ES2578636T3

ES2578636T3 - Péptidos novedosos antienvejecimiento y composición cosmética y/o farmacéutica que los contiene

Info

Publication number: ES2578636T3
Application number: ES10703307.8T
Authority: ES
Inventors: Claude Dal Farra; Nouha Domloge; Jean-Marie Botto; Isabelle Imbert
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2009-01-09
Filing date: 2010-01-07
Publication date: 2016-07-28
Anticipated expiration: 2030-01-07
Also published as: CN102272150A; EP2376529A1; CN102272150B; FR2940969A1; JP5647994B2; PL2376529T3; JP2012514625A; US8877713B2; EP2376529B1; FR2940969B1; US20140045766A1; US20110269695A1; WO2010079284A1

Abstract

Compuesto peptídico de la fórmula general (I) siguiente: R1-(AA)n- X1 - Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)p - R2 en la cual, X1 representa una treonina, una serina o es igual a cero, X2 representa una isoleucina, una leucina, una valina, una alanina, una glicina o es igual a cero, AA representa un aminoácido cualquiera salvo prolina, o uno de sus derivados, y n y p son números enteros comprendidos entre 0 y 4, R1 representa la función amina primaria del aminoácido N-terminal, libre o sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre un grupo acetilo, un grupo benzoílo, un grupo tosilo o un grupo benciloxicarbonilo, R2 representa el grupo hidroxilo de la función carboxilo del aminoácido C-terminal, sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre una cadena alquilo de C1 a C20, o un grupo NH2, NHY o NYY en el que Y representa una cadena alquilo de C1 a C4, estando constituida dicha secuencia de fórmula general (I) por 3 a 13 residuos de aminoácidos, caracterizado por que se corresponde con una de las fórmulas siguientes: (SEQ ID n.°1) Tyr - Val - Ser - Thr - Pro - Tyr - Asn - NH2 (SEQ ID n.°2) Val - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2 (SEQ ID n.°3) Ser - Thr - Pro - NH2 (SEQ ID n.°4) Leu - His - Ser - Thr - Pro - NH2 (SEQ ID n.°5) Arg - His - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2 (SEQ ID n.°6) His - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2, y permite restaurar el ritmo circadiano y resincronizar el reloj biológico de las células de la piel.

Description

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DESCRIPCION

Peptidos novedosos antienvejecimiento y composicion cosmetica y/o farmaceutica que los contiene

[0001] La presente invencion se situa en los campos de la cosmetica y de la dermofarmacia. La presente invencion se refiere a compuestos peptidicos de secuencias espedficas de formula general (I) Ri-(AA)n- X1 - Ser - Thr - Pro - X2-(AA)p - R2 destinados a restaurar el ritmo circadiano y a resincronizar el reloj biologico de las celulas de la piel, asf como para prevenir y corregir los efectos del envejecimiento.

[0002] La funcion primera de la epidermis es la de constituir una barrera entre el entorno exterior y el medio interior. La capa mas externa de la epidermis, el stratum corneum, se encarga de garantizar esta funcion. Esta compuesto por queratinocitos en la ultima fase de su diferenciacion, los corneocitos, separados entre sf por medio de un cemento intercelular espeso, flexible e impermeable al mismo tiempo. Esta barrera ffsica que es la piel permite que el cuerpo humano se proteja de numerosos tipos de agresiones. Estas agresiones pueden tener diversos ongenes intrmsecos, tales como el envejecimiento cronologico o incluso modificaciones bioqmmicas que tienen lugar tras estados de fatiga, de estres, de cambios hormonales como tras el embarazo... Otras agresiones tienen un origen extrmseco, tales como la contaminacion, el sol, las enfermedades... En respuesta a dichas agresiones, el aspecto de la piel se modifica y por tanto aparecen arrugas y pequenas arrugas, manchas de hiper o hipopigmentacion, sequedades e incluso una deshidratacion de la piel, un adelgazamiento de la epidermis, una elastosis, imperfecciones, manchas de vejez... Estas modificaciones se deben a la alteracion de las funciones de renovacion celular, de cohesion celular, de smtesis de colageno, de elastina y otras protemas y conducen finalmente a una disminucion de las cualidades de barrera protectora de la piel y a un aspecto poco estetico de esta.

[0003] La piel, como el resto de organos, esta sometida a la influencia de variaciones periodicas. Es el centro de una organizacion coherente de ritmos circadianos y nictamerales que modulan diversos ciclos biologicos, muy a menudo de gran amplitud (F. Henry et al., Rev Med Liege; 57: 10: 661-665). Estos ritmos cutaneos en el hombre sugieren que por el dfa la piel favorece diversas funciones protectoras frente al entorno. Por la tarde y noche, favorece su renovacion celular y diversos procesos metabolicos de smtesis.

