ES2552595T3 - Derivado de hexapéptido-2 unido a biotina y usos del mismo - Google Patents

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Abstract

Un derivado peptídico que tiene una estructura de la siguiente Fórmula Química 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:**Fórmula**

Description

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DESCRIPCION
Derivado de hexapeptido-2 unido a biotina y usos del mismo Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un derivado de hexapeptido-2 conjugado con biotina o a una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y a usos del mismo. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un derivado de hexapeptido-2 conjugado con biotina o a una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, a un metodo de preparacion del mismo, a una composicion que incluye el mismo como un principio activo y a un metodo para la mejora de las arrugas y la inhibicion del envejecimiento cutaneo utilizando el mismo.
Antecedentes de la tecnica
La piel es un organo que realiza funciones tales como proteccion, barrera, control de temperatura, excrecion y respiracion y se compone de la epidermis, la dermis y la grasa subcutanea. La epidermis es la capa mas delgada y es una estructura organizada de queratinocitos y melanocitos. La dermis es una capa que constituye aproximadamente el 95 % de la piel y que actua para hidratar y proteger la piel. En la dermis, el colageno y la elastina, que desempenan un papel importante en la elasticidad de la piel (arrugas) se distribuyen para formar una estructura en forma de red, encontrandose vasos sangulneos y nervios y los mastocitos implicados en la reaccion alergica y tambien se incluyen factores humectantes naturales tales como Na-PCA o acido hialuronico. La grasa subcutanea actua para proporcionar nutrientes a la epidermis y a la dermis, determinar la forma del cuerpo, mantener la temperatura corporal, absorber los impactos externos y proteger las celulas bajo la grasa subcutanea.
El envejecimiento cutaneo se produce con el tiempo debido a la reduccion rapida de las funciones de la piel debido a factores endogenos o exogenos. Con el envejecimiento cutaneo, la epidermis, la dermis y la grasa subcutanea que son los componentes de la piel se vuelven delgados y el colageno y la elastina tambien se vuelven delgados y flacidos y comienzan a perder su elasticidad, causando las arrugas. Ademas, el envejecimiento o la exposicion de la piel a los rayos UV inhiben la adipogenesis en los adipocitos subcutaneos, lo que conduce a la perdida de la funcion protectora de la piel y al rapido envejecimiento cutaneo. Por tanto, los tejidos de la cara, el pecho y la cadera se vuelven caldos y se produce el desarrollo de arrugas, con el tiempo dejar de tener el aspecto de belleza.
Se han realizado muchos estudios para mejorar la funcion reducida de la piel y el metodo mas importante es encontrar un metodo de promocion de la bioslntesis de colageno de las celulas cutaneas. Para lograr esto, se han seleccionado y utilizado vitamina C y derivados de las misma, peptido KTTKS, peptido de cobre y diversos extractos naturales. Sin embargo, la vitamina C y los derivados de la misma tienen las desventajas de una baja estabilidad y una baja actividad a largo plazo, y el peptido KTTKS y el peptido de cobre tienen la desventaja de tener un escaso efecto de promocion de la bioslntesis de colageno. Los extractos naturales tienen las desventajas de una baja actividad y la diferencia en su actividad en el momento de preparacion de la muestra. Por consiguiente, existe una necesidad urgente de desarrollar un material de nuevo concepto para la promocion de la bioslntesis de colageno con el fin de resolver todas las desventajas.
Divulgacion
Problema tecnico
Por tanto, los inventores de la presente invencion han examinado las tecnicas anteriores con el fin de resolver los problemas. Se ha descubierto que el hexapeptido-2 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-Nhh) elimina los depositos patologicos de material fibrotico en la piel (documento EP 1994939). Ademas, los inventores descubrieron que el hexapeptido-2 es capaz de promover el crecimiento de los fibroblastos (Publicacion de Patente Coreana N° 10-20080075530) y realizaron un experimento para dotarlo de una nueva actividad a traves de diversas modificaciones y conjugaciones del mismo. Finalmente, los inventores de la presente invencion demostraron que un derivado peptldico del hexapeptido-2 conjugado con biotina tiene una excelente capacidad para promover la produccion de colageno en los fibroblastos y el derivado peptldico puede utilizarse para mejorar las arrugas de la piel y el envejecimiento cutaneo.
