ES2538790T3 - Métodos para la producción de polipéptidos en mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas - Google Patents

Métodos para la producción de polipéptidos en mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas Download PDF

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Abstract

Método para producir un polipéptido, que comprende: (a) cultivo de un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum en un medio para la producción del polipéptido, donde la cepa mutante comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas; y (b) recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para la producción de polipéptidos en mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas
Referencia a un listado de secuencias 5
[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en forma informáticamente legible. La forma informáticamente legible se incorpora aquí por referencia.
Antecedentes de la invención 10
Campo de la invención
[0002] La presente invención se refiere a métodos de producción de polipéptidos en cepas mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas, cepas mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas y métodos de 15 obtención de las cepas mutantes de Fusarium venenatum deficientes en enzimas.
Descripción de las técnicas relacionadas
[0003] Fusarium venenatum ha demostrado ser útil como célula huésped para la producción recombinante de 20 polipéptidos con actividad biológica (WO 96/00787, WO 97/26330). Los huéspedes de Fusarium venenatum con los rasgos deseables de expresión y secreción de proteína aumentados pueden no tener necesariamente las características más deseables para la fermentación exitosa. La fermentación puede no ser óptima debido a la producción de sustancias biológicas, por ejemplo, enzimas, perjudiciales para la producción, recuperación, o solicitud de un polipéptido de interés en particular. 25
[0004] El documento WO 99/60137 divulga mutantes de Fusarium venenatum deficientes en tricoteceno. El documento WO 00/42203 divulga mutantes de Fusarium venenatum deficientes en ciclohexadopsipéptidos.
[0005] El documento WO9812300 divulga especies de Fusarium para la expresión génica heteróloga que están 30 modificadas genéticamente para expresar niveles reducidos de una proteasa alcalina mediante mutaciones del gen alp.
[0006] La presente invención se refiere a huéspedes de Fusarium venenatum mejorados que combinan la capacidad de la expresión de cantidades comerciales de un polipéptido de interés mientras son deficientes en la producción de 35 enzimas que pueden complicar la recuperación y el siguiente procesamiento del polipéptido.
Resumen de la invención
[0007] La presente invención se refiere a métodos de producción de un polipéptido, que comprenden: 40
1. (a) cultivo de un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum en un medio para la producción del polipéptido, donde la cepa mutante comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa-amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre 45 de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas; y
2. (b) recuperación del polipéptido del medio de cultivo.
[0008] En un aspecto de los métodos de producción de un polipéptido, la cepa mutante comprende además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el primero o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la 50 cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
[0009] La presente invención también se refiere a mutantes de una cepa madre de Fusarium venenatum, que 55 comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
60
[0010] En un aspecto, los mutantes de una cepa madre de Fusarium venenatum comprenden además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el primero o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. 65
[0011] La presente invención también se refiere a métodos para obtener un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum, que comprende:
1. (a) la modificación de pyrG, amyA y alpA; y
2. (b) la identificación de una cepa mutante del paso (a) donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la 5 deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
[0012] Preferiblemente, en los aspectos de la invención, el polipéptido es nativo o foráneo a la cepa de Fusarium 10 venenatum.
[0013] En un aspecto, los métodos de obtención de mutantes de una cepa madre de Fusarium venenatum comprenden además la modificación de uno o ambos de los genes tri5 y dps1 que dejan la cepa mutante deficiente en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en 15 comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
Breve descripción de las figuras
[0014] 20
La Figura 1 muestra un mapa de restricción de pDM156.2.
La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pEmY21.
La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pEmY23.
La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pWTY1470-19-07. 25
La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pWTY1515-2-01.
La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pJaL504-[Bam HI].
La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pJaL504-[Bgl II].
La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pJaL574.
La Figura 9 muestra un mapa de restricción de pWTY1449-02-01. 30
La Figura 10 muestra un mapa de restricción de pJfyS1540-75-5.
La Figura 11 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-1-13.
La Figura 12 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-8-6.
La Figura 13 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-21-16.
La Figura 14 muestra un mapa de restricción de pAILo1492-24. 35
La Figura 15 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-35-2.
La Figura 16 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-41-11.
La Figura 17 muestra un mapa de restricción de pJfyS1604-55-13.
La Figura 18 muestra un mapa de restricción de pJfyS1579-93-1.
La Figura 19 muestra un mapa de restricción de pJfyS1604-17-2. 40
La Figura 20 muestra un mapa de restricción de pEJG61.
La Figura 21 muestra un mapa de restricción de pEJG69.
La Figura 22 muestra un mapa de restricción de pEJG65.
La Figura 23 muestra un mapa de restricción de pMStr19.
La Figura 24 muestra un mapa de restricción de pEJG49. 45
La Figura 25 muestra un mapa de restricción de pEmY15.
La Figura 26 muestra un mapa de restricción de pEmY24.
La Figura 27 muestra un mapa de restricción de pDM257.
La Figura 28 muestra un mapa de restricción de pDM258.
La Figura 29 muestra que la oxidasa de lactosa produce transformantes de Fusarium venenatum JfyS 1643-95-04 50 (tri5 pyrG amyA).
La Figura 30 muestra la actividad de alfa amilasa relativa de transformantes de transformantes de Fusarium venenatum JfyS1643-95-04 (tri5 pyrG amyA).
La Figura 31 muestra un mapa de restricción de pJfyS1698-65-15.
La Figura 32 muestra un mapa de restricción de pJfyS1698-72-10. 55
La Figura 33 muestra la actividad de proteasa alcalina relativa de transformantes de Fusarium venenatum JfyS1763-11-01 (tri5 pyrG amyA alpA).
La Figura 34 muestra un mapa de restricción de pJfyS1879-32-2.
La Figura 35 muestra un mapa de restricción de pJfyS111.
60
Definiciones
[0015] Orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa: el término "orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa" se define aquí como una ligasa UTP:amonio (formación de ADP) (EC 6.3.4.2) que cataliza la conversión del ATP + UTP + NH3 a ADP + fosfato + CTP. Para fines de la presente invención, la actividad de la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa 65 se determina según el método descrito por Liberman, 1956, Journal of Biological Chemistry 222: 765-775).
[0016] Alfa amilasa: el término "alfa amilasa" se define aquí como un 1,4--D-glucano glucanohidrolasa (EC 3.2.1.1) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4--D-glucosídicos en polisacáridos que contienen tres o más unidades D-glucosa unidas a 1,4-. Para fines de la presente invención, la actividad de la alfa amilasa se determina usando el 4,6-etilideno (G7)-p-nitrofenil (G1)-alfa-D-maltoheptasida como sustrato y Sigma Chemical Co. Kit 577 (St. Louis, 5 MO, EE.UU) a pH 7,0.
[0017] Proteasa alcalina: el término "proteasa alcalina" se define aquí como una proteasa serina que cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos en proteínas. Para fines de la presente invención, la actividad de proteasa alcalina se determina según el procedimiento descrito en ejemplo 28. 10
[0018] Tricotecenos: el término "tricotecenos" se define aquí como una familia de epóxidos sesquiterpénicos producidos por una secuencia de oxigenaciones, isomerizaciones, ciclizaciones y esterificaciones que llevan del tricodieno a los tricotecenos más complejos (Desjardins, Hohn y McCormick, 1993, Microbiological Reviews 57: 595-604). Los tricotecenos incluyen, pero de forma no limitativa, 2-hidroxitricodieno, 12,13-epoxi-9,10-tricoeno-2-ol, 15 isotricodiol, isotricotriol, tricotriol, isotricodermol, isotricodermina, 15-decalonectrina, 3,15-didecalonectrina, deoxinivalenol, 3-acetildeoxinivalenol, calonectrina, 3,15-diacetoxiscirpenol, 3,4,15-triacetoxiscirpenol, 4,15-diacetoxiscirpenol, 3-acetilneosolaniol, toxina acetil T-2 y toxina T-2; y derivados de los mismos.
[0019] Tricodieno sintasa: el término "tricodieno sintasa" se define aquí como una dextrina 6-alfa-D-glucanohidrolasa 20 que cataliza la isomerización-ciclización de farnesilpirofosfato para formar el tricodieno de olefina bicíclico. Para fines de la presente invención, la actividad de tricodieno sintasa se determina según el procedimiento descrito por Hohn y Beremand, 1989, Applied and Environmental Microbiology 55: 1500-1503.
[0020] El nivel de tricotecenos producido por una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención se 25 puede determinar usando métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Rood et al., 1988, Journal of Agricultural and Food Chemistry 36: 74-79; Romer, 1986, Journal of the Association of Official Analytical Chemists 69: 699-703; McCormick et al., 1990, Applied and Environmental Microbiology 56: 702-706).
[0021] Ciclohexadopsipéptidos: el término "ciclohexadopsipéptidos" se define aquí como una familia de compuestos 30 relacionados con péptidos compuestos de ácidos hidroxi y amino enlazados por enlaces amida y éster. El término ciclohexadopsipéptidos incluye, pero de forma no limitativa, eniatinas.
[0022] Eniatinas: el término "eniatinas" se define aquí como una familia de ciclohexadopsipéptidos compuesta por tres residuos de ácido D-2-hidroxiisovalérico unidos alternativamente a ácidos L-amino o ácidos N-metil-L-amino 35 para producir una estructura cíclica de 18 miembros. Las eniatinas son fitotoxinas ciclohexadepsipeptídicas con propiedades ionoforéticas producidas por varias especies de actinomicetos y hongos filamentosos, particularmente cepas de Fusarium. Las eniatinas incluyen, pero de forma no limitativa, eniatina A, A1, B, B1, B2, B3, B4, C, D, E y F; y derivados de las mismas (Visconte et al., 1992, Journal of Agricultural and Food Chemistry 40: 1076-1082; Tomodo et al., 1992, Journal of Antibiotics 45: 1207-1215) y eniatinas de tipo mixto que contienen más de una especie de 40 aminoácido (Zocher et al. 1982, Biochemistry 21: 43-48).
[0023] La biosíntesis de eniatinas se cataliza con la eniatin sintetasa, que es una enzima multifuncional grande que tiene todas las funciones esenciales para ensamblar eniatinas a partir de sus precursores primarios, es decir, ácido D-2-hidroxiisovalérico, un ácido L-amino de cadena ramificada (por ejemplo, valina, leucina, isoleucina), S-45 adenosilmetionina y ATP (Reper et al., 1995, European Journal of Biochemistry 230: 119-126). Los precursores (ácido D-2-hidroxiisovalérico y ácido L-amino de cadena ramificada) se activan como tioésteres. Los residuos de aminoácidos de sustrato unidos de manera covalente se metilan bajo el consumo de S-adenosilmetionina. Luego ocurre la formación del enlace peptídico y las reacciones de ciclización.
50
[0024] La ciclohexadepsipéptido sintetasa: el término "ciclohexadepsipéptido sintetasa" se define aquí como una sintetasa que cataliza la producción de un ciclohexadepsipéptido a partir de ácido D-2-hidroxiisovalérico, un ácido L-amino de cadena ramificada (por ejemplo, valina, leucina, isoleucina), S-adenosilmetionina y ATP. Para fines de la presente invención, la actividad de la ciclohexadepsipéptido sintetasa se determina midiendo la producción de un ciclohexadepsipéptido según el procedimiento de Zocher et al., 1982, Biochemistry 21: 43-48. Específicamente, la 55 ciclohexadepsipéptido sintetasa se incuba con 1 mM valina, 0,2 mM S-adenosilmetionina, 0,2 mM ácido D-2-hidroxiisovalérico, 4 mM ATP y 4 mM acetato magnésico en un volumen total de 100 µl durante 10 minutos a 37°C en 50 mM MOPS a pH 7,0. La cantidad de ciclohexadepsipéptido se determina como se describe en el documento WO 2000/92203 basado en el método de Visconti et al., 1992, Journal of Agriculture and Food Chemistry 40: 1076-1082. Una unidad de actividad de ciclohexadepsipéptido sintetasa se define como 1,0 µmol de 60 ciclohexadepsipéptido producido por minuto a 37°C a pH 7,0.
[0025] El nivel de ciclohexadopsipéptidos se puede determinar según el método de Visconti et al., 1992, Journal of Agriculture and Food Chemistry 40: 1076-1082. Específicamente, se extrae dos veces un ml de caldo de cultivo libre de células de Fusarium venenatum con 2,0 ml etil acetato. Los extractos orgánicos combinados se evaporan hasta la 65 sequedad bajo una corriente de gas nitrógeno y se redisuelven en 0,5 ml hexano. Se analizan muestras de un
microlitro utilizando un sistema Hewlett-Packard 6890 GC/Series MSD que opera en modo de impacto de electrones (EI). Las muestras se inyectan en columna y se separan utilizando una columna capilar DB-5 (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm película) utilzando un programa de temperatura con calentamiento de 120 a 300°C a un índice de 15°C/minuto. Por ejemplo, las eniatinas A, A1, B, B1, B2 y B3 se identifican con índices m/z para el ión (M+ + H) 682, 668, 640, 654, 626 y 612, respectivamente. 5
[0026] Deficiente: el término "deficiente" se define aquí como una cepa mutante de Fusarium venenatum que no produce ninguna actividad detectable de una o más enzimas (diferentes) seleccionadas del grupo consistente en orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina y alternativamente también una o ambas de las enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa en comparación con la cepa madre de Fusarium 10 venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. El nivel de enzima producido por una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención se puede determinar utilizando métodos descritos aquí o conocidos en la técnica.
[0027] Polipéptido aislado: el término "polipéptido aislado" como se usa aquí se refiere a un polipéptido que está 15 aislado de una fuente. En un aspecto preferido, el polipéptido es al menos un 1% puro, preferiblemente al menos un 5% puro, de forma más preferible al menos un 10% puro, de forma más preferible al menos un 20% puro, de forma más preferible al menos un 40% puro, de forma más preferible al menos un 60% puro, de forma aún más preferible al menos un 80% puro y de la forma más preferible al menos un 90% puro, como se determina por SDS-PAGE.