[0004] Un individuo saludable, cuyo organismo vive en harmoma con su entorno, presenta una sincronizacion de sus ritmos biologicos. En cambio, pueden aparecer perturbaciones de los ritmos biologicos en un determinado numero de afecciones denominadas de desincronizacion (Reinberg y Touitou, 1996). Una desincronizacion es un estado en el cual dos variables ntmicas (o mas), anteriormente sincronizadas, han dejado de presentar las mismas relaciones de frecuencia y/o de acrofase y muestran relaciones temporales distintas de las relaciones habituales. La desincronizacion puede ser de origen externo, por lo que depende de las modificaciones del entorno y se encuentra, por ejemplo, tras un vuelo transmeridiano de cinco husos horarios (el fenomeno del jet- lag) o en el trabajo nocturno. En cuanto a la desincronizacion de origen interno, esta no depende de los factores del entorno. Se encuentra en el envejecimiento o en un determinado numero de enfermedades como la depresion o determinados tipos de cancer. Estos problemas de la desincronizacion pueden corregirse por medio de diversos tratamientos: por ejemplo, la administracion de luz fuerte para tratar el trastorno afectivo estacional, o incluso la administracion de melatonina (Dijk y col., 1995; Eastman y Miescke, 1990; Palm y col., 1991; Shochat y col., 1998; Touitou y col., 1998). En cosmetica es bien sabido que la eficacia de un cuidado puede verse optimizada en funcion del momento del dfa en que se administre. Por ejemplo, las cremas de dfa permiten proteger la piel de las agresiones externas durante el dfa, mientras que las cremas de noche permiten que la piel repare los danos sufridos durante el dfa por medio del aumento de la renovacion y del metabolismo celulares. Asimismo, se ha demostrado que el envejecimiento esta acompanado de una modificacion de los ritmos biologicos, con una disminucion de la amplitud y una tendencia al avance de fase (Weinert D., Chronobiol. Int. 2000; 17:261-83). Ademas, se ha mostrado que el reloj circadiano se vefa alterado por ese mismo envejecimiento. No obstante, en la actualidad no hay tratamiento que permita que la piel «se reinicie» o incluso que reactive su ciclo circadiano, ni que resincronice su reloj biologico. Un tratamiento de este tipo permitina de este modo ayudar a que la piel se recupere de un desfase horario, de un trabajo nocturno o incluso que combata los signos provocados por el envejecimiento.

[0005] De forma sorprendente, el solicitante ha descubierto que los compuestos peptfdicos de la siguiente formula general R1-(AA)n- X1 -Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)p- R2 ternan la propiedad de restaurar el ritmo circadiano y resincronizar el reloj biologico de las celulas de la piel. No hay ningun documento en la tecnica anterior que describa que dichos compuestos peptfdicos permitan obtener tales efectos. Ademas, estos compuestos peptfdicos se caracterizan por el hecho de que son agentes activadores de la protema Clock (Circadian Locomotor Output Cycles Kaput), que esta implicada de forma directa o indirecta en la regulacion del ciclo circadiano. En consecuencia, la presente invencion tiene como objeto unos compuestos peptfdicos activadores de Clock, asf como su uso en composiciones cosmeticas y farmaceuticas a fin de restaurar el ritmo circadiano y resincronizar el reloj biologico de las celulas de la piel o incluso prevenir o corregir los signos provocados por el envejecimiento.

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[0006] Desde hace tiempo se sabe que el reloj circadiano esta controlado por medio de un bucle negativo de regulacion que implica un conjunto de genes, principalmente los genes Per-1 (Period), Clock y BMAL-1 (Brain and Muscle ARNt-like Protein). Hasta ahora, en la tecnica anterior, se han propuesto numerosas aplicaciones en lo que respecta al uso de los nucleotidos y/o de las protemas procedentes de los genes Clock, Per-1 o BMAL-1. Se puede citar, por ejemplo, la patente US 6 291 429, que describe el uso del producto del gen Clock para la resincronizacion del ciclo del sueno o de procesos fisiologicos o endocrinos, la resincronizacion del cuerpo despues de un desfase horario... Los documentos de patente WO 99/57237 y EP1864997 dan a conocer protemas procedentes de los genes Clock, Per-1 et BMAL-1 para la regulacion de los ritmos biologicos. No obstante, ningun documento de la tecnica anterior describe el uso de peptidos espedficos activadores de Clock para restaurar el reloj biologico interno de la piel.

