ES2540538T3 - Anticuerpos anti-TSHR humanos - Google Patents

Abstract

Una molécula de anticuerpo recombinante o monoclonal humana que se une al TSHR y que reduce la estimulación inducida por ligando del TSHR pero no tiene ningún efecto en la actividad constitutiva de TSHR en donde la molécula de anticuerpo humana aislada tiene la característica de autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente de inhibir la unión de TSH y M22 al TSHR, y en donde la molécula de anticuerpo humana aislada comprende SEC ID Nº: 70 (CDR I), SEC ID Nº: 71 (CDR II) y SEC ID Nº: 72 (CDR III) y SEC ID Nº: 42 o 52 (CDR I), SEC ID Nº: 43 o 53 (CDR II) y SEC ID Nº: 44 o 54 (CDR III).

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-TSHR humanos

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos (MAb) reactivos con el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) (TSHR). Uno de los MAb humanos (K1-18) tiene la capacidad de unirse con el TSHR y de estimular la actividad de AMP cíclico de TSHR. El otro MAb humano (K1-70) tiene la capacidad de unirse con el TSHR y de bloquear la acumulación de AMP cíclico mediada por anticuerpos estimulantes de TSH y TSHR. Ambos MAb humanos se aislaron de los linfocitos periféricos de un paciente que presentaba síntomas clínicos de hipotiroidismo.

Antecedentes

15 La función tiroidea está regulada por TSH secretada por la hipófisis (Szkudlinski MW, et al 2002. Physiological Reviews 82: 473-502). La TSH se une con TSHR en la superficie de tirocitos y esto es la primera etapa en el inicio de la cascada de señalización de TSHR. La unión de TSH con el TSHR da lugar a la estimulación de la formación o liberación de hormonas tiroideas; tirosina (T4) y tri-yodotironina (T3). Un mecanismo de retroalimentación que implica los niveles de T4 y T3 en la circulación y hormona liberadora de tirotropina (TRH) secretada por el hipotálamo controla la liberación de TSH que a su vez controla la estimulación de la tiroides y los niveles de hormonas tiroideas en suero (Szkudlinski MW, et al, 2002, mencionado anteriormente). El TSHR es un receptor acoplado a proteína G y está compuesto de tres dominios: un dominio de repetición rico en leucina (LRD), un dominio de escisión (CD) y un dominio transmembrana (TMD) (Núñez Miguel R, et al 2004. Thyroid 14: 991-1011).

25 Está bien documentado en la técnica que algunos pacientes con enfermedad tiroidea autoinmunitaria (AITD) desarrollan autoanticuerpos que son reactivos con el TSHR (Rees Smith B, et al 1988. Endocrine Reviews 9: 106121). Hay dos tipos principales de autoanticuerpos de TSHR (TRAb); un tipo estimulante y un tipo de bloqueo. Los autoanticuerpos de tipo estimulante de la tiroides se unen con el TSHR e imitan las acciones de la TSH estimulando de este modo la tiroides para que produzca altos niveles de T4 y T3; estos autoanticuerpos también se describen como TRAb con actividad estimulante o actividad agonista de TSH (Rees Smith B, et al 2007. Thyroid 17: 923-938). El mecanismo de control de retroalimentación de la función tiroidea ya no es eficaz en presencia de autoanticuerpos estimulantes de la tiroides y pacientes que presentan los síntomas clínicos de una tiroides hiperactiva caracterizado por un exceso de hormonas tiroideas en suero y sus consecuencias metabólicas. Esta afección se conoce como

35 enfermedad de Graves. Los TRAb con actividad estimulante también pueden interaccionar con los TSHR en tejido – orbital y contribuir al desarrollo de las señales oculares de enfermedad de Graves. Se ha descrito en detalle en el documento WO 2004/050708A2 un autoanticuerpo monoclonal humano que actúa como un estimulador potente de la tiroides (hMAb TSHR1; también denominado M22). La estructura del complejo de M22 Fab unido con el TSHR LRD se ha resuelto por cristalografía de rayos X a una resolución de 2,55 A como se describe en el documento WO 2008/025991A1. El análisis de la estructura del complejo de TSHR -M22 proporciona información detallada acerca de los restos del receptor y los restos del autoanticuerpo estimulante implicados en las interacciones entre sí.

Se ha usado M22 en ELISA para medición del anticuerpo de TSHR (Zöphel, K et al, Clinica Chimica Acta 2009 y Zöphel, K et al, Clinica Chimica Acta 2008).

45 Los TRAb de tipo de bloqueo aparecen menos frecuentemente en pacientes con AITD que los autoanticuerpos estimulantes. Los autoanticuerpos de tipo de bloqueo se unen con el TSHR, evitan que TSH se una con el receptor pero no tienen capacidad para estimular la actividad de TSHR. En consecuencia la formación y secreción de hormonas tiroideas (T4 y T3) se reduce en gran medida y los pacientes con este tipo de TRAb pueden presentar síntomas clínicos de un tiroides infraactivo (hipotiroidismo). Los autoanticuerpos de tipo bloqueo se conocen como TRAb con actividad de bloqueo o actividad antagonista de TSH (Rees Smith B, et al 1988 mencionado anteriormente y Rees Smith B, 2007 et al mencionado anteriormente). Los TRAb con actividad de bloqueo cuando están presentes en suero de mujeres embarazadas cruzan la placenta y pueden bloquear los TSHR en la tiroides fetal conduciendo a hipotiroidismo neonatal y graves consecuencias para el desarrollo. Además, los TRAb con actividad de bloqueo

55 pueden encontrarse en leche materna de madres afectadas y pueden provocar hipotiroidismo clínico en el bebé (Evans C, et al 2004 European Journal of Endocrinology 150: 265-268). Un autoanticuerpos humano para el TSHR con actividad antagonista de TSHR (5C9) se ha descrito en detalle en el documento WO 2008/099185A1. Los síntomas clínicos en pacientes con AITD y TRAb en circulación están relacionados con el efecto de autoanticuerpos en la actividad de TSHR, es decir si los TRAb provocan estimulación o bloqueo. Se ha propuesto, sin embargo, que en algunos pacientes puede estar presente simultáneamente una mezcla de TRAb de estimulación y bloqueo con la presentación clínica general relacionada con mayor concentración y/o actividad de un tipo de los TRAbs (Rees Smith B et al 1988 mencionado anteriormente; Furmaniak J et al 1993 Springer Seminars in Immunopathology 14: 309-321 y Schott M et al 2005 Trends in Endocrinology and Metabolism 16: 243-248). Además, las concentraciones y/o actividades de TRAb estimulantes o de bloqueo pueden variar en el mismo paciente durante la evolución de la

65 enfermedad y de hecho se ha presentado fluctuación de síntomas de hipo a hipertiroidismo en el mismo paciente a lo largo del tiempo (Rees Smith B et al 1988 mencionado anteriormente; Furmaniak J y Rees Smith B 1993 mencionado anteriormente y Schott M et al 2005 mencionado anteriormente). Sin embargo, los intentos de separar los TRAb con diferente bioactividad o de diferenciar entre estos TRAb en muestras de suero usando bioensayos disponibles en la actualidad son difíciles. Más recientemente, la invención descrita en el documento WO2006/016121A1 proporciona un medio para diferenciar entre tipos de TRAb estimulantes y de bloqueo usando

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5 bioensayos que emplean TSHR mutado en R255.

La TSH recombinante humana (Thyrogen®) es una preparación de TSH humana producida según las regulaciones de GMPc como una proteína recombinante y aprobada por la FDA de Estados Unidos como una ayuda para el diagnóstico de cáncer tiroideo residual o recurrente (Duntas LH, Cooper DS 2008 Thyroid 18: 509-516). El control de los pacientes con cáncer tiroideo después del tratamiento incluye la estimulación de restos de tiroides o metástasis con TSH humana recombinante seguido de una exploración de tiroides y/o medida de los niveles de tiroglobulina en suero (Duntas LH y Cooper DS 2008 mencionado anteriormente). La gonadotropina coriónica humana es una hormona producida durante el embarazo que tiene efectos leves estimulantes de la tiroides (Grossmann M et al 1997 Endocrine Reviews 18: 476-501). La caracterización de los tipos de TRAb estimulantes o de bloqueo y cómo

15 interaccionan con el TSHR tiene importancia clínica para el desarrollo de métodos mejorados para diagnosticar y controlar diferentes formas de AITD. Además estos estudios son críticos para desarrollar nuevas estrategias para el control de enfermedades asociadas con una respuesta autoinmunitaria al TSHR. La disponibilidad de estimuladores de la tiroides potentes distintos de TSH humana recombinante proporcionan nuevas alternativas para controlar y tratar a pacientes con cáncer de tiroides.

Los anticuerpos aislados de linfocitos de sangre periférica de pacientes con enfermedad de Graves bloquean la unión de TSH a TSHR, según comunicó Valente et al (1982, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 79: es 6680-6684 presenta los específicos del TSHR) mientras que los anticuerpos antagonistas y agonistas humanos se han comunicado por Kohn et al (1997, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 82: 3998

25 4009).

Solicitudes de Patente previas relacionadas

La invención descrita en el documento WO2004/050708A2 proporciona detalles de las propiedades de un autoanticuerpo monoclonal humano (MAb) con actividad estimulante potente y su interacción con el TSHR. Las interacciones entre este otro autoanticuerpo (M22) y el TSHR LRD se han resuelto a nivel molecular a partir de un análisis de difracción de rayos X (resolución de 2,55 A) de un complejo entre las dos moléculas como se describe en el documento WO2008/025991A1. El documento WO2006/016121A1 desvela una preparación del TSHR mutado que incluye al menos una mutación puntual que puede usarse en la exploración diferencial e identificación de 35 autoanticuerpos de TSHR estimulantes en suero del paciente, autoanticuerpos de TSHR de bloqueo en suero del paciente y TSH en una muestra de fluido corporal del Sumario de la Invención de un paciente que se está explorando. También se describe en el documento WO2004/050708A2 la generación y caracterización de un MAb de ratón (9D33) con actividad de bloqueos de TSRH. 9D33 se une con el TSHR con alta afinidad (2 x 1010 l/mol) y es un antagonista eficaz de TSH, hMAb TSHR1 (M22) y TRAb en suero de paciente con actividades estimulantes o de bloqueo. El documento WO2008/099185A1 desvela el aislamiento y caracterización de MAb humano (5C9) para el TSHR que es un antagonista eficaz del TSH y el TRAb estimulante en sueros de pacientes. Se ha descubierto que 5C9 inesperadamente inhibía la actividad constitutiva de TSHR (también denominada la actividad basal de TSHR), es decir la producción de AMP cíclico en un sistema de ensayo en ausencia de TSH o M22. Además, se ha descubierto que 5C9 inhibe la actividad de AMP cíclico de TSHR asociada con mutaciones de activación de TSHR.

45 El documento WO2008/091981A2 describe un MAb de ratón que tiene la capacidad de suprimir la actividad constitutiva de TSHR y los métodos para usar el MAb para tratar enfermedades tiroideas incluyendo hipertiroidismo cáncer de tiroides. Las propiedades del MAb descrito en el documento WO2008/091981A2 también se desvelan en Chen CR et al 2007 Endocrinology 148: 2375-2382.

Presente invención

Se han aislado anticuerpos K1-18 y K1-70 de linfocitos de sangre periférica de una paciente de 54 años de edad con hipotiroidismo y altos niveles de autoanticuerpos de TSHR. La paciente tenía un historial de 8 años de AITD y presentó en primer lugar hipertiroidismo y respondió al tratamiento con metimazol que continuó durante 3 años. Sin

55 embargo, aproximadamente 10 meses después de alcanzar el estado eutiroideo (es decir que tiene función normal) la paciente desarrolló hipotiroidismo y se trató con tirosina. La paciente tuvo hipotiroidismo durante aproximadamente 4,5 años en el momento de la recogida de sangre. En el momento del aislamiento de linfocitos los niveles de TRAb en suero eran de 160 unidades/l medidos por el ensayo de inhibición de la unión a TSH. El suero también mostró la capacidad de bloquear la estimulación por TSH del TSHR (ensayo basado en AMP cíclico). Los autoanticuerpos en suero para peroxidasa tiroidea fueron positivos a >500 unidades/ml (las Unidades son de la preparación de referencia 66/367 del Instituto Nacional para Patrones y Control (NIBSC) Potters Bar, Reino Unido).

Los linfocitos del paciente se inmortalizaron por infección con virus de Epstein Barr (EBV) y los sobrenadantes de cultivos de las células infectadas se exploraron con respecto a su capacidad para inhibir la unión de 125I-TSH con 65 tubos recubiertos con TSHR. Se fusionaron células de cultivos celulares positivos con una línea celular de ratón/humana y se exploraron como anteriormente. Se obtuvieron 2 clones estables que secretaban autoanticuerpos

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de TSHR. Se purificaron IgG de sobrenadantes en los cultivos de clones y se evaluó la capacidad de los 2 MAb (K118 y K1-70) IgG para unirse con el TSHR e influir en la actividad de TSHR. En particular, se estudió la capacidad de K1-18 y K1-70 para inhibir la unión de TSH con el TSHR. La capacidad de K1-18 para estimular el TSHR también se estudió y se comparó con la actividad de diversos otros estimulantes de la tiroides. La capacidad de K1-70 para

5 inhibir la capacidad de TSH para estimular el TSHR se estudió y se comparó con las actividades de otros antagonistas de TSH. Además, se evaluó la capacidad de TRAb de suero de paciente estimulantes o de bloqueo para inhibir la unión de TSHR y la actividad biológica de K1-18 y K1-70. Además, se investigó el uso de K1-18 y K170 en ensayos para anticuerpos de TSHR, TSH y compuestos relacionados. Los genes de región variable (región V) de las cadenas pesadas (HC) y ligeras (LC) de K1-18 y K1-70 se secuenciaron y se asignaron las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Además, se cristalizaron preparaciones purificadas de K1-70 Fab y se analizaron usando métodos de difracción de rayos X. Estos análisis proporcionaron detalles a nivel molecular acerca de la estructura general de K1-70 Fab y la topografía del sitio de unión a antígeno de K1-70.

De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona una molécula de anticuerpo humana aislada que se une

15 con un TSHR y que reduce la estimulación inducida por ligando de dicho TSHR pero no tiene ningún efecto en la actividad constitutiva de dicho TSHR en el que la molécula de anticuerpo humano aislada tiene la característica de autoanticuerpos de TSHR de suero de paciente, que inhiben la unión de TSH y M22 con el TSHR, y en el que la molécula de anticuerpo humano aislada comprende las SEC ID Nº: 70 (CDR I), SEC ID Nº: 71 (CDR II) y SEC ID Nº: 72 (CDR III) y SEC ID Nº: 42 o 52 (CDR I), SEC ID Nº: 43 o 53 (CDR II) y SEC ID Nº: 44 o 54 (CDR III).

Preferentemente la molécula de anticuerpo humana aislada o fragmento de la misma tiene al menos una característica adicional de autoanticuerpos de receptor de TSH de suero de paciente seleccionados de los que tenían una afinidad de unión por el TSHR de al menos 108 l/mol, preferentemente al menos 109 l/mol y la capacidad para provocar bloqueo detectable de la estimulación de TSHR inducida por ligando a una concentración de

25 anticuerpo de menos de 1 µg/ml, preferentemente menos de 0,1 µg/ml. El anticuerpo humano aislado puede ser un antagonista de TSH y/o autoanticuerpos estimulantes de la tiroides y/o de gonadotropina coriónica humana.

La molécula de anticuerpo aislada puede comprender un dominio VH de anticuerpo seleccionado de la secuencia de aminoácidos de la Figura 5b y 5d (SEC ID Nº: 41 y 51, respectivamente). La molécula de anticuerpo aislada puede comprender un dominio VH de anticuerpo que consiste preferentemente en la secuencia de aminoácidos de la Figura 5b y 5d (SEC ID Nº: 41 y 51, respectivamente). La molécula de anticuerpo aislada puede comprender un dominio VL de anticuerpo seleccionado preferentemente de una secuencia de aminoácidos de la Figura 6d (SEC ID Nº: 69). La molécula de anticuerpo aislada puede comprender un dominio VL de anticuerpo que consiste preferentemente en una secuencia de aminoácidos de la Figura 6d (SEC ID Nº: 69).

35 En la mayoría de las aplicaciones un dominio VH en una molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención se dispondrá con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión a TSHR. En algunas aplicaciones puede proporcionarse un dominio VH solamente para unirse con un TSHR.

Se conocen bien en la técnica métodos para injertar dominios de anticuerpo de modo que pueda construirse alguna molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención usando dominios VH y VL o partes de los mismos de diferentes fuentes.

La expresión “molécula de anticuerpo” y términos afines, tales como “moléculas de anticuerpo”, usados en el

45 presente documento en relación con moléculas de anticuerpo de la invención abarca, de acuerdo con el contexto, restos de unión basados en inmunoglobulina tales como anticuerpos monoclonales, recombinantes, sintéticos y policlonales, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos y también restos de unión, que pueden sustituirse por el destinatario experto en la materia para dichos restos de unión basados en inmunoglobulina, tales como anticuerpos de dominio, diacuerpos, así como restos IgG[Delta]CH2, F(ab’)2), Fab, scFv, VL, VH, dsFv, Minicuerpos, Triacuerpos, Tetracuerpos, (scFv)2, scFv-Fc, F(ab’)3 (Holliger P, et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448.), (Carter PJ 2006 Nat Rev Immunol 6: 343-357). La expresión también abarca fragmentos de dichas entidades, preferentemente fragmentos que se unen con TSHR, y más preferentemente tienen los efectos de K1-18

o K1-70.

55 Las expresiones “receptor de hormona estimulante de la tiroides” y “TSHR” se refieren a un TSHR humano de longitud completa que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 7a (SEC ID Nº: 74) o variantes o fragmentos de la misma que tienen alta homología con dicho TSHR. Preferentemente, dichas variantes y fragmentos tienen del 70 al 99,9 % de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 7a (SEC ID Nº: 74). En realizaciones preferidas dichas variantes o fragmentos son al menos el 70 % idénticos, más preferentemente al menos 80 % idénticos, altamente preferentemente al menos 90 % idénticos, particularmente preferentemente al menos 95 % idénticos y especialmente preferentemente 99,9 % idénticos a esa secuencia.

El anticuerpo aislado de la invención puede estar preferentemente en forma de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante o un anticuerpo sintético. Pueden incorporarse las CDR I, II o III de los dominios VH o VL 65 de K1-70 en un armazón adecuado. Pueden producirse variantes de los dominios VH y VL de K1-70 y sus CDR por modificaciones usando métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Dichas variantes pueden comprender

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una o más variaciones de secuencias de aminoácidos, incluyendo las mutaciones de adición, deleción, sustitución o inserción. El armazón de K1-70 también puede modificarse en moléculas de anticuerpo de acuerdo con la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un nucleótido aislado que codifica una molécula de 5 anticuerpo aislada o fragmento de la misma de acuerdo con la invención.

El nucleótido aislado puede comprender una secuencia de nucleótidos de 5a (SEC ID Nº 37), 5c (SEC ID Nº 46) o 6c (SEC ID Nº 64).

Puede proporcionarse una pluralidad de dichos nucleótidos, por ejemplo en una biblioteca de presentación en bacteriófagos. Dichas bibliotecas de presentación en bacteriófagos pueden usarse para expresar diversas moléculas de anticuerpo o fragmentos de las mismas tales como dominios aislados.

La invención también proporciona un vector que incluye un nucleótido aislado de acuerdo con la invención, o una

15 célula hospedadora incluyendo dicho vector o un nucleótido de acuerdo con la invención. El vector puede ser un plásmido, virus o fragmento del mismo. Los destinatarios expertos en la materia conocen muchos tipos diferentes de vectores. La célula aislada puede expresar un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferentemente, la célula aislada secreta un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferentemente, una célula aislada de acuerdo con la invención es de una línea celular de hetero-hibridoma estable.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con la invención y, opcionalmente, un vehículo.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede ser adecuada para administración a seres

25 humanos. Preferentemente, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención no tiene ningún efecto adverso significativo en el sistema inmunitario del sujeto.

Se contemplan diversos formatos para composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de una afección relacionada con la tiroides puede estar en un formato inyectable. Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de enfermedad oftálmica de Graves está preferentemente en forma de colirio. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un anticuerpo aislado de acuerdo con la invención, con un vehículo, adyuvante o transportador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos, adyuvantes y transportadores farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención 35 incluyen, pero sin limitación, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias de tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato magnésico, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, poliletilenglicol y lanolina. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por vía oral, por vía parenteral, por pulverización, por inhalación, por vía tópica, por colirios, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal o mediante un depósito implantado. Los inventores prefieren la administración oral o administración por inyección. El término “parenteral” como se usa en el presente documento incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, 45 intracutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con técnicas conocidas en este campo usando agentes de dispersión o humectantes adecuados (tales como, por ejemplo, Tween 80) y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están manitol, agua, solución de Ringer y solución de cloruro sódico isotónica. Además, se emplean convencionalmente aceites estériles, fijos, como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite no volátil insípido incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Son útiles ácidos grasos 55 tales como ácido oleico y sus derivados de glicéridos en la preparación de inyectables, así como aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones en aceite también pueden contener un diluyente de alcohol de cadena larga o dispersante tal como Ph. Helv o un alcohol similar. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero sin limitación, cápsulas, comprimidos, y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que se usan habitualmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden normalmente agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. Para administración oral en una fórmula de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se administran suspensiones acuosas por vía oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se 65 desea, pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes y/o saporíferos y/o colorantes. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden proporcionarse en forma de supositorios para administración rectal. Estas composiciones pueden prepararse mezclando un compuesto de la presente invención con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar los componentes activos. Dichos materiales incluyen pero sin limitación, manteca de cacao, cera de abeja y polietilenglicoles. La administración tópica de las composiciones 5 farmacéuticas de la presente invención es especialmente útil cuando el tratamiento deseado implica áreas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica. Para aplicación por vía tópica a la piel, la composición farmacéutica debería formularse en una pomada adecuada que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en un vehículo. Los vehículos para administración tópica de los compuestos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, compuesto de polixoetilenopolioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, la composición farmacéutica puede formularse con una loción o crema adecuada que contiene el compuesto activo disuelto o suspendido en un vehículo. Los vehículos adecuados, incluyen pero sin limitación, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de cetil ésteres, alcohol ceterarílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden aplicarse por vía tópica al tracto intestinal inferior por formulación de supositorio

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15 rectal o en una formulación de enema adecuada. También se incluyen en la presente invención parches transdérmicos por vía tópica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por aerosol nasal o inhalación. Dichas composición se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en este campo de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes conocidos en la técnica.

Los anticuerpos de acuerdo con el primer aspecto mencionado de la invención tienen aplicaciones potenciales para tratamiento y control de afecciones asociadas con la activación del TSHR por ejemplo: enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves o hipertiroidismo debido a niveles anómalos de TSH o hCG.

25 De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona el uso de una molécula de anticuerpo aislada o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención en terapia. La invención también proporciona una molécula de anticuerpo aislada o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en terapia.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un método in vitro para caracterizar la actividad de los anticuerpos de TSHR, TSH o gonadotropina coriónica humana, comprendiendo el método una etapa que incluye el uso de una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un método de diagnóstico in vitro para detectar

35 autoanticuerpos de analitos para el TSHR que comprende poner en contacto una muestra, que se ha aislado de un sujeto que se cree que contiene dichos analitos de autoanticuerpos y una molécula de anticuerpo de la invención con un TSHR o un fragmento del mismo. El TSHR o fragmento del mismo puede mutarse en arginina 255 de modo que interaccione preferentemente con analitos de anticuerpos de TSHR de tipo bloqueo en comparación con analitos de anticuerpos de TSHR de tipo estimulante. La unión del analito con TSHR260 o TSHR260 mutado en arginina 255 puede detectarse por la inhibición de la unión de un anticuerpo de TSHR marcado directa o indirectamente o fragmento del mismo con dicho TSHR260 o TSHR260 mutado en la arginina 255.

Un marcador detectable adecuado que puede emplearse en un método de acuerdo con la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en marcadores enzimáticos, marcadores isotópicos, marcadores

45 quimioluminiscentes, colorantes fluorescentes y similares.

En caso de que se emplee un marcador isotópico (tal como 125I, 14C, 3H o 35S), el control puede comprender por lo tanto medir la radioactividad que depende de la unión de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención. La radioactividad se mide en general usando un contador gamma, o contador de centelleo líquido.

La presente invención puede proporcionar medios nuevos y/o mejorados para:

1 Prevenir la unión de autoanticuerpos estimulantes del tiroides con el TSHR en el tiroides y proporcionar de este modo un nuevo tratamiento para enfermedad de Graves.

55 2 Prevenir la unión de los anticuerpos de TSHR con los TSHR extra-tiroideos (por ejemplo en tejido retro-orbital o tejido pre-tibial) y de este modo proporcionar oportunidades mejoradas para el tratamiento de oftalmopatía de Graves y mixoedema pre-tibial. 3 Determinar los aminoácidos de TSHR críticos para unir TRAb con actividades estimulantes. 4 Determinar los aminoácidos de TSHR críticos para unir TRAb con actividades de bloqueo.

5.

Comparar los aminoácidos de TSHR críticos para la unión de TRAb con actividades estimulantes y de bloqueo.

6.

Desarrollar nuevos ensayos para TRAb que diferencian entre anticuerpos de bloqueo y estimulantes. 7 Desarrollar nuevos ensayos para TRAb basados en fragmentos de TSHR termoestables. 8 Determinar los aminoácidos de TSHR críticos para activación de TSHR inducida por ligando.

65 9 Determinar los aminoácidos de TSHR críticos para inactivación de TSHR inducida por ligando. 10 Determinar los aminoácidos de un autoanticuerpo de bloqueo críticos para la unión con el TSHR.

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11 Determinar los aminoácidos de un autoanticuerpo de bloqueo críticos para afectar a la activación de TSHR mediada por anticuerpo estimulante de TSH o tiroideo. 12 Controlar el hipertiroidismo de la enfermedad de Graves, hipertiroidismo neonatal y las señales oculares de enfermedad de Graves. Como alternativa, la afección relacionada con el tiroides puede ser hipotiroidismo relacionado con la presencia de TRAb con actividad de bloqueo en pacientes con AITD, o hipotiroidismo neonatal debido a la transferencia de TRAb de tipo bloqueo materno (a través de la placenta o leche materna). 13 Entender las diferencias moleculares entre autoanticuerpos de TSHR con actividad estimulante o de bloqueo del tiroides producidos por el sistema inmunitario del mismo paciente y por el sistema inmunitario de diferentes pacientes. 14 Entender los mecanismos inmunológicos implicados en el desarrollo y producción de autoanticuerpos de TSHR estimulantes y de bloqueo. 15 Entender los mecanismos incluyendo fuerzas impulsoras evolutivas que son la base de la mimésis molecular entre autoanticuerpos de TSH y TSHR.

Breve descripción de los dibujos

Se describirán ahora moléculas de anticuerpo y métodos de acuerdo con la invención, solamente como ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, Figuras 1 a 9, en las que:

La Figura 1 muestra las características de asociación y disociación de la unión de K1-70 marcado con 125I o K118 marcado con 125I con el TSHR: (a) el ciclo temporal de unión de K1-70 IgG y Fab marcado con 125I con TSHR de longitud completa; (b) el ciclo temporal de la unión de K1-70 IgG marcado con 125I con TSHR260; (c) el ciclo temporal de K1-70 Fab marcado con 125I con TSHR260; (d) la disociación de K1-70 IgG marcado con 125I del TSHR (longitud completa) en presencia de diversos ligandos; (e) la disociación de K1-70 IgG marcado con 125I de TSHR (longitud completa) en presencia de K1-18 Fab; (f) la disociación de K1-70 Fab marcado con 125I del TSHR (longitud completa) en presencia de diversos ligandos; (g) la disociación de K1-70 IgG marcado con 125I de TSHR260 en presencia de diversos ligandos; (h) la disociación de K1-70 IgG marcado con 125I de TSHR260 en presencia de K1-18 Fab; (i) la disociación de K1-70 Fab marcado con 125I de TSHR260 en presencia de diversos ligandos; (j) el ciclo temporal de la unión de K1-18 IgG marcado con 125I con TSHR de longitud completa y TSHR260; (k) la disociación de K1-18 IgG marcado con 125I de TSHR de longitud completa en presencia de diversos ligandos; y (l) la disociación de K1-18 IgG marcado con 125I de TSHR260 en presencia de diversos ligandos; La Figura 2 muestra los resultados de las mediciones de los autoanticuerpos de TSHR en sueros de pacientes:

(a)

comparación de las mediciones en un ensayo de tubo recubierto con TRAb (basado en la inhibición de la unión con TSH) y en un ELISA de TSHR260-AP; (b) comparación de las mediciones por ELISA basándose en la inhibición de la unión de M22 con TSHR de longitud completa y por la inhibición de la unión de Fab M22 con TSHR260 en el ELISA; (c) comparación de las mediciones en un ensayo de tubo recubierto de TRAb (basándose en la inhibición de la unión con TSH) y por inhibición de la unión de Fab M22 con placas recubiertas con TSHR260 en un ELISA; y (d) comparación de las mediciones es un ELISA de TRAb (basándose en la inhibición de la unión de M22) y en un ELISA de TSHR260-AP; La Figura 3 proporciona las secuencias de región variable de cadena pesada de K1-18 (HC): (a) la secuencia oligonucleotídica de K1-18 HC (SEC ID Nº 1) mostrada en formas anotadas y no anotadas. En las formas anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR están subrayadas; para Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita; (b) la secuencia de aminoácidos de K1-18 HC (SEC ID Nº 5) derivada de la secuencia oligonucleotídica mostrada en (Figura 3a) en formas anotadas y no anotadas; (c) la secuencia oligonucleotídica preferida de K1-18 HC (SEC ID Nº 10) con la secuencia N terminal real (la secuencia líder) mostrada en formas anotadas y no anotadas. En las formas anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR están subrayadas, la secuencia líder se muestra en letras minúsculas; las CDR individuales están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita; y (d) la secuencia de aminoácidos preferida de K1-18 HC (SEC ID Nº 15) con la secuencia líder derivada de la secuencia oligonucleotídica mostrada en la Figura 3c en forma anotadas y no anotadas. La Figura 4 proporciona las secuencias de región variable de la cadena ligera de K1-18 (LC): (a) la secuencia oligonucleotídica de K1-18 LC (SEC ID Nº 19) mostrada en formas anotadas y no anotadas. En las En las formas anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR están subrayadas; las CDR individuales están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita; (b) la secuencia de aminoácidos de K1-18 LC (SEC ID Nº 23) derivada de la secuencia de oligonucleótidos mostrada en la Figura 4a en formas anotadas y no anotadas;

(c)

la secuencia oligonucleotídica preferida de K1-18 LC (SEC ID Nº 28) con la secuencia N terminal real (la secuencia líder) mostrada en formas anotadas y no anotadas. En las formas anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR están subrayadas, la secuencia líder se muestra en letras minúsculas, las CDR individuales están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita; y (d) la secuencia de aminoácidos preferida de K1-18 LC (SEC ID Nº 33) con la secuencia líder derivada de la secuencia oligonucleotídica mostrada en la Figura 4c en formas anotadas y no anotadas; La Figura 5 proporciona las secuencias de región variable de la cadena pesada de K1-70 (HC): (a) la secuencia oligonucleotídica de K1-70 HC (SEC ID Nº 37) mostrada en formas anotadas y no anotadas. En las En las formas anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR están subrayadas; las CDR individuales están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita; (b) la secuencia de aminoácidos de K1-70 LC (SEC ID

5

15

25

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55

65 E09795799 24-06-2015

Nº 41) derivada de la secuencia de oligonucleótidos mostrada en la Figura 5a en formas anotadas y no anotadas;

(c)

la secuencia oligonucleotídica preferida de K1-70 HC (SEC ID Nº 46) con la secuencia N terminal real (la secuencia líder) mostrada en formas anotadas y no anotadas. En las formas anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR están subrayadas, la secuencia líder se muestra en letras minúsculas, las CDR individuales están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita; y (d) la secuencia de aminoácidos preferida de K1-70 HC (SEC ID Nº 51) con la secuencia líder derivada de la secuencia oligonucleotídica mostrada en la Figura 5c en formas anotadas y no anotadas; La Figura 6 proporciona las secuencias de región variable de la cadena ligera de K1-70 (LC): (a) la secuencia oligonucleotídica de K1-70 LC (SEC ID Nº 55) mostrada en formas anotadas y no anotadas. En las En las formas anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR están subrayadas; las CDR individuales están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita; (b) la secuencia de aminoácidos de K1-70 LC (SEC ID Nº 59) derivada de la secuencia de oligonucleótidos mostrada en la Figura 6a en formas anotadas y no anotadas;

(c)

la secuencia oligonucleotídica preferida de K1-70 LC (SEC ID Nº 64) con la secuencia N terminal real (la secuencia líder) mostrada en formas anotadas y no anotadas. En las formas anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR están subrayadas, la secuencia líder se muestra en letras minúsculas, las CDR individuales están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita; y (d) la secuencia de aminoácidos preferida de K1-70 LC (SEC ID Nº 69) con la secuencia líder derivada de la secuencia oligonucleotídica mostrada en la Figura 6c en formas anotadas y no anotadas; y (e) la secuencia de aminoácidos N terminal real (aminoácidos 2-21) SEC ID Nº 73) determinada por reacción de degradación de Edman; La Figura 7 proporciona la secuencia de aminoácidos del TSHR humano: (a) ilustra la secuencia de aminoácidos consenso del TSHR humano (aminoácidos 1-764 (SEC ID Nº 74) (nº de referencia P16473; http://www.ncbi.nlm.nih.govlentrezlviewer.fcgi?db=protein&val=62298994); (b) ilustra la secuencia de aminoácidos consenso de los aminoácidos 1-260 de TSHR humano. La secuencia líder (aminoácidos 1-21) se muestra en minúscula y la secuencia de histidina añadido para fines de purificación se muestra en el extremo C terminal en negrita (SEC ID Nº 75); y (c) ilustra la secuencia de aminoácidos del extremo C terminal de TSHR LRD. La secuencia líder (aminoácidos 1-21) se muestra en minúscula y la secuencia de histidina añadida para fines de purificación se muestra en el extremo C terminal en negrita (SEC ID Nº 76);La Figura 8 proporciona las coordenadas de K1-70 Fab a una resolución de 2,22 Å. La Figura 9 muestra: (a) la estructura de K1-70 Fab – representación de la estructura en formato Joy; (b) el potencial electrostático del sitio de combinación de K1-70 Fab; y (c) aminoácidos aromáticos del sitio de combinación de K1-70 Fab.

Métodos

Aislamiento de linfocitos y clonación de autoanticuerpos de TSHR monoclonales humanos

Los autoanticuerpos monoclonales K1-18 y K1-70 se aislaron usando el procedimiento descrito en el documento WO2004/050708A2. Los linfocitos se aislaron de una muestra de sangre recogida de una paciente con un historial clínico de 8 años de AITD de altos niveles de TRAb. Se obtuvieron el consentimiento de la paciente y la aprobacióndel Comité de Ética Local. Se diagnosticó a la paciente por primera vez hipertiroidismo, ésta alcanzó el estado eutiroideo después de tratamiento con metimazol, sin embargo, aproximadamente 4,5 años antes de la recogida de sangre desarrolló hipotiroidismo. En el momento de la recogida de sangre la paciente se estaba tratando con tiroxina (50 µg diarios). Los linfocitos se infectaron con Virus de Epstein Barr (Colección Europea de Cultivos Celulares – ECACC; Porton Down, SP4 0JG, Reino Unido) y se cultivaron en capas de alimentación de macrófagos como se describe en el documento WO2004/050708A2. Se fusionaron linfocitos inmortalizados que secretaban autoanticuerpos de de TSHR con una línea celular híbrida de ratón/humana K6H6/B5 (ECACC) y se clonaron cuatro veces por dilución limitante para obtener una única colonia. La presencia de autoanticuerpo de TSHR en sobrenadantes de cultivos celulares en diferentes estadios de clonación se detectó por la inhibición de la unión de TSH marcada con el TSHR (documento WO2004/050708A2). Se expandieron dos clones individuales que producían los autoanticuerpos de TSHR y se recogieron sobrenadantes de los cultivos para purificación de autoanticuerpos. Un clon se designó K1-18 y el otro K1-70.

Purificación, caracterización y marcaje de K1.18 y K1.70

Se purificaron MAb IgG humanos de TSHR de sobrenadantes de cultivo usando cromatografía de afinidad de proteína A en MabSelect™ (GE Healthcare, Reino Unido) como se describe en Sanders J et al 2004 (Thyroid 2004

14: 560-570) y se evaluó la pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE). El isotipo de cadena pesada se determinó usando un ensayo de difusión radial (The Binding Site; Birmingham, B29 6AT, Reino Unido), y el isotipo de cadena ligera se determinó por transferencia de Western con anticuerpos monoclonales de ratón específicos anti-cadena kappa humana y anti-cadena lambda humana (Sigma-Aldrich, Company Ltd., Poole, Reino Unido). Se trató IgG K1-18 purificada con mercuripapaína (Sigma Aldrich, Poole, Reino Unido) a una relación de IgG/enzima de 100:1 en solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mmol/l, Na2HPO4 8,1 mmol/l, KCL 2,7 mmol/l, KH2PO4 1,47 mmol/l, pH 7,4 que contenía cisteína a una concentración final de 1 mmol/l y EDTA a una concentración final de 2 mmol/l) durante 4 horas a 37 ºC. La reacción se detuvo mediante la adición de yodoacetamida (concentración final de 50 mmol/l) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se pasó a través de una columna de MabSelect para retirar cualquier IgG intacta o fragmentos Fc de la preparación de Fab. La solución que contenía Fab se dializó en PBS que contenía NaN3 3,1 mmol/l y se concentró usando un concentrador Centriprep (Millipore, Watford, WD18 8YH, Reino Unido) cuando fue apropiado. Se obtuvieron K1-70 Fab usando un método similar excepto que se usó una relación de IgG/enzima de 200:1 y la digestión con enzima fue durante una hora a 37 ºC. El análisis por SDS-PAGE indicó que IgG intacta era

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5 indetectable en las preparaciones Fab. Las preparaciones de IgG se marcaron con 125I como se describe en Sanders J et al 1999. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1999 84: 3797-3802) o con hidrazida de biotina (Perbio Science, Cramlington, Reino Unido) (Rees Smith et al 2004. Thyroid 14: 830-835).

Inhibición de la unión de 125I-TSH o MAb humanos marcados con 125I con el TSHR

Se llevaron a cabo ensayos de inhibición de unión usando tubos recubiertos con TSHR como se describe en el documento WO2004/050708A2. En el ensayo, se incubaron 100 µl de muestra de ensayo (preparación de MAb, suero de paciente o TSH no marcada) y 50 µl de tampón de inicio (RSR Ltd.) en tubos recubiertos con TSHR durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Después de la aspiración, los tubos se lavaron y se

15 añadieron 100 µl de proteína marcada con 121I (5 x 104 cpm) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Los tubos se aspiraron después, se lavaron y se contaron en un contador gamma. Se calculó la inhibición de unión de proteína marcada como 100 x [1 –(cpm unido en presencia de material de ensayo/cpm unido en presencia de material de control)]. Las preparaciones de MAb usadas en estos experimentos fueron K1-18, K170, M22, 5C9, 9D33 descritos anteriormente. TSMAb 1-7 son MAb estimulantes de tiroides de ratón (documento WO 03/01863 y Sanders J et al 2002, mencionado anteriormente). El material de control fue un grupo de sueros de donante de sangre sanos o sueros de donantes de sangre sanos individuales u otros materiales como se indica en los resultados de diversos experimentos.

Análisis de Scatchard de la unión de MAb IgG humana con el TSHR

25 Se incubaron IgG K1-18 o K1-70 no marcadas en 50 µl de tampón de ensayo (NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8 y Triton X-100 al 0,1 %) y 50 µl de tampón de inicio (RSR Ltd) y 50 µl de IgG K1-18 o K1-70 marcada con 125I respectivamente (30.000 cpm en tampón de ensayo) en tubos recubiertos con TSHR durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación (se produjo unión máxima en estas condiciones), se aspiraron, se lavaron dos veces con 1 ml de tampón de ensayo y se contaron en un contador gamma. La concentración de IgG unida frente a unida/libre se representó (Scatchard G 1949. Annals of the New York Academy of Sciences 51: 660-672) para derivar la constante de asociación.

Inhibición de la unión de TSH con el TSHR medida por ELISA

35 Se usó un ELISA de TRAb basado en la unión de TSH-biotina con pocillos de ELISA recubiertos con TSHR como se ha descrito anteriormente (Bolton J, et al 1999 Clinical Chemistry 45: 2285-2287). En el ensayo se añadieron 75 µl de muestra de ensayo a 75 µl de tampón de inicio en los pocillos de las placas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación a aproximadamente 500 agitaciones/minuto. Después de lavar se añadieron 100 µl de TSH-biotina y la incubación continuó durante 25 minutos sin agitación. Los pocillos se lavaron de nuevo, la reacción se reveló usando procedimientos convencionales descritos y se leyó la absorbancia de cada pocillo a 450 nm.

Se calculó la inhibición de la unión de TSH-biotina como: 100 x [1 – (absorbancia de muestra de ensayo a 450

45 nm/absorbancia de muestra de control negativo a 450 nm)]. Las preparaciones de MAb usadas en estos experimentos fueron K1-18, K1-70, M22, 5C9, 9D33 descritos anteriormente. Los TSMAbs 1-7 son MAb estimulantes de tiroides de ratón (documento WO03/01863 y Sanders J, et al 2002 mencionado anteriormente). El material de muestra de control fue un grupo de sueros de donantes de sangre sanos u otros materiales como se indica en los resultados de diversos experimentos.

Inhibición de la unión de M22 con el TSHR en ELISA

Se usó un ELISA de TRAb basado en la unión de M22 marcado (M22 Fab-POD) con pocillos de ELISA recubiertos con TSHR (Rees Smith B et al 2004 mencionado anteriormente). El ensayo se llevó a cabo como el ELISA basado

55 en TSH-biotina excepto en que la primera incubación fue durante 1 hora. Los resultados se expresaron como inhibición de la unión de M22 usando la fórmula: 100 x [1 – (absorbancia de muestra de ensayo a 450 nm/absorbancia de muestra de control negativo a 450 nm)]. Las preparaciones de MAb usadas en estos experimentos fueron K1-18, K1-70, M22, 5C9, 9D33 descritos anteriormente. Los TSMAb 1-7 son MAb estimulantes de tiroides de ratón (número de Solicitud de Patente WO03/01863 y Sanders J, 2002 mencionado anteriormente). El material de control fue un grupo de sueros de donantes de sangre sanos u otros materiales como se indica en los resultados de diversos experimentos.

Análisis de la estimulación de TSHR

65 La capacidad de IgG K1-18 o K1-70 y otras preparaciones para estimular la producción de AMP cíclico en células de

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ovario de hámster Chino (CHO) transfectadas con el TSHR humano se ensayó como se describe en el documento WO2004/0507080A2. Se sembraron células CHO que expresaban aproximadamente 5 x 104 o aproximadamente 5 x 105 TSHR por célula en placas de 96 pocillos a 3 x 104 células por pocillo, se adaptaron a DMEM (Invitrogen Ltd, Paisley, Reino Unido) sin suero de ternero fetal y después se añadieron muestras de ensayo (TSH, IgG o suero de 5 paciente) (100 µl diluidos en tampón de ensayo de AMP cíclico, es decir, solución de Sales Tamponadas de Hank sin NaCl que contiene glucosa 1 g/l, HEPES 20 mmol/l, sacarosa 222 mmol/l, albúmina de suero bovino 15 g/l y 3isobutil-1-metilxantina 0,5 mmol/l pH 7,4; tampón hipotónico de ensayo de AMP cíclico) y se incubó durante 1 hora a 37 ºC. Después de retirar las soluciones de ensayo, las células se lisaron y se ensayó la concentración de AMP cíclico en los lisados usando kits de Correlación Directa de AMP Cíclico-EIA de Assay Designs; Cambridge 10 Bioscience, Reino Unido. Los resultados se expresan como pmol/ml de AMP cíclico en el lisado celular (200 µl). Algunos experimentos se llevaron a cabo en condiciones de tampón isotónico. En estos experimentos se usó tampón de Hepes de Krebs-Ringer (tampón KRH) (NaCl 124 mmol/l, KCl 5 mmol/l, MgSO4 1,25 mmol/l, CaCl2 1,45 mmol/l, KH2PO4 1,25 mmol/l, HEPES 25 mmol/l, glucosa 8 mmol/l, albúmina de suero bovino 0,5 g/l, 3-isobutil-1metilxantina 0,5 mmol/l, pH 7,4). Se permitió que las células alcanzaran la densidad requerida, el medio de cultivo se 15 retiró y las células se lavaron con 1 ml de tampón KRH. Después se añadió tampón KRH nuevo y las células se incubaron durante 30 minutos a 37 ºC. El tampón se retiró después y se reemplazó con tampón KRH nuevo que contenía muestras de ensayo (TSH, preparaciones de MAb, muestras de suero, etc.). Las siguientes etapas se llevaron a cabo posteriormente como se ha descrito con anterioridad para los experimentos en las condiciones hipotónicas (es decir, en tampón de ensayo de AMP cíclico). En algunos experimentos se evaluó el efecto de

20 diversos de MAb en la actividad estimulante de TSHR de diversas preparaciones (por ejemplo, TSH, MAb humanos, sueros de pacientes) medido como se ha descrito anteriormente. Esto se llevó a cabo comparando (a) la actividad estimulante de la muestra sola con (b) actividad estimulante en presencia de diversos MAb.

Medición de la actividad antagonista (de bloqueo)

25 Se evaluó la capacidad de IgG K1-70 y otras preparaciones para inhibir la actividad estimulante de TSH porcina (p), TSH humana nativa (h) y TSH humana recombinante (rh), MAb M22, MAb K1-18 y TRAb del suero de paciente en células CHO que expresaban TSHR. Esto se llevó a cabo comparando el efecto estimulador de TSH, M22, K1-18 0 TRAb en ausencia y en presencia de IgG K1-70 (u otras preparaciones que se ensayan). El ensayo se llevó a cabo

30 como se ha descrito anteriormente excepto en que se añadieron 50 µl de K1-70 (u otras preparaciones que se ensayan) diluidos en tampón de ensayo de AMP cíclico a los pocillos celulares seguido de 50 µl de TSH o M22 o K118 o suero del paciente (diluido según sea apropiado en tampón de ensayo de AMP cíclico) y se incubó y se ensayó como para el ensayo de estimulación descrito anteriormente. Otros MAb y sueros de pacientes con TRAb de tipo de bloqueo se ensayaron en ese ensayo además de K1-70.

35

Asociación y disociación de la unión de K1-18 y K1-70 con el TSHR

La asociación y disociación de la unión IgG K1-18, Fab K1-K18, IgG K1-70 y Fab K1-K70 con el TSHR de longitud completa y el TSHR260 se estudió usando el método como se describe en: Nakatake N, et al Thyroid 2006, 16;

40 1077-1084. Se usó TSHR de longitud completa o TSHR260 para recubrir tubos de plástico que se habían recubierto previamente con un MAb de ratón adecuado al TSHR. En experimentos de asociación, se incubaron 100 µl de IgG o Fab marcado con 125I en los tubos recubiertos con TSHR a temperatura ambiente durante 5-180 min. Los tubos se aspiraron después, se lavaron con tampón de ensayo y se contaron en un contador gamma. En los experimentos de disociación se incubaron 100 µl de IgG o Fab marcado con 125I en tubos recubiertos con TSHR durante 180 min a

45 temperatura ambiente seguido de la adición de 10 µl de 1 mg/ml de diversas preparaciones de MAb IgG o Fab e incubación durante 0-180 min a temperatura ambiente. En diferentes puntos temporales los tubos se aspiraron, se lavaron y se contaron. En algunos experimentos se añadió TSH o tampón en lugar de una preparación de MAb.

Mutaciones de aminoácidos en el TSHR

50 Los métodos usados para introducir mutaciones específicas en la secuencia de TSHR se han descrito en la Solicitud de Patente WO2006/016121A. Además, la transfección de construcciones de TSHR mutado en células CHO usando el sistema de Flp-in también se describe en el documento WO2006/016121A. Se sembraron células Flp-In-CHO que expresaban TSHR de tipo silvestre o mutados en placas de 96 pocillos y se usaron para ensayar la capacidad de

55 diversas preparaciones para estimular la actividad de AMP cíclico en las células de CHO que expresaban el TSHR que contenía mutaciones de aminoácidos. Estos experimentos se compararon con experimentos similares llevados a cabo usando células CHO que expresaban TSHR de tipo silvestre. También se usaron células Flp-In-CHO que expresaban TSHR bien de tipo silvestre o bien mutados en experimentos para estudiar la capacidad de diversas preparaciones para bloquear la actividad estimulante de TSH, estimular anticuerpos o TRAb de suero del paciente

60 como se ha descrito anteriormente.

Producción de construcción de TSHR260-fosfatasa alcalina (TSHR260-AP)

La construcción de TSHR 260 (que codifica los aminoácidos 1-260 del TSHR humano; siendo los aminoácidos 1-21 65 la secuencia líder) se amplificó usando TSHR humano de longitud completa como molde (Oda Y, et al 1998. Journal

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of Molecular Endocrinology 20: 233-244) y se unió con la secuencia codificante de una fosfatasa alcalina secretada (menos la secuencia líder de fosfatasa alcalina de 17 aminoácidos) usando el vector de clonación pSEAP2-basic (Clontech) como molde. Se llevaron a cabo dos reacciones de PCR, la primera usaba el TSHR de longitud completa amplificado con cebadores específicos de SEC ID Nº 77 y SEC ID Nº 78 (Sigma Genosys) que añadieron un sitio de restricción EcoRI en el extremo N terminal, y un enlazador de 1 aminoácido (Asparagina) y los primeros 8 aminoácidos (excluyendo la secuencia líder de 17 aminoácidos) de la fosfatasa alcalina secretada en el extremo C terminal. La segunda PCR se llevó a cabo usando el vector de clonación pSEAP2-basic amplificado con los cebadores SEC ID Nº 79 y SEC ID Nº 80 que añaden los aminoácidos 254-260 del TSHR y 1 enlazador de un aminoácido (Asparagina) al extremo N terminal de la fosfatasa alcalina secretada y un marcador de 6 histidinas, un codon de parada y un sitio de restricción XhoI en el extremo C terminal del gen la fosfatasa alcalina secretada. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo durante 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 40 ºC y 1 minuto a 72 ºC seguido de 7 minutos a 72 ºC. Los productos de PCR se procesaron en geles de agarosa al 1 % y el ADN se extrajo usando un kit geneclean II (Anachem Ltd., Luton) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después se usaron productos de purificados de las PCR 1 y 2 para preparar una tercera PCR para construir el gen de fosfatasa alcalina de TSHR 260 completo. La reacción de PCR 3 contenía 200 ng de PCR 1 y 200 ng de producto de PCR 2 y la PCR 3 se llevo a cabo durante 7 ciclos a 94 ºC durante 1,5 minutos, 65 ºC durante 1,5 minutos y 72 ºC durante 1,5 minutos. La temperatura se aumentó después a 94 ºC de nuevo durante 2 minutos y se añadieron los cebadores SEC ID Nº 77 y 80 seguido de 30 ciclos de 94 ºC durante 1 minuto, 52 ºC durante 1 minuto y 72 ºC durante 2 minutos. El producto de PCR 3 se clonó en pFastBac1 usando sitios de restricción EcoRI y XhoI y la presencia de la mutación se verificó usando secuenciación por el método de Sanger-Coulson (Sanger F et al 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74: 5463-5467). Se preparó ADN recombinante usando el sistema de expresión de Baculovirus Bac to Bac (Invitrogen, Reino Unido) y se transfectó en células Sf-9 para obtener y amplificar una reserva de baculovirus recombinante como se describe en el documento WO2008/025991A1. TSHR260-AP se expresó en células de insecto como se describe en el documento WO2008/025991A1.

ELISA basado en TSHR260-AP

Se estableció un ELISA basado en la capacidad de los anticuerpos de TSHR divalentes para unirse a un sitio de unión a antígeno para TSHR que recubre un pocillo de placa de ELISA y con el otro sitio de unión a antígeno para TSHR260-AP en una fase líquida, es decir, formando un enlace. El TSHR en forma de receptor de longitud completa solubilizado por detergente expresado en células CHO se usó para recubrir pocillos de placas de ELISA con un anticuerpo C terminal como se ha descrito previamente (Bolton J et al 1999 mencionado anteriormente). En el ensayo se añadieron 75 µl de tampón de inicio (como se describe para ELISA de TRAb; Bolton J et al 1999 mencionado anteriormente) y 75 µl de muestra de ensayo (sueros de pacientes o anticuerpos monoclonales) a los pocillos de placas de ELISA con el TSHR de longitud completa solubilizado en detergente y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación (500 rpm). Después se retiraron los contenidos de los pocillos, los pocillos se lavaron 3 veces con tampón de lavado (NaCl 50 mmol/l, Tris 20 mmol/l pH 7,8 Triton X-100 1 %) seguido de la adición de 100 µl de TSHR260-AP (diluido en tampón de lavado que contenía MgCl2-6H2O 0,2 g/l y BSA 2 g/l). Después de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación (500 rpm) los pocillos se vaciaron, se lavaron (3 veces) y se añadieron 100 µl de sustrato de p-nitrofenil fosfato (pNpp) (Europa Bioproducts Ltd, Ely, Cambridge Reino Unido) y la placa se incubó en oscuridad durante 45 minutos. A continuación se añadieron 100 µl de solución de parada (NaOH 1 mol/l) y la absorbancia se leyó a 450 nm en un lector de placas de ELISA. Los resultados se expresaron como valores de absorbancia a DO405 nm, los valores mayores que los observados con un panel de sueros de donantes de sangre sanos (HBD) indicaron la presencia de autoanticuerpos de TSHR en la muestra. En algunos experimentos se usaron preparaciones solubilizadas de TSHR expresado en CHO recombinante que contenía la mutación R255D para recubrir los pocillos de placas de ELISA.

Producción de construcción de TSHR LRD C-CAP

La construcción de TSHR LRD C-CAP que codificaba los aminoácidos de 1-409 de TSHR humano con los aminoácidos 306-384 retirados, se amplificó usando TSHR humano de longitud completa como el molde (Oda Y, et al 1998. Journal of Molecular Endocrinology 20: 233-244). Se llevaron a cabo dos reacciones de PCR, la primera usó el TSHR de longitud completa amplificado con cebador T7 (SEC ID Nº: 81) y cebador específico SEC ID Nº: 82 (Sigma Genosys, Gillingham, Dorset, Reino Unido) que añadió los aminoácidos 385-342 de TSHR al extremo C terminal del aminoácido 305 del TSHR. La segunda PCR se llevó a cabo usando el TSHR de longitud completa amplificado con el cebador inverso de BGH SEC ID Nº 83 y el cebador específico (SEC ID Nº 84), que añade los aminoácidos 298-305 del TSHR al extremo N terminal del aminoácido 385 del TSHR. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo durante 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 40 ºC y 2 minutos a 72 ºC seguido de 7 minutos a 72 ºC. Los productos de PCR se procesaron en geles de agarosa al 1 % y el ADN se extrajo usando un kit Geneclean II (Anachem Ltd, Luton, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después se usaron los productos de PCR purificados 1 y 2 para preparar una tercera PCR para construir una secuencia de TSHR continua uniendo Ser305 con Tyr385 con los aminoácidos 308-384 retirados. La reacción de PCR 3 que contenía 200 ng de producto de PCR 1 y 200 ng de producto de PCR 2 y la PCR 3 se llevó a cabo durante 7 ciclos a 94 ºC durante 1,5 minutos, 65 ºC durante 1,5 minutos y 72 ºC durante 1,5 minutos. La temperatura se aumentó después a 94 ºC de nuevo durante 2 minutos y se añadieron cebador T7 (SEC ID Nº: 81) y cebador BGHR (SEC ID Nº 83) seguido de 30

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ciclos de 94 ºC durante 1 minuto, 52 ºC durante 1 minuto y 72 ºC durante 2 minutos. El producto de PCR 3 que contenía la secuencia de TSHR que omitía los aminoácidos 306-384, se procesó después en un gel de agarosa al 1 % y el ADN se extrajo usando un kit Geneclean II (Anachem Ltd) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se usó un producto de PCR3 purificado como el molde para construcción del gen de TSHR LRD C-CAP en PCR 4. La 5 reacción de PCR 4 contenía 200 ng de PCR 3 como ADN molde y se amplificó con cebador T7 (SEC ID Nº 81) y el cebador específico (SEC ID Nº 85) que añade un marcador de 6 histidinas, un codon de parada y un sitio de restricción Xhol al extremo C terminal del aminoácido 409 de la secuencia de TSHR (1-409 con los aminoácidos 306-384 suprimidos). Se llevó a cabo PCR 4 durante 30 ciclos de 1 minuto a 94 º C, 1 minuto a 40 ºC y 1 minuto a 72 ºC, seguido de 10 minutos a 72 ºC. El producto de PCR 4 se clonó en pFastBac1 usando sitios de restricción BamHI y Xhol y la presencia de la mutación se verificó usando secuenciación por el método de Sanger-Coulson (Sanger F. et al 1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74: 5463-5467). Se preparó ADN recombinante usando el sistema de expresión de Baculovirus Bac to Bac (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) y se transfectó en células Sf-9 para obtener y amplificar reserva de baculovirus recombinante como se describe en el documento WO2008/025991A1. Se expresó TSHR LRD C-CAP (Figura 7c; SEC ID Nº 76) en células de insecto

15 usando el procedimiento descrito en el documento WO2008/025991A1.

