteiligt sind, sind: subkutanes Gewebe (Extremitäten, Gesicht, Genitalien, Gesäß), Bauchorgane und die oberen Luftwege (Kehlkopf). Die Schwellung der Darmschleimhaut kann sehr schmerzhaft sein, und ein Kehlkopfödem stellt eine lebensbedrohende Situation dar.
  • Alternativ oder zusätzlich kann die Diagnose bei den Patienten durch eine biochemische Analyse gestellt werden. Diagnostische Tests werden häufig an Blutplasma durchgeführt und umfassen Funktions- und Antigen-Tests auf den C1-Inhibitor sowie die Bestimmung der Spiegel der Komplementkomponenten C4 und C2. Die Spiegel der Komplementkomponenten C4 und C2 sind während der Anfälle des Angioödems im Allgemeinen stark reduziert, dies ist auch manchmal zwischen den Anfällen der Fall, jedoch in einem geringeren Ausmaß. Die Spiegel der Komplementkomponenten C4 und C2 sind aufgrund einer anhaltenden Aktivierung und eines Verbrauchs der Komponenten C4 und C2 durch die C1-Esterase reduziert. In Patienten mit einem erworbenen Angioödem ist die Komplementkomponente C1 oder die Subkomponente C1q allgemein auf Werte in der Nähe der Komplement-C4- und C2-Spiegel reduziert. Patienten mit einem hereditären Angioödem können in Patienten vom Typ I oder Typ II eingeteilt werden. Der häufigere Mangel vom Typ I ist durch niedrige Spiegel des zirkulierenden C1-Inhibitors gekennzeichnet, die durch genetische Läsionen zustande kommen, welche die Expression des betroffenen Allels aufheben (vgl. Tosi, M., 1998, Immunbiol. 199: 358–365). Der Mangel vom Typ II, mit normalen Spiegeln des C1-Inhibitor-Antigens, wird hauptsächlich durch Punktmutationen verursacht, die zur Expression eines nicht-funktionellen Proteins führen (Tosi, M., 1992, „Molecular genetics of C1 inhibitor and hereditary angioedema"; in: Complement in Health and Disease, 2. Aufl., Whaley, Loos und Weiler, Hrsg.). Die Diagnose kann bei Patienten auch gestellt werden, indem homozygote oder heterozygote Mutationen im C1-Inhibitor-Gen nachgewiesen werden. Die Diagnose wird vorzugsweise durch Nachweis eines C1-Inhibitor-Mangels oder durch DNA-Analyse gestellt, bevor Symptome auftreten. Bei Nachkommen von Familien, von denen bekannt ist, dass Mitglieder von ihnen an einem hereditären Angioödem leiden, ist es manchmal ratsam, eine prophylaktische Behandlung zu beginnen, noch bevor eine definitive Diagnose gestellt werden kann.
  • Arzneimittel
  • In einigen Verfahren wird der aus Milch oder einer anderen Quelle gereinigte menschliche C1-Inhibitor in gereinigter Form zusammen mit einem pharmazeutischen Träger als ein Arzneimittel verabreicht. Die bevorzugte Form hängt von der vorgesehenen Art der Verabreichung und therapeutischen Anwendung ab. Der pharmazeutische Träger kann ein beliebiger kompatibler, nicht-toxischer Stoff sein, der zum Verabreichen der Polypeptide an den Patienten geeignet ist. Als Träger können steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe verwendet werden. Außerdem können pharmazeutisch verträgliche Adjuvantien, Puffer, Dispergiermittel und dergleichen in die Arzneimittel eingearbeitet werden.
  • Die Konzentration des Inhibitors in dem Arzneimittel kann stark variieren, d. h. von weniger als etwa 0,1 Gew.-%, wobei sie üblicherweise mindestens etwa 1 Gew.-% beträgt, bis zu so viel wie 20 Gew.-% oder mehr.
  • Für eine orale Verabreichung kann der Wirkstoff in festen Dosierungsformen wie Kapseln, Tabletten und Pulvern oder in flüssigen Dosierungsformen wie Elixieren, Sirups und Suspensionen verabreicht werden. Der Wirkstoff (Die Wirkstoffe) kann (können) in Gelatinekapseln zusammen mit inaktiven Bestandteilen und pulverförmigen Trägern wie Glucose, Lactose, Saccharose, Mannit, Stärke, Cellulose oder Cellulosederivaten, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Natriumsaccharin, Talkum, Magnesiumcarbonat und dergleichen eingekapselt werden. Beispiele zusätzlicher inaktiver Bestandteile, die zugegeben werden können, um eine(n) wünschenswerte(n) Farbe, Geschmack, Stabilität, Pufferkapazität, Dispersion oder andere bekannte wünschenswerte Merkmale bereitzustellen, sind Eisenoxid, Kieselgel, Natriumlaurylsulfat, Titandioxid, essbare weiße Tinte und dergleichen. Genauso können Verdünnungsmittel verwendet werden, um gepresste Tabletten herzustellen. Sowohl Tabletten als auch Kapseln können als langzeitwirkende Produkte hergestellt werden, mit denen eine kontinuierliche Freisetzung des Medikaments über einen Zeitraum von Stunden bereitgestellt wird. Gepresste Tabletten können mit Zucker oder einem Film beschichtet sein, um einen unangenehmen Geschmack zu maskieren oder die Tablette vor der Atmosphäre zu schützen, oder sie können magensaftresistent beschichtet sein, um eine selektive Auflösung im Gastrointestinaltrakt zu ermöglichen. Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung können Farbstoffe und Geschmackstoffe enthalten, um die Akzeptanz durch den Patienten zu erhöhen.
  • Der C1-Inhibitor wird vorzugsweise parenteral verabreicht. C1-Inhibitor-Präparate für die parenterale Verabreichung müssen steril sein. Die Sterilisation wird einfach mittels Filtration durch sterile Filtermembranen vor oder nach der Gefriertrocknung und Rekonstitution erreicht. Die parenterale Route für die Verabreichung des C1-Inhibitors entspricht bekannten Verfahren, z. B. Injektion oder Infusion durch intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraoculäre, intraarterielle oder intraläsionale Routen. Der C1-Inhibitor wird kontinuierlich durch Infusion oder durch eine Bolus-Injektion verabreicht. Eine typische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion könnte so hergestellt werden, dass sie 100 bis 150 ml steriles 0,9% NaCl oder 5% Glucose, gegebenenfalls angereichert mit einer 20% Albuminlösung, und 100 bis 500 mg des C1-Inhibitors enthält. Ein typisches Arzneimittel für die intramuskuläre Injektion würde so hergestellt werden, dass es z. B. 1 bis 10 ml steriles gepuffertes Wasser und 1 bis 100 mg des C1-Inhibitors der vorliegenden Erfindung enthält. Verfahren zum Herstellen von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen sind dem Fachmann bekannt und werden in verschiedenen Werken noch ausführlicher beschrieben, einschließlich z. B. Remington's Pharmaceutical Science (15. Aufl., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen).