[0007] La presente invencion tiene como primer objeto unos compuestos peptfdicos de formula (I) siguiente

Rr(AA)n- X1 - Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)p- R2

en la cual,

X1 representa una treonina, una serina o es igual a cero,

X2 representa una isoleucina, una leucina, una valina, una alanina, una glicina o es igual a cero,

AA representa un aminoacido cualquiera salvo prolina, o uno de sus derivados, y n y p son numeros enteros comprendidos entre 0 y 4,

R1 representa la funcion amina primaria del aminoacido N-terminal, libre o sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre un grupo acetilo, un grupo benzoflo, un grupo tosilo o un grupo benciloxicarbonilo,

R2 representa el grupo hidroxilo de la funcion carboxilo del aminoacido C-terminal, sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre una cadena alquilo de C1 a C20, o un grupo NH2, NHY o nYy en el que Y representa una cadena alquilo de C1 a C4,

estando constituida dicha secuencia de formula general (I) por 3 a 13 residuos de aminoacidos, caracterizado por que se corresponde con una de las formulas siguientes:

(SEQ ID n.°1) Tyr - Val - Ser - Thr - Pro - Tyr - Asn - NH2

(SEQ ID n.°2) Val - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2

(SEQ ID n.°3) Ser - Thr - Pro - NH2

(SEQ ID n.°4) Leu - His - Ser - Thr - Pro - NH2

(SEQ ID n.°5) Arg - His - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2

(SEQ ID n.°6) His - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2,

y permite restaurar el ritmo circadiano y resincronizar el reloj biologico de las celulas de la piel.

[0008] La presente invencion tiene como segundo objeto una composicion cosmetica que comprende compuestos peptfdicos de formula general (I) de secuencia SEQ ID n.° 1-6.

[0009] El primer objeto de la invencion se refiere a un compuesto peptfdico de la formula general (I) siguiente: en la cual,

R-i-(AA)n- X1 - Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)p-R2

en la cual,

X1 representa una treonina, una serina o es igual a cero,

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Ri representa la funcion amina primaria del aminoacido N-terminal, libre o sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre un grupo acetilo, un grupo benzoflo, un grupo tosilo o un grupo benciloxicarbonilo,

R2 representa el grupo hidroxilo de la funcion carboxilo del aminoacido C-terminal, sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre una cadena alquilo de Ci a C20, o un grupo NH2, NHY o NYY en el que Y representa una cadena alquilo de Ci a C4,

(SEQ ID n.°1) Tyr - Val - Ser - Thr - Pro - Tyr - Asn - NH2

(SEQ ID n.°2) Val - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2

(SEQ ID n.°3) Ser - Thr - Pro - NH2

(SEQ ID n.°4) Leu - His - Ser - Thr - Pro - NH2

(SEQ ID n.°5) Arg - His - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2

(SEQ ID n.°6) His - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2,

[0010] El compuesto peptfdico segun la invencion se caracteriza por que es activador de los productos de los genes del ritmo circadiano. Por «genes del ritmo circadiano» se entienden los genes Clock, Per-i y BMAL-i.

[0011] En una forma de realizacion concreta, la secuencia del compuesto peptfdico es la secuencia SEQ ID n.°3, es decir Ser - Thr - Pro - NH2.

[0012] En otra forma de realizacion, la secuencia del compuesto peptfdico es la secuencia SEQ ID n.°4, es decir Leu -His - Ser - Thr - Pro - NH2.

[0013] El termino «peptido» o «compuesto peptfdico» designa un encadenamiento de dos o varios aminoacidos ligados entre sf por medio de enlaces peptfdicos o enlaces peptfdicos modificados.

[0014] Por «peptido» o «compuesto peptfdico», cabe entender el peptido natural o sintetico de la invencion del modo descrito anteriormente, que se obtenga por proteolisis o de forma sintetica.

[0015] El peptido de formula general (I) segun la invencion puede obtenerse o bien por smtesis qrnmica clasica (en fase solida o en fase homogenea lfquida) o bien por smtesis enzimatica (Kullman et al., J. Biol. Chem. 1980, 225, 8234), a partir de aminoacidos constitutivos o sus derivados.

[0016] El peptido segun la invencion puede ser de origen natural o sintetico. Preferiblemente segun la invencion, el peptido se obtiene por smtesis qrnmica.

[0017] Por ultimo, el principio activo puede ser un peptido unico de secuencia SEQ ID n.° 1-6, o una mezcla de dichos peptidos.

[0018] El compuesto peptfdico segun la invencion puede utilizarse como medicamento.

[0019] El segundo objeto de la presente invencion se refiere a composiciones cosmeticas que comprenden dicho compuesto peptfdico de formula general (I) de secuencia SEQ ID n.° 1-6. De forma preferida, las composiciones segun la invencion se presentan en una forma adaptada para su aplicacion por via topica, comprendiendo un medio cosmetica o dermatologicamente aceptable. Por «cosmetica o dermatologicamente aceptable» se entiende aquellos medios que sirven para un uso en contacto con la piel o las faneras humanas, sin riesgo de toxicidad, de incompatibilidad, de inestabilidad, de respuesta alergica y otros. Preferiblemente, dicho compuesto peptfdico esta presente en la composicion en una concentracion comprendida entre alrededor de 0,0005 y 500 ppm, y preferiblemente en una concentracion comprendida entre 0,01 y 5 ppm. En las composiciones segun la invencion, el compuesto peptfdico se solubiliza previamente en uno o varios disolventes cosmetica o

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dermatologicamente aceptables, como agua, glicerol, etanol, propilenglicol, butilenglicol, dipropilenglicol, diglicoles etoxilados o propoxilados, polioles dclicos, vaselina, aceite vegetal o toda mezcla de dichos disolventes.