Comparación de la estabilidad de diferentes preparaciones de TSHR

Se comparó estabilidad de temperatura de diferentes preparaciones de TSHR recombinante. Se ensayaron TSHR solubilizado de longitud completa expresado en células CHO, TSHR260 expresado en células de insecto, TSHR260-AP expresado en células de insecto y TSHR LRD C-CAP expresado en células de insecto. Se retiró una alícuota de cada una de las preparaciones anteriormente enumeradas de almacenamiento a -80 ºC, se descongeló en hielo, se devolvió una muestra a -80 ºC como un control mientras que el grueso se almacenó a temperatura ambiente (2025 ºC) durante 24 o 48 horas. Después de 24 o 48 horas a temperatura ambiente las preparaciones de TSHR se 25 almacenaron a -80 ºC y después se ensayaron como se describe posteriormente. Se recubrieron pocillos de placas de ELISA con una preparación F(ab’)2 del MAb de TSHR 14C4 (Jeffreys J et al 2002, Thyroid 12: 1051-1061 y Sanders J et al 2007 Thyroid 17: 395-410) a 1 µg/ml en tampón de recubrimiento (Bolton J et al 1999 mencionado anteriormente). Se diluyeron preparaciones de TSHR que se investigan en el NaCl 20 mmol/l, Tris 10 mmol/l, pH 7,8, Triton X-1000 1 % v/v, BSA 1 g/l, NaN3 200 mg/ml y se añadieron 150 µl a pocillos de placas de ELISA (por cuadruplicado). Después de incubación durante una noche a 4 ºC para permitir que las preparaciones de TSHR se unieran con los pocillos recubiertos con anticuerpo (F(ab’)2) 14C4), los pocillos se lavaron y se incubaron con 75 µl de tampón de ensayo (NaCl 50 mmol/l, Tris 20 mmol/l pH 7,8, Triton X-100 1 % v/v, BSA 1 g/l) y 75 µl de suero de donante de sangre sano durante 1 hora a temperatura ambiente a 500 agitaciones por minuto en un agitador de placas de ELISA. A continuación los contenidos de los pocillos se vaciaron, los pocillos se lavaron y se añadieron

35 100 µl de conjugado de peroxidasa-Fab M22 (véase anteriormente) a cada pocillo. Después de 25 minutos de incubación a temperatura ambiente sin agitación los pocillos de las placas se lavaron de nuevo seguido de la adición de 100 µl de tetrametilbenzidina y una incubación adicional de 25 minutos a temperatura ambiente sin agitación. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de H2SO4 de 0,5 mol/l y se leyó la absorbancia de cada pocillo a 450 nm en un lector de placas de ELISA.

Análisis de genes de región variable

Los genes de región variable (V) de cadenas pesadas y ligeras K1-18 o K1-70 se determinaron como se describe en el documento WO2004/050708A2, usando ARN total preparado a partir de 1 x 107 células de hetero-hibridoma (que 45 secreta IgG K1-18 o IgG K1-70) para producir ARNm para reacciones de RT-PCR (PCR de transcriptasa inversa). Se usaron cebadores oligonucleotídicos de cadena con sentido y antisentido IgG1 HC y kappa LC específicos diseñados usando la V-base del Consejo de Investigación Médica (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) y se sintetizaron por Invitrogen (Paisley, PA4 9RF, Reino Unido), se usaron en reacciones de RT-PCR con ARNm de K1-18. Se usaron cebadores de IgG HC y lambda LC específicos preparados como se ha descrito anteriormente en reacciones de RT-PCR con ARNm de K1-70. La reacción de RT se llevó a cabo a 50 ºC durante 15 minutos seguido de 40 ciclos de PCR a 94 ºC durante 15 segundos, 50 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos. Los productos de ADN se clonaron en pUC18 y se secuenciaron por el método de Sanger-Coulson (Sanger F, et al 1977 mencionado anteriormente). Las secuencias de región V se compararon con secuencias disponibles de genes Ig humanos usando blast de Ig (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gblast/). Las CDR se asignaron por el método de Kabat 55 (Kabat E et al 1991 Sequences of proteins of immunological interest (US Public Health service, Bethesda, MD) Quinta edición) y blast de Ig (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Se llevó a cabo un segundo ciclo de aislamiento de ARNm a partir de las líneas celulares de hibridoma tanto K1-70 como K1-18 que HC habían experimentos reclonación adicional por dilución limitante. Las secuencias de región V (HC K1-18, LC K1-18, K1-70 y LC K1-70) se obtuvieron por RT-PCR a partir del ARNm seguido de clonación y secuenciación como se ha descrito anteriormente. Además las reacciones de RT-PCR también se llevaron a cabo usando cebadores de PCR diseñados específicamente correspondientes al extremo 5’ de las secuencias líder respectivas para cada una de las regiones

V. Esto permitió la identificación de las secuencias oligonucleotídicas reales (y secuencias de aminoácidos derivadas) en los extremos N terminales de las regiones V HC y LC de K1-18 y K1-70. Además, la secuencia de aminoácidos N terminal de la proteína LC K1-70 se analizó por reacción de degradación de Edman por Alta

65 Bioscience (Birmingham, Reino Unido). Esto fue posible después del “desbloqueo” N terminal de la preparación de

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proteína LC K1-70 con piroglutamato aminopeptidasa. Se trataron Fab K1-70 purificados (10 µg) con 2,5 mU de piroglutamato aminopeptidasa (en Na2HPO4 50 mmol/l pH 7,0: ditiotreitol 10 mmol/l y EDTA 1 mmol/l) durante 6 horas a 75 ºC. Se añadió un volumen igual de tampón de muestra de SDS-PAGE y después de calentar a 100 ºC durante 5 minutos, se resolvió el Fab K1-70 en el HC (parte Fd) y el LC en SDS-PAGE 15 %. La banda de LC se cortó cuidadosamente del gel y se determinó la secuencia proteica N terminal. Los ciclos de repetición de RT-PCR y secuenciación de HC K1-18, LC K1-18 y HC K1-70 confirmaron que las secuencias de región V eran iguales que las obtenidas antes mientras que la secuencia de región V de LC K1-70 era diferente. La secuencia de LC K1-70 obtenida en el ciclo de repetición de experimentos fue coherente con la secuencia proteica de los 2-21 aminoácidos N terminales consecutivos obtenidos por la reacción de Edman (Figura 6e; SEC ID N 73) y la densidad electrónica de los aminoácidos de LC en la estructura cristalina de Fab K1-70 (Figura 8) y en consecuencia se concluyó como la secuencia de LC K1-70 preferida (Figuras 6c y 6d; (SEC ID Nº 64 y 69, respectivamente).

Análisis por difracción de rayos X de Fab K1-70

Se concentraron soluciones de Fab K1-70 preparadas como se ha descrito anteriormente a 15,5 mg/ml usando concentradores iCON (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) con un punto de corte de 9000 Da y se almacenaron a -20 ºC en alícuotas. Se cultivaron cristales de Fab K1-70 usando el método de gota colgante de difusión de vapor usando la exploración de matriz dispersa Exploración de Estructura 1 de Molecular Dimensions (Newmarket, Reino Unido). Se obtuvieron varios cristales en varias condiciones y todos se exploraron para identificar el cristal más adecuado para el análisis por difracción de rayos X en Biofocus DPI (Saffron Walden, Reino Unido). Se eligió un cristal que había crecido en PEG 400 al 30 %, Hepes sódico 0,1 M pH 7,5, cloruro de magnesio 0,2 M. Se lavó en solución de pocillo y se congeló instantáneamente sumergiéndolo en nitrógeno líquido. El conjunto de datos se recogió en un detector de placa de imágenes R-Axis IV de Rigaku y se clasificó, se integró y se cambió de escala usando MOSFLM y SCALA (del conjunto de programas CCP4 (Collaborative computational project, número 4. 1994. “The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography”. Acta Cryst. D50, 760-763). Se eligieron tres estructuras del Banco de Datos de Proteínas (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) 1LIL (dominios VL y CL), 2BOS (dominio VH) y 2EH7 (dominio VL) para su uso en reemplazo molecular, basándose en el alineamiento de secuencias. Hubo dos moléculas Fab K1-70 completas en la unidad asimétrica y se proporciona al modelo resultante diez ciclos de refinamiento atómico con ponderaciones geométricas estrechas usando REFMAC5 (CCP4). Los mapas de densidad electrónica calculados de reemplazo molecular y el refinamiento inicial se examinaron en el programa de construcción de modelos COOT (Emsley P, Cowtan K 2004. Nature 355: 472-475) y se realizó reconstrucción de modelo automática usando BUCCANEER (CCP4). El modelo se reexaminó y se construyó manualmente cualquier elemento ausente restante y el modelo se refinó usando REFMAC5 (CCP4). Se añadieron después moléculas de agua usando la opción de posicionamiento en agua en COOT y se refinó usando REFMAC5 (CCP4). La geometría estructural de Fab K1-70 se comprobó usando PROCHECK (CCP4) y RAMPAGE (CCP4). Finalmente, los restos en el modelo se reenumeraron de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat E et al 1991 mencionado anteriormente).

Clonación y expresión de Fab K1-70 recombinante en E. coli

El producto de RT-PCR de HC K1-70 se cortó con endonucleasas de restricción Xhol y SpeI y el producto de PCR de LC K1-70 se cortó con endonucleasas de restricción SacI y XabI y se clonaron ADNc tanto de HC como de LC en el vector Immunozap H/L (Stratagene Europe; Ámsterdam, Países Bajos) (Matthews I, et al 2002 Laboratory Investigation 82: 1-11) bajo el control del promotor lacZ. Se preparó ADN plasmídico usando el kit de purificación de plásmido midi Qiagen (Qiagen Ltd, Crawley, Reino Unido) y se confirmó la presencia de ADNc de HC y LC K1-70 por secuenciación usando el método de Sanger-Coulson (Sanger F, et al 1977, mencionado anteriormente). Se transformó ADN plasmídico en la cepa de E. coli HB2151 (GE Life Sciences, Little Chalfont, REINO UNIDO) y se cultivó durante una noche a 37 ºC en placas de agar con ampicilina LB (Triptona 10 g/l, Extracto de Levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l, concentración final de ampicilina 100 µg/ml) (agar 15 g/l). Se dejaron crecer precultivos (una colonia en 3 ml de ampicilina LB `glucosa 1 %) durante una noche a 30 ºC con agitación. Se inhibe la producción del Fab recombinante en presencia de glucosa. Se diluyeron precultivos después de incubación durante una noche 1/100 (0,5 ml en 50 ml de ampicilina LB) y se cultivaron a 30 ºC hasta que la DO600 fue de 1,2 seguido de la adición de sacarosa (concentración final 0,3 mol/l) y se dejó crecer en cultivo a 30 ºC hasta que la DO600 volvió a 1,2. A continuación se añadió isopropilo-β-D-tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 1 mmol/l y los cultivos continuaron incubándose durante 24 horas a 23 ºC con agitación. Los cultivos se centrifugaron después a través de un filtro de 0,45 µm y se dializaron durante una noche en PBS (Na2HPO4 8,1 mmol/l, KH2PO4 1,5 mmol/l, KCl 2,7 mmol, NaCl 137 mmol/l pH 7,4). El sobrenadante de cultivo de células HB2151 transformadas con el plásmido de K1-70 (HB215/K1-70) cultivadas con glucosa sin IPTG es decir no inducidas, se usaron como controles negativos. Los sobrenadantes de cultivo se ensayaron con respecto a (a) su capacidad para inhibir la unión de TSH con el TSHR y (b) su capacidad para inhibir la estimulación mediada por TSH de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR.

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Resultados

Aislamiento y clonación de líneas celulares estables que secretan K1-18 o K1-70

5 Se infectaron linfocitos (26 x 106) obtenidos de 20 ml de sangre del paciente con VEB y se sembraron en placas a 1 x 106 células por pocillo en una placa de 48 pocillos en capas de alimentación de macrófagos de ratón. El día 13 después de la infección por VEB los sobrenadantes de pocillos de placa se controlaron con respecto a inhibición de la unión con 125I-TSH. Los clones positivos se ensayaron adicionalmente con respecto a sus efectos (estimulantes o de bloqueo) en el TSHR. Las células de pocillos positivos (positivos en cualquiera de los ensayos usados) se expandieron y se fusionaron con la línea celular de hibridoma K6H6/B5 y se sembraron en placas de 96 pocillos. Se obtuvieron dos clones que producían de forma estable anticuerpos con actividad inhibidora de la unión con 125I-TSH y se volvieron a clonar 4 veces. Uno de los clones secretó un MAb humano designado K1-18 que tenía actividad estimulante de TSHR. El anticuerpo K1-18 purificado de los sobrenadantes de cultivo de hetero-hibridoma fue de la subclase IgG1 con cadenas ligeras kappa. El otro clon estable secretó un MAb humano designado K1-70 que tenía

15 la capacidad para bloquear la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR. El anticuerpo K1-70 purificado a partir de sobrenadantes de cultivo de hetero-hibridoma fue de la subclase IgG1 con cadenas ligeras lamba.

Inhibición de la unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR

La capacidad de diferentes concentraciones de IgG K1-18 o K1-70 para inhibir la unión de TSH marcada con tubos recubiertos con TSHR se muestra en las Tablas 1a y 1b. Como se muestra en la Tabla 1a, IgG K1-18 diluido en suero de donantes de sangre sanos (HBD) mostró inhibición máxima de la unión de 125I-TSH de aprox. 95 % a concentraciones de 1 µg/ml. El efecto inhibidor de IgG K1-18 a concentraciones entre 1-0,001 µg/ml fue dependiente 25 de la dosis. El efecto inhibidor de K1-18 fue comparable al efecto de IgG M22 a las mismas concentraciones. IgG K1-18 a 1 µg/ml es un inhibidor más potente de la unión con 125I-TSH que IgG 5C9, IgG TSMAb 1-7 o IgG 9D33 (Tabla 1a). Se muestran efectos inhibidores de IgG o Fab K1-70 en la unión con 125I-TSH en la Tabla 1b. IgG K1-70 diluido en suero de HBD mostró inhibición dependiente de dosis que variaba de 13,5 ± 2,3 % a 0,03 µg/ml a 95,9 ± 0,8 % a 100 µg/ml. Los efectos inhibidores de Fab K1-70 fueron comparables a los efectos de IgG K1-70 a las mismas concentraciones (Tabla 1b). Las Tablas 1a y 1b también muestran los efectos en la unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por K1-18 y K1-70 y diferentes MAb IgG diluidos en el tampón de ensayo de tubo recubierto; en el caso de todos los MAb excepto 5C9 estos efectos fueron comparables con los resultados observados cuando se diluyeron MAb en suero de HBD. La Tabla 2a muestra inhibición de la unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por diferentes preparaciones de K1-18, suero de donante de K1 y suero de donante de 35 K1-IgG. En este experimento, se observó una inhibición de aproximadamente el 12 % con tan poco como 0,01 µg/ml de IgG K1-18 diluido en sueros de HBD y la inhibición aumentó de una manera dependiente de dosis hasta el 95 % de inhibición a 10 µg/ml de IgG K1-18. Fab K1-18 a 0,01 µg/ml en sueros de HBD mostró inhibición del 5,6 ± 7,3 % y la inhibición aumentó de una manera dependiente de dosis hasta una inhibición máxima de 82,2 ± 0,9 % a 10 µg/ml. Esto puede compararse con la inhibición de la unión de 125I-TSH por IgG en suero de donante diluido en sueros de HBD; inhibición de 13,7 ± 1,3 % a 0,125 mg/ml que aumenta de una manera dependiente de dosis a inhibición de 76,5 ± 1,5 % a 1 mg/ml. El suero de donante a diferentes diluciones también mostró inhibición dependiente de dosis de la unión de 125I-TSH; inhibición de 9,1 ± 0,8 % y dilución de 1/160 a inhibición de 81,1 ± 0,4 % a dilución 1/10. Los datos en la Tabla 2a mostraron que IgG K1-18 purificado era 6600 veces más activo con respecto a inhibición de la unión con TSH en comparación con IgG de suero de donante K1. Cuando se diluyeron IgG de K1-18 e IgG de suero 45 donante en tampón de ensayo la capacidad de IgG K1-18 para inhibir la unión con TSH fue de 4700 veces mayor que la de la IgG de suero donante (Tabla 2a). La Tabla 2b muestra inhibición de la unión de 125I-TSH con el TSHR en ensayo de tubos recubiertos por diferentes preparaciones de K1-18 en comparación con el efecto de la preparación de referencia de Autoanticuerpo Estimulante de Tiroides 90/672 del Instituto Nacional para Patrones Biológicos y Control (NIBSC; Potters Bar, Reino Unido). IgG K1-18 diluido en suero de HBD mostró actividad inhibidora de la unión de 125I-TSH de 69 NIBSC 90/672 unidades/mg (la media de la actividad calculada a tres concentraciones de IgG K1-18; 30 ng/ml, 100ng/ml y 300 ng/ml) (Tabla 2b). La actividad inhibidora de la unión de125I-TSH de Fab K1-18 (diluido en suero) calculada en el mismo experimento de 46 NIBSC 90/672 unidades/mg (actividad a 30 ng/ml, 100 ng/ml y 300 ng/ml de Fab K1-18 se usó para los cálculos) (Tabla 2b). Esto puede compararse con la actividad inhibidora de la unión con 125I-TSH de IgG M22 de 131 NIBSC unidades/mg (Tabla 2b).

55 Las actividades inhibidores de la unión con 125I-TSH de diluciones de suero de donante e IgG de suero de donante en comparación con la actividad de NIBSC 90/672 se muestran en la Tabla 2c. La actividad inhibidora de la unión con 125I-TSH del suero de donante fue de 0,075 NIBSC 90/672 unidades/ml (media de los valores a diluciones 40x y 20x) y de IgG de suero de donante diluido en suero de HBD fue de 0,011 unidades/mg (media de los valores a 0,1; 0,3 y 1,0 mg/ml) (Tabla 2c). Esto puede compararse con la actividad de IgG K1-18 (diluido en suero de HBD) medida en el mismo experimento de 63,3 unidades de NIBSC 90/672/mg (medio de los valores a 30, 100 y 300 ng/ml) y la actividad de IgG K1-70 (diluido en suero de HBD) de 114 unidades/mg (media de los valores a 10, 30 y 100 ng/ml) (Tabla 2c). En consecuencia, en este sistema de ensayo la actividad específica de IgG K1-18 fue de 5755x la de la IgG de suero de donante. De forma similar, la actividad específica de IgG K1-70 fue de 10.364x la de la IgG de suero de donante.

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Análisis de Scatchard de la unión de K1-18 y K1-70 con tubos recubiertos de TSHR

La afinidad de unión de IgG K1-18 por el TSHR (longitud completa) fue de 6,7 ± 1,0 x 109 l/mol (media ± DT; n =3) mientras que la afinidad de unión de Fab K1-18 fue de 1,8 ± 1,0 x 109 l/mol (media ± DT; n =3). La afinidad de unión de IgG K1-18 por el TSHR260 fue de 5,9 ± 1,0 x 109 l/mol (media ± DT; n =3). La afinidad de unión de IgG K1-70 por el TSHR (longitud completa) fue de 3,9 ± 0,8 x 1010 l/mol (media ± DT; n =3) mientras que la afinidad de unión de Fab K1-70 fue de 2,3 ±0,3 x 1010 l/mol (media ± DT; n =3). La afinidad de unión de IgG K1-70 por el TSHR260 fue de 3,1 ± 0,4 x 1010 (media ± DT; n =3) y de Fab K1-70 fue de 9,3 ± 0,4 x 109 l/mol (media ± DT; n =3). Esto puede compararse con la afinidad de unión de TSH porcina por el TSHR (longitud completa) de 0,6 ± 0,9 x 109 l/mol (media ± DT; n = 5) (Nakatake et al 2006 mencionado anteriormente).

Inhibición de la unión de TSH-biotina con el TSHR medida por ELISA

Los efectos de IgG K1-18 en la unión de TSH-biotina con pocillos de placas de ELISA recubiertas por TSHR se estudiaron y se compararon con los efectos de otros diversos MAb. Como se muestra en la Tabla 3a, IgG K1-18 diluido en suero de HBD tenía un efecto inhibidor dependiente de la dosis en la unión de TSH-biotina con inhibición del 10,0 ± 08 % en 0,01 µg/ml, esencialmente inhibición máxima de 96,2 ± 0,2 % a 1 µg/ml y una estabilización de inhibición máxima a concentraciones de 3 µg/ml y superiores. Esto puede compararse con el efecto inhibidor de IgG M22 (diluido en suero de HBD) DE 17,5 ± 2,0 % a 0,01 µg/ml y 98,3 ± 0,0 % a 1 µg/ml (Tabla 3a). La actividad inhibidora de la unión de TSH-biotina de IgG K1-18 a 1 µg/ml (diluido en suero de HBD) fue mayor de IgG 5C9, IgG TSMAb 1-7 e IgG 9D33 como se ilustra por los ejemplos mostrados en la Tabla 3a. Cuando se ensayó IgG K1-18 diluido en tampón de ensayo de ELISA (NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8, Triton X-100 0,1 % v/v, BSA 1 mg/ml) los efectos inhibidores fueron esencialmente los mismos que cuando las diluciones se realizaron en suero de HBD (Tabla 3a). Como se muestra por los ejemplos en la Tabla 3b Fab K1-18 diluido en suero de HBD o en tampón de ensayo de ELISA también fue un inhibidor eficaz de la unión de TSH-biotina en el ELISA. Los efectos inhibidores de IgG K1-18 diluido en tampón de ensayo de ELISA con adición de MAb IgG de control (5B3 que es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa) a 100 µg/ml se muestra en la Tabla 3c. Cuando se diluye en el tampón que contiene MaB de control IgG K1-18 mostró actividad de inhibición de unión de TSH-biotina similar a cuando se diluyó en tampón que contenía BSA o en suero de HBD (Tabla 3c). En consecuencia, la presencia de un MAb IgG humano no relacionado a alta concentración (100 µg/ml) no tuvo ningún efecto en la actividad inhibidora de IgG K1-18 ni IgG M22 ni IgG 5C9. La Tabla 3d muestra los efectos de K1-70 en la unión de TSH-biotina con el TSHR y estos son comparables con los efectos de K1-18 o M22 (Tablas 3a y 3b). IgG K1-70 diluido en suero de HBD tuvo un efecto inhibidor dependiente de la dosis en la unión de TSH-biotina con 13,6 ± 1,4 %; 74,1 ± 0,4 % y 97,4 ± 0,2% de inhibición a 0,01 µg/ml; 0,1 µg/ml y 1 µg/ml, respectivamente. Fab K1-70 fue similarmente activo con inhibiciones de 18,2 ± 0,6 %; 88,3 ± 0,3 % y 96,9 ± 0,1 % a 0,01 µg/ml; 0,1 µg/ml y 1 µg/ml, respectivamente. Cuando se diluyeron preparaciones de IgG o Fab K1-70 en tampón de ensayo de ELISA las actividades inhibidoras fueron esencialmente las mismas en comparación con diluciones realizadas en suero de HBD (Tabla 3d). La capacidad de IgG K1-18 para inhibir la unión de Fab M22-POD con pocillos de placas de ELISA recubiertos con TSHR se muestra en la Tabla 4a. IgG K1-18 diluido en suero de HBD inhibió la unión de Fab M22-POD de una manera dependiente de dosis; en particular se observaron inhibiciones a 0,03 mg/ml, 0,3 mg/ml y 3 mg/ml, respectivamente. Este efecto fue comparable al efecto inhibidor de IgG M22 (diluido en suero de HBD) de 51,0 ± 2,4 %, 93,2 ± 0,3 % y 98,0 ± 0,2 % a 0,03 mg/ml, 0,3 mg/ml y 3 mg/ml, respectivamente. Fab K1-18 mostró capacidad similar para inhibir la unión de Fab M22-POD como IgG K1-18 (Tabla 4b). Como se muestra en la Tabla 4a, la capacidad de K1-18 y M22 para inhibir la unión de M22 marcado con el TSHR fue mayor que las actividades inhibidoras de 5C9, TSMAb 1-7 y 9D33. Los efectos inhibidores de todos los MAb estudiados cuando se diluyeron en tampón de ensayo de ELISA fueron similares a los observadores cuando se diluyeron en suero de HBD (Tabla 4a y b). Los efectos inhibidores de K1-18 y la unión de Fab-POD M22 con el TSHR pueden compararse con los efectos de K1-70 (Tabla 4c). IgG K1-70 diluido en suero de HBD mostró inhibición de 34,5 ± 3,8 %, 91,1 ± 0,3 % y 97,6 ± 0,1 % a 0,03 mg/ml, 0,3 mg/ml y 3 mg/ml, respectivamente. Se observaron porcentajes de inhibición similares cuando IgG K1-70 se diluyó en tampón de ensayo de ELISA (Tabla 4c). Como se ilustra en la Tabla 4c Fab K1-70 diluido en suero de HBD o en tampón de ensayo de ELISA mostró actividad inhibidora de unión de M22-POD similar a IgG K1-70.

Inhibición de la unión de IgG o Fab K1-18 marcado con 125I con tubos recubiertos con TSHR

En presencia de un IgG MAb 4B4 humano de control a concentraciones de 0,01 – 100 µg/ml (diluido en suero de HBD) la unión de 125I-IgG K1-18 esencialmente no se vio afectada (Tabla 5a). Esto puede compararse con los efectos de diferentes concentraciones de IgG K1-18 no marcado (diluido en suero de HBD); dosis crecientes de 0,001; 0,01; 0,1 y 1,0 µg/ml provocaron inhibición de la unión de K118 marcado con 125I de 11,1 ± 4,4 %, 22,9 ±2,4 %, 69,0 ± 0,5 % y 91,7 % ± 0,8 %, respectivamente. El Fab K1-18 no marcado ensayado a concentraciones de 0,001

– 100 ng/ml mostró inhibiciones que variaban de 10,3 ± 2,2 % (a 0,03 µg/ml) hasta 84,8 ± 0,9 % (a 100 µg/ml) (Tabla 5b). IgG y Fab K1-70 (ambos ensayados en el intervalo de concentraciones de 0,001 – 100 µg/ml) también inhibieron la unión de 125I-IgG K1-18 de una manera dependiente de dosis hasta una inhibición esencialmente completa de 95,1 ± 0,3 % a 10 µg/ml de IgG K1-70 y 9,28 ± 1,1 % a 3 µg/ml de Fab K1-70 (Tabla 5b). Además, la unión de 125I-IgG K1-18 se inhibió de una manera dependiente de dosis por IgG M22, Fab M22, IgG 5C9, IgG

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TSMAb 1-7 e IgG 9D33 (Tabla 5a y 5b). Cuando se llevaron a cabo los mismos experimentos usando diversas preparaciones de MAb diluidas en tampón de ensayo de tubo recubierto los efectores inhibidores de las preparaciones respectivas fueron comparables con el efecto observado cuando se diluyeron en suero de HBD excepto en el caso de IgG 5C9 (Tabla 5a). En el caso de 5C9 diluido en tampón de ensayo la inhibición máxima a 100 µg/ml fue de 91,3 ± 0,4 % en comparación con 57,7 ± 2,4 % cuando se diluyó en suero de HDB y las inhibiciones a 0,01 µg/ml fueron de 11,7 ± 1,8 % y -1,8 ± 2,7 %, respectivamente (Tabla 5a). La unión de 125I-IgG K118 con tubos recubiertos con TSHR se inhibió por el suero donante de linfocitos dando como resultado una inhibición de 35,2 % y 59,3 % en diluciones en suero de 1:20 y 1:10, respectivamente (Tabla 5c). Los sueros de 20 pacientes de Graves inhibieron la unión de 125I-IgG K1-18 y el efecto inhibidor fue comparable al efecto inhibidor en la unión de 125I-TSH (Tabla 5c). La Tabla 5c también muestra el efecto de diluciones de suero de dos pacientes con TRAb de bloqueo (B1 y B2) y sueros de dos pacientes con TRAb estimulantes (S1 y S2) en la unión tanto de IgG I-K1-18 como de 125I-TSH. El efecto de diversos MAb en la unión de 125I-Fab K1-18 con los tubos recubiertos con TSHR se muestra en la Tabla 5d. Ambos, IgG K1-18 y Fab K1-18 no marcados tuvieron efecto inhibidor dependiente de la dosis en la unión de 125I-Fab K1-18 y estos efectos fueron comparables a los efectos de IgG M22, Fab M22 e IgG K1-70 (Tabla 5d). IgG 5C9, IgG TSMAb 1-7 e IgG 9D33 también inhibieron la unión de 125I-Fab K1-18, sin embargo, sus efectos fueron menores en comparación con preparaciones de M22, K1-18 y K1-70 (Tabla 5d).

Estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR

IgG K1-18 estimuló la producción de AMP cíclico en células CHO que expresaban el TSHR de una manera dependiente de dosis como se muestra en la Tabla 6a. En tampón hipotónico, los niveles de AMP cíclico en presencia de IgG K1-18 0,1 ng/ml fueron de 1,56 ±0,32 pmol/l, a 1,0 ng/ml fueron de 4,08 ± 0,28 pmol/l, a 10 ng/ml fueron de 31,66 ± 5,06 pmol/l, a 100 ng/ml fueron de 64,95 ± 9,61 pmol/l y a 1000 ng/ml fueron de 67,90 ± 10,44 pmol/l. Los niveles de AMP cíclico a diferentes concentraciones de Fab K1-18 en tampón hipotónico fueron de 1,72 ± 0,82 pmol/l, 9,99 ± 3,52 pmol/ l, 53,22 pmol/l y 66,94 ± 6,93 pmol/l a 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml y 1000 ng/ml de Fab K1-18 Fab, respectivamente. Fab M22 Fab a 1 ng/ml en tampón hipotónico estimuló la producción de AMP cíclico de 29,80 ± 0,97 pmol/l y a 10 ng/ml de 57,41 ± 5,05 pmol/l (Tabla 6a). La Tabla 6a también muestra el efecto de IgG o Fab K1-18 en la estimulación de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR ensayado en las condiciones isotónicas. Como se ilustra por los ejemplos de la Tabla 6a tanto IgG como Fab K1-18 provocaron aumento de la producción de AMP cíclico en condiciones isotónicas aunque los niveles de AMP cíclico producido fueron menores en comparación con experimentos usando condiciones hipotónicas. Se muestra en la Tabla 6b la comparación de la actividad estimulante de IgG M22 e IgG K1-18 ensayados en tampón hipotónico. A una concentración de 3 ng/ml IgG M22 estimuló 24,3 ± 2,3 pmol/ml de AMP cíclico mientras que IgG K1-18, 8,3 ± 0,5 pmol/ml. A 10 ng/ml IgG M22 e IgG K1-18 provocó estimulación de 50,3 ± 1,6 y 25,0 ± 1,0 pmol/ml de AMP cíclico respectivamente y a 100 ng/ml 64,6 ± 1,9 y 62,6 ± 2,7 pmol/ml respectivamente. La actividad estimulante de IgG y Fab K1-18 también se evaluó en relación con la actividad de la preparación de referencia de NIBSC 90/672 (Tabla 6c). La actividad estimulante de AMP cíclico calculada de IgG K1-18 fue de 155 unidades de NIBSC 90/672 unidades/mg (media de la actividad calculada a las tres concentraciones de IgG K1-18; 1 ng/ml, 3 ng/ml y 10 ng/ml) (Tabla 6c). La actividad estimulante de AMP cíclico de Fab K1-18 calculada en el mismo experimento fue de 22 unidades de NIBSC 90/672/mg (actividad a 10 ng/ml, 30 ng/ml y 100 ng/ml de Fab K1-18 se usó para los cálculos) (Tabla 6c). Esto puede compararse con la actividad estimulante de AMP cíclico de IgG M22 de 286 unidades de NIBSC/mg (Tabla 6c). Para fines comparativos las actividades estimulantes de TSH porcina, TSH humana nativa y TSH humana recombinante en tampones isotónico e hipotónicos se muestran en la Tabla 6d.

Se muestran ejemplos adicionales en la Tabla 6e con respecto a los efectos estimulantes de IgG K1-18, IgG M22 o pTSH cuando se mezclan entre sí en diferentes combinaciones. El efecto estimulante de pTSH, M22 o K1-18 parece estar potenciado cuando dos estimulantes se mezclan entre sí en comparación con el efecto del estimulador solo a las mismas concentraciones. En particular, la producción de AMP cíclico de 11,01 ± 0,99 pmol/ml (media ± DT) a 0,1 ng/ml de pTSH solo y de 35,17 ± 6,38 pmol/ml (media ± DT) a 1 ng/ml de IgG M22 aumentó a 47,22 ± 3,89 pmol/ml (media ± DT) cuando se mezclaron entre sí pTSH 0,1 ng/ml e IgG M22 1 ng/ml. También una mezcla de 0,1 ng/ml de pTSH y 10 ng/ml de IgG K1-18 tuvo un efecto estimulante mayor que estos estimulantes por sí solos (Tabla 6e). Además, dos anticuerpos estimulantes mezclados entre sí fueron más potentes que un único anticuerpo a las mismas concentraciones. Por ejemplo, se produjeron 29,95 ± 1,18 pmol/ml (media ± DT) de AMP cíclico en respuesta a 5 ng/ml de IgG K1-18, se produjeron 20,20 ± 2,48 pmol/ml (media ± DT) en respuesta a 0,5 ng/ml de IgG M22 mientras que se produjeron 4,01 ± 7,19 pmol/ml (media ± DT) de AMP cíclico en respuesta a 5 ng/ml de K1-18 y 0,5 ng/ml de M22 mezclados entre sí (Tabla 6e).

Los resultados de dos experimentos en los que se compararon la capacidad de la IgG suero de donante de K1-18 y K1-70 para estimular AMP cíclico con la actividad estimulante de NIBSC 91/672 se muestran en las Tablas 6f y 6g. En el experimento 1, la actividad estimulante del suero del donante fue de 4,7 ± 0,1 pmol/ml de AMP cíclico a una dilución 30 veces en comparación con el efecto del suero de HBD a la misma dilución de 1,7 ± 0,4 pmol/ml mientras que la actividad estimulante da IgG del suero de donante fue de 7,7 ± 1,0 pmol/ml a 30 µg/ml lo que representó una actividad relativa a NIBSC 90/672 de 0,013 unidades/mg (Tabla 6f). En el experimento 2, el suero del donante diluido 30 veces provocó estimulación de AMP cíclico hasta 9,5 ± 0,7 pmol/ml mientras que la IgG del suero de donante a

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30 µg/ml provocó estimulación a 15,6 ±0,7 pmol/ml que representaba actividad relativa a NIBSC 90/672 de 0,014 unidades/mg (Tabla 6g). Se inhibición la actividad estimulación TSHR por IgG K1-18 por MAb humanos con actividad antagonista de TSH (K1-70 y 5C9) como se ilustra por los ejemplos mostrados en la Tabla 6h. En particular, IgG K1-18 a 10 ng/ml provocó estimulación de AMP cíclico a 50,0 ± 3,3 pmol/ml y ésta se redujo a 3,8 ± 5 1,0 pmol/ml en presencia de 0,1 µg/ml de IgG K1-70 (inhibición del 92 %). En presencia de 10 ng/ml de IgG K1-18 y 0,1 µg/ml de IgG 5C9 los niveles de AMP cíclico fueron de 4,4 ± 1,5 pmol/ml (inhibición el 91 %). A concentraciones mayores de IgG K1-70 e IgG 5C9 el efecto inhibidor era completo (inhibición del 100 %) (Tabla 6h). En experimentos adicionales el efecto de IgG K1-70 mezclado junto con IgG 5C9 en actividad estimulante de IgG K1-18 se estudió (Tabla 6i). Como se muestra en la Tabla 6i la estimulación de IgG K1-18 a 10 ng/ml se inhibió eficazmente por 0,1 10 µg/ml de IgG 5C9 o 0,1 µg(ml de IgG K1-70. Cuando se mezclaron IgG K1-70 e IgG 5C9 para proporcionar una concentración total final de 0,1 µg/ml la actividad estimulante de IgG K1-18 también se inhibió eficazmente (97,3 % de inhibición). Sin embargo a concentraciones menores IgG K1-70 e IgG 5C9 cuando se mezclaron entre sí fueron inhibidores más eficaces de la actividad estimulante de IgG K1-18 que un anticuerpo solamente. Por ejemplo, a 0,001 µg/ml IgG K1-70 e IgG 5C9 no provocaron individualmente ninguna inhibición (0 % y 1 % respectivamente)

15 mientras que cuando se mezclaron entre sí con la misma concentración final de IgG total (es decir 0,001 µg/ml) la inhibición fue del 25, 5 %.

La Tabla 6i también muestra que la concentración de AMP cíclico en presencia de IgG K1-70 (100 µg/ml) era similar a la observada en presencia de tampón de ensayo mientras que en presencia de IgG K1-5C9 (100 µg/ml) la 20 concentración de AMP cíclico fue menor (0,89 ± 0,13; 0,89 ± 0,15 y 0,55 ± 0,14, respectivamente) (media ± DT de determinaciones por triplicado). Cuando IgG K1-70 e IgG 5C9 se mezclaron entre sí (concentración final de 100 µg/ml de IgG total) las concentraciones de AMP cíclico no se redujeron por debajo de los niveles observados en presencia de tampón (es decir, no menores de los niveles de actividad basal o constitutiva). Para comparación se observó inhibición esencialmente completa de la actividad estimulante de IgG M22 (3 ng/ml) a 1 µg/ml de IgG 5C9 o 25 1 µg/ml de IgG K1-70 (97,1 % y 96,6 % de inhibición respectivamente) e inhibiciones de 0,1 µg/ml de IgG 5C9 o 0,1 µg/ml de IgG K1-70 fueron de 92,8 % y 75,5 %, respectivamente (Tabla 6j). Sin embargo, cuando 5C9 y K1-70 se mezclaron entre sí hasta una concentración final de IgG total de 0,1 µg/ml se observó una observación una inhibición del 91,9 % (Tabla 6j). Los efectos de las mezclas de IgG K1-70 e IgG 9D33 en la actividad estimulante de IgG K1-18 se muestran en la Tabla 6k. En el caso de IgG 9D33 se observó una inhibición del 95 % a 1 µg/ml mientras que IgG 30 K1-70 a 0,1 µg/ml mostró la misma inhibición (95 % de inhibición). Cuando los dos MAb de bloqueo (9D33 y K1-70) se mezclaron entre sí hasta una concentración final de IgG total de 0,1 µg/ml se observó también inhibición del 95 % (Tabla 6k). IgG 9D33 a 10 µg/ml fue capaz de inhibir esencialmente de forma completa la estimulación de AMP cíclico por IgG M22 (94 % de inhibición) mientras que concentraciones menores de IgG K1-70 (1 µg/ml) tuvieron un efecto similar (inhibición del 96 %) (Tabla 6l). La inhibición esencialmente completa de la actividad de M22 (inhibición 35 del 96 %) fue evidente a 1 µg/ml de la mezcla 9D33 y K1-70 (Tabla 6l). Esto es comparable con el efecto inhibidor de una mezcla de 9D33 y K1-70 (1 µg/ml) en la actividad estimulante de TSH (inhibición del 97 %) (Tabla 6m). Sin embargo, debería observarse que la actividad estimulante de TSH se inhibió más eficazmente por IgG K1-70 solamente (inhibición del 98 % a 1 µg/ml) que por IgG 9D33 solamente (inhibición 95 % a 100 µg/ml) (Tabla 6m). La Tabla 6n muestra el efecto del suero de donante de linfocitos y tres sueros de pacientes que contenían TRAb con 40 actividad de bloqueo (B1-B3) en la actividad estimulante de TSHR de TSH, IgG M22 e IgG K1-18. El suero de donante inhibió las actividades estimulantes de TSH, IgG M22 e IgG K1-18 (inhibiciones del 63,8 %, 80,1 % y 79,5 %, respectivamente). Tres sueros diferentes con TRAb de bloqueo que tenían un fuerte efecto inhibidor en TSH y la estimulación de IgG M22 también inhibieron la actividad estimulante de IgG K1-18 (Tabla 6n). Los efectos inhibidores de los diferentes sueros de pacientes en las actividades estimulantes de TSH, IgG M22 o IgG K1-18

45 fueron comparables.

Medición de la actividad antagonista (de bloqueo)

La incubación de células CHO que expresaban el TSHR con TSH porcina a 3 ng/ml provocó la estimulación de la

50 producción de AMP cíclico a 62,6 ± 3,9 pmol/ml (Tabla 7a). En presencia de cantidades crecientes de IgG K1-70 la actividad estimulante de TSH porcina se inhibió de una manera dependiente de dosis. En particular en presencia de 0,01, 0,05, 0,1 y 1 mg/ml de IgG K1-70 los niveles de AMP cíclicos fueron 60,1 ± 1,6, 31,4 ± 1,9, 5,8 ± 2,8 y 2,0 ± 0,2 pmol/ml respectivamente lo que representa una inhibición de 4,0 %, 49,8 %, 90,7 % y 96,8 % respectivamente en relación con el efecto del MAb IgG de control (5B3) (Tabla 7a). La Tabla 7a también muestra los efectos inhibidores

55 de IgG 5C9 para comparación. Los efectos de Fab K1-70 en la actividad estimulante de TSH en 2 condiciones experimentales diferentes se muestran en la Tabla 7b. En presencia de Fab K1-70 a 1 µg/ml la actividad estimulante de TSH porcina se inhibió esencialmente de forma completa en ambas condiciones (es decir en medio isotónico y en medio hipotónico). El efecto de Fab K1-70 dependió de la dosis en el intervalo de concentraciones estudiado (0,003 µg/ml a 3 µg/ml) mostrando tan poco como 0,5 µg/ml de Fab una capacidad para reducir la estimulación de TSH

60 porcina hasta 28,9 ± 1,1 pmol/ml de AMP cíclico desde 39,5 ± 1,9 pmol/ml en presencia de 1 µg/ml de MAb de control (condiciones isotónicas) (Tabla 7b). La potencia de Fab K1-70 en condiciones hipotónicas fue similar a la observada en condiciones isotónicas (Tabla 7b).

Concentraciones crecientes de IgG K1-70 (intervalo de 0,001 – 100 µg/ml) no mostraron ninguna capacidad para inhibir la actividad constitutiva (basal) de TSHR como se ilustra por los ejemplos mostrados en la Tabla 7c. Esto contrasta con los efectos de IgG 5C9 como se muestra en la Tabla 7c para comparación. El anticuerpo de ratón de bloqueo 9D33 ensayado en el mismo experimento no tuvo ninguna capacidad para afectar a la actividad constitutiva de TSHR (Tabla 7c) y se observó algo de actividad estimulante débil (aproximadamente 2 x la basal) con altas

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5 concentraciones de 9D33.

La actividad de bloqueo de IgG K1-70 se comparó con la actividad de bloqueo del suero de donante de linfocitos como se muestra en la Tabla 7d. Los niveles de AMP cíclico después de incubación con TSH porcina a 1 ng/ml fueron de 61,7 ± 4,3 pmol/ml y los niveles descendieron en presencia de suero donante (dilución 10x) hasta 14,9 ± 1,2 pmol/ml (inhibición del 75,9 %) y hasta 51,6 ± 2,6 pmol/ml con suero diluido 20 veces (inhibición del 16,4 %). El suero del donante a diluciones mayores no tuvo un efecto detectable en la actividad estimulante de la TSH. El efecto del suero de donante puede compararse con el efecto de IgG K1-70 que a 0,1 µg/ml tuvo efecto similar al suero diluido 10 veces (inhibición del 67,6 % y 75,9 % respectivamente) (Tabla 7d). IgG K1-70 tuvo la capacidad para bloquear la actividad estimulante de AMP cíclico de TSH porcina, TSH humana y TSH recombinante humana como 15 se ilustra por los ejemplos en la Tabla 7e. IgG K1-70 a 0,1 µg/ml fue un bloqueador eficaz de la actividad estimulante de las tres preparaciones de TSH ensayadas en condiciones de medio hipotónico. La actividad de bloqueo de IgG K1-70 fue menos eficaz en condiciones de medio isotónico (Tabla 7e). Los efectos de IgG K1-70 en la estimulación mediada por IgG M22 de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresaban el TSHR se muestran en la Tabla 7f. Los niveles de AMP cíclico observados a 3 ng/ml de IgG M22 fueron de 33,1 ± 1,8 pmol/l y éstos se redujeron en presencia de IgG K1-70 por ejemplo, 4,3 ± 2,4 pmol/l a 0,1 µg/ml (inhibición del 87 %) (Tabla 7f). Los efectos de IgG K1-70 fueron comparables a los efectos de IgG 5C9 ensayados en el mismo experimento (Tabla 7f). Además, IgG K1-70 mostró la capacidad para bloquear la actividad estimulante de AMP cíclico de TRAb en sueros de pacientes con enfermedad de Graves y los ejemplos en las Tablas 7g – 7k ilustran que concentraciones de 100 µg/ml de IgG K1-70 provocaron la inhibición completa de la actividad estimulante en los 15 sueros estudiados (la 25 inhibición de T1-T15 varió de 90,8 % a 98,7 %). Los efectos de IgG K1-70 en las actividades estimulantes de sueros T1-T15 fueron comparables a los efectos de IgG 5C9 e IgG 9D33 ensayados en el mismo experimento excepto por un suero, es decir T11 (Tabla 7j). La actividad estimulante del suero T11 solamente se inhibió débilmente por 100 µg/ml de IgG 5C9 (inhibición del 8,5 %) mientras que en presencia de 100 µg/ml de K1-70 la inhibición fue esencialmente completa (inhibición del 95,1 %) (Tabla 7j). También se observó inhibición eficaz (87,1 %) de T11 con 9D33 100 µg/ml (Tabla 7j). El efecto de diferentes MAb de bloqueo a diferentes concentraciones (0,01 – 100 µg/ml) en las actividades estimulantes de tres sueros de Graves (incluyendo suero T11) se muestra en más detalle en las Tablas 7l-7n. Estos experimentos mostraron que IgG K1-70, IgG 5C9 e IgG 9D33 son inhibidores eficaces a concentraciones tan bajas como 0,1 µg/ml excepto en el caso del suero T11 en el que IgG 5C9 tuvo poco o ningún efecto (Tabla 7n). La Tabla 7o muestra la inhibición de la estimulación de TSH porcina por IgG K1-70 e IgG 5C9 35 cuando los dos MAb de bloqueo se mezclaron entre sí en un experimento. Estos experimentos mostraron que los dos MAb de bloqueo fueron eficaces en combinación en su capacidad para inhibir la estimulación de TSH de la producción de AMP cíclico. Además, se ensayó el efecto de IgG K1-70 e IgG 5C9 mezclados entre sí en la actividad constitutiva del TSHR. Como se muestra en las Tablas 7c y 7p IgG K1-70 no tuvo ningún efecto en la actividad basal del TSHR en contraste con IgG 5C9. Cuando se mezclaron entre sí IgG K1-70 y 5C9 para proporcionar una concentración de IgG final de 2 µg/ml los niveles de AMP cíclico descendieron ligeramente de 58,04 ± 8,52 pmol/ml (media ± DT, n = 3), en presencia de tampón solamente hasta 55,28 ± 6,17 pmol/ml (media ± DT, n = 3), es decir inhibición del 4,8 % (Tabla 7p). Sin embargo, cuando se mezcló IgG 5C9 con IgG 5B3 (anticuerpo de control para ácido glutámico descarboxilasa) para proporcionar una concentración de IgG final de 2 µg/ml se inhibió la actividad constitutiva del TSHR hasta el 52,1 % de los valores basales (nivel de AMP cíclico 27,78 ±2,96 pmol/ml; media ± DT,

45 n = 3) (Tabla 7p). Estos experimentos muestran que en presencia de IgG K1-70, IgG 5C9 es incapaz de actuar como un inhibidor eficaz de la actividad constitutiva de TSHR.

Efecto de las mutaciones de TSHR en la actividad estimulante de K1-18

El efecto de IgG K1-18 en la estimulación de la producción de AMP cíclico se ensayó usando células CHO que expresaban TSHR con las siguientes mutaciones de aminoácidos: Lys58Ala, Arg80Ala, Tyr82Ala, Glu107Ala, Arg109Ala, Lys129Ala, Phe130Ala, Phe134Ala, Lys183Ala, Asp203Ala, Arg255Asp (Tabla 8a-k y resumido en la Tabla 10). La mutación de los aminoácidos de TSHR Lys58, Arg80, Tyr82, Glu107, Arg109, Lys129, Phe130, Phe 134 y Asp203 a alanina no tuvo ningún efecto en la capacidad de IgG K1-18 para estimular la producción de AMP 55 cíclico. La capacidad de IgG K1-18 para estimular la producción de AMP cíclico se perdió completamente con células CHO que expresaban TSHR que contenía mutaciones Lys183Ala y Arg255Asp y las concentraciones de AMP cíclico en respuesta a IgG K1-18 fueron similares a las concentraciones observadas en presencia del tampón de AMP cíclico solamente (Tabla 8i y 8k). Sin embargo, se conservó la sensibilidad a TSH con las mutaciones Lys183Ala y Arg255Asp. En una serie adicional de experimentos los efectos de las mutaciones de diversos aminoácidos del TSHR en la actividad estimulante de AMP cíclico de IgG K1-18 se ensayaron adicionalmente (Tablas 14a-14v y resumido en la Tabla 16). Las mutaciones (a alanina) de los restos de TSHR Asp43, Ile60, Glu61, Thr104, His105, Lys250, Arg255, Thr257, Asp276 y Ser281 no tuvieron ningún efecto en la capacidad de IgG K1-18 para estimular la producción de AMP cíclico. Las mutaciones de TSHR Asp151, Glu178, Lys209, Gln235, Glu251 a alanina provocaron una reducción pequeña de la actividad estimulante de IgG K1-18, sin embargo, estas mutaciones 65 también afectaron a la actividad estimulante de TSH, por lo tanto, las interacciones con estos restos de TSHR no se

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consideraron específicos para K1-18. Por el contrario, las mutaciones de TSHR Glu157Ala, Lys183Asp, Tyr185Ala y Asp232Ala dieron como resultado pérdida de la capacidad de IgG K1-18 para estimular el AMP cíclico (menos del 20 % de la actividad de tipo silvestre; Tablas 14g, 14i, 14j, 14m). Además, la capacidad de IgG K1-18 para estimular el TSHR mutado en Tyr206, Trp258 y Arg274 a alanina se redujo a aproximadamente 40-60 % de la actividad de tipo

5 silvestre (Tablas 14k, 14s, 14t).

Efecto de las mutaciones de TSHR en la actividad de bloqueo K1-70

El efecto de IgG K1-70 en la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico se ensayó en células CHO que expresaban TSHR que contiene mutaciones de los siguientes aminoácidos a alanina: Lys58, Arg80, Tyr82, Glu107, Arg109, Lys129, Phe130, Phe134, Lys183 y Asp203. Además del efecto de TSHR se ensayó la mutación Arg255Asp. (Tabla 9 a-k y resumido en la Tabla 10). La mutación de los aminoácidos de TSHR Arg80, Glu107, Lys129, Phe130, Phe134 y Asp203 a alanina no tuvo ningún efecto en la capacidad de IgG K1-70 para inhibir la producción de AMP cíclico estimulada por TSH. La capacidad de K1-70 para inhibir la producción de AMP cíclico 15 estimulada por TSH se redujo por la mutación de Lys58, Tyr82, Arg109 y Lys183 de TSHR a alanina. La mutación Lys58Ala tuvo el mayor efecto (Tabla 9a) seguido de Arg109Ala, Lys183Ala y Tyr82Ala que tuvo el menor efecto (Tablas 9e, 9i, 9c respectivamente y Tabla 10). Sin embargo, ninguna de las mutaciones estudiadas provocó una pérdida completa de la capacidad de IgG K1-70 para bloquear la producción de AMP cíclico estimulada por TSH. En una serie adicional de experimentos los efectos de las mutaciones de diversos aminoácidos del TSHR en la actividad de bloqueo de IgG K1-70 se ensayó adicionalmente (Tablas 15a-15v y resumido en la Tabla 16). La capacidad de K1-70 para inhibir la producción de AMP cíclico estimulada por TSHR en células CHO transfectadas con TSHR no se vio afectada por las mutaciones de TSHR Asp43, Thr104, His105, Asp151, Tyr185, Tyr206, Lys209, Asp232, Gln235, Glu251, Arg255, Thr257, Trp258, y Arg274 a alanina ni las mutaciones Asp160Lys y Lys183Asp. Las mutaciones (a alanina) en Glu178 y Ser281 de TSHR tuvieron un efecto pequeño en la capacidad de IgG K1-70

25 para bloquear la actividad estimulante de TSH (80-100 % de la actividad de tipo silvestre; Tablas 15h y 15v). Las mutaciones de TSHR Glu61, Lys250 y Asp276 a alanina provocaron algún efecto (60-80 % del tipo silvestre) en la actividad de bloqueo IgG K1-70 (Tablas 15c, 15o, 15u) mientras que la mutación de TSHR Ille60Ala provocó una reducción de la actividad de bloqueo de IgG K1-70 al 40-60 % de la actividad de tipo silvestre (Tabla 15b).

Inhibición de la unión de IgG o Fab K1-70 marcado con 125I con el TSHR

La unión de 125I-IgG K1-70 con tubos recubiertos con TSHR se inhibió de una manera dependiente de dosis por IgG K1-70 no marcado y a concentraciones de 0,003 µg/ml, 0,03 µg/ml, 0,3 µg/ml y 3 µg/ml (diluido en suero de HBD). Las inhibiciones fueron de 10,2 ± 2,4 %; 36,5 ± 1,9 %; 84,4 ± 0,8 % y 92,0 ± 0,5 %, respectivamente (Tabla 11 a). 35 Como se muestra en la Tabla 11a la unión de 125I-IgG K1-70 se inhibió de una manera muy similar a IgG M22 (diluido en suero de HBD); inhibiciones del 6,2 % (media de determinaciones por duplicado); 33,8 ± 0,9 %; 84,6 ± 1,1 % y 91,6 ± 0,5 % a concentraciones de 0,003 µg/ml, 0,03 µg/ml, 0,3 µg/ml y 3 µg/ml. Fab M22 mostró una mayor potencia para inhibir la unión de 125I-IgG K1-70 a concentraciones menores con las inhibiciones de 16,7 ± 6,0 %; 60,2 ± 1,8 %; 89,9 imagen1301 % y 92,0 ± 0,3 % a concentraciones de 0,003 µg/ml, 0,03 µg/ml, 0,3 µg/ml y 3 µg/ml (en suero de HBD) (Tabla 11a). Además, IgG y Fab K1-18 inhibieron la unión de 125I-IgG K1-70 con el TSHR de una manera dependiente de dosis (Tabla 11b). Las diluciones de IgG K1-18 a 0,03 µg/ml, 0,3 µg/ml y 3 µg/ml (en suero de HBD) mostraron una inhibición del 20,0 ± 1,9 %, 73,9 ± 0,6 % y 91,0 ± 0,3 % respectivamente y Fab K1-18 a 0,03 µg/ml, 0,3 µg/ml y 3 µg/ml (en suero de HBD) mostró una inhibición del 10,2 ± 2,1 %, 60,9 ± 1,1 % y 80,5 6 0,6 % respectivamente (Tabla 11b). Por el contrario, se requirieron mayores concentraciones de IgG 5C9 para inhibir la 45 unión de 125I-IgG K1-70; fue necesario 1 µg/ml para inhibición de 15,4 ± 3,4 % y 100 µg/ml mostraron inhibición de 68,5 ± 0,7 % (Tabla 11a). Las Tablas 11a y 11b también muestras los efectos de diversos MAb humanos en la unión de 125I-IgG K1-70 en tampón de ensayo. Los efectos son más fuertes cuando se realizan diluciones en tampón de ensayo en comparación con sueros de HBD. Los efectos de diferentes anticuerpos monoclonales de ratón para el TSHR con la actividad estimulante de TSHR (TSMAb 1-7) y con actividad de bloqueo de TSHR (9D33) en la unión de 125I-IgG K1-70 con el TSHR se muestran en la Tabla 11c. Todos los TSMAb ensayados tuvieron la capacidad para inhibir la unión de 125I-IgG K1-70 y concentraciones de 100 µg/ml (en suero de HBD) provocaron una inhibición que varió de 33,5 ± 3,7 % (TSMAb 3) a 59,6 ± 0,6 % (TSMAb 5) (Tabla 11c). IgG 9D33 a 100 µg/ml (en suero de HBD) mostró inhibición de 51,1 ± 1,7 % (Tabla 11c). Cuando estos MAb se diluyeron en tampón de ensayo los % de inhibición fueron ligeramente mayores en comparación con sueros de HBD en algunos casos y ligeramente menores 55 en otros (Tabla 11c). Experimentos adicionales mostraron que la unión de 125I-Fab K1-70 con el TSHR también se inhibía eficazmente por IgG K1-18, Fab K1-18, IgG M22, Fab M22, IgG K1-70, Fab K1-70, y TSMAb de ratón de una manera dependiente de dosis (Tabla 11d). Los sueros de pacientes de Graves (n=20) que contenían autoanticuerpos de TSHR con actividad de inhibición de la unión de 125I-TSH en el intervalo de 15,9 % a 80,0 % (en el ensayo de tubo recubierto con TSHR) también mostraron la capacidad para inhibir la unión de 125I-IgG o Fab K170 con el TSHR (intervalo de 19,2 % a 77,6 % y 15,9 % a 72,8 %, respectivamente) (Tabla 11e). El % de inhibición para los tres ligandos marcados ensayados fue comparable en el caso de cada suero (Tabla 11e). Ninguno de los sueros de HBD (n=10) tuvo efecto en la unión con TSH marcado con 125I, IgG o Fab K1-70 (Tabla 11e). La Tabla 11e muestra ejemplos de experimentos usando dos sueros con actividad estimulante de TSHR (S1 y S2) y dos sueros con actividad de bloqueo de TSHR (B1 y B2). Los sueros con uno de los tipos de actividad inhibieron la unidad de

65 IgG o Fab K1-70, TSH marcado con 125I de una manera dependiente de dosis y el grado de inhibición de la unión de los diferentes ligandos fue comparable para cada suero (Tabla 11e).