20
[0028] Polipéptido sustancialmente puro: el término "polipéptido sustancialmente puro" denota aquí una preparación de polipéptido que contiene como mucho un 10%, preferiblemente como mucho un 8%, de forma más preferible como mucho un 6%, de forma más preferible como mucho un 5%, de forma más preferible como mucho un 4%, de forma más preferible como mucho un 3%, de forma aún más preferible como mucho un 2%, de la forma más preferible como mucho un 1%, e incluso de la forma más preferible como mucho un 0,5% en peso de otro material 25 polipeptídico con el cual está asociado nativamente o recombinantemente. Es, por lo tanto, preferido que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos un 92% puro, preferiblemente al menos un 94% puro, de forma más preferible al menos un 95% puro, de forma más preferible al menos un 96% puro, de forma más preferible al menos un 97% puro, de forma más preferible al menos un 98% puro, de forma aún más preferible al menos un 99% puro, de la forma más preferible al menos un 99,5% puro, e incluso de la forma más preferible 100% puro en peso del 30 material de polipéptido total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura, es decir, que la preparación del polipéptido está esencialmente libre de otro material de polipéptido con el cual está asociado nativamente o recombinantemente. Esto se puede realizar, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación tradicional. 35
[0029] Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" se define aquí como un polipéptido con actividad enzimática que está en su forma final siguiente a la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como tratamiento del N-terminal, truncamiento del C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc.
40
[0030] Secuencia codificante de polipéptido maduro: el término "secuencia codificante de polipéptido maduro" se define aquí como una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido maduro con actividad enzimática.
[0031] Identidad: la relación entre dos secuencias de aminoácido o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad". 45
[0032] Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276- 277), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los 50 parámetros opcionales usados son penalización por apertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:
55
(Residuos idénticos x 100) / (Longitud de alineamiento - Número total de gaps en el alineamiento)
[0033] Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 60 Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización por apertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:
65
(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100) / (Longitud de alineamiento - Número total de gaps en el alineamiento)
[0034] Fragmento de polipéptido: el término "fragmento de polipéptido" se define aquí como un polipéptido con uno o más aminoácidos (diferentes) eliminados del terminal amino y/o carboxil de un polipéptido maduro o una secuencia homóloga del mismo; donde el fragmento tiene actividad enzimática, por ejemplo, actividad de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa, proteasa alcalina, tricodieno sintasa o ciclohexadepsipéptido sintetasa. 5
[0035] Subsecuencia: el término "subsecuencia" se define aquí como una secuencia de nucleótido con uno o más nucleótidos (diferentes) eliminados del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipéptido maduro o una secuencia homóloga de la misma; donde la subsecuencia codifica un fragmento de polipéptido con actividad enzimática, por ejemplo, actividad de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa, proteasa alcalina, 10 tricodieno sintasa, o ciclohexadepsipéptido sintetasa.
[0036] Variante alélica: el término "variante alélica" denota aquí cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede resultar en el polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (ningún 15 cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
[0037] Polinucleótido aislado: el término "polinucleótido aislado" como se usa aquí se refiere a un polinucleótido que está aislado de una fuente. En un aspecto preferido, el polinucleótido es al menos un 1% puro, preferiblemente al 20 menos un 5% puro, de forma más preferible al menos un 10% puro, de forma más preferible al menos un 20% puro, de forma más preferible al menos un 40% puro, de forma más preferible al menos un 60% puro, incluso de forma más preferible al menos un 80% puro y de la forma más preferible al menos un 90% puro, como se determina por electroforesis de agarosa.
25
[0038] Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" como se usa aquí se refiere a una preparación de polinucleótidos libre de otros nucleótidos extraños o indeseados y en una forma adecuada para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas genéticamente modificadas. Así, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como mucho un 10%, preferiblemente como mucho un 8%, de forma más preferible como mucho un 6%, de forma más preferible como mucho un 5%, de forma más preferible como 30 mucho un 4%, de forma más preferible como mucho un 3%, de forma aún más preferible como mucho un 2%, de la forma más preferible como mucho un 1%, e incluso de la forma más preferible como mucho un 0,5% en peso de otro material polinucleótido con el cual está asociado nativamente o recombinantemente. Un polinucleótido sustancialmente puro puede, no obstante, incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos un 90% puro, 35 preferiblemente al menos un 92% puro, de forma más preferible al menos un 94% puro, de forma más preferible al menos un 95% puro, de forma más preferible al menos un 96% puro, de forma más preferible al menos un 97% puro, de forma aún más preferible al menos un 98% puro, de la forma más preferible al menos un 99% puro, e incluso de la forma más preferible al menos un 99,5% en peso puro. Los polinucleótidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura, es decir, que la preparación de polinucleótidos está 40 esencialmente libre de otro material polinucleótido con el que está asociado nativamente o recombinantemente. Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos.
[0039] Secuencia codificante: cuando se usa aquí el término "secuencia codificante" significa una secuencia de 45 nucleótidos, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente con un marco de lectura abierto, que empieza con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codón de terminación tal como TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser una secuencia de nucleótidos de ADN, ADNc, sintético, o recombinante. 50
[0040] ADNc: el término "ADNc" se define aquí como una molécula de ADN que se puede preparar mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura, empalmada, obtenida de una célula eucariota. El ADNc carece de secuencias de intrón que están presentes normalmente en el ADN genómico correspondiente. La transcripción de ARN inicial primaria es un precursor para el ARNm que se procesa a través de una serie de pasos 55 antes de aparecer como ARNm maduro empalmado. Estos pasos incluyen la eliminación de secuencias de intrón mediante un proceso llamado empalme. El ADNc derivado de ARNc carece, por lo tanto, de cualquier secuencia de intrón.
[0041] Constructo de ácidos nucleicos: el término "constructo de ácidos nucleicos" como se utiliza en este caso se 60 refiere a una molécula de ácido nucleico, bien uni- o bicatenaria, que se aísla a partir de un gen de origen natural o modificado para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera que de lo contrario no existirían en la naturaleza o que son sintéticos. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término "cassette de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. 65
[0042] Secuencias de control: el término "secuencias de control" se define aquí para incluir todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o foránea a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o nativa o foránea entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de transcripción. Como 5 mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traslacional. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlaces con motivo de introducir sitios de restricción específicos que facilitan el ligamiento de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.
10
[0043] Enlazado operativamente: el término "enlazado operativamente" denota aquí una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada relativa a la secuencia de codificación de la secuencia polinucleótida de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.
15
[0044] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitándose a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
[0045] Vector de expresión: el término "vector de expresión" se define aquí como una molécula de ADN lineal o 20 circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención y está enlazado operativamente a nucleótidos adicionales que prevén su expresión.
[0046] Célula huésped: el término "célula huésped", como se utiliza en este caso, incluye cualquier tipo celular susceptible a la transformación, transfección, transducción y similares con un constructo de ácidos nucleicos o vector 25 de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención.
[0047] Modificación: el término "modificación" se define aquí como una introducción, sustitución, o eliminación de uno o varios nucleótidos en un gen o una secuencia de control necesaria para la transcripción o traducción de la misma, o interrupción génica, conversión génica, deleción génica, o mutagénesis aleatoria o específica de amyA, 30 alpA, dps1, pyrG, tri5, o una combinación de los mismos. La deleción de uno o varios genes (diferentes) de amyA, alpA, dps1, pyrG y tri5 puede ser parcial o completa. La modificación produce una reducción en o una eliminación (inactivación) de la expresión de pyrG, amyA, alpA, tri5, dps1, o una combinación de los mismos. En un aspecto preferido, se inactivan uno o varios (diferentes).
35
Descripción detallada de la invención
[0048] La presente invención se refiere a métodos de producción de un polipéptido, que comprenden:
(a) el cultivo de un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum en un medio para la producción del 40 polipéptido, donde la cepa mutante comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas; y
(b) la recuperación del polipéptido del medio de cultivo. 45
[0049] En un aspecto de los métodos de producción de un polipéptido, la cepa mutante comprende además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el primero o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones 50 idénticas.
[0050] Una ventaja de la presente invención es la eliminación de una o varias actividades enzimáticas que pueden ser perjudiciales para la producción, tratamiento posterior, por ejemplo, recuperación y/o solicitud de un polipéptido particular de interés. 55
[0051] La presente invención también se refiere a mutantes de una cepa madre de Fusarium venenatum, que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum 60 cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
[0052] La presente invención también se refiere a métodos para la obtención de un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum, que comprende:
65
(a) la modificación de pyrG, amyA y alpA; y
(b) la identificación de una cepa mutante del paso (a) donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
5
[0053] En los métodos de la presente invención, la cepa madre de Fusarium venenatum puede ser una cepa de Fusarium venenatum de tipo natural o un mutante de la misma. Se entiende que el término "Fusarium venenatum" también incluye variedades de Fusarium venenatum (véase, por ejemplo, Robert A. Samsom y John I. Pitt, editores, Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus Classification, Harwoord Academic Publishers, Países Bajos). En un aspecto, la cepa madre de Fusarium venenatum es Fusarium venenatum A3/5. En 10 otro aspecto, la cepa madre de Fusarium venenatum es Fusarium venenatum NRRL 30747. En otro aspecto, la cepa madre de Fusarium venenatum es Fusarium venenatum ATCC 20334. En otro aspecto, la cepa madre de Fusarium venenatum es un mutante morfológico (WO 97/26330).
[0054] La cepa mutante de Fusarium venenatum deficiente en enzimas se puede construir eliminando la expresión 15 de uno o varios genes (diferentes) seleccionados del grupo consistente en pyrG, amyA y alpA y alternativamente también uno o ambos de los genes tri5 y dps1 usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como inserciones, interrupciones, reemplazos, o deleciones. Una parte del gen se puede modificar como la región de codificación o una secuencia de control necesaria para la expresión de la región de codificación. Tal secuencia de control de un gen puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, es decir, una parte 20 suficiente para afectar la expresión del gen. Por ejemplo, se puede inactivar una secuencia promotora dando como resultado ninguna expresión. Otras secuencias de control para la posible modificación incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, secuencia de propéptido, secuencia de señal, terminador de transcripción y activador transcripcional.
25
[0055] Las cepas mutantes de Fusarium venenatum se pueden construir mediante técnicas de deleción génica para eliminar o reducir la expresión de un gen. Las técnicas de deleción génica permiten la eliminación parcial o completa del gen eliminando así su expresión. En tales métodos, la deleción del (los) gen(es) se realiza mediante recombinación homóloga utilizando un plásmido que se ha construido para contener contiguamente las regiones 5' y 3' que flanquean el gen. 30
[0056] Las cepas mutantes de Fusarium venenatum también se pueden construir mediante introducción, sustitución y/o eliminación de uno o varios nucleótidos (diferentes) en el gen o una secuencia de control del mismo necesaria para la transcripción o traducción del mismo. Por ejemplo, se pueden insertar o eliminar nucleótidos para dar como resultado la introducción de un codón de terminación, la eliminación del codón de inicio, o un desplazamiento del 35 marco de lectura del marco de lectura abierto. Tal modificación se puede realizar mediante mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis por PCR conforme a métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Botstein y Shortle, 1985, Science 229: 4719; Lo et al., 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences 81: 2285; Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351; Shimada, 1996, Meth. Mol. Biol. 57: 157; Ho et al., 1989, Gene 77: 61; Horton et al., 1989, Gene 77: 61; y Sarkar y Sommer, 1990, BioTechniques 8: 404. 40
[0057] Las cepas mutantes de Fusarium venenatum también se pueden construir mediante técnicas de interrupción génica mediante la inserción en un gen de un constructo de ácidos nucleicos interruptor que comprende un(os) fragmento(s) de ácido nucleico homólogo(s) al gen que creará una duplicación de la región de homología y que incorporará el constructo de ADN entre las regiones duplicadas. Tal interrupción génica puede eliminar la expresión 45 génica si la construcción insertada separa el promotor del gen de la región de codificación o interrumpe la secuencia codificante de manera que resulta un producto génico no funcional. Una construcción de interrupción puede ser simplemente un gen marcador seleccionable acompañado por regiones 5' y 3' homólogas al gen. El marcador seleccionable permite la identificación de transformantes que contienen el gen interrumpido.
50
[0058] Las cepas mutantes de Fusarium venenatum también se pueden construir mediante el proceso de conversión de gen (véase, por ejemplo, Iglesias y Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189: 73-76). Por ejemplo, en el método de conversión génica, una secuencia de nucleótidos que corresponde con el (los) gen(es) se mutageniza in vitro para producir una secuencia de nucleótidos defectuosa, que se transforma posteriormente en la cepa madre de Fusarium venenatum para producir un gen defectuoso. Mediante recombinación homóloga, la secuencia de 55 nucleótidos defectuosa reemplaza el gen endógeno. Puede ser deseable que la secuencia de nucleótidos defectuosa también comprenda una etiqueta para la selección de transformantes que contengan el gen defectuoso.
[0059] Las cepas mutantes de Fusarium venenatum también se pueden construir mediante técnicas de antisentido establecidas que utilizan una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del gen 60 (Parish y Stoker, 1997, FEMS Microbiology Letters 154: 151-157). Más específicamente, la expresión del gen por una cepa de Fusarium venenatum se puede reducir o inactivar mediante la introducción de una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del gen, que se puede transcribir en la cepa y es capaz de hibridar el ARNm producido en la cepa. Bajo condiciones que permiten que la secuencia de nucleótidos de antisentido complementaria hibride el ARNm, la cantidad de proteína traducida se elimina así. 65
[0060] Las cepas mutantes de Fusarium venenatum también se pueden construir mediante técnicas de interferencia de ARN (ARNi) establecidas (véase, por ejemplo, WO 2005/056772).
