JP4980901B2 - 新規なモノクローナル甲状腺刺激または阻害抗体、その可変領域に相当するペプチド配列、ならびに診断用医薬、予防用医薬および治療用医薬におけるそれらの使用 - Google Patents
新規なモノクローナル甲状腺刺激または阻害抗体、その可変領域に相当するペプチド配列、ならびに診断用医薬、予防用医薬および治療用医薬におけるそれらの使用 Download PDFInfo
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Description
a.ヒトTSHrのエピトープについてウシTSHと競合すること、
b.ヒトTSHrのエピトープについてグレーブス病患者から得た血清由来の自己抗体と、および阻害性自己抗体を有する患者から得た血清由来の自己抗体と競合すること、
c.ヒトTSHrの最初の281アミノ酸に位置するヒトTSHrの立体構造エピトープと結合すること、
d.ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、およびヒツジ起源のTSH受容体(TSHr)と結合すること、および
e.その解離定数Kdが、組換えヒトTSHr調製物で被覆した試験管での飽和実験において測定された場合、約20×10-10から約0.5×10-10Mの範囲であること。
e.配列番号1もしくは配列番号9の重鎖と、および/または配列番号2もしくは配列番号10の軽鎖と少なくとも90%の相同性をそれぞれ示す重鎖および軽鎖の可変領域を有するか、あるいは
f.ヒト化または一本鎖mAb、あるいは配列番号3、配列番号4もしくは配列番号11および配列番号5の重鎖の相補性決定領域(CDR)ならびに/または配列番号6、配列番号7もしくは配列番号12および配列番号8もしくは配列番号13の軽鎖の相補性決定領域(CDR)を少なくとも含むmAbの断片であるのいずれかであることが好ましい。
g.配列番号14の重鎖と、および/または配列番号15の軽鎖と少なくとも90%の相同性をそれぞれ示す重鎖および軽鎖の可変領域を有するか、あるいは
h.ヒト化または一本鎖mAb、あるいは配列番号16、配列番号17もしくは配列番号18の重鎖の相補性決定領域(CDR)および/または配列番号19、配列番号20もしくは配列番号21の軽鎖の相補性決定領域(CDR)を少なくとも含むmAbの断片であるのいずれかであることが好ましい。
1.1試薬
3G4(15)およびBA8(16)モノクローナル抗体は別の場所に記載した。mAb IRI-SAb1は比較のためにより詳しく調べたが、これもすでに部分的に特性決定されていた(11)。ウシTSHはSigma (Chemical CO, St Louis, MO)から購入した。PCR、クローニングまたは配列決定に用いたすべてのプライマーはEurogentec (Se-raing, Belgium)によって合成し、配列は要求に応じて入手できる。
6週齢の雌NMRIマウス[Ico:NMRI(IOPS:Han)]を、すでに記載されたようにヒトTSHrをコードするcDNAを用いて免疫化した(8)。血液サンプルは最初の免疫化の8週間後に得た。すべての測定について、血清を個々に試験した。マウスには、動物の福祉のための地方委員会によって承認された手順に従って取り扱い、飼育した。血清中の、hTSHrを刺激する抗体の存在について陽性のスコアを有するマウス42を選択し、脾臓細胞の骨髄腫NS1/0との融合を先に記載された通り実施した(11、16)。メチル-セルロースHAT培地(ClonCell-HY選択培地、STEMCELL Technologies Inc、Vancouver, Canada)で選択した後、1200個のクローンを液体培地で増殖させた。
1.3.1.フローサイトメトリー
FACS分析を2μlの血清を用い、hTSHrを発現するCHO細胞[JP19(17)]で先に、記載された通り実施した(16)。結果はAFU(任意の蛍光単位)で表す。
TSAb活性は、hTSHrを発現するCHO細胞[JP26(17)]を用いて、記載された通り測定した(18)。すべての実験で2連のサンプルをアッセイし、結果はpmoles cAMP/mlとして表す。