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Cinética de la unión de K1-18 y K1-70 con el TSHR

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5 La unión de IgG y Fab K1-70 marcado con con tubos recubiertos con TSHR (de longitud completa) a temperatura ambiente alcanzó un máximo después de 180 min (45,5 % y 37,1 % de unión respectivamente). Se produjo 50 % de la unión máxima después de aproximadamente 35 min (Figura 1a). La unión IgG K1-70 marcado con 125I con tubos recubiertos con TSHR260 alcanzó el 36,2 % a 180 min y se observó 50 % de la unión máxima después de 60 min de incubación (Figura 1b). El ciclo temporal de la unión de Fab K1-70 marcado con 125I con el TSHR260 fue similar al observado para IgG K1-70 con la unión máxima después de 60 min de incubación de 37,3 % y 50 % de unión máxima después de aproximadamente 60 min (Figura 1c). La adición de IgG o Fab K1-70, IgG o Fab K1-19, IgG M22 no marcados (todos a 1 mg/ml), TSH porcino (100 mU/ml) o tampón de ensayo a 125I-IgG K1-70

o 125I-Fab K1-70 unido con tubos recubiertos con TSHR (longitud completa) no dio como resultado asociación detectable incluso después de 180 min de incubación (Figura 1d, 1e y 1f). Sin embargo, después de la adición de 15 Fab M22 no marcado (1 mg/ml) a 125I-IgG K1-70 o 125I-Fab K1-70 unido con tubos recubiertos de TSHR 41,2 % y 27,9 % respectivamente de los recuentos unidos se disociaron después de 180 min de incubación (Figura 1d y 1f). El efecto de disociación de diversos ligandos no marcados en IgG K1-70 marcado con 125I unido con TSHR260 se muestra en la Figura 1g. TSH porcino, IgG M22 e IgG K1-18 no tuvieron ningún efecto mientras que Fab M22 y Fab K1-70 provocaron que aproximadamente el 30 % de IgG K1-70 marcado con 125I unido se disociara de TSHR260 después de 30 min de incubación y a continuación la disociación no aumentó más hasta 180 min (Figura 1g). Fab K1-18 tuvo efecto similar como se muestra en la Figura 1h. La unión de 125I-Fab K1-70 con tubos recubiertos con TSHR260 no se disoció por incubación con IgG K1-70, IgG K1-18, IgG M22 no marcados (todos a 1 mg/ml), TSH porcino (100 mU/ml) o tampón de ensayo. La incubación con Fab M22 o Fab K1-70 no marcado (1 mg/ml) provocó disociación de la unión de 125I-Fab K1-70 con TSHR260 (58,9 % y 62 % respectivamente) (Figura 1i). La unión de 25 IgG K1-18 marcado con 125I con tubos recubiertos con TSHR a temperatura ambiente alcanzó un máximo después de 180 min de 32,7 % en el caso de tubos recubiertos con el TSHR de longitud completa y 23,3 % en el caso de tubos recubiertos con TSHR260 (Figura 1j). Se observó 50 % de unión máxima después de aprox. 45 min en el caso de TSHR de longitud completa y después de aprox. 50 min en el caso de TSHR260 (Figura 1j). IgG K-18 marcado con 125I unido con tubos de TSHR de longitud completa no se disoció en un pequeño grado por incubación con TSHR porcina no marcada mientras que la incubación con IgG K1-18, IgG M22, IgG K1-70, Fab K1-18 y Fab K1-70 no marcados tuvo un efecto ligeramente mayor (aprox. 25 % de disociación después de 180 min) (Figura 1k). Por el contrario, Fab M22 provocó un 29 % de disociación de 125I-IgG K1-18 unido con TSHR de longitud completa después de 60 min de incubación que aumentaba al 43 % de disociación después de 180 min de incubación (34,5 % de 125I-IgG K1-18 unido en ausencia de Fab M22 en comparación con 24,5 % y 19,8 % después de 60 y 180 min de

35 incubación con Fab M22 respectivamente) (Figura 1k). En el caso de IgG K1-18 marcado con 125I unido con tubos recubiertos con TSHR260 la incubación con TSH porcino no tuvo ningún efecto de disociación (Figura 1l). Por el contrario, la incubación con Fab M22, Fab K1-70 y Fab K1-18 no marcado provocó que 125I-IgG K1-18 unido se disociara de TSHR260. En presencia de Fab M22 y Fab K1-70 la disociación fue rápida (aproximadamente 50 % después de 30 min de incubación) mientras que la incubación con Fab K1-18 provocó 50 % de disociación después de 90 min (Figura 1l). IgG M22, IgG K1-70 e IgG K1-18 tuvieron menor capacidad para disociar 125I-IgG K1-18 de TSHR260 con aproximadamente 30 % de disociación observada después de 180 min de incubación (Figura 1l). Una serie de experimentos separada mostró que TSH porcina marcada con 125I no fue capaz de unirse con tubos recubiertos con TSHR260. La unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con el TSHR de longitud completa se ha descrito anteriormente (Nakatake et al 2006 mencionado anteriormente).

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Efectos de IgG K1-18 o K1-70 en un ELISA basado en TSHR260-AP

La capacidad de IgG K1-18 para formar un “puente” entre el TSHR de longitud completa inmovilizado en pocillos de placas de ELISA y TSHR260-AP en la fase líquida se ilustra por los ejemplos mostrados en la Tabla 12a. Los valores de DO405 nm aumentaron de una manera dependiente de la dosis con concentraciones crecientes de IgG K1-18 (diluido en suero de HBD). En particular, los valores de DO405 nm fueron de 0,013, 0,191, 0,511, 0,660 y 0,706 a 0,005, 0,05, 0,5, 10 y 100 µg/ml de IgG K1-18 respectivamente en comparación con DO405 nm de -0,002 en presencia de suero de HBD solo. IgG K1-70 (diluido en sueros de HBD) también se unión bien en el ELISA de enlace y mostró valores de DO405 nm de 0,045, 0,290, 0,661, 0,738 y 0,794 a concentraciones de K1-70 IgG de 55 0,005, 0,05, 0,5, 10 y 100 µ/ml (Tabla 12a). Los efectos de IgG K1-18 y K1-70 pueden compararse con la capacidad de IgG M22 para unirse con preparaciones de TSHR260-AP como se muestra en la Tabla 12a. En el ensayo, dosis crecientes de IgG M22 (que variaban de 0,005 µg/ml a 10 µg/ml diluido en sueros de HBD) se unieron con cantidades crecientes de los TSHR variando los valores de DO405 nm entre 0,045 y 0,796. Cuando se realizaron diluciones de MAb en tampón de ensayo de ELISA en lugar de sueros de HBD, las absorbancias a 450 nm fueron mayores particularmente en el caso de 5C9 (Tabla 12a). El principio del ELISA de “tipo puente” en el que IgG divalente se une con dos moléculas del TSHR se ha validado adicionalmente por los resultados de los experimentos mostrados en la Tabla 12b. Los IgG intactos de MAb humanos para el TSHR (M22, 5C9, K1-18 y K1-70) mostraron unión dependiente de dosis en el ELISA mientras que los fragmentos Fab monovalentes de los mismos MAb mostraron poca o ninguna respuesta (Tabla 12b). Los TSMAb 1-7 de ratón también se unieron bien en el ELISA de 65 TSHR260-AP como se ilustra por los ejemplos en la Tabla 12c. La señal de DO405 nm varió de 0,103 a 0,561 a concentraciones de 10 µg/ml de TSMAb 1-7 (Tabla 12c). El MAb 9D33 de bloque de TSHR de ratón también se unión en este sistema de ensayo con una señal de DO405 nm de 0,481 a 10 µ 405 nm varió de 0,407 a 0,924 a diluciones 1/5 en sueros de HBD. Además los sueros de pacientes con autoanticuerpos de TSHR de tipo bloqueo se unieron bien en el ELISA de TSHR260-AP como se ilustra por los ejemplos en la Tabla 12f variando la señal de DO405 nm de 0,323 a 0,896 a diluciones 1/10 en sueros de HBD. La Tabla 12g muestra más ejemplos de unión de sueros de pacientes en el ELISA de TSHR260-AP. Se calcularon las concentraciones de TRAb en el ELISA de TSHR260-AP a partir de una curva de calibración preparada a partir de la preparación de referencia de NIBSC 90/672 y se comparó con concentraciones de TRAb (expresadas como un NIBSC U/L) medidas en los mismos sueros usando un ensayo de tubos recubiertos con TSHR. Hubo en general un buen acuerdo e las mediciones de TRAb realizadas usando el ELISA de TSHR260-AP y mediante inhibición de la unión de TSH con TSHR de longitud completa (ensayo de tubo recubierto) (r=0,913, n=57) (Figura 2a). La Tabla 12h muestra que los TRAb de suero del paciente tienen la capacidad para inhibir la unión de Fab M22 marcado con 15 peroxidasa con TSHR260 que recubre pocillos de placas de ELISA. La comparación de la medición de TRAb en un ensayo basado en la inhibición de la unión de Fab M22 con TSHR de longitud completa se correlacionó bien con resultados en el ensayo basado en la inhibición de la unión de Fab M22 con TSHR260 (r=0,761; n=56) (Figura 2b). Otros datos de comparación se muestran en las Figuras 2c y 2d. Se ensayó el efecto de la mutación de TSHR R255D en la unión de anticuerpos en el ELISA de TSHR260-AP. En estos experimentos se usaron preparaciones de longitud completa de TSHR que contenía la mutación R255D para recubrir los pocillos de placas y el ELISA se llevó a cabo usando el protocolo convencional descrito anteriormente. Como se muestra en la Tabla 12i la unión de IgG K1-70 o IgG 9D33 se vio afectada solamente de forma ligera por la mutación de TSHR R255D. Por el contrario, la unión de IgG M22 se vio afectada notablemente por la mutación de TSHR R255D reduciéndose la señal de DO a todas las concentraciones estudiadas (Tabla 12i). La mutación de TSHR R255D tuvo poco efecto en 25 concentraciones superiores de IgG K1-18 pero concentraciones menores (0,1 µg/ml e inferiores) eran mucho menos eficaces en el ensayo usando el receptor mutado (Tabla 12i). La Tabla 12j también muestra que la señal de DO 405 nm con 10 sueros de Graves (no seleccionados para actividad estimulante de bloqueo de TSHR) se redujo cuando se usaron placas recubiertas con TSHR R255D en comparación con TSHR de tipo silvestre. En el grado de la reducción de señal varió con diferentes sueros (Tabla 12j). Los sueros de bloqueo de TSHR del paciente se unieron bien en el ELISA de TSHR260-AP (Tabla 12f) y la unión de los mismos sueros con TSHR R255D se muestra en la Tabla 12k. Los valores de señal de DO405 nm en experimentos con TSHR de tipo silvestre y TSHR mutado en R255D son similares y en consecuencia el efecto de la mutación de TSHR R255D en la unión de los sueros de bloqueo no parece evidente en este sistema de ensayo. El efecto de la mutación de R255D en la unión de sueros de bloqueo del paciente en el ELISA de TSHR260-AP puede compararse con el efecto de la misma mutación en la 35 unión de sueros del paciente con actividad estimulante del tiroides. La Tabla 121 muestra la unión de seis sueros estimulantes (los sueros S1-S6 son los mismos que en la Tabla 12e) con TSHR R255D. En el caso de los seis sueros de los valores de DO405 nm fueron menores en los ensayos con TSHR R255D en comparación con TSHR de tipo silvestre. El grado de la reducción de señal varió; en el caso de los sueros S4, S5 y S6 (diluidos 1:5 en suero agrupado de HBD) la señal descendió de 0,646, 0,407 y 0,531 en los experimentos con el TSHR de tipo silvestre a 0,193, 0,133 y 0,342 en los experimentos con TSHR R255D, respectivamente (Tabla 12l). La reducción de los valores de DO405 nm en el caso de sueros con altos niveles de TRAb (sueros S1-S3 en la Tabla 12e y 12l) fue claramente evidente a diluciones de suero mayores. Por ejemplo, la señal de DO405 nm en el caso de sueros S1, S2 y S3 (diluidos 1:20 en grupo de HBD) de 0,583, 0,407 y 0,453 en los experimentos con el TSHR de tipo silvestre se redujeron claramente a 0,193, 0,117 y 0,210 en los experimentos con TSHR R255D, respectivamente. Los ejemplos

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45 mostrados en las Tablas 12k y 12l sugieren que los sueros con actividades estimulantes de TSHR pueden diferenciarse de los sueros con actividades de bloqueo de TSHR en algunos casos al menos basados en las diferencias en la unión con el TSHR que contiene la mutación R255D. La unión de sueros de pacientes con actividades estimulantes tiende a verse afectada por la mutación mientras que la unión de sueros de pacientes con actividades de bloqueo tiende a no estarlo.

Estabilidad frente a temperatura de diferentes preparaciones de TSHR

En los experimentos de estabilidad frente a temperatura los valores de DO450 nm de la unión de Fab M22-peroxidasa con el TSHR de longitud completa en el ELISA fueron de 0,748, 0,268 y 0,126 respectivamente para (a) 55 preparaciones almacenadas a -80 ºC (no tratadas), (b) incubadas durante 24 horas a temperatura ambiente seguido de devolución a -80 ºC y (c) incubadas durante 48 horas a temperatura ambiente seguido de devolución a -80 ºC, respectivamente. En consecuencia las preparaciones de TSHR de longitud completa almacenadas a temperatura ambiente durante 48 a 24 horas mostraron respectivamente solamente 7 % y 15 % de actividad en relación con preparaciones no tratadas. Los valores de DO450 nm de unión de Fab M22-peroxidasa fueron de 2,293 para TSHR260 no tratado y 1,836 y 1,676 para TSHR260 almacenado a temperatura ambiente durante 24 y 48 horas respectivamente. La actividad de TSHR260 almacenada a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas en relación con preparaciones no tratadas fue del 80 % y 73 % respectivamente. Se observaron resultados similares en el caso de TSHR260-AP con DO450 nm de 2,106 y 1,983 para muestras almacenadas a temperatura ambiente durante 24 y 48 horas respectivamente en comparación con 2,395 para muestras no tratadas. Esto representó el 88 % y 83 % de 65 actividad de unión después de 24 y 48 horas de almacenamiento a temperatura ambiente en relación con TSHR260-AP no tratado. En los experimentos con TSHR LRD C-CAP no tratado la DO450 nm fue de 1,826 y después de 24 y

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48 horas de almacenamiento a temperatura ambiente 1,158 y 1,155, respectivamente. TSHR LRD C-CAP mostró 63 % de actividad en relación con preparaciones no tratadas después de 24 y 48 horas de almacenamiento a temperatura ambiente. Los experimentos anteriormente descritos mostraron que la capacidad para unirse con M22 de TSHR260, TSHR260-AP y TSHR LRD C-CAP después de tratamiento a temperatura ambiente fue mayor que las

5 preparaciones de TSHR de longitud completa. Esto indica que TSHR260, TSHR260-AP y TSHR LRD C-CAP son más estables a temperatura ambiente en comparación con TSHR de longitud completa.

Secuencias de región variable

El análisis de secuencia de los genes que codificaban K1-18 indicó que los genes de región V HC fueron de la familia de VH5-51*01, los genes D de la familia D3-16*02 (o D3-16* 01) y los genes JH de la familia J3*02. En el caso del LC, los genes de región V fueron de la familia V3-20*01 y los genes de región J fueron de la línea germinal de JK-1*01. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de HC se muestran en la Figura 3 (SEC ID Nº 1-18) y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de LC se muestran en la Figura 4 (SEC ID Nº 19-36). Hay mutaciones 15 somáticas en la secuencia génica de HC en comparación con las secuencias de línea germinal; en particular una mutación silenciosa y una mutación de reemplazo en CDR 1, 1 mutación silenciosa y 3 de reemplazo en CDR 2, 3 mutaciones de reemplazo en FRW3 y 1 mutación silenciosa y 1 de reemplazo en CDR 3. La relación de mutación de reemplazo/silenciosa (R/S) para las CDR es de 2,7, sin embargo, además de las mutaciones hay una inserción de 8 pares de bases de longitud en la CDR 3. La CDR1 de HC (SEC ID Nº 6 y 16) es de 5 aminoácidos de longitud, la CDR 2 (SEC ID Nº 7 y 17) es de 17 aminoácidos de longitud y la CDR 3 (SEC ID Nº 8 y 18) es de 13 aminoácidos de longitud (Figuras 3b y 3d, respectivamente). En la secuencia de LC hay: 2 mutaciones de reemplazo en CDR1, 1 mutación silenciosa en FWR2 y 3 mutaciones de reemplazo en CDR 3 con la relación de mutación de R/S general de 5,0 (FWR y CDR). La CDR 1 de LC (SEC ID Nº 24 y 34) está compuesta de 12 aminoácidos, la CDR 2 (SEC ID Nº 25 y 35) de 7 aminoácidos y la CDR 3 (SEC ID Nº 26 y 36) de 9 aminoácidos (Figuras 4b y 4d, respectivamente). 25 La región V de HC de K1-70 es de la línea germinal VH5-51*01, los genes D de la familia D1-7*01 y los genes JH de la familia J4*02. Los genes de LC son de la línea germinal LV1-51*01 combinada con genes JL de la LJ7*01. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de HC se muestran en la Figura 5 (SEC ID Nº 37-54), las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de LC preferidas se muestran en las Figuras 6c y 6d (SEC ID Nº 63-72). En la secuencia de HC de K1-70 hay tres puntuaciones de reemplazo en FWR1, 3 mutaciones de reemplazo den CDR1, 1 mutación de reemplazo en FWR2, 2 mutaciones silenciosas en CDR 2, 4 mutaciones de reemplazo en FWR3 y 1 mutación de reemplazo en FWR4. La relación general de mutación R/S (FWR y CDR) es de 6,0. Además hay 2 inserciones en la CDR 3; un inserción de 5 pares de bases en el punto de unión entre los genes V y D y una inserción de 12 pares de bases en el punto de unión entre los genes D y J (Figura 5b y 5d; SEC ID Nº 41 y 51)). La CDR 1 de HC (SEC ID Nº 42 y 52) es de 5 aminoácidos de longitud, la CDR 2 (SEC ID Nº 43 y 53) es de 17 aminoácidos de longitud y la CDR

35 3 (SEC ID Nº 44 y 54) es de 10 aminoácidos de longitud (Figuras 5b y 5d, respectivamente). Los genes de LC de K1-70 muestran 1 mutación silenciosa en FWR1, 1 mutación silenciosa y 1 de reemplazo en FWR2 y 1 mutación de remplazo en FWR3. Hay 1 mutación silenciosa y 2 de reemplazo en la CDR1 y 2 mutaciones de reemplazo en la CDR3. La relación general de mutaciones R/S (FWR y CDR) es de 2,0. Además hay una inserción de 2 pares de bases entre los genes V y J de LC. La CDR 1 de LC (SEC ID Nº 70) está compuesta de 13 aminoácidos, CDR 2 (SEC ID Nº 71) de 7 aminoácidos y CDR 3 (SEC ID Nº 72) de 11 aminoácidos (Figura 6d).

Estructura de Fab K1-70

Se ha determinado la estructura de Fab K1-70 a una resolución de 2,22 Å (Figura 8). Los parámetros de

45 representación de Ramachandran y la estadística de refinamiento estuvieron dentro del intervalo aceptable para el refinamiento de estructura correcto. La unidad asimétrica contiene dos moléculas de Fab K1-70 completas, Fab A y Fab B. Fab A contiene la cadena pesada A y cadena ligera B, mientras que Fab B contiene cadena pesada C y cadena ligera D. Las dos moléculas de Fab no están relacionadas por simetría no cristalográfica debido a diferencias en los ángulos de codo (Fab A = 145,5º, Fab B = 163,1º). No hay roturas en la densidad electrónica de la cadena principal en la estructura, pero algunos restos están ausentes en los extremos terminales. En Fab A la cadena pesada A y cadena ligera B consisten en los restos 1 a 227 y 4 a 211, respectivamente, y en Fab B la cadena pesada C y la cadena ligera D consisten en los restos 1 a 227 y 2 a 212, respectivamente. Los restos en Fab A y Fab B están numerados de acuerdo con (el sistema de Kabat (Kabat E et al 1991 mencionado anteriormente). Véanse las Figuras 8 y 9a para más detalles. La densidad electrónica no pudo observarse para las cadenas laterales

55 de los restos 1, 58, 129 y 213 de la cadena pesada A; las cadenas laterales de los restos 18, 94, 110, 126, 156, 163 y 166 de la cadena ligera B; las cadenas laterales de los restos 1, 58 y 218 de la cadena pesada C; y las cadenas laterales de los restos 17, 18, 94, 108, 156, 172, 184, 187 y 190 de la cadena ligera D. La ausencia de estas cadenas laterales en el mapa de densidad electrónica indica que son altamente móviles, principalmente debido a su posicionamiento en regiones accesibles al disolvente de la estructura cristalina. La raíz cuadrática media de la desviación (r.m.s.d) para las dos moléculas de Fab, calculada usado LSQKAB (CCP4), es de 0,20 Å para los dominios VH (117 átomos Cα), 0,23 Å para dominios VL (106 átomos Cα), 0,22 Å para dominios CH (96 átomos Cα)y 0,29 Å para dominios CL (97 átomos Cα). Esto demuestra que incluso aunque los ángulos de codo entre las dos moléculas de Fab difieren, los dominios en sí mismos muestran diferencias mínimas. La estructura de Fab K1-70 es convencional (Figura 9a); las estructuras canónicas adoptadas por las seis CDR son 1,1 y 2 para LC CDR1, LC

65 CDR2 y LC CDR3 respectivamente y 1 y 2A para HC CDR1 y HC CDR2 respectivamente. La HC CDR3 no se ha asignado a ninguna clase canónica debido a mayores variaciones en la secuencia y conformación. Están presentes

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enlaces disulfuro entre los restos de cisteína LC23-LC88, LC134-LC194, HC22-HC92, HC142-HC208. En la estructura cristalina de Fab K1-70 LC CDR1 es de 13 restos de longitud, LC CDR2 es de 7 restos de longitud y LC CDR3 es de 1 restos de longitud. HC CDR1 está compuesta de 5 restos, HC CDR2 de 17 restos y HC CDR3 de 12 restos. Para análisis adicional de la estructura las cadenas laterales de LC CDR3 Arg94 y HC CDR2 Arg58 (para las 5 que la densidad electrónica estaba ausente en el conjunto de datos de difracción) se añadieron. En la descripción de la estructura posterior los valores entre paréntesis se refieren a los valores obtenidos incluyendo estas cadenas laterales. Hay 158 enlaces de hidrógeno dentro del LC y 177 dentro del HC. 52 (52) restos del LC están implicados en el contacto interfacial con 44 (45) restos del HC. Hay 7 enlaces de hidrógeno y 2 puentes salinos que mantienen las dos cadenas en su posición relativa. El área de superficie accesible al disolvente (ASA) para la LC CDR1 es de525(485) Å2, para LC CDR2 es 508(508) Å2, para LC CDR3 es 257(442) Å2, para HC CDR1 es 120 Å2, para HC CDR2 es 759 (842) Å2 y para HC CDR3 es 557(528) Å2. La distribución de aminoácidos con carga en la superficie del sitio de unión a antígeno de Fab K1-70 se ha analizado y se muestra en la Figura 9b. La superficie del sitio de combinación está dominada por restos con carga negativa en un lado y por restos con carga positiva en el otro lado. Los parches ácidos en la superficie de unión a antígeno tienen contribuciones de los restos de LC: Asp27B (CDR1),

15 Asp50 (CDR2), Asp92 (CDR3) y de los restos de HC: Asp31 (CDR1), Asp54 y Asp56 (CDR2) y Asp96 (CDR3). Los parches básicos tienen contribuciones de los restos de LC: Lys53 y Arg54 (CDR1) y Arg94 (CDR3) y de los restos de HC: Arg58 (CDR2) y Arg 101 (CDR3). Además, LC Lys 66 que está fuera de las regiones CDR también contribuye a un parche básico en la superficie. En general, el área con carga positiva en la superficie de unión a antígeno de K1-70 está compuesta predominantemente por los restos de LC mientras que el área con carga negativa por los restos de HC. La superficie de unión a antígeno de K1-70 también es rica en restos aromáticos con 5 tirosinas, una fenilalanina y tres triptófanos de las CDR de HC y LC (Figura 9c). Además, cuatro tirosinas y una fenilalanina de las regiones FRW contribuyen al área superficial.

La superficie global del área de unión a antígeno de K1-70 es altamente irregular con una cavidad cerca del centro.

25 La cavidad está rodeada principalmente por restos aromáticos y por LC Asp50 (Figuras 9b y 9c). Además, el interior de la cavidad también está poblado por restos aromáticos. Esto sugiere que los contactos aromáticos pueden ser importantes para la interacción entre K1-70 y el TSHR con el resto aromático prominente en la superficie del TSHR “ajustándose” a la cavidad de la superficie de K1-70.

Fab K1-70 recombinante

La Tabla 17a muestra que Fab K1-70 recombinante en sobrenadante de cultivo de E. coli tuvo la capacidad para inhibir la unión de 125I-TSH con el TSHR. El efecto inhibidor fue completo a diluciones menores de los sobrenadantes de cultivo (91,9 % a dilución 1:2) mientras que diluciones crecientes del sobrenadante provocan efecto inhibidor

35 dependiente de dosis (27,9 % de inhibición a dilución 1:256) (Tabla 17a). El efecto de Fab K1-70 recombinante en la estimulación mediada por TSH de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR se muestra en la Tabla 17b. Las diferentes diluciones de sobrenadantes de cultivo mostraron inhibición dependiente de dosis de la estimulación de AMP cíclico; del 89,3 % de inhibición a dilución 1:5 a 39,7 % de inhibición a dilución 1:40 (Tabla 17b). Los sobrenadantes de cultivo de control de cultivos de E. coli no inducidos no produjeron inhibición detectable de la unión de TSH o inhibición de estimulación de AMP cíclico mediada por TSH (Tablas 17a y b).

Sumario y conclusiones

Los experimentos descritos anteriormente muestran que dos autoanticuerpos monoclonales para el TSHR con

45 actividades biológicas muy diferentes (K1-18 estimulante y K1-70 de bloqueo) pueden aislarse de una única preparación de linfocitos de un paciente. En consecuencia, el sistema inmunitario del paciente producía ambos tipos de autoanticuerpos de TSHR, es decir tipo estimulante y tipo de bloqueo al mismo tiempo. Una vez aislados (como se ha descrito anteriormente) en forma de autoanticuerpos monoclonales, las propiedades de los dos tipos de autoanticuerpos de TSHR pueden investigarse sin que se interfieran entre sí. Las características del nuevo MAb humano con actividad estimulante de TSHR (K1-18) se han descrito y comparado con las características de algunos otros MAb de TSHR conocidos, específicamente de un MAb humano estimulante (M22), un MAb humano de bloqueo (5C9), un Mab humano de bloqueo (K1-70), un MAb de ratón de bloqueo (9D33) y MAb estimulantes de ratón (TSMAb 1-7). Además se han descrito las características del nuevo MAb humano con actividad antagonista de TSH (K1-70) y se ha comparado con las características de MAb conocidos. Específicamente de un MAb humano de

55 bloqueo (5C9), un MAb de ratón de bloqueo (9D33), un MAb humano estimulante (M22), un MAb humano estimulante (K1-18) y MAb estimulantes de ratón (TSMAb 1-7). Se ha mostrado que el nuevo MAB K1-18 de TSHR estimulante humano tiene propiedades similares al M22 con respecto a: inhibición de la unión de TSH marcada con el TSHR, inhibición de la unión entre sí con el TSHR, inhibición de la unión de MAb humanos de bloqueo (5C9 y K170) con el TSHR, inhibición de la unión de MAb de bloqueo estimulantes de ratón (9D33 y TSMAb 1-7). Además los TRAb de suero del paciente inhibieron la unión de K1-18 con el TSHR. Además, tanto M22 como K1-18 se unen con el TSHR con una alta afinidad y son capaces de unirse con un fragmento de TSHR que consiste en los aminoácidos 22-260 unidos con fosfatasa alcalina. Anticuerpos tales como M22 y K1-18 tienen la capacidad de estimular la actividad de AMP cíclico de TSHR aunque la potencia de los dos anticuerpos difiere en aproximadamente 1,5 veces. Los estudios muestran que las propiedades de los autoanticuerpos estimulantes de TSHR son similares en

65 diferentes pacientes y que son representativas de las propiedades de los autoanticuerpos estimulantes de TSHR en todos los pacientes con enfermedad de Graves estudiados hasta el momento. Se muestra un sumario de las

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10

15

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25

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40

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55 E09795799 24-06-2015

características de K1-18 en la Tabla 13a. Los experimentos de los inventores también mostraron que el nuevo MAb humano de tipo de bloqueo K1-70 (obtenido de la misma muestra de linfocitos que el MAb estimulante K1-18) tiene la capacidad para: inhibir la unión de TSH marcada con el TSHR, inhibir la unión de MAb humanos (M22, K1-18 y 5C9) con el TSHR, inhibir la unión de MAb de bloqueo y estimulantes de ratón (9D33 y TSMAb 1-7) con el TSHR. Además la unión de K1-70 con el TSHR se inhibió por TRAb de suero del paciente. K1-70 mostró una potente actividad antagonista de TSH y la capacidad para bloquear la estimulación del TSHR para todos los TRAb ensayados de suero del paciente. Se mostró que K1-70 era un inhibidor más eficaz de la unión de TSH con el TSHR que 5C9. K1-70 se une con el TSHR con una alta afinidad y es capaz de unirse con el fragmento de TSHR de los aminoácidos 22-260 unido a la fosfatasa alcalina. En consecuencia, K1-70 tiene las características de sueros de pacientes con TRAb de bloqueo incluyendo la alta afinidad de unión por el TSHR, la capacidad para inhibir la unión de TSH y M22 con el TSHR y la capacidad para bloquear la estimulación de TSHR inducida por ligando a bajas concentraciones de anticuerpo. Sin embargo, K1-70 no tuvo ningún efecto en la actividad constitutiva de TSHR mientras que 5C9 sí. Se muestra un sumario de las características de K1-70 en la Tabla 13b. La capacidad de K1-18 para estimular la actividad de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR se perdió cuando TSHR se mutó en Glu157Ala, Lys183Ala, Tyr185Ala, Asp232Ala o Arg255Asp. La capacidad de K1-70 para bloquear la actividad AMP cíclica mediada por TSH en células CHO que expresan TSHR se redujo en el caso de mutaciones de TSHR Lys58Ala, Ile60Ala, Arg109Ala, Lys183Ala, Lys250Ala y se redujo ligeramente por la mutación de TSHR Tyr82Ala. Tanto K1-18 como K1-70 así como M22 reaccionaron bien con el fragmento de TSHR de 22-260 en un ELISA basado en TSHR 260-AP. Además un panel de autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente reaccionó bien con los aminoácidos de TSHR 22-260 en el mismo ensayo. Sueros de pacientes con uno de los tipos de actividades de TRAb (estimulante y de bloqueo) se unieron con TSHR260 en el ELISA. Además, los pocillos de placa de ELISA recubiertos con el fragmento de TSHR de los aminoácidos 22-260 se unieron bien con M22-peroxidasa (de RSR Ltd) y esta unión de M22-peroxidasa se inhibió por un panel de autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente. Esta inhibición de la unión de M22-peroxidasa por los autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente fue similar a la inhibición de la unión de M22-peroxidasa con TSHR de longitud completa. Sorprendentemente por lo tanto el fragmento de TSHR de los aminoácidos 22-260 (o quizás un fragmento menor) para que sea suficiente para ensayos rutinarios de autoanticuerpos TSHR. Además, M22 también se unió bien con un fragmento más largo del TSHR (TSHR LRD C-CAP). En estudios de estabilidad, la capacidad de M22 para unirse con TSHR260, TSHR260-AP y TSHR LRD C-CAP después de haberse preincubado a temperatura ambiente fue mayor que las preparaciones de TSHR de longitud completa que se habían preincubado en las mismas condiciones. Esto indica que TSHR260, TSHR260-AP y TSHR LRD C-CAP son más estables a temperatura ambiente en comparación con TSHR de longitud completa. La mutación de TSHR Arg255Asp no tuvo ningún efecto en la unión de IgG K1-70 mientras que IgG K1-18 (a concentraciones menores, es decir 0,1 µg/ml e inferiores) se unió menos eficazmente con el receptor mutado. Los experimentos con diferentes TRAb de suero del paciente indican que los sueros con actividades estimulantes de THSR pueden diferenciarse de sueros con actividades de bloqueo de TSHR basándose en diferencias en la unión con el TSHR que contiene mutación R255D. La unión de sueros de pacientes con actividades estimulantes se ve afectada por la mutación mientras que la unión de sueros de pacientes con actividades de bloqueo se vio afectada menos o nada en absoluto. Los experimentos proporcionan secuencias de nucleótidos y aminoácidos de K1-18 y K1-70. Aunque genes de V de cadena pesada de L1-18, K1-70 derivan de la misma línea germinal que pertenece a la misma familia que los otros genes de V de cadena pesada de MAb humano M22 estimulantes, todos se combinan con genes D y J de diferentes familias; además K1-18 usa la cadena ligera kappa, mientras que M22 y K1-70 usan cadenas ligeras lambda. Los genes de línea germinal de 5C9 (el otro MAb humano de tipo de bloqueo) son diferentes de M22, K1-18 y K1-70 excepto que 5C9 y K1-70 usan genes de cadena pesada J4. Las secuencias de aminoácidos de las CDR de MAb estimulantes (M22 y K1-18) y MAb de bloqueo (5C9 y K1-70) son esencialmente diferentes en particular dentro de las CDR3 de cadenas pesadas y ligeras. Estas observaciones indican que cada uno de los 4 autoanticuerpos humanos se deriva de líneas germinales distintas. Además diferentes secuencias de CDR pueden mostrar actividades biológicas similares hacia el TSHR. Los datos de difracción de rayos X proporcionan detalles moleculares de la estructura de Fab K1-70 incluyendo la topografía del sitio de unión a antígeno. Un Fab K1-70 recombinante producido por clonación y expresión del HC K1-70 (SEC ID Nº 46) y LC K1-70 (SEC ID Nº 63 con SEC ID Nº 64) en E. coli mostró la capacidad para inhibir la unión de TSH marcada con 125I con el TSHR y la capacidad para inhibir la estimulación mediada por TSH de la actividad AMP cíclico de TSHR. En general los resultados indican que los anticuerpos de acuerdo con la invención tales como K1-18 y K1-70 muestran actividad de unión a TSHR similar y efectos biológicos similares en la función de TSHR como MAb TSHR descritos previamente (M22 y 5C9) y como autoanticuerpos de TSHR hallados en diferentes sueros de pacientes con enfermedad tiroidea autoinmunitaria.

Tabla 1a Inhibición de la unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por IgG K1-18 y diferentes anticuerpos monoclonales de TSHR

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen18DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen19DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

91,4 ± 0,7 95,9 ± 0,2

30 µg/ml

89,5 ± 1,0 96,0 ± 0,3

imagen20

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen21DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen22DT)

10 µg/ml

91,1 ± 1,1 96,0 ± 0,5

3 µg/ml

89,1 ± 0,4 95,3 ± 0,5

1 µg/ml

89,3 ± 1,3 94,0 ± 0,7

0,3 µg/ml

89,7 ± 0,7 82,6 ± 1,0

0,1 µg/ml

78,5 ± 0,6 62,0 ± 1,6

0,03 µg/ml

45,2 ± 2,3 26,6 ± 1,2

0,01 µg/ml

21,1 ± 2,3 9,3 ± 2,1

0,003 µg/ml

0,5* 11,4 ± 3,0

0,001 µg/ml

-4,6* 1,6 ± 3,2

IgG M22

100 µg/ml

91,4 ± 1,8 96,5 ± 0,1

30 µg/ml

89,2 ± 0,5 96,1 ± 0,5

10 µg/ml

89,3 ± 0,6 96,1 ± 0,5

3 µg/ml

89,6 ± 0,4 96,0 ± 0,6

1 µg/ml

89,9 ± 1,7 95,5 ± 0,3

0,3 µg/ml

88,6 ± 1,2 89,9 ± 0,2

0,1 µg/ml

87,2 ± 1,2 76,1 ± 2,2

0,03 µg/ml

58,3 ± 1,5 41,6 ± 3,5

0,01 µg/ml

23,4 ± 3,4 18,0 ± 0,8

0,003 µg/ml

7,1* 11,1 ± 2,9

0,001 µg/ml

1,5* 10,6 ± 8,7

IgG 5C9

100 µg/ml

82,9 ± 1,0 35,3 ± 2,8

10 µg/ml

40,5 ± 0,3 40,9 ± 1,1

1 µg/ml

23,5 ± 2,9 19,7 ± 1,2

0,1 µg/ml

21,3* 16,2 ± 4,3

0,01 µg/ml

15,9* 4,1 ± 2,2

IgG TSMAb 1

100 µg/ml

61,1 ± 4,1 54,1 ± 4,1

10 µg/ml

48,1 ± 1,7 43,4 ± 1,1

1 µg/ml

29,3 ± 1,5 26,5 ± 0,5

0,1 µg/ml

11,0 ± 1,7 6,8 ± 1,7

0,01 µg/ml

2,6 ± 2,1 2,4*

IgG TSMAb 2

100 µg/ml

77,6 ± 7,7 48,0 ± 4,4

10 µg/ml

37,7 ± 2,6 39,0 ± 0,5

imagen23

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen24DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen25DT)

1 µg/ml

29,1 ± 2,5 33,6*

0,1 µg/ml

23,4 ± 2,7 15,9 ± 0,8

0,01 µg/ml

1,6 ± 1,5 0,7 ± 1,7

IgG TSMAb 3

100 µg/ml

81,1 ± 2,9 54,3 ± 3,3

10 µg/ml

58,1 ± 1,1 44,7 ± 2,8

1 µg/ml

35,2 ± 1,5 37,7 ± 0,7

0,1 µg/ml

30,7 ± 0,8 15,7 ± 4,9

0,01 µg/ml

9,0 ± 0,5 -2,5 ± 4,1

IgG TSMAb 4

100 µg/ml

57,2 ± 4,7 63,5 ± 5,6

10 µg/ml

40,8 ± 1,3 56,5 ± 1,2

1 µg/ml

39,8 ± 0,8 53,9 ± 2,3

0,1 µg/ml

42,8 ± 61,4 32,1 ± 3,3

0,01 µg/ml

33,3* 8,6 ± 7,2

IgG TSMAb 5

100 µg/ml

87,8 ± 1,0 61,9 ± 2,8

10 µg/ml

64,6 ± 1,1 56,9 ± 1,9

1 µg/ml

43,9 ± 1,1 53,8 ± 2,6

0,1 µg/ml

39,7 ± 0,9 38,6 ± 2,4

0,01 µg/ml

15,9 ± 9,4 7,5 ± 0,6

IgG TSMAb 6

100 µg/ml

68,6 ± 2,5 46,9 ± 2,6

10 µg/ml

32,8 ± 0,9 40,8 ± 2,3

1 µg/ml

28,9 ± 3,0 40,2 ± 0,9

0,1 µg/ml

24,6 ± 0,6 30,2 ± 1,3

0,01 µg/ml

9,5 ± 5,8 19,6 ± 0,6

IgG TSMAb 7

100 µg/ml

69,4 ± 3,4 45,9 ± 1,1

10 µg/ml

43,9 ± 0,6 42,0 ± 0,7

1 µg/ml

28,5 ± 4,8 37,7 ± 1,6

0,1 µg/ml

19,8 ± 1,5 19,9 ± 1,5

0,01 µg/ml

-3,1 ± 5,2 8,0 ± 2,1

IgG 9D33

100 µg/ml

75,6 ± 1,2 67,4 ± 4,6

10 µg/ml

58,7 ± 4,1 60,5 ± 2,6

imagen26

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen27DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen28DT)

1 µg/ml

50,9 ± 2,9 50,8 ± 2,2

0,1 µg/ml

48,3 ± 2,6 30,5 ± 2,7

0,01 µg/ml

15,8 ± 3,0 3,6 ± 3,3

IgG 5B3

100 µg/ml

22,4 ± 1,5 -3,9 ± 5,7

10 µg/ml

-5,7 ± 2,1 -1,9 ± 1,5

1 µg/ml

-1,7 ± 5,3 -4,9 ± 3,4

0,1 µg/ml

-5,0 ± 3,7 4,4 ± 2,5

0,01 µg/ml

-5,8* 2,6*

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinaciones por triplicado. *Media de determinaciones por duplicado. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. 5B3 es un MAb de ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). La unión de 125I-TSH en presencia de tampón de ensayo fue del 11 %. La unión de 125I-TSH en presencia de grupo de HBD fue del 11,5 %. El tampón de ensayo es NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8, Triton X-100 0,1 %.

Tabla 1b Inhibición de la unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por IgG K1-70 y Fab K1-70 y por diversos anticuerpos monoclonales de TSHR

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen29DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen30DT)

IgG K1-70

100 µg/ml

94,6 ± 0,2 95,9 ± 0,8

30 µg/ml

93,3 ± 0,4 94,9 ± 0,4

10 µg/ml

92,7 ± 0,8 93,9 ± 1,4

3 µg/ml

91,8 ± 0,5 94,1 ± 0,4

1 µg/ml

92,3 ± 0,4 91,9 ± 0,9

0,3 µg/ml

91,3 ± 1,1 83,5 ± 1,3

0,1 µg/ml

86,9 ± 1,1 50,0 ± 1,6

0,03 µg/ml

50,5 ± 2,0 13,5 ± 2,3

0,01 µg/ml

8,3 ± 2,8 -7,0 ± 1,9

0,003 µg/ml

-3,7 ± 1,6 0,8 ± 4,7

0,001 µg/ml

-6,1 ± 5,5 -3,0 ± 2,2

Fab K1-70

100 µg/ml

87,3 ± 0,9 93,3 ± 1,2

30 µg/ml

89,0 ± 0,1 92,5 ± 0,8

10 µg/ml

87,2 ± 0,9 91,2 ± 0,2

3 µg/ml

88,2 ± 0,4 91,6 ± 0,5

1 µg/ml

88,1 ± 0,7 91,8 ± 1,3

0,3 µg/ml

87,5 ± 0,3 88,1 ± 2,3

0,1 µg/ml

85,0 ± 0,4 71,6 ± 3,1

0,03 µg/ml

70,3 ± 0,6 40,7 ± 0,6

imagen31

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen32DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen33DT)

0,01 µg/ml

24,8 ± 1,3 18,9 ± 0,5

0,003 µg/ml

2,7 ± 2,8 *-1,7

0,001 µg/ml

-2,6 ± 3,5 7,2 ± 2,8

IgG M22

100 µg/ml

88,5 ± 0,9 96,2 ± 0,5

30 µg/ml

90,0 ± 2,4 94,3 ± 0,3

10 µg/ml

87,5 ± 1,4 93,4 ± 1,6

3 µg/ml

89,5 ± 2,5 94,6 ± 0,7

1 µg/ml

91,6 ± 0,8 92,6 ± 1,6

0,3 µg/ml

89,9 ± 0,6 82,2 ± 2,0

0,1 µg/ml

84,3 ± 0,9 62,1 ± 1,7

0,03 µg/ml

48,3 ± 0,9 31,4 ± 3,8

0,01 µg/ml

7,5 ± 1,1 -0,3 ± 5,5

0,003 µg/ml

-1,5 ± 5,5 -1,8 ± 4,0

0,001 µg/ml

-11,0 ± 0,7 1,2 ± 6,9

Fab M22

100 µg/ml

91,3 ± 0,1 94,4 ± 0,8

30 µg/ml

89,9 ± 3,1 93,5 ± 0,7

10 µg/ml

90,1 ± 1,6 93,9 ± 0,7

3 µg/ml

87,5 ± 1,2 93,4 ± 0,5

1 µg/ml

89,2 ± 0,4 92,5 ± 0,5

0,3 µg/ml

87,3 ± 0,7 90,0 ± 0,2

0,1 µg/ml

86,7 ± 0,5 77,1 ± 2,9

0,03 µg/ml

71,4 ± 1,4 35,3 ± 3,3

0,01 µg/ml

27,1 ± 2,7 8,7 ± 4,9

0,003 µg/ml

1,1 ± 6,8 -7,9 ± 0,3

0,001 µg/ml

-9,3 ± 2,1 -11,2 ± 1,9

IgG 5C9

100 µg/ml

92,5 ± 0,4 59,2 ± 5,3

10 µg/ml

76,7 ± 1,3 39,9 ± 5,6

1 µg/ml

38,7 ± 0,7 24,8 ± 0,8

0,1 µg/ml

24,4 ± 4,5 7,0 ± 2,4

0,01 µg/ml

8,3 ± 3,3 -5,5 ± 4,8

0,001 µg/ml

-11,2 ± 2,9 -8,0 ± 1,1

Véase leyenda de la Tabla 1a para detalles. La unión de 125I-TSH en presencia de tampón de ensayo fue del 13,4 %. La unión de 125I-TSH en presencia de grupos de HBD fue del 11,5 %.

imagen34

Tabla 2a Inhibición de la unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por suero de donante K1 e IgG y por IgG y Fab K1-18

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen35DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen36DT)

Dilución de suero de donante K1

1/10

94,7 ± 0,9 81,1 ± 0,4

1/20

89,3 ± 0,7 62,4 ± 3,5

1/40

67,0 ± 1,0 39,0 ± 0,9

1/80

34,0 ± 3,8 19,8 ± 1,9

1/160

13,1 ± 3,1 9,1 ± 0,8

1/320

6,6 ± 0,9 2,17 ± 1,5

IgG de suero de donante K1

1 µg/ml

89,6 ± 0,8 76,5 ± 1,5

0,5 µg/ml

79,4 ± 0,7 52,3 ± 0,7

0,25 µg/ml

52,1 ± 2,0 27,8 ± 0,4

0,125 µg/ml

29,5 ± 2,6 13,7 ± 1,3

IgG K1-18

100 µg/ml

93,7 ± 0,6 95,7 ± 0,6

30 µg/ml

93,3 ± 0,5 95,3 ± 0,0

10 µg/ml

93,3 ± 1,1 95,3 ± 0,4

3 µg/ml

94,2 ± 1,4 94,3 ± 0,6

1 µg/ml

93,3 ± 1,0 92,0 ± 0,4

0,3 µg/ml

90,9 ± 1,3 80,9 ± 2,2

0,1 µg/ml

78,0 ± 0,4 54,0 ± 2,4

0,03 µg/ml

38,8 ± 2,2 25,5 ± 3,2

0,01 µg/ml

14,6 ± 5,2 11,8 ± 6,1

0,003 µg/ml

0,2 ± 0,2 2,4 ± 4,2

0,001 µg/ml

0,5 ± 0,9 0,9 ± 1,5

Fab K1-18

100 µg/ml

88,9 ± 0,8 81,7 ± 1,6

30 µg/ml

85,6 ± 0,3 81,3 ± 1,4

10 µg/ml

82,9 ± 1,1 82,2 ± 0,9

3 µg/ml

79,3 ± 0,9 80,9 ± 2,1

1 µg/ml

77,0 ± 1,8 76,8 ± 1,6

0,3 µg/ml

72,4 ± 1,1 60,6 ± 1,3

0,1 µg/ml

56,2 ± 4,2 35,7 ± 3,3

0,03 µg/ml

25,6 ± 4,9 15,9 ± 4,6

0,01 µg/ml

7,4 ± 4,8 5,6 ± 7,3

imagen37

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen38DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen39DT)

0,003 µg/ml

2,4 ± 3,9 0,5 ± 0,86

Dilución de suero de donante K1

0,001 µg/ml

0,0 ± 0,0 2,1 ± 2,2

Véase leyenda de la Tabla 1a para detalles. La unión de 125I-TSH en presencia de tampón de ensayo fue del 10,8 %. La unión de 125I-TSH en presencia de grupo de HBD fue del 12,4 %.

Tabla 2b Inhibición de la unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por preparación de referencia de la OMS NIBSC 90/672 y por preparaciones de IgG y Fab K1-18

Muestra de ensayo

Muestras diluidas en suero Muestras diluidas en tampón de ensayo

Inhibición de la unión (%) (media ± DT)

unidades/l unidades/mg media de unidades/mg Inhibición de la unión (%) (media ± DT) unidades/l unidades/mg media de unidades/mg

NIBSC 90/672

0,125 unidades/l

0 0

0,25 unidades/l

0 0

0,5 unidades/l

5,6 ± 2,5 3,1 ± 1,6

1,0 unidades/l

8,1 ± 5,8 14,0 ± 2,6

2,0 unidades/l

18,2 ± 1,2 26,2 ± 4,2

4,0 unidades/l

34,8 ± 0,6 49,0 ± 4,3

8,0 unidades/l

65,3 ± 0,3 62,7 ± 0,2

40,0 unidades/l

90,9 ± 0,5 91,0 ± 0,6

IgG M22

0,3 ng/ml

0 0

1 ng/ml

0 4,5 ± 1,6

3 ng/ml

0 10,9 ± 3,5

10 ng/ml

13,0 ± 1,51 1,5 150 26,4 ± 0,1 2,5 250

30 ng/ml

37,6 ± 1,7 4,3 143 131 64,1 ± 3,2 8,6 287 266

100 ng/ml

70,4 ± 1,1 9,9 99 87,6 ± 0,6 26 260

300 ng/ml

87,9 ± 0,1 87,6 ± 0,5

NIBSC 90/672

1000 ng/ml

92,5 ± 0,5 91,2 ± 0,3

IgG K1-18

0,3 ng/ml

0 0,6 ± 1,9

imagen40

Muestra de ensayo

Muestras diluidas en suero Muestras diluidas en tampón de ensayo

Inhibición de la unión (%) (media ± DT)

unidades/l unidades/mg media de unidades/mg Inhibición de la unión (%) (media ± DT) unidades/l unidades/mg media de unidades/mg

1 ng/ml

0 4,5 ± 2,9

3 ng/ml

0 7,8 ± 2,1

10 ng/ml

6,4 ± 0,8 21,4 ± 1,8 1,52 152

30 ng/ml

24,7 ± 4,7 2,7 90 49,9 ± 4,2 5,3 177 181

100 ng/ml

60,2 ± 1,7 7 70 69 84,3 ± 0,9 21,5 215

300 ng/ml

79,9 ± 1,7 14,5 48 87,8 ± 1,1

1000 ng/ml

90,7 ± 0,8 90,1 ± 0,3

Fab K1-18

0,3 ng/ml

0 2,0 ± 0,9

1 ng/ml

0 5,7 ± 3,0

3 ng/ml

0 7,8 ± 5,4

10 ng/ml

2,6 ± 3,2 16,6 ± 1,9 1,2 120

30 ng/ml

17,1 ± 1,0 1,9 63 34,5 ± 1,1 3,12 104 86

100 ng/ml

41,0 ± 2,4 4,6 46 46 58,7 ± 0,7 7,1 71

300 ng/ml

66,6 ± 0,9 8,4 28 70,8 ± 2,5 15 50

1000 ng/ml

74,4 ± 4,3 75,7 ± 0,8

IgG 4B4

0,3 ng/ml

0 5,0 ± 3,5

3 ng/ml

0 0,8 ± 1,9

NIBSC 90/672

30 ng/ml

0 1,9 ± 0,8

300 ng/ml

0 0,7 ± 2,0

Fab 4B4

0,3 ng/ml

0 10,7 ± 3,9

3 ng/ml

0 8,9 ± 2,5

30 ng/ml

0 0

300 ng/ml

0 0,5 ± 0,5

Véase leyenda de la Tabla 1a para detalles. La unión de 125I-TSH en presencia de tampón de ensayo fue del 17,7 %. La unión de 125I-TSH en presencia de grupo de HBD fue del 16,0 %.

imagen41

Tabla 2c Inhibición de la unión de 121I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por IgG de suero del donante de linfocitos Tabla 3a Inhibición de la unión de TSH-biotina con pocillos de placas de ELISA recubiertos con TSHR por IgG K1-18 y diferentes anticuerpos monoclonales de TSHR

Muestras diluidas en suero

Muestras diluidas en tampón de ensayo

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) (media ± DT) unidades/l unidades/mg (o U/ml en suero no diluido) media de unidades/mg (o medio de unidades/ml) Inhibición de la unión (%) (media ± DT) unidades/l unidades/mg (o U/ml en suero no diluido) media de unidades/mg (o media de unidades/ml)

NIBSC 90/672

0,125 unidades/l

2,4 ± 0,7 5,1 ± 4,2

0,25 unidades/l

3,5 ± 2,0 0,9 ± 1,4

0,5 unidades/l

9,3 ± 2,7 2,8 ± 2,2

1 unidad/l

15,5 ± 1,7 14,1 ± 2,7

2 unidades/l

22,9 ± 6,4 27,2 ± 5,4

4 unidades/l

49,2 ± 1,2 53,3 ± 2,1

8 unidades/l

63,2 ± 1,1 62,2 ± 1,8

40 unidades/l

90,0 ± 0,1 90,9 ± 1,0

NIBSC 90/672 de suero del donante

diluido 160x

3,5 ± 1,9 5,3 ± 0,7

diluido 80x

10,4 ± 1,0 17,9 ± 2,9 1,25 (0,1)

diluido 40x

23,3 ± 2,6 2 (0,08) (0,075) 39,5 ± 1,3 2,8 (0,112) (0,144)

diluido 20x

39,7 ± 4,4 3,3 (0,07) 67,8 ± 1,6 11 (0,22)

IgG de suero del donante

0,01 mg/ml

0 5,1 ± 8,5

0,03 mg/ml

0,4 ± 2,7 4,4 ± 2,7

0,1 mg/ml

13,5 ± 1,6 0,8 0,008 19,8 ± 1,5 1,4 0,014

0,3 mg/ml

36,1 ± 3,0 3,0 0,010 0,011 60,6 ± 2,8 7 0,023 0,024

1 mg/ml

72,3 ± 1,2 13,5 0,014 87,2 ± 2,0 34 0,034

HBD

diluido 160x

0 0

diluido 80x

0 0

diluido 40x

0 0

diluido 20x

0 0

IgG HBD

imagen42

Muestras diluidas en suero

Muestras diluidas en tampón de ensayo

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) (media ± DT) unidades/l unidades/mg (o U/ml en suero no diluido) media de unidades/mg (o medio de unidades/ml) Inhibición de la unión (%) (media ± DT) unidades/l unidades/mg (o U/ml en suero no diluido) media de unidades/mg (o media de unidades/ml)

0,01 mg/ml

0 0

0,1 mg/ml

0 0

1 mg/ml

0 0

NIBSC 90/672

IgG K1-18

0,3 ng/ml

0 0

1 ng/ml

0 1,7 ± 4,4

3 ng/ml

0 12,9 ± 7,0

10 ng/ml

6,0 ± 1,3 20,5 ± 6,4 1,4 140

30 ng/ml

24,4 ± 1,8 2,1 70,0 48,1 ± 5,5 3,5 116,7 150,4

100 ng/ml

53,6 ± 0,6 5,0 50,0 63,3 79,7 ± 2,8 22,5 225

300 ng/ml

79,7 ± 0,6 21 70,0 88,5 ± 2,6 36 120

1000 ng/ml

91,3 ± 0,7 ± 5,3

IgG K1-70

0,3 ng/ml

0 0

1 ng/ml

0 0

3 ng/ml

1,0 ± 5,9 5,2 ± 4,0 0,56 186,7

10 ng/ml

14,9 ± 2,1 1,0 100 21,1 ± 2,1 1,45 145 166,1

30 ng/ml

36,4 ± 1,6 3,5 117 114 55,8 ± 0,6 5 166,7

100 ng/ml

71,9 ± 1,4 12,5 125 89,8 ± 0,7

300 ng/ml

89,4 ± 0,6 89,2 ± 0,6

1000 ng/ml

93,2 ± 0,7 90,7 ± 1,4

Véase leyenda de la Tabla 1a para detalles. La unión de 125I-TSH en presencia de tampón de ensayo fue del 12,6 %. La unión de 125I-TSH en presencia de grupo de HBD fue del 12,9 %.