[0061] Las cepas mutantes de Fusarium venenatum pueden ser además construidas mediante mutagénesis aleatoria o específica usando métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen, pero no de forma limitativa, 5 mutagénesis química (véase, por ejemplo, Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J.R. Norris y D.W. Ribbons, eds.) págs. 363-433, Academic Press, Nueva York, 1970). La modificación del gen se puede realizar sometiendo la cepa madre a mutagénesis y visualizando cepas mutantes donde la expresión del gen ha sido inactivada. La mutagénesis, que puede ser específica o aleatoria, puede realizarse, por ejemplo, usando un agente mutagenizante químico o físico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN 10 a mutagénesis por PCR. Además, la mutagénesis se puede realizar usando cualquier combinación de estos métodos mutagenizantes.
[0062] Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para este fin incluyen radiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), N-metil-N'-nitrosogaunidina (NTG) O-metil 15 hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico y análogos de nucleótidos. Cuando se usan tales agentes, la mutagénesis se realiza normalmente mediante la incubación de la cepa madre por mutagenizar en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas y mediante selección de mutantes que no muestran ninguna expresión de un gen.
20
[0063] En un aspecto, el gen pyrG comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa que comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la 25 forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 44. En otro aspecto, el gen pyrG comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 44. En otro aspecto, el gen pyrG comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa que consiste en la secuencia de aminoácidos 30 de SEC ID nº 44.
[0064] En otro aspecto, el gen pyrG comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún 35 más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 43. En otro aspecto, el gen pyrG comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 43. En otro aspecto, el gen pyrG consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 43.
40
[0065] En otro aspecto, el gen pyrG comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones de astringencia preferiblemente muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia media, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 43 o su cadena complementaria en toda su longitud. 45
[0066] En otro aspecto, la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e 50 incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 44. En otro aspecto, la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 44. En otro aspecto, la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 44.
55
[0067] En otro aspecto, la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa se codifica por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 60 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 43. En otro aspecto, la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa se codifica por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 43. En otro aspecto, la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa se codifica por un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 43.
65
[0068] En otro aspecto, la orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa se codifica por un polinucleótido que comprende
una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia medias, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 43 o su cadena complementaria en toda su longitud. 5
[0069] En otro aspecto, el gen amyA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de alfa amilasa que comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más 10 preferible al menos un 90%, de forma más preferible al menos un 95% y de la forma aún más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 52. En otro aspecto, el gen amyA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de alfa amilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 52. En otro aspecto, el gen amyA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de alfa amilasa que 15 consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 52.
[0070] En otro aspecto, el gen amyA comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma 20 aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 51. En otro aspecto, el gen amyA comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 51. En otro aspecto, el gen amyA consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 51.
25
[0071] En otro aspecto, el gen amyA comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia media, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 51 o su cadena complementaria en toda su longitud. 30
[0072] En otro aspecto, la alfa amilasa comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más 35 preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 52. En otro aspecto, la alfa amilasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 52. En otro aspecto, la alfa amilasa consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 52.
[0073] En otro aspecto, la alfa amilasa se codifica mediante un polinucleótido que comprende una secuencia de 40 nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 51. En otro aspecto, la alfa amilasa se 45 codifica por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 51. En otro aspecto, la alfa amilasa se codifica por un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 51.
[0074] En otro aspecto, la alfa amilasa se codifica por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible 50 condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia medias, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 51 o su cadena complementaria en toda su longitud.
55
[0075] En otro aspecto, el gen alpA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de proteasa alcalina que incluye una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al 60 menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 84. En otro aspecto, el gen alpA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de proteasa alcalina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 84. En otro aspecto, el gen alpA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de proteasa alcalina que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 84. 65
[0076] En otro aspecto, el gen alpA comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos 5 de la SEC ID nº 83. En otro aspecto, el gen alpA comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 83. En otro aspecto, el gen alpA consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 83.
[0077] En otro aspecto, el gen alpA comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más 10 preferible condiciones de astringencia medias, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 83 o su cadena complementaria en toda su longitud.
[0078] En otro aspecto, la proteasa alcalina comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al 15 menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 84. En otro aspecto, la alfa amilasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC 20 ID nº 84. En otro aspecto, la alfa amilasa consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 84.
[0079] En otro aspecto, la proteasa alcalina se codifica por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, 25 de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 83. En otro aspecto, la proteasa alcalina se codifica por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 83. En otro aspecto, la proteasa alcalina se codifica por un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 83. 30
[0080] En otro aspecto, la proteasa alcalina se codifica por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia media, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y 35 de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 83 o su cadena complementaria en toda su longitud.
[0081] En otro aspecto, el gen tri5 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad tricodieno sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, 40 de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 20. En otro aspecto, el gen tri5 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica 45 un polipéptido con actividad de tricodieno sintasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 20. En otro aspecto, el gen tri5 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tricoodieno sintasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 20.
[0082] En otro aspecto, el gen tri5 comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, 50 de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 19. En otro aspecto, el gen tri5 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 19. En otro 55 aspecto, el gen tri5 consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 19.
[0083] En otro aspecto, el gen tri5 comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia medias, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de 60 forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 19 o su cadena complementaria en toda su longitud.
[0084] En otro aspecto, la tricodieno sintasa comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más 65 preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%,
de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 20. En otro aspecto, la tricodieno sintasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 20. En otro aspecto, la tricodieno sintasa consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 20. 5
[0085] En otro aspecto, la tricodieno sintasa se codifica por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible 10 al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 19. En otro aspecto, la tricodieno sintasa se codifica por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 19. En otro aspecto, la tricodieno sintasa se codifica por un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 19.
15
[0086] En otro aspecto, la tricodieno sintasa se codifica por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia medias, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 19 20 o su cadena complementaria en toda su longitud.
[0087] En otro aspecto, el gen dps1 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de ciclohexadepsipéptido sintetasa que comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más 25 preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 94. En otro aspecto, el gen dps1 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de ciclohexadepsipéptido sintetasa que comprende la 30 secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 94. En otro aspecto, el gen dps1 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de ciclohexadepsipéptido sintetasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 94.
[0088] En otro aspecto, el gen dps1 comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, 35 de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 93. En otro aspecto, el gen dps1 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 93. En otro 40 aspecto, el gen dps1 consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 93.
[0089] En otro aspecto, el gen dps1 comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia medias, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de 45 forma aún más preferible condiciones de astringencia altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 93 o su cadena complementaria en toda su longitud.
[0090] En otro aspecto, la ciclohexadepsipéptido sintetasa comprende una secuencia de aminoácidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 50 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 94. En otro aspecto, la ciclohexadepsipéptido sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 94. En otro aspecto, la ciclohexadepsipéptido sintetasa 55 consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 94.
[0091] En otro aspecto, la ciclohexadepsipéptido sintetasa se codifica por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos con preferiblemente al menos un 60%, de forma más preferible al menos un 65%, de forma más preferible al menos un 70%, de forma más preferible al menos un 75%, de forma más preferible al menos 60 un 80%, de forma más preferible al menos un 85%, de forma aún más preferible al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 93. En otro aspecto, la ciclohexadepsipéptido sintetasa se codifica por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 93. En otro aspecto, la ciclohexadepsipéptido sintetasa se codifica por un polinucleótido que consiste en 65 la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 93.
[0092] En otro aspecto, la ciclohexadepsipéptido sintetasa se codifica por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo preferiblemente condiciones de astringencia muy bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia bajas, de forma más preferible condiciones de astringencia medias, de forma más preferible condiciones de astringencia medias-altas, de forma aún más preferible condiciones de astringencia 5 altas y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy altas con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 93 o su cadena complementaria en toda su longitud.
[0093] Las secuencias de nucleótidos aquí descritas o subsecuencias de las mismas, al igual que las secuencias de aminoácidos de las mismas o fragmentos de las mismas, se pueden utilizar para diseñar muestras de ácido nucleico 10 para identificar y clonar ADN homólogo de los genes anteriormente descritos a partir de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales muestras se pueden usar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o especies de interés, seguido de procedimientos de hibridación Southern blot estándar, para identificar y aislar el gen correspondiente en ellos. Tales muestras pueden ser considerablemente más cortas que toda la secuencia, pero deberían ser al menos 15, preferiblemente al menos 15 25 y de forma más preferible al menos 35 nucleótidos de longitud. También se pueden usar muestras más largas. Pueden usarse tanto muestras ADN como ARN. Las muestras son normalmente etiquetadas para la detección del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina).
[0094] Así, se puede seleccionar una genoteca de ADN genómico o ADNc obtenida a partir de tales otros 20 organismos para el ADN que hibrida con las muestras anteriormente descritas. Se puede separar el ADN genómico u otro ADN de tales otros organismos por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado se puede transferir a e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que es homólogo a las secuencias de nucleótidos aquí descritas o subsecuencias de las mismas, se usa el material portador en un Southern blot. Para fines de la presente 25 invención, la hibridación indica que la secuencia de ácidos nucleicos hibrida a una muestra de ácido nucleico etiquetada que corresponde con las secuencias de nucleótidos descritas por la presente, su cadena complementaria, o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de astringencia entre muy bajas y muy altas. Las moléculas a las que la muestra de ácido nucleico hibrida bajo estas condiciones se detectan usando película radiográfica. 30
[0095] Para muestras largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia entre muy bajas y muy altas se definen como prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y bien un 25% de formamida para astringencias muy bajas y bajas, un 35% de formamida para astringencias medias y medias-altas, o bien un 50% de formamida para astringencias 35 altas y muy altas, después de procedimientos Southern blot estándares durante 12 a 24 horas óptimamente.
[0096] Para muestras largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% SDS preferiblemente a 45°C (astringencia muy baja), de forma más preferible a 50°C (astringencia baja), de forma más preferible a 55°C (astringencia media), de forma más 40 preferible a 60°C (astringencia media-alta), incluso de forma más preferible a 65°C (astringencia alta) y de la forma más preferible a 70°C (astringencia muy alta).
[0097] Para muestras cortas de aproximadamente 15 nucleótidos hasta aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia se definen como prehibridación, hibridación y post-hibridación de lavado a 45 aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 10°C por debajo de la Tm calculada utilizando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences 48:1390) en 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl a pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40,1X solución de Denhardt, 1 mM pirofosfato de sodio, 1 mM fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por ml después de procedimientos de Southern blot estándares durante 12 a 24 horas óptimamente. 50
[0098] Para muestras cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC más 0,1% SDS durante 15 minutos y dos veces cada uno durante 15 minutos usando 6X SSC a 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada.
55
[0099] Se puede utilizar una secuencia de nucleótidos homóloga o complementaria a un gen descrito aquí proveniente de otras fuentes microbianas para modificar el gen correspondiente en la cepa de Fusarium venenatum seleccionada.
[0100] En otro aspecto, la modificación de un gen en la cepa mutante de Fusarium venenatum se desetiqueta con 60 una etiqueta seleccionable.
[0101] La eliminación del gen marcador seleccionable se puede realizar mediante cultivo de los mutantes en un medio de contraselección. Donde el gen marcador seleccionable contiene repetidores que flanquean sus extremos 5' y 3', los repetidores facilitarán la formación de un bucle del gen marcador seleccionable mediante recombinación 65 homóloga cuando la cepa mutante se somete a contraselección. El gen marcador seleccionable también se puede
eliminar mediante recombinación homóloga introduciendo en la cepa mutante un fragmento de ácido nucleico que comprende regiones 5' y 3' del gen defectuoso, pero que carece del gen marcador seleccionable, seguido de la selección en el medio de contraselección. Mediante recombinación homóloga, el gen defectuoso que contiene el gen marcador seleccionable se sustituye con el fragmento de ácido nucleico que carece del gen marcador seleccionable. También se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica. 5
[0102] Se entiende que los métodos de la presente invención no se limitan a un orden particular para obtener la cepa mutante de Fusarium venenatum. La modificación de un gen se puede introducir en la cepa madre en cualquier paso de la construcción de la cepa para la producción de un polipéptido de interés. Se prefiere que la cepa mutante de Fusarium venenatum ya haya sido hecha deficiente en enzimas antes de tal construcción. 10
[0103] En otro aspecto de la presente invención, los mutantes de las cepas de Fusarium venenatum pueden contener modificaciones adicionales, por ejemplo, deleciones o interrupciones, de otros genes, que pueden codificar sustancias perjudiciales para la producción, recuperación, o aplicación de un polipéptido de interés.
15
[0104] En un aspecto, la cepa de Fusarium venenatum comprende además una modificación, por ejemplo, interrupción o deleción, de uno o varios genes (diferentes) que codifican una actividad proteolítica. En otro aspecto, la actividad proteolítica se selecciona del grupo que consiste en una aminopeptidasa, dipeptidilaminopeptidasa, tripeptidilaminopeptidasa, carboxipeptidasa, aspergillopepsina, serina proteasa, metaloproteasa, cisteína proteasa y proteasa vacuolar. 20
[0105] En otro aspecto, la cepa de Fusarium venenatum comprende además una modificación, por ejemplo, interrupción o deleción, de uno o varios genes (diferentes) adicionales que codifican una enzima seleccionada del grupo que consiste en una carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrin glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, galactosidasa, beta-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosidasa, 25 haloperoxidasa, hemicelulasa, invertasa, isomerasa, lacasa, ligasa, lipasa, liasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, fenoloxidasa, polifenoloxidasa, ribonucleasa, transferasa, alfa-1,6-transglucosidasa, alfa-1,6-transglucosidasa, transglutaminasa y xilanasa.