  • Therapeutische Verfahren
  • Die vorliegende Erfindung stellt wirksame Verfahren zum Behandeln eines C1-Inhibitor-Mangels unter Verwendung eines exogenen humanen C1-Inhibitors bereit. Der C1-Inhibitor kann auch zum Behandeln anderer Krankheiten eingesetzt werden, in denen die Komplementaktivität des klassischen Stoffwechsels (aktivierte C1-Komponente) und/oder die Aktivität des Kontaktsystems (Faktor XIIa, Kallikrein, Faktor XIa) zu unerwünschten Immun- oder Entzündungsantworten beiträgt/beitragen. Solche Krankheiten umfassen Myokardinfarkt ( WO 95/06479 ); erworbene systemische Entzündungsantworten, u. a. schwere Sepsis, septischer Schock, ARDS (Schocklunge), multiples Organversagen und Präeklampsie ( WO 92/22320 : Genentech Inc.); Kapillarleck-Syndrom und Kreislaufversagen in Fällen von schweren Verbrennungen, Polytraumata, Operationen mit Extrakorporalkreislauf ( EP 0586909 ), therapeutische Infusion eines Cytokins (z. B. IL2), akute Graft-versus-Host-Krankheit nach einer allogenen (oder autologen) Knochenmarktransplantation. Andere Indikationen können Störungen sein, bei denen überschüssiges Komplement der klassischen Route und/oder Kontaktaktivierung und/oder C1-Inhibitor-Verbrauch oder (relativer) Mangel des funktionellem C1-Inhibitors mit der Pathophysiologie in Zusammenhang gebracht wurde, wie Meningitis, rheumatoide Arthritis, hyperakute Transplantatabstoßung nach Allo- und Xenotransplantation und Pankreatitis.
  • Die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung werden üblicherweise intravenös verabreicht. Unter gewissen Umständen ist auch eine intradermale, intramuskuläre oder orale Verabreichung möglich. Die Zusammensetzungen können für eine prophylaktische Behandlung von Individuen, die an einer Krankheit leiden oder ein Risiko dafür haben, in einer Menge verabreicht werden, die ausreichend ist, um die anschließende Krankheit zu verhindern, zu verzögern oder ihre Schwere zu reduzieren. Für therapeutische Anwendungen werden die Arzneimittel an einen Patienten, der an einer etablierten Krankheit leidet, in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um die Schwere von Symptomen zu reduzieren und/oder eine weitere Entwicklung von Symptomen zu verhindern oder aufzuhalten. Eine Menge, die dafür geeignet ist, ist als eine „therapeutisch-" oder „prophylaktisch-wirksame Dosis" definiert. Solche wirksamen Dosierungen hängen von der Schwere des Leidens und vom allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten ab. Eine wirksame Dosis ist diejenige, die erforderlich ist, um eine Plasmakonzentration von mindestens etwa 50 μg des funktionellen C1-Inhibitors pro ml Plasma, vorzugsweise von mindestens etwa 100 μg des funktionellen C1-Inhibitors pro ml Plasma, stärker bevorzugt von mindestens etwa 200 μg des funktionellen C1-Inhibitors pro ml Plasma und am stärksten bevorzugt von mindestens etwa 250 μg des funktionellen C1-Inhibitors pro ml Plasma, zu erreichen. Typischerweise werden diese Plasmakonzentrationen des funktionellen C1-Inhibitors mindestens eine Stunde, vorzugsweise mindestens vier Stunden, stärker bevorzugt mindestens 12 Stunden und am stärksten bevorzugt mindestens 24 Stunden aufrechterhalten.
  • In den vorliegenden Verfahren wird der C1-Inhibitor üblicherweise in einer Dosis von etwa 10 mg/kg Körpergewicht des Patienten oder mehr pro Woche an einen Patienten verabreicht. Häufig liegen die Dosierungen über 10 mg/kg pro Woche. Dosierungsschemata können im Bereich von 10 mg/kg pro Woche bis mindestens 1000 mg/kg pro Woche liegen. Typischerweise betragen Dosierungsschemata 10 mg/kg pro Woche, 20 mg/kg pro Woche, 30 mg/kg pro Woche, 40 mg/kg pro Woche, 60 mg/kg pro Woche, 80 mg/kg pro Woche und 120 mg/kg pro Woche. In bevorzugten Schemata werden 10 mg/kg, 20 mg/kg oder 40 mg/kg einmal, zweimal oder dreimal pro Woche verabreicht. Die Behandlung wird typischerweise mindestens vier Wochen, manchmal 24 Wochen und manchmal das ganze Leben des Patienten fortgesetzt. Die Behandlung wird vorzugsweise durch die intravenöse Route verabreicht. Gegebenenfalls werden die Spiegel des C1-Inhibitors nach der Behandlung überwacht (z. B. im Plasma), und eine weitere Dosis wird verabreicht, wenn nachgewiesene Spiegel wesentlich unter z. B. weniger als 40%, weniger als 30% oder weniger als 20% der Werte in normalen Personen fallen. Alternativ kann es bei einigen Zuständen wünschenswert sein, höhere als normale Werte zu erreichen, z. B. 150% der normalen Spiegel, 200% der normalen Spiegel oder sogar 300% der normalen Spiegel.
  • Andere Anwendungen
  • Ein in der Milch von transgenen Tieren produzierter menschlicher C1-Inhibitor hat eine Reihe von anderen Anwendungsmöglichkeiten. Z. B. kann der C1-Inhibitor als Kontrollreagens in Kits für die in vitro-Diagnose der endogenen C1-Inhibitor-Aktivität eingesetzt werden. Alternativ kann der C1-Inhibitor an extrakorporalen Vorrichtungen immobilisiert werden, um Anti-C1-Inhibitor-Antikörper selektiv aus Patienten zu entfernen.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Konstruktion von Transgenen
  • A. Überlappende genomische Konstrukte (CINH1)
  • Ein Satz von zwei Expressionsvektoren wurde konstruiert, die überlappende Teile der genomischen Sequenz des menschlichen C1-Inhibitor-Gens enthielten. Zusammen enthalten diese Plasmide den αS1-Casein-Promotor des Rindes und die komplette genomische Sequenz des menschlichen C1-Inhibitors. Alle verwendeten C1-Inhibitor-Fragmente stammten von dem P1-Clon DMDC-HFF#1-1112-69, der von Genome Systems Inc. (8620 Pennell Drive, St. Louis, Missouri 63114) erhalten wurde und der aus einer menschlichen genomischen P1-Bank durch PCR mit zwei C1-Inhibitor-spezifischen Primern isoliert worden war (Anhang 1A).