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen43DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen44DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

96,9 ± 0,2 98,6 ± 0,1

30 µg/ml

96,7 ± 0,2 98,4 ± 0,1

10 µg/ml

96,2 ± 0,2 98,3 ± 0,1

3 µg/ml

96,6 ± 0,2 98,2 ± 0,1

1 µg/ml

96,6 ± 0,3 96,2 ± 0,2

0,3 µg/ml

93,8 ± 0,4 90,7 ± 0,3

0,1 µg/ml

76,3 ± 1,8 55,0 ± 0,2

imagen45

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen46DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen47DT)

0,03 µg/ml

33,8 ± 1,2 31,9 ± 0,2

0,01 µg/ml

12,9 ± 2,8 10,0 ± 0,8

0,003 µg/ml

1,6 ± 0,5 1,4 ± 2,1

0,001 µg/ml

-4,2 ± 0,9 -3,7 ± 1,1

IgG M22

100 µg/ml

96,8 ± 0,2 98,8 ± 0,1

30 µg/ml

97,0 ± 0,1 98,8 ± 0,1

10 µg/ml

97,0 ± 0,1 98,7 ± 0,1

3 µg/ml

97,1 ± 0,1 98,6 ± 0,1

1 µg/ml

97,0 ± 0,1 98,3 ± 0,0

0,3 µg/ml

96,0 ± 0,2 95,5 ± 0,1

0,1 µg/ml

88,3 ± 1,1 78,2 ± 0,7

0,03 µg/ml

35,2 ± 2,4 33,3 ± 2,0

0,01 µg/ml

14,9 ± 2,0 17,5 ± 2,0

0,003 µg/ml

9,2 ± 3,4 12,1 ± 4,7

0,001 µg/ml

0,4* 7,8 ± 5,1

IgG SC9

100 µg/ml

54,3 ± 1,3 37,1 ± 2,2

10 µg/ml

37,8 ± 2,1 37,4 ± 0,9

1 µg/ml

31,4 ± 1,9 28,5 ± 1,6

0,1 µg/ml

26,1 ± 3,2 10,4 ± 1,6

0,01 µg/ml

7,5 ± 0,9 -2,6 ± 2,3

IgG TSMAb 1

100 µg/ml

84,3 ± 0,8 82,6 ± 2,2

10 µg/ml

73,4 ± 2,8 74,6 ± 1,3

1 µg/ml

44,3 ± 1,2 47,9*

0,1 µg/ml

3,8 ± 5,9 21,2 ± 1,5

0,01 µg/ml

-6,3 ± 3,3 12,8 ± 2,9

IgG TSMAb 2

100 µg/ml

85,2 ± 0,3 78,6 ± 1,4

10 µg/ml

77,0 ± 0,7 75,1 ± 0,6

1 µg/ml

67,3 ± 1,5 65,0 ± 1,0

0,1 µg/ml

39,6 ± 0,8 29,1 ± 0,7

0,01 µg/ml

8,8 ± 0,4 7,5 ± 0,1

IgG TSMAb 3

I

100 µg/ml

82,6 ± 0,1 78,6 ± 1,4

imagen48

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen49DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen50DT)

10 µg/ml

77,0 ± 0,7 75,1 ± 0,6

1 µg/ml

67,3 ± 1,5 65,0 ± 1,0

0,1 µg/ml

39,6 ± 0,8 29,1 ± 0,7

0,01 µg/ml

8,8 ± 0,4 7,5 ± 0,1

IgG TSMAb 4

100 µg/ml

73,1 ± 1,8 81,0 ± 1,5

10 µg/ml

72,0 ± 0,5 79,6 ± 0,3

1 µg/ml

73,1 ± 1,3 73,3 ± 1,3

0,1 µg/ml

59,0 ± 1,7 50,1 ± 1,6

0,01 µg/ml

18,9 ± 0,7 14,8 ± 3,8

IgG TSMAb 5

100 µg/ml

89,9 ± 0,3 85,2 ± 0,1

10 µg/ml

85,8 ± 0,7 82,8 ± 0,4

1 µg/ml

79,0 ± 2,2 79,2 ± 0,7

0,1 µg/ml

60,9 ± 4,0 55,2 ± 0,9

0,01 µg/ml

19,1 ± 3,1 19,3 ± 0,4

IgG TSMAb 6

100 µg/ml

80,3 ± 1,0 77,8 ± 0,6

10 µg/ml

73,0 ± 0,6 75,6 ± 0,4

1 µg/ml

69,5 ± 2,5 73,6 ± 0,9

0,1 µg/ml

58,5 ± 3,1 54,7 ± 2,3

0,01 µg/ml

16,9 ± 3,1 19,2 ± 1,8

IgG TSMAb 7

100 µg/ml

83,1 ± 0,7 77,6 ± 0,5

10 µg/ml

75,3 ± 0,2 73,4 ± 0,8

1 µg/ml

62,8 ± 2,3 67,4 ± 1,9

0,1 µg/ml

38,2 ± 7,1 36,8 ± 3,4

0,01 µg/ml

14,1 ± 3,8 20,5 ± 1,7

IgG 9D33

IgG TSMAb 4

100 µg/ml

86,8 ± 0,3 84,0 ± 0,3

10 µg/ml

84,8 ± 0,2 83,2 ± 0,2

1 µg/ml

81,8 ± 0,1 76,0 ± 0,4

0,1 µg/ml

59,7 ± 0,5 39,0 ± 1,5

0,01 µg/ml

15,3 ± 0,9 10,1 ± 4,2

IgG 5B3

imagen51

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen52DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen53DT)

100 µg/ml

1,3 ± 1,9 -2,3 ± 2,2

10 µg/ml

-8,4 ± 2,3 -1,6 ± 3,3

1 µg/ml

-8,3 ± 3,8 -3,5 ± 0,5

0,1 µg/ml

-7,8 ± 10,0 -1,2 ± 4,3

0,01 µg/ml

-5,9 ± 4,4 -5,1 ± 3,3

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinación por triplicado. *Media de determinaciones por duplicado. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. 5B3 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). El tampón de ensayo es NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8, Triton X-100 0,1 %, BSA 1 g/ml.

Tabla 3b Inhibición de la unión de TSH-biotina con pocillos de placas de ELISA recubiertos con TSHR por IgG K1-18 y Fab K1-18 Tabla 3c Inhibición de la unión de TSH-biotina con pocillos de placas recubiertas con TSHR por IgG K1-18 (efecto de diferentes condiciones de ensayo) Tabla 3d Inhibición de la unión de TSH-biotina con pocillos de placa recubiertas con TSHR por IgG K1-70 y Fab K170

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen54DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen55DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

97,0 ± 0,2 98,1 ± 0,0

30 µg/ml

97,0 ± 0,1 97,9 ± 0,2

10 µg/ml

96,9 ± 0,1 97,9 ± 0,1

3 µg/ml

96,8 ± 0,2 97,9 ± 0,0

1 µg/ml

96,3 ± 0,1 96,8 ± 0,0

0,3 µg/ml

94,2 ± 0,1 87,8 ± 0,1

0,1 µg/ml

78,1 ± 0,3 61,8 ± 1,2

0,03 µg/ml

34,9 ± 0,3 26,3 ± 1,1

0,01 µg/ml

13,7 ± 0,4 8,2 ± 1,2

0,003 µg/ml

8,5 ± 1,1 3,0 ± 2,9

0,001 µg/ml

0,8 ± 2,6 -1,9 ± 0,1

Fab K1-18

100 µg/ml

93,8 ± 0,2 95,6 ± 0,1

30 µg/ml

93,6 ± 0,2 95,6 ± 0,1

10 µg/ml

93,3 ± 0,1 95,6 ± 0,3

3 µg/ml

92,9 ± 0,6 95,3 ± 0,2

1 µg/ml

91,2 ± 0,2 92,9 ± 0,4

0,3 µg/ml

85,1 ± 0,4 80,3 ± 0,2

0,1 µg/ml

61,7 ± 1,6 47,7 ± 0,7

IgG K1-18

0,03 µg/ml

28,9 ± 2,6 18,2 ± 1,6

0,01 µg/ml

10,5 ± 3,0 5,7*

0,003 µg/ml

5,1 ± 0,9 3,1 ± 4,7

0,001 µg/ml

-0,1 ± 2,3 0,3 ± 2,2

Fab M22

imagen56

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen57DT) Inhibición de la unión (%) de diluciones en HBD (media imagen58DT)

0,1 µg/ml

92,9 ± 0,3 89,7 ± 0,5

0,03 µg/ml

57,0 ± 1,5 49,9 ± 2,2

0,01 µg/ml

18,6 ± 3,0 16,3 ± 3,2

0,003 µg/ml

5,3 ± 1,8 5,4 ± 5,6

0,001 µg/ml

-0,1 ± 0,5 -1,4 ± 7,0

Véase leyenda de la Tabla 3a para detalles. Los resultados de MAb de control negativo (IgG 5B3) se muestran en la Tabla 3a.

Muestra ensayo

de % de Inhibición (media imagen59DT) de Diluciones en tampón de ensayo % de Inhibición (media imagen60DT) de Diluciones en HBD % de Inhibición (media imagen61DT) de Diluciones en tampón de ensayo + IgG 5B3 100 imagen62g/ml

IgG K1-18

100 µg/ml

96,9 ± 0,2 98,6 ± 0,1 96,7 ± 0,1

30 µg/ml

96,7 ± 0,2 98,4 ± 0,1 96,7 ± 0,2

10 µg/ml

96,2 ± 0,2 98,3 ± 0,1 96,6 ± 0,1

3 µg/ml

96,6 ± 0,2 98,2 ± 0,1 96,6 ± 0,1

1 µg/ml

96,6 ± 0,3 96,2 ± 0,2 96,4 ± 0,0

0,3 µg/ml

93,8 ± 0,4 90,7 ± 0,3 94,8 ± 0,1

0,1 µg/ml

76,3 ± 1,8 55,0 ± 0,2 82,8 ± 0,4

0,03 µg/ml

33,8 ± 1,2 31,9 ± 0,2 45,6 ± 1,1

0,01 µg/ml

12,9 ± 2,8 10,0 ± 0,8 17,6 ± 4,9

0,003 µg/ml

1,6 ± 0,5 1,4 ± 2,1 4,6 ± 1,3

0,001 µg/ml

-4,2 ± 0,9 -3,7 ± 1,1 -4,0 ± 5,2

IgG M22

100 µg/ml

96,8 ± 0,2 98,8 ± 0,1 97,2 ± 0,9

30 µg/ml

97,0 ± 0,1 98,8 ± 0,1 97,0 ± 0,1

10 µg/ml

97,0 ± 0,1 98,7 ± 0,1 97,0 ± 0,0

3 µg/ml

97,1 ± 0,1 98,6 ± 0,1 96,9 ± 0,0

1 µg/ml

97,0 ± 0,1 98,3 ± 0,0 96,8 ± 0,0

0,3 µg/ml

96,0 ± 0,2 95,5 ± 0,1 96,4 ± 0,0

0,1 µg/ml

88,3 ± 1,1 78,2 ± 0,7 91,2 ± 0,1

0,03 µg/ml

35,2 ± 2,4 33,3 ± 2,0 43,6 ± 3,4

0,01 µg/ml

14,9 ± 2,0 17,5 ± 2,0 12,9 ± 2,0

0,003 µg/ml

9,2 ± 3,4 12,1 ± 4,7 -0,5 ± 5,1

0,001 µg/ml

0,4* 7,8 ± 5,1 -7,7 ± 5,8

IgG 5C9

100 µg/ml

91,2 ± 0,8 48,6 ± 1,8 92,3 ± 0,3

10 µg/ml

58,2 ± 0,5 42,6 ± 4,6 63,9 ± 0,8

imagen63

Muestra de ensayo

% de Inhibición (media imagen64DT) de Diluciones en tampón de ensayo % de Inhibición (media imagen65DT) de Diluciones en HBD % de Inhibición (media imagen66DT) de Diluciones en tampón de ensayo + IgG 5B3 100 imagen67g/ml

1 µg/ml

42,9 ± 1,6 35,7 ± 4,0 46,7 ± 1,7

0,1 µg/ml

34,9 ± 4,0 21,6 ± 4,7 36,3 ± 2,0

0,01 µg/ml

16,1 ± 2,9 7,5 ± 5,4 20,7 ± 2,9

IgG 5B3

100 µg/ml

8,3 ± 2,4 10,9 ± 2,9 1,1 ± 3,6

10 µg/ml

0,9 ± 0,6 11,6 ± 3,3 -4,8 ± 1,8

1 µg/ml

-1,0 ± 0,2 8,0 ± 1,7 -4,8 ± 3,2

0,1 µg/ml

-2,0 ± 0,7 8,6 ± 1,9 -6,4 ± 2,6

Véase leyenda de la Tabla 3a para detalles.

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen68DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen69DT)

IgG K1-70

100 µg/ml

97,2 ± 0,2 98,2 ± 0,1

30 µg/ml

97,2 ± 0,1 98,2 ± 0,1

10 µg/ml

97,3 ± 0,1 97,9 ± 0

3 µg/ml

97,2 ± 0,2 97,8 ± 0,1

1 µg/ml

97,3 ± 0,1 97,4 ± 0,2

0,3 µg/ml

97,0 ± 0,1 93,8 ± 0,1

0,1 µg/ml

91,3 ± 0,8 74,1 ± 0,4

0,03 µg/ml

45,0 ± 3,1 35,0 ± 1,0

0,01 µg/ml

10,7 ± 0,7 13,6 ± 1,4

0,003 µg/ml

-1,7 ± 2,6 12,1 ± 2,8

0,001 µg/ml

-0,1 ± 3,9 3,5 ± 1,8

Fab K1-70

100 µg/ml

96,5 ± 0,2 97,3 ± 0,1

30 µg/ml

96,4 ± 0 97,4 ± 0,2

10 µg/ml

96,3 ± 0,1 97,3 ± 0

3 µg/ml

97,3 ± 0,2 97,3 ± 0,1

1 µg/ml

96,2 ± 0,1 96,9 ± 0,1

0,3 µg/ml

95,8 ± 0,1 95,8 ± 0,7

0,1 µg/ml

94,2 ± 0,6 88,3 ± 0,3

0,03 µg/ml

57,6 ± 1,2 55,5 ± 1,5

0,01 µg/ml

23,4 ± 3,1 18,2 ± 0,6

0,003 µg/ml

18,3 ± 0,6 9,2 ± 5,6

0,001 µg/ml

-3,2 ± 3,3 4,8 ± 4,7

imagen70

Véase leyenda de la Tabla 3a para detalles. Los resultados de MAb de control negativo (IgG 5B3) se muestran en la Tabla 3a.

Tabla 4a Inhibición de la unión de M22-peroxidasa con pocillos de placas de ELISA recubiertos con TSHR por IgG K1-18 y diferentes anticuerpos monoclonales de TSHR

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen71DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen72DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

98,4 ± 0,1 98,0 ± 0,1

30 µg/ml

98,2 ± 0,1 97,8 ± 0,1

10 µg/ml

98,2 ± 0,1 97,6 ± 0,2

3 µg/ml

98,1 ± 0,1 97,2 ± 0,1

1 µg/ml

97,2 ± 0,3 94,5 ± 0,0

0,3 µg/ml

92,1 ± 0,7 81,6 ± 0,5

0,1 µg/ml

73,9 ± 7,1 49,8 ± 0,6

0,03 µg/ml

29,9 ± 5,3 21,0 ± 1,3

0,01 µg/ml

9,1 ± 3,7 1,2 ± 4,6

0,003 µg/ml

-1,7 ± 4,0 0,4 ± 4,3

0,001 µg/ml

-5,2 ± 4,7 -0,0 ± 2,0

IgG M22

100 µg/ml

98,9 ± 0,1 98,6 ± 0,1

30 µg/ml

98,6 ± 0,1 98,4 ± 0,0

10 µg/ml

98,6 ± 0,1 98,4 ± 0,1

3 µg/ml

98,4 ± 0,1 98,0 ± 0,2

1 µg/ml

98,3 ± 0,0 97,4 ± 0,1

0,3 µg/ml

96,7 ± 0,3 93,2 ± 0,3

0,1 µg/ml

90,6 ± 0,9 79,4 ± 0,5

0,03 µg/ml

66,0 ± 2,1 51,0 ± 2,4

0,01 µg/ml

29,5 ± 0,9 22,7 ± 3,7

0,003 µg/ml

5,7 ± 1,4 8,8 ± 4,4

0,001 µg/ml

2,0 ± 4,1 2,6 ± 3,4

IgG 5C9

100 µg/ml

24,6 ± 1,3 19,6 ± 5,3

10 µg/ml

13,2 ± 2,6 13,0 ± 2,6

1 µg/ml

12,1 ± 2,1 7,8 ± 2,4

0,1 µg/ml

7,1 ± 0,9 6,3 ± 2,7

0,01 µg/ml

0,6 ± 3,6 0,9 ± 1,0

IgG TSMAb 1

100 µg/ml

74,0 ± 0,6 71,0 ± 1,2

10 µg/ml

68,6 ± 0,4 63,5 ± 1,9

imagen73

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen74DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen75DT)

1 µg/ml

39,0 ± 1,8 30,6 ± 3,8

0,1 µg/ml

8,8 ± 1,8 2,4 ± 3,4

0,01 µg/ml

4,3 ± 1,7 -6,3 ± 1,1

IgG TSMAb 2

100 µg/ml

63,1 ± 0,2 65,2 ± 3,9

10 µg/ml

58,3 ± 1,2 62,4 ± 1,2

1 µg/ml

52,8 ± 0,7 56,4 ± 3,9

0,1 µg/ml

29,5 ± 1,6 25,8 ± 2,8

0,01 µg/ml

5,6 ± 2,8 8,4 ± 3,8

IgG TSMAb 3

100 µg/ml

34,5 ± 0,5 42,7 ± 2,9

10 µg/ml

38,4 ± 1,5 40,7 ± 3,1

1 µg/ml

34,3 ± 1,5 29,8 ± 2,5

0,1 µg/ml

19,4 ± 1,6 16,7 ± 7,1

0,01 µg/ml

8,2 ± 1,3 3,8 ± 3,1

IgG TSMAb 4

100 µg/ml

56,6 ± 2,8 55,2 ± 3,1

10 µg/ml

56,0 ± 1,7 55,4 ± 1,8

1 µg/ml

55,6 ± 1,3 52,4 ± 1,3

0,1 µg/ml

40,2 ± 1,6 25,2 ± 0,7

0,01 µg/ml

13,7 ± 3,5 11,6 ± 5,0

IgG TSMAb 5

100 µg/ml

67,2 ± 1,2 63,7 ± 1,7

10 µg/ml

65,4 ± 1,0 63,6 ± 2,3

1 µg/ml

63,4 ± 1,0 59,2 ± 1,1

0,1 µg/ml

54,3 ± 2,8 37,1 ± 1,9

0,01 µg/ml

22,6 ± 1,3 9,1 ± 2,9

IgG TSMAb 6

100 µg/ml

62,9 ± 4,4 56,3 ± 2,0

10 µg/ml

55,8 ± 1,1 52,2 ± 1,5

1 µg/ml

54,7 ± 0,7 51,3 ± 1,1

0,1 µg/ml

40,7 ± 2,5 37,3 ± 5,7

0,01 µg/ml

11,6 ± 2,5 2,9 ± 1,6

IgG TSMAb 7

100 µg/ml

51,2 ± 1,0 46,8 ± 0,2

10 µg/ml

54,1 ± 4,4 46,1 ± 1,2

imagen76

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen77DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen78DT)

1 µg/ml

46,9 ± 1,1 44,9 ± 2,2

0,1 µg/ml

28,9 ± 2,9 28,3 ± 8,5

0,01 µg/ml

3,9 ± 1,5 1,4 ± 1,4

IgG 9D33

100 µg/ml

64,1 ± 1,7 65,9 ± 0,3

10 µg/ml

64,2 ± 1,7 66,7 ± 1,4

1 µg/ml

60,1 ± 0,9 57,8 ± 1,2

0,1 µg/ml

35,1 ± 2,0 24,1 ± 1,9

0,01 µg/ml

14,8 ± 3,5 6,2 ± 4,9

IgG 5B3

100 µg/ml

8,1 ± 0,9 3,8 ± 2,5

10 µg/ml

2,4 ± 1,2 4,9 ± 7,1

1 µg/ml

3,4 ± 1,7 9,7 ± 3,9

0,1 µg/ml

1,4 ± 1,9 3,0 ± 3,1

0,01 µg/ml

2,2 ± 6,1 4,3 ± 3,0

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinaciones por triplicado. *Media de determinaciones por duplicado. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. 5B3 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). El tampón de ensayo es NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8, Triton X-100 0,1 %, BSA 1 mg/ml.

Tabla 4b Inhibición de la unión de M22-peroxidasa con pocillos de placas de ELISA recubiertos con TSHR por preparaciones de IgG K1-18, Fab K1-18 y Fab M22 Tabla 4c Inhibición de la unión de M22-peroxidasa con pocillos de placas de ELISA recubiertos por TSHR por preparaciones de IgG K1-70 y Fab K1-70

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen79DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen80DT)

IgG K1-18

3 µg/ml

97,7 ± 0,1 96,7 ± 0,3

1 µg/ml

96,5 ± 0,4 93,2 ± 0,3

0,3 µg/ml

91,9 ± 0,8 82,2 ± 1,2

0,1 µg/ml

71,9 ± 0,6 45,3 ± 1,5

0,03 µg/ml

37,2 ± 2,6 24,4 ± 1,7

0,01 µg/ml

16,7 ± 0,9 4,7 ± 0,6

0,003 µg/ml

6,5* 2,6*

Fab K1-18

100 µg/ml

95,1 ± 0,8 93,4 ± 0,4

30 µg/ml

94,8 ± 0,1 92,6 ± 0,2

10 µg/ml

93,6 ± 0,4 92,0 ± 0,3

3 µg/ml

92,5 ± 0,1 91,7 ± 0,5

1 µg/ml

90,4 ± 0,1 87,5 ± 0,9

0,3 µg/ml

79,5 ± 0,1 70,4 ± 1,7

imagen81

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen82DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen83DT)

0,1 µg/ml

53,5 ± 0,3 47,3 ± 6,3

0,03 µg/ml

24,6 ± 3,4 14,5 ± 4,7

0,01 µg/ml

11,2 ± 1,9 11,7 ± 7

0,003 µg/ml

6,3 ± 1,1 4,9 ± 7,9

0,001 µg/ml

3,6* 2,4 ± 5,0

M22 Fab

3 µg/ml

97,5 ± 0,3 96,8 ± 0,3

1 µg/ml

97,2 ± 0,3 96,4 ± 0,2

0,3 µg/ml

96,9 ± 0,1 94,7 ± 0,3

0,1 µg/ml

93,9 ± 0,5 85,2 ± 0,3

0,03 µg/ml

80,0 ± 1,1 60,0 ± 4,9

0,01 µg/ml

44,7 ± 2,0 28,8 ± 1,1

0,003 µg/ml

17,4 ± 3,8 13,1 ± 3,1

0,001 µg/ml

5,0* 8,5*

Véase leyenda de la Tabla 4a para detalles. Los resultados del MAb de control negativo (IgG 5B3) se muestran en la Tabla 4a.

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen84DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen85DT)

IgG K1-70

100 µg/ml

98,5 ± 0,3 98,3 ± 0,2

30 µg/ml

98,2 ± 0,1 97,9 ± 0,1

10 µg/ml

97,9 ± 0,2 97,8 ± 0,1

3 µg/ml

98,1 ± 0,2 97,6 ± 0,1

1 µg/ml

98,1 ± 0,1 96,4 ± 0,2

0,3 µg/ml

97,3 ± 0,3 91,1 ± 0,3

0,1 µg/ml

93,0 ± 0,3 69,7 ± 0,7

0,03 µg/ml

71,8 ± 4,2 34,5 ± 3,8

0,01 µg/ml

28,0 ± 2,8 92 ± 2,6

0,003 µg/ml

6,4 ± 3,1 9,6*

0,001 µg/ml

-5,0 ± 2,7 0,8*

Fab K1-70

100 µg/ml

97,4 ± 0,1 97,4 ± 0,1

30 µg/ml

97,6 ± 0,05 97,5 ± 0,2

10 µg/ml

97,5 ± 0,1 97,1 ± 0,1

3 µg/ml

97,2 ± 0,2 96,5 ± 0,5

1 µg/ml

97,2 ± 0,1 96,1 ± 0,3

imagen86

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen87DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen88DT)

0,3 µg/ml

96,8 ± 0,2 94,4 ± 0,1

0,1 µg/ml

94,6 ± 0,2 86,0 ± 0,4

0,03 µg/ml

82,0 ± 0,7 58,8 ± 1,2

0,01 µg/ml

57,5 ± 3,7 27,9 ± 3,2

0,003 µg/ml

21,8 ± 3,9 8,2 ± 2,1

0,001 µg/ml

4,9 ± 0,4 -6,6 ± 1,9

IgG K1-18

1 µg/ml

96,3 ± 0,2 94,6 ± 0,2

0,1 µg/ml

71,9 ± 0,9 56,3 ± 1,1

0,03 µg/ml

35,7 ± 4,2 13,6 ± 0,8

0,01 µg/ml

8,9 ± 3,2 -4,0 ± 4,9

0,003 µg/ml

-1,9* -1,3 ± 2,9

Véase leyenda de la Tabla 4a para detalles. Los resultados del MAb de control negativo (IgG 5B3) se muestran en la Tabla 4a.

Tabla 5a Inhibición de la unión de 125I-IgG K1-18 con tubos recubiertos con TSHR por IgG K1-18, Fab K1-18, IgG K1-70 y otros MAb

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen89DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen90DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

94,0 ± 0,9 94,9 ± 0,2

30 µg/ml

93,2 ± 0,3 94,7 ± 0,2

10 µg/ml

92,4 ± 1,5 93,6 ± 0,9

3 µg/ml

93,0 ± 0,3 93,5 ± 0,8

1 µg/ml

92,6 ± 0,4 91,7 ± 0,8

0,3 µg/ml

91,0 ± 0,5 84,6 ± 0,5

0,1 µg/ml

82,9 ± 1,8 69,0 ± 0,5

0,03 µg/ml

52,7 ± 0,9 36,0 ± 1,8

0,01 µg/ml

19,4 ± 4,1 22,9 ± 2,4

0,003 µg/ml

9,2 ± 2,6 7,2 ± 3,5

0,001 µg/ml

1,9 ± 7,2 11,1 ± 4,4

IgG M22

100 µg/ml

94,5 ± 1,2 95,5 ± 0,9

30 µg/ml

93,3 ± 0,9 94,3 ± 1,2

10 µg/ml

93,3 ± 0,8 94,9 ± 0,7

3 µg/ml

93,4 ± 0,6 94,6 ± 0,1

1 µg/ml

92,3 ± 0,4 94,1 ± 0,4

0,3 µg/ml

92,2 ± 0,3 92,4 ± 0,6

0,1 µg/ml

87,1 ± 0,5 80,9 ± 0,3

imagen91

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen92DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen93DT)

0,03 µg/ml

53,3 ± 3,4 56,5 ± 1,7

0,01 µg/ml

18,3 ± 5,3 36,9 ± 5,4

0,003 µg/ml

5,1 ± 3,1 14,3 ± 3,4

0,001 µg/ml

-1,6 ± 3,8 11,0 ± 0,4

Fab M22

100 µg/ml

95,0 ± 0,6 94,1 ± 0,9

10 µg/ml

91,8 ± 0,8 92,6 ± 1,2

1 µg/ml

91,6 ± 0,8 92,8 ± 0,2

0,1 µg/ml

90,2 ± 0,1 87,4 ± 0,5

0,01 µg/ml

39,1 ± 2,8 48,0 ± 1,0

0,001 µg/ml

2,9 ± 2,8 9,3*

IgG K1-70

100 µg/ml

94,6 ± 1,2 95,2 ± 2,0

30 µg/ml

94,6 ± 0,6 95,2 ± 0,1

10 µg/ml

93,6 ± 0,8 94,5 ± 0,3

3 µg/ml

93,1 ± 1,0 94,6 ± 0,5

1 µg/ml

93,6 ± 1,4 93,1 ± 0,1

0,3 µg/ml

92,7 ± 0,5 88,6 ± 0,3

0,1 µg/ml

89,0 ± 1,9 87,1 ± 1,3

0,03 µg/ml

55,7 ± 1,4 58,6 ± 2,0

0,01 µg/ml

18,5 ± 4,1 48,7 ± 1,3

0,003 µg/ml

1,5 ± 2,9 17,5 ± 3,9

0,001 µg/ml

1,3 ± 4,1 10,7 ± 0,9

IgG 484

100 µg/ml

20,7 ± 2,7 -1,6 ± 2,3

10 µg/ml

5,1 ± 3,9 0,6 ± 3,0

1 µg/ml

4,5 ± 2,9 7,4 ± 5,4

0,1 µg/ml

-2,3 ± 2,0 1,8 ± 4,3

0,01 µg/ml

-3,5 ± 4,24 -0,8 ± 1,3

Fab 4B4

100 µg/ml

-6,3 ± 0,8 -0,2 ± 1,0

10 µg/ml

-4,9 ± 3,9 3,0 ± 1,5

IgG 5C9

100 µg/ml

91,3 ± 0,4 57,7 ± 2,4

10 µg/ml

65,9 ± 1,4 46,7 ± 0,6

1 µg/ml

48,0 ± 7,5 26,8*

imagen94

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen95DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen96DT)

0,1 µg/ml

33,4 ± 0,2 21,3 ± 6,4

0,01 µg/ml

11,7 ± 1,8 -1,8 ± 2,7

IgG TSMAb 1

100 µg/ml

56,1 ± 2,0 62,5 ± 4,0

10 µg/ml

46,0 ± 2,2 57,8 ± 1,5

1 µg/ml

41,0 ± 0,4 36,3 ± 1,0

0,1 µg/ml

17,6 ± 4,5 3,8 ± 3,8

0,01 µg/ml

3,6 ± 9,5 -6,9 ± 3,4

IgG TSMAb 2

100 µg/ml

72,8 ± 5,9 64,5 ± 7,3

10 µg/ml

48,2 ± 1,5 62,0 ± 2,6

1 µg/ml

43,2 ± 2,0 48,8 ± 2,8

0,1 µg/ml

37,1 ± 0,6 30,2 ± 3,2

0,01 µg/ml

7,6 ± 1,2 4,9 ± 2,0

IgG TSMAb 3

100 µg/ml

62,7 ± 1,2 64,8 ± 7,4

10 µg/ml

54,2 ± 0,4 55,6 ± 0,4

1 µg/ml

54,3 ± 1,3 46,1 ± 1,3

0,1 µg/ml

45,7 ± 5,1 24,0 ± 8,5

0,01 µg/ml

23,4 ± 3,8 -1,5 ± 2,0

IgG TSMAb 4

100 µg/ml

64,4 ± 2,0 81,6 ± 3,8

10 µg/ml

59,7 ± 0,4 75,7 ± 2,1

1 µg/ml

57,5 ± 1,5 70,5 ± 4,6

0,1 µg/ml

48,5 ± 0,7 39,2 ± 0,3

0,01 µg/ml

12,3 ± 2,9 5,1 ± 0,9

IgG TSMAb 5

100 µg/ml

71,9 ± 1,0 85,3 ± 3,4

10 µg/ml

67,7 ± 1,5 78,9 ± 1,6

1 µg/ml

60,5 ± 1,0 70,8 ± 1,1

0,1 µg/ml

52,7 ± 0,7 47,7 ± 1,8

0,01 µg/ml

14,4 ± 1,5 17,5 ± 9,9

IgG TSMAb 6

100 µg/ml

72,0 ± 1,6 71,3 ± 1,6

10 µg/ml

49,3 ± 0,6 60,5 ± 1,1

1 µg/ml

46,9 ± 1,1 57,0 ± 0,6

imagen97

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen98DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen99DT)

0,1 µg/ml

40,4 ± 2,4 38,6 ± 3,8

0,01 µg/ml

19,1 ± 2,4 9,6 ± 2,4

IgG TSMAb 7

100 µg/ml

68,7 ± 1,0 65,3 ± 4,1

10 µg/ml

53,4 ± 0,5 59,9 ± 1,3

1 µg/ml

41,0 ± 0,2 54,8 ± 2,3

0,1 µg/ml

29,4 ± 1,4 28,6 ± 1,0

0,01 µg/ml

4,3 ± 2,0 -1,0 ± 3,0

IgG 9D33

100 µg/ml

72,5 ± 0,8 68,7 ± 2,2

10 µg/ml

63,2 ± 0,8 68,1 ± 1,5

1 µg/ml

63,0 ± 0,9 62,1 ± 2,1

0,1 µg/ml

54,8 ± 1,4 33,8 ± 3,0

0,01 µg/ml

20,9 ± 0,7 5,3 ± 1,5

IgG 5B3

100 µg/ml

6,7 ± 2,1 29,4 ± 3,4

10 µg/ml

-2,7 ± 1,1 -0,1*

1 µg/ml

-3,8 ± 1,0 -6,2 ± 0,7

0,1 µg/ml

-4,8 ± 1,8 -7,8 ± 0,6

0,01 µg/ml

-4,2 ± 3,2 -8,1 ± 1,4

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinaciones por triplicado. *Media de determinaciones por duplicado. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. 4B4 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). 5B3 es un MAB humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). La unión de 125I-IgG K1-18 en presencia de tampón de ensayo fue del 13,6 %. La unión de 125I-IgG K1-18 en presencia del grupo de HBD fue del 13,8 %. El tampón de ensayo es NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8, Triton X-100 0,1 %.

Tabla 5b Inhibición de la unión de 125I-IgG K1-18 con tubos recubiertos con TSHR por preparaciones de IgG K1-18, Fab K1-18, IgG K1-70 y Fab K1-70

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen100DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen101DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

94,5 ± 0,8 96,1 ± 0,0

30 µg/ml

93,8 ± 1,2 95,6 ± 0,8

10 µg/ml

92,5 ± 1,4 94,0 ± 1,2

3 µg/ml

93,0 ± 0,5 94,0 ± 0,3

1 µg/ml

92,8 ± 1,0 91,1 ± 0,5

0,3 µg/ml

90,9 ± 0,5 78,3 ± 3,4

0,1 µg/ml

78,9 ± 2,9 49,4 ± 2,3

0,03 µg/ml

39,3 ± 1,6 15,1 ± 2,9

imagen102

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen103DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen104DT)

0,01 µg/ml

14,9 ± 2,1 5,8 ± 5,5

0,003 µg/ml

2,9 ± 5,4 -0,3 ± 2,5

0,001 µg/ml

6,9 ± 5,1 2,7 ± 1,8

Fab K1-18

100 µg/ml

86,2 ± 2,2 84,8 ± 0,9

30 µg/ml

83,0 ± 0,8 85,0 ± 0,8

10 µg/ml

81,8 ± 0,7 83,0 ± 1,7

3 µg/ml

81,9 ± 1,3 83,4 ± 1,1

1 µg/ml

77,5 ± 1,6 80,2 ± 1,1

0,3 µg/ml

71,1 ± 0,8 65,5 ± 1,5

0,1 µg/ml

56,7 ± 0,8 39,0 ± 2,3

0,03 µg/ml

24,8 ± 0,2 10,3 ± 2,2

0,01 µg/ml

8,8 ± 2,6 1,8 ± 2,0

0,003 µg/ml

0,8 ± 4,5 1,0 ± 1,6

0,001 µg/ml

-2,6 ± 5,2 -1,0 ± 3,4

IgG K1-70

100 µg/ml

94,5 ± 0,6 95,3 ± 0,1

30 µg/ml

93,1 ± 1,0 93,9 ± 1,9

10 µg/ml

91,9 ± 0,4 95,1 ± 0,3

3 µg/ml

92,9 ± 0,9 94,1 ± 0,6

1 µg/ml

92,0 ± 0,7 92,9 ± 0,4

0,3 µg/ml

91,5 ± 0,2 82,2 ± 0,6

0,1 µg/ml

89,2 ± 1,5 55,6 ± 1,2

0,03 µg/ml

45,6 ± 2,8 17,8 ± 2,1

0,01 µg/ml

6,8 ± 1,0 6,1 ± 4,2

0,003 µg/ml

0,1 ± 2,2 2,1 ± 3,4

0,001 µg/ml

-1,7 ± 2,2 -0,0 ± 2,3

Fab K1-70

100 µg/ml

93,3 ± 0,6 92,5 ± 0,3

30 µg/ml

92,2 ± 1,5 91,8 ± 2,1

10 µg/ml

92,4 ± 1,2 92,6 ± 0,4

3 µg/ml

91,1 ± 0,8 92,8 ± 1,1

1 µg/ml

91,0 ± 0,5 92,1 ± 0,2

0,3 µg/ml

89,6 ± 0,1 88,1 ± 1,1

0,1 µg/ml

87,6 ± 1,5 75,2 ± 1,1

0,03 µg/ml

68,8 ± 2,3 35,0 ± 3,5

imagen105

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen106DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen107DT)

0,01 µg/ml

25,6 ± 4,3 16,2 ± 1,2

0,003 µg/ml

4,1 ± 4,8 3,7 ± 2,6

0,001 µg/ml

-3,9 ± 0,8 -3,2 ± 4,0

Fab M22

1 µg/ml

90,5 ± 0,7 91,8 ± 0,4

0,3 µg/ml

87,7 ± 4,0 87,8 ± 1,8

0,01 µg/ml

90,2 ± 0,6 77,4 ± 1,7

0,03 µg/ml

77,0 ± 1,1 39,5 ± 0,7

0,01 µg/ml

29,1 ± 6,0 10,5 ± 2,9

0,003 µg/ml

1,9 ± 3,1 1,0 ± 0,5

0,001 µg/ml

-7,3 ± 3,5 3,8 ± 2,6

IgG 4B4

100 µg/ml

17,7 ± 1,8 -3,5 ± 2,2

10 µg/ml

-0,5 ± 2,1 0,6 ± 5,3

1 µg/ml

2,1 ± 1,5 -1,2 ± 1,5

Véase leyenda de la Tabla 5a para detalles. La unión de 125I-IgG K1-18 en presencia de tampón de ensayo fue del 19,1 %. La unión de 125I-IgG K1-18 en presencia del grupo de HBD fue del 15,3 %.

Tabla 5c Inhibición de la unión de 125I-IgG K1-18 con tubos recubiertos con TSHR por sueros de pacientes positivos para TRAb (estimulante y de bloqueo) y por K1 de suero de donante

Muestra de ensayo

% de inhibición de la unión de 125I-IgG K1-18 % de inhibición de la unión de 125I-TSH

G1

37,8 38,6

G2

43,1 31,5

G3

36,5 35,6

G4

44,1 47,1

G5

42,6 44,7

G6

54,5 52,1

G7

25,5 15,9

G8

48,2 41,8

G9

79,5 80,0

G10

63,1 68,7

G11

37,2 31,0

G12

37,2 29,7

G13

63,1 57,9

G14

56,4 49,3

G15

43,8 38,6

G16

44,0 42,9

G17

27,7 24,5

imagen108

Muestra de ensayo

% de inhibición de la unión de 125I-IgG K1-18 % de inhibición de la unión de 125I-TSH

G18

44,5 39,1

G19

23,2 20,6

G20

54,4 38,4

HBD 1

1,9 -12,6

HBD 2

-1,2 -4,2

HBD 3

7,7 -5,4

HBD 4

5,7 -11,8

HBD 5

14,7 -4,7

HBD 6

11,8 1,8

HBD 7

0,0 -13,7

HBD 8

1,5 -12,8

HBD 9

0,2 -11,0

HBD 10

1,1 -10,6

suero de donante K1

diluido 10x

59,3 67,2

diluido 20x

35,2 44,0

diluido 40x

14,2 24,8

diluido 80x

6,9 11,9

diluido 160x

5,1 2,7

diluido 320x

5,7 2,1

B1

diluido 5x

88,1 91,5

diluido 10x

77,6 83,9

diluido 20x

57,1 65,8

diluido 40x

35,5 39,6

diluido 80x

18,7 20,7

diluido 160x

11,6 7,5

diluido 320x

5,4 -2,5

B2

diluido 20x

90,3 93,5

diluido 40x

79,1 86,5

diluido 80x

58,7 68,7

diluido 160x

32,9 42,8

diluido 320x

32,6 20,4

diluido 640x

10,7 10,5

diluido 1280x

9,6 14,1

S1

imagen109

Muestra de ensayo

% de inhibición de la unión de 125I-IgG K1-18 % de inhibición de la unión de 125I-TSH

diluido 5x

80,6 82,0

diluido 10x

66,9 66,5

diluido 20x

52,0 47,1

diluido 40x

32,4 32,5

diluido 80x

13,6 17,4

diluido 160x

15,8 5,2

diluido 320x

10,2 2,3

S2

diluido 5x

58,0 55,1

diluido 10x

41,5 33,7

diluido 20x

27,9 18,4

diluido 40x

19,5 9,5

diluido 80x

10,6 7,7

diluido 160x

6,7 -0,7

G1-G20 son sueros de pacientes con enfermedad de Graves positiva para TRAb. HBD 1-10 son sueros individuales de donantes de sangre sanos. B1 y B2 son sueros de pacientes con TRAb de tipo bloqueo. S1 y S2 son sueros de pacientes con TRAb de tipo estimulante.

Tabla 5d Inhibición de la unión de 125I-Fab K1-18 con tubos recubiertos con TSHR por preparaciones de IgG K1-18, Fab K1-18 e IgG K1-70

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen110DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen111DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

94,8 ± 0,8 96,0 ± 0,8

30 µg/ml

94,5 ± 0,8 95,7 ± 1,2

10 µg/ml

94,8 ± 2,6 94,5 ± 1,6

3 µg/ml

93,7 ± 0,5 94,0 ± 0,2

1 µg/ml

93,3 ± 0,7 91,9 ± 0,7

0,3 µg/ml

91,1 ± 0,9 83,5 ± 1,9

0,1 µg/ml

78,5 ± 2,5 57,0 ± 2,8

0,3 µg/ml

22,0 ± 1,4 23,5 ± 2,1

0,01 µg/ml

8,6 ± 1,4 11,0 ± 2,7

0,003 µg/ml

1,4 ± 1,7 9,0 ± 2,5

0,001 µg/ml

-3,0 ± 6,1 9,4 ± 5,3

Fab K1-18

100 µg/ml

86,2 ± 3,3 84,8 ± 1,0

30 µg/ml

84,2 ± 2,6 82,6 ± 0,9

10 µg/ml

83,5 ± 3,0 81,6 ± 1,8

3 µg/ml

81,1 ± 0,1 82,8 ± 1,0

1 µg/ml

81,5 ± 3,8 79,2 ± 1,4

imagen112

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen113DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen114DT)

0,1 µg/ml

62,5 ± 0,9 43,9 ± 1,3

IgG M22

100 µg/ml

94,9 ± 0,3 95,9 ± 0,2

30 µg/ml

93,9 ± 2,0 95,2 ± 2,4

10 µg/ml

95,3 ± 1,1 95,5 ± 0,2

3 µg/ml

94,4 ± 0,7 95,1 ± 0,4

1 µg/ml

93,4 ± 0,5 93,6 ± 1,0

0,3 µg/ml

92,5 ± 0,5 87,1 ± 0,6

0,1 µg/ml

69,8 ± 2,0 61,5 ± 1,4

0,03 µg/ml

14,7 ± 3,2 23,8 ± 1,9

0,01 µg/ml

8,0 ± 10,2 10,9 ± 2,5

0,003 µg/ml

9,0 ± 10,3 10,8 ± 5,8

0,001 µg/ml

2,9 ± 2,4 2,9 ± 3,7

Fab M22

100 µg/ml

94,5 ± 0,4 94,5 ± 1,1

10 µg/ml

92,0 ± 2,1 92,8 ± 1,5

1 µg/ml

91,4 ± 0,5 92,8 ± 0,4

0,1 µg/ml

79,5 ± 1,2 84,5 ± 0,2

0,01 µg/ml

3,1 ± 3,3 20,4 ± 5,6

0,001 µg/ml

-0,7 ± 6,4 4,7 ± 3,9

IgG K1-70

100 µg/ml

94,8 ± 2,2 95,6 ± 1,8

30 µg/ml

95,1 ± 0,4 95,5 ± 0,6

10 µg/ml

94,6 ± 1,0 95,8 ± 0,4

3 µg/ml

94,5 ± 0,5 95,3 ± 0,3

1 µg/ml

94,0 ± 0,5 94,0 ± 0,2

0,3 µg/ml

93,4 ± 0,6 87,7 ± 0,9

0,1 µg/ml

73,8 ± 0,6 60,1 ± 2,8

0,03 µg/ml

24,1 ± 5,8 28,7 ± 1,5

0,01 µg/ml

4,8 ± 3,5 11,7 ± 4,6

0,003 µg/ml

2,2 ± 2,2 6,4 ± 2,2

0,001 µg/ml

-3,9 ± 4,3 4,7 ± 3,5

IgG 4B4

100 µg/ml

17,9 ± 3,9 2,7 ± 5,2

10 µg/ml

-1,35 ± 3,2 1,3 ± 0,7

1 µg/ml

-2,16 ± 0,6 5,5 ± 3,6

imagen115

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen116DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen117DT)

0,1 µg/ml

-4,5 ± 2,4 1,6 ± 1,7

0,01 µg/ml

-8,9 ± 1,3 1,9 ± 1,1

Fab 4B4

100 µg/ml

-7,8 ± 3,5 -0,8 ± 2,2

10 µg/ml

-8,5 ± 1,4 1,6 ± 2,8

IgG 5C9

100 µg/ml

85,2 ± 1,0 61,3 ± 1,6

10 µg/ml

63,8 ± 2,1 49,8 ± 1,6

1 µg/ml

52,5 ± 1,3 23,2 ± 1,9

0,1 µg/ml

27,7 ± 1,5 6,3 ± 0,4

0,01 µg/ml

3,0 ± 2,7 5,7 ± 8,8

IgG TSMAb 1

100 µg/ml

67,0 ± 2,0 76,8 ± 1,5

10 µg/ml

61,1 ± 3,1 67,7 ± 5,0

1 µg/ml

48,5 ± 0,8 43,4 ± 1,6

0,1 µg/ml

13,1 ± 2,0 12,8 ± 2,7

0,01 µg/ml

-0,1 ± 2,6 6,3 ± 2,7

IgG TSMAb 2

100 µg/ml

82,8 ± 1,8 83,9 ± 3,1

10 µg/ml

60,5 ± 2,5 77,1 ± 1,4

1 µg/ml

57,5 ± 0,9 63,1 ± 2,9

0,1 µg/ml

39,5 ± 1,4 32,1 ± 2,8

0,01 µg/ml

4,7 ± 4,2 6,5 ± 3,8

IgG TSMAb 3

100 µg/ml

76,5 ± 2,4 78,5 ± 4,1

10 µg/ml

68,6 ± 1,3 72,4 ± 1,1

1 µg/ml

66,0 ± 1,9 59,4 ± 1,8

0,1 µg/ml

41,3 ± 1,2 19,7 ± 3,9

0,01 µg/ml

5,5 ± 0,4 1,4 ± 3,9

IgG TSMAb 4

100 µg/ml

71,4 ± 1,5 82,7 ± 2,4

10 µg/ml

67,6 ± 0,6 80,5 ± 1,1

1 µg/ml

66,2 ± 0,2 70,3 ± 1,5

0,1 µg/ml

46,1 ± 0,6 31,1 ± 4,0

0,01 µg/ml

8,1 ± 2,1 2,5 ± 1,9

IgG TSMAb 5

imagen118

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen119DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen120DT)

100 µg/ml

87,3 ± 0,9 86,4 ± 2,7

10 µg/ml

79,8 ± 1,3 81,1 ± 2,1

1 µg/ml

69,9 ± 0,9 75,9 ± 1,4

0,1 µg/ml

50,0 ± 3,0 44,1 ± 0,6

0,01 µg/ml

4,2 ± 2,5 3,3 ± 4,5

IgG TSMAb 6

100 µg/ml

75,8 ± 2,5 77,5 ± 1,9

10 µg/ml

59,0 ± 0,7 75,4 ± 0,5

1 µg/ml

56,3 ± 4,0 70,0 ± 1,8

0,1 µg/ml

43,9 ± 0,8 40,2 ± 2,5

0,01 µg/ml

*5,6 7,1 ± 3,4

IgG TSMAb 7

100 µg/ml

78,0 ± 0,4 77,4 ± 1,3

10 µg/ml

61,8 ± 2,2 72,5 ± 2,9

1 µg/ml

51,1 ± 1,5 62,8 ± 1,0

0,1 µg/ml

30,2 ± 1,2 31,3 ± 1,5

0,01 µg/ml

2,0 ± 7,0 5,6 ± 0,8

IgG 9D33

100 µg/ml

81,5 ± 2,0 77,3 ± 2,2

10 µg/ml

69,5 ± 3,9 73,9 ± 0,9

1 µg/ml

66,5 ± 0,9 64,8 ± 0,7

0,1 µg/ml

48,6 ± 2,7 32,2 ± 1,1

0,01 µg/ml

7,9 ± 1,8 2,3 ± 3,0

IgG 5B3

100 µg/ml

6,3 ± 4,5 -1,1 ± 4,8

10 µg/ml

0,6 ± 3,9 -0,1 ± 0,8

1 µg/ml

-0,9 ± 1,7 -3,1 ± 3,5

0,1 µg/ml

-3,6 ± 2,5 -8,3 ± 2,0

0,01 µg/ml

-0,0 ± 2,3 -8,6 ± 1,3

Véase leyenda de la Tabla 5a para detalles. La unión de 125I-Fab K1-18 en presencia de tampón de ensayo fue del 10 %. La unión de 125I-Fab K1-18 en presencia de grupo de HBD fue del 9,4 %.

Tabla 6a Comparación de la estimulación de la producción de AMP cíclico por IgG K1-18, Fab K1-18 y Fab M22 en células CHO que expresan el TSHR Tabla 6b Estimulación de la producción de AMP cíclico por IgG K1-18, IgG M22 y pTSH en células CHO que expresan el TSHR Tabla 6c Estimulación de la producción de AMP cíclico por la preparación de referencia de NIBSC 90/672 y por preparaciones de IgG y Fab K1-18 en comparación con IgG M22 Tabla 6d Comparación de la estimulación de la producción de AMP cíclico por TSH porcina (p), humana nativa (h) y humana recombinante (rh) en células CHO que expresan el TSHR Tabla 6e Estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por pTSH, IgG M22 e IgG K1-18 mezclados entre sí en diferentes combinaciones Tabla 6f Estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por la preparación de referencia de NIBSC 90/672 y por IgG K1-18, suero de donante e IgG de suero de donante (experimento 1) Tabla 6g Estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por la preparación de referencia de NIBSC 90/672 y por IgG K1-18, suero de donante e IgG de suero de donante (experimento 2)

Muestra de ensayo

Estimulación de la producción de AMP cíclico en tampón isotónico (media de pmol/ml de AMP cíclico imagen121DT) Estimulación de la producción de AMP cíclico en tampón hipotónico (media de pmol/ml de AMP cíclico imagen122DT)

Tampón de AMP cíclico

0,88 ± 0,12 1,48 ± 0,13

imagen123

Muestra de ensayo

Estimulación de la producción de AMP cíclico en tampón isotónico (media de pmol/ml de AMP cíclico imagen124DT) Estimulación de la producción de AMP cíclico en tampón hipotónico (media de pmol/ml de AMP cíclico imagen125DT)

IgG K1-18

1000 ng/ml

51,16 ± 5,29 67,90 ± 10,44

100 ng/ml

22,95 ± 2,90 64,95 ± 9,61

30 ng/ml

9,63 ± 0,76 50,72 ± 3,69

10 ng/ml

4,81 ± 0,22 31,66 ± 5,06

3 ng/ml

1,61 ± 0,77 12,55 ± 1,75

1 ng/ml

1,56 ± 0,40 4,08 ± 0,28

0,3 ng/ml

1,14 ± 0,10 2,32 ± 0,47

0,1 ng/ml

1,29 ± 0,31 1,56 ± 0,32

0,03 ng/ml

0,95 ± 0,04 1,26 ± 0,30

Fab K1-18

1000 ng/ml

35,73 ± 2,25 66,94 ± 6,93

100 ng/ml

8,93 ± 0,18 * 53,22

30 ng/ml

2,97 ± 0,82 27,99 ± 6,25

10 ng/ml

1,65 ± 0,20 9,99 ± 3,52

3 ng/ml

1,14 ± 0,19 2,93 ± 0,17

1 ng/ml

0,79 ± 0,10 1,72 ± 0,82

0,3 ng/ml

0,71 ± 0,10 1,13 ± 0,24

0,1 ng/ml

0,84 ± 0,41 1,33 ± 0,53

0,03 ng/ml

0,50 ± 0,44 0,68 ± 0,18

Fab M22

10 ng/ml

34,71 ± 1,43 57,41 ± 5,05

3 ng/ml

16,30 ± 1,49 55,34 ± 7,49

1 ng/ml

9,14 ± 0,82 29,80 ± 0,97

0,3 ng/ml

2,19 ± 0,19 10,08 ± 0,95

0,1 ng/ml

1,38 ± 0,07 3,83 ± 0,30

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinaciones por triplicado. *Media de determinaciones por duplicado. Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico.

Muestra de ensayo

Concentración de producción de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen126DT)

Tampón de AMP

1,3 ± 0,2

IgG K1-18

300 ng/ml

63,3 ± 3,7

100 ng/ml

62,6 ± 2,7

30 ng/ml

38,4 ± 3,1

imagen127

Muestra de ensayo

Concentración de producción de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen128DT)

10 ng/ml

25,0 ± 1,0

3 ng/ml

8,3 ± 0,5

1 ng/ml

3,0 ± 1,0

0,3 ng/ml

1,7 ± 0,3

0,1 ng/ml

0,9 ± 0,2

0,03 ng/ml

1,0 ± 0,2

0,01 ng/ml

1,0 ± 0,2

IgG M22

100 ng/ml

64,6 ± 1,9

30 ng/ml

60,9 ± 3,5

10 ng/ml

50,3 ± 1,6

3 ng/ml

24,3 ± 2,3

1 ng/ml

8,1 ± 1,2

0,3 ng/ml

2,9 ± 0,9

pTSH

3 ng/ml

55,4 ± 7,3

1 ng/ml

51,7 ± 3,6

0,3 ng/ml

18,5 ± 1,5

0,1 ng/ml

7,2 ± 0,6

0,03 ng/ml

2,4 ± 0,7

0,01 ng/ml

1,4 ± 0,3

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen129DT) unidades/l unidades/mg media de unidades/mg

Tampón de AMP cíclico

1,36 ± 0,39

NIBSC 90/672

3 unidades/l

60,37 ± 3,73

1 unidad/l

27,43 ± 3,52

0,3 unidades/l

12,47 ± 0,23

0,1 unidades/l

5,00 ± 0,69

IgG K1-18

100 ng/ml

73,05 ± 3,43

30 ng/ml

63,68 ± 1,54

10 ng/ml

41,91 ± 3,97 1,85 185

3 ng/ml

16,87 ± 0,96 0,48 160 155

imagen130

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen131DT) unidades/l unidades/mg media de unidades/mg

1 ng/ml

5,36 ± 0,68 0,12 120

0,3 ng/ml

1,91 ± 0,45

Fab K1-18

100 ng/ml

51,38 ± 1,87 2,40 24

30 ng/ml

22,25 ± 0,81 0,70 23 22

10 ng/ml

8,34 ± 1,91 0,18 18

3 ng/ml

3,40 ± 0,52

1 ng/ml

1,91 ± 0,30

0,3 ng/ml

1,30 ± 0,32

IgG M22

10 ng/ml

58,88 ± 8,96 2,9 290

3 ng/ml

24,57 ± 6,55 0,8 267 286

1 ng/ml

12,01 ± 2,52 0,3 300

0,3 ng/ml

2,36 ± 0,29

IgG 4B4

10 ng/ml

1,00 ± 0,33

1 ng/ml

1,09 ± 0,22

Fab 4B4

10 ng/ml

0,89 ± 0,11

1 ng/ml

0,68*

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles. 4B4 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico hipotónico.

Muestra de ensayo

Cíclico en tampón isotónico (media de pmol/ml imagen132DT) Concentración de AMP cíclico en tampón hipotónico (media de pmol/ml imagen133DT)

Tampón de AMP cíclico

1,3 ± 0,5 2,0 ± 0,1

pTSH

20 ng/ml

73,9 ± 12,7 89,9 ± 10,1

3 ng/ml

46,6 ± 3,3 76,6 ± 0,0

2 ng/ml

49,5 ± 3,9 77,6 ± 9,2

1 ng/ml

37,8 ± 3,8 69,0 ± 1,4

0,3 ng/ml

14,3 ± 1,1 34,1 ± 2,8

0,1 ng/ml

4,0 ± 0,4 11,0 ± 0,6

0,03 ng/ml

2,0 ± 0,3 4,1 ± 0,3

0,01 ng/ml

1,4 ± 0,2 2,4 ± 0,2

hTSH nativa

250 ng/ml

57,9 ± 7,2 79,3 ± 1,0

imagen134

Muestra de ensayo

Cíclico en tampón isotónico (media de pmol/ml imagen135DT) Concentración de AMP cíclico en tampón hipotónico (media de pmol/ml imagen136DT)

100 ng/ml

41,6 ± 3,0 74,4 ± 0,9

50 ng/ml

29,0 ± 0,8 69,4 ± 11,7

25 ng/ml

19,9 ± 1,2 55,2 ± 2,7

10 ng/ml

9,6 ± 1,7 37,8 ± 2,0

2,5 ng/ml

3,7 ± 0,4 11,6 ± 0,2

1 ng/ml

2,0 ± 1,2 6,1 ± 0,6

rhTSH

250 ng/ml

46,2 ± 10,2 67,4 ± 4,6

100 ng/ml

35,4 ± 2,5 63,0 ± 7,9

50 ng/ml

24,5 ± 1,3 44,7 ± 4,3

25 ng/ml

14,4 ± 0,6 30,6 ± 1,4

10 ng/ml

6,2 ± 1,1 14,3 ± 1,2

2,5 ng/ml

2,1 ± 0,4 6,0 ± 1,9

1 ng/ml

1,4 ± 0,3 3,0 ± 0,3

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles. pTSH fue de RSR Ltd, Cardiff, CF23 8HE, RU. hTSH nativa fue una preparación de referencia de NIBSC 81/565. rhTSH fue una preparación de referencia de NIBSC 94/674.