[0106] En los métodos de la presente invención, la cepa mutante de Fusarium venenatum produce preferiblemente 30 al menos la misma cantidad del polipéptido de interés que la cepa madre de Fusarium venenatum correspondiente cuando se cultivan bajo condiciones de producción idénticas. En otro aspecto, la cepa mutante produce al menos un 25% más, preferiblemente al menos un 50% más, de forma más preferible al menos un 75% más y de la forma más preferible al menos un 100% más del polipéptido que la cepa madre de Fusarium venenatum correspondiente cuando se cultivan bajo condiciones de producción idénticas. 35
[0107] Las cepas mutantes de Fusarium venenatum se cultivan en un medio nutritivo para la producción del polipéptido de interés usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la cepa se puede cultivar mediante cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo continuo, lote, lote alimentado, o fermentaciones de estado sólido) en el laboratorio o fermentadores industriales realizados en un 40 medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido se exprese y/o aísle. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, que usa procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). El polipéptido segregado se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se segrega, se 45 puede obtener a partir de lisatos de célula.
[0108] El polipéptido de interés se puede detectar usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para el polipéptido. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía capilar, formación de un producto enzimático, desaparición de un sustrato 50 enzimático, o SDS-PAGE. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de una enzima. Se conocen en la técnica procedimientos para determinar la actividad enzimática para muchas enzimas (véase, por ejemplo, D. Schomburg y M. Salzmann (eds.), Enzyme Handbook, Springer-Verlag, Nueva York, 1990).
[0109] El polipéptido resultante se puede aislar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede 55 aislar un polipéptido de interés del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales que comprenden, pero no se limitan a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación. El polipéptido aislado puede además purificarse posteriormente mediante numerosos procedimientos conocidos en la técnica que comprenden, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbico, cromatoenfoque y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo 60 (IEF), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
[0110] El polipéptido de interés puede ser cualquier polipéptido nativo o foráneo (heterólogo) a la cepa de Fusarium venenatum. El polipéptido se puede codificar mediante un único gen o dos o más genes. Se entiende que el término 65 "polinucleótido que codifica el polipéptido" abarca uno o varios genes (diferentes) implicados en la producción del
polipéptido. El término "polipéptido heterólogo" se define aquí como un polipéptido que no es nativo a la cepa de huésped; un polipéptido nativo donde se han hecho modificaciones estructurales para alterar el polipéptido nativo, por ejemplo, la secuencia de proteína de un polipéptido nativo; o un polipéptido nativo cuya expresión se altera de forma cuantitativa como resultado de una manipulación del polinucleótido o cepa huésped mediante técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, un promotor más fuerte. Así, la presente invención también abarca, dentro del 5 campo del término "polipéptidos heterólogos", tal producción recombinante de polipéptidos nativos, en la medida en que tal expresión implica el uso de elementos genéticos no nativos a la cepa de Fusarium venenatum, o el uso de elementos nativos que han sido manipulados para funcionar de modo que normalmente no ocurren en la cepa huésped. En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido nativo para la cepa de Fusarium venenatum. En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido heterólogo para la cepa de Fusarium venenatum. 10
[0111] El polipéptido puede ser cualquier polipéptido con una actividad biológica de interés. El término "polipéptido" no pretende referirse aquí a una longitud específica del producto codificado y, por lo tanto, abarca péptidos, oligopéptidos y proteínas. El término "polipéptido" también abarca dos o más polipéptidos combinados para formar el producto codificado. Los polipéptidos también incluyen polipéptidos de fusión, que comprenden una combinación de 15 secuencias de polipéptidos parciales o completas obtenida de al menos dos polipéptidos diferentes donde uno o varios (diferentes) pueden ser heterólogos a la cepa de Fusarium venenatum. Los polipéptidos incluyen además variaciones alélicas de origen natural y variaciones manipuladas de los polipéptidos mencionados anteriormente y polipéptidos híbridos.
20
[0112] Preferiblemente, el polipéptido es un anticuerpo, antígeno, péptido antimicrobiano, enzima, factor de crecimiento, hormona, inmunodilatador, neurotransmisor, receptor, proteína indicadora, proteína estructural, o factor de transcripción.
[0113] En un aspecto, el polipéptido es una oxidorreductasa, transferasa, hidrolasa, liasa, isomerasa, o ligasa. En 25 otro aspecto, el polipéptido es una aminopeptidasa, alfa amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrin glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa galactosidasa, beta galactosidasa, glucocerebrosidasa, alfa glucosidasa, beta glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fosfolipasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, uroquinasa, o xilanasa. 30
[0114] En otro aspecto, el polipéptido es una albúmina, colágeno, tropoelastina, elastina, o gelatina.
[0115] En los métodos de la presente invención, el mutante de la cepa de Fusarium venenatum es una cepa recombinante, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo, que se usa ventajosamente 35 en la producción recombinante del polipéptido. La cepa se transforma preferiblemente con un vector que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido heterólogo seguido de integración del vector en el cromosoma. Los medios de "transformación" que introducen un vector que comprende el polinucleótido en una cepa huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal que autorreplica. La integración se considera generalmente una ventaja ya que es más posible que el polinucleótido se 40 mantenga de forma estable en la cepa. La integración del vector en el cromosoma puede ocurrir mediante recombinación homóloga, recombinación no homóloga, o transposición.
[0116] El polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo se puede obtener de cualquier fuente procariota, eucariota, u otra fuente, por ejemplo, arqueobacteria. Para fines de la presente invención, el término "obtenido de" 45 como se utiliza en este caso en relación con una fuente dada debería significar que el polipéptido es producido por la fuente o por una cepa en la que se ha insertado un gen a partir de la fuente.
[0117] En los métodos de la presente invención, una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención también se puede usar para la producción recombinante de un polipéptido que es nativo a la cepa de Fusarium 50 venenatum. El polipéptido nativo se puede producir por medios recombinantes mediante, por ejemplo, la colocación de un gen que codifica el polipéptido bajo el control de un promotor diferente para mejorar la expresión de la sustancia, acelerando su exportación fuera de la cepa usando, por ejemplo, una secuencia de señal, o aumentando el número de copias de un gen que codifica el polipéptido normalmente producido por la cepa de Fusarium venenatum. 55
[0118] Se conocen en la técnica las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés y comprenden aislamiento del ADN genómico, preparación del ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de tal polinucleótido de tal ADN genómico puede ser llevada a cabo, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide 60 to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula vector, y la incorporación del vector recombinante en una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención donde se replicarán múltiples copias o clones del polinucleótido. El polinucleótido puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier 65 combinación de los mismos.
[0119] En los métodos de la presente invención, el polipéptido también puede ser un polipéptido fusionado o polipéptido de fusión divisible donde un polipéptido se fusiona al N-terminal o al C-terminal de otro polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica un polipéptido a otra secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica otro 5 polipéptido. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligar las secuencias de codificación que codifican los polipéptidos de modo que éstas están en marco y que la expresión del polipéptido fusionado está bajo el control del (de los) mismo(s) promotor(es) y terminador.
[0120] Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido heterólogo se puede manipular de múltiples formas para 10 proveer la expresión del polipéptido en una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias polinucleótidas utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.
15
[0121] Un constructo de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido puede ser enlazado operativamente a una o varias secuencias de control (diferentes) capaces de dirigir la expresión de la secuencia codificante en una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
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[0122] La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención para la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad transcripcional en la cepa mutante de Fusarium venenatum, que incluye promotores mutantes, truncados e 25 híbridos y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien nativos o heterólogos (foráneos) a la cepa mutante de Fusarium venenatum.
[0123] Ejemplos de promotores adecuados para la dirección de la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos en los métodos de la presente invención son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de 30 Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), proteasa de tipo tripsina de Fusarium 35 oxysporum (WO 96/00787), beta glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores a partir de los genes 40 para alfa amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.
[0124] La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención para terminar la 45 transcripción. La secuencia terminadora está enlazada operativamente al terminal 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido heterólogo.
[0125] Los terminadores preferidos se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa glucosidasa de Aspergillus niger y 50 proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0126] La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por parte de una cepa mutante de Fusarium venenatum de la presente invención. La secuencia líder está enlazada operativamente al terminal 5' de la secuencia de nucleótidos que 55 codifica el polipéptido heterólogo. En la presente invención se puede utilizar cualquier secuencia líder que sea funcional en la cepa mutante de Fusarium venenatum.
[0127] Los líderes preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans. 60
[0128] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada operativamente al terminal 3' de la secuencia de nucleótidos y, cuando se transcribe, la cepa mutante de Fusarium venenatum la reconoce como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. En la presente invención se puede utilizar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la cepa mutante de Fusarium 65 venenatum.
[0129] Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa glucosidasa de Aspergillus niger.
5
[0130] La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al terminal amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede contener intrínsecamente una secuencia codificante de péptido señal enlazada naturalmente en el marco de lectura del movimiento con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido segregado. Alternativamente, el 10 extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante de péptido señal que sea foránea a la secuencia codificante. La secuencia codificante del péptido señal foráneo puede ser necesaria donde la secuencia codificante no contiene naturalmente una secuencia codificante de péptido señal. Alternativamente, la secuencia codificante del péptido señal foráneo puede simplemente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. No obstante, en la presente invención se puede utilizar cualquier 15 secuencia codificante de péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la vía secretora de la cepa mutante de Fusarium venenatum, es decir, que es secretado en un medio de cultivo.
[0131] Las regiones codificantes del péptido señal eficaces para las cepas mutantes de Fusarium venenatum son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa 20 neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa.
[0132] La secuencia de control también puede ser una región codificante del propéptido, que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el terminal amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido 25 como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipéptido maduro y activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener a partir de genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836). 30
[0133] Donde ambas secuencias señal de péptido y de propéptido están presentes en el terminal amino de un polipéptido, la secuencia de propéptido está situada junto al terminal amino de un polipéptido y la secuencia del péptido señal está situada junto al terminal amino de la secuencia de propéptido.
35
[0134] Los constructos de ácidos nucleicos también pueden comprender uno o varios polinucleótidos (diferentes) que codifican uno o varios factores (diferentes) que son ventajosos para la dirección de la expresión del polipéptido heterólogo, por ejemplo, un activador transcripcional (por ejemplo, un factor de actuación trans), una chaperona y una proteasa de tratamiento. En la presente invención se puede utilizar cualquier factor que sea funcional en la cepa mutante de Fusarium venenatum. Los ácidos nucleicos que codifican uno o varios de estos factores (diferentes) no 40 están necesariamente en serie con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido heterólogo.
[0135] También puede ser deseable añadir secuencias de control o reguladores que permiten la regulación de expresión del polipéptido en relación al crecimiento de la cepa mutante de Fusarium venenatum. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan la expresión del gen por ser activado o desactivado en respuesta a 45 una sustancia química o estímulo físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en hongos filamentosos tales como el promotor de TAKA alfa amilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en la 50 presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido estaría enlazada operativamente con la secuencia reguladora.
[0136] En los métodos de la presente invención, se pueden utilizar un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos, un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional para la 55 producción recombinante de un polipéptido de interés. Los numerosos ácidos nucleicos y secuencias de control descritos aquí se pueden juntar entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o varios sitios de restricción convenientes (diferentes) para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos se puede expresar mediante la inserción de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucleicos que comprende 60 la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante está enlazada operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
[0137] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede 65 estar sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión de la
secuencia de nucleótidos. La elección del vector normalmente dependerá de su compatibilidad con la cepa mutante de Fusarium venenatum en la que se debe introducir el vector. El vector puede ser un plásmido circular lineal o cerrado.
[0138] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad 5 extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se le introduce en la cepa mutante de Fusarium venenatum, se integra en el genoma y se replica junto con el (los) cromosoma(as) en el (los) que ha sido integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o dos o más 10 vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total por ser introducido en el genoma de la cepa mutante de Fusarium venenatum, o un transposón.
[0139] El vector contiene preferiblemente uno o varios marcadores seleccionables (diferentes) que permiten la selección fácil de cepas mutantes de Fusarium venenatum transformadas. Una etiqueta seleccionable es un gen el 15 producto del cual proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.
[0140] Ejemplos de marcadores seleccionables para su uso en la cepa mutante de Fusarium venenatum comprenden, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar 20 (fosfinotricina acetiltransferasa), hpt (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Son preferidos para el uso en la cepa mutante de Fusarium venenatum el gen amdS de Aspergillus nidulans y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.
25
[0141] Los vectores preferiblemente contienen un(os) elemento(s) que permite la integración del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
[0142] Para la integración en el genoma de la cepa mutante de Fusarium venenatum, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el 30 genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la cepa mutante de Fusarium venenatum en una ubicación(es) precisa(s) en el (los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integradores deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 10.000 pares de bases, preferiblemente 400 a 10.000 35 pares de bases y de la forma más preferible 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un grado alto de identidad a la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la cepa mutante de Fusarium venenatum. Además, los elementos integradores pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la cepa mutante de Fusarium 40 venenatum por recombinación no homóloga.
[0143] Para una replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de manera autónoma en la cepa mutante de Fusarium venenatum. El origen de la replicación puede ser cualquier replicador plásmido que medie en la replicación autónoma que funciona en una 45 célula. El término "origen de la replicación" o "replicador plásmido" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.
[0144] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en la cepa mutante de Fusarium venenatum son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). El 50 aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede realizar según los métodos divulgados en el documento WO 00/24883.
[0145] Los procedimientos usados para enlazar los elementos aquí descritos para la construcción de los vectores de expresión recombinantes son bien conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E.F. 55 Fritsch y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York).
[0146] Se puede introducir un vector que comprende la secuencia de nucleótidos, por ejemplo, mediante transformación, en la cepa mutante de Fusarium venenatum de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal que se autorreplica. La integración se considera generalmente una 60 ventaja ya que es más posible que la secuencia de nucleótidos se mantenga de forma estable en la cepa. La integración del vector en el cromosoma ocurre por recombinación homóloga, recombinación no homóloga, o trasposición.