Solucion tecnica
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un nuevo derivado peptldico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo que tenga un excelente efecto de promocion de la bioslntesis de colageno en los fibroblastos.
Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo para preparar el derivado peptldico o la sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
Otro objetivo mas de la presente invencion es proporcionar una composicion cosmetica para la mejora de las arrugas y la inhibicion del envejecimiento cutaneo, incluyendo el derivado peptldico o la sal farmaceuticamente
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aceptable del mismo.
Otro objetivo mas de la presente invencion es proporcionar una composicion farmaceutica para la mejora de las arrugas y la inhibicion de envejecimiento cutaneo, incluyendo el derivado de peptido o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Efectos ventajosos
El derivado peptfdico del hexapeptido-2 conjugado con biotina de la presente invencion tiene excelentes efectos en la mejora de las arrugas y la prevencion del envejecimiento cutaneo y exhibe eficazmente sus efectos intrfnsecos sin efectos secundarios tales como irritacion de la piel cuando se aplica al cuerpo humano y por tanto es un material muy util en los campos industriales tales como producciones de medicamentos de uso externo y cosmeticos. Ademas, las composiciones cosmeticas y farmaceuticas que incluyen el derivado peptfdico del hexapeptido-2 conjugado con biotina de la presente invencion son dignos de mencion como alternativa a los metodos y tratamientos conocidos para la inhibicion del envejecimiento cutaneo mediante la mejora de la biosfntesis de colageno en la piel.
Descripcion de los dibujos
La FIG. 1 muestra el resultado del ensayo de la citotoxicidad del derivado peptfdico del hexapeptido-2 conjugado con biotina de acuerdo con la presente invencion; y
La FIG. 2 muestra el resultado del ensayo de la biosfntesis de colageno del derivado peptfdico del hexapeptido-2 conjugado con biotina de acuerdo con la presente invencion.
Mejor modo
En un aspecto para conseguir los objetivos anteriores, la presente invencion se refiere a un nuevo derivado peptfdico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo que maximiza capacidad de sfntesis de colageno de los fibroblastos.
Especfficamente, la presente invencion se refiere a un derivado peptfdico que tiene una estructura de la siguiente Formula Qufmica 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo:
imagen1
El derivado peptfdico de Formula Qufmica 1 es un nuevo derivado peptfdico que se prepara mediante conjugacion con biotina del peptido hexapeptido-2 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2).
Como se utiliza en el presente documento, la expresion "sal farmaceuticamente aceptable" incluye sales que se derivan de un acido inorganico, acido organico o base farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de acido adecuado pueden incluir acido clorhfdrico, acido bromhfdrico, acido sulfurico, acido nftrico, acido perclorico, acido fumarico, acido maleico, acido fosforico, acido glicolico, acido lactico, acido salicflico, acido succfnico, acido p- toluenosulfonico, acido tartarico, acido acetico, acido cftrico, acido metanosulfonico, acido formico, acido benzoico, acido malonico, acido naftaleno-2-sulfonico, acido bencenosulfonico, acido trifluoroacetico, etc. Los ejemplos de sales derivadas de bases adecuadas pueden incluir metales alcalinos tales como sodio, etc., metales alcalinoterreos tales como magnesio, etc. y amonio, etc.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para sintetizar el nuevo derivado peptfdico.
El derivado peptfdico de la presente invencion o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo pueden prepararse mediante el uso de una tecnica conocida en la tecnica. El metodo de sfntesis se representa mediante la siguiente
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descripcion, pero la presente invencion no se limita a la misma, y el metodo puede modificarse apropiadamente por aquellos expertos en la materia dentro del alcance de la tecnologia conocida en la tecnica.
En una realizacion especifica de la presente invencion, los derivados peptidicos que tienen un efecto hidratante se prepararon mediante sintesis peptidica en fase solida estandar (SPPS) con qmmica de Fmoc y quimica de solucion.
El metodo de smtesis de peptidos en fase solida se realizo de acuerdo con el total de 6 etapas de 1) cargar aminoacidos protegidos en una resina; 2) retirar los grupos protectores de los aminoacidos; 3) inducir reacciones de acoplamiento de los aminoacidos; 4) control de las reacciones (por ejemplo, el ensayo de Kaiser); 5) retirar la resina y los grupos protectores; y 6) solidificar los peptidos.