上清を回収し、3種のアッセイを用いてhTSHrに対する抗体の存在を評価した: 10μlの上清を用いたJP19細胞でのFACS(上記参照)。125I-TSH結合についての競合はDYNOtest(登録商標)TRAK humanコーティングした試験管(B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft, Hennigsdorf)(19)を用い、50μLの上清を用いて実施した。10μlの上清を用いたJP26 CHO細胞(上記参照)を用いるcAMP生成の刺激。3種の試験で陽性のスコアを有するハイブリドーマをクローニングし、増殖させ、mAbのIgイソタイプを決定した(IsoStrip(商標)、Roche, Belgium)
1.4.1.TSAbおよびTBII活性
選択したmAbおよびFab(パパイン消化後に生成した)をセファロース-タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィーによって精製し(ImmunoPure(商標)Fab調製キット、Pierce, Perbio Science, Belgium)、正常等張培地(上記参照)においてJP26 CHO細胞を用いてcAMP生成を刺激するその能力について調べた。TBII活性測定のために、250μlのバッファーA(20mM Hepes-NaOH、pH7.5、50mM NaCl、1% BSA、10% グリセロール、2mg/mlマウスIgG)に溶解した種々の量の抗体をhTSHrコーティングした試験管に加えた。室温で1時間インキュベーションした後、同バッファーに溶解した50μlの125I-TSH(B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft)を加えた。この試験管を室温で2時間インキュベートし、2mlの洗浄バッファー(8mM Tris-HCl、6OmM NaCl、0.02% Tween-20、pH7.5)で4回洗浄し、結合している放射能をカウントした。
0.3mlのバッファーAに溶解した、5ng(約200000RLU)のアクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体(20)および種々の量の非標識抗体をTSHrコーティングした試験管に加えた。試験管を室温で24時間インキュベートし、2mlの洗浄バッファーで4回洗浄し、RLUをルミノメーターで測定した。
150μlバッファー(100mM Hepes-KOH、pH7.5、20mM EDTA、0.5mM N-エチル-マレイミド、1% BSA、0.5% Triton X100、30μg/ml抗ヒトTSH抗体、2mg/mlマウスIgG)および100μlの患者の血清または標準物質をTSHrコーティングした試験管に加えた。2時間インキュベートした後、50μlの5ngの標識抗体を含有するPBSをトレーサーとして加えた。試験管を4℃で一晩インキュベートし、2mlの洗浄バッファーで4回洗浄し、結合しているRLUをルミノメーターで測定した。結果は以下のように算出した阻害指数(InI)として表した:InI(%)=100-100×(試験血清の計数率/標準ゼロ血清の計数率)。グレーブス病(GD)血清は、国家倫理委員会によって承認された、in vitro診断薬の開発のために募集された血液ドナーから得た。臨床上甲状腺機能低下性であるが高レベルのTBIIを含んでいた自己免疫甲状腺疾患の患者から得た血清はDaphne Khoo博士(Singapore General Hospital)から譲渡された。すべての血液ドナーから書面による同意を得た。
濃度-作用曲線、飽和曲線、スキャッチャードおよび統計解析(ノンパラメトリックマンホイットニー順位和試験による)を、Prism(登録商標)プログラム(GraphPad Software, Inc.、San Diego, CA, USA)を用いてフィッティングし、コンピュータで計算した。
PBSに溶解した、100μgの精製mAb(IRI-SAB2、IRI-SAB3、1H7、BA8)を8週齢の雌Balb/cマウスの尾静脈に注射した。血液サンプルを、注射後種々の時点で得た。PBSおよびmAb BA8を対照として用いた。
総T4は市販のキット(T4 mAb、ICN pharmaceuticals、New York, USA)を用いて測定した。TSHはこれまでに記載された通りに測定した(21)。
精製mAbを用いて注射した4日後、ネンブタール麻酔下での心臓穿刺によってマウスから血を抜いた。甲状腺を採取し、光学顕微鏡および免疫組織化学のために処理した。凍結切片を、先に記載されたように(22)、CDR5RA陽性免疫細胞およびMac-1陽性マクロファージ細胞に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫ペルオキシダーゼ染色に付した。
全RNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen Inc.、Valencia, CA, USA)を用いて単離した。ランダムヘキサマーを用いて第1鎖cDNAを合成した後、Kettleboroughらによって記載され(23)、配列決定された縮重プライマーを用いて重鎖および軽鎖Fv領域を増幅した。これらの配列を、IMGT/V-QUEST(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)を用いて入手可能なマウスIg遺伝子の配列と比較した。重鎖および軽鎖のフレームワーク(FR)およびCDR領域について、置換/サイレントR/S突然変異率を算出した。CDR R/S率>2.9(構造が保存される必要がないタンパク質をコードする遺伝子中にランダムに生じる体細胞突然変異について算出した)は、抗原による抗体の成熟を示し、他方、低いFR R/S突然変異率(<2.9)は、保存される必要がある構造要素の負の圧力を反映する(24)。
2.1.ハイブリドーマ融合のために選択したマウス
20個体の雌NMRIマウスを、これまでに記載された遺伝子免疫のプロトコールに従ってヒトTSHrに対して免疫化した(12)。最初のDNA注射の8週間後にマウスを出血させ、免疫化したマウスから得たすべての血清においてFACSによってTSHrに対する抗体を検出したところ、値は20±2.5AFU〜91±7AFUの範囲であった(対照値:6±0.82AFU)。TBII活性は、免疫化したマウスから得たすべての血清に同様に存在し、値は標識したTSH結合の42〜92%阻害の範囲であった(対照マウス:2±0.5%)。TSAb活性は、5種の血清でしか検出可能でなく、cAMP値は5pmole/mlよりも高かった(対照マウス:0.77±0.15pmole/ml)。3個体のマウスが、対照よりも有意に高い総T4を示した(>4.5μg/dl)。マウス42は4種のアッセイすべてで陽性であり、TBII、TSAbおよび総T4において最高値を示し、これをハイブリドーマ融合のために選択した。
分析した1,200個のハイブリドーマのうち129個が、JP19細胞でのFACSによるスクリーニング後に陽性のスコアを有した。これらのうち30個が、TRAKアッセイにおいてTBIIについて陽性であり、そのうち7個が正常塩培地におけるインキュベーション下でJP26細胞においてcAMP生成を刺激した(方法参照)。cAMP値は9.3±0.2pmole/ml〜188.3±8.7pmole/mlの範囲であった(対照上清:1.49±0.15pmole/ml)。TSAb活性を示す7個の上清のうち2個が、飽和濃度のウシTSH(100mIU/ml、280±21pmole/ml)によって引き起こされる最大刺激の67%(IRI-SAb2、188.3±8.7pmole/ml、すなわち126倍の基礎cAMP値)および20%(IRI-SAb3、56±1.2pmole/ml、すなわち37倍の基礎cAMP値)に達するcAMP生成の刺激を達成した。これら2種のmAbを製造のために選択し、さらなる分析のために精製した。IgGイソタイプはIRI-SAb2についてはIgG2aであり、IRI-SAb3についてはIgG1であった。
2.3.1. IgGのTSAb活性
種々の濃度の精製IRI-SAb2およびIRI-SAb3を、正常塩培地においてインキュベートしたJP26細胞においてcAMP生成を刺激するその能力について試験した。両場合においてcAMP生成の濃度依存的増加が観察され、IRI-SAb2およびIRI-SAb3それぞれについて131倍および105倍の基礎cAMP値という最大刺激であった(図1A)。これらの値はそれぞれ、同じ実験において飽和濃度のウシTSH(100mIU/ml)によって生じた最大刺激の98%および80%に相当した。EC50は、IRI-SAb2およびIRI-SAb3それぞれについて2.75±0.25nMおよび16.5±3.5nMであった。比較すると、これまでに特性決定されたIRI-SAb1(11)(EC50=3.6±0.6nM)によって達成された最大刺激は、ウシTSHで達成される値のわずか10%であった(図1A、挿入図)。これらの結果は、アッセイの条件下ではIRI-SAb2はhTSHrの完全アゴニストとして挙動するということを示す。