[0020] Segun incluso otra forma de realizacion ventajosa, el principio activo segun la invencion se solubiliza previamente en un vector cosmetico o farmaceutico como los liposomas, o se absorbe sobre polfmeros organicos en polvo, soportes minerales como talcos y bentonitas, y mas generalmente se solubiliza en, o se fija sobre, todo vector fisiologicamente aceptable.

[0021] Las composiciones destinadas a su aplicacion sobre la piel pueden presentarse en forma de solucion acuosa o hidroalcoholica, emulsion de agua en aceite o de aceite en agua, microemulsion, gel acuoso o anhidro, serum, o incluso en forma de dispersion de gotas, parche, crema, pulverizador, unguento, pomada, locion, coloide, solucion, suspension u otras. Las composiciones tambien pueden aplicarse sobre las faneras en forma de champu, tinte o nmel para aplicarse con pincel o peine, en concreto sobre las pestanas, cejas o cabello, o incluso en forma de cuidados para las unas como los esmaltes de unas.

[0022] En una forma de realizacion concreta, la composicion segun la invencion contiene ademas al menos otro principio activo que favorece la accion de dicho principio activo peptidico. Se puede citar, de forma no limitadora, las siguientes clases de ingredientes: otros agentes activos peptfdicos, extractos de vegetales, agentes cicatrizantes, antienvejecimiento, antiarrugas, calmantes, antirradicales, anti-UV, agentes que estimulan la smtesis de macromoleculas dermicas o el metabolismo energetico, agentes hidratantes, antibacterianos, antifungicos, antiinflamatorios, anestesicos, agentes que modulan la diferenciacion, la pigmentacion o la despigmentacion cutanea, agentes que estimulan el crecimiento de las unas o el cabello... Preferiblemente, se utilizara un agente antirradicales o antioxidante, o un agente que estimule la smtesis de macromoleculas dermicas, o incluso un agente que estimule el metabolismo energetico.

[0023] Asimismo, pueden anadirse a la composicion aditivos tales como agentes espesantes, emulsionantes, humectantes, emolientes, perfumes, antioxidantes, agentes filmogenos, quelantes, secuestrantes, acondicionadores.

[0024] En todos los casos, el experto en la materia cuidara por que dichos adyuvantes asf como sus proporciones se seleccionen de modo que no resulten perjudiciales para las propiedades ventajosas investigadas de la composicion segun la invencion. Dichos adyuvantes pueden, por ejemplo, corresponderse con un 0,01 a un 20 % del peso total de la composicion. Cuando la composicion de la invencion sea una emulsion, la fase grasa puede representar de 5 a 80 % en peso, y preferiblemente de 5 a 50 % en peso con respecto al peso total de la composicion. Los emulsionantes y coemulsionantes utilizados en la composicion se seleccionaran de entre aquellos clasicamente utilizados en el campo considerado. Por ejemplo, pueden utilizarse en una proporcion que vaya de 0,3 a 30 % en peso con respecto al peso total de la composicion.

[0025] Un tercer objeto de la presente invencion se refiere al compuesto peptfdico de secuencia SEQ ID n.° 1-6 como principio activo activador de Clock. Por peptido «activador de Clock» se entiende todo peptido segun la invencion capaz de aumentar la actividad de Clock, ya sea por aumento de la smtesis proteica de Clock (por modulacion directa o indirecta de la expresion genica de Clock) o por otros procesos biologicos como la estabilizacion de la protema Clock o incluso la estabilizacion de las transcripciones de ARN mensajero.

[0026] Otro objeto de la presente invencion se refiere a una composicion que comprende dicho compuesto peptfdico de formula general (I) de secuencia SEQ ID n.° 1-6 segun dicha invencion para restaurar el ritmo circadiano y resincronizar el reloj biologico de las celulas de la piel.

[0027] Una forma de realizacion concreta de la invencion se refiere a una composicion de este tipo para activar la renovacion celular y estimular el metabolismo celular. Mas en concreto, la invencion consiste en una composicion de este tipo para reducir las disfunciones causadas por el desfase horario y/o el trabajo nocturno. Ventajosamente, la invencion se refiere a dicho compuesto peptfdico de secuencia SEQ ID n.° 1-6 utilizado en una composicion destinada a respetar la cronobiologfa cutanea, principalmente por medio de una aplicacion en cuidado cosmetico de noche.