En lo sucesivo, cada etapa del metodo de sintesis se describira en mas detalle.
La Etapa 1) es una etapa de carga de aminoacidos y biotina sobre una resina. La resina puede incluir resinas de Wang, resinas de clorotritilo, resinas de poliestireno o similares. Para la optimization de la sintesis, se utiliza una resina cuyos residuos reactivos se unen con grupos amina y se anade un disolvente adecuado a esta resina de amina para hinchar la resina. El disolvente puede ser, por ejemplo, MC (cloruro de metileno), pero no se limita al mismo. A continuation, el disolvente se retira a presion reducida y los aminoacidos protegidos se disuelven en un disolvente adecuado y se anade una mezcla de DIC (diisopropilcarbodiimida) y DMAP (4-dimetilaminopiridina) a un recipiente y se hace reaccionar. El disolvente puede ser, por ejemplo, DMF (dimetilformamida) y el grupo protector de aminoacido puede ser Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), pero no se limitan a los mismos.
La Etapa 2 es una etapa de elimination de los grupos protectores de aminoacidos. La elimination de los grupos protectores de aminoacidos puede realizarse de acuerdo con un metodo generalmente conocido en la tecnica. En la realizacion especifica de la presente invencion, la solucion de aminoacidos cargados en la resina se retiro a presion reducida y la resina se lavo y despues se hizo reaccionar con piperidina en solucion de DMF para retirar los grupos protectores.
La Etapa 3 es una etapa de induction de reacciones de acoplamiento de aminoacidos. La reaction de acoplamiento de aminoacidos puede realizarse de acuerdo con un metodo generalmente conocido en la tecnica, por ejemplo, el metodo de HOBt-DCC (N-hidroxibenzotriazol-diciclohexilcarbodiimida) o el metodo de HOBt-DIC (N- hidroxibenzotriazol-diisopropilcarbodiimida) (Wang C. Chan, Peter D. White, "Fmoc solid phase peptide synthesis", Oxford). Ademas, los reactivos de acoplamiento tales como N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N'- diisopropilcarbodiimida (DIC), hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitris(dimetilamino)fosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il- oxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP), [hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotri-azol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio] (HATU), 1H-hidroxi-benzotriazol (HOBt), 1H-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) o similares pueden utilizarse para realizar la sintesis y una base organica tal como acido trifluoroacetico (TFA), diisopropiletilamina (DIPEA), N- metilmorfolina (NMM) o similar puede anadirse en funcion del reactivo de acoplamiento para realizar la reaccion, pero no se limitan a los mismos.
La Etapa 4 es una etapa de control de la reaccion. En la realizacion especifica de la presente invencion, por ejemplo, se utilizo el ensayo de Kaiser (E. Kaiser et al., Anal. Biochem. (1970) 34, 595) con el fin de controlar la reaccion de acoplamiento de los aminoacidos. El ensayo de Kaiser es un metodo cualitativo de detection de la presencia de grupos funcionales amina primaria por los cambios de color utilizando ninhidrina. En detalle, despues de las reacciones de acoplamiento de aminoacidos, se anaden 2-3 gotas de una solucion de ensayo de Kaiser a una pequena cantidad de la resina lavada y despues se observan los cambios de color de la resina durante un tiempo predeterminado. Ningun cambio de color de la resina indica que la reaccion de acoplamiento se realiza correctamente y por tanto se pasa a la siguiente reaccion. Un color azul de la resina indica la presencia de aminoacidos sin reaccionar y por tanto las reacciones de acoplamiento de aminoacidos deben repetirse.
La Etapa 5) es una etapa de eliminacion de la resina y los grupos protectores. Los peptidos sintetizados mediante la repetition de las Etapas 3 a 5 se retiran de la resina y los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoacidos se desprotegen. La eliminacion de la resina y del grupo protector del aminoacido puede realizarse de acuerdo con un metodo generalmente conocido en la tecnica. En la realizacion especifica de la presente invencion, se anadio una solucion de coctel de escision que consiste en TFA (acido trifluoroacetico), TIS (triisopropilsilano), tioanisol, H2O y EDT (etanoditiol) para obtener una solucion peptidica. La composition de la solucion puede modificarse apropiadamente por los expertos en la materia, dependiendo de las condiciones experimentales.