3種のmAb Fab断片の、cAMP生成の刺激に対する有効性は、対応する無傷の免疫グロブリンを用いて得られるものと同様であり、IRI-SAb2は再度完全アゴニストとして挙動した(図1B)。EC50値は、無傷のIgGによって示されるもの(IRI-SAb2およびIRI-SAb3それぞれについて1.2±0.5nMおよび74±4nM)と同様の範囲にあった。
種々の濃度の精製IRI-SAb1、IRI-SAb2およびIRI-SAb3を、TSHrコーティングした試験管で125I標識したTSHとともにインキュベートした(図1C)。最初のスクリーニングでTSH結合を阻害するが、TSAb活性は欠くと検出されたmAb 1H7も試験した。IRI-SAb2、IRI-SAb3および1H7はTSH結合について競合し、125I標識したTSHの50%を置き換えるのに必要な濃度はそれぞれ、2±0.5nM(0.3±0.075μg/ml)、3.3±0.2nM(0.5±0.03μg/ml)および2.6±0.2nM(0.4±0.03μg/ml)であった。対照的に、IRI-SAb1はあまり効率的ではなく、10μg/ml(66nM)で、125I標識したTSHを5%未満しか置き換わらなかった。
アクリジニウムエステルで標識した4種のmAbを、hTSHrコーティングした試験管での結合トレーサーとして用いた(20)。競合は104人の甲状腺機能正常な対照被験者、100人のグレーブス病患者、8人のTSH阻害活性(TBAb)アッセイにおいて陽性をスコアしている患者および20人の橋本病のTBII陰性患者から得た血清を用いてアッセイした。また、これらの血清すべてをTSH-TRAKアッセイにおいても評価した(19)。IRI-SAb1を除くすべてのmAbは、対照被験者または橋本病の患者と比較した場合に、グレーブス病またはTBAb陽性患者に由来する自己抗体によって効率的かつ大きく競合された(図2)。
2.4.1.IRI-SAb2、IRI-SAb3および1H7
IRI-SAb2、IRI-SAb3および1H7抗体は、FACSによって試験した場合にヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌおよびヒツジ由来のTSHrを認識した(データは示していない)。3種のmAbすべてについて、TSH受容体とLH/CG受容体の間のキメラにより、エクトドメインの最初の281残基に位置するエピトープが示された(データは示していない)。発明者らは次いでこれらの抗体の、TSHrの馬蹄領域の内表面の残基と相互作用する能力を試験した。この表面(図3Aおよび図3B)は、7残基、X1-X2-L-X3-L-X4-X5からなる9つの単位から構成されていることが示されている。X残基の側鎖は溶媒に面し、ホルモンまたは抗体との相互作用に利用可能であると予測される(図3C)。このモデルは、GPHR間の特定のX残基を置換した結果、対応するキメラにおける認識特異性の取替えがもたらされたことを実証することによって確認されている(3)。3種のmAbはX残基の20置換を有するT90キメラを認識せず(図3D)、X残基が8つの位置(LRR1中の3残基、LRR2中の2残基およびLRR7中の3残基)で突然変異されたT56キメラも認識しなかった(図3Bおよび図3D)。次いで、発明者らは、X残基が突然変異されている全部で35種の突然変異体を個々に、または組み合わせて試験した。結果は図4にまとめられている。
種々の種のTSHrでトランスフェクトしたCOS-7細胞からのFACS結果から、IRI-SAb1はヒトTSHrを極めて効率的に認識し、ヒツジ受容体をより低い程度でしか認識しないということが実証された。ラット、ネコまたはイヌ由来TSHrとは結合せず、マウス受容体とも結合しなかった。IRI-SAb1の、ラットとヒトTSH受容体の間の一連のキメラとの結合の最初の分析により、N末端システインクラスター部分と馬蹄構造領域の最初の半分[ロイシンリッチリピート(LRR)1〜5を含有する]とを包含する、位置21(G21、シグナルペプチドの後ろの最初のアミノ酸)と165の間のエクトドメインのセグメントが示された。種々の種のTSHrのアラインメントにより、認識されない種に由来するTSHrでは置換されている(それぞれ、H45およびR91で)、2個の残基、Q45(N末端システインクラスター領域に位置する)およびQ91(LRR領域の第2のβシートと第2のαヘリックスの間のループに位置する)が同定された。これら2種の「ヒト特異的」残基をラットTSHrバックグラウンドに導入すると、キメラの認識が回復した。これらの結果は、Q45およびQ91がIRI-SAb1のエピトープのほぼ確実な部分であるということを示す。最後に、この抗体を、TSHrのLRRのβ鎖のほぼすべてのX2、3、4、5残基がそのLH/CGr対応物と交換されたT90キメラ(3)でFACSによって試験した(詳細については、参照文献(3)および図3C参照)。これらのアミノ酸置換は、IRI-SAb1による認識に影響を及ぼさなかったが、このことは、結合データと一致して(図1C)、この抗体のエピトープはTSHrの馬蹄領域の内表面と重複しないということを示す(図3D)。