[0028] Otra forma de realizacion de la invencion consiste en una composicion que comprende dicho compuesto peptfdico de formula general (I) de secuencia SEQ ID n.° 1-6 para prevenir o tratar los signos cutaneos del envejecimiento. Los «signos cutaneos del envejecimiento» incluyen, pero no se limitan a, todas las manifestaciones visibles sobre la piel causadas por el envejecimiento. Principalmente se entienden arrugas, pequenas arrugas, grietas, poros dilatados, imperfecciones, perdida de firmeza, decoloracion, manchas de vejez, queratosis, perdida de colageno y otros cambios de la dermis y la epidermis... Por «signos cutaneos del envejecimiento» tambien se entiende toda modificacion del aspecto exterior de la piel y de las faneras debida al envejecimiento como, por ejemplo, las rugosidades superficiales de la capa cornea, las arrugas y las pequenas arrugas, asf como toda modificacion interna de la piel que no se traduce sistematicamente en un aspecto exterior

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modificado como, por ejemplo, el adelgazamiento de la dermis o toda degradacion interna de la piel tras una exposicion a los rayos ultravioleta (UV). Mas en concreto, la invencion se refiere a la composicion tal y como se ha descrito anteriormente utilizada a fin de reducir los signos de fatiga de la piel.

[0029] Se aplica topicamente en la piel o las faneras a tratar una composicion que contiene una cantidad eficaz de principio activo peptidico para restaurar el ritmo circadiano y resincronizar el reloj biologico de las celulas.

[0030] Asimismo, la composicion se aplica antes de dormir de modo que se respete el ritmo circadiano de la piel para obtener un efecto antienvejecimiento sobre la piel. En efecto, durante la noche, la piel favorece funciones de renovacion asf como procesos metabolicos de smtesis. En consecuencia, la aplicacion de la composicion que se reivindica, al respetar el ritmo biologico de la piel, permite obtener un efecto antienvejecimiento, estimulando la renovacion celular, regenerando y reduciendo de este modo los signos del envejecimiento.

[0031] Los siguientes ejemplos describen y demuestran la eficacia de compuestos peptfdicos como los descritos segun la invencion. Las formulaciones cosmeticas citadas son representativas de la invencion pero se proporcionan unicamente a modo ilustrativo y no deben interpretarse como limitaciones de la presente invencion.

Ejemplo 1: Demostracion del efecto activador del peptido SEQ ID n.° 2 en la expresion de la protema Clock en fibroblastos en cultivo

[0032] Se ha realizado un estudio del efecto activador del peptido SEQ ID n.° 2 mediante la evaluacion de la expresion de las protemas Clock en inmunoelectrotransferencia en fibroblastos en cultivo. La tecnica de la inmunoelectrotransferencia es un metodo semicuantitativo que permite apreciar la proporcion de protemas Clock en las celulas.

Protocolo

[0033] Se cultivan fibroblastos en cultivos en cajas de 100 mm de diametro a 37 °C en una atmosfera humidificada que contiene 5 % de CO2 durante 18 h en presencia o no del peptido SEQ ID n.° 2, diluido 1 % (a partir de una solucion 10-4M). Las celulas se enjuagan y despues se separan del soporte con un tampon de extraccion (20mM TRIS, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 0,2% Triton X10) en presencia de una mezcla de inhibidores de proteasas (Sigma). Las protemas extrafdas de ese modo se centrifugan a 4 °C a 10 000 rpm durante 10 minutos antes de cuantificarse por medio del kit de cuantificacion de protemas por BCA (Pierce). Los lisados celulares se mezclan con un tampon de desnaturalizacion y se someten a una electroforesis SDS-PAGE. El gel utilizado es un Nupage 4-12% (invitrogen). Las protemas se transfieren finalmente a una membrana de nitrocelulosa (Pal corporation). Las membranas se saturan en PBS 5% leche, 0,1% Tween 20, 2h a temperatura ambiente, y despues se incuban a 4 °C toda la noche con un anticuerpo primario anti-Clock a 1/1000 (ABcam) seguido de una incubacion con un anticuerpo secundario anti-conejo Iggy-peroxidasa diluido 1/5000. La revelacion se efectua por medio de un sustrato quimioluminiscente. La evaluacion cuantitativa de las protemas presentes en las celulas se efectua gracias al programa informatico chemiimager (Alpha innotech Corporation USA). La cantidad de protemas se expresa en porcentaje de intensidad luminosa en comparacion con la condicion control que no tiene el tratamiento.

Resultados:

[0034] Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento por medio del peptido SEQ ID n.° 2, diluido a 1 % aumenta de forma significativa la protema Clock en los fibroblastos en cultivo. Los resultados se resumen en la siguiente tabla.

Intensidad (%): Experimento 1

Control sin tratar: 100 %

1 % tratamiento: 154 %

[0035] El experimento se ha realizado varias veces y demuestra por medio de la prueba estadfstica t de Student que el aumento de la expresion de la protema Clock es significativo (p=0,0445).