Muestra de ensayo

AMP cíclico (pmol/ml; media imagen137DT)

Tampón de AMP cíclico

1,00 ± 0,72

IgG 5B3 10 ng/ml

1,58*

IgG 5B3 1 ng/ml

1,19*

IgG 5B3 0,1 ng/ml

1,53*

pTSH 0,1 ng/ml

11,01 ± 0,99

IgG M22 1 ng/ml

35,17 ± 6,38

pTSH 0,1 ng/ml + IgG M22 1 ng/ml

47,22 ± 3,89

pTSH 0,05 ng/ml

5,83*

IgG M22 0,5 ng/ml

20,20*

pTSH 0,05 ng/ml + IgG M22 0,5 ng/ml

25,99 ± 2,19

pTSH 0,1 ng/ml

11,01 ± 0,99

IgG K1-18 10 ng/ml

45,09 ± 6,15

pTSH 0,1 ng/ml + IgG K1-18 10 ng/ml

52,84 ± 6,76

pTSH 0,05 ng/ml

5,83*

IgG K1-18 5 ng/ml

29,95*

pTSH 0,05 ng/ml + IgG K1-18 5 ng/ml

29,87 ± 4,34

IgG K1-18 10 ng/ml

45,09 ± 6,15

IgG M221 ng/ml

35,17 ± 6,38

imagen138

Muestra de ensayo

AMP cíclico (pmol/ml; media imagen139DT)

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG M22 1 ng/ml

52,84 ± 6,76

IgG K1-18 5 ng/ml

29,95*

IgG M22 0,5 ng/ml

20,20*

IgG K1-18 5 ng/ml + IgG M22 0,5 ng/ml

44,01 ± 7,19

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles. 5B3 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). Las muestras del ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico hipotónico.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen140DT) unidades/l unidades/mg media de unidades/mg

Tampón de AMP cíclico

1,5 ± 0,3

NIBSC 90/672

3 unidades/l

37,6 ± 3,9

1 unidad/l

19,0 ± 1,4

0,3 unidades/l

6,8 ± 0,5

0,1 unidades/l

2,7 ± 0,3

IgG de donante K1

30 µg/ml

7,7 ± 1,0 0,45 0,013 0,013

10 µg/ml

3,3 ± 0,2

3 µg/ml

1,8 ± 0,3

suero de donante K1

diluido 10x

3,2 ± 0,4

diluido 30x

4,7 ± 0,1 0,29

diluido 100x

2,8 ± 0,0

diluido 300x

2,4 ± 0,3

suero de HBD

diluido 10x

1,8 ± 0,1

diluido 30x

1,7 ± 0,4

diluido 100x

1,4 ± 0,4

IgG de suero de HBD

30 µg/ml

1,2 ± 0,2

10 µg/ml

1,2 ± 0,2

3 µg/ml

2,1 ± 0,2

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles. HBD = suero de un donante de sangre sano (se aisló IgG de HBD del mismo suero). Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico hipotónico.

imagen141

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen142DT) unidades/l unidades/mg media de unidades/mg

Tampón de AMP cíclico

2,5*

NIBSC 90/672

3 unidades/l

64,6 ± 6,9

1 unidad/l

36,4 ± 4,6

0,3 unidades/l

10,2 ± 1,0

0,1 unidades/l

4,3 ± 0,5

IgG de donante K1

30 µg/ml

15,6 ± 0,7 0,42 0,014 0,014

10 µg/ml

* 5,7

3 µg/ml

2,2 ± 0,3

suero de donante K1

diluido 10x

6,9 ± 0,6

diluido 30x

9,5 ± 0,7 0,28

diluido 100x

6,6 ± 0,9

diluido 300x

3,9 ± 2,4

suero de HBD

diluido 10x

3,0 ± 0,7

diluido 30x

1,5 ± 1,5

diluido 100x

2,1 ± 0,3

IgG de suero de HBD

30 µg/ml

2,0 ± 0,2

10 µg/ml

2,1 ± 0,2

3 µg/ml

2,3 ± 0,9

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles. HBD = suero de un donante de sangre sano (se aisló IgG de HBD del mismo suero). Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico hipotónico.

Tabla 6h Inhibición de la actividad estimulante de TSHR de IgG K1-18 por MAb humanos IgG K1-70 y 5C9 con actividad antagonista de TSH

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen143DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,6 ± 0,2

IgG K1-70 100 µg/ml

1,1 ± 0,2

IgG 5B3 100 µg/ml

1,6 ± 0,5

IgG 5C9 100 µg/ml

1,0 ± 0,1

IgG K1-18 10 ng/ml

50,0 ± 3,3

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5B3 100 µg/ml

61,1 ± 5,9 0

imagen144

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen145DT) % de inhibición

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 100 µg/ml

1,3 ± 1,7 97

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 50 µg/ml

0,9 ± 1,5 98

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 10 µg/ml

0,1 ± 0,0 100

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 5 µg/ml

0,0 ± 0,0 100

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 1 µg/ml

0,1 ± 0,0 100

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 0,5 µg/ml

0,0 ± 0,0 100

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 0,1 µg/ml

3,8 ± 1,0 92

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 0,01 µg/ml

48,6 ± 1,7 3

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K170 0,001 µg/ml

52,1 ± 11,4 0

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 100 µg/ml

0,1 ± 0,0 100

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 50 µg/ml

0,1* 100

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 10 µg/ml

1,4 ± 1,5 97

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 5 µg/ml

1,5 ± 2,4 97

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 1 µg/ml

0,9 ± 1,4 98

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 0,5 µg/ml

0,3* 99

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 0,1 µg/ml

4,4 ± 1,5 91

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 0,01 µg/ml

51,8 ± 4,9 0

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 0,001 µg/ml

40,4 ± 7,0 19

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles. 5B3 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico hipotónico.

Tabla 6i Inhibición de la estimulación por IgG K1-18 de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por IgG K1-70 y 5C9 mezclados entre sí Tabla 6j Inhibición de la estimulación por IgG M22 de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por IgG K1-70 y 5C9 mezclados entre sí Tabla 6k Inhibición de la estimulación por IgG K1-18 de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por IgG K1-70 y 9D33 mezclados entre sí Tabla 6l Inhibición de la estimulación por IgG M22 de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por IgG K1-70 y 9D33 mezclados entre sí

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen146DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

0,89 ± 0,15

imagen147

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen148DT) % de inhibición

IgG K1-18 10 ng/ml

50,3 ± 4,97

IgG 5B3 100 µg/ml

1,20 ± 0,24

IgG 5C9 100 µg/ml

0,55 ± 0,14

IgG K1-70 100 µg/ml

0,89 ± 0,13

(IgG K1-70 + IgG 5C9)a 100 µg/ml

0,86 ± 0,17

K1-18 10 ng/ml + IgG 5B3 100 µg/ml

52,8 ± 0,21 0

K1-18 10 ng/ml + IgG 5B3 10 µg/ml

48,5 ± 2,16 3,5

K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 100 µg/ml

0,66 ± 0,25 98,7

K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 10 µg/ml

0,21 ± 0,18 99,6

K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 1 µg/ml

0,29 ± 0,25 99,4

K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 0,1 µg/ml

0,50 ± 0,62 99,0

K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 0,01 µg/ml

37,7 ± 1,75 25,0

K1-18 10 ng/ml + IgG 5C9 0,001 µg/ml

51,2 ± 2,6 0

K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 100 µg/ml

0,74 ± 0,12 98,5

K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 10 µg/ml

0,38 ± 0,19 99,2

K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 1 µg/ml

0,37 ± 0,15 99,3

K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 0,1 µg/ml

1,88 ± 0,06 96,3

K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 0,01 µg/ml

40,4 ± 3,19 19,6

K1-18 10 ng/ml + K1-70 0,001 µg/ml

49,74 ± 1,73 1,0

K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 100 µg/ml

0,57 ± 0,18 98,9

K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 10 µg/ml

0,59 ± 0,11 98,8

K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 1 µg/ml

0,39 ± 0,09 99,2

K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 0,1 µg/ml

1,37 ± 0,92 97,3

K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 0,01 µg/ml

34,15 ± 0,62 32,0

18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 0,001 µg/ml

37,4 ± 1,84 25,5

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles. 5B3 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). aSe muestra la concentración final total de la mezcla de IgG; es decir en el caso de (IgG K1-70 + IgG 5C9) 100 µg/ml la mezcla contiene IgG K1-70 50 µg/ml e IgG 5C9 50 µg/ml. En consecuencia, el efecto combinado de dos IgG a 100 µg/ml puede compararse con el efecto del IgG individual a la misma concentración (100 µg/ml). Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico hipotónico.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen149DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,8 ± 0,2

IgG M22 3 ng/ml

44,4 ± 7,1

IgG 5B3 100 µg/ml

2,3 ± 0,2

imagen150

Muestra de ensayo

Concentración de AMP (pmol/ml; media imagen151DT) cíclico % de inhibición

IgG 5C9 100 µg/ml

1,7 ± 0,2

IgG K1-70 100 µg/ml

1,8 ± 0,2

(IgG K1-70 + IgG 5C9)a 100 µg/ml

1,9 ± 0,2

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5B3 100 µg/ml

51,3 ± 1,2 0

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5B3 10 µg/ml

44,7 ± 4,3 0

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 100 µg/ml

1,3 ± 0,2 97,1

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 10 µg/ml

2,5 ± 1,6 94,4

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 1 µg/ml

1,3 ± 0,1 97,1

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 0,1 µg/ml

3,2 ± 0,5 92,8

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 0,01 µg/ml

33,2 ± 1,5 25,2

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 0,001 µg/ml

41,0 ± 1,9 7,7

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 100 µg/ml

1,4 ± 0,1 96,8

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 10 µg/ml

1,2 ± 0,1 97,3

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 1 µg/ml

1,5 ± 0,2 96,6

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,1 µg/ml

10,9 ± 3,7 75,5

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,01 µg/ml

38,4 ± 3,2 13,5

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,001 µg/ml

40,5 ± 1,3 8,8

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 100 µg/ml

1,7 ± 0,1 96,2

IgG M22 3 ng/ml +(IgG K1-70 + IgG 5C9)a 10 µg/ml

1,8 ± 0,2 95,9

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 1 µg/ml

1,4 ± 0,1 96,8

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 0,1 µg/ml

3,6 ± 0,4 91,9

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 0,01 µg/ml

39,1 ± 7,9 11,9

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 5C9)a 0,001 µg/ml

36,5 ± 2,8 17,8

Véase leyenda de la Tabla 6i para detalles.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen152DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,5 ± 0,05

IgG K1-18 10 ng/ml

37,0 ± 0,9

IgG 5B3 100 µg/ml

1,3 ± 0,1

IgG 9D33 100 µg/ml

2,0 ± 0,6

IgG K1-70 100 µg/ml

1,3 ± 0,1

(IgG K1-70 + IgG 9D33)a 100 µg/ml

1,3 ± 0,2

imagen153

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen154DT) % de inhibición

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5B3 100 µg/ml

41,9 ± 4,3 -13

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 5B3 10 µg/ml

35,4 ± 1,6 4

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 9D33 100 µg/ml

2,2 ± 0,7 94

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 9D33 10 µg/ml

1,9 ± 0,6 95

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 9D33 1 µg/ml

1,9 ± 0,2 95

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 9D33 0,1 µg/ml

5,3 ± 1,1 86

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 9D33 0,01 µg/ml

31,32 ± 3,3 15

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG 9D33 0,001 µg/ml

35,8 ± 2,3 3

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 100 µg/ml

1,4 ± 0,4 96

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 10 µg/ml

0,9 ± 0,1 98

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 1 µg/ml

1,1 ± 0,5 97

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 0,1 µg/ml

1,7 ± 0,8 95

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 0,01 µg/ml

27,7 ± 0,8 25

IgG K1-18 10 ng/ml + IgG K1-70 0,001 µg/ml

37,4 ± 1,3 -1

IgG K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 100 µg/ml

1,2 ± 0,1 97

IgG K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 10 µg/ml

0,9 ± 0,2 98

IgG K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 1 µg/ml

1,1 ± 0,1 97

IgG K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,1 µg/ml

1,7 ± 0,05 95

IgG K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,01 µg/ml

29,4 ± 0,6 20

IgG K1-18 10 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,001 µg/ml

35,2 ± 1,7 5

Véase leyenda de la Tabla 6i para detalles. aSe muestra la concentración total final de mezcla de IgG; es decir en el caso de (IgG K1-70 + IgG 9D33) 100 µg/ml la mezcla contiene IgG K1-70 50 µg/ml e IgG 9D33 50 ng/ml. En consecuencia, el efecto combinado de dos IgG a 100 µg/ml puede compararse con el efecto del IgG individual a la misma concentración (100 µg/ml).

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen155DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

0,52 ± 0,3

IgG M22 3 ng/ml

21,33 ± 1,3

IgG 5B3 100 µg/ml

1,10 ± 0,3

IgG 9D33 100 µg/ml

1,31 ± 0,4

IgG K1-70 100 µg/ml

0,47 ± 0,1

(IgG K1-70 + IgG 9D33)a 100 µg/ml

0,45 ± 0,02

imagen156

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen157DT) % de inhibición

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5B3 100 µg/ml

28,13 ± 3,9 0

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5B3 10 µg/ml

21,55 ± 1,2 0

IgG M22 3 ng/ml + IgG 9D33 100 µg/ml

1,01 ± 0,18 95

IgG M22 3 ng/ml + IgG 9D33 10 µg/ml

1,20 ± 0,1 94

IgG M22 3 ng/ml + IgG 9D33 1 µg/ml

1,48 ± 0,1 93

IgG M22 3 ng/ml + IgG 9D33 0,1 µg/ml

7,19 ± 1,6 66

IgG M22 3 ng/ml + IgG 9D33 0,01 µg/ml

21,00 ± 1,25 2

IgG M22 3 ng/ml + IgG 9D33 0,001 µg/ml

19,36 ± 7,3 9

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 100 µg/ml

0,77 ± 0,3 96

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 10 µg/ml

0,72 ± 0,3 97

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 1 µg/ml

0,82 ± 0,1 96

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,1 µg/ml

4,82 ± 0,7 77

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,01 µg/ml

18,67 ± 1,9 12

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,001 µg/ml

19,82 ± 0,3 7

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 100 µg/ml

0,77 ± 0,1 96

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 10 µg/ml

0,56 ± 0,4 97

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 1 µg/ml

0,90 ± 0,4 96

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,1 µg/ml

3,34 ± 2,4 84

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,01 µg/ml

18,20 ± 2,0 15

IgG M22 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,001 µg/ml

21,09 ± 0,6 1

Véase leyenda de la Tabla 6i para detalles. aSe muestra la concentración total final de mezcla de IgG; es decir en el caso de (IgG K1-70 + IgG 9D33) 100 µg/ml la mezcla contiene IgG K1-70 50 µg/ml e IgG 9D33 50 µg/ml. En consecuencia, el efecto combinado de dos IgG a 100 µg/ml puede compararse con el efecto del IgG individual a la misma concentración (100 µg/ml).

Tabla 6m Inhibición de la estimulación por pTSH de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por IgG K1-70 y 9D33 mezclados entre sí

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen158DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

6,04 ± 1,78

pTSH 3 ng/ml

70,82 ± 1,75

IgG 5B3 100 µg/ml

3,29 ± 0,18

IgG 9D33 100 µg/ml

1,58 ± 0,25

IgG K1-70 100 µg/ml

1,27 ± 0,17

(IgG K1-70 + IgG 9D33)a 100 µg/ml

0,41 ± 0,68

pTSH 3 ng/ml + IgG 5B3 100 µg/ml

65,74* 7

pTSH 3 ng/ml + IgG 5B3 10 µg/ml

65,97 ± 7,7 7

imagen159

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (pmol/ml; media imagen160DT) % de inhibición

pTSH 3 ng/ml + IgG 9D33 100 µg/ml

3,26 ± 0,17 95

pTSH 3 ng/ml + IgG 9D33 10 µg/ml

9,17 ± 1,46 87

pTSH 3 ng/ml + IgG 9D33 1 µg/ml

23,60 ± 1,33 67

pTSH 3 ng/ml + IgG 9D33 0,1 µg/ml

50,73 ± 5,03 28

pTSH 3 ng/ml + IgG 9D33 0,01 µg/ml

67,60 ± 7,15 5

pTSH 3 ng/ml + IgG 9D33 0,001 µg/ml

61,65 ± 6,60 13

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 100 µg/ml

1,46 ± 0,11 98

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 10 µg/ml

1,52 ± 0,25 98

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 1 µg/ml

1,70 ± 0,19 98

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 0,1 µg/ml

27,50 ± 3,26 61

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 0,01 µg/ml

74,70 ± 9,2 0

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 0,001 µg/ml

86,95 ± 4,38 0

pTSH 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 100 µg/ml

1,69 ± 0,12 98

pTSH 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 10 µg/ml

1,39 ± 0,08 98

pTSH 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 1 µg/ml

1,90 ± 0,13 97

3 ng/ml pTSH + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,1 µg/ml

16,30 ± 1,16 77

pTSH 3 ng/ml +(IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,01 µg/ml

61,50 ± 5,06 13

pTSH 3 ng/ml + (IgG K1-70 + IgG 9D33)a 0,001 µg/ml

72,11 ± 5,5 0

Véase leyenda de la Tabla 6i para detalles. aSe muestra la concentración total final de mezcla de IgG; es decir en el caso de (IgG K1-70 + IgG 9D33) 100 µg/ml la mezcla contiene IgG K1-70 50 µg/ml e IgG 9D33 50 ng/ml. En consecuencia, el efecto combinado de dos IgG a 100 µg/ml puede compararse con el efecto del IgG individual a la misma concentración (100 µg/ml).

Tabla 6n Efecto de suero de donante K1 y TRAb del suero con actividad de bloqueo en la actividad estimulante de TSH, IgG M22 e IgG K1-18

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen161DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

0,9 ± 0,2

pTSH 3 ng/ml

73,7 ± 6,0

IgG M22 3 ng/ml

42,0 ± 9,5

IgG K1-18 10 ng/ml

44,1 ± 3,3

control de HBD

0,5 ± 0,4

HBD + pTSH 3 ng/ml

99,4 ± 4,3 0

HBD + IgG M22 3 ng/ml

34,7 ± 3,9 0

HBD + IgG K1-18 10 ng/ml

22,0 ± 3,1 0

B1

2,0 ± 0,1

B1 + pTSH 3 ng/ml

32,0 ± 5,2 67,8

imagen162

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen163DT) % de inhibición

B1 + IgG M22 3 ng/ml

4,5 ± 1,3 87,0

B1 + IgG K1-18 10 ng/ml

3,8 ± 1,2 82,7

B2

1,0 ± 0,7

B2 + pTSH 3 ng/ml

1,7 ± 0,2 98,3

B2 + IgG M22 3 ng/ml

0,9 ± 0,1 97,4

B2 + IgG K1-18 10 ng/ml

0,6 ± 0,3 97,3

B3

0,4 ± 0,1

B3 + pTSH 3 ng/ml

9,3 ± 2,2 90,6

B3 + IgG M22 3 ng/ml

4,9 ± 0,7 85,9

B3 + IgG K1-18 10 ng/ml

6,1 ± 0,6 72,3

Donante K1

3,8 ± 1,5

K1 + pTSH 3 ng/ml

36,0 ± 3,7 63,8

K1 + IgG M22 3 ng/ml

6,9 ± 0,8 80,1

K1 + IgG K1-18 10 ng/ml

4,5 ± 0,2 79,5

Véase leyenda de la Tabla 6a para detalles. pTSH = TSH porcina. B1-B3 son sueros de pacientes con TRAb de tipo bloqueo. HBD = suero de donante de sangre sano. Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico hipotónico.

Tabla 7a Inhibición de la estimulación por TSH porcina (p) de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por IgG K1-70 e IgG 5C9 Tabla 7b Inhibición de la estimulación por TSH porcina (p) de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por preparaciones de IgG y Fab K1-70 Tabla 7c El efecto de MAb de bloqueo de TSHR humano y de ratón (K1-70, 5C9 y 9D33) en la actividad constitutiva (es decir actividad basal) del TSHR Tabla 7d Efecto del suero de donante K1 en la estimulación mediada por TSH del AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR Tabla 7e Efecto de IgG K1-70 en la estimulación de la producción de AMP cíclico por TSH porcina (p), humana (h) y humana recombinante (rh) en células CHO que expresan el TSHR

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen164DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico solamente

1,6 ± 0,3

pTSH 3 ng/ml

62,6 ± 3,9 0

IgG 5B3

100 µ g/ml + pTSH 3 ng/ml

66,7 ± 3,7 0

10 µ g/ml + pTSH 3 ng/ml

67,8 ± 3,7 0

IgG K1-70

3 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

1,7 ± 0,6 97,3

1 ng/ml + pTSH 3 ng/ml

2,0 ± 0,2 96,8

0,3 µ g/ml + pTSH 3 ng/ml

2,5 ± 0,9 96,0

0,1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

5,8 ± 2,8 90,7

0,075 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

11,6 ± 2,0 81,5

0,05 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

31,4 ± 1,9 49,8

0,025 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

50,5 ± 7,3 19,3

0,01 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

60,1 ± 1,6 4,0

0,003 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

59,5 ± 5,1 5,0

3 µg/ml + sin pTSH

0,8 ± 0,1

IgG 5C9

imagen165

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen166DT) % de inhibición

3 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

4,5 ± 1,5 92,8

1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

4,8 ± 0,7 92,3

0,3 µ g/ml + pTSH 3 ng/ml

7,8 ± 2,1 87,5

0,1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

11,4 ± 1,1 81,8

0,0075 + 3

14,7 ± 0,6 76,5

0,05 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

23,3 ± 2,9 62,8

0,025 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

46,3 ± 4,6 26,0

0,01 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

61,8 ± 4,8 1,0

0,003 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

56,1 ± 7,5 10,4

3 µg/ml + sin pTSH

0,9 ± 0,1

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinaciones por triplicado. 5B3 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico hipotónico.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico en medio hipotónico (media de pmol/ml imagen167DT) Concentración de AMP cíclico en medio isotónico (media de pmol/ml imagen168DT)

Tampón de AMP cíclico solamente

2,4 ± 0,4 0,7 ± 0,1

IgG 5B3 3 µg/ml

1,9 ± 0,3 0,5 ± 0,1

IgG K1-70 3 µg/ml

2,3 ± 0,9 0,5 ± 0,1

Fab K1-70 3 µg/ml

2,3 ± 0,8 0,8 ± 0,2

pTSH 3 ng/ml

65,2 ± 11,2 42,4 ± 1,1

IgG 5B3

3 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

75,7 ± 11,4 42,5 ± 2,8

1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

71,9 ± 14,3 39,5 ± 1,9

IgG K1-70

3 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

3,0 ± 1,2 1,1 ± 0,2

1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

4,0 ± 0,7 2,2 ± 0,2

0,3 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

4,5 ± 0,6 8,2 ± 0,4

0,1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

6,4 ± 0,9 27,0 ± 3,5

0,075 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

16,3 ± 1,3 33,3 ± 0,7

0,05 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

24,5 ± 5,2 36,5 ± 2,2

0,025 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

71,0 ± 4,5 38,1 ± 3,8

0,01 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

64,0 ± 9,9 45,0 ± 3,0

0,003 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

72,5 ± 16,2 40,8 ± 3,5

Fab K1-70

3 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

3,7 ± 0,3 1,8 ± 0,5

imagen169

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico en medio hipotónico (media de pmol/ml imagen170DT) Concentración de AMP cíclico en medio isotónico (media de pmol/ml imagen171DT)

1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

3,8 ± 0,2 2,1 ± 0,8

0,3 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

5,2 ± 1,0 5,6 ± 1,3

0,1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

12,9 ± 1,4 18,5 ± 2,1

0,075 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

14,1 ± 1,0 22,4 ± 0,4

0,05 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

28,9 ± 1,5 28,9 ± 1,1

0,025 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

59,9 ± 5,8 42,4 ± 1,1

0,01 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

58,8 ± 1,5 43,2 ± 4,0

0,003 µg/ml + pTSH 3 ng/ml

56,3 ± 6,0 41,2 ± 1,0

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen172DT) % de inhibición

Tampón de AMP solamente

18,7 ± 2,3 0

IgG K1-70

100 µg/ml

17,6 ± 1,6 6

10 µg/ml

17,3 ± 0,3 7

3 µg/ml

18,1 ± 0,7 3

1 µg/ml

16,8 ± 0,5 10

0,3 µg/ml

18,9 ± 1,2 0

0,1 µg/ml

19,6 ± 0,8 0

0,01 µg/ml

19,1 ± 2,6 0

0,001 µg/ml

20,3 ± 3,1 0

IgG 5C9

100 µg/ml

9,0 ± 1,0 52

10 µg/ml

8,3 ± 0,9 56

3 µg/ml

6,9 ± 0,8 63

1 µg/ml

7,4 ± 1,3 61

0,3 g/ml

9,3 ± 1,2 50

0,1 µg/ml

16,3 ± 0,9 13

0,01 µg/ml

18,6 ± 1,7 1

0,001 µg/ml

19,1 ± 0,8 0

IgG 9D33

100 µg/ml

38,0 ± 1,9 0

10 µg/ml

34,3 ± 1,4 0

3 µg/ml

32,3 ± 2,3 0

imagen173

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen174DT) % de inhibición

1 µg/ml

35,5 ± 4,3 0

0,3 µg/ml

26,4 ± 1,2 0

0,1 µg/ml

23,9 ± 2,7 0

0,01 µg/ml

20,3 ± 1,2 0

0,001 µg/ml

18,8 ± 2,1 0

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. Los experimentos se llevaron a cabo usando la línea celular CHO que expresa TSHR de tipo silvestre a aproximadamente 5 x 105 receptores por célula.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen175DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,7 ± 1,0

pTSH 1 ng/ml

61,7 ± 4,3

IgG K1-70 3 µg/ml

1,7 ± 0,1

1 ng/ml + IgG K1-70 3

3,6 ± 0,6 94,2

pTSH 1 ng/ml + IgG K1-70 1 µg/ml

3,9 ± 0,1 93,7

pTSH 1 ng/ml + IgG K1-70 0,3 µg/ml

3,3 ± 0,4 94,7

pTSH 1 ng/ml + IgG K1-70 0,1 µg/ml

20,0 ± 1,2 67,6

pTSH 1 ng/ml + IgG K1-70 0,03 µg/ml

52,2 ± 11,2 18,2

pTSH 1 ng/ml + IgG K1-70 0,01 µg/ml

67,7 ± 3,7 0

pTSH 1 ng/ml + IgG K1-70 0,003 µg/ml

72,4 ± 5,5 0

pTSH 1 ng/ml + IgG K1-70 0,001 µg/ml

58,7 ± 2,2 4,9

pTSH 1 ng/ml + IgG K1-70 0,0003 µg/ml

66,2 ± 1,7 0

IgG 5B3 100 µg/ml

2,6 ± 0,2

pTSH 1 ng/ml + IgG 5B3 100 µg/ml

79,3 ± 8,9 0

pTSH 1 ng/ml + IgG 5B3 10 µg/ml

80,7 ± 1,1 0

pTSH 1 ng/ml + suero de donante K1 diluido 10x

14,9 ± 1,2 75,9

pTSH 1 ng/ml+ suero de donante K1 diluido 20x

51,6 ± 2,6 16,4

pTSH 1 ng/ml+ suero de donante K1 diluido 40x pTSH 1 ng/ml+ suero de donante K1 diluido 80x pTSH 1 ng/ml+ suero de donante K1 diluido 160x

63,0 ± 3,4 0

64,4 ± 3,5

0

63,9 ± 3,6

0

suero de donante K1 diluido 10x

4,7 ± 0,3

pTSH 1 ng/ml + HBD diluido 10x pTSH 1 ng/ml + HBD diluido 20x

101,3 ± 5,1 0

88,6 ± 6,4

0

HBD diluido 10x

2,2 ± 1,0

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. pTSH = TSH porcina.

imagen176

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico en medio hipotónico (media de pmol/ml imagen177DT) Concentración de AMP cíclico en medio isotónico (media de pmol/ml imagen178DT)

Tampón de AMP cíclico

2,5 ± 0,5 1,1 ± 0,4

IgG 5B3 100 µg/ml

2,2 ± 0,6 1,4 ± 0,5

IgG K1-70 100 µg/ml

2,5 ± 0,5 1,1 ± 0,2

3 ng/ml

48,1 ± 0,9 41,1 ± 2,2

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 100 µg/ml

0,1 ± 0,0 1,3 ± 0,3

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 10 µg/ml

0,2 ± 0,1 1,2 ± 0,3

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 1 µg/ml

0,1* 2,0 ± 0,4

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 0,1 µg/ml

3,3 ± 2,8 24,4 ± 1,2

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 0,01 µg/ml

53,8 ± 3,4 39,7 ± 3,0

pTSH 3 ng/ml + IgG K1-70 0,001 µg/ml

44,9 ± 1,8 36,6 ± 5,8

hTSH 100

56,8 ± 0,1 42,3 ± 4,5

hTSH 100 ng/ml + IgG K170 100 µg/ml

0,1* 1,3 ± 0,3

hTSH 100 ng/ml + IgG K170 10 µg/ml

0,1 ± 0,0 1,0 ± 0,3

hTSH 100 ng/ml + IgG K170 1 µg/ml

0,2 ± 0,1 1,9 ± 0,2

100 ng/ml hTSH + IgG K170 0,1 µg/ml

0,1 ± 0,0 29,8 ± 1,5

hTSH 100 ng/ml + IgG K170 0,01 µg/ml

55,2* 37,9 ± 2,7

hTSH 100 ng/ml + IgG K170 0,001 µg/ml

55,0 ± 3,0 38,8 ± 2,8

rhTSH 100 ng/ml

37,8 ± 4,9 29,9 ± 2,3

rhTSH 100 ng/ml + IgG K170 100 µg/ml

0,3 ± 0,1 0,9 ± 0,1

rhTSH 100 ng/ml + IgG K170 10 µg/ml

0,2 ± 0,1 0,7 ± 0,2

rhTSH 100 ng/ml + IgG K170 1 µg/ml

0,3* 1,3 ± 0,6

rhTSH 100 ng/ml + IgG K170 0,1 µg/ml

0,3 ± 0,1 10,2 ± 0,9

rhTSH 100 ng/ml + IgG K170 0,01 µg/ml

27,3 ± 5,5 21,4 ± 1,0

imagen179

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico en medio hipotónico (media de pmol/ml imagen180DT) Concentración de AMP cíclico en medio isotónico (media de pmol/ml imagen181DT)

rhTSH 100 ng/ml + IgG K170 0,001 µg/ml

30,8 ± 1,4 23,0 ± 3,8

rhTSH 100 ng/ml + IgG K170 100 µg/ml

36,7 ± 3,4 28,1 ± 1,5

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. *Media de determinaciones por duplicado. Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de AMP cíclico.

Tabla 7f Efecto de IgG K1-70 en la estimulación mediada por IgG M22 de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen182DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,4 ± 0,4

IgG K1-70 100 µg/ml

1,1 ± 0,5

IgG 5B3 100 µg/ml

1,2 ± 0,5

IgG 5C9 100 µg/ml

0,5 ± 0,2

IgG M22 3 ng/ml

33,1 ± 1,8 0

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5B3 100 µg/ml

41,8 ± 5,3 0

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 100 µg/ml

0,6 ± 0,3 98,2

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 50 µg/ml

0,8 ± 0,4 97,6

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 10 µg/ml

0,6 ± 0,4 98,2

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 5 g/ml

0,1 ± 0,2 99,7

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 1 µg/ml

0,6 ± 0,2 98,2

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,5 µg/ml

0,5 ± 0,3 98,5

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,1 µg/ml

4,3 ± 2,4 87,0

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,01 µg/ml

33,0 ± 3,2 0

IgG M22 3 ng/ml + IgG K1-70 0,001 µg/ml

35,9 ± 3,2 0

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 100 µg/ml

0,4 ± 0,4 98,8

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 50 µg/ml

0,3 ± 0,1 99,1

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 10 µg/ml

0,3 ± 0,1 99,1

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 5 µg/ml

0,2 ± 0,2 99,4

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 1 µg/ml

0,8 ± 0,4 97,6

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 0,5 µg/ml

1,0 ± 0,1 97,0

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 0,1 µg/ml

2,9 ± 0,6 91,2

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 0,01 µg/ml

42,3 ± 7,1 0

imagen183

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen184DT) % de inhibición

IgG M22 3 ng/ml + IgG 5C9 0,001 µg/ml

39,3 ± 3,6 0

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. HBD = sueros de donantes de sangre sanos.

Tabla 7g Efecto de IgG K1-70 en la actividad estimulante de TSHR de sueros de pacientes positivos para TRAb (T1-T3)

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen185DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

2,0 ± 0,6

HBD

1,7 ± 0,2

HBD + IgG 5B3 100 µg/ml

2,0 ± 0,1

HBD + IgG K1-70 100 µg/ml

1,2 ± 0,1

HBD + IgG 5C9 100 µg/ml

0,9 ± 0,3

HBD + IgG 9D33 100 µg/ml

1,9 ± 0,1

suero T1

99,8 ± 6,1 0

Suero T1 + IgG 5B3 100 µg/ml

94,9 ± 14,2 4,9

Suero T1 + IgG K1-70 100 µg/ml

1,4 ± 0,3 98,6

Suero T1 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,3 ± 0,2 98,7

Suero T1 + IgG 9D33 100 µg/ml

4,6 ± 0,7 95,4

Suero T2

61,8 ± 6,3 0

Suero T2 + IgG 5B3 100 µg/ml

62,0 ± 14,6 0

Suero T2 + IgG K1-70 100 µg/ml

1,5 ± 0,1 97,6

Suero T2 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,1 ± 0,3 98,2

Suero T2 + IgG 9D33 100 µg/ml

2,0 ± 0,2 96,8

Suero T3

63,3 ± 9,7 0

Suero T3 + IgG 5B3 100 µg/ml

54,2 ± 3,8 14,4

Suero T3 + IgG K1-70 100 µg/ml

1,2 ± 0,3 98,1

Suero T3 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,4 ± 0,2 97,8

Suero T3 + IgG 9D33 100 µg/ml

3,7 ± 1,0 94,2

IgG 5B3 100 µg/ml

1,0 ± 0,4

IgG K1-70 100 µg/ml

0,8 ± 0,1

IgG 5C9 100 µg/ml

1,0 ± 0,5

IgG 9D33 100 µg/ml

2,1 ± 0,5

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. Los sueros se diluyeron hasta una concentración final de 1:10 en tampón de ensayo de AMP cíclico hipotónico.

Tabla 7h Efecto de IgG K1-70 en la actividad estimulante de TSHR de sueros de pacientes positivos para TRAb (T4-T6)

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de % de inhibición

pmol/ml imagen186 DT)

Tampón de AMP cíclico

1,9 ± 0,4

imagen187

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen188DT) % de inhibición

HBD

2,4 ± 0,1

HBD + IgG 5B3 100 µg/ml

3,0 ± 0,1

HBD + IgG K1-70 100 µg/ml

2,1 ± 0,2

HBD + IgG 5C9 100 µg/ml

1,8 ± 0,9

HBD + 9D33 100 µg/ml

3,9 ± 0,5

Suero T4

78,9 ± 8,2 0

Suero T4 + IgG 5B3 100 µg/ml

55,0 ± 14,0 30,3

Suero T4 + IgG K1-70 100 µg/ml

3,0 ± 0,4 96,2

Suero T4 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,9 ± 0,3 97,6

Suero T4 + 9D33 100 µg/ml

4,1 ± 1,1 94,8

Suero T5

66,6* 0

Suero T5 + IgG 5B3 100 µg/ml

66,7 ± 5,3 0

Suero T5 + IgG K1-70 100 µg/ml

1,6 ± 0,4 97,6

Suero T5 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,1 ± 0,2 98,3

Suero T5 + 9D33 100 µg/ml

2,9 ± 0,2 95,6

Suero T6

83,0 ± 6,9 0

Suero T6 + IgG 5B3 100 µg/ml

81,5 ± 20,5 1,8

Suero T6 + IgG K1-70 100 µg/ml

2,5 ± 0,1 97,0

Suero T6 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,8 ± 0,4 97,8

Suero T6 + 9D33 100 µg/ml

5,0 ± 1,0 94,0

IgG 5B3 100 µg/ml

2,6 ± 0,7

IgG K1-70 100 µg/ml

1,4 ± 0,5

IgG 5C9 100 µg/ml

1,2 ± 0,3

9D33 100 µg/ml

2,0 ± 0,6

Véase leyenda de la Tabla 7g para detalles. *Media de determinaciones por duplicado. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos.

Tabla 7i Efecto de IgG K1-70 en la actividad estimulante de TSHR de sueros de pacientes positivos para TRAb (T7-T9)

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen189DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

2,9 ± 1,1

HBD

3,1 ± 0,4

HBD + IgG 5B3 100 µg/ml

4,0 ± 0,4

HBD + IgG K1-70 100 µg/ml

2,7 ± 0,1

HBD + IgG 5C9 100 µg/ml

2,7 ± 1,4

HBD + IgG 9D33 100 µg/ml

5,4 ± 0,3

Suero T7

90,6*

Suero T7 + IgG 5B3 100 µg/ml

91,9 ± 29,6 0

Suero T7 + IgG K1-70 100 µg/ml

3,2 ± 0,4 96,5

imagen190

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen191DT) % de inhibición

Suero T7 + IgG 5C9 100 µg/ml

2,1 ± 0,5 97,7

Suero T7 + IgG 9D33 100 µg/ml

6,3 ± 1,2 93,0

Suero T8

85,6* 0

Suero T8 + IgG 5B3 100 µg/ml

76,3 ± 10,7 10,9

Suero T8 + IgG K1-70 100 µg/ml

3,2 ± 0,5 96,3

Suero T8 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,8 ± 0,3 97,9

Suero T8 + IgG 9D33 100 µg/ml

4,3 ± 0,6 95,0

Suero T9

56,4 ± 0,0 0

Suero T9 + IgG 5B3 100 µg/ml

53,2* 0

Suero T9 + IgG K1-70 100 µg/ml

5,2 ± 0,5 90,8

Suero T9 + 5C9 100

3,0 ± 0,4 94,7

Suero T9 + IgG 9D33 100 µg/ml

7,2 ± 1,1 87,2

IgG 5B3 100 µg/ml

2,7 ± 0,3

IgG K1-70 100 µg/ml

1,6 ± 0,4

IgG 5C9 100 µg/ml

1,0 ± 0,5

IgG 9D33 100 µg/ml

2,4 ± 0,4

Véase leyenda de la Tabla 7 g para detalles. *Media de determinaciones por duplicado. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos.

Tabla 7j Efecto de IgG K1-70 en la actividad estimulante de TSHR de sueros de pacientes positivos para TRAb (T10-T12) Tabla 7k Efecto de IgG K1-70 en la actividad estimulante de TSHR de sueros de pacientes positivos para TRAb (T13-T15) Tabla 7l Efecto en la actividad estimulante de suero T5 de diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales de bloqueo de TSHR (K1-70, 5C9, 9D33)

Muestra de ensayo

Concentración pmol/ml imagen192DT) de AMP cíclico (media de % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,8 ± 0,2

HBD

2,2 ± 0,2

HBD + IgG 5B3 100 µg/ml

2,4 ± 0,4

HBD + IgG K1-70 100 µg/ml

1,7 ± 0,0

HBD + IgG 5C9 100 µg/ml

1,1 ± 0,3

HBD + IgG 9D33 100 µg/ml

3,2 ± 0,6

Suero T10

56,3 ± 5,2 0

Suero T10 + IgG 5B3 100 µg/ml

59,3 ± 7,1 0

Suero T10 + IgG K1-70 100 µg/ml

1,8 ± 0,2 96,8

Suero T10 + IgG 5C9 100 µg/ml

0,9 ± 0,1 98,4

Suero T10 + IgG 9D33 100 µg/ml

2,6 ± 0,3 95,4

Suero T11

41,0 ± 4,5 0

Suero T11 + IgG 5B3 100 µg/ml

39,7 ± 1,8 3,2

Suero T11 + IgG K1-70 100 µg/ml

2,0 ± 0,2 95,1

Suero T11 + IgG 5C9 100 µg/ml

37,5 ± 3,9 8,5

Suero T11 + IgG 9D33 100 µg/ml

5,3 ± 1,6 87,1

imagen193

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen194DT) % de inhibición

Suero T12

43,2 ± 3,1 0

Suero T12 + IgG 5B3 100 µg/ml

43,3 ± 4,0 0

Suero T12 + IgG K1-70 100 µg/ml

1,8 ± 0,0 95,8

Suero T12 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,6 ± 0,7 96,3

Suero T12 + IgG 9D33 100 µg/ml

3,6 ± 0,1 91,7

IgG 5B3 100 µg/ml

2,0 ± 0,4

IgG K1-70 100 µg/ml

1,1 ± 0,1

IgG 5C9 100 µg/ml

0,9 ± 0,1

IgG 9D33 100 µg/ml

1,9 ± 0,4

Véase leyenda de la Tabla 7 g para detalles. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen195DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,6 ± 0,2

HBD

2,2 ± 0,4

HBD + IgG 5B3 100 µg/ml

5,1 ± 1,2

HBD + IgG K1-70 100 µg/ml

2,1 ± 0,8

HBD + IgG 5C9 100 µg/ml

1,0 ± 0,2

HBD + IgG 9D33 100 µg/ml

3,3 ± 0,3

Suero T13

48,5 ± 3,8 0

Suero T13 + IgG 5B3 100 µg/ml

37,6 ± 3,4 22,5

Suero T13 + IgG K1-70 100 µg/ml

2,1 ± 0,3 95,7

Suero T13 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,2 ± 0,3 97,5

Suero T13 + IgG 9D33 100 µg/ml

3,8 ± 0,3 92,2

Suero T14

27,2 ± 3,6 0

Suero T14 + IgG 5B3 100 µg/ml

20,5 ± 2,3 24,6

Suero T14 + IgG K1-70 100 µg/ml

1,9 ± 0,4

Suero T14 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,4 ± 0,5 94,9

Suero T14 + IgG 9D33 100 µg/ml

2,8 ± 0,3 89,7

Suero T15

51,3* 0

Suero T15 + IgG 5B3 100 µg/ml

41,9 ± 4,0 18,3

Suero T15 + IgG K1-70 100 µg/ml

2,7 ± 0,1 94,7

Suero T15 + IgG 5C9 100 µg/ml

1,6 ± 0,3 96,9

Suero T15 + IgG 9D33 100 µg/ml

3,9 ± 0,2 92,4

IgG 5B3 100 µg/ml

4,1 ± 0,9

IgG K1-70 100 µg/ml

2,6 ± 1,5

imagen196

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen197DT) % de inhibición

IgG 5C9 100 µg/ml

0,9 ± 0,2

IgG 9D33 100 µg/ml

2,3 ± 0,2

Véase leyenda de la Tabla 7g para detalles. *Media de determinaciones por duplicado. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos.

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen198DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,4 ± 0,5

HBD diluido 10x

2,8 ± 0,7

Suero T5 diluido 10x

63,9 ± 5,9

IgG 5B3 (control negativo)

100 µg/ml

1,1 ± 0,5

100 µg/ml + T5

55,9 ± 5,5 12,5

10 µg/ml + T5

61,9 ± 2,6 3,1

1 µg/ml + T5

61,3 ± 5,5 4,1

0,1 µg/ml + T5

59,4* 7,0

IgG K1-70

100 µg/ml

1,0 ± 0,3

100 µg/ml + T5

1,4 ± 0,6 97,8

10 µg/ml + T5

0,9 ± 0,1 98,6

1 µg/ml + T5

1,4 ± 0,1 97,8

0,1 µg/ml + T5

8,3 ± 1,1 87,0

0,01 µg/ml + T5

52,4 ± 4,8 18,0

IgG 5C9

100 µg/ml

1,1 ± 0,3

100 µg/ml + T5

0,7 ± 0,1 98,9

10 µg/ml + T5

0,7 ± 0,0 98,9

1 µg/ml + T5

1,4 ± 0,5 97,8

0,1 µg/ml + T5

5,6 ± 0,3 91,2

0,01 µg/ml + T5

52,9 ± 2,0 17,2

IgG 9D33

100 µg/ml

2,4 ± 0,2

100 µg/ml + T5

3,0 ± 0,2 95,3

10 µg/ml + T5

2,3 ± 0,2 96,4

1 µg/ml + T5

4,1 ± 0,3 93,6

0,1 µg/ml + T5

28,3 ± 0,8 55,7

0,01 µg/ml + T5

49,2 ± 3,5 23,0

imagen199

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. T5 = Suero positivo para TRAb con actividad estimulante del tiroides; el suero T5 se diluyó hasta una concentración final de 1:10 en tampón de AMP cíclico hipotónico. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos.

Tabla 7m Efecto en la actividad estimulante de suero T8 de diferentes concentraciones de anticuerpos

monoclonales de bloqueo de TSHR (K1-70, 5C9, 9D33) Tabla 7n Efecto en la actividad estimulante de suero T11 de diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales de bloqueo de TSHR (K1-70, 5C9, 9D33) Tabla 7o Inhibición de la estimulación por TSH porcina (p) de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR por K1-70 y 5C9 mezclados entre sí

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen200DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,7 ± 0,2

HBD diluido 10x

2,5 ± 1,0

Suero T8 diluido 10x

52,3 ± 10,5

IgG 5B3

100 µg/ml

2,1 ± 0,5

100 µg/ml + T8

50,5 ± 3,1 3

10 µg/ml + T8

56,0 ± 14,7 0

1 µg/ml + T8

51,4 ± 2,7 2

0,1 µg/ml + T8

50,7 ± 10,2 3

IgG K1-70

100 µg/ml

1,8 ± 0,2

100 µg/ml + T8

2,4 ± 0,3 95

10 µg/ml + T8

2,1 ± 0,7 96

1 µg/ml + T8

2,5 ± 0,2 95

0,1 µg/ml + T8

5,8 ± 0,3 89

0,01 µg/ml + T8

63,4 ± 8,0 0

IgG 5C9

100 µg/ml

1,2 ± 0,2

100 µg/ml + T8

1,7 ± 0,8 97

10 µg/ml + T8

1,7 ± 0,2 97

1 µg/ml + T8

2,2 ± 0,3 96

0,1 µg/ml + T8

4,6 ± 0,5 91

0,01 µg/ml + T8

53,7 ± 7,1 0

IgG 9D33

100 µg/ml

2,4 ± 0,5

100 µg/ml + T8

3,6 ± 0,8 93

10 µg/ml + T8

3,7 ± 0,5 93

1 µg/ml + T8

4,7 ± 0,2 91

0,1 µg/ml + T8

22,9 ± 0,4 56

0,01 µg/ml + T8

45,8 ± 4,9 12

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. T8 = Suero positivo para TRAb con actividad estimulante del receptor de TSH; el suero T8 se diluyó hasta una concentración final de 1:10 en tampón de AMP cíclico hipotónico. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos.

imagen201

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen202DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

1,2 ± 0,4

HBD diluido 10x

1,8 ± 0,4

Suero T11 diluido 10x

25,2 ± 4,4

IgG 5B3

100 µg/ml

1,0 ± 0,2

100 µg/ml + T11

18,4 ± 1,3 27,0

10 µg/ml + T11

18,8 ± 1,3 25,4

1 µg/ml + T11

19,8 ± 1,2 21,4

0,1 µg/ml + T11

17,7 ± 2,1 29,8

IgG K1-70

100 µg/ml

0,9 ± 0,2

100 µg/ml + T11

1,0 ± 0,3 96,0

10 µg/ml + T11

1,1 ± 0,1 95,6

1 µg/ml + T11

1,1 ± 0,1 95,6

0,1 µg/ml + T11

2,4 ± 0,3 90,5

0,01 µg/ml + T11

22,1 ± 0,8 12,3

IgG 5C9

100 µg/ml

0,9 ± 0,1

100 µg/ml + T11

22,4 ± 1,9 11,1

10 µg/ml + T11

21,7 ± 0,5 13,9

1 µg/ml + T11

19,4 ± 2,2 23,0

0,1 µg/ml + T11

20,2 ± 0,4 19,8

0,01 µg/ml + T11

24,1 ± 0,5 4,3

IgG 9D33

100 µg/ml

1,3 ± 0,2

100 µg/ml + T11

2,1 ± 0,1 94,8

10 µg/ml + T11

2,5 ± 0,1 90,1

1 µg/ml + T11

3,1 ± 0,3 87,7

0,1 µg/ml + T11

12,5 ± 0,3 50,4

0,01 µg/ml + T11

20,9 ± 0,3 17,1

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. T11 = Suero positivo para TRAb con actividad estimulante del receptor de TSH; el suero T11 se diluyó hasta una concentración final de 1:10 en tampón de AMP cíclico hipotónico. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos.

imagen203

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen204DT) % de inhibición

Tampón de AMP cíclico

0,6 ± 0,1

pTSH 3 ng/ml

64,2 ± 3,5

5B3 100 µg/ml

0,9 ± 0,2

5C9 100 µg/ml

0,2 ± 0,0

K1-70 100 µg/ml

0,6 ± 0,2

(K1-70 + 5C9)a 100 µg/ml

0,7 ± 0,5

pTSH 3 ng/ml + 5B3 100 µg/ml

63,9 ± 5,1 0,5

pTSH 3 ng/ml + 5B3 10 µg/ml

66,9 ± 6,5 0

pTSH 3 ng/ml + 5C9 100 µg/ml

0,5 ± 0,0 99,2

pTSH 3 ng/ml + 5C9 10 µg/ml

1,3 ± 0,4 98,0

pTSH 3 ng/ml + 5C9 1 µg/ml

4,2 ± 0,6 93,5

pTSH 3 ng/ml + 5C9 0,1 µg/ml

13,7 ± 4,9 78,7

pTSH 3 ng/ml + 5C9 0,01 µg/ml

64,6 ± 1,4 0

pTSH 3 ng/ml + 5C9 0,001 µg/ml

64,1 ± 7,3 0,2

pTSH 3 ng/ml + K1-70 100 µg/ml

0,7 ± 0,1 98,9

pTSH 3 ng/ml + K1-70 10 µg/ml

1,0 ± 0,6 98,4

pTSH 3 ng/ml + K1-70 1 µg/ml

0,7 ± 0,4 98,9

pTSH 3 ng/ml + K1-70 0,1 µg/ml

5,9 ± 2,8 90,8

pTSH 3 ng/ml + K1-70 0,01 µg/ml

52,0 ± 3,0 19,0

pTSH 3 ng/ml + K1-70 0,001 µg/ml

59,4 ± 3,7 7,5

pTSH 3 ng/ml + (K1-70 + 5C9)a 100 µg/ml

1,1 ± 0,4 98,3

pTSH 3 ng/ml + (K1-70 + 5C9)a 10 µg/ml

0,5 ± 0,1 99,2

pTSH 3 ng/ml + (K1-70 + 5C9)a 1 µg/ml

2,5 ± 0,3 96,1

pTSH 3 ng/ml + (K1-70 + 5C9)a 0,1 µg/ml

9,4 ± 4,0 85,4

pTSH 3 ng/ml + (K1-70 + 5C9)a 0,01 g/ml

49,4 ± 2,9 23,0

pTSH 3 ng/ml + (K1-70 + 5C9)a 0,001 µg/ml

48,3 ± 4,8 24,8

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. K1-70, 5C9 y 5B3: se usaron IgG purificados de los MAb en todos los experimentos. aEn algunos experimentos los MAb se mezclaron en proporciones iguales y la concentración mostrada para una mezcla representa la cantidad total de IgG añadida, es decir: (K1-70 + 5C9) 100 µg/ml = 50 µg/ml de K1-70 + 50 µg/ml de 5C9 usado en el experimento.

Tabla 7p El efecto de IgG K1-70 y 5C9 mezclados entre sí en la actividad constitutiva (es decir actividad basal) del TSHR

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen205DT) % de inhibición

Tampón de AMP solamente

cíclico 58,04 ± 8,52

imagen206

Muestra de ensayo

Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml imagen207DT) % de inhibición

IgG 5C9 0,1 µg/ml

68,21 ± 2,81 0

IgG 5C9 0,2 µg/ml

58,75 ± 3,92 0

IgG 5C9 1 µg/ml

31,40 ± 0,89 45,9

IgG 5C9 2 µg/ml

31,75 ± 2,73 45,3

IgG K1-70 0,01 µg/ml

92,24 ± 3,92 0

IgG K1-70 0,1 µg/ml

62,77 ± 2,18 0

IgG K1-70 0,2 µg/ml

58,75 ± 3,92 0

IgG K1-70 1 µg/ml

61,52 ± 5,04 0

IgG K1-70 2 µg/ml

52,12 ± 1,84 10,2

IgG 5B3 0,01 µg/ml

58,16 ± 9,42 0

IgG 5B3 0,1 µg/ml

58,75 ± 3,92 0

IgG 5B3 0,2 µg/ml

53,30 ± 3,36 8,2

IgG 5B3 1 µg/ml

54,39 ± 2,62 6,3

IgG 5B3 2 µg/ml

50,57 ± 2,39 12,9

IgG 5C9 0,01 µg/ml + IgG K170a

83,80 ± 5,12 0

IgG 5C9 0,1 µg/ml + IgG K1-70a

76,28 ± 1,72 0

IgG 5C9 0,2 µg/ml + IgG K1-70a

71,85 ± 5,96 0

IgG 5C9 1 µg/ml + IgG K1-70a

67,70 ± 12,58 0

IgG 5C9 2 µg/ml + IgG K1-70a

55,28 ± 6,17 4,8

IgG 5C9 0,01 µg/ml + IgG 5B3a

73,53 ± 4,31 0

IgG 5C9 0,1 µg/ml + IgG 5B3a

82,26 ± 12,07 0

IgG 5C9 0,2 µg/ml + IgG 5B3a

62,03 ± 1,22 0

IgG 5C9 1 µg/ml + IgG 5B3a

36,49 ± 1,10 37,1

IgG 5C9 2 µg/ml + IgG 5B3a

27,78 ± 2,96 52,1

Véase leyenda de la Tabla 7a para detalles. Los experimentos se llevaron a cabo usando células CHO que expresaban TSHR de tipo silvestre a aproximadamente a 5 x 105 receptores por células. aSe muestra la concentración total final de la mezcla de IgG; es decir en el caso de IgG K1-70 + IgG 5C9 2 µg/ml, la mezcla contiene IgG K1-70 1 µg/ml e IgG 5C9 1 µg/ml. En consecuencia, el efecto combinado de dos IgG a 2 µg/ml puede compararse con el efecto del IgG individual a la misma concentración (2 µg/ml).

Tabla 8a Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys58 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 8b Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg80 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 8c Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Tyr82 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen208 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,32 ± 0,37 8,23 ± 0,00 355

K1-18

0,3 ng/ml

4,69 ± 0,95 12,02 ± 1,52 256

imagen209

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen210 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

1 ng/ml

8,95 ± 0,18 19,35 ± 3,45 216

3 ng/ml

25,47 ± 4,30 43,07 ± 13,04 169

10 ng/ml

66,57 ± 3,17 69,61 ± 1,25 105

30 ng/ml

84,18 ± 11,86 79,39 ± 9,40 94

100 ng/ml

98,12 ± 5,31 102,88 ± 3,31 105

TSH

0,01 ng/ml

3,11 ± 1,09 7,16 ± 0,97 230

0,03 ng/ml

4,43 ± 0,67 10,00 ± 0,29 226

0,1 ng/ml

10,11 ± 1,27 17,24 ± 1,77 171

0,3 ng/ml

41,25 ± 5,41 45,94 ± 1,43 111

1 ng/ml

74,52 ± 3,07 75,22* 101

3 ng/ml

95,34 ± 6,60 83,71 ± 7,10 88

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinaciones por triplicado. *Determinación por duplicado. Muestra diluidas en tampón de AMP cíclico hipotónico.