La Etapa 6 es una etapa de solidification de los peptidos. Por ejemplo, puede anadirse una cantidad excesiva de disolvente eter dietilico para producir la precipitation de solidos, pero no se limita a ello.
El derivado peptidico de acuerdo con la presente invencion y la sal farmaceuticamente aceptable del mismo no mostraron ningun efecto secundario tal como citotoxicidad sobre los fibroblastos de la piel (FIG. 1) y mostraron una fuerte capacidad para promover la biosintesis de colageno en los fibroblastos de la piel. En particular, el tratamiento de hexapeptido-2 y biotina solos o en combination no mostro ningun aumento de la biosintesis de colageno de tipo
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1, pero el hexapeptido-2 conjugado con biotina mostro un aumento significativo en la bioslntesis de colageno de tipo 1 (Fig. 2).
En otro aspecto mas, la presente invencion se refiere a una composicion para la mejora de las arrugas y la prevencion del envejecimiento cutaneo, incluyendo el derivado peptldico de la presente invencion o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo. La composicion para la mejora de las arrugas y la prevencion del envejecimiento cutaneo que incluye el derivado peptldico de la presente invencion o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo como un principio activo abarca tanto las composiciones cosmeticas como farmaceuticas de acuerdo con el uso y los efectos deseados.
En la realization preferida, la presente invencion se refiere a composiciones cosmeticas y farmaceuticas para la mejora de las arrugas y la inhibition del envejecimiento cutaneo, incluyendo el derivado peptldico de la presente invencion o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Cuando se utiliza en forma de las composiciones cosmeticas y farmaceuticas para la mejora de las arrugas y la inhibicion de envejecimiento cutaneo, la composicion puede aplicarse a la piel, el cuero cabelludo o el cabello y puede utilizarse con el fin de prevenir el envejecimiento cutaneo y mejorar las arrugas y la piel aspera.
El contenido del derivado peptldico en la composicion para la mejora de las arrugas y la inhibicion del envejecimiento cutaneo de la presente invencion puede controlarse adecuadamente de acuerdo con el uso de la composicion, el tipo de aplicacion, la finalidad de uso y los efectos deseados y es preferentemente del 0,0001 al 99 % en peso, preferentemente del 0,001 al 50 % en peso, mas preferentemente del 0,001 al 1 % en peso y lo mas preferentemente del 0,005 al 0,1 % en peso, basado en el peso total de la composicion, en vista del coste frente al efecto.
La composicion para la mejora de las arrugas y la prevencion del envejecimiento cutaneo de la presente invencion pueden administrarse a traves de las vlas oral o parenteral, por ejemplo, por via oral, percutanea, subcutanea o intravenosa, preferentemente a traves de una via percutanea para la administration parenteral y mas preferentemente a traves de la aplicacion topica.
La composicion puede aplicarse por la via percutanea a la piel, el cuero cabelludo o el cabello y lo que significa que es una composicion que puede utilizarse en la production de todos los productos cosmeticos tales como los cosmeticos fundamentales, cremas para el busto y la cadera, productos de maquillaje, productos de cuidado corporal, productos para el afeitado, productos para el cuidado capilar, etc. La composicion puede formularse en forma de una pomada, spray, suspension, emulsion, crema, gel, espuma, etc., pero no existe ninguna limitation particular en su formulation.
Preferentemente, la composicion cosmetica puede tener una formulacion seleccionada entre el grupo que consiste en un suavizante de la piel, locion astringente, locion nutritiva, crema nutritiva, crema de masaje, crema para los ojos, esencia para los ojos, esencia, crema limpiadora, locion limpiadora, espuma limpiadora, agua limpiadora, polvos compactos, polvos, locion corporal, crema corporal, esencia corporal, gel de bano, crema de protection solar, tinte capilar, champu, enjuague, pasta de dientes, refrescante bucal, acondicionador capilar, tonico capilar, locion, pomada, gel, crema, parche y aerosol.