Conclusion:

[0036] El peptido SEQ ID n.° 2 permite aumentar la expresion de la protema Clock en las celulas dermicas en cultivo.

Ejemplo 2: Demostracion del efecto activador del peptido SEQ ID n.° 3 en la expresion de la proteina Clock, Per-1 y BMAL-1 en biopsias de piel

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[0037] Se ha realizado un estudio del efecto activador del peptido SEQ ID n.° 3 mediante la evaluacion de la expresion de la protema Clock, Per-1 y BMAL-1 en biopsias de piel ex vivo.

Protocolo

[0038] Los estudios ex vivo por inmunomarcado han permitido poner de manifiesto la expresion de la protema Clock, Per-1 y BMAL-1 en muestras de piel. Las muestras de piel humana se ponen en cultivo en la interfaz aire/lfquido. El peptido SEQ ID n.° 3 diluido a 1 % (a partir de una solucion 10'4M) se aplica de forma topica en dichas muestras durante 48 h.

[0039] Las muestras de piel no tratadas por el peptido SEQ ID n.° 3 sirven de control. Las muestras de piel se fijan con formaldefudo 10% y se incluyen en parafina. Se realizan cortes de 3 pm con microtomo. El inmunomarcado se efectua tras un desparafinado y un desenmascaramiento de los sitios antigenicos. El inmunomarcado para la protema Clock se efectua por medio de un anticuerpo (ABcam) diluido 1/250 y un anticuerpo secundario 1/50 acoplado a un fluorocromo.

[0040] El inmunomarcado para la protema Per-1 se efectua por medio de un anticuerpo policlonal (Cosmobio) diluido 1/100 y un anticuerpo secundario 1/50 acoplado a un fluorocromo.

[0041] El inmunomarcado para la protema BMAL-1 se efectua por medio de un anticuerpo policlonal (Aviva Systems Biology) diluido 1/120 y un anticuerpo secundario 1/50 acoplado a un fluorocromo.

[0042] Las laminas se montan entonces en un medio adecuado y se observan con microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse E600).

Resultados:

[0043] Los resultados obtenidos muestran que las pieles tratadas con el peptido SEQ ID n.° 3 expresan cantidades de protema Clock, Per-1 y BMAL-1 superiores a las pieles sin tratar.

[0044] La evaluacion semicuantitativa del marcado se efectua por observacion microscopica y se resume en la siguiente tabla.

: Sin tratar Tratado con peptido SEQ ID n.°3 diluido a 1 %

Marcado protema Clock: +/- +

Marcado protema PER-1: + + + +

Marcado BMAL-1: + + + +

Conclusion:

[0045] La administracion de peptido SEQ ID n.° 3 permite aumentar la expresion de las protemas Clock, Per-1 y BMAL-1 en una piel irradiada y tratada.

Ejemplo 3: Demostracion del efecto activador del peptido SEQ ID n.° 3 en la expresion de la protema Clock en biopsias de piel en el envejecimiento

[0046] Se ha realizado un estudio del efecto activador del peptido SEQ ID n.° 3 mediante la evaluacion de la expresion de la protema Clock en modelos de piel, envejecidos artificialmente en cultivo. El analisis se ha llevado a cabo tras 62 h y 134 h de cultivo.

Protocolo

[0047] Los estudios ex vivo por inmunomarcado han permitido demostrar la expresion de la protema Clock en muestras de piel envejecidas en cultivo. Las muestras de piel humana se ponen en cultivo en la interfaz aire/lfquido durante 62 h y 134 h. El peptido SEQ ID n.° 1 diluido a 1 % (a partir de una solucion 10‘4M) se aplica de forma topica en dichas muestras 2 veces al dfa durante el tiempo del experimento.

[0048] Las muestras de piel no tratadas por el peptido SEQ ID n.° 3 sirven de control. Las muestras de piel se fijan con formaldefudo 10% y se incluyen en parafina. Se realizan cortes de 3 pm con microtomo. El inmunomarcado se efectua tras un desparafinado y un desenmascaramiento de los sitios antigenicos. El inmunomarcado para la protema Clock se efectua por medio de un anticuerpo anti-conejo (ABcam) diluido 1/250 y un anticuerpo secundario 1/50 acoplado a un fluorocromo.

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[0049] Las laminas se montan entonces en un medio adecuado y se observan con microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse E600).

Resultados:

[0050] Los resultados obtenidos muestran que el marcado de la protema Clock (esencialmente epidermico) aumenta tras 62 horas de cultivo con respecto a las laminas control sin tratar. Este aumento se mantiene en el tiempo ya que al cabo de 134 horas el marcado de la protema Clock aumenta en gran medida con respecto a las pieles control sin tratar. La siguiente tabla da una evaluacion visual del marcado.