  • Das Plasmid pαS1/5'C1, das 6,3 kb von regulatorischen Sequenzen des αS1-Casein des Rindes, fusioniert an den 5'-Teil des C1-Inhibitor-Gens, einschließt, wurde wie folgt konstruiert. Zuerst wurde pKUN1 [Konings, 1996, Gene 46: 269–276] mit EcoRI und SalI gespalten und an Linker 1 (Anhang 1B) ligiert, worauf die Entfernung der ClaI-Stelle durch Auffüllen mit Klenow und Ligierung folgte. Aus dem resultierenden Plasmid pKUN2ΔC wurde pKUN2ΔCNBS hergestellt, indem der Linker 2 (Anhang 1C) in die NotI- und SalI-Stellen ligiert wurde. Der Linker 2 stellte eine ClaI-Stelle, 19 bp des Exons 1 von αS1-Casein (wobei das erste C zu einem T mutiert ist, um eine Methylierung der ClaI-Stelle zu verhindern), die 6 bp, die normalerweise die Translations-Startstelle ATG des C1-Inhibitors flankieren, und eine SfiI-Stelle bereit, die mit der BglI-Stelle im C1-Inhibitor-Gen kompatibel war, welche das ATG überlappt. Danach wurde der Linker 3 (Anhang 1D) in die SfiI- und MluI-Stellen von pKUN2ΔCNBS ligiert, wodurch das Plasmid pKUN2ΔCEV entstand. Der Linker 3 führte eine zweite SfiI-Stelle, die zu der nächsten BglI-Stelle im C1-Inhibitor-Gen kompatibel war, in Position 4,8 kb stromabwärts des ATG, und eine NotI-Stelle ein. Anschließend wurde das 4,8-kb-BglI-Fragment aus dem P1-Clon (vorstehend) in die dephosphorylierten SfiI-Stellen von Plasmid pKUN2ΔCEV ligiert, wodurch pK-BglI-C1 erhalten wurde. In diesem Konstrukt fehlen Exon 1 und die ersten 16 bp aus Exon 2, die zusammen den Großteil der 5'-UTR (untranslatierten Region) des C1-Inhibitors bilden, jedoch enthält es noch das Translations-Startcodon ATG, das in Exon 2 liegt. Aus diesem Plasmid wurde das 4,85 kb große ClaI-SalI-Fragment in Plasmid p(–8kb,CS) (Patentanmeldung WO 93/25567 ) cloniert, wodurch Plasmid pαS1/5'-C1 erhalten wurde. Dieses verbindet das C1-Inhibitor-Fragment mit dem 6,2 kb großen NotI-ClaI-Promotor-Fragment des Rinder-αS1-Caseins, welches die ersten 20 bp aus dem Exon 1 des αS1-Caseins (EMBL-Datenbank, Hinterlegungsnummer X59856; [Koczan, 1991, Nucleic Acids Res. 19: 5591–5596]) einschließt, direkt flankiert durch die ClaI-Stelle, die im Clonierungsschritt verwendet wurde.
  • Der zweite Vektor, pIC20R/3'-C1 wurde durch Spaltung des P1-Clons (vorstehend) mit SpeI hergestellt, worauf eine Ligierung des 20 kb großen SpeI-Fragments, enthaltend die Exons 4 bis 8 plus etwa 5,5 kb der 3'-flankierenden DNA, in die dephosphorylierte XbaI-Stelle von pIC20R [Marsh, 1984, Gene 32: 481–485] folgte. Die Überlappung zwischen pαS1/5'-C1 und pIC20R/3'-C1 betrug 2,0 kb.
  • B. Einzelnes genomisches Konstrukt (CINH2)
  • Außerdem wurde ein einzelnes Konstrukt hergestellt, welches das vollständige menschliche C1-Inhibitor-Gen, fusioniert an den Rinder-αS1-Casein-Promotor, enthielt. Zuerst wurde das Plasmid pK-BglI-C1-Inhibitor (vorstehend) mit SpeI und SalI gespalten und an Linker 4 (Anhang 1E) ligiert, wodurch das Plasmid pK-BgSpL-C1 erhalten wurde. Danach wurde das 20 kb große SpeI-Fragment aus dem P1-Clon (vorstehend) in pK-BgSpL-C1, gespalten mit SpeI und dephosphoryliert, cloniert. Aus dem resultierenden Vektor, der mit pCBSpeIC1 bezeichnet wurde, wurde ein 22 kb großes ClaI-SalI-Fragment, das die gesamte codierende Region des C1-Inhibitors plus 5,5 kb einer flankierenden 3'-DNA enthielt, in p(–8kb,CS) (vorstehend), gespalten mit ClaI und SalI, ligiert. Das endgültige Konstrukt wurde mit p6,2C1-INH2 bezeichnet.
  • Beispiel 2: Transgenese
  • A. Überlappende Konstrukte (CINH1) in Mäusen
  • Transgene Mäuse wurden durch Vorkern-Injektion von befruchteten Eizellen, im Wesentlichen wie von Hogan et al., 1986, „Manipulating the Mouse Embryo", Cold Spring Harbor Press NY, beschrieben, hergestellt. pαS1-5'C1 (vgl. 1A) wurde mit NotI gespalten, wodurch ein 11,3-kb-Fragment erhalten wurde, das durch Gelreinigung und Elektroelution isoliert wurde. Genauso wurde ein 15,8 kb großes ScaI-EcoRV-Fragment aus pIC20R/3'-C1 hergestellt, das sich von Intron 3 bis 2 kb hinter das letzte Exon erstreckte. Beide Fragmente wurden kombiniert (bei einer Konzentration von 3 ng/μl) und in den Vorkern von befruchteten Maus-Eizellen injiziert, diese wurden in den Uterus von scheinträchtigen Maus-Leihmüttern implantiert. Die Nachkommen wurden durch Southern-Blot-Verfahren mit der aus gestutzten Schwänzen isolierten DNA auf den Einbau des genomischen Genkonstrukts des menschlichen C1-Inhibitors analysiert. Auf den Southern-Blots und durch PCR wurde untersucht, ob eine korrekte homologe Rekombination zwischen den überlappenden Fragmenten erfolgt ist. 33 transgene Mäuse wurden erhalten, von denen 31 korrekt rekombinierte Transgene enthielten. 17 dieser 31 Mäuse wurden unter Verwendung einer FISH-Analyse für die weitere Zucht ausgewählt, wobei Tiere mit mehreren Integrationsstellen und/oder einem hohen Ausmaß an genetischem Mosaik („mosaicism") ausgeschlossen wurden.
  • B. Einzelnes genomisches Konstrukt (CINH2) in Mäusen
  • p6,2C1-INH2 wurde mit NotI und SalI gespalten, wodurch ein 28,2-kb-Fragment erhalten wurde (1B). Eine Lösung dieses Fragments bei einer Konzentration von 3 ng/μl wurde für die Mikroinjektion in Eizellen der Maus, wie vorstehend beschrieben, verwendet. 30 transgene Mäuse wurden erhalten, von denen 12 durch FISH-Analyse für die weitere Züchtung ausgewählt wurden.
  • C. Einzelnes genomisches Konstrukt (CINH2) in Kaninchen
  • Transgene Kaninchen wurden gemäß dem folgenden Protokoll erzeugt. Jedes weibliche Spendertier (New Zealand White) wurde drei Tage subkutan mit Schweine-FSH (Sigma) behandelt. Am ersten und zweiten Tag wurden 0,5 E etwa um 8 Uhr früh und um 6 Uhr abends injiziert. Am dritten Tag wurden 0,5 E etwa um 8 Uhr früh und um 11 Uhr abends injiziert. Am vierten Tag ließ man die Paarung der Weibchen um 2 Uhr nachmittags zu (mit New Zealand White-Männchen). Direkt nach der Paarung wurden den Weibchen intramuskulär 150 E Pregnil (humanes; Organon) injiziert. Am fünften Tag wurden die Spendertiere um 9 Uhr früh durch eine intravenöse Injektion von T61 (Hoechst Roussel Vet) getötet und die Embryos durch Spülung gewonnen. Aufgrund des relativ langen Abstands zwischen der Paarung und dem Töten der Tiere war es weder erforderlich, die Embryos mit Hyaluronidase zu behandeln, noch war eine Mikrodissektion nötig, um umgebende Zellen zu entfernen, die spontan freigesetzt wurden. Die Embryos wurden bei 39°C in RD-Medium gehalten (1:1 (Vol./Vol.) Gemisch von RPMI-1640 und Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (Modifikation mit hohem Glucosegehalt), angereichert mit 100 E Penicillin-G pro ml, 100 mg Streptomycinsulfat pro ml und 15 mg Fraktion V BSA pro ml; Carney, E. W., und Foote, R. H., 1991, J. Reprod. Fert. 91: 113–123). Sofort wurden Mikroinjektionen (2 bis 3 Pikoliter pro Eizelle) durchgeführt und die Embryos in beide Eileiter (10 bis 15 Embryos auf jeder Seite) von Empfängerweibchen implantiert. Die Empfängerweibchen wurden durch subkutane Injektion von 15 E Folligon des Pferdes (Intervet) am Tag 2 vorbereitet. Am vierten Tag erhielten die Empfängerweibchen eine intramuskuläre Injektion mit 0,33 ml Receptal (0,0014 mg Buserelini, Hoechst Roussel, Vet.).