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen211 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,65 0,40 4,76 ± 1,30 288

K1-18

0,3 ng/ml

2,46 ± 0,49 4,59 ± 0,41 187

1 ng/ml

5,11 ± 0,77 7,22 ± 0,69 141

3 ng/ml

10,65 ± 1,17 13,81 ± 2,53 130

10 ng/ml

31,34 ± 5,31 31,72 ± 1,53 101

30 ng/ml

50,15 ± 6,02 45,47 ± 3,59 91

100 ng/ml

66,30 ± 6,93 64,50 ± 0,51 97

TSH

0,01 ng/ml

2,00 ± 0,81 4,06 ± 0,36 203

0,03 ng/ml

3,68 ± 0,28 6,19 ± 0,95 168

0,1 ng/ml

9,10 ± 1,19 13,31 ± 1,94 146

0,3 ng/ml

22,19 ± 1,46 27,66 ± 2,20 125

1 ng/ml

57,48 ± 4,57 54,55 ± 10,40 95

3 ng/ml

58,48 ± 8,87 56,95 ± 3,97 97

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

imagen212

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen213 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

0,52 ± 0,09 1,88 ± 0,25 362

K1-18

0,3 ng/ml

1,39 ± 0,10 4,72 ± 0,95 340

1 ng/ml

2,95 ± 0,51 5,48 ± 0,91 186

3 ng/ml

7,22 ± 1,08 13,26 ± 1,61 184

10 ng/ml

26,07 ± 1,15 28,73 ± 2,65 110

30 ng/ml

36,96 ± 2,55 41,91 ± 5,06 113

100 ng/ml

50,72 ± 6,93 57,64 ± 1,84 114

TSH

0,01 ng/ml

1,01 ± 0,42 2,60 ± 0,44 257

0,03 ng/ml

4,39 ± 1,65 4,10 ± 0,63 93

0,1 ng/ml

9,67 ± 1,07 9,64 ± 1,49 100

0,3 ng/ml

29,80 ± 2,51 33,66 ± 4,57 113

1 ng/ml

53,34 ± 4,68 49,96 ± 0,72 94

3 ng/ml

56,56 ± 4,76 61,34 ± 4,96 108

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

Tabla 8d Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu107 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 8e Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg109 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen214 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

0,91 ± 0,15 7,16 ± 0,17 787

K1-18 (ng/ml)

0,3 ng/ml

1,78 ± 0,20 9,30 ± 1,48 522

1 ng/ml

3,73 ± 0,09 10,96 ± 0,69 294

3 ng/ml

11,06 ± 1,45 20,55 ± 3,83 186

10 ng/ml

30,04 ± 2,34 31,49 ± 2,70 105

30 ng/ml

49,28 ± 3,28 40,92 ± 2,03 83

100 ng/ml

57,80 ± 5,23 53,62 ± 3,86 93

TSH (ng/ml)

0,01 ng/ml

1,41 ± 0,10 8,20 ± 1,87 582

0,03 ng/ml

1,99 ± 0,09 8,92 ± 2,93 448

imagen215

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen216 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

0,1 ng/ml

5,54 ± 0,60 8,24 ± 0,60 149

0,3 ng/ml

16,27 ± 4,48 15,72 ± 0,81 97

1 ng/ml

44,20 ± 3,64 30,22 ± 2,62 68

3 ng/ml

53,86 ± 7,00 43,91 ± 2,61 82

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen217 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,75 ± 0,35 3,42 ± 0,41 195

K1-18 (ng/ml)

0,3 ng/ml

2,66 ± 0,13 5,31 ± 0,11 200

1 ng/ml

5,81 ± 0,13 9,39 ± 0,88 162

3 ng/ml

12,86 ± 0,77 17,99 ± 3,94 140

10 ng/ml

40,46 ± 1,76 40,55 ± 3,48 100

30 ng/ml

58,91 ± 9,28 50,84 ± 1,01 86

100 ng/ml

66,01 ± 4,85 59,9 ± 1,25 91

TSH (ng/ml)

0,01 ng/ml

2,74 ± 0,37 3,15 ± 0,22 115

0,03 ng/ml

4,24 ± 0,24 4,92 ± 0,54 116

0,1 ng/ml

9,39 ± 1,16 8,39 ± 0,46 89

0,3 ng/ml

39,63 ± 2,57 39,17 ± 1,70 99

1 ng/ml

61,19 ± 8,50 43,82 ± 1,69 72

3 ng/ml

70,6 ± 10,03 55,16 ± 2,59 78

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

Tabla 8f Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys129 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 8 g Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Phe130 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 8h Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Phe134 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen218 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,72 ± 0,44 2,69 ± 0,25 156

K1-18

0,3 ng/ml

2,49 ± 0,34 3,24 ± 0,03 130

imagen219

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen220 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

1 ng/ml

4,78 ± 0,88 5,53 ± 1,04 116

3 ng/ml

12,22 ± 0,32 10,58 ± 0,61 87

10 ng/ml

30,88 ± 3,70 23,53 ± 1,04 76

30 ng/ml

44,61 ± 4,59 33,46 ± 2,66 75

100 ng/ml

52,57 ± 1,30 52,88 ± 2,31 101

TSH

0,01 ng/ml

2,01 ± 0,40 2,69 ± 0,44 134

0,03 ng/ml

3,32 ± 0,26 5,34 ± 0,05 161

0,1 ng/ml

9,69 ± 0,91 12,69 ± 1,06 131

0,3 ng/ml

26,14 ± 2,72 29,0 ± 1,07 111

1 ng/ml

46,33 ± 2,29 40,78 ± 5,20 88

3 ng/ml

48,07 ± 2,77 48,50 ± 5,38 101

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/mlpmol/ml) media imagen221 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,96 ± 0,22 3,38 ± 0,47 172

K1-18

0,3 ng/ml

3,23 ± 0,26 4,01 ± 0,03 124

1 ng/ml

6,24 ± 0,70 6,71 ± 0,35 108

3 ng/ml

15,42 ± 1,00 14,89 ± 12,46 97

10 ng/ml

49,72 ± 5,36 36,36 ± 2,23 73

30 ng/ml

51,57 ± 8,02 54,0 ± 2,20 66

100 ng/ml

98,73 ± 8,67 78,11 ± 7,43 79

TSH

0,01 ng/ml

2,28 ± 0,15 3,05 ± 0,29 134

0,03 ng/ml

3,77 ± 0,83 4,12 ± 0,55 109

0,1 ng/ml

9,55 ± 0,15 9,61 ± 1,14 101

0,3 ng/ml

28,77 ± 1,08 35,64 ± 3,00 124

1 ng/ml

76,83 ± 10,33 66,16 ± 4,97 86

3 ng/ml

93,08 ± 7,22 80,37 ± 3,05 86

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

imagen222

AMP cíclico producido (pmol/ml) media imagen223 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,85 ± 0,37 4,62 ± 0,89 250

K1-18

0,3 ng/ml

2,44 ± 0,12 2,71 ± 0,65 234

1 ng/ml

5,97 ± 0,63 9,56 ± 0,52 160

3 ng/ml

13,43 ± 0,46 24,24 ± 1,93 180

10 ng/ml

35,49 ± 1,71 43,41 ± 1,29 122

30 ng/ml

46,48 ± 3,34 66,25 ± 11,73 143

100 ng/ml

58,93 ± 10,42 78,69 ± 6,43 134

TSH

0,01 ng/ml

2,50 ± 0,43 4,73 ± 0,24 189

0,03 ng/ml

4,29 ± 0,33 6,05 ± 0,21 141

0,1 ng/ml

10,60 ± 0,56 12,70 ± 2,22 120

0,3 ng/ml

28,93 ± 3,07 27,28 ± 1,96 94

1 ng/ml

52,55 ± 3,97 53,68 ± 4,76 102

3 ng/ml

61,09 ± 8,26 61,51 ± 0,99 101

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

Tabla 8i Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys183 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 8j Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp203 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 8k Niveles de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg255 mutada a Asp. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 9a Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys58 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml) media imagen224 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Experimento 1

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,49 ± 0,31 4,54 ± 0,23 305

K1-18

0,3 ng/ml

2,67 ± 0,30 4,41 ± 0,07 165

1 ng/ml

5,69 ± 0,26 4,72 ± 0,53 83

3 ng/ml

14,43 ± 2,30 4,55 ± 0,32 32

10 ng/ml

43,94 ± 2,59 4,73 ± 0,57 11

30 ng/ml

73,60 ± 9,07 4,58 ± 0,29 6

100 ng/ml

84,59 ± 5,65 5,31 ± 1,38 6

TSH

0,01 ng/ml

1,80 ± 0,13 4,95 ± 0,23 275

0,03 ng/ml

3,91 ± 0,06 6,94 ± 1,04 177

0,1 ng/ml

8,92 ± 1,47 13,04 ± 1,12 146

imagen225

AMP cíclico producido (pmol/ml) media imagen226 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

0,3 ng/ml

33,01 ± 3,49 34,95 ± 1,12 106

1 ng/ml

76,07 ± 4,42 57,18 ± 2,97 75

3 ng/ml

86,17 ± 2,02 69,15 ± 3,34 80

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

0,53 ± 0,27 3,72 ± 0,19 702

K1-18

0,3 ng/ml

1,93 ± 0,92 3,25 ± 0,23 168

1 ng/ml

3,59 ± 0,47 2,77 ± 1,32 77

3 ng/ml

6,56 ± 2,29 3,24 ± 0,63 49

10 ng/ml

27,79 ± 1,77 0,58 ± 0,89 2

30 ng/ml

46,16 ± 5,72 1,97 ± 0,11 4

100 ng/ml

61,78 ± 3,78 0,92 ± 1,17 1

TSH

0,01 ng/ml

1,30 ± 0,20 3,73 ± 0,10 287

0,03 ng/ml

3,00 ± 0,12 5,37 ± 0,31 179

0,1 ng/ml

6,69 ± 0,41 10,08 ± 0,82 151

0,3 ng/ml

26,22 ± 6,92 27,84 ± 2,8 106

1 ng/ml

68,12 ± 15,71 55,78 ± 2,52 82

3 ng/ml

69,75 ± 13,30 72,17 ± 8,74 103

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml) media imagen227 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,64 ± 0,17 6,06 ± 0,16 370

K1-18

0,3 ng/ml

2,68 ± 0,21 8,14 ± 0,24 304

1 ng/ml

5,60 ± 0,27 12,54 ± 0,46 224

3 ng/ml

11,54 ± 2,20 26,08 ± 2,19 226

10 ng/ml

38,16 ± 0,90 49,54 ± 2,38 130

30 ng/ml

60,04 ± 6,18 67,45 ± 4,04 112

100 ng/ml

76,63 ± 4,54 78,94 ± 3,75 103

TSH

0,01 ng/ml

2,29 ± 0,18 5,30 ± 0,53 231

imagen228

0,03 ng/ml

3,56 ± 0,21 7,13 ± 0,29 200

0,1 ng/ml

8,45 ± 0,07 13,02 ± 2,00 154

0,3 ng/ml

26,33 ± 1,63 33,77 ± 1,37 128

1 ng/ml

65,72 ± 5,74 58,56 ± 3,02 89

3 ng/ml

77,11 ± 4,86 69,26 ± 0,68 90

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml) media imagen229 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Experimento 1

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,65 ± 0,20 1,89 ± 0,28 71

K1-18

0,3 ng/ml

4,40 ± 0,67 1,93 ± 0,23 44

1 ng/ml

8,93 ± 2,17 2,19 ± 0,25 25

3 ng/ml

16,31 ± 1,29 4,14 ± 0,95 25

10 ng/ml

42,50 ± 3,42 7,87 ± 0,53 19

30 ng/ml

49,10 ± 9,27 15,59 ± 1,15 32

100 ng/ml

55,17 ± 10,84 31,58 ± 6,83 57

TSH

0,01 ng/ml

4,36 ± 1,05 2,59 ± 0,31 59

0,03 ng/ml

v9,19 ± 1,74 6,47 ± 0,10 70

0,1 ng/ml

26,86 ± 2,67 19,18 ± 2,69 71

0,3 ng/ml

42,03 ± 6,15 51,67 ± 3,38 123

1 ng/ml

60,08 ± 4,20 68,59 ± 7,07 114

3 ng/ml

61,27 ± 2,99 57,72 ± 9,50 94

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,80 ± 0,14 2,35 ± 0,45 131

K1-18

0,3 ng/ml

2,26 ± 0,22 2,13 ± 0,19 94

1 ng/ml

5,21 ± 0,60 1,93 ± 0,67 37

3 ng/ml

11,23 ± 1,35 3,49 ± 0,08 31

10 ng/ml

30,58 ± 1,89 6,08 ± 0,93 20

30 ng/ml

51,91 ± 5,11 7,96 ± 0,29 15

100 ng/ml

67,17 ± 5,84 20,23 ± 0,48 30

TSH

imagen230

AMP cíclico producido (pmol/ml) media imagen231 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

0,01 ng/ml

2,21 ± 0,25 1,49 ± 0,25 67

0,03 ng/ml

3,61 ± 0,28 2,81 ± 0,38 78

0,1 ng/ml

7,86 ± 3,02 6,92 ± 0,35 88

0,3 ng/ml

27,07 ± 2,08 21,24* 78

1 ng/ml

54,24 ± 5,41 41,06 ± 1,0 76

3 ng/ml

58,14 ± 3,02 52,35 ± 3,20 90

Experimento 3

Tampón de ensayo de AMP cíclico

4,02 ± 0,14 5,88 ± 0,27 146

K1-18

0,3 ng/ml

5,65 ± 0,61 5,76 ± 0,33 102

1 ng/ml

9,40 ± 0,97 5,93 ± 0 63

3 ng/ml

21,39 ± 0,55 6,06 ± 0,40 28

10 ng/ml

67,31 ± 4,56 9,44 ± 0,82 14

30 ng/ml

131,53 ± 5,0 13,46 ± 1,25 10

100 ng/ml

226,28 ± 15,17 30,07 ± 5,98 13

TSH

0,01 ng/ml

5,19 ± 0,15 6,46 ± 0,13 124

0,03 ng/ml

9,82 ± 0,96 9,44 ± 0,27 96

0,1 ng/ml

24,96* 22,74 ± 2,24 91

0,3 ng/ml

91,70 ± 3,45 68,89 ± 3,12 75

1 ng/ml

191,94 ± 11,08 154,26 ± 4,66 80

3 ng/ml

226,42 ± 16,78 201,17 ± 16,22 89

Véase leyenda de la Tabla 8a para detalles.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen232 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,86 ± 0,41 5,03 ± 0,29 270

TSHb

68,83 ± 0,70 78,46 ± 4,71 114

5B3 10 µg/ml + TSHb

82,85 ± 10,89 81,62 ± 5,07 99

5B3 100 µg/ml + TSHb

80,67 ± 13,25 81,61 ± 5,04 101

K1-70 0,001 µg + TSHb

92,76 ± 13,12 104,76 ± 7,65 113

imagen233

K1-70 0,01 µg + TSHb

82,54 ± 2,17 108,22 ± 8,17 131

K1-70 0,1 µg + TSHb

4,26 ± 0,83 85,28 ± 6,13 2002

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,56 ± 0,20 61,47 ± 2,61 3940

K1-70 10 µg + TSHb

1,72 ± 0,34 33,11 ± 4,67 1925

K1-70 100 µg + TSHb

1,58 ± 0,05 18,75 ± 4,91 1187

K1-70 100 µg

1,04 ± 0,61 4,06 ± 0,66 390

TSH (2)

74,30 ± 18,86 85,20 ± 4,48 115

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

94 0

K1-70 1 µg/ml

98 22

K1-70 10 µg/ml

98 58

K1-70 100 µg/ml

98 76

TSH (2)

0 0

Experimento 2

Cíclico

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen234DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,49 ± 0,21 3,68 ± 0,45 247

TSHb

97,87 ± 4,55 96,77 ± 9,54 99

5B3 10 µg/ml + TSHb

105,71 ± 16,43 92,91 ± 1,17 88

5B3 100 µg/ml + TSHb

90,43 ± 5,84 95,85 ± 6,56 106

K1-70 0,001 µg+TSHb

101,80 ± 13,32 105,33 ± 11,55 103

K1-70 0,01 µg + TSHb

115,21 ± 7,84 107,32 ± 11,90 93

K1-70 0,1 µg + TSHb

8,94 ± 2,47 83,06 ± 10,21 929

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,71 ± 0,40 60,95 ± 3,72 3564

K1-70 10 µg + TSHb

1,27 ± 0,47 25,12 ± 4,15 1978

K1-70 100 µg + TSHb

1,31 ± 0,33 17,34 ± 1,35 1324

K1-70 100 µg

1,38 ± 1,81 2,56 ± 0,20 186

TSH (2)

102,41 ± 6,78 95,84 ± 1,30 94

% de inhibición de la estimulación de TSHc

imagen235

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 4

5B3 100 µg/ml

8 1

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

91 14

K1-70 1 µg/ml

98 37

K1-70 10 µg/ml

99 74

K1-70 100 µg/ml

99 82

TSH (2)

0 1

aMuestras de ensayo en tampón de ensayo de AMP cíclico hipotónico.bConcentración final de TSH = 3 ng/ml c % de inhibición = 100 x [1 -(AMP cíclico en presencia de muestras de ensayo y TSH/AMP cíclico en presencia de tampón de AMP cíclico y TSH)], 5B3 es un anticuerpo monoclonal humano para GAD (control negativo para K1-70)

Tabla 9b Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg80 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 9c Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Tyr82 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen236 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

3,44 ± 0,35 4,01 ± 0,07 117

TSHb

85,04 ± 5,88 105,33 ± 10,10 124

5B3 10 µg/ml + TSHb

103,34 ± 14,25 104,97 ± 12,48 102

5B3 100 µg/ml + TSHb

94,76 ± 19,53 101,43 ± 4,34 107

K1-70 0,001 µg + TSHb

79,24 ± 9,29 90,78 ± 8,65 115

K1-70 0,01 µg + TSHb

83,30 ± 7,42 99,26 ± 7,04 119

K1-70 0,1 µg + TSHb

40,75 ± 8,82 38,83 ± 8,04 95

K1-70 1,0 µg + TSHb

5,0 ± 0,72 6,71 ± 1,42 134

K1-70 10 µg + TSHb

3,17 ± 0,18 5,14 ± 1,43 162

K1-70 100 µg + TSHb

4,67 ± 0,32 4,83 ± 0,25 103

K1-70 100 µg

2,98 ± 0,13 3,19 ± 0,51 107

TSH (2)

93,53 ± 17,83 88,18 ± 2,24 94

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 0,3

5B3 100 µg/ml

0 4

K1-70 0,001 µg

7 14

K1-70 0,01 µg/ml

2 6

K1-70 0,1 µg/ml

52 63

imagen237

K1-70 11 µg/ml

94 94

K1-70 10 µg/ml

96 95

K1-70 100 µg/ml

95 95

TSH (2)

0 16

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen238 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,38 ± 0,19 2,00 ± 0,22 145

TSHb

153,65 ± 17,41 165,92 ± 11,45 108

5B3 10 µg/ml + TSHb

163,14 ± 13,71 139,01 ± 5,40 85

5B3 100 µg/ml + TSHb

146,23 ± 19,81 139,28 ± 11,07 95

K1-70 0,001 µg + TSHb

172,63 ± 16,69 103,81 ± 9,73 60

K1-70 0,01 µg + TSHb

146,19 ± 29,10 99,95 ± 12,23 68

K1-70 0,1 µg + TSHb

21,73 ± 3,85 69,85 ± 16,62 321

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,88 ± 0,24 31,82 ± 3,29 1696

K1-70 10 µg + TSHb

1,35 ± 0,26 11,74 ± 1,33 870

K1-70 100 µg + TSHb

1,05 ± 0,07 7,88 ± 2,09 750

K1-70 100 µg

0,84 ± 0,12 1,81 ± 0,13 215

TSH (2)

159,76 ± 4,28 92,29 ± 5,79 58

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 16

5B3 100 µg/ml

5 16

K1-70 0,001 µg

0 62

imagen239

 µg/ml

5 40

K1-70 0,1 µg/ml

86 60

K1-70 1 µg/ml

99 81

K1-70 10 µg/ml

99 93

K1-70 100 µg/ml

99 95

TSH (2)

0 44

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen240 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,62 ± 0,16 5,67 ± 0,29 915

TSHb

59,91 ± 5,85 74,61 ± 6,62 125

5B3 10 µg/ml + TSHb

73,66 ± 23,18 71,92 ± 5,39 96

5B3 100 µg/ml + TSHb

68,87 ± 10,44 68,46 ± 3,41 99

K1-70 0,001 µg + TSHb

97,15 ± 2,87 89,47 ± 9,17 92

K1-70 0,01 µg + TSHb

81,95 ± 4,74 95,68 ± 7,62 117

K1-70 0,1 µg + TSHb

5,79 ± 0,68 50,57 ± 19,35 873

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,01 ± 0,36 14,55 ± 0,65 1440

K1-70 10 µg + TSHb

1,02 ± 0,19 9,07 ± 0,70 889

K1-70 100 µg + TSHb

1,00 ± 0,19 7,28 ± 0,44 728

K1-70 100 µg

0,84 ± 0,14 5,32 ± 0,74 633

TSH (2)

61,54 ± 7,58 57,87 ± 1,52 94

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 4

imagen241

5B3 100 µg/ml

0 8

K1-70 0,001 g

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

90 32

K1-70 1 µg/ml

98 80

K1-70 10 µg/ml

98 88

K1-70 100 µg/ml

98 90

TSH (2)

0 22

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

Tabla 9d Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu107 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 9e Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg109 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 9f Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys129 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 9 g Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Phe130 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 9h Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Phe134 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 9i Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys183 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 9j Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp203 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 9k Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg255 mutada a Asp. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen242 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,60 ± 0,19 5,29 ± 0,36 331

TSHb

76,22 ± 4,52 83,70 ± 3,92 110

5B3 10 µg/ml + TSHb

85,30 ± 5,68 70,93 ± 5,64 83

5B3 100 µg/ml + TSHb

81,64 ± 5,48 66,84 ± 7,24 82

K1-70 0,001 µg + TSHb

103,6 ± 5,93 94,45 ± 8,21 91

K1-70 0,01 µg + TSHb

89,43 ± 19,6 82,88 ± 4,50 93

K1-70 0,1 µg + TSHb

12,10 ± 2,22 4,97 ± 0,59 41

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,71 ± 0,32 2,71 ± 0,05 158

K1-70 10 µg + TSHb

1,49 ± 0,16 2,45 ± 0,13 164

K1-70 100 µg + TSHb

1,86 ± 0,23 2,75 ± 0,17 148

K1-70 100 µg

1,60 ± 0,07 1,80 ± 0,30 113

TSH (2)

93,75 ± 9,25 73,24 ± 5,57 78

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 15

5B3 100 µg/ml

0 17

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 1

K1-70 0,1 µg/ml

84 94

imagen243

K1-70 1 µg/ml

98 97

K1-70 10 µg/ml

98 97

K1-70 100 µg/ml

98 97

TSH (2)

0 12

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen244 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,94 ± 0,35 4,42 ± 0,55 228

TSHb

67,67 ± 4,90 32,90 ± 2,55 49

5B3 10 µg/ml + TSHb

65,84 ± 1,73 34,41 ± 1,67 52

5B3 100 µg/ml + TSHb

68,54 ± 1,22 34,51 ± 5,03 50

K1-70 0,001 µg + TSHb

66,99 ± 8,59 34,24 ± 0,25 51

K1-70 0,01 µg + TSHb

66,85 ± 2,02 32,56 ± 1,04 49

K1-70 0,1 µg + TSHb

6,41 ± 0,32 24,84 ± 1,94 388

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,60 ± 0,28 24,45 ± 0,49 1528

K1-70 10 µg + TSHb

1,51 ± 0,08 18,92 ± 2,16 1253

K1-70 100 µg + TSHb

1,36 ± 0,17 14,05 ± 3,4 1033

K1-70 100 µg

1,48 ± 0,1 3,39 ± 0,29 229

TSH (2)

67,54 ± 2,56 33,30 ± 2,27 49

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

3 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

1 0

K1-70 0,01 µg/ml

1 0

K1-70 0,1 µg/ml

91 24

K1-70 1 µg/ml

98 26

K1-70 10 µg/ml

98 42

K1-70 100 µg/ml

98 57

TSH (2)

0,1 0

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen245 DT, n=3)

imagen246

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,89 ± 0,19 1,61 ± 0,14 181

TSHb

60,73 ± 7,97 53,41 ± 3,69 88

5B3 10 µg/ml + TSHb

68,59 ± 2,26 60,65 ± 0,63 88

5B3 100 µg/ml + TSHb

66,50 ± 2,55 56,57 ± 3,26 85

K1-70 0,001 µg + TSHb

55,89 ± 6,77 61,82 ± 17,17 111

K1-70 0,01 µg + TSHb

61,90 ± 1,57 46,01 ± 0,91 74

K1-70 0,1 µg + TSHb

5,54 ± 1,21 30,32 ± 3,35 547

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,32 ± 0,21 25,25 ± 1,54 1913

K1-70 10 µg + TSHb

0,97* 14,80 ± 0 1526

K1-70 100 µg + TSHb

0,88 ± 0,11 9,14 ± 0,91 1039

K1-70 100 µg

1,02 ± 0,06 126 ± 0,41 124

TSH (2)

67,80 ± 3,83 50,39 ± 2,52 74

*Determinación por duplicado

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

8 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 14

K1-70 0,1 µg/ml

91 43

K1-70 1,0 µg/ml

98 53

K1-70 10 µg/ml

98 72

K1-70 100 µg/ml

99 83

TSH (2)

0 6

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen247 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

3,10 ± 2,74 3,37 ± 0,85 109

TSHb

50,03 ± 3,0 49,2 ± 6,7 98

5B3 10 µg/ml + TSHb

53,88 ± 3,67 50,5 ± 3,43 94

5B3 100 µg/ml + TSHb

52,60 ± 6,43 42,63 ± 2,35 81

K1-70 0,001 µg + TSHb

49,48 ± 6,51 44,76 ± 2,58 90

imagen248

K1-70 0,01 µg + TSHb

51,04 ± 0,00 38,66 ± 2,03 76

K1-70 0,1 µg + TSHb

4,70 ± 1,25 9,86 ± 1,14 210

K1-70 1,0 µg + TSHb

0,74 ± 0,06 3,23 ± 0,15 436

K1-70 10 µg + TSHb

0,80 ± 0,33 2,83 ± 0,71 354

K1-70 100 µg + TSHb

1,12 ± 0,46 2,82 ± 0,21 251

K1-70 100 µg

0,88 ± 0,21 3,06 ± 1,11 348

TSH (2)

53,1 ± 8,0 47,9 ± 0,41 90

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 13

K1-70 0,001 µg

1 9

K1-70 0,01 µg/ml

0 21

K1-70 0,1 µg/ml

91 80

K1-70 1 µg/ml

99 93

K1-70 10 µg/ml

98 94

K1-70 100 µg/ml

98 94

TSH (2)

0 3

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen249 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,39 ± 0,29 3,53 ± 0,49 254

TSHb

79,42 ± 5,15 120,74 ± 2,87 152

5B3 10 µg/ml + TSHb

78,18 ± 1,95 110,76 ± 1,49 142

5B3 100 µg/ml + TSHb

86,94 ± 15,80 113,8 ± 11,11 131

K1-70 0,001 µg + TSHb

82,73 ± 3,36 102,43 ± 7,59 124

K1-70 0,01 µg + TSHb

83,95 ± 5,31 103,90 ± 7,14 124

K1-70 0,1 µg + TSHb

4,86 ± 1,52 12,71 ± 3,24 262

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,56 ± 0,61 2,87 ± 0,28 184

K1-70 10 µg + TSHb

1,27 ± 0,15 2,22 ± 0,40 175

K1-70 100 µg + TSHb

1,18 ± 0,09 2,68 ± 0,41 242

K1-70 100 µg

1,23 ± 0,08 2,37 ± 0,26 193

TSH (2)

89,12 ± 4,45 95,39 ± 7,44 107

imagen250

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

2 8

5B3 100 µg/ml

0 6

K1-70 0,001 µg

0 15

K1-70 0,01 µg/ml

0 14

K1-70 0,1 µg/ml

94 89

K1-70 1 µg/ml

98 98

K1-70 10 µg/ml

98 98

K1-70 100 µg/ml

99 98

TSH (2)

0 0

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen251 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

6,83 ± 1,44 14,86 ± 2,75 218

TSHb

108,08 ±13,83 111,16 ± 2,0 103

5B3 10 µg/ml + TSHb

131,38 ± 6,77 101,30 ± 8,44 77

5B3 100 µg/ml + TSHb

112,49 ± 2,66 115,54 ± 9,72 103

K1-70 0,001 µg + TSHb

137,02 ± 27,32 106,92 ± 15,54 78

K1-70 0,01 µg + TSHb

120,16 ± 3,88 111,84 ± 6,01 93

K1-70 0,1 µg + TSHb

8,09 ± 1,00 27,86 ± 3,72 344

K1-70 1,0 µg + TSHb

2,02 ± 0,39 5,59 ± 1,40 277

K1-70 10 µg + TSHb

1,88 ± 0,35 4,00 ± 1,77 213

K1-70 100 µg + TSHb

1,48 ± 0,33 3,50 ± 0,09 236

K1-70 100 µg

1,34 ± 0,40 2,86 ± 0,41 213

TSH (2)

142,29 ± 13,46 101,70 ± 1,33 71

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 9

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 4

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

93 75

K1-70 1 µg/ml

98 95

imagen252

K1-70 10 µg/ml

98 96

K1-70 100 µg/ml

99 97

TSH (2)

0 9

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen253 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,43 ± 0,69 3,20 ± 0,15 744

TSHb

61,1 ± 2,48 75,8 ± 8,25 124

583 10 µg/ml + TSHb

62,03 ± 12,77 57,82 ± 7,43 93

5B3 100 µg/ml + TSHb

69,24 ± 6,19 63,12 ± 10,69 91

K1-70 0,001 µg + TSHb

83,86 ± 6,22 64,26 ± 2,45 77

K1-70 0,01 µg + TSHb

91,30 ± 15,24 61,76 ± 5,46 68

K1-70 0,1 µg + TSHb

9,35 ± 4,52 35,73 ± 5,57 382

K1-70 1,0 µg + TSHb

0,94 ± 0,34 4,02 ± 0,35 428

K1-70 10 µg + TSHb

0,52 ± 0,44 2,13 ± 0,89 410

K1-70 100 µg + TSHb

1,22 ± 0,32 1,88 ± 0,17 154

K1-70 100 µg

0,02 ± 0,01 1,42 ± 0,18 7100

TSH (2)

83,6 ± 2,95 62,16 ± 4,39 74

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 24

5B3 100 µg/ml

0 17

K1-70 0,001 µg

0 15

K1-70 0,01 µg/ml

0 19

K1-70 0,1 µg/ml

85 53

K1-70 1 µg/ml

98 95

K1-70 10 µg/ml

99 97

K1-70 100 µg/ml

98 98

TSH (2)

0 18

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen254 DT, n=3)

imagen255

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

2,28 ± 0,08 4,86 ± 0,69 213

TSHb

78,45 ± 5,2 100,68 ± 6,89 128

5B3 10 µg/ml + TSHb

87,4 ± 1,07 91,25 ± 1,14 104

5B3 100 µg/ml + TSHb

82,72 ± 3,42 91,89 ± 0,00 111

K1-70 0,001 µg + TSHb

94,13 ± 3,00 98,03 ± 9,02 104

K1-70 0,01 µg + TSHb

101,52 ± 6,79 103,40 ± 5,88 102

K1-70 0,1 µg + TSHb

19,94 ± 4,38 69,63 ± 3,65 349

K1-70 1,0 µg + TSHb

2,26 ± 0,17 13,36 ± 3,85 591

K1-70 10 µg + TSHb

2,24 ± 0,33 4,32 ± 0,30 193

K1-70 100 µg + TSHb

2,29 ± 0,42 4,01 ± 0,56 175

K1-70 100 µg

2,32 ± 0,21 3,26 ± 0,08 141

TSH (2)

79,45 ± 4,3 77,34 ± 3,86 97

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 9

5B3 100 µg/ml

0 9

K1-70 0,001 µg

0 3

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

75 31

K1-70 1 µg/ml

97 87

K1-70 10 µg/ml

97 96

K1-70 100 µg/ml

97 96

TSH (2)

0 23

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen256 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,55 ± 0,40 5,22 ± 0,77 337

TSHb

71,0 ± 6,52 53,85 ± 2,96 76

5B3 10 µg/ml + TSHb

72,22 ± 3,73 64,34 ± 5,43 89

5B3 100 µg/ml + TSHb

72,78 ± 4,65 61,38 ± 1,95 84

K1-70 0,001 µg + TSHb

79,43 ± 2,28 65,83 ± 4,66 83

K1-70 0,01 µg + TSHb

80,84 ± 4,72 63,32± 8,41 78

imagen257

K1-70 0,1 µg + TSHb

7,51 ± 0,12 15,13 ± 3,92 201

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,33 ± 0,03 4,43 ± 0,96 333

K1-70 10 µg + TSHb

0,39 ± 0,31 4,37 ± 0,56 1121

K1-70 100 µg + TSHb

0,62 ± 0,45 4,55 ± 1,57 734

K1-70 100 µg

0,53 ± 0,27 3,79 ± 0,59 715

TSH (2)

68,0 ± 3,15 59,29 ± 9,87 87

% de inhibición de la estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

89 72

K1-70 1 µg/ml

98 92

K1-70 10 µg/ml

99 92

K1-70 100 µg/ml

99 92

TSH (2)

0 0

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen258 DT, n=3)

Muestra de ensayoa

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado R255D Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,95 ± 0,25 2,17 ± 0,78 111

TSHb

66,48 ± 5,07 57,84 ± 4,45 87

5B3 10 µg/ml + TSHb

69,15 ± 0,73 59,42 ± 3,05 86

5B3 100 µg/ml + TSHb

83,38 ± 7,53 62,20 ± 10,14 75

K1-70 0,001 µg + TSHb

74,70 ± 1,78 55,65 ± 3,99 74

K1-70 0,01 µg + TSHb

77,09 ± 6,60 56,26 ± 3,14 73

K1-70 0,1 µg + TSHb

24,06 ± 0,32 5,67 ± 1,26 24

K1-70 1,0 µg + TSHb

3,22 ± 0,64 1,56 ± 0,34 48

K1-70 10 µg + TSHb

2,38 ± 0,28 0,10 ± 0,08 4

K1-70 100 µg + TSHb

1,99 ± 0,14 1,05 ± 0,56 53

K1-70 100 µg

1,85 ± 0,44 0,60 ± 0,47 32

TSH (2)

64,84 ± 8,16 50,21 ± 5,27 77

% de inhibición de la estimulación de TSHc

imagen259

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 g

0 4

K1-70 0,01 µg/ml

0 3

K1-70 0,1 µg/ml

64 90

K1-70 1 µg/ml

95 97

K1-70 10 µg/ml

96 100

K1-70 100 µg/ml

97 98

TSH (2)

2 13

Véase leyenda de la Tabla 9a para detalles.

Tabla 10 Sumario de los efectos de mutaciones de TSHR (en relación con el tipo silvestre) en la capacidad de IgG K1-18 para estimular el TSHR y de IgG K1-70 para bloquear la estimulación por TSH del TSHR

Mutación de TSHR

Estimulación de la producción de AMP cíclico por IgG K1-18 Bloqueo por K1-70 de la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico

Tipo silvestre

+++++ +++++

Lys58 Ala

+++++ ++

Arq80 Ala

+++++ +++++

Tyr82 Ala

+++++ ++++

Glu107 Ala

+++++ +++++

Arg109 Ala

+++++ +++

Lys129 Ala

+++++ +++++

Phe130 Ala

+++++ +++++

Phe134 Ala

+++++ +++++

Lys183 Ala

0 +++

Asp203 Ala

+++++ +++++

Arq255 Asp

0 +++++

Los efectos de las mutaciones de TSHR se expresaron como porcentaje de la actividad observada con el tipo silvestre de la siguiente manera: +++++ = 100 % de actividad de tipo silvestre; ++++ = <100-80 % de la actividad de tipo silvestre; +++ = <80-60 % de la actividad de tipo silvestre; ++ = <60-40 % de la actividad de tipo silvestre; + = <40-20 % de la actividad de tipo silvestre; 0 = <20 % de la actividad de tipo silvestre.

Tabla 11a Inhibición de la unión de 125I-IgG K1-70 con tubos recubiertos con TSHR por autoanticuerpos de TSHR monoclonales humanos

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen260DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen261DT)

IgG M22

100 µg/ml

92,2 ± 0,2 94,0 ± 0,6

30 µg/ml

90,5 ± 0,4 94,4 ± 1,1

10 µg/ml

90,2 ± 0,7 92,5 ± 0,1

3 µg/ml

89,5 ± 1,0 91,6 ± 0,5

1 µg/ml

89,0 ± 0,1 90,4 ± 0,7

imagen262

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen263DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen264DT)

0,3 µg/ml

87,7 ± 0,4 84,6 ± 1,1

0,1 µg/ml

84,5 ± 0,4 65,5 ± 0,2

0,03 µg/ml

70,4 ± 1,1 33,8 ± 0,9

0,01 µg/ml

43,4 ± 1,9 17,1 ± 2,4

0,003 µg/ml

16,7 ± 3,7 6,2*

0,001 µg/ml

5,5 ± 0,7 3,0 ± 3,6

Fab M22

100 µg/ml

93,2 ± 0,5 93,1 ± 0,2

30 µg/ml

92,2 ± 0,7 93,2 ± 0,3

10 µg/ml

89,4 ± 1,3 92,6 ± 0,4

3 µg/ml

89,1 ± 1,0 92,0 ± 0,3

1 µg/ml

88,8 ± 0,8 91,7 ± 0,7

0,3 µg/ml

88,0 ± 0,4 89,9 ± 0,1

0,1 µg/ml

86,5 ± 0,1 82,5 ± 0,4

0,03 µg/ml

79,7 ± 0,4 60,2 ± 1,8

0,01 µg/ml

63,5 ± 0,8 34,0 ± 2,1

0,003 µg/ml

31,0 ± 3,3 16,7 ± 6,0

0,001 µg/ml

15,9 ± 3,1 9,3 ± 1,3

IgG K1-70

100 µg/ml

93,0 ± 0,3 94,6 ± 0,7

30 µg/ml

92,3 ± 0,2 93,7 ± 0,5

10 µg/ml

90,8 ± 1,0 92,6 ± 0,4

3 µg/ml

89,7 ± 0,4 92,0 ± 0,5

1 µg/ml

89,9 ± 0,7 91,8 ± 0,9

0,3 µg/ml

89,0 ± 0,5 84,4 ± 0,8

0,1 µg/ml

86,7 ± 0,5 67,4 ± 0,7

0,03 µg/ml

77,0 ± 0,6 36,5 ± 1,9

0,01 µg/ml

50,7 ± 1,5 19,9 ± 5,8

0,003 µg/ml

17,0 ± 0,8 10,2 ± 2,4

0,001 µg/ml

3,4 ± 0,7 4,8 ± 4,8

IgG 5C9

100 µg/ml

93,3 ± 0,2 68,5 ± 0,7

10 µg/ml

84,8 ± 0,8 22,7 ± 1,0

1 µg/ml

56,4 ± 0,9 15,4 ± 3,4

0,1 µg/ml

24,6 ± 0,4 4,4 ± 2,7

0,01 µg/ml

4,5 ± 2,4 2,8 ± 4,5

imagen265

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen266DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen267DT)

IgG 5B3

100 µg/ml

15,2 ± 2,5 1,1*

10 µg/ml

-2,1 ± 1,3 -0,7 ± 2,2

1 µg/ml

-2,6 ± 1,1 0,0*

0,1 µg/ml

1,0 ± 2,7 9,4 ± 4,2

0,01 µg/ml

3,2 ± 3,4 3,2 ± 3,4

0,001 µg/ml

-1,5 ± 4,3 3,7 ± 2,1

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinaciones por triplicado. *Determinación por duplicado. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. 5B3 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). 125I-IgG K1-70 en presencia de tampón de ensayo proporcionó 20,4 % de unión. 125I-IgG K1-70 en presencia del grupo de HBD proporcionó 20,5 % de unión. El tampón de ensayo es NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8, Triton X-100 0,1 %.

Tabla 11b Inhibición de la unión de 125I-IgG K1-70 con tubos recubiertos con TSHR por autoanticuerpos de TSHR monoclonales humanos Tabla 11c Inhibición de la unión de 125I-IgG K1-70 con tubos recubiertos con TSHR por autoanticuerpos de TSHR monoclonales de ratón

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen268DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen269DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

92,9 ± 0,2 93,5 ± 0,2

30 µg/ml

91,2 ± 0,7 92,2 ± 0,6

10 µg/ml

91,8 ± 0,3 92,5 ± 0,7

3 µg/ml

90,5 ± 1,0 91,0 ± 0,3

1 µg/ml

89,6 ± 1,2 85,8 ± 0,3

0,3 µg/ml

86,4 ± 0,8 73,9 ± 0,6

0,1 µg/ml

77,9 ± 0,2 48,6 ± 0,9

0,03 µg/ml

53,9 ± 1,9 20,0 ± 1,9

0,01 µg/ml

30,2 ± 2,1 3,1 ± 2,0

0,003 µg/ml

17,0 ± 3,1 -2,7 ± 7,9

0,001 µg/ml

7,2 ± 2,5 -3,0 ± 3,9

Fab K1-18

100 µg/ml

86,0 ± 1,4 83,6 ± 0,3

30 µg/ml

83,3 ± 1,5 83,2 ± 1,4

10 µg/ml

81,9 ± 0,9 82,0 ± 0,2

3 µg/ml

79,4 ± 1,1 80,5 ± 0,6

1 µg/ml

78,5 ± 1,8 75,6 ± 1,0

0,3 µg/ml

71,4 ± 1,7 60,9 ± 1,1

0,1 µg/ml

62,8 ± 5,1 38,4 ± 1,2

0,03 µg/ml

31,3 ± 1,0 10,2 ± 2,1

0,01 µg/ml

23,7 ± 5,4 1,1 ± 2,6

0,003 µg/ml

15,2 ± 3,4 -3,5 ± 3,1

imagen270

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen271DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen272DT)

0,001 µg/ml

13,8 ± 5,9 0,5 ± 4,4

IgG K1-70

100 µg/ml

93,8 ± 0,2 93,6 ± 0,4

30 µg/ml

93,1 ± 0,5 94,3 ± 0,2

10 µg/ml

92,3 ± 0,3 93,1 ± 0,6

3 µg/ml

90,7 ± 0,4 91,7 ± 0,4

1 µg/ml

90,8 ± 0,4 90,4 ± 0,3

0,3 µg/ml

89,2 ± 0,6 82,7 ± 0,6

0,1 µg/ml

87,1 ± 0,6 62,8 ± 1,1

0,03 µg/ml

74,2 ± 1,5 33,6 ±1,8

0,01 µg/ml

50,9 ± 0,8 11,4 ± 3,6

0,003 µg/ml

24,0 ± 4,5 2,2 ± 6,2

0,001 µg/ml

15,3 ± 1,1 -7,6 ± 2,8

Fab K1-70

100 µg/ml

91,5 ± 0,2 90,8 ± 0,6

30 µg/ml

90,7 ± 0,1 91,0 ± 0,7

10 µg/ml

89,8 ± 1,2 90,6 ± 0,1

3 µg/ml

89,4 ± 0,3 90,9 ± 0,4

1 µg/ml

88,3 ± 0,4 89,5 ± 0,3

0,3 µg/ml

88,0 ± 0,1 87,3 ± 0,6

0,1 µg/ml

87,5 ± 0,8 76,5 ± 0,4

0,03 µg/ml

81,7 ± 0,6 49,6 ± 0,4

0,01 µg/ml

64,8 ± 2,7 21,6 ± 3,8

0,003 µg/ml

32,7 ± 2,7 5,6 ± 6,0

0,001 µg/ml

12,2 ± 2,3 -3,6 ± 1,0

Véase leyenda de la Tabla 11a para detalles. 125I-IgG K1-70 en presencia de tampón de ensayo proporcionó 20,4 % de unión. 125I-IgG K1-70 en presencia del grupo de HBD proporcionó 20,5 % de unión. El efecto de IgG 5B3 (MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa; control negativo) se muestra en la Tabla 11a.

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen273DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen274DT)

IgG TSMAb 1

100 µg/ml

47,4 ± 1,2 44,7 ± 0,5

10 µg/ml

23,0 ± 0,5 37,7 ± 1,2

1 µg/ml

14,8 ± 0,5 16,8 ± 2,3

0,1 µg/ml

2,3 ± 2,3 -2,2 ± 1,9

0,01 µg/ml

-1,0 ± 4,4 -3,3 ± 2,9

imagen275

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen276DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen277DT)

IgG TSMAb 2

100 µg/ml

53,7 ± 1,4 43,8 ± 0,9

10 µg/ml

14,5 ± 1,4 35,5 ± 1,3

1 µg/ml

9,3 ± 1,6 28,6 ± 0,6

0,1 µg/ml

6,5 ± 2,3 10,2 ± 0,8

0,01 µg/ml

0,3 ± 3,4 1,2 ± 3,6

IgG TSMAb 3

100 µg/ml

54,8 ± 2,8 33,5 ± 3,7

10 µg/ml

25,4 ± 2,9 24,9 ± 2,8

1 µg/ml

14,6 ± 0,9 18,5 ± 0,8

0,1 µg/ml

13,1 ± 0,7 4,8 ± 1,7

0,01 µg/ml

5,3 ± 0,7 -1,3 ± 0,3

IgG TSMAb 4

100 µg/ml

47,7 ± 2,6 54,2 ± 1,7

10 µg/ml

31,9 ± 0,7 52,8 ± 2,5

1 µg/ml

29,9 ± 1,0 42,8 ± 1,2

0,1 µg/ml

22,6 ± 1,6 18,6 ± 0,2

0,01 µg/ml

6,7 ± 0,6 2,3 ± 3,1

IgG TSMAb 5

100 µg/ml

72,5 ± 1,3 59,6 ± 0,6

10 µg/ml

53,1 ± 1,6 53,8 ± 0,7

1 µg/ml

33,8 ± 3,9 46,3 ± 1,3

0,1 µg/ml

25,7 ± 0,7 30,6 ± 1,5

0,01 µg/ml

10,9 ± 3,1 7,2 ± 1,4

IgG TSMAb 6

100 µg/ml

59,5 ± 3,2 48,1 ± 2,1

10 µg/ml

23,9 ± 3,0 47,4 ± 4,1

1 µg/ml

19,2 ± 2,3 37,0 ± 1,4

0,1 µg/ml

16,6 ± 1,1 22,0 ± 1,2

0,01 µg/ml

7,8 ± 0,5 3,6 ± 1,6

IgG TSMAb 7

100 µg/ml

61,2 ± 0,8 44,7 ± 1,6

10 µg/ml

41,2 ± 2,3 41,8 ± 2,7

1 µg/ml

19,4 ± 3,7 33,1 ± 1,4

0,1 µg/ml

13,4 ± 1,5 13,0 ± 1,2

0,01 µg/ml

2,9 ± 1,2 -2,1 ± 0,4

imagen278

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen279DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen280DT)

IgG 9D33

100 µg/ml

61,4 ± 0,4 51,1 ± 1,7

10 µg/ml

41,7 ± 1,6 48,0 ± 2,2

1 µg/ml

37,2 ± 4,0 40,5 ± 3,6

0,1 µg/ml

24,8 ± 1,1 14,8 ± 0,2

0,01 µg/ml

9,4 ± 1,1 0,6 ± 0,4

IgG 5B3

100 µg/ml

1,3 ± 0,6 -0,9 ± 2,6

10 µg/ml

2,3 ± 2,3 -1,5 ± 1,5

1 µg/ml

4,2 ± 5,3 -1,5 ± 5,4

0,1 µg/ml

-1,2 ± 1,3 -3,6 ± 3,3

0,01 µg/ml

-3,6 ± 1,8 -5,8 ± 1,9

Véase leyenda de la Tabla 11a para detalles. 125I-IgG K1-70 en presencia de tampón de ensayo proporcionó 20,3 % de unión. 125I-IgG K1-70 en presencia del grupo de HBD proporcionó 19,5 % de unión.

Tabla 11d Inhibición de la unión de 125I-Fab K1-70 con tubos recubiertos con TSHR por autoanticuerpos de TSHR monoclonales humanos y de ratón

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen281DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen282DT)

IgG K1-18

100 µg/ml

95,3 ± 0,2 96,0 ± 0,0

30 µg/ml

94,5 ± 0,1 95,6 ± 0,4

10 µg/ml

94,0 ± 0,4 94,8 ± 0,3

3 µg/ml

93,3 ± 0,5 93,0 ± 0,5

1 µg/ml

93,1 ± 0,3 89,4 ± 0,7

0,3 µg/ml

92,6 ± 0,8 77,7 ± 1,5

0,1 µg/ml

83,6 ± 0,3 51,0 ± 3,2

0,03 µg/ml

63,1 ± 0,6 17,2 ± 2,6

0,01 µg/ml

30,3 ± 2,1 2,2 ± 7,8

0,003 µg/ml

11,4 ± 4,1 -9,4 ± 3,1

0,001 µg/ml

5,9 ± 5,6 -6,8 ± 5,4

Fab K1-18

100 µg/ml

86,4 ± 0,5 85,7 ± 1,6

30 µg/ml

83,2 ± 0,1 85,4 ± 0,8

10 µg/ml

80,8 ± 0,9 83,2 ± 0,7

3 µg/ml

80,6 ± 1,9 82,6 ± 0,5

1 µg/ml

79,0 ± 1,5 78,7 ± 1,6

0,3 µg/ml

75,9 ± 0,2 63,9 ± 1,3

0,1 µg/ml

62,9 ± 0,7 36,9 ± 2,2

imagen283

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen284DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen285DT)

0,03 µg/ml

38,8 ± 0,4 7,9 ± 1,5

0,01 µg/ml

16,7 ± 0,4 -0,8 ± 4,7

0,003 µg/ml

5,0 ± 4,6 -9,6 ± 4,8

0,001 µg/ml

3,8 ± 5,8 -8,2 ± 5,6

IgG M22

100 µg/ml

97,2 ± 0,3 96,5 ± 0,5

30 µg/ml

96,3 ± 0,5 95,8 ± 0,3

10 µg/ml

95,8 ± 0,5 95,4 ± 0,7

3 µg/ml

95,4 ± 0,4 95,1 ± 0,4

1 µg/ml

94,5 ± 0,9 93,1 ± 0,2

0,3 µg/ml

93,1 ± 0,3 86,6 ± 3,3

0,1 µg/ml

89,4 ± 0,4 68,2 ± 0,4

0,03 µg/ml

72,7 ± 1,3 32,7 ± 1,3

0,01 µg/ml

41,0 ± 2,4 5,7 ± 2,0

0,003 µg/ml

19,3 ± 3,1 -5,8 ± 2,8

0,001 µg/ml

12,1 ± 4,8 -3,1 ± 5,5

M22 Fab

100 µg/ml

97,7 ± 0,1 94,9 ± 0,5

30 µg/ml

96,2 ± 0,3 95,3 ± 0,2

10 µg/ml

95,5 ± 0,1 94,8 ± 0,5

3 µg/ml

94,2 ± 0,2 94,1 ± 0,4

1 µg/ml

93,6 ± 0,5 93,7 ± 0,7

0,3 µg/ml

92,7 ± 0,4 92,2 ± 0,7

0,1 µg/ml

91,8 ± 0,2 86,4 ± 1,8

0,03 µg/ml

83,9 ± 0,8 66,8 ± 0,8

0,01 µg/ml

61,6 ± 1,2 36,6 ± 1,0

0,003 µg/ml

29,7 ± 1,4 11,5 ± 1,9

0,001 µg/ml

10,9 ± 0,5 7,7 ± 7,3

IgG K1-70

100 µg/ml

97,7 ± 0,2 97,7 ± 0,2

30 µg/ml

97,7 ± 0,2 97,4 ± 0,2

10 µg/ml

96,9 ± 0,3 96,6 ± 0,2

3 µg/ml

95,5 ± 0,5 96,2 ± 0,5

1 µg/ml

95,2 ± 0,3 94,1 ± 0,4

0,3 µg/ml

94,2 ± 0,2 97,0 ± 1,0

0,1 µg/ml

93,5 ± 0,7 66,5 ± 1,4

imagen286

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen287DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen288DT)

0,03 µg/ml

89,0 ± 0,5 37,8 ± 3,3

0,01 µg/ml

66,2 ± 2,1 10,6 ± 1,6

0,003 µg/ml

27,7 ± 3,8 -0,8 ± 2,6

0,001 µg/ml

5,5 ± 1,0 -8,8 ± 2,4

Fab K1-70

100 µg/ml

96,7 ± 0,4 96,3 ± 0,1

30 µg/ml

95,1 ± 0,9 95,7 ± 0,4

10 g/ml

93,6 ± 0,0 94,8 ± 0,5

3 µg/ml

93,5 ± 0,2 94,9 ± 0,3

1 µg/ml

93,5 ± 0,1 94,2 ± 0,3

0,3 µg/ml

92,7 ± 0,4 91,4 ± 0,8

0,1 µg/ml

92,2 ± 0,3 81,9 ± 0,5

0,03 µg/ml

89,0 ± 0,3 57,2 ± 2,6

0,01 µg/ml

75,6 ± 1,3 25,3 ± 3,9

0,003 µg/ml

40,0 ± 3,9 2,5 ± 5,8

0,001 µg/ml

11,9 ± 2,6 -2,5 ± 3,2

IgG 5C9

100 µg/ml

93,3 ± 0,9 40,6 ± 3,8

10 µg/ml

80,4 ± 2,4 20,7 ± 1,1

1 µg/ml

41,5 ± 3,2 8,1 ± 5,5

0,1 µg/ml

21,9 ± 0,6 6,0 ± 8,6

0,01 µg/ml

10,9 ± 1,6 -4,4 ± 5,9

IgG TSMAb 1

100 µg/ml

48,8 ± 1,9 46,3 ± 1,6

10 µg/ml

29,9 ± 0,4 41,4 ± 1,3

1 µg/ml

21,9 ± 1,5 25,0 ± 2,0

0,1 µg/ml

4,1 ± 3,0 8,4 ± 4,3

0,01 µg/ml

-2,5 ± 2,5 3,5 ± 3,5

IgG TSMAb 2

100 µg/ml

56,3 ± 2,1 38,3 ± 3,0

10 µg/ml

24,0 ± 3,8 34,7 ± 1,2

1 µg/ml

16,8 ± 1,4 26,9 ± -2,9

0,1 µg/ml

13,0 ± 2,2 12,5 ± 1,7

0,01 µg/ml

4,0 ± 2,1 8,6 ± 8,6

IgG TSMAb 3

100 µg/ml

58,9 ± 3,2 32,6 ± 2,6

imagen289

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen290DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen291DT)

10 µg/ml

30,3 ± 1,8 29,0 ± 3,4

1 µg/ml

29,3 ± 3,2 18,2 ± 2,1

0,1 µg/ml

21,1 ± 1,9 3,6 ± 1,3

0,01 µg/ml

7,2 ± 1,7 2,4 ±3,7

IgG TSMAb 4

100 µg/ml

53,8 ± 3,4 57,8 ± 3,3

10 µg/ml

41,8 ± 2,1 53,5 ± 1,4

1 µg/ml

38,8 ± 2,2 41,2 ± 0,1

0,1 µg/ml

29,9 ± 1,3 12,8 ± 1,6

0,01 µg/ml

8,6 ± 1,2 -1,4 ±1,7

IgG TSMAb 5

100 µg/ml

81,8 ± 1,5 57,5 ± 1,6

10 µg/ml

62,0 ± 5,7 57,0 ± 2,6

1 µg/ml

41,2 ± 0,9 52,3 ± 1,2

0,1 µg/ml

34,4 ± 1,4 28,8 ± 1,2

0,01 µg/ml

14,4 ± 1,9 6,8 ± 0,4

IgG TSMAb 6

100 µg/ml

68,3 ± 2,9 43,9 ± 1,0

10 µg/ml

28,9 ± 3,7 39,2 ± 3,8

1 µg/ml

25,4 ± 2,4 36,9 ± 4,7

0,1 µg/ml

19,5 ± 2,0 19,2 ± 1,6

0,01 µg/ml

4,9 ± 0,7 0,2 ± 0,9

IgG TSMAb 7

100 µg/ml

59,8 ± 2,8 38,2 ± 2,1

10 µg/ml

40,6 ± 1,2 39,5 ± 5,5

1 µg/ml

21,7 ± 2,1 30,7 ± 2,8

0,1 µg/ml

13,5 ± 1,7 9,3 ± 2,7

0,01 µg/ml

-1,7 ± 1,6 -2,9 ± 2,3

IgG 9D33

100 µg/ml

62,7 ± 2,5 55,7 ± 7,1

10 µg/ml

48,0 ± 2,6 47,7 ± 1,7

1 µg/ml

43,8 ± 1,8 38,8 ± 3,3

0,1 µg/ml

29,7 ± 3,4 12,7 ± 1,8

0,01 µg/ml

5,0 ± 0,4 -1,2 ± 2,7

IgG 5B3

100 µg/ml

1,4 ± 0,6 -8,6 ± 1,2

imagen292

Muestra de ensayo

Inhibición de la unión (%) de Diluciones en tampón de ensayo (media imagen293DT) Inhibición de la unión (%) de Diluciones en HBD (media imagen294DT)

10 µg/ml

-2,1 ± 2,6 -5,7 ± 4,4

1 µg/ml

-1,7 ± 0,2 -7,8 ± 2,2

0,1 µg/ml

2,2 ± 0,8 -8,7 ± 0,8

0,01 µg/ml

-1,7 ± 1,7 -5,3 ± 7,0

0,001 µg/ml

-1,8 ± 3,1 -12,1 ± 2,8

Véase leyenda de la Tabla 11a para detalles. 125I-Fab K1-70 en presencia de tampón de ensayo proporcionó 20,3 % de unión. 125I-Fab K1-70 en presencia del grupo de HBD proporcionó 19,5 % de unión.

Tabla 11e Inhibición de la unión de 125I-Fab K1-70, 125I-IgG K1-70 y 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por sueros de pacientes

Muestra ensayo

de % de inhibición de la unión de 125I-Fab K1-70 % de inhibición de la unión de 125I-IgG K1-70 % de inhibición de la unión de 125I-TSH

G1

43,7 47,6 38,6

G2

29,0 33,8 31,5

G3

33,3 44,7 35,6

G4

39,2 47,5 47,1

G5

40,9 41,1 44,7

G6

50,2 55,1 52,1

G7

15,9 19,2 15,9

G8

34,6 41,5 41,8

G9

72,8 77,6 80,0

G10

55,2 62,4 68,7

G11

32,7 38,3 31,0

G12

30,8 42,1 29,7

G13

47,3 51,8 57,9

G14

49,7 53,3 49,3

G15

41,1 48,4 38,6

G16

36,9 43,3 42,9

G17

17,5 23,3 24,5

G18

33,9 40,6 39,1

G19

22,2 33,4 20,6

G20

33,5 38,1 38,4

HBD 1

-4,7 -6,5 -12,6

HBD 2

-1,7 -3,5 -4,2

HBD 3

1,2 -2,8 -5,4

HBD 4

-3,4 0,8 -11,8

HBD 5

-0,5 5,6 -4,7

HBD

1,6 4,1 1,8

imagen295

Muestra ensayo

de % de inhibición de la unión de 125I-Fab K1-70 % de inhibición de la unión de 125I-IgG K1-70 % de inhibición de la unión de 125I-TSH

HBD 7

-9,0 -2,4 -13,7

HBD 8

-4,6 0,8 -12,8

HBD 9

-0,6 1,2 -11,0

HBD 10

-4,3 2,1 -10,6

Suero donante K1

de

diluido 10x

72,9 73,7 67,2

diluido 20x

52,2 56,6 44,0

diluido 40x

29,5 39,5 24,8

diluido 80x

15,5 26,2 11,9

diluido 160x

7,8 15,3 2,7

diluido 320x

3,2 8,0 2,1

B1

diluido 5x

85,7 89,0 91,5

diluido 10x

76,5 81,7 83,9

diluido 20x

60,6 68,1 65,8

diluido 40x

38,4 51,3 39,6

diluido 80x

21,0 36,9 20,7

diluido 160x

8,6 20,4 7,5

diluido 320x

3,6 10,7 -2,5

B2

diluido 5x

90,4 89,9 93,5

diluido 10x

84,6 86,6 86,5

diluido 20x

71,9 78,1 68,7

diluido 40x

52,4 63,1 42,8

diluido 80x

34,9 45,1 20,4

diluido 160x

18,6 29,5 10,5

diluido 320x

10,7 16,6 14,1

S1

diluido 5x

73,6 72,1 82,0

diluido 10x

58,6 60,2 66,5

diluido 20x

45,1 45,7 47,1

diluido 40x

32,9 34,5 32,5

diluido 80x

19,7 21,6 17,4

diluido 160x

9,7 13,7 5,2

diluido 320x

2,2 4,7 2,3

S2

imagen296

 ensayo

% de inhibición de la unión de 125I-Fab K1-70 % de inhibición de la unión de 125I-IgG K1-70 % de inhibición de la unión de 125I-TSH

diluido 5x

50,0 54,7 55,1

diluido 10x

34,8 38,9 33,7

diluido 20x

24,2 22,9 18,4

diluido 40x

11,8 16,0 9,5

diluido 80x

5,6 9,4 7,7

diluido 160x

0,3 4,9 -0,7

Véase leyenda de la Tabla 11a para detalles. Se realizaron diluciones en el suero de grupo de HBD. HBD 1-10 = sueros de donantes de sangre sanos 1-10. B1, B2 = sueros de dos pacientes diferentes con autoanticuerpos de bloqueo de TSHR. S1, S2 = sueros de dos pacientes diferentes con autoanticuerpos estimulantes de TSHR.