Las composiciones cosmeticas y farmaceuticas de la presente invencion pueden incluir adicionalmente todo tipo de ingredientes que pueden utilizarse en la produccion o la formulacion tlpicas, por ejemplo, una fragancia, un agente colorante, un agente bactericida, un antioxidante, un conservante, un humectante, un agente espesante, un excipiente, un diluyente, un mineral, un pollmero sintetico, etc., ademas de los ingredientes eficaces anteriores y el tipo y el contenido pueden ajustarse adecuadamente de acuerdo con el uso del producto final y el proposito de uso.
La composicion de la presente invencion puede incluir ademas un disolvente que puede incluirse normalmente en la formulacion, por ejemplo, uno o mas seleccionados entre etanol, glicerina, butilenglicol, propilenglicol, polietilenglicol, 1,2,4-butanotriol, ester de sorbitol, 1,2,6-hexanotriol, alcohol bencllico, isopropanol, butanodiol, eter monoetilllico de dietilenglicol, isosorbida de dimetilo, N-metil-2-pirrolidona, carbonato de propileno, glicereth-26, metil gluceth-20, isocetilmiristato, isocetiloctanoato, miristato de octildodecilo, octildodecanol, isoestearato de isoestearilo, octanoato de cetilo y dicaprato de neopentilglicol. Cuando se prepara la composicion de la presente invencion utilizando estos disolventes, la solubilidad del compuesto en el disolvente varla ligeramente, dependiendo del compuesto particular y de la proportion de mezcla de los disolventes. Sin embargo, aquellos expertos en la materia pueden seleccionar el disolvente particular y su contenido de adecuadamente dependiendo de las caracterlsticas del producto.
Ademas, la composicion de la presente invencion puede incluir diversos materiales para potenciar la penetration percutanea tras la administracion percutanea, por ejemplo, derivados de laurocaprama, acido oleico, derivados de ester de derivado de monooleato, adapaleno, tretinolna, retinaldehldo, tazaroteno, acido salicllico, acido azelaico, acido glicolico, etoxidiglicol, Tween 80, organogel de lecitina, etc. Con el fin de proporcionar funciones adicionales, la composicion de la presente invencion puede incluir ademas otros ingredientes tales como un cotensioactivo, un tensioactivo, un agente anticaspa, un ablandador de callos, un estimulante del flujo sangulneo, un activador celular,
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un agente refrescante, un agente humectante, un antioxidante, un ajustador de pH, agua purificada, etc., dentro del alcance de no afectar el efecto hidratante de la composicion. La composicion tambien puede incluir un aditivo adecuado tal como una fragancia, un color, un conservante, un excipiente, etc., dependiendo de la forma aplicada.
Modo para la invencion
En lo sucesivo, la presente invencion se describira en detalle con referencia a los Ejemplos.
Ejemplo 1. Preparacion del derivado peptidico
En la presente invencion, los derivados peptldicos se prepararon mediante la slntesis de peptidos en fase solida estandar utilizando Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) como un grupo protector de aminoacido Na y el ejemplo especlfico de los mismos es como se indica a continuacion.
En primer lugar, la cantidad de resina de amina (1,1°mmol/g, Novabiochem Corporation) que corresponde a 1°mmol se peso y se puso en un recipiente de reaccion y despues se anadieron 30 ml de MC para hinchar la resina durante 10 minutos. El disolvente se elimino a presion reducida y se anadieron Fmoc-lisina (4 eq.) en disolvente DMF y una mezcla de DIC (2 eq.; diisopropilcarbodiimida) y DMAP (0,1 eq.; 4-dimetilaminopiridina) al recipiente y se hizo reaccionar durante 4 horas. Despues, la solucion de aminoacido cargada en la resina de amina se elimino a presion reducida y la resina se lavo con cada uno: 30 ml de DMF y MC 5 veces. La resina cargada con Fmoc-lisina se hizo reaccionar con piperidina al 20 % (v/v %) en solucion de DMF durante 10 minutos para la desproteccion y despues se lavo con cada uno: 30 ml de DMF y MC 5 veces. Despues, los peptidos Fmoc y la biotina disueltos en el disolvente DMF (usense Fmoc-D-fenilalanina, Fmoc-triptofano, Fmoc-alanina, Fmoc-D-triptofano, Fmoc-histidina y biotina en este orden) (cada uno 4 eq.), DIC (4 eq; diisopropilcarbodiimida) y HOBt (4 eq; N-hidroxibenzotriazol) como un reactivo de acoplamiento se anadieron a la resina Fmoc-desprotegida y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 4 horas para inducir reacciones de acoplamiento de aminoacidos. Despues de las reacciones de acoplamiento de aminoacidos, se anadieron 2-3 gotas de solucion de ensayo de Kaiser A, B, C [solucion A: ninhidrina (5 g) en etanol (100 ml), solucion B: fenol (80 g) en etanol (20 ml), solucion C: KCN 0,1 M (2 ml) en piridina (98 ml)] a una pequena cantidad de la resina lavada y se mantuvieron a 100 °C para observar los cambios de color de la resina durante 10 minutos. Ningun cambio de color en la resina indica que la reaccion de acoplamiento se realiza correctamente y por tanto se continuo a la siguiente reaccion. Un color azul de la resina indica la presencia de aminoacidos que no han reaccionado y por tanto las reacciones de acoplamiento de aminoacidos deben repetirse.