  • Anfangs wurden einige wenige Kaninchen unter Verwendung der überlappenden Konstrukte erzeugt. Die PCR-Analyse zeigte, dass nicht nur das korrekt rekombinierte Transgen vorlag, sondern auch nicht-rekombinierte, ligierte 5'- und 3'-Fragmente. In einer solchen Konfiguration ist Exon 4 dupliziert. Umgelagerte Kopien des Transgens sind unerwünscht, da sie möglicherweise anomale Transkripte und somit abweichende Proteinmoleküle hervorbringen können. Deshalb wurde entschieden, für die Erzeugung transgener Kaninchen zur kommerziellen Produktion des C1-Inhibitors nur das einzelne genomische Konstrukt zu verwenden.
  • p6,2C1-INH2 wurde mit NotI und SalI gespalten, wodurch ein 28,2-kb-Fragment erhalten wurde (1B). Eine Lösung dieses Fragments mit einer Konzentration von 3 ng/μl wurde für die Mikroinjektion in befruchtete Kaninchen-Eizellen verwendet. Zehn transgene Kaninchen wurden erzeugt und durch PCR, Southern-Blot und FISH analysiert. Eine Linie (3358) enthielt keine vollständige Kopie des Transgens. Die restlichen neun Linien wurden alle gezüchtet, um Milch für die Expressionsanalyse zu erhalten.
  • Beispiel 3: Analyse des C1-Inhibitors in der Milch von transgenen Tieren
  • A, B: Überlappende und einzelne genomische Konstrukte in Mäusen (CINH1 und CINH2)
  • Die Milch von transgenen Mäusen und nicht-transgenen Kontrollen wurde durch einen enzymverbundenen Radioimmuntest analysiert (eine Beschreibung des ELISA findet sich in Anhang 2; die Expressionsdaten finden sich in den Tabellen 1, 2 und 3). Der ELISA misst die Gesamtmengen des C1-Inhibitors (sowohl aktiv als auch inaktiv). Die durchschnittlichen Spiegel des C1-Inhibitors, die in den transgenen Mäusen erhalten wurden, welche mit den überlappenden Fragmenten hergestellt worden waren, lagen im Bereich von 0,04 bis 5 mg/ml. Einige einzelne Proben der produktivsten Linien enthielten mehr als 20 mg/ml. Die durchschnittlichen Spiegel des C1-Inhibitors, die in den transgenen Mäusen erhalten wurden, welche mit dem einzelnen Fragment hergestellt worden waren, lagen im Bereich von 0,1 μg/ml bis 10 mg/ml. Einige einzelne Proben der produktivsten Linie (5903) enthielten mehr als 20 mg/ml. Tabelle 1: Expressionsdaten des C1-Inhibitors von rH-C1INH1-Mauslinien
    Linie Nr. Anzahl d. Einbaustellen Sublinie C1-Inhibitor-Expression F1 μg/ml1
    Durchschnitt2 Max3
    5394 1 6 17
    5395 1 7282 10830
    5396 1 803 1290
    5398 1 39 123
    5399 2 A 28 46
    B 131 411
    5400 1 9838 21902
    5401 1 12 30
    5402 1 855 2739
    5403 1 < 1 < 1
    5404 1 505 1632
    5405 2 A 2 5
    B 1 2
    5406 2 A 2768 6500
    B 2478 3236
    5408 1 32 73
    5410 2 A 52 136
    B 3344 4345
    doppelter Einbau 3344 5099
    • 1 Die Expressionsraten wurden durch ELISA bestimmt (Anhang 2A).
    • 2 Die durchschnittliche Expression von Milchproben vom Tag 6, 9 und 12 nach der Geburt von zwei Laktationsperioden aus allen F1-Mäusen einer bestimmten Linie.
    • 3 Die höchste Expression, die in den Milchproben von allen F1-Mäusen einer bestimmten Linie gefunden wurde.
    Tabelle 2: Expressionsdaten des C1-Inhibitors von rH-C1INH2-Mauslinien
    Linie Nr.1 C1-inhibitor-Expression F1 μg/ml2
    Durchschn.3 max4
    5895 485 902
    5896 1617 5749
    5897 0.2 0.3
    5898 0.1 0.1
    5899 0.1 0.2
    5900 91 264
    5902 0.4 1
    5903 9721 24516
    5904 46 151
    5905 32 149
    5906 1.3 3
    5907 62 257
    • 1 Alle Linien enthielten aufgrund der Vorselektion durch FISH eine einzelne Transgen-Einbaustelle.
    • 2 Die Expressionsraten wurden durch ELISA bestimmt (Anhang 2A).
    • 3 Die durchschnittliche Expression von Milchproben vom Tag 6, 9 und 12 nach der Geburt von zwei Laktationsperioden aus allen F1-Mäusen einer bestimmten Linie.
    • 4 Die höchste Expression, die in den Milchproben von allen F1-Mäusen einer bestimmten Linie gefunden wurde.
    Tabelle 3: Zusammenfassung der Expressionsdaten von rH-C1INH1- und rH-C1INH2-Mauslinien
    Konstrukt Anzahl der exprimierenden Linien (%)1
    > 1 mg/ml 0.1 > < 1 mg/ml < 0.1 mg/ml
    C1INH1 6/19 (31.6) 4/19 (21.0) 9/19 (47.4)
    C1INH2 2/12 (16.7) 2/12 (16.7) 8/12 (66.7)
    • 1 Anzahl der Linien, geteilt durch die Gesamtzahl der Linien.