種々のmAbをコードするV遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を調べた(図5)。IRI-SAb2とIRI-SAb3の重鎖(93%)および軽鎖(91%)の間にはそれぞれ高い配列同一性が観察される。mAb 1H7は、その重鎖についてはIRI-SAB2またはIRI-SAb3と72〜75%の同一性を、軽鎖については50〜52%の同一性を共有していた(図5)。重鎖CDRの範囲内での置換/サイレント(R/S)突然変異率>2.9は、これらの抗体に対する抗原の陽性選択圧を反映していた(24)。
2種の抗体の、マウスTSHrと相互作用する能力を、ネズミ受容体を発現するCHO細胞株(MT3)を用いて試験した(公開されていないデータ)。FACSによってIRI-SAb1はマウスTSHrと結合しなかったが(上記参照)、IRI-SAb2、IRI-SAb3および1H7は、ヒトおよびネズミ受容体を同様に良好に認識した(図6A)。これらの結果は、エピトープに関するデータと一致する。3種の抗体の相互作用において重要であるとわかった残基は、ヒトおよびネズミTSHr間で100%保存されている。
2種の刺激抗体IRI-SAb2およびIRI-SAb3ならびに阻害抗体1H7を産生するハイブリドーマを、DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweigで2004年5月27日に寄託し、それぞれ受託番号(Eingangsnummern) DSM ACC2664、DSM ACC2662およびDSM ACC2663が割り当てられた。国際寄託当局(DSMZ)の国際受領用紙を同封する。
1つの注目すべき例外はあるが(14)、確かな甲状腺刺激活性を有するモノクローナル抗体は、グレーブス病のネズミモデルからのみ作製されている(11〜13)。このことは自己に対する寛容が破壊されている動物から得ることに成功したことを意味し、さらにこれによってこれらの実験の低収率を説明できる。甲状腺機能亢進性マウス由来のmAbの機能的スクリーニングは通常、ヒト受容体を発現するトランスフェクトされた細胞を用いて行うので、同定されるmAbはマウスとヒトに共通するエピトープを認識すると期待される。実験的グレーブス病のマウスから単離された一連の刺激性mAbおよび阻害性mAbの中で、TSAb活性を有する3種のモノクローナル(IRI-SAb1、IRI-SAb2、IRI-SAb3)および阻害活性を有する1種(参照文献(11)および本出願)を詳細に研究した。
a.IRI-SAb2はヒトTSHrの完全アゴニストである
低いナノモル範囲で作用すると考えられているが(25〜28)、TSAb活性を有する自己抗体は、現在用いられているcAMPベースのアッセイにおいて広範囲の有効性を示す。低塩培地でのTSAbアッセイを実施した結果、感度の大幅な増大が引き起こされたという観察結果から、低塩条件を採り入れて標準臨床TSAb試験を実施することとなった(29)。同様に、TSAb活性を有する第1のネズミmAbを低塩培地で主に試験し(13)、ヒトTSHrの完全または部分アゴニストとしてのその機能についてははっきりしなかった。ハムスターモノクローナル抗体は明らかに部分アゴニストであった(12)。IRI-SAb2には、およびより低い程度であるがIRI-SAb3には例外がある。正常塩条件下で試験した場合に、hTSHr発現CHO細胞においてcAMP蓄積を刺激するその能力は、bTSHによって達成される最大刺激の98%および80%に達し、これは希少な患者で見い出された最強のTSAbに匹敵する。この高い有効性と相まって、その効力はTSHの効力に接近する(EC502.75±0.25nMおよび16.5±3.5nM対bTSHの1nM)。IRI-SAb2とIRI-SAb3双方のヒトTSHrとの結合親和性は、グレーブス病患者から精製した自己抗体の結合親和性に匹敵する(25)。