: Sin tratar Tratado con peptido SEQ ID n°3 diluido a 1 %

Marcado protema Clock 62 h: + + +

Marcado protema Clock 134 h: - + +

Conclusion:

[0051] La aplicacion del compuesto peptfdico SEQ ID n.° 3 permite aumentar la expresion de la protema Clock en biopsias de piel tratadas y envejecidas artificialmente en cultivo.

Ejemplo 4: Demostracion del efecto antienvejecimiento del peptido SEQ ID n.° 3 en fibroblastos en cultivo

[0052] Se ha realizado un estudio del efecto antienvejecimiento del peptido SEQ ID n.° 3 mediante la evaluacion de la actividad de la beta-galactosidasa en fibroblastos en cultivo a corto y largo plazo. En efecto, la beta- galactosidasa es conocida por estar presente en las celulas senescentes, mientras que no se encuentra actividad beta-galactosidasa en celulas presenescentes, quiescentes o inmortales.

Protocolo

[0053] Fibroblastos en cultivos en Labteck 8 pocillos se mantienen 2 semanas (efecto corto plazo) o 7 semanas (efecto largo plazo) en presencia o no del peptido SEQ ID n.° 3, diluido 1 % (a partir de una solucion 10'4M). El tratamiento se efectua una vez al dfa. Las celulas sin tratar pero mantenidas en cultivo durante 2 o 7 semanas en funcion de las necesidades del experimento sirven de control. El dfa del marcado, las celulas se enjuagan y se fijan en una mezcla (2 % glutaraldetudo- 2 % formaldetudo) durante 3 minutos. Las celulas se enjuagan y se aplican 300 pl de (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosidasa), denominada comunmente X-gal (sustrato de la beta-galactosidasa). La incubacion se efectua 24 h en la incubadora de CO2, y despues las celulas se enjuagan y la Labteck se monta rapidamente en un medio adecuado. La observacion se efectua con microscopio de transmision. El principio es simple, cuando las celulas son senescentes y contienen la beta-galactosidasa, el sustrato X-gal se escinde en un producto azul insoluble.

Resultados:

[0054] La actividad beta-galactosidasa se mide en las celulas control sin tratar por medio de una coloracion de estas en azules. La actividad beta-galactosidasa se reduce en gran medida en las celulas tratadas por el peptido SEQ ID n.° 3. Este efecto se observa a la vez en las celulas tratadas a corto plazo (2 semanas de experimento) y tambien a largo plazo cuando las celulas se tratan durante 7 semanas consecutivas.

Conclusion:

[0055] La administracion del peptido SEQ ID n.° 3 permite poner de manifiesto un efecto antienvejecimiento en fibroblastos en cultivo envejecidos artificialmente durante 2 o 7 semanas.

Ejemplo 5: preparacion de una crema antienvejecimiento

[0056]

Nombres comerciales: Denominacion INCI % en peso

Fase A

Montanov 68: Cetearyl Alcohol (and) Cetearyl Glucoside 6,00

Squalane
Squalane: 3,00

Cetiol SB 45: Butyrospermum Parkii (Shea Butter) 2,00

Waglinol 250: Cetearyl Ethylhexanoate 3,00

Nombres comerciales: Denominacion INCI % en peso

Amerchol L-101: Mineral Oil (and) Lanolin Alcohol 2,00

Abil 350: Dimethicone 1,50

BHT
BHT: 0,01

Coenzima Q 10: Ubiquinone 0,10

Fase B

Aceite de aguacate: Persea Gratissima (Avocado) Oil 1,25

Phenopip: Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and) Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben 0,75

Fase C

Agua desmineralizada: Aqua (Water) c.s.p.

Butylene Glycol
Butylene Glycol: 2,00

Glucam E10: Methyl Gluceth-10 1,00

Allantoin
Allantoin: 0,15

Carbopol Ultrez 10: Carbomer 0,20

Fase D

TEA: Triethanolamine 0,18

Fase E

Peptido SEQ ID n.°2: 1 ppm

GP4G: Water (and) Artemia Extract 1,50

Collaxyl: Water (and) Butylene Glycol (and) Hexapeptide-9 3,00

Fase F

Perfume: Parfum (Fragrance) c.s.p.

Colorante: c.s.p.

Procedimiento:

[0057] Preparar y fundir la fase A a 65-70 °C. Calentar la fase C a 65-70 °C.

5 antes de emulsionar A en B. A alrededor de 45°C, el carbomer se neutraliza

A continuacion se anade la fase E bajo una agitacion ligera y se continua fase F se anade entonces si asf se desea.