  • C. Einzelnes genomisches Konstrukt in Kaninchen
  • Milch von transgenen Kaninchen und nicht-transgenen Kontrollen wurde durch zwei verschiedene Tests analysiert (die Beschreibung dieser ELISAs findet sich in Anhang 2B; die Expressionsdaten finden sich in Tabelle 4). Durch den ELISA wird die Gesamtmenge des in der Milch vorliegenden antigenen C1-Inhibitor-Proteins gemessen, wohingegen durch den C1-Inhibitor-Aktivitätstest die Menge des funktionell aktiven C1-Inhibitors gemessen wird. Die durchschnittlichen Spiegel des aktiven C1-Inhibitors, die in den transgenen Kaninchen erhalten wurden, lagen im Bereich von 0,05 bis 20 mg/ml. Einige einzelne Proben der produktivsten Linien enthielten mehr als 25 mg/ml. Tabelle 4: rH-C1INH-Kaninchen-Gründer: Kopienzahlen und Expressionsraten des Transgens (Proteingehalt und Aktivität)
    Linie Tier Geschl. G1 Anz. Einbaustellen2 Chrom. Kopie Expression (g/l)4 Aktivität (g/l)5
    # # Arm.2 #3 L1 L2 L3 L1 L2
    1775 1775 M F0 1 4.5 NA NA NA NA NA
    3459 F F1 1 4.5 2,1 (9) 2,4 (2)
    3461 F F1 1 4.5 2,5 (13) 1,9 (9) 2.1 (3)
    3321 F F1 2,0 (16) 1,8 (14) 1,3 (1) 1,9 (4) 1,7 (3)
    3334 F F1 2,3 (12) 1,6 (6) 2,2 (1) 1,9 (3)
    3493 F F1 1,9 (13) 1,8 (12) 1,5 (3)
    2069 2069 F F0 1 ? 0,025
    2972 2972 M F0 2 p + q ? NA NA NA NA NA
    3632 M F1 1 p 6.0°
    3677 F F1 1 p 12,6 (13) 13,9 (16) 12,4 (6) 16,3 (9)
    3804 F F1 1 p 20,3 (2)
    3806 F F1 1 p 13,6 (14) 13,9 (9)
    4461 F F2 1 p 18.2 (8)
    3679 F F1 1 q 6,5 (14) 6.5 (17) 7,5 (15) 5,4 (9)
    4038 F F1 2 ? 7,8 (5)
    3586 M F1 1 q 8.0
    3674 F F1 1 q 8.0
    3676 F F1 2 p + q 18,8 (13) 17,6 (7) 21,9 (9)
    3735 F F1 2 p + q 16,2 (6) 17.2 (4)
    4042 F F1 2 p + q 17,3 (9)
    2977 2977 M 2 p + q 16 + ? NA NA NA NA NA
    3748 F F1 1 p 0,5 (3)
    3773 F F1 1 p 1,2 (10)
    3778 F F1 1 q 16 15,7 (12) 18,6 (9)
    3597 F F1 2 p + q 12,7 (14) 13,2 (7) 13,9 (9)
    3023 3023 M F0 1 3 NA NA NA NA NA
    3640 F F1 0,45 (8)
    3802 F F1 1 3 0,215
    3659 F F1 0,26 (7)
    3024 3024 M F0 1 3 NA NA NA NA NA
    3802 F 0.28 (3)
    3824 F F1 1 4.5 0,72 (3)
    3832 F F1 0,34 (2)
    3836 F F1 0,14 (2)
    3951 F F1 0,68 (1)
    3958 F F1 0,24 (1)
    3368 3368 F F0 1 7 1,2 (19) 1 (17) 1,2 (9) 0,65 (2)
    3370 3370 M F0 8 NA NA NA NA NA
    3376 3376 M F0 1 5.5 NA NA NA NA NA
    4253 F F1 13,2 (13)
    3558 3558 F F0 1 0.5
    • 1 = Generation;
    • 2 = bestimmt durch Metaphasen-FISH;
    • 3 = bestimmt durch Faser-FISH („FiberFISH");
    • 4 = Konzentration von C1-Inhibitor-Antigen (Anhang 2B I); Durchschnitt von (n) Proben;
    • 5 = Konzentration von funktionell aktivem C1-Inhibitor (Anhang 2B II); Durchschnitt von (n) Proben;
    • 6 = sechs vollständige und zwei halbe Kopien liegen vor;
    • 7 = keine vollständige Kopie liegt vor.
  • Beispiel 4: Reinigung eines rekombinanten menschlichen C1INH aus Kaninchenmilch
  • Das Vorliegen von R-C1INH in Milch wurde durch Immunblot-Verfahren und SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen bestätigt, die nach Reinigung aus nicht-transgener Kaninchenmilch erhalten wurden. Aus dem abgeschätzten Spiegel von R-C1INH und der Konzentration von rH-C1INH in transgener Milch wurde gefolgert, dass eine Trennung erforderlich war. Die Trennung von rH-C1INH von R-C1INH wurde unter Verwendung einer Anionenaustausch-Chromatographie auf Q-Sepharose (Pharmacia) bei pH 5,5 und 7,0 erreicht. Der Unterschied in der Elution betrug etwa 0,1 M Natriumchlorid, dieser Unterschied war für die Herstellung groß genug.
  • Transgene Kaninchenmilch von der Linie 2972p mit einer rH-C1INH-Konzentration von 15 g/l wurde aufgetaut, vereinigt und mit 1 Volumen von 20 mM Natriumcitrat, pH 5,5, verdünnt. Der pH-Wert betrug nach der Verdünnung 7,0. Die verdünnte Milch wurde anschließend über ein 25-μm-Polygard®-Filter (Millipore) filtriert und durch kontinuierliche Zentrifugation bei Raumtemperatur entrahmt. 200 Milliliter der entrahmten Milch wurden auf eine Säule mit großen SP-Sepharose-Perlen (Pharmacia) (50/15) aufgetragen, die in 20 mM Natriumcitrat, pH 7,0, plus 0,05 M Natriumchlorid äquilibriert war. Die lineare Fließrate betrug 60 cm/h. Nach dem Auftragen wurde die Säule mit fünf Säulenvolumina von 20 mM Natriumcitrat, pH 7,0, plus 0,05 M Natriumchlorid gewaschen, und der gebundene rH-C1INH wurde mit einem Schritt von 20 mM Natriumcitrat, pH 7,0, plus 0,2 M Natriumchlorid eluiert. Der eluierte rH-C1INH wurde durch 0,22 μm filtriert, in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, dreifach verdünnt und mit einer linearen Fließrate von 60 cm/h auf eine Q-Sepharose-Hochleistungs-Säule (Pharmacia) (50/20) aufgetragen, die in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,05 M Natriumchlorid äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit zehn Volumina 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,05 M Natriumchlorid bei einer linearen Fließrate von 90 cm/h wurde der gebundene rH-C1INH mit einem Schritt von 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,25 M Natriumchlorid eluiert. Die lineare Fließrate während der Elution betrug 60 cm/h. Die rH-C1INH-Fraktion wurde anschließend auf eine Zink-geladene Chelating Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia) (50/15) mit einer linearen Fließrate von 60 cm/h in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,25 M Natriumchlorid aufgetragen. Die Proteinfraktion, die durch die Säule nicht adsorbiert worden war, wurde eingeengt und der Puffer unter Verwendung einer 50 cm2-Biomay-30-Membran (Millipore) gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ausgetauscht. Der eingeengte rH-C1INH wurde durch 0,22 μm filtriert, in Aliquots geteilt und unter –70°C gelagert.
  • Die Ausbeute dieses Prozesses wurde unter Verwendung eines spezifischen ELISA für rH-C1INH überwacht und betrug etwa 40%. Außerdem blieb die Aktivität von rH-C1INH während der ganzen Reinigung bestehen, dies wurde durch die Hemmung von C1s bestimmt. Die Reinheit wurde durch SDS-PAGE und Größenausschluss-Chromatographie auf über 99% und unter Verwendung eines spezifischen ELISA, der in Kaninchenmilch vorliegende Wirtsproteine nachweist, auf über 99,95% bestimmt.
  • Bestimmung der Reinheit von rH-C1INH-Präparaten
  • Größenausschluss-Chromatographie
  • Gereinigter rH-C1INH (100 μl, 2 mg/ml) wurde durch eine Superose 12 HR 10/30-Gelfiltrations-Säule (Pharmacia) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung plus 0,15 M Natriumchlorid mit einer Fließrate von 0,5 ml/min filtriert (Äkta Explorer 10-System, Pharmacia). Das eluierte Proteine wurde durch Absorption bei 205 nm nachgewiesen. Der prozentuale Anteil der eluierenden Peaks wurde durch Integration unter Verwendung der Software Unicorn (Pharmacia) bestimmt.