[0147] La introducción de un vector de expresión en la cepa mutante de Fusarium venenatum puede implicar un 65 proceso que consiste en formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared de
la cepa de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de cepas de Fusarium venenatum se describen en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787.
Ejemplos
5
Materiales
[0148] Los productos químicos usados como tampones y sustratos eran productos comerciales de al menos calidad reactiva. Todos los cebadores y oligonucleótidos fueron suministrados por MWG Biotech, Inc., High Point, NC, EE. UU. 10
Cepa fúngica
[0149] La cepa A3/5 de Fusarium, ahora reclasificada como Fusarium venenatum (Yoder y Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80; O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67), se obtuvo 15 del Dr. Antonio Trinci, Universidad de Manchester, Manchester, Inglaterra. Los depósitos de esta cepa se pueden obtener de la American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU como cepa de Fusarium ATCC 20334 o la Agricultural Research Service Patente Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, EE. UU como cepa de Fusarium NRRL 30747.
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Medios y soluciones
[0150] Se compusieron placas LB por litro de 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de Bacto agar.
25
[0151] Se compuso NZY agarosa de parte superior por litro de 5 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NZ amina, 2 g de MgSO4 y 7 g de agarosa.
[0152] Se compuso medio M400 por litro de 50 g de maltodextrina, 2 g de MgSO4·7H2O, 2 g de KH2PO4, 4 g de ácido cítrico, 8 g de extracto de levadura, 2 g de urea, 0,5 g CaCl2 y 0,5 ml de solución de metales traza AMG, a pH 30 6,0.
[0153] Se compuso solución de metales traza AMG por litro de 14,3 g ZnSO4·7H2O, 2,5 g CuSO4·5H2O, 0,5 g NiCl2, 13,8 g FeSO4, 8,5 g MnSO4 y 3,0 g ácido cítrico.
35
[0154] Se compuso medio 2XYT por litro de 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 5 g de Bacto agar.
[0155] Se compuso medio YP por litro de 10 g de extracto de levadura y 20 g de Bacto peptona.
40
[0156] Se compuso medio YPG5% por litro de 10 g de extracto de levadura, 20 g de Bacto peptona y 50 g de glucosa.
[0157] Se compuso medio RA por litro de 50 g ácido succínico, 12,1 g NaNO3, 1g glucosa y 20 ml de solución de sales Vogels 50X (sin C, sin NaNO3).
45
[0158] Se compuso medio RA + uridina por litro de 50 g ácido succínico, 12,1 g NaNO3, 1 g glucosa y 20 ml solución de sales Vogels 50X (sin C, sin NaNO3). Después de la esterilización del filtro del medio RA, se añadió la uridina esterilizada de filtro a una concentración final de 10 mM.
[0159] Se compuso medio RA + BASTA™ por litro de 50 g ácido succínico, 12,1 g NaNO3, 1 g glucosa y 20 ml 50 solución de sales Vogels 50X (sin C, sin NaNO3). Después de la esterilización del filtro del medio RA, se añadió BASTA™ esterilizado por filtro (glufosinato, Hoechst Schering AgrEvo, Frankfurt, Alemania) a una concentración final de 6 mg/ml utilizando una solución madre de trabajo de 250 mg/ml.
[0160] Se compuso la solución de sales Vogels 50X (sin C, sin NaNO3) por litro de 250 g KH2PO4, 10 g 55 MgSO4·7H2O, 5 g CaCl2·2H2O, 2,5 ml solución de biotina y 5 ml solución de oligoelementos Vogels.
[0161] La solución madre de biotina estaba compuesta por 5 mg de biotina en 100 ml de etanol al 50%.
[0162] La solución de oligoelementos Vogels estaba compuesta por 100 ml 5 g ácido cítrico, 5 g ZnSO4·7H2O, 1 g 60 Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O, 0,25 g CuSO4·5H2O, 0,05 g MnSO4·H2O, 0,05 g H3BO3 y 0,05 g Na2MoO4·2H2O.
[0163] Las placas VNO3RLMT estaban compuestas por litro por 20 ml solución de sales Vogels 50X (25 mM NaNO3), 273,33 g sacarosa y 15 g LMT agarosa (Sigma, St. Luis, MO, EE. UU).
65
[0164] La solución de sales Vogels 50X (25 mM NaNO3) estaba compuesta por litro por 125 g citrato sódico, 250 g
de KH2PO4, 106,25 g NaNO3, 10 g MgSO4·7H2O, 5 g CaCl2·2H2O, 2,5 ml solución madre de biotina y 5 ml solución de oligoelementos Vogels.
[0165] Las placas VNO3RLMT-BASTA™ estaban compuestas por litro por 20 ml solución de sales Vogels 50X (25 mM NaNO3), 273,33 g sacarosa y 15 g LMT agarosa. Después del autoclavado y enfriado, el BASTA™ se añadió a 5 una concentración final de 6 mg/ml.
[0166] STC estaba compuesto por 0,8 M sorbitol, 25 o 50 mM Tris a pH 8 y 50 mM CaCl2.
[0167] SPTC estaba compuesto por 40% PEG 4000, 0,8 M sorbitol, 25 o 50 mM Tris a pH 8 y 50 mM CaCl2. 10
[0168] El medio SY50 (pH 6,0) estaba compuesto por litro por 50 g sacarosa, 2,0 g MgSO4·7H2O, 10 g KH2PO4, 2,0 g K2SO4, 2,0 g ácido cítrico, 10 g extracto de levadura, 2,0 g urea, 0,5 g CaCl2·2H2O y 5 ml 200X solución de metales traza AMG (sin níquel).
15
[0169] La solución de metales traza AMG (sin níquel) 200X estaba compuesta por litro por 3,0 g ácido cítrico, 14,3 g ZnSO4·7H2O, 2,5 g CuSO4·5H2O, 13,8 g FeSO4·7H2O y 8,5 g MnSO4·H2O.
[0170] El SSC 20X estaba compuesto por 0,3 M citrato sódico a pH 7 y 3 M cloruro sódico.
20
Secuenciación del ADN
[0171] La secuenciación del ADN fue llevada con un analizador de ADN ABI PRIZM® 3700 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE.UU).
25
Ejemplo 1: procedimiento de transformación de Fusarium venenatum
[0172] Se digirieron cien microgramos de cada uno de los cassettes de eliminación descritos en los siguientes ejemplos bien con Bst Z171/Bam HI (ejemplo 11) o Not I (ejemplos 14, 16, 28 y 30). Se purificó cada reacción de digestión con 1% electroforesis en gel de agarosa en tampón TAE y se extrajo una banda de ADN utilizando un 30 equipo de extracción de gel QIAQUICK® Gel Extraction Kit. Se concentró el ADN purificado resultante en un tubo de microfuga de 1,5 ml con precipitación de etanol con la adición de un 10% de volumen de reacción de 3 M acetato sódico a pH 5 seguido de 2,5 volúmenes de etanol a muy baja temperatura (94%) y la incubación en hielo durante 20 minutos. Posteriormente se centrifugó el tubo a 15,000 x g durante 10 minutos en una centrifugadora de mesa de EPPENDORF® 5424 (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Se descartó el sobrenadante y se lavó el granulado con 1 35 ml de etanol al 70% a temperatura muy fría y se centrifugó a 15,000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se descartó y se permitió que el granulado se secara al aire. El granulado se resuspendió posteriormente en 70 µl de tampón 10 mM Tris a pH 8. La concentración del ADN resultante que contenía solución se determinó usando un espectrofotómetro NANODROP® 1000 (ThermoFischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU).
40
[0173] Los protoplastos de la cepa receptora apropiada se generaron mediante el siguiente método. Se obtuvieron primero esporas inoculando 500 ml de medio RA (ejemplo 11) o medio RA suplementado con 10 mM uridina (ejemplos 14, 16, 28 y 30) en un matraz Fernbach de 2,8 L con tapones de agar de 15 x 1 cm2 de un cultivo de 7 días de antigüedad que contenía medio VNO3RLMT e incubando el matraz durante 36 horas a 28°C con agitación a 150 r.p.m. El cultivo de espora se filtró a través de MIRACLOTH™ estéril y las esporas se capturaron en un filtro 45 unitario STERICUP® 0,2 µm de MILLIPORE® (Millipore, Bellerica, MA, EE.UU). Se lavaron las esporas con 200 ml de agua destilada estéril cristalina y se resuspendieron en 10 ml de agua destilada estéril cristalina.
[0174] Se usó un ml de la solución de espora para inocular 100 ml de medio YP suplementado con 5% glucosa (ejemplo 11) o medio YP suplementado con 5% glucosa y 10 mM uridina (ejemplos 14, 16, 28 y 30). El medio 50 inoculado se incubó durante 16 horas a 17°C con agitación a 150 r.p.m. Se filtraron los cultivos a través de MIRACLOTH™ para recopilar micelios, que se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 ml utilizando una espátula estéril. Los micelios se resuspendieron en 20 ml de solución protoplástica, que contenía 5 mg de NOVOZYME™ 234 por ml y 5 mg de GLUCANEX™ (ambos de Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) en 1 M MgSO4 por ml y se transfirieron a tubos de polipropileno de 50 ml. Los tubos se incubaron a 29,5°C con agitación a 55 90 r.p.m. durante una hora después de lo cual se añadieron 30 ml de sorbitol 1 M. Luego los tubos se centrifugaron a 800 x g durante 10 minutos en un centrifugador basculante Sorvall RT 6000B (ThermoFischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU). Los sobrenadantes se descartaron y los gránulos de protoplasto se lavaron dos veces con 30 ml de sorbitol1 M. Los tubos se centrifugaron a 800 x g durante 5 minutos y los sobrenadantes se descartaron. Los protoplastos se resuspendieron en una solución de esterilizados por filtro 9:1:0,1 (v/v) STC:SPTC:DMSO a una 60 concentración de 5 x 107 por ml y se congelaron durante toda la noche a -80°C a congelación de índice controlado utilizando un contenedor de congelación NALGENE™ Cryo 1°C Freezing Container (ThermoFischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU).
[0175] La transformación se realizó mediante descongelación de los protoplastos en hielo y adición de 200 µl de los 65 protoplastos a cada uno de cuatro tubos de 14 ml. Se añadieron cinco µg de ADN (en menos de 10 µl) a los tres
primeros y no se añadió ADN al cuarto. Luego se añadieron 750 µl de SPTC a cada tubo y los tubos se invirtieron suavemente 6 veces. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se añadieron 6 ml de STC a cada tubo.
Cada transformación se dividió en tres partes y se añadió a placas con diámetro de 150 mm que contenían medio VNO3RLMT suplementado con 125 µg de higromicina por ml (ejemplo 11) o medio VNO3RLMT suplementado con 5 125 µg de higromicina por ml y 10 mM uridina (ejemplos 14, 16, 28 y 30) se incubaron a temperatura ambiente durante 7 días.
Ejemplo 2: análisis Southern
10
[0176] Se produjo biomasa fúngica inoculando 25 ml de medio M400 (ejemplo 11) o medio M400 suplementado con 10 mM uridina (ejemplos 14, 16, 28 y 30) con cuatro tapones de agar de 1 cm a partir de transformantes de 7 días de antigüedad generados como se describe en los ejemplos 1 y 11. Los cultivos se incubaron durante 3 días a 28°C con agitación a 150 r.p.m. Se retiraron los tapones de agar y los cultivos se filtraron a través de MIRACLOTH™. La biomasa cosechada se congeló con nitrógeno líquido y los micelios se molieron utilizando un mortero y mano de 15 mortero.
[0177] El ADN genómico se aisló utilizando un equipo DNEASY® Plant Maxi Kit (QIAGEN, Valencia, CA, EE. UU) según las instrucciones del fabricante excepto en que el periodo de incubación lítica a 65°C se extendió de 10 minutos a 1,5 horas. 20
[0178] Se digirieron dos µg de ADN genómico con las endonucleasas de restricción indicadas en volumen de reacción de 50 µl a 37°C durante 22 horas. Las digestiones se sometieron a 1,0% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE. El ADN se fragmentó en el gel tratándolo con 0,25 M HCl, se desnaturalizó con 1,5 M NaCl-0,5 M NaOH, se neutralizó con 1,5 M NaCl-1 M Tris a pH 8 y luego se transfirió en 20X SSC a una membrana de nylon 25 NYTRAN® Supercharge utilizando un equipo TURBOBLOTTER™ Kit (ambos de Whatman, Kent, GB). El ADN se reticuló con UV a la membrana utilizando un UV STRATALINKER™ (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) y se pre-hibridó durante 1 hora a 42°C en 20 ml DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE. UU).
[0179] Se generaron muestras utilizando un equipo de síntesis PCR Dig Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics 30 Corporation, Indianapolis, IN, EE. UU) según las instrucciones del fabricante. Las muestras se purificaron con 1,2% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindieron las bandas correspondientes a las muestras y se extrajeron con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU). Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y a cada una se añadieron 10 ml DIG Easy Hyb para producir la solución de hibridación. La hibridación se realizó a 42°C durante 15-17 horas. Las membranas se 35 lavaron posteriormente bajo condiciones de astringencia altas en 2X SSC más 0,1% SDS durante 5 minutos a temperatura ambiente seguido de dos lavados en 0,1X SSC más 0,1% SDS cada uno durante 15 minutos a 65°C. Los híbridos con objetivo de muestra se detectaron mediante ensayo quimioluminiscente (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE. UU) según las instrucciones del fabricante.