相対的に、これまでに特性決定されたIRI-SAb1(図1A)およびmAb MS-1(12)は弱く、部分アゴニストであり、このことはそれらが「トリガー」エピトープを十分に認識しないことを示唆する。また、釣鐘状の濃度作用曲線を示すMS-1とは対照的に(TSHrのダウンレギュレーションを示すと解釈される)(12)、IRI-SAb2およびIRI-SAb3は片対数プロットで古典的なS字状の濃度作用曲線を示し、高mAb濃度でのダウンレギュレーションまたは脱感作を表すものは全くない(図1A)。最近記載されたヒトモノクローナル(14)は、IRI-SAb2の機能的特徴に接近している。しかし、それが正常塩培地においてヒトTSHrの完全アゴニストとして挙動するかどうかは今後実証すべきことである。
GPCRの二量体形成/オリゴマー形成は現在強く注目される対象である。矛盾する示唆はいくつかあるが、GPCRまたはGPHRの二量体形成/オリゴマー形成状態の修飾が活性化プロセス自体に関与しているという強力な証拠はない。IRI-SAb2およびIRI-SAb3のFab断片を用いた発明者らの結果から、一価の抗体は無傷のIgGであるほど活性であるという患者から得たTSAbを用いた初期の結果(1,30)が確認され、これらの抗体の活性化は強制二量体形成または凝集に続発するものであるということが除外される。
最初の研究から、クローニングしたTSHr cDNAが利用可能になった場合、グレーブス病患者から得たTSAbのエピトープは立体構造であると結論付けた(1,31〜33)。この考えは、刺激活性を有する、本mAb、ならびにこれまでに記載されたmAbを用いて得られた結果と一致している(12,13)。IRI-SAb1はヒトTHSHrとのみ結合し、そのエピトープはエクトドメインのN末端部分に位置していた。このエピトープは、LRR部分のすぐ上流の、エクトドメインの最初のシステインクラスター中に位置するグルタミン残基(Q45)を含む。Q45は高度に立体構造的であると予測され、TSHrの曲がりくねった部分がグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって置換されている構築物においてTSAbとの相互作用に特に十分に曝される受容体のセグメントに属する。IRI-SAb1のエピトープは、第2のLRRのαヘリックス中の、エクトドメインの馬蹄構造の凸面部分に位置する第2のグルタミン残基(Q91)を含む。この馬蹄の面はTSHと直接接触をするとは予測されておらず(3)、このことはIRI-SAb1にTSH置換活性がないことと一致する(図1C)。これによってTBII活性を持たないいくつかの自己抗体がTSAbとして作用できる可能性が高まる。グレーブス病のTBII陰性患者が記載されているが、TSAbの大部分がTSHrとの結合についてTSHと競合するという考えと一致して、彼らはまれである(19)。この見解と一致して、IRI-SAb1はグレーブス患者から得た自己抗体の大部分で置き換えられない(図2A)。
強力な阻害性mAb、1H7のエピトープは、IRI-SAb2およびIRI-SAb3のものと著しく重複している。このエピトープは、5個の残基をそれらの各々と共有している(IRI-SAb2とはT56、K58、R80、Y82、R109、IRI-SAb3とはY82、R109、F130、G132、F134)。この場合も単一のアミノ酸レベルでのこのような重複の解釈は注意して行わなければならない(上記参照)。それにもかかわらず、この観察結果は、刺激抗体と阻害抗体の間の相違は、極めて類似した、すぐ近くのエピトープと関連している可能性があることを強く示す。エクトドメインおよび刺激活性があるまたは刺激活性がない組換えmAb双方の突然変異構築物に関する機能的研究は、活性化トリガーに関わる残基の描写に役立つはずである。驚くことではないが、阻害性mAb 1H7もIRI-SAb2およびIRI-SAb3と同様に、グレーブス病の患者から得た自己抗体で受容体から置き換えられる(図2D)。この観察結果は、「純粋な」阻害活性を有する(すなわち、TSAb活性を示さない)、患者から得た精製自己抗体は、古典的グレーブス病患者から得た自己抗体でTSHrから置き換えられるその能力について精製TSAbと区別することができないということを示す最近の結果と完全に一致している(25)。これらの観察結果とともに、活性化抗体および阻害抗体はエクトドメインのアミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に位置するエピトープを認識するという考え(33、概説)に挑む。