  • Nachweis der mit dem Wirt zusammenhängenden Verunreinigung
  • Das relative Vorliegen von mit dem Wirt zusammenhängenden Verunreinigungen (HRI) im Endprodukt wurde durch einen quantitativen Enzymimmuntest (ELISA) bestimmt. Polyclonale Antikörper, die an den menschlichen C1-Inhibitor binden, ohne an den Kaninchen-C1-Inhibitor zu binden, wurde durch Immunisieren von Kaninchen mit menschlichem C1-Inhibitor erzeugt. Spezifische Antikörper gegen Kaninchenmilch-Proteine wurden durch Immunisieren von Schafen und Ziegen mit Milch- und Molkeproteinen erzeugt. Die Spezifität der Antiseren wurde durch Western-Blot-Analyse untersucht. Diejenigen Antiseren, die mit den meisten, wenn nicht mit allen Kaninchen-Milchproteinen reagierten, wurden ausgewählt. Die gesamte IgG-Fraktion wurde auf Protein-G-Sepharose gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pharmacia) gereinigt. Das gereinigte IgG wurde für die Entwicklung des Sandwich-ELISA verwendet.
  • Mikrotiterplatten (Polysorp, Nunc) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 5 μg/ml gereinigtem IgG in 0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,4, beschichtet. Nach Waschen mit PBS, 0,02% Tween-20 wurden die Vertiefungen mit Proben, die in PBS, 0,3% BSA, 0,1% Tween-20, 10 mM EDTA verdünnt waren, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen mit PBS, 0,02% Tween-20 wurden die Vertiefungen mit Peroxidase-markiertem IgG (1:2000 in PBS, 0,3% BSA, 0,1% Tween-20) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem weiteren Waschgang wurde Substratlösung (ImmunoPure TMB Substrate Kit, Pierce) zugegeben. Die Umwandlung des Substrat wurde durch die Zugabe von 2 M H2SO4 gestoppt und die Platten bei 450 nm in dem Pattenlesegerät SLT 340 ATTC (SLT Labinstruments) unter Verwendung der Software BIOLISE abgelesen. Alle Inkubationen wurden mit Volumina von 100 μl durchgeführt.
  • Die Gesamtmenge der mit dem Wirt zusammenhängenden Verunreinigungen, ausgedrückt als „parts per million" (ppm) auf Gewicht-zu-Gewicht-Basis, wurde aus der Reaktivität von gereinigten rH-C1INH-Proben im Vergleich mit einem Milchstandard berechnet, von dem die gesamte Proteinkonzentration durch den Bicinchinonic-Assay (Pierce) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt wurde.
  • Für Kontrollzwecke wurde der Kaninchen-C1-Inhibitor aus Kaninchenplasma gereinigt. Die Reinigung erfolgte durch Fällung mit Polyethylenglykol, Einfangen durch Kationenaustausch-Chromatographie, unmittelbare Reinigung des Zwischenprodukts durch Lektin-Affinitäts-Chromatographie und Endreinigung durch Anionenaustausch-Chromatographie.
  • Beispiel 5: Reinigung eines rekombinanten C1-Inhibitors aus der Milch von verschiedenen transgenen Gründerkaninchen
  • Milchpools aus den Linien 2972q, 2972p und 2977q wurden mit gleichen Volumina von 20 mM Natriumcitrat, pH 5,5, gemischt, und danach wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Die verdünnte Milch wurde durch Zentrifugation bei 1300 g, 20 Minuten, bei 4°C entfettet und anschließend einer Kationenaustausch-Chromatographie auf einer SP-Sepharose-Säule, die in 20 mM Natriumcitrat, pH 7,0 (Puffer A), äquilibriert war, unterworfen. Nach dem Beladen wurde die Säule mit Puffer A gewaschen und gebundene Proteine wurden mit 0,15 M Natriumchlorid in Puffer A mit einer linearen Fließrate von 60 cm/h eluiert. Die eluierten Fraktionen, die den C1-Inhibitor enthielten, wie durch den spezifischen ELISA bestimmt wurde (vgl. Anhang 2B I), wurden vereinigt und mikrofiltriert (0,45 μm), worauf eine Filtration durch eine Superdex 200-Gelfiltrations-Säule folgte (in 20 mM Natriumphosphat, enthaltend 0,15 M NaCl, bei einer linearen Fließrate von 15 cm/h). C1-Inhibitor-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, in Aliquots geteilt und bei unter –50°C gelagert. Die Ausbeute von jedem Schritt wurde bestimmt und lag jeweils über 90%. Die Reinheit, die unter Verwendung der quantitativen SDS-PAGE bestimmt wurde (vgl. Anhang 3), lag über 98%.
  • Cetor® (= C1-Inhibitor, gereinigt aus gepooltem menschlichem Plasma, CLB, Niederlande), das in Charakterisierungsstudien als Kontrolle eingesetzt wurde, wurde auch auf Superdex 200 unter den gleichen Bedingungen, wie vorstehend erwähnt, filtriert.
  • Beispiel 6: Charakterisierung der verschiedenen rekombinanten C1-Inhibitor- Präparate
  • Funktionalitätsindex
  • In Tabelle 5 ist der Funktionalitätsindex (FI) angegeben, der als das Verhältnis zwischen funktionell aktivem C1-Inhibitor und Gesamt-C1-Inhibitor-Antigen definiert ist. Die Menge des Gesamt-C1-Inhibitor-Antigens wird unter Verwendung eines ELISA, wie in Anhang 2BI, beschrieben gemessen. Die Menge des funktionell aktiven C1INH wird unter Verwendung des C1INH-Aktivitätstest wie, in Anhang 2BII beschrieben, bestimmt. Tabelle 5: Funktionalitätsindex (FI) der verschiedenen C1INH-Präparate
    C1INH-Präparat Gesamt-C1INH-Antigen (mg/ml) funktionell aktiver C1INH (mg/ml) FI
    Cetor® 0,86 0,92 1,07
    2972 p 1,56 1,79 1,15
    2972 q 1,69 1,80 1,07
    2977 q 2,04 1,85 0,91
  • SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen
  • Die verschiedenen C1-Inhibitor-Präparate wurden mittels 4 bis 20% SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Alle C1-Inhibitor-Präparate laufen sowohl unter reduzierenden als auch unter nichtreduzierenden Bedingungen als eine einzelne Bande, und die Banden werden auf Western-Blots durch Kaninchen-Anti-C1-Inhibitor-Antikörper (DAKO, A0253) erkannt.
  • Unter nicht-reduzierenden Bedingungen hat Cetor® ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 105 kDa, wohingegen die drei verschiedenen C1-Inhibitoren alle ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 96 kDa aufweisen.
  • Unter reduzierenden Bedingungen betragen die offensichtlichen Molekulargewichte für Cetor® etwa 95 kDa und für die rekombinanten C1INH-Präparate 80 kDa.
  • Analysen der C-terminale Sequenz
  • Die Sequenzanalyse wurde durch C-terminalen Abbau (Boyd, V. L., et al., 1992, Anal. Biochem. 206: 344–352; Boyd, V. L., et al., 1995, J. Organic Chem. 60: 2581–2587) mit einem automatischen Sequenziergerät (Modell 477A, Applied Biosystems) unter Verwendung von Protokollen, Reagenzien, Chemikalien und Material von Applied Biosystems (Warrington, UK, und Foster City, Kalifornien, USA) durchgeführt. Schrittweise freigesetzte ATH-Aminosäuren wurden mit einer on-Line-HPLC (Modell 120A, Applied Biosystems) auf der Basis ihrer Elutionszeiten identifiziert.