40
Ejemplo 3: construcción del plásmido pDM156.2 que contiene el fragmento de ADN genómico que incorpora el gen orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa (pyrG) de Fusarium venenatum
[0180] Una muestra de un gen orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa (pyr4) de Neurospora crassa (SEC ID nº 1 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 2 para la secuencia de aminoácido deducido) se preparó mediante PCR que 45 incorporaba desoxiuridín trifosfato (dUTP) etiquetado con digoxigenina y los cebadores descritos a continuación.
Cebador (sentido):
5'-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3' (SEC ID nº 3)
50
Cebador (antisentido):
5'-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3' (SEC ID nº 4)
[0181] Se digirió el plásmido pFB6 (Buxton et al, 1983, Molecular and General Genetics 190: 403-405) con Hind III y la digestión se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TAE. Se escindió un fragmento de 55 pyr-4 de 1,1 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo QIAQUICK® Gel Extraction Kit según los protocolos sugeridos por el fabricante.
[0182] La reacción de amplificación (50 µl) estaba compuesta por 1X tampón Taq DNA Polymerase Buffer (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU), 5 µl PCR DIG Labeling Mix (Boehringer Mannheim, Mannheim, 60 Alemania), 10 ng del fragmento de pyr-4 con Hind III de 1,1 kb, 10 pmol cebador de sentido, 10 pmol cebador anti-sentido y 1 unidad de Taq ADN polimerasa (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU). La reacción se incubó en un ROBOCYCLER® (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) programado para 1 ciclo a 95°C durante 3 minutos seguido de 35 ciclos cada uno a 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto. Se realizó una extensión final durante 5 minutos a 72°C. 65
[0183] Los productos reactivos de amplificación se purificaron por 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TAE. Una muestra etiquetada con digoxigenina (DIG) de aproximadamente 0,78 kb se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit.
[0184] Se generó una biblioteca de ADN genómico de la cepa A3/5 de Fusarium venenatum y se clonó en el vector 5 lambda EMBL4 como se describe en el documento WO 99/60137.
[0185] La muestra etiquetada con DIG se usó para visualizar la genoteca genómica de ADN A3/5 clonado de Fusarium venenatum en el vector lambda EMBL4. Se colocaron fagos lambda en placas con células E. coli K802 (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU) sobre placas LB con NZY top agarosa. Se hicieron hibridizaciones 10 elevadas de placa a membranas de nilón HYBOND™ N (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, GB) utilizando la técnica de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición; J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Se ligó ADN a las membranas mediante reticulación de UV utilizando un STRATALINKER™ UV. Posteriormente se hibridaron filtros con la muestra de pyr-4 de N. crassa etiquetada con DIG de 0,78 kb. La hibridación y detección de clones de pyrG se realizaron según la guía GENIUS™ 15 System User's Guide (Boehringer Hammheim, Mannheim, Alemania) a 42°C con una solución de hibridación compuesta por 5X SSC, 35% formamida, 0,1% L-lauroilsarcosina, 0,02% SDS y 1% reactivo de bloqueo (Boehringer Hammheim, Mannheim, Alemania). La concentración de la muestra etiquetada con DIG usada era 2.5 ng por ml de la solución de hibridación. La hibridación de ADN se inmunodetectó con un anticuerpo de anti-digoxigenina conjugada con alcalina-fosfatasa (Boehringer Hammheim, Mannheim, Alemania) y se visualizó con Lumiphos 530, 20 un sustrato quimioluminiscente (Boehringer Hammheim, Mannheim, Alemania). Se hicieron preparaciones de ADN a partir de clones lambda positivos putativos utilizando un equipo Lambda Midi Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE. UU).
[0186] El ADN lambda a partir de un clon identificado anteriormente se digirió con Eco RI y se sometió a 1% 25 electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE. Se escindió un fragmento de 3,9 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAEX Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE. UU). El fragmento se clonó posteriormente en el sitio Eco RI de pUC18 (Viera y Messing, 1987, Methods in Enzymology 153: 3-11) y se transformaron células competentes ONE SHOT® TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) con 2 µl de la reacción de clonación. Se analizó el plásmido de ADN de ocho de los transformantes resultantes mediante secuenciación del 30 ADN. Se seleccionó un clon con la secuencia deseada y se designó pDM156.2 (figura 1). El fragmento pyrG contenía toda la región de codificación más 1,3 kb del promotor y 1,5 kb del terminador.
Ejemplo 4: generación de pEmY21
35
[0187] Un gen higromicina fosfotransferasa (hpt) de E. coli (SEC ID nº 5 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 6 para la secuencia de aminoácido deducido) se amplificó a partir del plásmido pPHTI (Cummings et al., 1999, Current Genetics 36: 371-382) utilizando los siguientes cebadores:
Cebador directo: 40
5'-GGGttcgaaTTCATTTAAACGGCT-3' (SEC ID nº 7)
Cebador inverso:
5'-GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3' (SEC ID nº 8)
45
Los sitios de enzima de restricción Bst BI (cebador directo) y Eco 47III (cebador inverso) se manipularon en los cebadores representados por la secuencia subrayada, para la clonación.
[0188] La reacción por PCR (para amplificar el gen hpt) estaba compuesta por 1X tampón de reacción ThermoPol, 200 µM dNTPs, 50 pmol cebadores directo e inverso, 100 pg pPHT1, 1 unidad de ADN polimerasa Vent® DNA 50 polymerase (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU) y agua destilada estéril en un volumen total de 100 µl. La reacción de amplificación se realizó utilizando un ROBOCYCLER® programado durante 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 25 ciclos cada uno a 95°C durante 1 minuto, 51°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos.
55
[0189] Se separaron los productos PCR por 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE. Un fragmento de 1,8 kb se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. El fragmento purificado de gel se clonó posteriormente en el pCR®-Bluntll-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) utilizando un equipo de clonación TOPO® Blunt Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU). El plásmido resultante se designó pEmY10. 60
[0190] El sitio Eco RI se eliminó después de la secuencia codificante del gen hpt en pEmY10 utilizando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio QUIKCHANGE® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) según las instrucciones del fabricante que utilizan los cebadores mostrados a continuación, donde las letras minúsculas representan los nucleótidos no mutados del sitio Eco RI objetivo y las letras subrayadas representan los 65 nucleótidos mutados. El plásmido resultante se designó pBK3.
Cebador directo:
5'-GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3' (SEC ID nº 9)
Cebador inverso: 5
5'-CCCATCTGCAgaatAcGCCCTTGGGGTACCC-3' (SEC ID nº 10)
El gen hpt resultante sin el sitio Eco RI se amplificó con PCR a partir de pBK3 usando cebadores directos e inversos mostrados a continuación.
10
Cebador directo:
5'-GGggtaccTTCATTTAAACGGCTTCAC-3' (SEC ID nº 11)
Cebador inverso:
5'-GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3' (SEC ID nº 12) 15
Las partes subrayadas representan introducidas sitios Kpn I para la clonación.
[0191] Se usaron partes del gen pyrG de Aspergillus oryzae para generar repeticiones directas y se amplificaron con PCR a partir de pSO2 (WO 98/12300) utilizando los siguientes cebadores: 20
Repetición 1:
Cebador directo:
5'-TCCcccgggTCTCTGGTACTCTTCGATC-3' (SEC ID nº 13) 25
Cebador inverso:
5'-GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3' (SEC ID nº 14)
Repetición 2: 30
Cebador directo:
5'-GGgataccTCTCTGGTACTCTTCGATC-3' (SEC ID nº 15)
Cebador inverso: 35
5'-TCCcccgggCGACCAGCAGACGGCCC-3' (SEC ID nº 16)
Las partes subrayadas representan sitios de restricción introducidos Sma I (cccggg) o Kpn I (ggtacc) para la clonación.
40
[0192] Los tres fragmentos (hpt, repetición 1 y repetición 2) se amplificaron en reacciones separadas (50 µl cada una) compuestas por 1X tampón de reacción ThermoPol, 200 µM dNTPs, 0,25 µM cada cebador, 50 ng modelo ADN y 1 unidad de ADN polimerasa Vent®. La reacción de amplificación se realizó utilizando un ROBOCYCLER® programado durante 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 30 ciclos cada uno a 95°C durante 1 minuto, 61°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos. 45
[0193] Los productos PCR fueron separados por 1,5% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE. El fragmento hpt amplificado en aproximadamente 2 kb y los fragmentos de repetición de aproximadamente 0,2 kb se escindieron de los geles y se extrajeron con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit. Los dos fragmentos de repetición pyrG se digirieron con Kpn I, se defosforilaron con fosfatasa de intestino de 50 ternero (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU) y se trataron con un equipo de limpieza MINELUTE® Reaction Cleanup Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE. UU) según las instrucciones del fabricante. Los fragmentos que contenían la repetición 1 y hpt se ligaron posteriormente entre sí utilizando un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ Kit (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU) según las instrucciones del fabricante, se trataron con un equipo de limpieza MINELUTE® Reaction Cleanup Kit y el ligamiento resultante se clonó en pCR®II Blunt 55 usando un equipo de clonación TOPO® Blunt Cloning Kit. El análisis de secuencias confirmó un clon donde la repetición 1 y el fragmento hpt se ligaron entre sí en pCR®II Blunt. Este plásmido se designó pEmY18.
[0194] Para clonar la segunda repetición en pEmY18, se digirió plásmido pEmy18 con Eco RV y se purificó la digestión con 1% electroforesis en gel de agarosa en tampón TAE. Se escindió un fragmento de 5,6 kb del gel y se 60 extrajo con agarosa utilizando un equipo QIAQUICK® Gel Extraction Kit. Se ligaron entre sí el fragmento de repetición 2 de 0,2 kb (anteriormente descrito) y pEmY18 digerido utilizando un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ Kit. La mezcla de ligamiento se usó para transformar células SOLOPACK® Gold Supercompetent Cells (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU). El análisis de secuencias identificó un plásmido donde los tres componentes (repetición 1, hpt y repetición 2) estaban en el orden y orientación deseados y que carecían de errores PCR. El 65 plásmido resultante se designó pEmY20.
[0195] Para asegurar que la digestión posterior de pEmY20 con Eco RI liberaría un único fragmento, se eliminó un sitio Eco RI utilizando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio QUIKCHANGE® Site-Directed Mutagenesis Kit según las instrucciones del fabricante y cebadores directos e inversos mostrados a continuación. El plásmido resultante se designó pEmY21 (figura 2) después de la verificación de la secuencia. 5
Cebador directo:
5'-GGGTACCCCAAGGGCQTATTCTGCAGATGGG-3' (SEC ID nº 17)
Cebador inverso: 10
5'-CCCATCTGCAGAATACGCCCTTGGGGTACCC-3' (SEC ID nº 18)
Ejemplo 5: creación del vector de deleción pEmY23 de pyrG de Fusarium venenatum
[0196] La secuencia codificante de pyrG de Fusarium venenatum (2,678 pares de bases) se escindió de pDM156,2 15 (ejemplo 3) mediante digestión con endonucleasas de restricción Eco RV y Stu I y el vector restante de 4,398 pares de bases se purificó con gel utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit según las indicaciones del fabricante. El fragmento Sma I de pEmY21 se aisló y purificó con gel utilizando un equipo de extracción de gel de QIAQUICK® Gel Extraction Kit y los dos fragmentos purificados con gel se ligaron entre sí. Se visualizaron para insertar la orientación, se secuenciaron para comprobar la ausencia de errores y uno de los clones 20 con la secuencia de inserción correcta se seleccionó y designó pEmY23 (figura 3).
Ejemplo 6: construcción del plásmido pWTY1470-19-07
[0197] El plásmido pJRoy40 (Patente EE.UU nº 7,332,341), que contiene secuencias flanqueantes 5' y 3' de un gen 25 tricodieno sintasa (tri5) de Fusarium venenatum (SEC ID nº 19 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 20 para la secuencia de aminoácidos deducida), se usó como modelo para la amplificación de una parte de la secuencia flanqueante 5' del gen tri5. La reacción por PCR contenía 200 µM dNTPs, 1X tampón Taq ADN polimerasa, 125 pg ADN pJRoy40, 50 pmol de cada cebador mostrado posteriormente y 1 unidad Taq de ADN polimerasa en un volumen final de 50 µl. 30
Cebador directo:
5'-GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3' (SEC ID nº 21)
Cebador inverso: 35
5'-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3' (SEC ID nº 22)
(Los nucleótidos subrayados indican sitios Bgl II introducidos).
[0198] La reacción de amplificación se incubó en un ROBOCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C durante 3 40 minutos; 10 ciclos cada uno a 95°C durante 30 segundos, 52°C durante 45 segundos y 7°C durante 2 minutos; 20 ciclos cada uno a 95°C durante 30 segundos, 52°C durante 45 segundos y 72°C durante 5 minutos; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos.
[0199] Los productos PCR se separaron mediante 1,5% electroforesis en gel de agarosa usando tampón TBE. Un 45 fragmento de aproximadamente 600 pares de bases se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit. El fragmento se insertó en pCR®2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) utilizando un equipo de clonación TOPO® TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) y células competentes ONE SHOT® TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) se transformaron con 2 µl de la reacción de clonación TOPO® TA. El plásmido de ADN que forma ocho de los transformantes resultantes se digirió con Eco RI y 50 Bgl II en reacciones separadas y se confirmaron mediante secuenciación del ADN las inserciones para tres transformantes con los modelos de digestión de restricción correctos. Se seleccionó un clon con la secuencia deseada y se designó pWTY1470-09-05.
[0200] Un fragmento Bgl II de 608 pares de bases que contiene la repetición 5' del gen tri5 se liberó del pWTY1470- 55 09-05 mediante digestión con Bgl II, se purificó con 1,0% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TBE, se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit.