甲状腺中毒症の徴候を示すマウスからのその単離は、IRI-SAb2およびIRI-SAb3は甲状腺機能亢進性状態の原因である(または寄与している)ということを強く示唆した。上記のように、これは自己に対する寛容が破壊されていること、およびこの動物ではいくつかの抗体がネズミTSHrを認識し、活性化できるはずであるということを意味する。IRI-SAb2およびIRI-SAb3は双方とも、ex vivoでマウスTSHrを発現するCHO細胞で試験した場合にこれらの特徴を示す(図6)。予想外にも、このアッセイ系ではIRI-SAb2およびIRI-SAb3は双方ともウシTSHよりも強力なアゴニストであった(図6)。それらはエクトドメインの活性な立体構造をウシTSHよりも効率的に安定化するということが考えられ、ネズミTSHを用いる状況は調査されていない。
すでに言及したように、本出願に記載されるモノクローナル抗体は、TSHrの活性化に関与する分子機構を調査するための有望な新規ツールとなる。
Claims (9)
- ヒトTSH受容体(hTSHr)に対してマウスを遺伝子免疫し、抗体の存在について陽性のスコアを有するマウスを選択し、選択したマウスの脾臓細胞を用いてハイブリドーマを作製し、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを増殖、試験および選択することによって得られる甲状腺刺激活性を有し、2004年5月27日にブタペスト条約のもとでDSMZ、BraunschweigにIRI-SAb2(DSM ACC2664)およびIRI-SAb3(DSM ACC2662)の名称で寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体あるいは前記モノクローナル抗体の断片(F(ab')2、FabもしくはFv)。
- ヒトTSH受容体に対してマウスを遺伝子免疫し、抗体の存在について陽性のスコアを有するマウスを選択し、選択したマウスの脾臓細胞を用いてハイブリドーマを作製し、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを増殖、試験および選択することによって得られる甲状腺阻害活性を有し、2004年5月27日、ブタペスト条約のもと、DSMZ、Braunschweigで1H7(DSM ACC2663)の名称で寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体あるいは前記モノクローナル抗体の断片(F(ab')2、FabもしくはFv)。
- モノクローナル抗体がIgGイソタイプIgG2Aに属し、配列番号1の重鎖と配列番号2の軽鎖とを含む(IRI-SAb2)、または前記抗体に由来する断片であることを特徴とする、請求項1に記載の抗体または断片。
- モノクローナル抗体がIgGイソタイプIgG1に属し、配列番号9の重鎖と配列番号10の軽鎖とを含む(IRI-SAb3)、または前記抗体に由来する断片であることを特徴とする、請求項1に記載の抗体または断片。
- TSH受容体に対する自己抗体(TRAb)を測定するための競合in vitroイムノアッセイまたはin vitroバイオアッセイにおける、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体または断片の使用。
- 抗体または断片が、TSHrとのその結合の検出を可能にする標識を有する、請求項5に記載の使用。
- 前記抗体が、TSHrを提示する組織および/または細胞のin vivoイメージングを可能にする放射性同位元素で標識されているか、または放射性同位元素を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体または断片の使用。
- 2004年5月27日にブタペスト条約のもとでDSMZ、BraunschweigにIRI-SAb2(DSM ACC2664)またはIRI-SAb3(DSM ACC2662)の名称で寄託された細胞。
- 2004年5月27日、ブタペスト条約のもと、DSMZ、Braunschweigで1H7(DSM ACC2663)の名称で寄託された細胞。
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