  • In den verschiedenen rekombinanten C1-Inhibitor-Präparaten und in Cetor® wurden identische C-terminale Sequenzen gefunden. In jeder Probe zeigte die Hauptsequenz ein Ala am C-Terminus. Aufgrund von Einschränkungen des Analyseverfahrens konnten Aminosäuren an der Position 2 bis 4 (beginnend vom C-Terminus aus) nicht bestimmt werden. Die Analyse der schwächeren Signale zeigt, dass in den verschiedenen rekombinanten C1-Inhibitor-Präparaten und Cetor® keine offensichtliche C-terminale Heterogenität vorliegt.
  • Beispiel 7: Reinigung eines rekombinanten menschlichen C1INH aus Milch im 10 Liter-Maßstab
  • Gefrorene Milch von der Linie 2972p, insgesamt 11 kg, wurde gefroren gelagert, aufgetaut und vereinigt. Nach dem Auftauen wurde eine gleiche Menge von 20 mM Natriumcitrat, pH 5,5, zugegeben. Die verdünnte Milch wurde über 25 μm filtriert, und durch kontinuierliche Zentrifugation bei Raumtemperatur entrahmt. Die entrahmte Milch wurde anschließend auf eine Säule mit großen SP-Sepharose-Perlen (Pharmacia, Schweden) (450/15) mit einer Fließrate von 60 cm/h aufgetragen, die in 20 mM Natriumcitrat, pH 7,0, plus 0,02 M Natriumchlorid äquilibriert war. Nach dem Beladen wurde die Säule mit fünf Säulenvolumina von 20 mM Natriumcitrat, pH 7,0, plus 0,02 M Natriumchlorid gewaschen und der gebundene rH-C1INH mit einem Schritt von 20 mM Natriumcitrat, pH 7,0, plus 0,2 M Natriumchlorid eluiert. Der eluierte rH-C1INH wurde durch 0,2 μm filtriert und sechs Stunden bei 25°C in Gegenwart von 1% Tween 80 (Merck, Deutschland) und 0,3% Tri-(n)-butylphosphat (Merck, Deutschland) inkubiert, um umhüllte Viren zu inaktivieren. Nach der Virus-Inaktivierung wurde der Pool in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, dreifach verdünnt, über 0,2 μm filtriert und mit einer Fließrate von 60 cm/h auf eine Q-Sepharose-Hochleistungs-Säule (Pharmacia, Schweden) (450/15) aufgetragen, die in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,05 M Natriumchlorid äquilibriert war. Nach Waschen der Säule mit fünf Säulenvolumina von 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,05 M Natriumchlorid wurde der gebundene rH-C1INH wurde mit einem Schritt von 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,22 M Natriumchlorid eluiert. Das Q-Sepharose-Eluat wurde anschließend in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, zweifach verdünnt, durch 0,2 μm filtriert und mit einer Fließrate von 30 cm/h auf eine mit Zink beladene Chelating Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia, Schweden) (450/15) aufgetragen, die in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,1 M Natriumchlorid äquilibriert war. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, plus 0,1 M NaCl gewaschen und die Proteinfraktion, die nicht von der Säule adsorbiert wurde, gewonnen. Diese Proteinfraktion wurde weiter über 0,2 μm filtriert, worauf eine Filtration über eine Vira/Gard 500-Membran (AG/T, USA) folgte, um mögliche virale Verunreinigungen zu entfernen. In einem späteren Experiment wurde die Vira/Gard-Membran durch ein Planova 15N-Filter von Asahi (Japan) ersetzt. Nach dieser Virusfiltration wurde der rH-C1INH eingeengt und der Puffer unter Verwendung einer Biomax-10-Membran (Millipore, USA) gegen 20 mM Natriumcitrat, pH 7,0, ausgetauscht. Der eingeengte rH-C1INH wurde durch 0,1 μm filtriert, in Gläschen überführt und bei –20°C gelagert. In einem späteren Experiment wurden 6,5% Saccharose zu dem eingeengten rH-C1INH zugegeben, dieses Produkt wurde anschließend durch 0,1 μm filtriert, in Gläschen überführt und gefriergetrocknet.
  • Die Ausbeute dieses Prozesses betrug bei Verwendung eines spezifischen ELISA für rH-C1INH 37%. Außerdem blieb die Aktvität von rH-C1INH während der ganzen Reinigung erhalten, wie durch die Hemmung von C1s bestimmt wurde. Die Reinheit wurde durch Größenausschluss-Chromatographie auf über 99% und unter Verwendung eines spezifischen ELISA, der in Kaninchenmilch vorliegende Wirtsproteine nachweist, auf über 99,999% bestimmt. Die Menge des endogenen R-C1INH wurde quantitativ bestimmt und lag unter 1 ppm.
  • Anhang 1
    Figure 00360001
  • Anhang 2
  • A. Beschreibung des Verfahrens, das verwendet wurde, um die Gesamtmenge des antigenen C1-Inhibitors in der Milch transgener Mäuse zu bestimmen
  • Die Expressionsraten des C1-Inhibitors in Mausmilch wurden unter Verwendung eines ELISA gemäß Veerhuis et al., (1998), [Veerhuis, 1998, Acta Neuropathol. 96: 287–296] bestimmt. Kurz gesagt wurden ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen mit monoclonalen Anti-C1-Inhibitor-Antikörpern beschichtet, worauf eine Inkubation mit Milchproben folgte. Gebundener C1-Inhibitor wurde unter Verwendung eines biotinylierten Kaninchen-Anti-C1-Inhibitor-Antikörpers nachgewiesen, gefolgt von einer Inkubation mit Peroxidase-markiertem Streptavidin und einer Färbereaktion mit TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin). Die Farbentwicklung wurde nach 20 Minuten mit 100 μl/Vertiefung von 2 M H2SO4 beendet und bei 450 nm mit einem Plattenlesegerät 340 ATTC (SLT Labinstruments) unter Verwendung der Software BIOLISE (Version 1.65) abgelesen.
  • Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt (eine Stunde), und zwischen jeder Inkubation wurden die Vertiefungen fünfmal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,02% Tween-20, gewaschen. Serielle Verdünnungen von vereinigtem normalem menschlichem Plasma (NP) wurden als Referenz verwendet, um die C1-Inhibitor-Spiegel in Milch zu berechnen. Gemäß CLB-Standards enthält NP 275 μg/ml C1-Inhibitor.
  • B. Beschreibung der Verfahren, die verwendet wurden, um die funktionellen und antigenen C1-Inhibitor-Spiegel in der Milch transgener Kaninchen zu bestimmen
  • I. Bestimmung der Gesamt-C1-Inhibitor-Antigen-Spiegel
  • ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 3,5 μg/ml Kaninchen-Anti-C1-Inhibitor-Antikörpern (DAKO, A0253) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, (PBS) (100 μl/Vertiefung) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen mit 100 μl/Vertiefung verdünnten Milchproben eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Gebundener C1-Inhibitor wurde unter Verwendung von 100 μl/Vertiefung von 1:5000 verdünnten Peroxidase-markierten Kaninchen-Anti-C1-Inhibitor-Antikörpern (eine Stunde bei Raumtemperatur) nachgewiesen und mit 100 μl/Vertiefung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (= TMB, ImmunoPure TMB Substrate Kit, Pierce 34021) als Substrat sichtbar gemacht. Die Farbentwicklung wurde nach 20 Minuten mit 100 μl/Vertiefung von 2 M H2SO4 gestoppt und bei 450 nm mit einem Plattenlesegerät 340 ATTC (SLT Labinstruments) unter Verwendung der Software BIOLISE (Version 1.65) abgelesen. Die Ergebnisse wurden durch Bezug auf serielle Verdünnungen von aus Plasma gereinigtem C1-Inhibitor (Sigma, E0518) (0 bis 130 ng/ml) berechnet. Alle Verdünnungen von (Milch-)Proben und Konjugat wurden in PBS, 2% Milch, 0,1% Tween-20 hergestellt.