Los peptidos sintetizados mediante los procedimientos anteriores se retiraron de la resina. Con el fin de desproteger los grupos protectores de las cadenas laterales de aminoacidos se anadio una mezcla que consiste en TFA (acido trifluoroacetico), TIS (triisopropilsilano), tioanisol, H2O y EDT (etanoditiol) en una proporcion de 90:2,5:2,5:2,5:2,5 para producir la precipitacion de solidos. Los precipitados resultantes se centrifugaron para eliminar el TFA, el TIS, el tioanisol, el H2O y el EDT restantes y este procedimiento se repitio tres o mas veces a fin de obtener peptidos de hexapeptido-2 conjugado con biotina solidos.
Para el analisis del peptido hexapeptido-2 conjugado con biotina, se realizaron RP-HPLC y CL-EM.
En la RP-HPLC, el tampon A era agua que contenla TFA al 0,1 % y el tampon B era acetonitrilo que contenla TFA al 0,1 % y el analisis se realizo con un gradiente de concentraciones del 5 % al 65 % de tampon B durante 30 minutos. Como resultado, el Tr fue de aproximadamente 25,808 minutos.
En la CL-EM, el valor predicho era 1099,3 Da y el valor experimental fue de 1099.1 Da.
Ejemplo 2. Ensayo de citotoxicidad del derivado peptidico hexapeptido-2 conjugado con biotina
Con el fin de examinar la citotoxicidad del peptido hexapeptido-2 peptido conjugado con biotina sintetizado en el Ejemplo 1, se realizo el siguiente experimento. La citotoxicidad se examino mediante el ensayo de MTT, y un grupo de control sin muestra anadida se considero como el 100 % para calcular la citotoxicidad relativa. El metodo experimental detallado es como se indica a continuacion.
Los fibroblastos humanos normales (fibroblastos dermicos humanos neonatales) se sembraron en una placa para cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 3.000 celulas por pocillo y se cultivaron en DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco, Gibco BRL) que contenla FBS al 10 % (suero fetal bovino) en una incubadora a 37 °C, CO2 al 5 % durante 24 horas. Cada material de ensayo se disolvio en agua a una concentracion de 10°mM para preparar los concentrados y los concentrados se diluyeron con DMEM que contenla FBS al 0,5 % a una concentracion de 200 uM, 20 uM y 2 uM. Despues, se anadieron 100 ul de cada una de las soluciones diluidas a cada pocillo que contenla previamente 100 ul del medio, seguido de incubacion durante 48 horas. Despues de completar el cultivo, se utilizaron los sobrenadantes para determinar la cantidad de colageno de tipo 1 producida (Ejemplo 3) y las celulas se utilizaron para determinar la citotoxicidad.
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En el ensayo de MTT para determinar la citotoxicidad, se anadieron 90 ul de DMEM que contenla FBS al 10 % a cada uno de los pocillos de los que se elimino el medio de cultivo y se anadieron 10 ul de bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) disueltos en PBS a una concentracion de 5 mg/ml, seguido de incubacion en las condiciones de 37 °C y CO2 al 5 % durante 3 horas. Despues de eso, el sobrenadante se retiro cuidadosamente y los precipitados de formazan de MTT de las celulas se disolvieron en 100 ul de DMSO para determinar la absorbancia a OD570 utilizando ando un lector de ELISA.