[0201] El plásmido pJRoy40 se linealizó mediante digestión con Bgl II, después de lo cual se defosforiló usando fosfatasa alcalina de gamba (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE. UU) según las instrucciones del 60 fabricante y se purificó utilizando un equipo de purificación QIAQUICK® PCR Purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU). El fragmento linealizado pJRoy40 y el fragmento purificado con gel Bgl II se ligaron entre sí usando ADN ligasa T4 (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU) según las instrucciones del fabricante. La transformación de células químicamente competentes de E. coli SURE® (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) se realizó según las indicaciones del fabricante. Se confirmó mediante secuenciación del ADN que un transformante 65 contenía el vector deseado, es decir, que contenía las secuencias flanqueantes 5' y 3' de tri5 y una repetición de una
parte de la secuencia flanqueante 5'. El plásmido resultante se designó pWTY1470-19-07 (figura 4).
Ejemplo 7: construcción del plásmido pWTY1515-02-01
[0202] Se sometió al plásmido pWTY1470-19-07 a mutagénesis in vitro utilizando un equipo de mutagénesis dirigida 5 al sitio QUIKCHANGE® Site-Directed Mutagenesis Kit según las instrucciones del fabricante y cebadores directos e inversos mostrados a continuación.
Cebador directo:
5'-CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3' (SEC ID nº 23) 10
Cebador inverso:
5'-CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3' (SEC ID nº 24)
[0203] La mutagénesis eliminó el sitio Bgl II a 1779 pares de bases y dejó el sitio Bgl II a 2386 pares de bases único 15 y utilizable en manipulaciones posteriores para insertar fragmentos que contienen cassettes de gen timidina quinasa (tk) e higromicina fosfotransferasa (hpt). La reacción de mutagénesis se usó para transformar las células ultra competentes de E. coli XL10-GOLD® Ultra-competent suministradas por el equipo (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) según el protocolo sugerido del fabricante.
20
[0204] Un transformante que contiene las mutaciones indicadas anteriormente, como se verifica mediante análisis de secuencias, se designó pWTY1515-02-01 (figura 5) y se usó como la estructura en el ejemplo 10.
Ejemplo 8: construcción del plásmido pJaL574
25
[0205] El plásmido pDV8 (Patente EEUU nº 6,806,062) contiene el gen timidina quinasa de tipo 1 de virus Herpes simplex (HSV1-TK; tk) (SEC ID nº 29 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 30 para la secuencia de aminoácidos deducida) como un fragmento de Bgl II/Bam HI de 1,2 kb insertado entre un fragmento Xho I/Bgl II del promotor gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (gpdA) de Aspergillus nidulans de 1,0 kb y un fragmento Bam HI/Hind III de 1,8 kb que contiene el terminador transcripcional trifuncional indol glicerol fosfato sintasa de Aspergillus nidulans, 30 fosforribosil antranilato isomerasa y glutamina amidotransferasa (trpC). El plásmido pDV8 se digirió con Bam HI, se extrajo con fenolcloroformo, precipitó etanol y luego se rellenó al usar polimerasa de Klenow (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU). El plásmido digerido se ligó de nuevo utilizando un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ después del protocolo del fabricante, se trató con un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit y los productos de ligamiento resultantes se clonaron en el pCR®4Blunt-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) utilizando un 35 equipo de clonación TOPO® Blunt Cloning Kit según las instrucciones del fabricante. La reacción de clonación se transformó en células TOP10 ONE SHOT® químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) según las indicaciones del fabricante. Se extrajo el plásmido de ADN de ocho de los transformantes resultantes usando un BIOROBOT® 9600 (QIAGEN Inc, Valencia, CA, EE.UU) y se visualizó mediante digestión de restricción usando Xho I/Bam HI y Xho I/Hind III. La secuenciación del ADN del plásmido de ADN a partir de dos transformantes con el 40 modelo de digestión de restricción correcto confirmó que ambos contenían la secuencia deseada. Uno se designó pJaL504-[Bam HI] (figura 6).
[0206] El plásmido pJaL504-[Bam HI] se digirió con Bgl II, se extrajo con fenolcloroformo, precipitó etanol y luego se rellenó al usar polimerasa de Klenow. El plásmido digerido se ligó de nuevo utilizando un equipo de ligamiento 45 QUICK LIGATION™ Kit después del protocolo del fabricante, se trató con un equipo de limpieza MINELUTE® Reaction Cleanup Kit y el ligamiento resultante se clonó en el pCR®4Blunt-TOPO® utilizando un equipo de clonación TOPO® Blunt Cloning Kit según las instrucciones del fabricante. La reacción de clonación se transformó en células químicamente competentes TOP10 de E. coli ONE SHOT® según las indicaciones del fabricante. Se extrajo el plásmido de ADN de ocho de los transformantes resultantes usando un BIOROBOT® 9600 y se visualizó 50 mediante digestión de restricción usando Xho I/Bgl II y Xho I/Hind III. La secuenciación del ADN del plásmido de ADN de dos transformantes con el modelo de digestión de restricción correcto confirmó que ambos contenían la secuencia deseada. Uno se designó pJaL504-[Bgl II] (figura 7). Punt et al. (1990, Gene 3: 101-109) han mostrado previamente que 364 pares de bases del promotor de gpdA de Aspergillus nidulans podrían ser eliminadas sin afectar la fuerza del promotor. Basándose en estas observaciones de los autores, se diseñó el cebador 172450 55 mostrado posteriormente para truncar el promotor de gpdA de Aspergillus nidulans y reducir el tamaño del vector.
Cebador 172450:
5’-GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTACAGTGACCGGTGACTC-3’
60
La secuencia subrayada corresponde a secuencia promotora de gpdA. La secuencia restante es un mango que contiene los siguientes sitios de restricción: Eco RI, Xba I, Bgl II, Xho I y Hind III.
[0207] Para el truncamiento del terminador trpC de Aspergillus nidulans (nuevamente para reducir el tamaño del vector), se diseñó el cebador 172499, mostrado a continuación, para que contuviera un mango Eco RI. 65
Cebador 172499:
5'-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-3' (SEC ID nº 26)
[0208] La secuencia subrayada corresponde a la secuencia terminadora trpC. Los cebadores de uso de amplificación 172499 y 172450 truncan el promotor en 364 pares de bases y la secuencia terminadora trpC en 239 5 pares de bases.
[0209] El PCR se realizó con los anteriores dos cebadores usando pJaL504-[Bgl II] como modelo para generar un fragmento de 2,522 kb compuesto por una versión truncada del promotor de gpd de A. nidulans, la secuencia codificante del gen HSV1-TK y una versión truncada del terminador trpC de A. nidulans. 10
[0210] La reacción de amplificación consistió en 5 µl de 10X tampón (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU), 0,4 µl de 25 mM dNTPs, 1,25 µl cebador 172450 (100 ng/µl), 1,25 µl cebador 172499 (100 ng/µl), 0,5 µl pJaL504-[Bgl II] (100 ng/µl), 2 µl de ADN polimerasa Pfu (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU) (2,5 U/µl) y 39,6 µl agua destilada estéril. La reacción de amplificación se incubó en un ROBOCYCLER® programado para 1 ciclo a 15 95°C durante 45 segundos; y 28 ciclos cada uno a 95°C durante 45 segundos, 57°C durante 45 segundos y 72°C durante 5 minutos. Se realizó una extensión final durante 10 minutos a 72°C.
[0211] Se sometió la reacción de amplificación a 1% electroforesis en gel de agarosa usando gel de agarosa de temperatura de fusión baja en tampón 50 mM Tris-50 mM ácido bórico-1 mM EDTA disódico (TBE). Se escindió un 20 fragmento de 2522 pares de bases del gel y se extrajo utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. El ADN purificado con gel se insertó posteriormente en el pCR®4Blunt-TOPO® utilizando un equipo de clonación TOPO® Blunt Cloning Kit según las instrucciones del fabricante. La reacción de clonación se transformó en células químicamente competentes TOP10 ONE SHOT® según las indicaciones del fabricante. Se extrajo el plásmido de ADN de ocho de los transformantes resultantes utilizando un BIOROBOT® 9600 y se visualizó 25 mediante digestión de restricción usando Eco RI y Bgl II. La secuenciación del ADN del plásmido de ADN de dos transformantes con el modelo de digestión de restricción correcto confirmó que ambos contenían la secuencia deseada. Uno se designó pJaL574 (figura 8).
Ejemplo 9: construcción del plásmido pWTY1449-02-01 30
[0212] El plásmido pJaL574 se transformó en células E. coli SCS110 competentes (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) después del protocolo recomendado por el fabricante. Se extrajo el plásmido de ADN de veinticuatro de los transformantes resultantes, usando un BIOROBOT® 9600 y luego se sometió a digestión analítica usando Eco RI y Bgl II. El posterior análisis de secuencia de ADN resultó en la identificación de un clon con la secuencia correcta, 35 que se designó pWTY1449-02-01 (figura 9).
Ejemplo 10: generación del vector de deleción pJfyS1579-21-16 de tri5
[0213] Un cassette de genes de fosfotransferasa de higromicina (hpt) de E. coli se amplificó con PCR a partir del 40 plásmido pEmY23 utilizando un equipo de PCR genómico ADVANTAGE® GC Genomic PCR Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, EE. UU) y cebadores directo e inverso específicos de gen mostrados a continuación. La parte subrayada en el cebador inverso es un sitio Bgl II para la clonación.
Cebador directo: 45
5'-TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3' (SEC ID nº 27)
Cebador inverso:
5'-CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3' (SEC ID nº 28)
50
[0214] La reacción por PCR contenía 362 ng de pEmY23 como molde de ADN, 200 µm dNTP, 1,1 mM acetato magnésico, 0,4 µM cebadores, 1X GC tampón de reacción (Clonetech, Palo Alto, CA, EE. UU), 0,5 M GC Melt (Clonetech, Palo Alto, CA, EE. UU) y 1X GC mezcla de polimerasa Genomic Polymerase Mix (Clonetech, Palo Alto, CA, EE. UU) en un volumen final de 50 µl.
55
[0215] La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® (Eppendorf, Múnich, Alemania) programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 25 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos y 66°C durante 3 minutos; y 1 ciclo a 66°C durante 3 minutos; y mantenimiento a 4°C.
[0216] Los productos PCR se separaron con 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TAE. Un 60 fragmento de aproximadamente 1,9 kb se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINIELUTE® Gel Extraction Kit. El fragmento se clonó en pCR®2.1 utilizando un equipo de clonación TOPO® TA Cloning Kit según las instrucciones del fabricante. Se transformaron células TOP10 competentes ONE SHOT® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) con 2 µl de la reacción TOPO® TA. El análisis de secuencias de plásmido de ADN de 8 transformantes confirmó que no había ninguna desviación de la secuencia prevista y el 65 plásmido se designó pJfyS1540-75-5 (figura 10).
[0217] Se liberó la inserción de hpt de pJfyS1540-75-05 mediante digestión con Bam HI y Bgl II y se purificó por 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE. Un fragmento de 1,9 kb se escindió y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINIELUTE® Gel Extraction Kit. Se usó un equipo de ligamiento Rapid DNA Ligation Kit para enlazar el fragmento al vector de deleción pWTY1515-02-01 de tri5 vacío linealizado con Bgl II 5 (ejemplo 7) que ha sido defosforilado usando fosfatasa de intestino de ternero. Las células químicamente competentes SURE® de E. coli se transformaron con la reacción de ligamiento y se analizó el plásmido de ADN de 24 de los transformantes resultantes mediante digestión de restricción con Eco RI para confirmar la orientación de la inserción. Se seleccionó uno de los transformantes que contenía la inserción en la orientación deseada y se designó pJfyS1579-1-13 (figura 11). 10
[0218] Se amplificó por PCR un gen de timidina quinasa (tk) de virus Herpes simplex (SEC ID nº 29 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 30 para la secuencia de aminoácido deducido) usando pWTY1449-2-1 como modelo y cebadores directo e inverso específicos de gen mostrados a continuación. La secuencia en negrita representa el sitio Bgl II introducido. 15
Cebador directo:
5'-GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3' (SEC ID nº 31)
Cebador inverso: 20
5'-CAGATAACGAAGATCTGAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3' (SEC ID nº 32)
[0219] La reacción por PCR contenía 1X tampón de reacción HERCULASE® (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU), 200 µM dNTPs, 55 ng pWTY1449-2-1, 0,2 µM cebadores, 2% DMSO y 2,5 unidades de ADN polimerasa HERCULASE® (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) en un volumen final de 50 µl. 25
[0220] La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 1 ciclo a 95°C durante 1 minuto; 25 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 68°C durante 2 minutos y 45 segundos; y 1 ciclo a 68°C durante 2 minutos y 45 segundos; y un mantenimiento a 4°C.
30
[0221] Se separaron los productos PCR con 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TAE. Un fragmento de aproximadamente 2,8 kb se escindió del gel y se purificó utilizando un equipo de extracción MINIELUTE® Gel Extraction Kit. El fragmento se clonó en pCR®2.1 utilizando un equipo de clonación TOPO® TA Cloning Kit. Se transformaron células TOP 10 competentes ONE SHOT® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) con 2 µl de la reacción TOPO® TA. El análisis de secuencias del plásmido de ADN de uno de los transformantes identificó 35 una mutación en la secuencia codificante tk (C1621G) dando como resultado un cambio aminoácido de glicina a alanina. Esta mutación se corrigió utilizando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio QUIKCHANGE® II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) según las instrucciones del fabricante y cebadores directo e inverso mostrados a continuación. La letra minúscula indica el cambio deseado. El análisis de secuencias de 16 clones resultó en la selección de uno que se designó pJfyS1579-8-6 (figura 12). 40
Cebador directo:
5'-CCCTGTTTCGGGgCCCCGAGTTGCTGG-3' (SEC ID nº 33)
Cebador inverso: 45
5'-CCAGCAACTCGGGGcCCCGAAACAGGG-3' (SEC ID nº 34)
[0222] Se digirió el plásmido pJfyS1579-08-06 con Bam HI y Bgl II para liberar el fragmento tk de 2,8 kb y se purificó el fragmento como se ha descrito anteriormente. Este fragmento se ligó a pJfyS1579-1-13, que ha sido linealizado con Bgl II y tratado con fosfatasa de intestino de ternero, usando un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ Kit y 50 ha sido usado para transformar células químicamente competentes SURE® de E. coli según el protocolo del fabricante. El plásmido resultante se designó pJfyS1579-21-16 (figura 13) y se usó como el cassette de deleción de tri5.