  • II. C1-Inhibitor-Aktivität
  • 25 μl verdünnte Milchproben wurden mit 25 μl 1,5 μg/ml C1s (Kordia, Niederlande, Enzyme Research Lab. Inc., USA) in Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die restliche C1s-Aktivität bestimmt, indem 25 μl 1 mM Pefachrome® C1E-5019 (Kordia, Niederlande, Pentapharm Ltd., Schweiz, PF 087-31) zugegeben wurden. Unmittelbar nach der Zugabe des chromogenen Substrats wurde die Änderung in der Absorption bei 450 nm 45 Minuten bei 37°C unter Verwendung eines Plattenlesegeräts 340 ATTC (SLT Labinstruments) unter Verwendung der Software BIOLISE (Version 1.65) überwacht. Die Ergebnisse wurden auf eine durch serielle Verdünnungen von gereinigtem Plasma-C1-Inhibitor (Sigma, E0518) (0 bis 6 μg/ml) hergestellte Eichkurve bezogen. Milchproben und C1s wurden in PBS, 0,1% Tween-20 verdünnt. Pefachrome® C1E-5019 wurde in destilliertem Wasser verdünnt.
  • Anhang 3
  • Quantitative SDS-PAGE, um die Reinheit der verschiedenen C1-Inhibitor-Präparate zu bestimmen
  • Der von Sigma erhaltene C1-Inhibitor (Sigma, E0518) und die verschiedenen gereinigten rekombinanten C1-Inhibitor-Präparate wurden in PBS, 0,1% Tween-20 verdünnt und mit einem gleichen Volumen von nicht-reduziertem Probenpuffer (Tris-Glycin, pH 6,8, Novex, 102676) gemischt. Die Konzentrationen der Eichproben variierten zwischen 1 μg/ml und 25 ng/ml, und die gereinigten rekombinanten C1-Inhibitor-Präparate hatten eine Konzentration von 500 μg/ml. 10 μl von jeder Probe wurden auf 4 bis 20% SDS-PAGE (Tris-Glycin, Novex, EC60252) aufgetragen und die Gele laufen gelassen und anschließend mit Silber gefärbt, wobei Standardverfahren verwendet wurden. Die Intensität der verschiedenen einzelnen Banden auf dem Gel wurde unter Verwendung eines Fluor-STM Multilmager (BIORAD) gemessen. Die Intensität der verschiedenen Eichproben wurde gegen die Menge des auf das Gel aufgebrachten Proteins aufgetragen und die beste Kurve durch die Punkte gezogen. Die Menge an Verunreinigung (ng) in den verschiedenen C1-Inhibitor-Präparaten wurde unter Verwendung der Eichkurve berechnet. Der prozentuale Anteil von Verunreinigung einer Probe ist die relative Menge der gesamten Verunreinigungen im Vergleich zur Gesamtmenge des auf das Gel aufgetragenen Proteins.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001

Claims (20)

  1. Nicht-menschlicher Säuger umfassend: ein DNA-Segment, das einen für den Säuger heterologen menschlichen C1-Inhibitor codiert, welches mit mindestens einer regulatorischen Sequenz funktionell verknüpft ist, die wirksam ist, um die Expression des DNA-Segmentes in Brustdrüsenzellen des Säugers zu fördern, und ein Segment, das ein in Brustzellen des Säugers funktionsfähiges Signalpeptid codiert; wobei die DNA-Sequenz, die den C1-Inhibitor codiert, in den Brustdrüsenzellen einer adulten Form des Säugers oder eines weiblichen Nachkommen davon exprimiert werden kann, um den C1-Inhibitor in der Milch des nicht-menschlichen Säugers zu produzieren.
  2. Nicht-menschlicher Säuger gemäß Anspruch 1, wobei die Konzentration des C1-Inhibitors in der Milch mindestens 1 mg/ml ist.
  3. Nicht-menschlicher Säuger gemäß Anspruch 1 oder 2, welcher eine Maus, ein Kaninchen, eine Ziege, ein Schaf, eine Schweine- oder Rinderart ist.
  4. Nicht-menschlicher Säuger gemäß Anspruch 3, welcher ein Kaninchen oder eine Rinderart ist.
  5. Nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei das rekombinante DNA-Segment cDNA ist.
  6. Nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei das rekombinante DNA-Segment genomisch ist.
  7. Nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei das rekombinante DNA-Segment ein cDNA-Genom-Hybrid ist.
  8. Nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei das Signalpeptid ein C1-Inhibitor-Signalpeptid ist.
  9. Nicht-menschlicher Säuger gemäß einem der Ansprüche 1–8, wobei das DNA-Segment das den C1-Inhibitor codiert, die regulatorische Sequenz und das Segment, welches das Signalpeptid codiert, in die Keimbahn des Säugers eingefügt sind.
  10. Verfahren zur Bereitstellung eines C1-Inhibitors umfassend: Milchgewinnung von der adulten Form des transgenen nicht-menschlichen Säugers, oder seinem weiblichen Nachkommen, wie in einem der Ansprüche 1–9 definiert.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, das weiterhin das Einbringen der Milch in ein Nahrungsmittel umfasst.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 10, das weiterhin das Reinigen des C1-Inhibitors aus der Milch umfasst.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der C1-Inhibitor mindestens zu 95% rein ist.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, das weiterhin das Mischen des C1-Inhibitors mit einem pharmazeutischen Exzipienten für intravenöse, intradermale, intramuskuläre oder orale Verabreichung umfasst.
  15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10–14, wobei die Konzentration des C1-Inhibitor-Proteins in der Milch mindestens 1 mg/ml ist.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10–15, wobei der C1-Inhibitor einen Funktionalitätsindex von mindestens 0.9 hat.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12–16, wobei das Reinigen des C1-Inhibitors aus der Milch die Schritte umfasst: Laden einer den C1-Inhibitor umfassenden Probe auf eine Kationenaustauschersäule unter Bedingungen, bei welchen der C1-Inhibitor an die Säule bindet; Eluieren des C1-Inhibitors von der Kationenaustauschersäule; Laden des Eluats auf eine Anionenaustauschersäule unter Bedingungen, bei welchen der C1-Inhibitor an die Säule bindet; Eluieren des C1-Inhibitors von der Anionenaustauschersäule; Laden des Eluats auf eine Metallionenaustauschersäule unter Bedingungen, bei welchen die restlichen verunreinigenden Proteine an die Säule binden; Sammeln des Eluats, welches den C1-Inhibitor enthält, von der Metallionenaustauschersäule.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Probe zusätzlich Kaninchen-C1-Inhibitor umfasst, und das Eluat von der Metallionenaustauschersäule einen höheren Anteil an menschlichem C1-Inhibitor im Vergleich zum Kaninchen-C1-Inhibitor hat als die Probe.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei das Verhältnis mindestens 500:1 ist.
  20. Verwendung des menschlichen C1-Inhibitors, hergestellt in einem Verfahren wie in einem der Ansprüche 10–19 definiert, in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Patienten, der an C1-Inhibitormangel leidet oder dafür empfänglich ist.
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