SEQUENCE LISTING

[0058]

10

<110> ISP Investments Inc

<120> PEPTIDOS NOVEDOSOS ANTIENVEJECIMIENTO Y COMPOSICION COSMETICA Y/O FARMACEUTICA QUE LOS CONTIENE

<130> Bv PCT 09-114

15 <150> FR 0900066

<151> 2009-01-09

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 20 <211> 7

La fase B se anade a la fase A justo por medio de la adicion de la fase D. con el enfriamiento hasta 25 °C. La

5

10

15

20

25

30

35

<212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Synthetic peptide <220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> AMIDATION

<400>1

Tyr Val Ser Thr Pro Tyr Asn 1 5

<210> 2 <211>5 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Synthetic peptide <220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> AMIDATION

<400> 2

Val Ser Thr Pro Glu 1 5

<210>3 <211>3 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Synthetic peptide <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> AMIDATION

<400> 3

Ser Thr Pro 1

<210> 4 <211>5 <212> PRT <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

<220>

<223> Synthetic peptide <220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> AMIDATION

<400>4

Leu His Ser Thr Pro 1 5

<210>5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Synthetic peptide <220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> AMIDATION

<400> 5

Arg His Ser Thr Pro Glu 1 5

<210> 6 <211>5 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Synthetic peptide <220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5)

<223> AMIDATION

<400> 6

His Ser Thr Pro Glu 1 5

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

REIVINDICACIONES

1. Compuesto peptidico de la formula general (I) siguiente:

Ri-(AA)n- X1 - Ser - Thr - Pro - X2 - (AA)p - R2

en la cual,

X1 representa una treonina, una serina o es igual a cero,

X2 representa una isoleucina, una leucina, una valina, una alanina, una glicina o es igual a cero,

AA representa un aminoacido cualquiera salvo prolina, o uno de sus derivados, y n y p son numeros enteros comprendidos entre 0 y 4,

R1 representa la funcion amina primaria del aminoacido N-terminal, libre o sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre un grupo acetilo, un grupo benzoflo, un grupo tosilo o un grupo benciloxicarbonilo,

R2 representa el grupo hidroxilo de la funcion carboxilo del aminoacido C-terminal, sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre una cadena alquilo de C1 a C20, o un grupo NH2, nHy o NYY en el que Y representa una cadena alquilo de C1 a C4, estando constituida dicha secuencia de formula general (I) por 3 a 13 residuos de aminoacidos, caracterizado por que se corresponde con una de las formulas siguientes:

(SEQ ID n.°1) Tyr - Val - Ser - Thr - Pro - Tyr - Asn - NH2

(SEQ ID n.°2) Val - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2

(SEQ ID n.°3) Ser - Thr - Pro - NH2

(SEQ ID n.°4) Leu - His - Ser - Thr - Pro - NH2

(SEQ ID n.°5) Arg - His - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2

(SEQ ID n.°6) His - Ser - Thr - Pro - Glu - NH2,

y permite restaurar el ritmo circadiano y resincronizar el reloj biologico de las celulas de la piel.
2. Compuesto peptfdico segun la reivindicacion 1, caracterizado por que se emplea como medicamento.
3. Composicion cosmetica que comprende como principio activo dicho compuesto peptfdico segun la reivindicacion 1.
4. Composicion cosmetica segun la reivindicacion 3, caracterizada por que se presenta en una forma adaptada para su aplicacion por via topica, comprendiendo un medio cosmeticamente aceptable.
5. Composicion cosmetica segun una de las reivindicaciones 3 o 4, caracterizada por que dicho compuesto peptfdico esta presente en la composicion en una concentracion comprendida entre alrededor de 0,0005 y 500 ppm, y preferiblemente en una concentracion comprendida entre 0,01 y 5 ppm.
6. Composicion cosmetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada por que dicho principio activo peptfdico se solubiliza en uno o varios disolventes, como agua, glicerol, etanol, propilenglicol, butilenglicol, dipropilenglicol, diglicoles etoxilados o propoxilados, polioles dclicos, vaselina, aceite vegetal o toda mezcla de dichos disolventes.
7. Composicion cosmetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizada por que contiene ademas al menos otro principio activo que favorece la accion de dicho principio activo peptfdico seleccionado entre un agente antirradicales o antioxidante, o un agente que estimula la smtesis de macromoleculas dermicas, o incluso un agente que estimula el metabolismo energetico.
8. Compuesto peptfdico segun se define en la reivindicacion 1, como principio activo activador de Clock.

10
9. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 para restaurar el ritmo circadiano y resincronizar el reloj biologico de las celulas de la piel.
10. Composicion segun la reivindicacion 9 para activar la renovacion celular y estimular el metabolismo celular.
11. Composicion segun la reivindicacion 9 para reducir las disfunciones causadas por el desfase horario y/o el trabajo nocturno.
12. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, para prevenir o tratar los signos cutaneos del envejecimiento, y reducir los signos de fatiga de la piel.
13. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizada por que se aplica en la piel o en las faneras a tratar antes de dormir de modo que respete el ritmo circadiano de la piel.