Tabla 12a Unión de MAb humanos con TSHR260-AP en un ELISA Tabla 12b Unión de MAb de TSHR humanos (preparaciones de IgG y Fab) en el ELISA basado en TSHR260-AP

Absorbancia media a 405 nm

Muestra de ensayo

Muestra de ensayo diluida en HBD Muestra de ensayo diluida en tampón de ensayo

Tampón de ensayo

-0,005

Suero de HBD

-0,002

IgG K1-18

250 µg/ml

0,722 1,197

100 µg/ml

0,706 0,993

10 µg/ml

0,660 0,800

1 µg/ml

0,578 0,715

0,5 µg/ml

0,511 0,673

0,1 µg/ml

0,292 0,545

0,05 µg/ml

0,191 0,396

0,01 µg/ml

0,053 0,255

0,005 µg/ml

0,013 0,136

IgG K1-70

250 µg/ml

0,817 1,134

100 µg/ml

0,794 1,030

10 µg/ml

0,738 0,885

1 µg/ml

0,677 0,806

0,5 µg/ml

0,661 0,802

0,1 µg/ml

0,440 0,713

0,05 µg/ml

0,290 0,593

0,01 µg/ml

0,086 0,183

0,005 µg/ml

0,045 0,085

IgG M22

250 µg/ml

0,833 1,007

100 µg/ml

0,851 0,967

imagen297

Absorbancia media a 405 nm

Muestra de ensayo

Muestra de ensayo diluida en HBD Muestra de ensayo diluida en tampón de ensayo

10 µg/ml

0,796 0,872

1  g/ml

0,726 0,821

0,5 µg/ml

0,657 0,776

0,1 µg/ml

0,365 0,653

0,05 µg/ml

0,204 0,484

0,01 µg/ml

0,030 0,101

0,005 µg/ml

0,045 0,075

IgG 5C9

250 µg/ml

0,058 1,124

100 µg/ml

0,027 0,669

10 µg/ml

0,004 0,099

1 µg/ml

0,045 0,011

0,5 µg/ml

0,016 -0,005

0,1 µg/ml

-0,005 -0,013

0,05 µg/ml

-0,003 -0,008

0,01 µg/ml

0,017 -0,001

0,005 µg/ml

0,020 -0,009

IgG 5B3

250 µg/ml

0,012 0,018

100 µg/ml

0,003 -0,011

10 µg/ml

-0,006 -0,014

1 µg/ml

0,049 -0,004

0,5 µg/ml

-0,001 -0,006

0,1 µg/ml

-0,002 -0,013

0,05 µg/ml

-0,006 -0,009

0,01 µg/ml

0,027 0,012

0,005 µg/ml

-0,002 -0,012

TSHR260-AP es una proteína de fusión que consiste en un fragmento de TSHR humano (aminoácidos 22-260) con fosfatasa alcalina. HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. Las muestras de ensayo se diluyeron en suero de HBD o tampón de ensayo. El tampón de ensayo es NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8, Triton X-100 0,1 %, BSA 1 µg/ml. 5B3 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo). Absorbancia media = media de determinaciones por duplicado.

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm de Diluciones en HBD Absorbancia media a 405 nm de Diluciones en tampón de ensayo

IgG

Fab IgG Fab

IgG M22

250 µg/ml

0,833 0,031 1,007 0,077

imagen298

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm de Diluciones en HBD Absorbancia media a 405 nm de Diluciones en tampón de ensayo

IgG

Fab IgG Fab

100 µg/ml

0,851 - 0,967 -

10 µg/ml

0,796 0,010 0,872 0,034

1 µg/ml

0,726 - 0,821 -

0,5 µg/ml

0,657 - 0,776 -

0,1 µg/ml

0,365 -0,007 0,653 0,015

0,05 µg/ml

0,204 - 0,484 -

0,01 µg/ml

0,030 - 0,101 -

0,005 µg/ml

0,045 -0,013 0,075 -0,004

IgG 5C9

250 µg/ml

0,058 -0,008 1,124 0,204

100 µg/ml

0,027 - 0,669 -

10 µg/ml

0,004 -0,008 0,099 0,016

1 µg/ml

0,045 - 0,011 -

0,5 µg/ml

0,016 - -0,005 -

0,1 µg/ml

-0,005 -0,009 -0,013 -0,009

0,05 µg/ml

-0,003 - -0,008 -

0,01 µg/ml

0,017 - -0,001 -

0,005 µg/ml

0,020 -0,012 -0,009 0,000

IgG K1-18

250 µg/ml

0,722 -0,007 1,197 0,049

100 µg/ml

0,706 - 0,993 -

10 µg/ml

0,660 -0,002 0,800 0,008

1 µg/ml

0,578 - 0,715 -

0,5 µg/ml

0,511 - 0,673 -

0,1 µg/ml

0,292 -0,011 0,545 0,002

0,05 µg/ml

0,191 - 0,396 -

0,01 µg/ml

0,053 - 0,255 -

0,005 µg/ml

0,013 -0,011 0,136 -0,004

IgG K1-70

250 µg/ml

0,817 0,020 1,134 0,056

100 µg/ml

0,794 - 1,030 -

10 µg/ml

0,738 0,018 0,885 0,033

1 g/ml

0,677 - 0,806 -

0,5 µg/ml

0,661 - 0,802 -

0,1 µg/ml

0,440 -0,010 0,713 0,007

imagen299

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm de Diluciones en HBD Absorbancia media a 405 nm de Diluciones en tampón de ensayo

IgG

Fab IgG Fab

0,05 µg/ml

0,290 - 0,593 -

0,01 µg/ml

0,086 - 0,183 -

0,005 µg/ml

0,045 -0,010 0,085 -0,004

IgG 5B3

250 µg/ml

0,012 - 0,018 -

100 µg/ml

0,003 - -0,011 -

10 µg/ml

-0,006 - -0,014 -

1 µg/ml

0,049 - -0,004 -

0,5 µg/ml

-0,001 - -0,006 -

0,1 µg/ml

-0,002 - -0,013 -

0,05 µg/ml

-0,006 - -0,009 -

0,01 µg/ml

0,027 - 0,012 -

0,005 µg/ml

-0,002 - -0,012 -

IgG 4B4

250 µg/ml

- -0,009 - -0,004

100 µg/ml

- - - -

10 µg/ml

- -0,009 - 0,012

1 µg/ml

- - - -

0,5 µg/ml

- - - -

0,1 µg/ml

- -0,001 - -0,006

0,05 µg/ml

- - - -

0,01 µg/ml

- - - -

0,005 µg/ml

- -0,014 - 0,000

Véase leyenda de la Tabla 12a para detalles. 4B4 es un MAb humano para ácido glutámico descarboxilasa (control negativo).

Tabla 12c Unión de TSMAb de ratón en el ELISA de TSHR260-AP Tabla 12d Unión de MAb de bloqueo de TSHR de ratón (9D33) en el ELISA de TSHR260-AP Tabla 12e Unión de sueros de pacientes con actividad estimulante de TSHR en el ELISA de TSHR260-AP Tabla 12f Unión de sueros de pacientes con actividad de bloqueo de TSHR en el ELISA de TSHR260-AP Tabla 12g Unión de sueros de pacientes en el ELISA de TSHR260-AP

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm de diluciones en HBD

HBD

-0,010

TSMAb 1

10 µg/ml

0,166

0,5 µg/ml

0,036

0,05 µg/ml

-0,002

0,005 µg/ml

0,006

TSMAb 2

10 µg/ml

0,410

0,5 µg/ml

0,191

0,05 µg/ml

0,033

0,005 µg/ml

0,003

TSMAb 3

imagen300

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm de diluciones en HBD

10 µg/ml

0,103

0,5 µg/ml

0,029

0,05 µg/ml

-0,001

0,005 µg/ml

0,003

TSMAb 4

10 µg/ml

0,428

0,5 µg/ml

0,253

0,05 µ 

0,048

0,005 µg/ml

0,013

TSMAb 5

10 µg/ml

0,561

0,5 µg/ml

0,319

0,05 µg/ml

0,054

0,005 µg/ml

0,011

TSMAb 6

10 µg/ml

0,486

0,5 µg/ml

0,310

0,05 µg/ml

0,090

0,005 µg/ml

0,002

TSMAb 7

10 µg/ml

0,357

0,5 µg/ml

0,184

0,05 µg/ml

0,027

0,005 µg/ml

0,004

IgG K1-70

10 µg/ml

1,252

1 µg/ml

1,122

0,5 µg/ml

1,038

0,1 µg/ml

0,606

0,05 µg/ml

0,348

0,01 µg/ml

0,069

0,005 µg/ml

0,076

IgG M22

10 µg/ml

1,272

1 µg/ml

1,094

0,5 µg/ml

1,018

0,1 µg/ml

0,548

0,05 µg/ml

0,292

0,01 µg/ml

0,043

0,005 µg/ml

0,011

Véase la leyenda de la Tabla 12a para detalles. La unión de 5B3 y 4B4 (MAb humanos para ácido glutámico descarboxilasa; controles negativos) se muestra en la Tabla 12b.

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm de diluciones en HBD

HBD

0,003

IgG 9D33

10 µg/ml

0,481

imagen301

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm de diluciones en HBD

1 µg/ml

0,329

0,5 µg/ml

0,273

0,1 µg/ml

0,102

0,05 µg/ml

0,056

0,01 µg/ml

0,011

0,005 µg/ml

0,006

IgG K1-70

10 µg/ml

1,324

1 µg/ml

1,164

0,5 µg/ml

1,083

0,1 µg/ml

0,639

0,05 µg/ml

0,388

0,01 µg/ml

0,094

0,005 µg/ml

0,059

IgG M22

10 µg/ml

1,360

1 µg/ml

1,172

0,5 µg/ml

1,093

0,1 µg/ml

0,599

0,05 µg/ml

0,332

0,01 µg/ml

0,064

0,005 µg/ml

0,032

Véase la leyenda de la Tabla 12a para detalles. La unión de 5B3 y 4B4 (MAb humanos para ácido glutámico descarboxilasa; controles negativos) se muestra en la Tabla 12b.

Muestra de ensayo

ELISA de TSHR260-AP Inhibición de ELISA de la unión de TSH

Absorbancia media a 405 nm

conc. de TRAb1 (imagen302g/ml) conc. de TRAb2 (U/l) conc. de TRAb2 (U/l) Estimulación de la producción de AMP cíclico3 (pmol/ml)

HBD

0,003 0 0 0

S1

diluido 1:5

0,924 0,31 38,0 >40 37,2

diluido 1:10

0,788 0,18 19,7 31,1

diluido 1:20

0,583 0,10 9,5 16,2

diluido 1:40

0,378 0,05 5,2 7,1

S2

diluido 1:5

0,740 0,17 17,9 36,0 47,6

diluido 1:10

0,595 0,10 9,8 23,6

diluido 1:20

0,407 0,06 5,7 13,6

diluido 1:40

0,235 0,03 2,9 6,6

S3

diluido 1:5

0,868 0,25 28,5 >40 35,9

diluido 1:10

0,651 0,12 11,8 34,0

diluido 1:20

0,453 0,06 6,5 23,5

diluido 1:40

0,290 0,04 3,8 12,2

S4

imagen303

Muestra de ensayo

ELISA de TSHR260-AP Inhibición de ELISA de la unión de TSH

Absorbancia media a 405 nm

conc. de TRAb1 (imagen304g/ml) conc. de TRAb2 (U/l) conc. de TRAb2 (U/l) Estimulación de la producción de AMP cíclico3 (pmol/ml)

diluido 1:5

0,646 0,11 11,6 19,8 107,5

diluido 1:10

0,362 0,05 4,9 7,6

diluido 1:20

0,171 0,02 2,0 3,1

diluido 1:40

0,080 0,01 1,0 1,4

S5

diluido 1:5

0,407 0,06 5,7 9,4 40,6

diluido 1:10

0,221 0,03 2,7 4,4

diluido 1:20

0,109 0,01 1,3 2,1

diluido 1:40

0,059 0,01 0,9 1,1

S6

diluido 1:5

0,531 0,08 8,2 19,9 43,5

diluido 1:10

0,363 0,05 5,0 9,2

diluido 1:20

0,213 0,03 2,6 4,7

diluido 1:40

0,124 0,02 1,5 2,0

Véase leyenda de la Tabla 12a para detalles. Lectura de la curva de calibración de IgG M22 (se procesó 0,005, 0,001, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0 y 10 µg/ml en cada ensayo). 2Las unidades son NIBSC 90/672. ·3Se ensayó la estimulación de la producción de AMP cíclico (suero diluido 1:10 en tampón de AMP cíclico hipotónico) usando células CHO que expresan el TSHR de longitud completa. S1 = suero 1 de paciente estimulante de TSHR, S2 = suero 2 de paciente estimulante de TSHR, S3 = suero 3 de paciente estimulante de TSHR, S4 = suero 4 de paciente estimulante de TSHR, S5 = suero 5 de paciente estimulante de TSHR, S6 = suero 6 de paciente estimulante de TSHR. Se realizaron diluciones del suero para ambos ELISA en HBD.

Muestra de ensayo

ELISA de TSHR260-AP Nivel de TRAb medido en ensayo de tubo recubierto con TSHR

Diluido en HBD

Diluido en tampón de ensayo

Absorbancia media a 405 nm

Absorbancia media a 405 nm

% de inhibición de la unión de 125I-TSH U/l

B1

no diluido

0,859 0,859 NT NT

diluido1:10

0,484 0,667 73 16,8

diluido1:20

0,284 0,457 45 4,3

diluido1:40

0,154 0,243 22 1,4

diluido1:80

0,078 0,119 4 0,1

diluido1:160

0,037 0,062 0 0

diluido1:320

0,021 0,032 NT NT

B2

no diluido

0,323 0,323 NT NT

diluido1:10

0,097 0,165 82 25,6

diluido1:20

0,052 0,114 70 14,6

diluido1:40

0,029 0,063 47 4,5

diluido1:80

0,015 0,036 23 2

diluido1:160

0,008 0,018 9 0,7

diluido1:320

0,007 0,014 NT NT

B3

diluido1:10

0,896 1,061 85a NT

diluido1:20

0,588 0,768 73a NT

imagen305

Muestra de ensayo

ELISA de TSHR260-AP Nivel de TRAb medido en ensayo de tubo recubierto con TSHR

Diluido en HBD

Diluido en tampón de ensayo

Absorbancia media a 405 nm

Absorbancia media a 405 nm

% de inhibición de la unión de 125I-TSH U/l

diluido1:40

0,320 0,443 51a NT

diluido1:80

0,168 0,218 34a NT

diluido1:160

0,091 0,104 22a NT

diluido1:320

0,041 0,054 13a NT

B4

diluido1:10

0,729 0,826 94a NT

diluido1:20

0,612 0,734 91a NT

diluido1:40

0,453 0,592 80a NT

diluido1:80

0,270 0,353 55a NT

diluido1:160

0,141 0,153 33a NT

diluido1:320

0,068 0,066 17a NT

B5

diluido1:10

0,772 0,910 98 >40

diluido1:20

0,652 0,835 97 >40

diluido1:40

0,470 0,735 95 >40

diluido1:80

0,291 0,522 90 36,2

diluido1:160

0,155 0,276 76 12,0

diluido1:320

0,077 0,130 45 3,0

Véase leyenda de la Tabla 12a para detalles. NT = no ensayado. B1 = Suero 1 de paciente de bloqueo de TSHR (suero de donante de linfocitos K1). B2 = Suero 2 de paciente de bloqueo de TSHR, B3 = TSHR Suero 3 de paciente de bloqueo de TSHR, B4 = Suero 4 de paciente de bloqueo de TSHR, B5 = Suero 5 de paciente de bloqueo de TSHR. Se realizaron diluciones en suero en HBD o tampón de ensayo. ªLa inhibición de la unión de 125I-TSH se llevó a cabo usando el ensayo de precipitación de PEG (Southgate K, Creagh F, Teece M, Kingwood C, Rees Smith B. A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted Suero. Clin Endocrinol 1984; 20: 539548).

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm Concentración de TRAb leída de la curva de calibración de IgG M22 (imagen306g/ml) Concentración de TRAb en ELISA de TSHR260-AP (U/l) Concentración de TRAb en ensayo de tubo recubierto con TSHR (U/l)

Suero 1

0,06 0,007 0,7 1,0

Suero 2

0,072 0,008 0,9 1,0

Suero 3

0,067 0,008 0,8 1,1

Suero 4

-0,004 0,000 0 1,1

Suero 5

0,38 0,052 5,2 1,2

Suero 6

0,099 0,012 1,2 1,2

Suero 7

0,051 0,006 0,6 1,2

Suero 8

0,113 0,014 1,3 1,4

Suero 9

0,07 0,008 0,8 1,4

Suero 10

0,157 0,019 1,9 1,5

Suero 11

0,191 0,025 2,5 2,0

Suero 12

0,157 0,019 1,9 2,1

Suero 13

0,23 0,029 2,9 2,2

Suero 14

0,047 0,006 0,7 2,7

Suero 15

0,198 0,026 2,6 2,7

Suero 16

0,238 0,032 3,2 3,0

Suero 17

0,296 0,041 4,1 3,0

imagen307

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm Concentración de TRAb leída de la curva de calibración de IgG M22 (imagen308g/ml) Concentración de TRAb en ELISA de TSHR260-AP (U/l) Concentración de TRAb en ensayo de tubo recubierto con TSHR (U/l)

Suero 18

0,322 0,042 4,3 3,6

Suero 19

0,326 0,043 4,3 3,7

Suero 20

0,088 0,011 1,1 4,7

Suero 21

0,005 <0,005 <0,6 5,1

Suero 22

0,383 0,056 5,5 5,1

Suero 23

0,211 0,026 2,6 5,7

Suero 24

0,461 0,071 7 6,4

Suero 25

0,453 0,067 6,6 6,6

Suero 26

0,295 0,038 3,8 6,7

Suero 27

0,419 0,062 6,2 7,1

Suero 28

0,363 0,050 5 8,1

Suero 29

0,526 0,086 8,6 8,5

Suero 30

0,611 0,112 11,3 11,8

Suero 31

0,49 0,077 7,7 14,3

Suero 32

0,621 0,116 11,7 16,9

Suero 33

0,696 0,150 15,6 17,8

Suero 34

0,592 0,104 10,4 19,0

Suero 35

0,832 0,259 30,4 21,1

Suero 36

0,78 0,222 24,5 21,2

Suero 37

0,782 0,224 24,6 21,5

Suero 38

0,754 0,196 21,1 21,7

Suero 39

1,008 1,375 >61 26,2

Suero 40

-0,008 0 0 0

Suero 41

-0,005 0 0 0

Suero 42

-0,006 0 0 0

Suero 43

-0,004 0 0 0

Suero 44

-0,007 0 0 0

Suero 45

-0,007 0 0 0

Suero 46

-0,002 <0,005 <0,6 0

Suero 47

-0,001 0 0 0

Suero 48

0,0095 <0,005 <0,6 0

Suero 49

-0,002 0 0 0

Suero 50

0,003 0 0 0

Suero 51

0,005 <0,005 <0,6 0

Suero 52

0,008 <0,005 <0,6 0

Suero 53

-0,003 0 0 0

Suero 54

-0,005 0 0 0

Suero 55

-0,006 0 0 <1

Suero 56

0,0065 <0,005 <0,6 0

Suero 57

-0,004 0 0 0

Suero 58

0,001 0 0,0 <1

Suero 59

0,041 0,005 0,6 0

Véase leyenda de la Tabla 12a para detalles. Los sueros 1-39 son de pacientes a los que se ha diagnosticado o se sospecha que tienen enfermedad de Graves. Los sueros 1-39 fueron positivos para TRAb en el ensayo de tubo recubierto (basado en la inhibición de la unión de 125I con TSHR de longitud completa que recubre los tubos). Los sueros 40-59 fueron de donantes de sangre sanos y fueron negativos para TRAb en el ensayo de tubo recubierto.

imagen309

Tabla 12h Medición de TRAb en suero por la inhibición de la unión de M22-peroxidasa con el TSHR260 en un ELISA

Muestra de ensayo

ELISA de TRAb (TSHR de longitud completa que recubre placas) ELISA de TRAb (TSHR260 que recubre placas)

Absorbancia media a 450 nm

% de inhibición de unión de TSH-biotina concentr. de TRAb (U/l) Absorbancia media a 450 nm % de inhibición de la unión de Fab M22peroxidasa concentr. de TRAb (U/l)

Suero 60

0,224 90 30,7 0,196 92 >40

Suero 61

0,514 77 15,2 0,569 77 14,7

Suero 62

0,605 73 12,4 0,470 81 24,7

Suero 63

1,555 30 2,1 1,109 55 3,7

Suero 64

1,639 26 1,7 1,208 51 3,1

Suero 65

1,488 33 2,4 1,341 45 2,4

Suero 66

1,267 43 3,6 0,706 71 8,5

Suero 67

1,066 52 5,1 0,908 63 5,3

Suero 68

1,341 40 3,1 0,704 71 8,6

Suero 69

1,414 37 2,7 0,764 69 7,3

Suero 70

0,704 68 10,0 0,797 67 6,7

Suero 71

1,691 24 1,5 0,797 67 6,7

Suero 72

2,404 -8 0 2,791 -14 0

Suero 73

2,203 1 0,1 2,509 -3 0

Suero 74

2,228 0 0,1 2,737 -12 0

Suero 75

2,274 -2 0 2,758 -13 0

Suero 76

2,178 2 0,2 2,215 10 0,3

Suero 77

2,292 -3 0 2,152 12 0,3

Suero 78

2,425 -9 0 2,676 -9 0

Suero 79

2,397 -8 0 3,363 -37 0

Suero 80

2,410 -8 0 2,905 -19 0

Suero 81

2,148 4 0,2 2,523 -3 0

Los sueros 60-71 son de pacientes a los que se ha diagnostico o se sospecha que tienen enfermedad de Graves. Los sueros 60-71 fueron positivos para TRAb en el ensayo de tubo recubierto (basado en la inhibición de la unión de125I-TSH con TSHR de longitud completa que recubre los tubos). Los sueros 72-81 fueron de donantes de sangre sanos que fueron negativos para TRAb en el ensayo de tubo recubierto.

Tabla 12i Capacidad de los MAb de TSHR para unirse con TSHR de tipo silvestre de longitud completa y TSHR Arg255 Asp que recubre pocillos de una placa de ELISA. TSHR260-AP usado para detectar la unión de MAb

TSHR de tipo silvestre

TSHR Arg255 Asp

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm Absorbancia media a 405 nm

HBD

0,003 0,005

IgG K1-70

10 µg/ml

1,324 1,357

1 µg/ml

1,164 1,141

0,5 µg/ml

1,083 0,998

0,1 µg/ml

0,639 0,322

0,05 µg/ml

0,388 0,146

0,01 µg/ml

0,094 0,021

0,005 µg/ml

0,059 0,008

IgG M22

10 µg/ml

1,360 0,551

1 µg/ml

1,172 0,340

0,5 µg/ml

1,093 0,262

imagen310

TSHR de tipo silvestre

TSHR Arg255 Asp

Muestra de ensayo

Absorbancia media a 405 nm Absorbancia media a 405 nm

0,1 µg/ml

0,599 0,050

0,05 µg/ml

0,332 0,017

0,01 µg/ml

0,064 -0,002

0,005 µg/ml

0,032 -0,007

IgG K1-18

10 µg/ml

1,187 1,111

1 µg/ml

0,986 0,888

0,5 µg/ml

0,876 0,710

0,1 µg/ml

0,452 0,176

0,05 µg/ml

0,301 0,099

0,01 µg/ml

0,072 0,014

0,005 µg/ml

0,038 0,002

IgG 9D33

10 µg/ml

0,481 0,534

1 µg/ml

0,329 0,322

0,5 µg/ml

0,273 0,242

0,1 µg/ml

0,102 0,053

0,05 µg/ml

0,056 0,020

0,01 µg/ml

0,011 -0,004

0,005 µg/ml

0,006 0,001

Véase leyenda de la Tabla 12a para detalles. Se realizaron diluciones en suero en HBD.

Tabla 12j Capacidad de los sueros de los pacientes para unirse con TSHR de longitud completa de tipo silvestre y TSHR Arg255 Asp que recubre pocillos de placas de ELISA. Se usó TSHR260-AP para detector la unión

Muestra de ensayo

TSHR de tipo silvestre TSHR Arg255 Asp nivel de TRAb en ensayo de tubo recubierto con TSHR

Absorbancia media a 405 nm

imagen311g/ml (leído de la calibración de IgG K1-70) Absorbancia media a 405 nm imagen312g/ml (leído de la calibración de IgG K1-70) U/l

Sueros de los pacientes

Suero 1

0,707 0,121 0,558 0,176 14,7

Suero 2

0,798 0,159 0,677 0,227 17,1

Suero 3

0,647 0,102 0,237 0,076 8,1

Suero 4

0,692 0,116 0,585 0,187 12,3

Suero 5

0,560 0,081 0,169 0,057 9,9

Suero 6

0,278 0,034 0,096 0,036 5,9

Suero 7

0,388 0,050 0,167 0,056 5,6

Suero 8

0,367 0,047 0,112 0,040 8,3

Suero 9

0,198 0,023 0,074 0,029 11,3

Suero 10

0,788 0,154 0,447 0,137 17

HBD

0,003 0 0,005 0 0

Véase leyenda de la Tabla 12a para detalles. Los sueros 1-10 son de pacientes con niveles de TRAb detectables en el ensayo de tubo recubierto. Se procesó una curva de calibración usando IgG K1-70 (0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0 y 10 µg/ml) en cada ensayo.

imagen313

Tabla 12k Capacidad de los sueros de los pacientes con actividad de bloqueo de TSHR para unirse con TSHR de tipo silvestre de longitud completa y TSHR Arg255 Asp que recubre pocillos de placas de ELISA. Se usó TSHR260-AP para detectar la unión Tabla 12l Capacidad de los sueros de los pacientes con actividad estimulante de TSHR para unirse con TSHR de tipo silvestre de longitud completa y TSHR Arg255 Asp que recubre pocillos de placas de ELISA. Se usó TSHR260-AP para detectar la unión Tabla 13a Sumario de las propiedades de MAb estimulante K1-18 (IgG1 kappa)

Muestra de ensayo

ELISA de TSHR260-AP

TSHR de tipo silvestre

TSHR Arg255 Asp

Absorbancia media a 405 nm

imagen314g/ml de IgGª leído de la calibración de IgG M22) Absorbancia media a 405 nm imagen315g/ml de IgGb leído de la calibración de IgG K1-70)

Suero 1

no diluido

0,859 0,30 0,879 0,47

1:10

0,484 0,09 0,202 0,08

1:20

0,284 0,05 NT NT

1:40

0,154 0,02 NT NT

1:50

NT NT 0,027 0,02

1:80

0,078 0,01 NT NT

1:100

NT NT 0,015 0,02

1:160

0,037 0,01 NT NT

1:320

0,021 0,00 NT NT

Suero 2

no diluido

0,323 0,05 0,274 0,11

1:10

0,097 0,02 0,021 0,02

1:20

0,052 0,01 NT NT

1:40

0,029 0,00 NT NT

1:50

NT NT 0,005 0,00

1:80

0,015 0,00 NT NT

1:100

NT NT 0,009 0,00

1:160

0,008 0,00 NT NT

1:320

0,007 0,00 NT NT

Suero 3

1:10

0,896 0,46 0,510 0,19

1:20

0,588 0,13 NT NT

1:40

0,320 0,06 NT NT

1:50

NT NT 0,056 0,04

1:80

0,168 0,03 NT NT

1:100

NT NT 0,020 0,02

1:160

0,091 0,02 NT NT

1:320

0,041 0,01 NT NT

Suero 4

1:10

0,729 0,21 0,639 0,25

1:20

0,612 0,14 NT NT

1:40

0,453 0,08 NT NT

1:50

NT NT 0,107 0,05

1:80

0,270 0,05 NT NT

1:100

NT NT 0,040 0,03

1:160

0,141 0,02 NT NT

1:320

0,068 0,01 NT NT

Suero 5

1:10

0,772 0,21 0,536 0,2

1:20

0,652 0,14 NT NT

1:40

0,470 0,08 NT NT

1:50

NT NT 0,114 0,06

imagen316

Muestra de ensayo

ELISA de TSHR260-AP

TSHR de tipo silvestre

TSHR Arg255 Asp

Absorbancia media a 405 nm

imagen317g/ml de IgGª leído de la calibración de IgG M22) Absorbancia media a 405 nm imagen318g/ml de IgGb leído de la calibración de IgG K1-70)

1:80

0,291 0,05 NT NT

1:100

NT NT 0,035 0,03

1:160

0,155 0,03 NT NT

1:320

0,077 0,01 NT NT

Véase leyenda de la Tabla 12a para detalles. NT = no ensayado. Suero 1 = Suero de donante de linfocitos K1. Suero 2 = Suero de paciente con autoanticuerpos de bloqueo de TSHR. Suero 3 = Suero de paciente con autoanticuerpos de bloqueo de TSHR. Suero 4 = Suero de paciente con autoanticuerpos de bloqueo de TSHR. Suero 5 = Suero de paciente con autoanticuerpos de bloqueo de TSHR. Se realizaron diluciones de suero en HBD. aSe procesó una curva de calibración usando IgG M22 (0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0 y 10 µg/ml) en cada ensayo. bSe procesó una curva de calibración usando IgG K1-70 (0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0 y 10 µg/ml) en cada ensayo.

Muestra de ensayo

ELISA de TSHR260-AP

TSHR de tipo silvestre

TSHR Arg255 Asp

Absorbancia media a 405 nm

imagen319g/ml de IgGª leído de la calibración de IgG M22 Absorbancia media a 405 nm imagen320g/ml de IgGb leído de la calibración de IgG K1-70

HBD

0,003 0 -0,01 0

S1

diluido 1:5

0,924 0,31 0,66 0,26

diluido 1:10

0,788 0,18 0,40 0,15

diluido 1:20

0,583 0,10 0,19 0,08

diluido 1:40

0,378 0,05 0,09 0,04

S2

diluido 1:5

0,740 0,17 0,50 0,19

diluido 1:10

0,595 0,10 0,26 0,10

diluido 1:20

0,407 0,06 0,12 0,05

diluido 1:40

0,235 0,03 0,05 0,03

S3

diluido 1:5

0,868 0,25 0,75 0,32

diluido 1:10

0,651 0,12 0,74 0,16

diluido 1:20

0,453 0,06 0,21 0,09

diluido 1:40

0,290 0,04 0,10 0,04

S4

diluido 1:5

0,646 0,11 0,19 0,08

diluido 1:10

0,362 0,05 0,07 0,04

diluido 1:20

0,171 0,02 0,02 0,02

diluido 1:40

0,080 0,01 0,00 0,01

S5

diluido 1:5

0,407 0,06 0,13 0,06

diluido 1:10

0,221 0,03 0,04 0,02

diluido 1:20

0,109 0,01 0,01 0,01

diluido 1:40

0,059 0,01 0,01 0,01

S6

diluido 1:5

0,531 0,08 0,34 0,13

diluido 1:10

0,363 0,05 0,16 0,07

imagen321

Muestra de ensayo

ELISA de TSHR260-AP

TSHR de tipo silvestre

TSHR Arg255 Asp

Absorbancia media a 405 nm

imagen322g/ml de IgGª leído de la calibración de IgG M22 Absorbancia media a 405 nm imagen323g/ml de IgGb leído de la calibración de IgG K1-70

diluido 1:20

0,213 0,03 0,06 0,03

diluido 1:40

0,124 0,02 0,03 0,02

Véase leyenda de la Tabla 12a para detalles. Se realizaron diluciones de suero en HBD. Los sueros S1-S6 son los mismos sueros mostrados en Tabla 12e. aSe procesó una curva de calibración usando IgG M22 (0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0 y 10 µg/ml) en cada ensayo. bSe procesó una curva de calibración usando IgG K1-70 (0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0 y 10 µ 

Afinidad de unión con TSHR

IgG 0,7 x 1010 l/mol

Fab

0,13 x 1010 l/mol

Inhibición de la unión de 125I-TSH con el TSHR

IgG (1 µg/ml) 94 % 181 unidades/mg (NIBSC 90/672) Tabla 1a Tabla 2b

Fab (1 µg/ml)

77 % 86 unidades/mg (NIBSC 90/672) Tabla 2a Tabla 2b

Inhibición de la unión de TSH-biotina con el TSHR

IgG (1 µg/ml) 96 % Tabla 3a

Fab (1 µg/ml)

93 % Tabla 3b

Inhibición de la unión de Fab M22 peroxidasa con el TSHR

IgG (1 µg/ml) 95 % Tabla 4a

Fab (1 µg/ml)

88 % Tabla 4b

Estimulación de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR

IgG (100 ng/ml) 40x basal 155 unidades/mg (NIBSC 90/672) Tabla 6a Tabla 6c

Fab (100 ng/ml)

35x basal 22 unidades/mg (NIBSC 90/672) Tabla 6a Tabla 6c

Unión con 260-AP TSHR

IgG (1 µg/ml) DO405 = 0,578 Tabla 12a

Regiones V

Cadena pesada (IgG1) VH5-51*01 D3-16*02 (D3-16*01) J3*02 Figura 3a y Figura 3c

Cadena ligera (kappa)

V3-20*01 JK-1*01 Figura 4a y Figura 4c

Tabla 13b Sumario de las propiedades de MAb K1-70 de bloqueo (IgG1 lambda) Tabla 14a Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp43 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

Afinidad de unión con TSHR

IgG 3,9 ± 6 0,8 x 1010 l/mol

Inhibición de la unión de 125I-TSH con el TSHR

IgG (1 µg/ml) 92 % 166 unidades/mg (NIBSC 90/672) Tabla 1b y Tabla 2c

Fab (1 µg/ml)

92 % Tabla 1b

Inhibición de la unión de TSH-biotina con el TSHR

IgG (1 µg/ml) 97 % Tabla 3d Tabla 3d

Fab (1 µg/ml)

97 % Tabla 3d

Inhibición de la unión de Fab M22 peroxidasa con el TSHR

IgG (1 µg/ml) 96 % Tabla 4c

Fab (1 µg/ml)

96 % Tabla 4c

Estimulación de AMP cíclico mediada por TSH de bloqueo en células CHO que expresan TSHR

IgG (1 µg/ml) 94 % Tabla 7b

imagen324

Fab (1 µg/ml)

94 % Tabla 7b

Unión con TSHR 260-AP

IgG (1 µg/ml) DO405 = 0,677 Tabla 12a

Regiones V

Cadena pesada (IgG1) VH5-51*01 D1-7*01 J4*02 Figura 5a y Figura 5c

Cadena ligera (lambda)

LV1-51*01 LJ7*01 Figura 6c

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen325 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,52 ± 0,23 2,60 ± 0,33 103

K1-18

0,3 ng/ml

3,84 ± 0,42 3,35 ± 0,20 87

1 ng/ml

7,35 ± 0,07 5,53 ± 0,15 75

3 ng/ml

17,04 ± 0,62 11,59 ± 0,42 68

10 ng/ml

37,74 ± 0,67 26,69 ± 1,57 71

30 nq/ml

51,46 ± 2,52 40,80 ± 0,74 79

100 ng/ml

57,08 ± 4,79 48,50 ± 4,25 85

TSH

0,01 ng/ml

2,85 ± 0,08 2,84 ± 0,14 100

0,03 ng/ml

3,81 ± 0,06 4,30 ± 0,10 113

0,1 ng/ml

8,70 ± 0,49 10,35 ± 2,47 119

0,3 ng/ml

22,78 ± 1,49 19,69 ± 1,60 86

1 ng/ml

46,09 ± 0,00 39,56 ± 0,31 86

3 ng/ml

54,16 ± 3,56 47,87 ± 0,09 88

Los resultados mostrados son la media ± DT de determinaciones por triplicado. Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón de ensayo AMP cíclico hipotónico.

Tabla 14b Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Ile60 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14c Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu61 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen326 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,00 ± 0,09 5,02 ± 1,03 502

K1-18

0,3 ng/ml

2,58 ± 0,33 7,76 ± 0,36 301

1 ng/ml

5,33 ± 0,59 10,94 ± 0,61 205

3 ng/ml

12,64 ± 2,43 23,29 ± 1,42 184

10 ng/ml

51,08 ± 11,46 44,53 ± 4,03 87

30 ng/ml

69,95 ± 3,59 57,58 ± 2,07 82

100 ng/ml

87,39 ± 6,54 67,02 ± 4,87 77

TSH

0,01 ng/ml

1,51 ± 0,49 5,40 ± 0,84 358

0,03 ng/ml

3,34 ± 1,14 5,93 ± 0,56 178

imagen327

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen328 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

0,1 ng/ml

5,58 ± 2,31 11,24 ± 1,18 201

0,3 nq/ml

29,97 ± 6,61 28,85 ± 1,39 96

1 ng/ml

64,61 ± 4,81 49,65 ± 5,10 77

3 ng/ml

73,22 ± 4,70 60,45 ± 7,70 83

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen329 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR Mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,47 ± 0,15 5,22 ± 0,71 355

K1-18

0,3 ng/ml

1,79 ± 0,19 6,02 ± 0,33 336

1 ng/ml

3,6 8 ± 0,26 8,45 ± 0,76 230

3 ng/ml

9,15 ± 0,43 15,04 ± 1,6 9 164

10 ng/ml

32,03 ± 0,84 34,30 ± 1,21 107

30 ng/ml

63,25 ± 0,99 55,51 ± 6,57 88

100 ng/ml

73,14 ± 1,81 81,13 ± 7,20 111

TSH

0,01 ng/ml

1,09 ± 0,28 5,12 ± 0,48 470

0,03 ng/ml

1,75 ± 0,06 6,46 ± 0,67 369

0,1 ng/ml

2,91 ± 0,16 7,88 ± 0,56 271

0,3 ng/ml

7,29 ± 0,10 13,74 ± 0,45 188

1 ng/ml

26,58 ± 1,60 34,30 ± 1,21 129

3 ng/ml

57,99 ± 3,45 63,63 ± 5,01 110

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles

Tabla 14d Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Thr104 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14e Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con His105 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14f Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp151 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen330 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,34 ± 0,29 3,56 ± 0,24 266

K1-18

0,3 ng/ml

2,95 ± 0,47 4,64 ± 0,14 157

1 ng/ml

6,14 ± 0,36 7,38 ± 0,38 120

3 ng/ml

14,80 ± 1,02 14,53 ± 1,12 98

10 ng/ml

39,45 ± 12,99 21,62 ± 16,74 55

30 ng/ml

68,16 ± 7,99 35,85 ± 26,65 53

100 ng/ml

83,92 ± 10,03 62,56 ± 6,94 75

TSH

imagen331

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen332 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

0,01 ng/ml

1,37 ± 0,21 2,58 ± 0,21 188

0,03 ng/ml

1,58 ± 0,10 3,20 ± 0,60 203

0,1 ng/ml

1,83 ± 0,88 3,64 ± 0,19 199

0,3 ng/ml

3,20** 5,38 ± 0,07 168

1 ng/ml

15,90 ± 0,95 15,80 ± 0,41 99

3 ng/ml

47,64 ± 6,10 34,47 ± 1,54 72

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,04 ± 0,26 3,70 ± 0,49 356

K1-18

0,3 ng/ml

4,94 ± 0,29 6,65 ± 0,23 135

1 ng/ml

9,47 ± 0,98 10,37 ± 1,18 110

3 ng/ml

26,53 ± 2,22 21,47 ± 3,41 81

10 ng/ml

54,89 ± 1,67 38,87 ± 3,69 71

30 ng/ml

79,51 ± 5,35 50,95 ± 3,65 64

100 ng/ml

78,3 ± 6,52 64,82 ± 5,61 83

TSH

0,01 ng/ml

2,10 ± 0,39 4,28 ± 0,18 204

0,03 ng/ml

4,48 ± 0,53 5,71 ± 0,77 127

0,1 ng/ml

10,27 ± 1,87 9,80 ± 0,53 95

0,3 ng/ml

35,72 ± 5,54 35,74 ± 1,21 100

1 ng/ml

71,99 ± 7,40 57,09 ± 2,53 79

3 ng/ml

79,18 ± 6,82 58,46 ± 0,86 74

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles. **determinación individual

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen333 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR Mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,02 ± 0,26 3,51 ± 0,31 173

K1-18

0,3 ng/ml

2,51 ± 0,14 3,91 ± 0,29 156

1 ng/ml

4,59 ± 0,48 4,99 ± 0,14 109

3 ng/ml

9,26 ± 0,49 10,42 ± 0,32 113

10 ng/ml

39,21 ± 2,49 27,25 ± 0,37 69

30 ng/ml

69,70 ± 5,97 51,22 ± 4,24 73

100 ng/ml

99,18 ± 3,6 3 78,03 ± 4,40 79

TSH

0,01 ng/ml

1,56 ± 0,28 4,80 ± 2,6 0 308

0,03 ng/ml

2,42 ± 0,39 3,55 ± 0,20 147

0,1 ng/ml

4,09 ± 0,79 4,82 ± 0,29 118

imagen334

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen335 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR Mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

0,3 ng/ml

11,44 ± 2,32 11,88 ± 2,77 104

1 ng/ml

45,6 2 ± 1,99 34,56 ±1,21 76

3 ng/ml

77,89 ± 8,17 58,28 ± 4,6 6 75

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen336 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,90 ± 0,61 5,93 ± 0,60 312

K1-18

0,3 ng/ml

4,01 ± 0,43 7,36 ± 0,35 184

1 ng/ml

9,64 ± 0,27 11,42 ± 2,31 118

3 ng/ml

20,53 ± 1,64 18,27 ± 0,51 89

10 ng/ml

54,20 ± 1,61 40,81 ± 7,12 75

30 ng/ml

81,74 ± 5,92 51,20 ± 5,41 63

100 ng/ml

79,82 ± 4,86 66,01 ± 5,14 83

TSH

0,01 ng/ml

2,96 ± 0,26 6,19 ± 0,36 209

0,03 ng/ml

5,36 ± 0,60 7,99 ± 1,12 149

0,1 ng/ml

14,33 ± 1,46 14,12 ± 0,67 99

0,3 ng/ml

43,55 ± 6,31 35,02 ± 4,18 80

1 ng/ml

73,50 ± 9,55 48,53 ± 6,40 66

3 ng/ml

80,67 ± 3,49 54,55 ± 3,53 68

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Tabla 14g Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu 57 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14h Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu178 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen337 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,89 ± 0,08 9,18 ± 0,08 485

K1-18

0,3 ng/ml

3,77 ± 0,18 11,44 ± 3,6 3 303

1 ng/ml

7,52 ± 0,26 9,76 ± 0,93 130

3 ng/ml

19,14 ± 0,40 9,31 ± 0,91 49

10 ng/ml

45,88 ± 1,10 14,37 ± 6 ,84 31

30 ng/ml

56,81 ± 5,21 11,01 ± 3,30 19

100 ng/ml

64,73 ± 5,17 9,39 ± 2,46 15

TSH

0,01 ng/ml

2,55 ± 0,32 11,48 ± 1,6 3 450

imagen338

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen339 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

0,03 ng/ml

3,56 ± 0,17 11,6 7 ± 1,56 328

0,1ng/ml

8,19 ± 0,96 13,43 ± 1,26 164

0,3 ng/ml

21,83 ± 0,73 25,78 ± 4,6 4 118

1 ng/ml

46,44 ± 3,10 40,14 ± 1,6 0 86

3 ng/ml

52,73 ± 2,18 60,81 ± 5,71 115

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen340 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,39 ± 0,21 9,71 ± 0,36 699

K1-18

0,3 ng/ml

3,10 ± 0,45 10,89 ± 0,67 351

1 ng/ml

7,67 ± 0,57 13,37 ± 0,56 174

3 ng/ml

19,48 ± 2,03 20,66* 106

10 ng/ml

56,35 ± 2,84 40,02* 71

30 ng/ml

72,19 ± 2,66 46,23 ± 1,87 64

100 ng/ml

77,30 ± 4,83 61,85 ± 3,91 80

TSH

0,01 ng/ml

1,99 ± 0,11 9,29 ± 1,00 467

0,03 ng/ml

4,84 ± 0,30 11,60 ± 0,21 240

0,1 ng/ml

12,93 ± 0,64 14,83 ± 2,25 115

0,3 ng/ml

47,70 ± 4,82 33,72 ± 3,43 71

1 ng/ml

79,36 ± 7,46 43,12 ± 1,05 54

3 ng/ml

74,89 ± 8,91 54,84 ± 4,58 73

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles. *media de duplicados.

Tabla 14i Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys183 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14j Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Tyr185 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14k Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Tyr206 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14l Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys209 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen341 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,23 ± 0,06 2,51 ± 0,63 113

K1-18

0,3 ng/ml

4,15 ± 0,47 2,40 ± 0,34 58

1 ng/ml

8,37 ± 2,15 2,20 ± 0,54 26

3 ng/ml

18,71 ± 2,79 3,05 ± 0,46 16

10 ng/ml

54,30 ± 2,14 2,35 ±0,77 4

30 ng/ml

89,01 ± 13,58 2,24 ±0,79 3

100 ng/ml

109,78 ± 16,33 2,30 ±0,72 2

imagen342

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen343 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

TSH

0,01 ng/ml

2,48 ± 0,32 4,08 ± 1,06 165

0,03 ng/ml

4,62 ± 0,25 7,18 ± 0,78 155

0,1 ng/ml

17,59 ± 8,60 19,10 ± 3,55 109

0,3 ng/ml

40,35 ± 5,38 51,68 ± 4,48 128

1 ng/ml

92,49 ± 2,61 93,34 ± 4,90 101

3 ng/ml

103,97 ± 13,32 106,27 ± 8,71 102

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen344 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,04 ± 0,15 3,02 ± 0,58 148

K1-18 (ng/ml)

0,3 ng/ml

3,69 ± 0,22 2,68 ± 0,19 73

1 ng/ml

7,76 ± 1,36 2,95 ± 0,51 38

3 ng/ml

22,97 ± 1,30 2,31 ± 0,50 10

10 ng/ml

55,05 ± 5,19 3,21 ± 0,80 6

30 ng/ml

97,56 ± 6,65 4,58 ± 0,63 5

100 ng/ml

120,10 ± 15,75 5,57 ± 1,20 5

TSH (ng/ml)

0,01 ng/ml

2,60 ± 0,30 3,33 ± 0,81 128

0,03 ng/ml

4,27 ± 0,38 3,85 ± 0,37 90

0,1 ng/ml

10,94 ± 1,68 8,36 ± 0,98 76

0,3 ng/ml

32,33 ± 2,26 21,15 ± 3,60 65

1 ng/ml

84,95 ± 2,47 37,84 ± 1,45 45

3 ng/ml

124,05 ± 7,70 42,9 ± 5,23 35

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,15 ± 0,04 4,23 ± 0,89 197

K1-18 (ng/ml)

0,3 ng/ml

7,38 ± 0,53 4,33 ± 0,20 59

1 ng/ml

7,51 ± 1,67 4,39 ± 0,45 58

3 ng/ml

28,12 ± 0,86 4,10 ± 0,68 15

10 ng/ml

50,76 ± 7,00 4,38 ± 1,82 9

30 ng/ml

89,92 ± 4,11 3,90 ± 1,06 4

100 ng/ml

105,22 ± 5,18 7,08 ± 0,31 7

TSH (ng/ml)

0,01 ng/ml

3,89 ± 0,51 3,82 ± 0,64 98

0,03 ng/ml

5,52 ± 0,31 5,60 ± 1,20 101

0,1 ng/ml

13,28 ± 0,63 12,32 ± 0,57 93

imagen345

0,3 ng/ml

35,35 ± 2,72 30,54 ± 3,00 86

1 ng/ml

82,08 ± 4,80 50,65 ± 1,32 62

3 ng/ml

91,67 ± 10,28 56,30 ± 6,87 61

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen346 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,50 ± 0,27 2,47 ± 0,13 165

K1-18

0,3 ng/ml

1,19 ± 1,22 2,68 ± 0,23 225

1 ng/ml

6,57 ± 0,16 3,11 ± 0,24 47

3 ng/ml

16,50 ± 1,42 1,75 ± 0,81 11

10 ng/ml

31,40 ± 14,65 8,14 ± 2,38 26

30 ng/ml

62,92 ± 1,83 15,07 ± 1,02 24

100 ng/ml

61,48 ± 14,14 20,32 ± 12,27 33

TSH

0,01 ng/ml

2,09 ± 0,51 1,74 ± 1,50 83

0,03 ng/ml

2,93 ± 0,48 3,64 ± 0,84 124

0,1 ng/ml

9,04 ± 0,73 8,40 ± 0,72 93

0,3 ng/ml

19,08 ± 12,79 19,83 ± 6,50 104

1 ng/ml

59,48 ± 1,26 38,98 ± 1,84 66

3 ng/ml

75,64 ± 2,36 46,68 ± 2,01 62

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,96 ± 0,19 4,35 ± 0,24 222

K1-18

0,3 ng/ml

5,09 ± 1,70 4,50 ± 0,37 88

1 ng/ml

7,69 ± 1,28 6,23 ± 0,55 81

3 ng/ml

18,47 ± 1,00 8,07 ± 0,28 44

10 ng/ml

55,94 ± 8,77 22,41 ± 2,17 40

30 ng/ml

69,92 ± 4,84 33,57 ± 1,65 48

100 ng/ml

85,46 ±15,91 45,40 ± 3,53 53

TSH

0,01 ng/ml

3,63 ± 1,30 4,90 ± 1,14 135

0,03 ng/ml

4,60 ± 0,31 6,64 ± 0,51 144

0,1 ng/ml

10,82 ± 0,50 19,25 ± 5,14 178

0,3 ng/ml

34,70 ± 5,34 38,33 ± 1,28 110

1 ng/ml

65,17 ± 6,68 60,87 ± 6,66 93

3 ng/ml

75,13 ± 8,64 73,06 ± 3,01 97

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

imagen347

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen348 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,97 ± 0,24 4,79 ± 0,77 243

K1-18

0,3 ng/ml

4,08 ± 0,19 5,52 ± 0,33 135

1 ng/ml

9,47 ± 0,42 8,07 ± 0,57 85

3 ng/ml

21,43 ± 1,03 12,65 ± 1,18 59

10 ng/ml

62,15 ± 8,08 32,55 ± 4,45 52

30 ng/ml

91,57 ± 5,64 43,71 ± 9,76 48

100 ng/ml

99,88 ± 10,13 69,49 ± 7,10 70

TSH

0,01 ng/ml

3,02 ± 0,62 5,16 ± 0,11 171

0,03 ng/ml

4,59 ± 0,54 5,87 ± 0,17 128

0,1 ng/ml

14,25 ± 1,09 9,27 ± 0,81 65

0,3 ng/ml

38,20 ± 6,84 24,27 ± 1,60 64

1 ng/ml

87,25 ± 1,51 39,31 ± 5,78 45

3 ng/ml

101,72 ± 11,82 63,25 ± 6,11 62

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Tabla 14m Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp232 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14n Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Gln235 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14o Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys250 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

Media de AMP cíclico producido ( imagen349 mol/ml) imagen350 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,02 ± 0,09 1,33 ± 0,21 66

K1-18

0,3 ng/ml

2,54 ± 0,06 0,99 ± 0,10 39

1 ng/ml

6,16 ± 0,44 1,31 ± 0,05 21

3 ng/ml

14,61 ± 0,83 1,80 ± 0,36 12

10 ng/ml

38,90 ± 1,79 3,61 ± 0,02 9

30 ng/ml

60,13 ± 3,16 8,21 ± 0,04 14

100 ng/ml

65,85 ± 1,99 16,17 ± 0,08 25

TSH

0,01 ng/ml

1,69 ± 0,21 1,40 ± 0,08 83

0,03 ng/ml

2,46 ± 0,20 2,16 ± 0,13 88

0,1 ng/ml

6,18 ± 0,69 5,39 ± 0,28 87

0,3 ng/ml

18,94 ± 0,29 15,11 ± 0,50 80

1 ng/ml

45,19 ± 3,19 31,85 ± 1,24 70

3 ng/ml

61,65 ± 5,29 40,95 ± 2,42 66

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,74 ± 1,29 2,80 ± 0,16 161

imagen351

Media de AMP cíclico producido ( imagen352 mol/ml) imagen353 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

K1-18

0,3 ng/ml

4,93 ± 0,61 2,86 ± 0,15 58

1 ng/ml

8,65 ± 0,84 3,53 ± 0,52 41

3 ng/ml

21,61 ± 0,47 4,78 ± 0,27 22

10 ng/ml

54,40 ± 0,93 1,76 ± 0,18 3

30 ng/ml

86,44 ± 6,25 3,79 ± 0,17 4

100 ng/ml

99,65 ± 10,16 6,49 ± 0,05 7

TSH

0,01 ng/ml

4,16 ± 1,96 2,58 ± 0,09 62

0,03 ng/ml

4,92 ± 0,92 4,10 ± 0,23 83

0,1 ng/ml

11,24 ± 1,01 9,44 ± 0,60 84

0,3 ng/ml

31,44 ± 1,09 23,47 ± 1,51 75

1 ng/ml

74,30 ± 2,40 44,35 ± 1,57 60

3 ng/ml

96,39 ± 4,85 62,02 ± 8,15 64

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen354 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

0,70 ± 0,09 1,98 ± 0,62 283

K1-18

0,3 ng/ml

1,80 ± 0,35 2,51 ± 0,43 139

1 ng/ml

4,34 ± 0,52 4,48 ± 0,64 103

3 ng/ml

9,25 ± 2,14 6,01 ± 1,95 65

10 ng/ml

33,66 ± 5,21 18,80 ± 1,99 56

30 ng/ml

79,70 ± 7,46 30,92 ± 2,83 39

100 ng/ml

74,66 ± 3,56 47,71 ± 1,54 64

TSH

0,01 ng/ml

1,09 ± 0,35 1,75 ± 0,00 161

0,03 ng/ml

2,31 ± 0,17 2,89 ± 0,03 125

0,1 ng/ml

6,54 ± 0,20 5,97 ± 1,62 91

0,3 ng/ml

26,48 ± 0,68 17,61 ± 0,48 67

1 ng/ml

67,72 ± 7,23 44,19 ± 18,05 65

3 ng/ml

83,50* 46,59 ± 8,21 56

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,85 ± 0,32 4,10 ± 0,42 222

K1-18

0,3 ng/ml

2,58 ± 0,21 4,27 ± 1,53 166

1 ng/ml

5,15 ± 0,85 7,30 ± 0,74 142

3 ng/ml

14,11 ± 0,27 12,33 ± 3,43 87

imagen355

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen356 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre  

10 ng/ml

32,68 ± 5,49 24,02 ± 3,07 74

30 ng/ml

58,74 ± 1,82 32,71 ± 2,05 56

100 ng/ml

66,70 ± 2,49 43,93 ± 0,41 66

TSH

0,01 ng/ml

1,9,3 ± 0,13 3,42 ± 0,30 177

0,03 ng/ml

2,75 ± 0,41 4,55 ± 0,24 165

0,1 ng/ml

7,25 ± 1,02 7,77 ± 1,16 107

0,3 ng/ml

25,26 ± 0,96 17,14 ± 0,56 68

1 ng/ml

50,96 ± 2,69 31,70 ± 1,10 62

3 ng/ml

69,68 ± 2,04 37,14 ± 1,16 53

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles. *media de duplicados.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen357 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,41 ± 0,87 6,48 ± 0,22 460

K1-18

0,3 ng/ml

3,20 ± 0,31 10,50 ± 0,55 328

1 ng/ml

8,57 ± 0,31 23,44 ± 6,81 274

3 ng/ml

27,68 ± 3,34 35,88 ± 0,55 130

10 ng/ml

54,04 ± 4,74 68,33 ± 5,39 126

30 ng/ml

85,58 ± 3,88 91,29 ± 2,75 107

100 ng/ml

81,79 ± 1,55 100,62 ± 8,66 123

TSH

0,01 ng/ml

4,00 ± 0,10 8,29 ± 0,69 207

0,03 ng/ml

6,66 ± 0,59 12,58 ± 0,44 189

0,1 ng/ml

19,66 ± 2,56 28,81 ± 3,56 147

0,3 ng/ml

44,98 ± 3,85 66,19 ± 0,67 147

1 ng/ml

75,67 ± 6,21 87,90 ± 5,38 116

3 ng/ml

87,19 ± 1,94 110,23 ± 9,68 126

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Tabla 14p Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu251 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14q Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg255 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen358 DT (n = 3))

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,22 ± 0,42 6,69 ± 2,73 548

K1-18

0,3 ng/ml

2,36 ± 0,37 6,85 ± 0,56 290

imagen359

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen360  )

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

1 ng/ml

6,40 ± 0,43 9,70 ± 1,01 152

3 ng/ml

19,16 ± 1,47 19,57 ± 1,63 102

10 ng/ml

55,42 ± 4,77 39,70 ± 4,02 72

30 ng/ml

84,02* 66,74 ± 3,34 79

100 ng/ml

111,09 ± 6,17 78,15 ± 0,89 70

TSH

0,01 ng/ml

1,64 ± 0,28 3,99 ± 0,94 243

0,03 ng/ml

2,67 ± 0,32 5,99 ± 2,43 224

0,1 ng/ml

9,75 ± 1,97 11,18 ± 1,33 115

0,3 ng/ml

33,26 ± 9,03 22,15 ± 3,42 67

1 ng/ml

77,73 ± 4,07 53,68 ± 1,90 69

3 ng/ml

109,36 ± 2,78 71,71* 66

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles. *media de duplicados.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen361 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,29 ± 1,04 4,37 ± 0,75 191

K1-18

0,3 ng/ml

4,64 ± 0,55 5,46 ± 0,19 118

1 ng/ml

8,87 ± 0,31 8,37 ± 0,20 94

3 ng/ml

18,48 ± 0,81 13,80 ± 1,77 75

10 ng/ml

55,33 ± 0,69 42,85 ± 1,72 77

30 ng/ml

73,94 ± 4,06 59,25 ± 2,70 80

100 ng/ml

79,57 ± 6,78 77,80 ± 4,90 98

TSH

0,01 ng/ml

2,94 ± 0,54 4,72 ± 0,33 161

0,03 ng/ml

4,82 ± 0,70 6,78 ± 0,49 141

0,1 ng/ml

9,25 ± 0,11 11,66 ± 0,75 126

0,3 ng/ml

36,20 ± 3,81 36,72 ± 3,56 101

1 ng/ml

69,17 ± 5,01 61,95 ± 3,97 90

3 ng/ml

88,05* 80,08 ± 0,72 91

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles. *media de duplicados.