Los resultados se muestran en la FIG. 1. Como se muestra en la FIG. 1, el hexapeptido-2 conjugado con biotina de la presente invention no mostro citotoxicidad, como en el tratamiento con hexapeptido-2 y biotina solos o en combination
Ejemplo 3. Medicion de la capacidad de promocion de biosintesis de colaaeno de tipo 1 del derivado peptidico hexapeptido-2 coniuaado con biotina
Con el fin de examinar la capacidad de promocion de biosintesis de colageno de tipo 1 del peptido hexapeptido-2 conjugado con biotina sintetizado en el Ejemplo 1, se realizo el siguiente experimento. El colageno de tipo 1 producido se midio mediante el ensayo ELlSA para examinar el efecto de promover la biosintesis de colageno y un grupo de control sin muestra anadida se considero como el 100 % para calcular la capacidad de production de colageno de tipo 1 relativa. El metodo experimental detallado es como se indica a continuation.
En primer lugar, una placa de 96 pocillos se recubrio con anticuerpos contra el colageno de tipo 1 y se bloqueo completamente utilizando un tampon de bloqueo. Despues de eso, los sobrenadantes del cultivo de fibroblastos descritos en el Ejemplo 2 se trasladaron a la placa de 96 pocillos recubierta con anticuerpos de colageno de tipo 1 y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de completar la reaction, se eliminaron los sobrenadantes y la placa se lavo con PBS que contenia Tween 20 al 0,05 % (PBST), y se trasladaron los anticuerpos secundarios conjugados con biotina a la placa de 96 pocillos, seguido de incubacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de completar la reaccion, los sobrenadantes restantes se retiraron de la misma manera que anteriormente. Despues de lavar con PBST, se ligo SA-HRP (peroxidasa de rabano-estreptavidina, Sigma) para medir el colageno ligado. Despues de tratar con TMB (3,3-'5,5'-tetrametilbenzidina, Sigma) como sustrato para el desarrollo del color, la reaccion se realizo a temperatura ambiente durante 15 minutos, mientras se bloqueaba la luz. La reaccion se detuvo utilizando acido clorhidrico 2 N y la absorbancia se midio a 450 nm. Para la comparacion de los efectos, la biosintesis de colageno de tipo 1 se midio en un tratamiento con hexapeptido-2 solo, en un tratamiento con biotina sola y en un tratamiento de combinacion con una mezcla de hexapeptido-2 y biotina.
Los resultados se muestran en la FIG. 2. Como se muestra en la FIG. 2, el tratamiento con hexapeptido-2 y biotina solos o en combinacion no mostro ningun aumento de la biosintesis de colageno de tipo 1, pero el hexapeptido-2 conjugado con biotina mostro un aumento significativo de la biosintesis de colageno de tipo 1.

Claims (6)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un derivado peptidico que tiene una estructura de la siguiente Formula Qufmica 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo:
    imagen1
  2. 2. Una composicion cosmetica para la mejora de las arrugas y la prevencion del envejecimiento cutaneo, que comprende el derivado peptidico o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo de la reivindicacion 1.
  3. 3. La composicion cosmetica de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde la composicion cosmetica tiene una funcion de promocion de la biosfntesis de colageno.
  4. 4. La composicion cosmetica de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde la composicion cosmetica tiene una formulacion seleccionada entre el grupo que consiste en suavizante de la piel, locion astringente, locion nutritiva, crema nutritiva, crema de masaje, crema para los ojos, esencia para los ojos, esencia, crema limpiadora, locion limpiadora, espuma limpiadora, agua limpiadora, polvos compactos, polvos, locion corporal, crema corporal, esencia corporal, gel de bano, crema de proteccion solar, tinte capilar, champu, enjuague, pasta de dientes, refrescante bucal, acondicionador capilar, tonico capilar, locion, pomada, gel, crema, parche y aerosol.
  5. 5. Una composicion farmaceutica para la mejora de las arrugas y la prevencion del envejecimiento cutaneo, que comprende el derivado peptidico o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo de la reivindicacion 1.
  6. 6. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde la composicion farmaceutica tiene una funcion de promocion de la biosfntesis de colageno.
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