Tabla 14r Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Thr275 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14s Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Trp258 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14t Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg274 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 14u Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp276 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen362 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP

1,01 ± 0,34 1,13 ± 0,45 112

imagen363

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen364 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

cíclico

K1-18

0,3 ng/ml

1,50 ± 0,68 1,54 ± 0,29 103

1 ng/ml

3,60 ± 0,36 2,69 ± 1,11 75

3 ng/ml

8,09 ± 0,45 7,13 ± 0,88 88

10 ng/ml

27,52 ± 3,28 20,22 ± 1,90 73

30 ng/ml

64,52 ± 1,71 39,26± 3,48 61

100 ng/ml

100,30 ± 2,04 81,11 ± 5,12 81

TSH

0,01 ng/ml

1,67 ± 0,27 1,50 ± 0,29 90

0,03 ng/ml

3,13 ± 0,68 2,92 ± 0,45 93

0,1 ng/ml

8,30 ± 0,37 7,65 ± 1,51 92

0,3 ng/ml

24,05 ± 2,75 25,30 ± 0,41 105

1 ng/ml

64,57 ± 3,16 60,69 ± 3,98 94

3 ng/ml

102,12 ± 9,89 88,24 ± 12,78 86

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen365 DT (n = 3)

Experimento 1

Tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

0,90 ± 0,08 2,05 ± 0,38 228

K1-18

0,3 ng/ml

2,29 ± 0,25 2,93 ± 0,39 128

1 ng/ml

5,47 ± 0,90 4,39 ± 0,24 80

3 ng/ml

15,27 ± 1,02 11,47 ± 0,72 75

10 ng/ml

45,65 ± 2,67 25,35 ± 2,59 56

30 ng/ml

70,22 ± 8,09 40,36 ± 0,00 57

100 ng/ml

77,74 ± 5,05 52,44 ± 4,72 67

TSH

0,01 ng/ml

1,22 ± 0,34 1,93 ± 0,24 158

0,03 ng/ml

1,85 ± 0,62 2,88 ± 0,09 156

0,1 ng/ml

4,89 ± 0,35 7,51 ± 1,57 154

0,3 ng/ml

17,37 ± 0,87 22,29 ± 3,45 128

1 ng/ml

52,88 ± 6 ,38 45,6 9 ± 7,63 86

3 ng/ml

70,6 3 ± 3,87 53,97 ± 3,81 76

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,45 ± 0,28 0,92 ± 0,21 63

K1-18

0,3 ng/ml

1,68 ± 0,21 1,53 ± 0,31 91

imagen366

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen367 DT (n = 3)

Experimento 1

Tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

1 ng/ml

5,21 ± 0,29 3,29 ± 0,75 63

3 ng/ml

15,99 ± 1,07 6,25 ± 0,22 39

10 ng/ml

41,40 ± 4,90 15,6 4 ± 0,90 38

30 ng/ml

77,09 ± 1,32 38,59 ± 1,52 50

100 ng/ml

106,57 ± 3,64 57,31 ± 2,41 54

TSH

0,01 ng/ml

2,02 ± 0,51 1,56 ± 0,18 77

0,03 ng/ml

1,96 ± 0,06 2,76 ± 0,71 141

0,1 ng/ml

4,49 ± 0,81 7,04 ± 0,83 156

0,3 ng/ml

13,47 ± 1,96 17,26 ± 4,12 128

1 ng/ml

43,24 ± 1,20 49,17 ± 5,52 114

3 ng/ml

84,76 ± 9,98 84,70* 100

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles. *media de duplicados.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen368 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,58 ± 0,21 1,71 ± 0,07 108

K1-18

0,3 ng/ml

1,75 ± 0,14 1,74 ± 0,17 99

1 ng/ml

3,17 ± 0,20 1,97 ± 0,82 62

3 ng/ml

10,91 ± 1,52 3,46 ± 0,07 32

10 ng/ml

28,17 ± 2,38 9,44 ± 0,80 34

30 ng/ml

71,50 ± 3,54 27,91 ± 1,72 39

100 ng/ml

96,37 ± 4,71 70,48 ± 5,61 73

TSH

0,01 ng/ml

1,86 ± 0,23 1,97 ± 0,06 106

0,03 ng/ml

3,32 ± 0,07 4,14 ± 1,36 125

0,1 ng/ml

14,60 ± 1,90 9,38 ± 0,23 64

0,3 ng/ml

48,54 ± 4,12 27,28 ± 1,62 56

1 ng/ml

91,18 ± 4,31 67,63 ± 0,93 74

3 ng/ml

118,63 ± 16,76 98,80 ± 7,10 83

Experimento 2

Tampón de ensayo de AMP cíclico

2,08 ± 0,14 1,65 ± 0,12 79

K1-18

0,3 ng/ml

2,70 ± 0,08 1,71 ± 0,13 63

1 ng/ml

5,96 ± 0,25 2,65 ± 0,20 44

3 ng/ml

14,95 ± 0 5,45 ± 0,28 36

10 ng/ml

51,80 ± 4,35 14,83 ± 1,86 29

30 ng/ml

81,16 ± 2,80 35,53 ± 0,93 44

imagen369

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen370 DT (n = 3)

Experimento 1

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

100 ng/ml

97,09 ± 10,91  ± 3,26 63

TSH

0,01 ng/ml

2,49 ± 0,39 1,37 ± 0,18 55

0,03 ng/ml

5,12 ± 0,22 2,94 ± 0,11 57

0,1 ng/ml

13,66 ± 1,00 8,29 ± 0,74 61

0,3 ng/ml

39,93 ± 2,47 25,47 ± 0,43 64

1 ng/ml

74,35 ± 5,04 58,49 ± 4,84 79

3 ng/ml

88,28 ± 15,49 73,19 ± 3,18 82

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen371 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,05 ± 0,23 13,94 ± 2,05 1328

K1-18

0,3 ng/ml

2,27 ± 0,23 17,17 ± 0,64 756

1 ng/ml

6,16 ± 0,90 23,79 ± 1,67 386

3 ng/ml

17,36 ± 0,80 32,67 ± 3,05 188

10 ng/ml

52,57 ± 0 56,94 ± 0,50 108

30 ng/ml

81,08 ± 11,47 65,05 ± 4,25 80

100 ng/ml

87,81 ± 14,82 86,02 ± 6,77 98

TSH

0,01 ng/ml

2,45 ± 0,68 14,29 ± 1,97 583

0,03 ng/ml

4,78 ± 0,57 17,64 ± 0,44 369

0,1 ng/ml

16,19 ± 0,95 21,70 ± 4,65 134

0,3 ng/ml

44,34 ± 6,02 45,58 ± 1,03 103

1 ng/ml

77,19 ± 4,48 68,31 ± 7,05 88

3 ng/ml

95,50 ± 7,45 76,02 ± 5,12 80

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

Tabla 14v Producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Ser281 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-18) con actividad agonista de TSH Tabla 15a Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp43 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15b Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Ile60 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K170) con actividad antagonista de TSH Tabla 15c Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu61 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15d Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Thr104 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen372 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico

1,72 ± 0,28 2,04 ± 0,29 119

K1-18 (ng/ml)

0,3 ng/ml

3,09 ± 0,17 3,62 ± 0,35 117

1 ng/ml

6,04 ± 0,42 7,01 ± 0,55 116

3 ng/ml

18,37 ± 1,19 15,23 ± 0,92 83

imagen373

Media de AMP cíclico producido (pmol/ml) imagen374 DT (n = 3)

TSHR de tipo silvestre

TSHR mutado Mutado/Tipo silvestre (%)

10 ng/ml

43,48 ± 0,76 31,25 ± 1,85 72

30 ng/ml

72,75 ± 5,88 55,19 ± 0,59 76

100 ng/ml

81,95 ± 2,57 65,22 ± 6,42 80

TSH (ng/ml)

0,01 ng/ml

2,03 ± 0,30 2,84 ± 0,06 140

0,03 ng/ml

3,65 ± 0,64 4,69 ± 0,05 128

0,1 ng/ml

9,65 ± 1,53 11,33 ± 0,62 117

0,3 ng/ml

31,40 ± 0,93 27,48 ± 2,15 88

1 ng/ml

61,04 ± 3,63 51,63 ± 0,54 85

3 ng/ml

82,58 ± 2,92 67,98 ± 2,73 82

Véase leyenda de la Tabla 14a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen375 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

3,57 ± 1,18 1,40 ± 0,04 39

TSHb

93,92 ± 3,88 ND ND

5B3 10 µg/ml + TSHb

106,48 ± 12,76 73,73 ± 6,47 69

5B3 100 µg/ml + TSHb

104,40 ± 2,12 57,99 ± 7,76 56

K1-70 0,001 µg + TSHb

109,98 ± 20,13 65,19 ± 11,37 59

K1-70 0,01 µg + TSHb

118,99 ± 3,21 61,42 ± 3,26 52

K1-70 0,1 µg + TSHb

82,87 ± 8,78 23,56 ± 12,03 28

K1-70 1,0 µg + TSHb

3,37 ± 0,81 1,82 ± 0,25 54

K1-70 10 µg + TSHb

2,05 ± 0,10 0,97 ± 0,16 47

K1-70 100 µg + TSHb

2,34 ± 0,18 1,16 ± 0,25 50

K1-70 100 µg

1,89 ± 0,12 1,64 ± 0,98 87

bTSH (2)

92,19 ± 5,64 60,27 ± 7,64 65

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 4

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

12 61

K1-70 1 µg/ml

96 97

K1-70 10 µg/ml

98 98

K1-70 100 µg/ml

98 98

bTSH (2)

2 0

ªMuestras de ensayo en tampón de AMP cíclico hipotónico, bconcentración final de TSH = 3 ng/ml. c% de inhibición = 100 x [1 – (AMP cíclico en presencia de muestras de ensayo y TSH/AMP cíclico en presencia de tampón de AMP

imagen376

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen377 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

cíclico y TSH)]. 5B3 es un anticuerpo monoclonal humano para GAD (control negativo para K1-70). ND = no determinado. TSH(2) = procesado al final del ensayo.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen378 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,78 ± 0,12 4,07 ± 0,08 229

TSHb

90,09 ± 1,19 51,32 ±3,85 57

5B3 10 µg/ml + TSHb

95,17 ± 4,45 54,77 ± 12,78 58

5B3 100 µg/ml + TSHb

88,16 ± 5,03 43,98 ± 3,05 50

K1-70 0,001 µg + TSHb

91,53 ± 28,48 42,91 ± 2,83 47

K1-70 0,01 µg + TSHb

92,89 ± 10,08 47,49 ± 2,80 51

K1-70 0,1 µg + TSHb

8,45 ± 0,58 44,85 ± 7,20 531

K1-70 1,0 µg + TSHb

2,39 ± 0,42 21,99 ± 1,61 920

K1-70 10 µg + TSHb

1,78 ± 0,21 10,90 ± 0,67 612

K1-70 100 µg + TSHb

1,54 ± 021 7,61 ± 0,53 494

K1-70 100 µg

1,12 ± 0,51 3,84 ± 0,56 343

bTSH (2)

82,90 ± 1,87 45,09 ± 0,90 54

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

2 14

K1-70 0,001 µg

0 16

K1-70 0,01 µg/ml

0 7

K1-70 0,1 µg/ml

91 13

K1-70 1 µg/ml

97 57

K1-70 10 µg/ml

98 79

K1-70 100 µg/ml

98 85

bTSH (2)

8 12

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen379 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,16 ± 0,21 5,06 ± 0,31 436

TSHb

81,69 ± 3,88 65,78 ± 5,98 81

5B3 10 µg/ml + TSHb

102,63 ± 13,71 54,69 ± 7,88 53

5B3 100 µg/ml + TSHb

107,64 ± 13,05 66,83 ± 6,83 62

K1-70 0,001 µg+ TSHb

93,21 ± 9,01 57,98 ± 6,22 62

K1-70 0,01 µg +TSHb

92,99 ± 6,39 58,40 ± 1,47 63

K1-70 0,1 µg + TSHb

4,12 ± 0,54 54,06 ± 5,59 1312

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,16 ± 0,09 14,82 ± 1,13 1278

imagen380

K1-70 10 µg + TSHb

1,85 ± 0,28 11,15 ± 2,09 603

K1-70 100 µg + TSHb

1,71 ± 0,56 7,87 ± 0,63 460

K1-70 100 µg

1,50 ± 0,25 4,13 ± 0,28 275

bTSH (2)

82,55 ± 7,76 56,96 ± 7,01 69

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 17

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 12

K1-70 0,01 µg/ml

0 11

K1-70 0,1 µg/ml

95 18

K1-70 1 µg/ml

99 77

K1-70 10 µg/ml

98 83

K1-70 100 µg/ml

98 88

bTSH (2)

0 13

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen381 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de AMP cíclico solamente

0,63 ± 0,27 1,49 ± 0,48 237

TSHb

115,33 ± 1,56 77,74 ± 6,57 67

5B3 10 µg/ml + TSHb

114,68 ± 8,12 77,87 ± 8,10 68

5B3 100 µg/ml + TSHb

127,08 ± 6,55 70,47 ± 2,85 55

K1-70 0,001 µg+TSHb

102,62 ± 6,91 72,39 ± 4,36 71

K1-70 0,01 µg + TSHb

109,66 ± 14,99 71,93 ± 9,10 66

K1-70 0,1 µg + TSHb

43,68 ± 13,73 54,35 ± 9,85 124

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,35 ± 0,08 1,18 ± 0,23 87

K1-70 10 µg + TSHb

1,25 ± 0,35 0,76 ± 0,23 60,8

K1-70 100 µg + TSHb

0,61 ± 0,46 0,91 ± 0,36 149

K1-70 100 µg

0,49 ± 0,47 1,69 ± 0,34 345

bTSH (2)

126,05 ± 6,29 64,74 ± 4,96 51

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

1 0

5B3 100 µg/ml

0 9

K1-70 0,001 µg

11 7

K1-70 0,01 µg/ml

5 7

K1-70 0,1 µg/ml

62 30

K1-70 1 µg/ml

99 98

K1-70 10 µg/ml

99 99

K1-70 100 µg/ml

99 99

imagen382

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen383 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

bTSH (2)

0 17

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen384 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de AMP cíclico solamente

0,89  0,29 1,36 ± 0,89 153

TSHb

83,78 ± 6,86 63,69 ± 1,38 76

5B3 10 µg/ml + TSHb

83,61 ± 3,29 59,13 ± 0,82 71

5B3 100 µg/ml + TSHb

88,04 ± 5,58 60,01 ± 3,04 68

K1-70 0,001 µg + TSHb

90,15 ± 15,94 64,74 ± 6,20 72

K1-70 0,01 µg + TSHb

92,33 ± 8,48 54,64 ± 1,42 59

K1-70 0,1 µg + TSHb

34,13 ± 3,95 24,89 ± 3,39 73

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,58 ± 0,16 2,55 ± 0,11 161

K1-70 10 µg + TSHb

1,07 ± 0,33 2,15 ± 1,06 201

K1-70 100 µg + TSHb

1,19 ± 0,35 1,86 ± 0,06 156

K1-70 100 µg

0,74 ± 0,30 1,48 ± 0,13 200

bTSH (2)

83,61 ± 3,30 57,01 ± 1,62 68

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 7

5B3 100 µg/ml

0 6

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 14

K1-70 0,1 µg/ml

59 61

K1-70 1 µg/ml

98 96

K1-70 10 µg/ml

99 97

K1-70 100 µg/ml

99 97

bTSH (2)

0,2 10

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Tabla 15e Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con His105 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15f Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp151 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15g Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp160 mutado a Lys. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen385 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,64 ± 0,08 0,99 ± 0,06 155

TSHb

93,59 ± 6,12 65,93 ± 4,03 70

5B3 10 µg/ml + TSHb

91,63 ± 10,00 75,20 ± 5,73 82

5B3 100 µg/ml + TSHb

133,84 ± 27,40 66,67 ± 1,51 50

imagen386

K1-70 0,001 µg + TSHb

135,86 ± 3,01 89,32 ± 7,04_ 66

K1-70 TSHb

119,40 ± 22,33 82,69 ± 6,53 69

K1-70 0,1 µg + TSHb

24,43 ± 4,03 10,46 ± 2,84 43

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,34 ± 0,26 1,47 ± 0,40 110

K1-70 10 µg + TSHb

1,96 ± 2,03 0,70 ± 0,16 36

K1-70 100 µg + TSHb

0,70 ± 0,24 0,80 ± 0,24 114

K1-70 100 µg

0,89 ± 0,19 0,66 ± 0,13 74

bTSH (2)

116,74 ± 5,43 58,53 ± 2,95 50

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

2 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

74 84

K1-70 1 µg/ml

99 98

K1-70 10 µg/ml

98 99

K1-70 100 µg/ml

99 99

bTSH (2)

0 11

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen387 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,06 ± 0,22 2,03 ± 0,48 192

TSHD

74,09 ± 8,63 45,72 ± 0,43 62

5B3 10 µg/ml + TSHb

76,94 ± 7,67 40,70 ± 2,59 53

5B3 100 µg/ml + TSHb

81,59 ± 6,54 46,24 ± 1,77 57

K1-70 0,001 µg + TSHb

80,09 ± 1,95 45,85 ± 4,25 57

K1-70 0,01 µg + TSHb

80,41 ± 8,03 44,71 ± 2,24 56

K1-70 0,1 µg + TSHb

13,74 ± 6,49 10,24 ± 0,91 75

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,10 ± 0,24 2,04 ± 0,41 185

K1-70 10 µg + TSHb

1,21 ± 0,33 1,60 ± 0,35 132

K1-70 100 µg + TSHb

1,06 ± 0,54 1,68 ± 0,19 158

K1-70 100 µg

1,20 ± 0,13 1,72 ± 0,68 143

bTSH (2)

95,46 ± 17,64 41,53 ± 1,51 44

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 11

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 2

K1-70 0,1 µg/ml

81 78

imagen388

K1-70 1 µg/ml

99 96

K1-70 10 µg/ml

98 97

K1-70 100 µ 

99 96

bTSH (2)

0 9

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen389 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,71 ± 0,10 5,83 ± 0,11 821

M22b

65,25 ± 4,95 51,70 ± 2,57 79

5B3 10 µg/ml + M22b

75,97 ± 4,49 52,50 ± 4,25 69

5B3 100 µg/ml + M22b

76,92 ± 9,97 45,83 ± 3,53 60

K1-70 0,001 µg + M22b

88,89 ± 11,87 51,99 ± 6,36 58

K1-70 0,01 µg + M22b

81,52 ± 12,62 41,02 ± 6,06 50

K1-70 0,1 µg + M22b

10,95 ± 1,07 9,26 ± 2,35 85

K1-70 1,0 µg + M22b

0,46 ± 0,06 0,25 ± 0,06 54

K1-70 10 µg + M22b

0,63 ± 0,33 0,07 ± 0,08 11

K1-70 100 µg + M22b

0,52 ± 0,46 0,27 ± 0,12 52

K1-70 100 µg

1,00 ± 0,68 0,09 ± 0,06 9

bM22 (2)

71,04 ± 1,30 45,81 ± 5,56 64

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 11

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 21

K1-70 0,1 µg/ml

83 82

K1-70 1 µg/ml

99 99

K1-70 10 µg/ml

99 100

K1-70 100 µg/ml

99 99

bM22 (2)

0 11

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Tabla 15h Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu178 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen390 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de AMP cíclico solamente

0,35 ± 0,47 9,18 ± 0,59 2623

TSHb

52,9 ± 3,27 56,61 ± 6,05 107

563 10 µg/ml + TSHb

65,73 ± 1,11 57,61 ± 2,52 88

5B3 + TSHb

65,49 ± 4,50 57,04 ± 7,63 87

imagen391

K1-70 0,001 µg + TSHb

63,14 ± 5,08 45,91 ± 1,28 73

K1-70 0,01 µg + TSHb

60,67 ± 7,43 47,28 ± 2,68 78

K1-70 TSHb

6,32 ± 2,70 37,53 ± 7,25 594

K1-70 1,0 µg + TSHb

0,78 ± 0,64 6,96 ± 0,61 892

K1-70 10 µg + TSHb

0,66 ± 0,34 5,65 ± 0,22 856

+ TSHb

0,42 ± 0,22 6,80 ± 0,16 1619

K1-70 100 µg

0,01* 6,11 ± 0,14 61100

bTSH (2)

77,16 ± 8,61 50,08 ± 5,73 65

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 19

K1-70 0,01 µg/ml

0 16

K1-70 0,1 µg/ml

88 34

K1-70 1 µg/ml

99 88

K1-70 10 µg/ml

99 90

K1-70 100 µg/ml

99 88

bTSH

0 12

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen392 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,83 ± 0,13 6,13 ± 0,45 335

TSHb

87,25 ± 10,43 46,20 ± 2,13 53

5B3 10 µg/ml + TSHb

100,35 ± 7,09 54,97 ± 4,10 55

5B3 100 µg/ml + TSHb

98,11 ± 11,88 44,98 ± 4,80 46

K1-70 0,001 µg + TSHb

103,37 ± 16,45 49,40 ± 4,23 48

K1-70 0,01 µg + TSHb

96,22 ± 16,49 48,01 ± 5,37 50

K1-70 0,1 µg + TSHb

20,35 ± 9,35 30,71 ± 3,37 151

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,13 ± 0,62 5,78 ± 0,42 512

K1-70 10 µg + TSHb

1,43 ± 0,34 4,88 ± 0,15 341

K1-70 100 µg + TSHb

1,54 ± 0,24 4,84 ± 0,32 314

K1-70 100 µg

1,08 ± 0,32 3,73 ± 0,64 345

bTSH (2)

88,09 ± 7,60 44,11 ± 1,34 50

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 3

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

77 34

K1-70 1 µg/ml

99 87

K1-70 10 µg/ml

98 89

imagen393

K1-70 100 µg/ml

98 90

bTSH (2)

0 5

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Tabla 15i Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys183 mutada a Asp. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen394 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo  (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,83 ± 0,70 1,26 ± 0,02 152

TSHb

85,81 ± 4,18 117,28 ± 3,46 137

5B3 10 µg/ml + TSHb

93,70 ± 8,12 104,75 ± 8,56 112

5B3 100 µg/ml + TSHb

108,83 ± 3,13 127,83 ± 6,64 117

K1-70 0,001 µg + TSHb

90,69 ± 2,74 101,41 ± 11,08 112

K1-70 0,01 µg + TSHb

97,27 ± 2,97 101,74 ± 14,23 105

K1-70 0,1 µg + TSHb

69,05 ± 10,81 33,97 ± 2,51 49

K1-70 1,0 µg + TSHb

2,33 ± 0,54 3,04 ± 1,07 130

K1-70 10 µg + TSHb

1,74 ± 0,11 0,85 ± 0,38 49

K1-70 100 µg + TSHb

1,61 ± 0,27 0,98 ± 0,23_ 61

K1-70 100 µg

1,46 ± 0,16 0,84 ± 0,26 58

bTSH (2)

97,81 ± 21,58 93,44 ± 3,40 96

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 11

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 14

K1-70 0,01 µg/ml

0 13

K1-70 0,1 µg/ml

20 71

K1-70 1 µg/ml

97 97

K1-70 10 µg/ml

98 99

K1-70 100 µg/ml

98 99

bTSH (2)

0 20

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Tabla 15j Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Tyr185 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15k Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Tyr206 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15l Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys209 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen395 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,20 ± 0,46 2,17 ± 0,33 181

TSHb

100,81 ± 7,98 52,49 ± 3,51 52

5B3 10 µg/ml + TSHb

125,53 ± 9,18 47,02 ± 2,22 37

5B3 100 µg/ml + TSHb

97,32 ± 11,29 56,13 ± 6,76 58

K1-70 0,001 µg + TSHb

118,92 ± 0 5 1,39 ± 4,61 43

K1-70 0,01 µg + TSHb

120,80 ± 7,93 46,06 ± 1,89 38

imagen396

K1-70 0,1 µg + TSH 

15,05 ± 4,72 10,84 ± 2,53 72

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,30 ± 0,32 2,10 ± 0,52 162

K1-70 10 µg + TSHb

1,61 ± 0,80 1,64 ± 0,49 102

K1-70 100 µg + TSHb

1,38 ± 0,09 2,07 ± 0,62 150

K1-70 100 ng

1,30 ± 0,17 1,54 ± 0,39 118

bTSH

131,33 ± 9,02 41,01 ± 1,66 31,2

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 10

5B3 100 µg/ml

3 0

K1-70 0,001 µg

0 2

K1-70 0,01 µg/ml

0 12

K1-70 0,1 µg/ml

85 79

K1-70 1 µg/ml

99 96

K1-70 10 µg/ml

98 97

K1-70 100 µg/ml

99 96

bTSH (2)

0 22

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen397 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo AMP cíclico solamente

1,45 ± 0,33 2,33 ± 0,17 161

TSHb

92,20 ± 5,95 82,89 ± 7,13 90

5B3 10 µg/ml + TSHb

94,47 ± 3,74 74,63 ± 5,45 79

5B3 100 µg/ml + TSHb

101,41 ± 6,91 75,18 ± 4,79 74

K1-70 0,001 µg + TSHb

102,14 ± 23,36 68,25 ± 5,23 67

K1-70 0,01 µg + TSHb

92,18 ± 10,18 73,26 ± 6,48 79

K1-70 0,1 µg + TSHb

9,63 ± 0,78 7,55 ± 0,73 78

K1-70 1,0 µg + TSHb

2,01 ± 1,50 2,46 ± 0,55 122

K1-70 10 µg + TSHb

1,45 ± 0,19 2,18 ± 0,16 150

K1-70 100 µg + TSHb

1,62 ± 0,44 2,31 ± 0,08 143

K1-70 100 µg

1,44 ± 0,23 2,13 ± 0,38 148

bTSH (2)

107,85 ± 5,97 69,48 ± 2,42 64

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 10

5B3 100 µg/ml

0 9

K1-70 0,001 µg

0 18

K1-70 0,01 µg/ml

0 12

K1-70 0,1 µg/ml

90 91

K1-70 1 µg/ml

98 97

imagen398

K1-70 10 µg/ml

98 97

K1-70 100 µg/ml

98 97

bTSH (2)

0 16

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen399 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de AMP cíclico solamente

0,88 ± 0,03 2,14  0,56 243

TSHb

78,97 ± 8,73 57,94 ± 4,39 73

5B3 10 µg/ml + TSHb

76,61 ± 6,55 56,52 ± 4,26 74

5B3 100 µg/ml + TSHb

87,72 ± 5,48 55,93 ± 3,69 64

K1-70 0,001 µg + TSHb

97,83 ± 2,41 52,17 ± 7,95 53

K1-70 0,01 µg + TSHb

99,22* 42,31 ± 6,68 43

K1-70 0,1 mg + TSHb

9,58 ± 1,13 5,45 ± 2,69 57

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,36 ± 0,10 1,43 ± 0,13 105

K1-70 10 µg + TSHb

0,88 ± 0 1,37 ± 0,29 156

K1-70 100 µg + TSHb

0,98 ± 0,24 1,58 ± 0,10 161

K1-70 100 µg

0,81 ± 0,09 1,84 ± 0,32 227

bTSH (2)

91,50 ± 6,84 47,73 ± 3,41 52

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

3 2

5B3 100 µg/ml

0 3

K1-70 0,001 µg

0 10

K1-70 0,01 µg/ml

0 27

K1-70 0,1 µg/ml

88 91

K1-70 1 µg/ml

98 98

K1-70 10 µg/ml

99 98

K1-70 100 µg/ml

99 97

bTSH (2)

0 18

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Tabla 15m Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp232 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15n Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Gln235 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15o Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys250 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen400 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,93 ± 0,10 2,61 ± 0,62 135

TSHb

82,02 ± 7,26 57,02 ± 6,10 70

5B3 10 µg/ml + TSHb

86,80 ± 8,83 51,42 ± 3,83 59

5B3 100 µg/ml + TSHb

92,84 ± 3,94 53,61 ± 5,00 58

K1-70 0,001 µg + TSHb

96,66 ± 2,53 56,21 ± 2,78 58

imagen401

K1-70 0,01 µg + TSH 

93,85 ± 4,23 32,28 ± 7,68 34

K1-70 0,1 µg + TSHb

4,46 ± 1,38 2,98 ± 0,19 67

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,66 ± 0,13 2,03 ± 0,10 122

K1-70 10 µg + TSHb

1,71 ± 0,25 2,35 ± 0,21 137

K1-70 100 µg + TSHb

1,81 ± 0,34 2,62 ± 0,17 145

K1-70 100 µg

1,13 ± 0,97 2,18 ± 0,32 193

bTSH (2)

82,64 ± 7,95 62,58 ± 3,86 76

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 10

5B3 100 µg/ml

0 6

K1-70 0,001 µg

0 1

K1-70 0,01 µg/ml

0 43

K1-70 0,1 µg/ml

95 95

K1-70 1 µg/ml

98 96

K1-70 10 µg/ml

98 96

K1-70 100 µg/ml

98 95

bTSH (2)

0 0

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen402 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,55 ± 0,63 3,85 ± 0,62 248

TSHb

79,85 ± 5,00 55,54 ± 2,28 70

5B3 10 µg/ml + TSHb

80,10 ± 8,09 63,73 ± 3,15 80

5B3 100 µg/ml + TSHb

93,18 ± 7,43 58,27 ± 3,67 63

K1-70 0,001 µg + TSHb

75,94 ± 9,09 50,44 ± 3,80 66

K1-70 0,01 µg + TSHb

83,71 ± 2,23 51,03 ± 3,63 61

K1-70 0,1 µg + TSHb

7,69 ± 0,71 23,70 ± 3,03 308

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,05 ± 0,12 5,05 ± 0,37 481

K1-70 10 µg + TSHb

1,81 ± 0,58 3,76 ± 0,11 208

K1-70 100 µg + TSHb

1,43 ± 0,56 4,93 ± 0,84 345

K1-70 100 µg

0,76 ± 0,42 3,59 ± 0,48 472

bTSH (2)

80,04 ± 7,76 48,55 ± 4,54 61

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

5 9

K1-70 0,01 µg/ml

0 8

K1-70 0,11 µg/ml

90 57

imagen403

K1-70 1 µg/ml

99 91

K1-70 10 µg/ml

98 93

K1-70 100  g/ml

98 91

bTSH (2)

0 13

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen404 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de AMP cíclico solamente

0,88 ± 0,09 2,06 ± 0,39 234

TSHb

56,39 ± 3,44 56,59 ± 2,20 100

5B3 10 µg/ml + TSHb

62,97 ± 1,58 48,72 ± 6,02 77

5B3 100 µg/ml + TSHb

60,63 ± 1,31 57,90 ± 6,25 95

K1-70 0,001 µg + TSHb

61,57 ± 5,25 54,73 ± 13,72 89

K1-70 0,01 µg + TSHb

55,31 ± 5,21 61,63 ± 17,52 111

K1-70 0,1 µg+TSHb

30,91 ± 2,16 27,18 ± 5,31 88

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,95 ± 1,37 2,82 ± 0,34 145

K1-70 10 µg + TSHb

1,15 ± 0,35 1,40 ± 0,15 122

K1-70 100 µg + TSHb

1,12 ± 0,41 1,65 ± 0,29 147

K1-70 100 µg

0,63 ± 0,11 1,20 ± 0,07 190

bTSH (2)

77,33 ± 18,51 55,10 ± 2,99 71

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 14

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 3

K1-70 0,01 µg/ml

2 0

K1-70 0,1 µg/ml

45 52

K1-70 1 µg/ml

97 95

K1-70 10 µg/ml

98 98

K1-70 100 µg/ml

98 97

bTSH (2)

0 3

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen405 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de AMP cíclico solamente

1,37 ± 0,11 5,15 ± 0,63 376

TSHb

77,89 ± 4,29 64,69 ± 4,82 83

5B3 10 µg/ml + TSHb

77,80 ± 3,64 67,66 ± 1,21 87

5B3 100 µg/ml + TSHb

79,92 ± 5,52 66,12 ± 2,92 83

K1-70 0,001 µg + TSHb

80,20 ± 4,04 64,15 ± 0 80

K1-70 0,01 µg + TSHb

68,64 ± 9,75 57,52 ± 4,14 84

imagen406

K1-70 0,1 µg + TSHb

5,75 ± 0,88 42,40 ± 1,47 737

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,67 ± 0,29 6,09 ± 0,05 365

K1-70 10 µg + TSHb

1,37 ± 0,06 4,29 ± 0,62 313

K1-70 100 µg + TSHb

1,48 ± 0,08 4,75 ± 0,08 319

K1-70 100 µg

1,66 ± 0,33 3,17 ± 0,19 191

bTSH (2)

84,45 ± 1,63 58,26 ± 3,24 69

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0,1 0

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 1

K1-70 0,01 µg/ml

12 11

K1-70 0,1 µg/ml

93 34

K1-70 1 µg/ml

98 91

K1-70 10 µg/ml

98 93

K1-70 100 µg/ml

98 93

bTSH (2)

0 10

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen407 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,36 ± 0,14 0,90 ± 0,36 250

TSHb

86,55 ± 2,19 54,99 ± 5,70 64

5B3 10 µg/ml + TSHb

90,58 ± 4,34 47,09 ± 1,88 52

5B3 100 µg/ml + TSHb

87,52 ± 2,25 54,67 ± 4,74 62

K1-70 0,001 µg + TSHb

88,48 ± 4,56 44,31 ± 3,00 50

K1-70 0,01 µg + TSHb

86,20 ± 7,37 45,44 ± 2,16 53

K1-70 0,1 µg + TSHb

8,81 ± 0,84 27,64 ± 1,41 314

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,05 ± 0,35 1,98 ± 0,29 189

K1-70 10 µg + TSHb

0,76 ± 0,58 0,72 ± 0,11 95

K1-70 100 µg + TSHb

0,40 ± 0,09 0,64 ± 0,16 160

K1-70 100 µg

0,61 ± 0,20 0,90 ± 0,15 148

bTSH (2)

75,91 ± 7,48 51,08 ± 3,64 67

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 14

5B3 100 µg/ml

0 1

K1-70 0,001 µg

0 19

K1-70 0,01 µg/ml

0 17

K1-70 0,1 µg/ml

90 50

K1-70 1 µg/ml

99 96

K1-70 10 µg/ml

99 99

K1-70 100 µg/ml

99 99

bTSH (2)

12 7

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

imagen408

Tabla 15p Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu251 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen409 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,78 ± 0,15  ± 0,73 267

TSHb

97,46 ± 6,92 76,06 ± 10,78 78

5B3 10 µg/ml + TSHb

92,91 ± 4,18 68,71 ± 3,38 74

5B3 100 µg/ml + TSHb

86,30 ± 10,26 76,69 ± 7,01 89

K1-70 0,001 µg + TSHb

90,50 ± 10,61 76,43 ± 13,91 84

K1-70 0,01 µg + TSHb

88,13 ± 2,76 60,62 ± 2,31 69

K1-70 0,1 µg + TSHb

4,06 ± 0,74 6,28 ± 2,22 155

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,73 ± 0,11 2,17 ± 0,04 125

K1-70 10 µg + TSHb

1,58 ± 0,15 3,18 ± 1,36 201

K1-70 100 µg + TSHb

1,66 ± 0,03 2,72 ± 0,52 164

K1-70 100 µg

1,54 ± 0,15 4,41 ± 1,24 286

bTSH (2)

104,06 ± 3,26 87,36 ± 14,82 84

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

5 10

5B3 100 µg/ml

11 0

K1-70 0,001 µg

7 0

K1-70 0,01 µg/ml

10 20

K1-70 0,1 µg/ml

96 92

K1-70 1 µg/ml

98 97

K1-70 10 µg/ml

98 96

K1-70100 µg/ml

98 96

bTSH (2)

0 0

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Tabla 15q Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg255 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15r Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Thr257 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15s Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Trp258 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen410 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de AMP cíclico solamente

1,65 ± 0,42 2,04 ± 0,48 124

TSHb

62,43 ± 4,24 63,86 ± 4,18 102

5B3 10 µg/ml + TSHb

75,59* 56,36 ± 3,72 75

5B3 100 µg/ml + TSHb

68,28 ± 4,90 62,53 ± 5,33 92

K1-70 0,001 µg + TSHb

89,67 ± 5,46 65,87 ± 8,49 73

K1-70 0,01 µg + TSHb

87,27 ± 9,27 55,02 ± 4,02 63

K1-70 0,1 µg + TSHb

33,63 ± 2,97 19,38 ± 3,27 58

K1-70 1,0 µg + TSHb

2,30 ± 0,34 3,96 ± 1,02 172

K1-70 10 µg + TSHb

1,28 ± 1,09 2,38 ± 0,52 186

imagen411

K1-70 100 µg + TSHb

2,88 ± 1,98 1,94 ± 0,45 67

K1-70 100  g

1,16 ± 0,45 1,34 ± 0,50 116

bTSH (2)

68,39 ± 1,88 59,58 ± 1,64 87

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 12

5B3 100 µg/ml

0 2

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 14

K1-70 0,1 µg/ml

46 70

K1-70 11 µg/ml

96 94

K1-70 10 µg/ml

98 96

K1-70 100 µg/ml

95 97

bTSH (2)

0 7

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen412 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,67 ± 0,13 2,08 ± 0,22 310

TSHb

66,07 ± 7,95 93,16 ± 6,69 141

5B3 10 µg/ml + TSHb

85,93 ± 3,35 94,23 ± 2,23 110

5B3 100 µg/ml +TSHb

83,73 ± 9,86 86,78 ± 13,03 104

K1-70 0,001 µg +TSHb

88,71 ± 7,01 87,21 ± 14,51 98

K1-70 0,01 µg + TSHb

84,72 ± 18,03 97,91 ± 10,18 116

K1-70 0,1 µg + TSHb

55,12 ± 14,21 80,13 ± 9,78 145

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,66 ± 0,44 3,97 ± 0,06 239

K1-70 10 µg + TSHb

0,91 ± 0,37 2,00 ± 0,28 220

K1-70 100 µg + TSHb

0,87 ± 0,31 2,25 ± 0,24 259

K1-70 100 µg

1,14 ± 0,11 1,44 ± 0,15 126

bTSH (2)

92,96 ± 1,88 85,41 ± 4,14 92

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 7

K1-70 0,001 µg

0 6

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

17 14

K1-70 1 µg/ml

97 96

K1-70 10 µg/ml

99 98

K1-70 100 µg/ml

99 98

bTSH (2)

0 8

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

imagen413

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen414 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,09 ± 0,13 1,93 ± 0,27 177

TSHb

 ± 3,32 59,87 ± 5,65 102

5B3 10 µg/ml+TSHb

67,66 ± 2,16 50,71 ± 1,58 75

5B3 100 µg/ml + TSHb

72,85 ± 11,12 57,62 ± 12,06 79

K1-70 0,001 µg + TSHb

64,08 ± 4,50 51,10 ± 5,86 80

K1-70 0,01 µg + TSHb

68,76 ± 7,18 51,22 ± 2,22 74

K1-70 0,1 µg + TSHb

12,46 ± 3,44 11,56 ± 5,39 93

K1-70 1,0 µg + TSHb

0,99 ± 0,52 1,38 ± 0,12 139

K1-70 10 µg+TSHb

0,64 ± 0,08 1,06 ± 0,21 166

K1-70 100 µg + TSHb

0,77 ± 0,27 1,38 ± 0,65 1 79

K1-70 100 µg

0,52 ± 0,23 1,34 ± 0,29 258

bTSH (2)

69,57 ± 4,31 47,82 ± 3,23 69

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 15

5B3 100 µg/ml

0 4

K1-70 0,001 µg

0 15

K1-70 0,01 µg/ml

0 14

K1-70 0,1 µg/ml

79 81

K1-70 1 µg/ml

98 98

K1-70 10 µg/ml

99 98

K1-70 100 µg/ml

99 98

bTSH (2)

0 20

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Tabla 15t Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg274 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15u Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp276 mutado a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH Tabla 15v Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Ser281 mutada a Ala. Efecto de diferentes diluciones de anticuerpo monoclonal humano para el TSHR (K1-70) con actividad antagonista de TSH

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen415 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,91 ± 0,23 2,61 ± 0,37 137

TSHb

97,06 ± 3,16 99,22 ± 9,24 102

5b3 10 µg/ml + TSHb

115,56 ± 7,73 106,00 ± 9,5 92

5b3 100 µg/ml + TSHb

120,83 ± 30,02 95,33 ± 4,48 79

K1-70 0,001 µg + TSHb

146,34 ± 0 11 7,54 ± 6,34 80

K1-70 0,01 µg + TSHb

133,74 ± 11,45 105,88 ± 9,33 79

K1-70 0,1 µg + TSHb

9,83 ± 1,02 4,09 ± 0,09 42

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,99 ± 0,45 1,70 ± 0,34 85

K1-70 10 µg + TSHb

1,49 ± 0,15 1,90 ± 0,14 128

imagen416

K1-70 100 µg + TSHb

1,54 ± 0,16 1,62 ± 0,21 105

K1-70 100 µ 

1,30 ± 0,25 1,75 ± 0,34 135

bTSH (2)

109,43 ± 12,79 100,21 ± 9,82 92

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 0

5B3 100 µg/ml

0 4

K1-70 0,001 µg

0 0

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

90 96

K1-70 1 µg/ml

98 98

K1-70 10 µg/ml

98 98

K1-70 100 µg/ml

98 98

bTSH (2)

0 0

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen417 DT, n = 3)

Muestra de ensayo ª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP solamente

cíclico 1,19 ± 0,45 7,20 ± 0,74 605

TSHb

78,01 ± 7,81 71,24 ± 4,72 91

5B3 10 µg/ml + TSHb

79,58 ± 5,41 66,78 ± 3,68 84

5B3 100 µg/ml + TSHb

72,68 ± 2,09 68,46 ± 7,03 94

K1-70 0,001 µg + TSHb

76,64 ± 4,38 68,87 ± 4,91 90

K1-70 0,01 µg + TSHb

71,64 ± 8,57 63,50 ± 3,61 89

K1-70 0,1 µg TSHb

9,89 ± 3,19 67,79 ± 9,74 685

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,02 ± 0,24 10,21 ± 0,58 1001

K1-7010 µg + TSHb

0,36 ± 0,31 5,07 ± 1,35 1408

K1-70 100 µg + TSHb

0,70 ± 0,26 5,14 ± 3,18 734

K1-70 100 µg

0,21 ± 0,30 3,56 ± 0,74 1695

bTSH (2)

74,30 ± 8,20 67,04 ± 6,95 90

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 6

5B3 100 µg/ml

7 4

K1-70 0,001 µg

2 3

K1-70 0,01 µg/ml

8 11

K1-70 0,1 µg/ml

87 5

K1-70 1 µg/ml

99 86

K1-70 10 µg/ml

99 93

K1-70100 µg/ml

99 93

bTSH (2)

5 6

imagen418

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen419 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

0,65 ± 0,27 12,17 ±   1872

TSHb

95,81 ± 9,24 74,82 ± 9,47 78

5B3 10 µg/ml + TSHb

106,73 ± 8,52 71,56 ± 4,30 67

5B3 100 µg/ml + TSHb

101,10 ± 2,58 75,93 ± 6,03 75

K1-70 0,001 µg + TSHb

104,99 ± 10,76 72,63 ± 9,99 69

K1-70 0,01 µg + TSHb

108,84 ± 12,41 78,47 ± 3,50 72

K-70 0,1 µg + TSHb

18,40 ± 12,30 66,36 ± 5,38 361

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,49 ± 0,67 9,63 ± 1,53 646

K1-70 10 µg + TSHb

0,85 ± 0,28 6,66 ± 0,81 784

K1-70 100 µg + TSHb

1,58 ± 0,41 6,53 ± 1,33 413

K1-70 100 µg

0,64 ± 0,04 5,88 ± ,36 919

bTSH (2)

92,86 ± 4,90 61,21 ± 1,70 66

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 4

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 3

K1-70 0,01 µg/ml

0 0

K1-70 0,1 µg/ml

81 11

K1-70 1 µg/ml

98 87

K1-70 10 µg//ml

99 91

K1-70 100 µg/ml

98 91

bTSH (2)

31 8

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

Experimento 1

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen420 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

1,27 ± 0,10 1,47 ± 0,26 116

TSHb

87,93 ± 17,36 69,80 ± 10,34 79

5B3 10 µg/ml + TSHb

84,72 ± 5,57 56,72 ± 2,69 67

5B3 100 µg/ml + TSHb

87,99 ± 4,63 62,11 ± 5,75 71

K1-70 0,001 µg + TSHb

86,36* 56,42 ± 8,88 65

K1-70 TSHb

79,79 ± 8,53 50,66 ± 7,96 63

K1-70 0,1 µg + TSHb

25,52 ± 8,47 40,25 ± 1,49 158

K1-70 1,0 µg + TSHb

1,47 ± 0,12 2,19 ± 0,52 150

K1-70 10 µg + TSHb

1,51 ± 0,11 2,08 ± 0,95 138

K1-70 100 µg + TSHb

1,18 ± 0,32 1,52 ± 0,19 129

imagen421

K1-70 100 µg

0,99 ± 0,29 1,22 ± 0,07 123

bTSH (2)

99,13 ± 16,11 56,62 ± 5,48 57

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

4 19

5B3 100 µ 

0 11

K1-70 0,001 µg

2 19

K1-70 0,01 µg/ml

9 27

K1-70 0,1 µg/ml

71 42

K1-70 1 µg/ml

98 97

K1-70 10 µg/ml

98 97

K1-70 100 µg/ml

99 98

bTSH (2)

0 19

Experimento 2

AMP cíclico producido (pmol/ml; media imagen422 DT, n = 3)

Muestra de ensayoª

TSHR de tipo silvestre TSHR mutado Mutado/tipo silvestre (%)

Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente

60,51 ± 0,27 2,70 ± 0,22 529

TSHb

75,33 ± 3,18 68,98 ± 3,03 92

5B3 10 µg/ml + TSHb

82,84 ± 2,66 66,07 ± 3,09 80

5B3 100 µg/ml + TSHb

82,89 ± 4,01 72,42 ± 3,12 87

K1-70 0,001 µg + TSHb

77,43 ± 3,86 53,94 ± 3,95 70

K1-70 0,01 µg + TSHb

87,16 ± 9,24 51,53 ± 6,84 59

K1-70 0,1 µg + TSHb

18,38 ± 2,79 40,45 ± 9,45 220

K1-70 1,0 µg + TSHb

0,60 ± 0,27 2,56 ± 0,63 427±

K1-70 10 µg + TSHb

0,38 ± 0,07 2,17 ± 0,83 571

K1-70 100 µg + TSHb

0,42 ± 0,20 1,85 ± 0,40 440

K1-70 100 µg

0,22± 0,07 2,08 ± 1,29 945

bTSH (2)

83,91 ± 6,87 5,94 ± 6,27 79

% de inhibición de estimulación de TSHc

Concentración de anticuerpo

TSHR de tipo silvestre TSHR Mutado

5B3 10 µg/ml

0 4

5B3 100 µg/ml

0 0

K1-70 0,001 µg

0 22

K1-70 0,01 µg/ml

0 25

K1-70 0,1 µg/ml

76 41

K1-70 11 µg/ml

99 96

K1-70 10 µg/ml

99 97

K1-70 100 µg/ml

99 97

bTSH

0 4

Véase leyenda de la Tabla 15a para detalles.

imagen423

Mutación de TSHR

Estimulación (en relación   Estimulación (en relación con el tipo silvestre) de la producción de AMP cíclico por IgG K1-18 Bloqueo (en relación con el tipo silvestre) de la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico por IgG K1-70

Tipo silvestre

+++++ +++++ +++++

Asp43 Ala

+++++ +++++ +++++

IIe60 Ala

+++++ +++++ ++

Glu61 Ala

+++++ +++++ +++

Thr104 Ala

+++++ +++++ +++++

His105 Ala

+++++ +++++ +++++

Asp151 Ala

++++ ++++ +++++

Glu157 Ala

+++++ 0 NT

Glu178 Ala

+++ ++++ ++++

Tyr185 Ala

++++ 0 +++++

Tyr206 Ala

+++++ ++ +++++

Lys209 Ala

++++ ++++ +++++

Asp232 Ala

++++ 0 +++++

Gln235 Ala

++++ ++++ +++++

Lys250 Ala

+++++ +++++ +++

Glu251 Ala

++++ ++++ +++++

Arg255 Ala

+++++ +++++ +++++

Thr257 Ala

+++++ +++++ +++++

Trp258 Ala

+++++ ++ +++++

Arq274 Ala

+++++ ++ +++++

Asp276 Ala

+++++ +++++ +++

Ser281 Ala

+++++ +++++ ++++

Asp160 Lys

0 NT +++++

Lys163 Asp*

+++++ 0 +++++

Los efectos relativos de las mutaciones de TSHR se expresaron como un porcentaje de la actividad observada con el tipo silvestre de la siguiente manera: +++++ = 100 % de la actividad de tipo silvestre; ++++ = <100-80 % de la actividad de tipo silvestre; +++ = <80-60 % de la actividad de tipo silvestre; ++ = <60-40 % de la actividad de tipo silvestre; + = <40-20 % de la actividad de tipo silvestre; 0 = <20 % de la actividad de tipo silvestre. *Se llevó a cabo bloqueo de la estimulación para esta mutación usando estimulación por M22 ya que el mutante no respondió a la estimulación con TSH. Concentración final de Fab M22 = 3 ng/ml.

Tabla 17a Inhibición de la unión de 125I-TSH con tubos recubiertos con TSHR por Fab K1-70 recombinante expresado en células de E. coli HB2151

Muestra de ensayo

Dilución de sobrenadante de cultivo (o concentration1 de Fab K1-70 ng/ml) % de unión de 125I-TSH % de inhibición2

Tampón de ensayo solamente

12,4 0

Células transformadas con Fab K1-70 pero no inducidas

1:2 11,4 8,0

1:4

12,3 0,7

1:8

10,9 12,4

1:16

11,8 5,0

1:32

12,6 -1,4

1:64

11,9 3,9

1:128

11,5 7,6

1:256

10,8 13,5

1:512

10,4 16,3

1:1024

10,7 14,2

imagen424

Muestra de ensayo

Dilución de sobrenadante de cultivo (o ES 2 540 538 T31 de Fab K1-70 ng/ml) % de unión de 125I-TSH % de inhibición2

Células transformadas con Fab K1-70 e inducidas

1:2 (700) 1,0 91,9

1:4 (350)

1,3 89,4

1:8 (175)

1,5 87,8

1:16 (87,5)

1,3 89,6

1:32 (44,8)

1,5 88,0

1:64 (22,4)

3,4 72,9

1:128 (11,2)

6,1 51,3

1:256 (5,6)

9,0 27,9

1:512 (2,8)

10,8 13,1

1:1024 (1,4)

11,6 6,6

Fab K1-70 (de IgG producido de hibridoma)

(100) 1,6 87,5

(50)

1,7 86,1

(25)

2,2 81,9

(10)

6,6 47,0

(5)

9,9 20,0

(2,5)

11,0 11,5

(1)

12,4 0,4

Concentración de Fab K1-70 recombinante en sobrenadante de cultivo medida usando el kit de ensayo de IgG Humano de Easy-Titer (H=L) (Pierce Biotechnology) usando diferentes concentraciones de Fab K1-70 producido por hibridoma como una curva de calibración,2La inhibición de la unión se calculó usando la fórmula: % de inhibición = 100 – [A/B x 100] en la que A = % de unión de 125I-TSH en presencia de la muestra en ensayo; y B = % de la unión de 125I-TSH en presencia de tampón de ensayo (NaCl 50 mM, Tris 10 mM, pH 7,8, Triton X-100 1 % y BSA 1 mg/ml),

Tabla 17b Inhibición de la estimulación mediada por TSH de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR por Fab K1-70 recombinante expresado en células de E. coli HB2151

Muestra de ensayo

Dilución2 de sobrenadante de cultivo (o concentration3 de Fab K1-70 ng/ml) Media AMP cíclico (pmol/ml) imagen425DT (n = 3) % de inhibición de la estimulación por TSH del AMP cíclico4

Tampón de ensayo1 solamente

2,39 ± 0,20

TSH 3 ng/ml

61,87 ± 2,74 0

Células transformadas con Fab K1-70 pero no inducidas

1:10 5,67 ± 0,31

Células transformadas con Fab K1-70 pero no inducidas + TSH 3 ng/ml

1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 70,95 ± 6,32 76,24 ± 6,55 67,11 ± 3,51 61,05 ± 8,44 64,94 ± 5,20 -14,7 -23,2 -8,5 1,3 -5,0

Células inducidas y transformadas con Fab K170

1:10(140)  ± 0,59

Células inducidas y transformadas con Fab K170 + TSH 3 ng/ml

1:5 (280) 1:10 (140) 1:20 (70) 1:40 (35) 1:80 (17,5) 6,64 ± 0,07 9,71 ± 1,50 18,55 ± 3,30 37,29 ± 6,47 51,68 ± 3,59 89,3 84,3 70,0 39,7 16,5

Fab K1-70 (de IgG producido por hibridoma)

(100.000) 1,71 ± 0,36

Fab K1-70 (de IgG producido por hibridoma) + TSH 3ng/ml

(100.000) (10.000) (1.000) (100) (10) 1,66 ± 0,08 2,20 ± 0,17 3,11 ± 0,09 6,52 ± 0,07 55,13 ± 5,26 97,3 96,4 95,0 89,5 10,9

Claims (16)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1.

   Una molécula de anticuerpo recombinante o monoclonal humana que se une al TSHR y que reduce la estimulación inducida por ligando del TSHR pero no tiene ningún efecto en la actividad constitutiva de TSHR en donde la molécula de anticuerpo humana aislada tiene la característica de autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente de inhibir la unión de TSH y M22 al TSHR, y en donde la molécula de anticuerpo humana aislada comprende SEC ID Nº: 70 (CDR I), SEC ID Nº: 71 (CDR II) y SEC ID Nº: 72 (CDR III) y SEC ID Nº: 42 o 52 (CDR I), SEC ID Nº: 43 o 53 (CDR II) y SEC ID Nº: 44 o 54 (CDR III).

2. 2.

   Una molécula de anticuerpo humana aislada de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene al menos una característica adicional de autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente seleccionada de una afinidad de unión por el TSHR de al menos 108 l/mol, preferentemente de al menos 109 l/mol, y la capacidad para bloquear la estimulación de TSHR inducida por ligando a una concentración de anticuerpo de menos de 1 µg/ml, preferentemente menos de 0,1 µg/ml.

3. 3.

   Una molécula de anticuerpo humana aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 que es un antagonista de TSH, autoanticuerpos estimulantes del tiroides o gonadotropina coriónica humana.

4. 4.

   Una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende un dominio VH de anticuerpo seleccionado de las secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº 41 y 51, preferentemente una molécula de anticuerpo aislada que comprende un dominio VH de anticuerpo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 41 y 51.

5. 5.

   Una molécula de anticuerpo humana aislada de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende una molécula de anticuerpo aislada que comprende un dominio VL de anticuerpo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 69.

6. 6.

   Un nucleótido aislado que codifica una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. 7.

   Un nucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 o SEC ID Nº: 64.

8. 8.

   Un vector que incluye un nucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7.

9. 9.

   Una célula hospedadora que incluye un nucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, o un vector de acuerdo con la reivindicación 8.

10. 10.

    Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

11. 11.

    Una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 para uso en terapia.

12. 12.

    Un método in vitro para caracterizar la actividad de anticuerpos de TSHR, TSH o gonadotropina coriónica humana, comprendiendo el método una etapa que incluye el uso de una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

13. 13.

    Un método de diagnóstico in vitro para detectar autoanticuerpos de analitos para el TSHR, comprendiendo el método poner en contacto una muestra, que se ha aislado de un sujeto que se cree que contiene dichos autoanticuerpos de analitos, y una molécula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 con un TSHR o un fragmento del mismo.

14. 14.

    Un método de diagnóstico in vitro para detectar anticuerpos de analitos para el TSHR de acuerdo con la reivindicación 13 en el que el TSHR o el fragmento del mismo están mutado en la arginina 255 de modo que en dicho método de diagnóstico dicho TSHR mutado o dicho fragmento del mismo interaccionen preferentemente con anticuerpos de TSHR de tipo bloqueo de analito en comparación con anticuerpos de TSHR de tipo estimulante de analito.

15. 15.

    Un método de diagnóstico in vitro de acuerdo con la reivindicación 14 en el que se detecta la unión de anticuerpo de TSHR de analito con TSHR260 o TSHR260 mutado en la arginina 255 mediante inhibición de la unión de un anticuerpo de TSHR marcado directa o directamente o de un fragmento del mismo con dicho TSHR260 o TSHR260 mutado en la arginina 255.

16. 16.

    Un método de diagnóstico in vitro de acuerdo con la reivindicación 15 en el que dicho anticuerpo de TSHR marcado es un anticuerpo monoclonal, recombinante o sintético o un fragmento del mismo.

    182