Ejemplo 11: construcción de la cepa JfyS1604-47-02 de Δtri5 de Fusarium venenatum 55
[0223] Se transformaron los protoplastos A3/5 de Fusarium venenatum con pJfyS1579-21-16 linealizado con Bst Z171/Bam HI utilizando el método descrito en el ejemplo 1. Se seleccionaron transformantes en placas VNO3RLMT que contienen 125 µg de higromicina B (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE. UU) por ml. Después del día 7, 48 de los 123 transformantes se sub-cultivaron a una placa nueva con el mismo medio. Posteriormente se 60 analizaron ocho transformantes mediante análisis Southern de la siguiente manera. La biomasa fúngica de estas cepas se generó inoculando 25 ml de medio M400 con cuatro tapones de agar de 1 cm a partir de transformantes de 7 días de antigüedad obtenidos como se ha descrito anteriormente. Los cultivos se incubaron durante 3 días a 28°C con agitación a 150 r.p.m. Se retiraron los tapones de agar y se filtraron los cultivos a través de MIRACLOTH™. La biomasa cosechada se congeló con nitrógeno líquido y los micelios se molieron utilizando mortero y mano de 65 mortero.
[0224] El ADN genómico se aisló utilizando un equipo DNEASY® Plant Maxi Kit según las instrucciones del fabricante, excepto el periodo de incubación lítica a 65°C se extendió de 10 minutos a 1,5 horas.
[0225] Se digirieron dos µg de ADN genómico con 16 unidades de Sph I y 22 unidades de Dra I en 50 µl de volumen 5 de reacción a 37°C durante 22 horas. La digestión se sometió a 1,0% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE. El ADN se fragmentó en el gel mediante el tratamiento con 0,25 M HCl, se desnaturalizó con 1,5 M NaCl-0,5 M NaOH, se neutralizó con 1,5 M NaCl-1 M Tris a pH 8 y luego se transfirió en 20X SSC a una membrana de nilón NYTRAN® Supercharge utilizando un equipo TURBOBLOTTER™ Kit. El ADN se reticuló con UV a la membrana utilizando un UV STRATALINKER™ y pre-hibridado durante 1 hora a 42°C en 20 ml de DIG Easy Hyb. 10
[0226] Se generó una muestra PCR a la secuencia flanqueante 3' del gen tri5 utilizando los siguientes cebadores directo e inverso.
Cebador directo: 15
5'-GTGGGAGGATCTGATGGATCACCATGGGC-3" (SEC ID nº 35)
Cebador inverso:
5'-CCGGGTTTCGTTCCGAACGATCTTTACAAGG-3' (SEC ID nº 36)
20
[0227] La muestra se generó utilizando un equipo de síntesis PCR Dig Probe Synthesis Kit según las instrucciones del fabricante. La muestra se purificó mediante 1,2% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió la banda que corresponde a la muestra y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit. La muestra se hirvió durante 5 minutos y se añadió a 10 ml de DIG Easy Hyb para producir la solución de hibridación. La hibridación se realizó a 42°C durante 15-17 horas. Posteriormente se lavó la 25 membrana bajo condiciones de astringencia altas en 2X SSC más 0,1% SDS durante 5 minutos a temperatura ambiente seguido de dos lavados en 0,1X SSC más 0,1% SDS durante 15 minutos cada uno a 65°C. Los híbridos con objetivo de muestra se detectaron mediante ensayo quimioluminiscente (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE. UU) según las instrucciones del fabricante.
30
[0228] Un transformante, Fusarium venenatum JfyS1579-43-23, que contenía el cassette de deleción en una única copia en el locus tri5, como se determinó mediante análisis Southern, se esporuló cortando cuatro tapones estériles de 1 cm2 usando palillos de una placa de 7 días de antigüedad que contiene medio VNO3RLMT y transferirlos a un matraz de agitación disipado de 125 ml que contiene 25 ml de medio RA. El matraz se incubó a 28°C con una agitación de 150 r.p.m. durante 48 horas. El cultivo de esporas se filtró a través de MIRACLOTH™ estéril y se 35 recogió en un tubo de polipropileno de 50 ml. La concentración de esporas se determinó usando un hemocitómetro y se transfirieron 105 esporas (en un ml) a una placa de 150 mm que contenía medio VNO3RLMT suplementado con 50 µM 5-fluoro-5'-deoxiuridina (FdU) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU) y se incubó durante 4 días a 28°C. Los aislados de espora se escogieron utilizando palillos estériles y se transfirieron a una placa nueva que contenía medio VNO3RLMT suplementado con 10 µM FdU y se dejaron crecer durante 7 días a 24-28°C. 40
[0229] Se extrajo ADN genómico de 7 aislados de espora y se llevaron a cabo análisis Southern como se ha descrito anteriormente para asegurar la escisión correcta del cassette del genoma. Todos los aislados de espora analizados mediante Southern blot habían cortado el cassette dejando una repetición como se preveía. Un aislado de espora se purificó por espora una vez induciendo la esporulación en la cepa como se describe en el párrafo precedente y la 45 concentración de espora se determinó usando un hemocitómetro y se diluyó a 40 esporas por ml. Se colocó en placas un ml de la solución de espora diluida en placas de 150 mm que contenían medio VNO3RLMT y las placas se incubaron a 28°C durante 4 días. Se sub-cultivaron los aislados de espora a nuevas placas que contenían medio VNO3RLMT y un aislado de espora, designado Fusarium venenatum JfyS1604-17-02 (Δtri5), se usó como cepa de inicio para la deleción del gen pyrG. 50
Ejemplo 12: construcción de un vector de deleción universal que contiene el marcador de selección negativa de timidina quinasa (tk) y el marcador de selección positiva de higromicina fosfotransferasa (hpt)
[0230] Se construyó un vector de deleción universal que contenía los marcadores de timidina quinasa (tk) e 55 higromicina fosfotransferasa (hpt) para facilitar el posterior ensamblaje de plásmidos de deleción. Las secuencias flanqueantes para las regiones 5' y 3' del gen previstas para la deleción pueden ligarse fácilmente al vector que sigue a la digestión de este último con Pme I o Asc I (para secuencias flanqueantes 5') y Sbf I o Swa I (para secuencias flanqueantes 3').
60
[0231] Para amplificar con PCR las repeticiones directas derivadas de la región flanqueante 5' del gen pyrG de Fusarium venenatum, se usaron 50 picomoles de los cebadores mostrados a continuación en dos reacciones de PCR que contenían 50 ng de pDM156.2, 1X tampón de amplificación Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU), 6 µl de 10 mM de mezcla de dNTPs, 2,5 unidades de ADN polimerasa PLATINUM® Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) y 1 µl de 50 mM MgSO4 en un volumen total de 50 µl. 65
Cebadores:
Repetición 1
Cebador de sentido: 5
5'-GTTTAAACGGCGCGCC CGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG-3' (SEC ID nº 37)
Cebador antisentido:
5'-TTGTCGCCCGGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3' (SEC ID nº 38)
10
Repetición 2
Cebador de sentido:
5'-AGTATTCCCGGG CGACAAAACAAGGCTACTGCA-3' (SEC ID nº 39)
15
Cebador antisentido:
5'-ATTTAAATCCTGCAGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3' (SEC ID nº 40)
[0232] Las reacciones de amplificación se incubaron en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado de la siguiente manera. Para la repetición 1: 1 ciclo a 98°C durante 2 minutos; y 5 ciclos cada uno a 94°C durante 30 20 segundos, 55°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto. Esto se siguió de 35 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 59°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto. Para repetición 2 los parámetros cíclicos eran: 1 ciclo a 98°C durante 2 minutos; y 5 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto. Esto se siguió de 35 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto. Después de los 35 ciclos ambas reacciones (es decir, las repeticiones 1 y 2) se incubaron a 25 68°C durante 10 minutos y luego se enfriaron a 10 °C hasta haber sido más procesadas.
[0233] Los productos PCR de ambas reacciones se separaron con 0,8% agarosa GTG (Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, EE. UU) electroforesis en gel que usa tampón TAE. Para la repetición 1 y repetición 2, los fragmentos de aproximadamente 0,26 kb se escindieron del gel y se purificaron utilizando cápsulas giratorias 30 Ultrafree®-DA (Millipore, Billerica, MA, EE. UU) según las instrucciones del fabricante. Se usaron diez microlitros de cada repetición purificada luego en una única reacción por PCR de superposición que contenía 1X tampón de amplificación Pfx, 6 µl de 10 mM mezcla de dATP, dTTP dGTP y dCTP, 2,5 unidades de ADN polimerasa PLATINUM® Pfx y 1 µl de 50 mM MgSO4 en un volumen total de 50 µl.
35
[0234] La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 1 ciclo a 98°C durante 2 minutos; y 5 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto.
La reacción se mezcló entonces con una solución precalentada que contenía 50 picomoles del cebador de sentido para la repetición 1 y 50 picomoles del cebador antisentido para la repetición 2, 1X tampón de amplificación Pfx, 6 µl 40 de 10 mM dNTPs, 2,5 unidades de ADN polimerasa PLATINUM® Pfx y 1 µl de 50 mM MgSO4 en un volumen final de 50 µl.
[0235] La nueva reacción de amplificación de 100 µl se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 35 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 45 minuto. Después de 35 ciclos, la reacción se incubó a 68°C durante 10 minutos y luego se enfrió a 10°C hasta ser más procesada. Un producto PCR de 0,5 kb (que contenía el ensamblaje de repetición) se aisló con 0,8% electroforesis en gel de agarosa GTG como se ha descrito anteriormente.
[0236] El plásmido PCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) se usó como la fuente de la estructura del vector para 50 la construcción del vector de deleción universal. Para eliminar las porciones no esenciales del ADN pCR4, se digirieron secuencialmente 2,5 µg de plásmido pTter61 C (WO 2005/074647) con Bsp LU11 I y Bst XI. El vector digerido se trató luego con fosfatasa antártica (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE.UU). La estructura digerida de 3,1 kb se aisló con 0,8% electroforesis en gel de GTG-agarosa como se ha descrito anteriormente. El ensamblaje de repetición purificado se ligó posteriormente a la estructura de vector purificado con un equipo de 55 ligamiento Rapid Ligation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE.UU). La reacción de ligamiento consistía en: 75 ng de estructura de vector purificado y 3 µl del ensamblaje de repetición purificado. Se usó un microlitro de esta reacción de ligamiento para transformar células químicamente competentes SOLOPACK® Supercompetent (Stratagene, Carlsbad, CA, EE. UU) utilizando los protocolos sugeridos del fabricante. Se analizaron veinticuatro transformantes con digestión de restricción Nco I/Pme I. Veintitrés de los veinticuatro 60 transformantes tenían el modelo de digestión de restricción previsto. Se seleccionó al azar el clon pFvRs 10 para la secuenciación para confirmar que no había errores inducidos por PCR. El análisis de secuenciación mostró que el ensamblaje de repetición en el clon pFvRs 10 tenía la secuencia prevista y por lo tanto fue seleccionado como la estructura del vector universal de Fusarium venenatum y se designó pAILo1492-24 (figura 14).
65
[0237] El cassette que contenía el gen higromicina fosfotransferasa (hpt) se amplificó por PCR a partir de pEmY23
utilizando los cebadores directo e inverso específicos de gen mostrados posteriormente. La secuencia subrayada representa un sitio Xma I y las letras en negrita representan un sitio Bgl II. Las cuatro aes en cada extremo 5' permiten la posterior digestión de los extremos terminales del producto PCR.
Cebador directo: 5
5'-aaaacccgggCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3' (SEC ID nº 41)
Cebador inverso:
5'-aaaacccgggAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3' (SEC ID nº 42)
10
[0238] La reacción de amplificación contenía 60 ng pEmY23, 200 µm dNTPs, 1 mM acetato magnésico, 0,4 µM cebadores, 1X tampón de amplificación Pfx, 0,5 M GC Melt y 2,5 unidades de polimerasa PLATINUM® Pfx en un volumen final de 50 µl. La reacción se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 10 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto 50 segundos; y 1 ciclo a 68°C durante 7 minutos seguidos de un mantenimiento a 4°C. 15
[0239] Los productos PCR se separaron con 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TAE. Un fragmento de aproximadamente 1,8 kb se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINIELUTE® Gel Extraction Kit. El producto PCR purificado con gel se digirió posteriormente con Xma I y se llevó a cabo en un 1% gel de agarosa y se purificó con gel otra vez como anteriormente. Un equipo de ligamiento 20 QUICK LIGATION™ Kit se usó para enlazar el producto PCR de hpt a pAILo1492-24 linealizado con Xma I, que se trató con fosfatasa de intestino de ternero. El plásmido resultante se designó pJfyS1579-35-2 (figura 15) y se usó como receptor para la inserción del gen de timidina quinasa.
[0240] La fuente del cassette tk del virus Herpes simplex era plásmido pJfyS1579-8-6 (ejemplo 10), a partir de la cual 25 se liberó la inserción mediante digestión con Bam HI y Bgl II. Los productos de digestión se separaron con 1% electroforesis en gel de agarosa usando tampón TAE y se escindió un fragmento correspondiente con la inserción de gen tk de 2,8 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit. Se usó un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ Kit para enlazar el cassette de gen tk a pJfyS1579-35-02 linealizado con Bgl II, que se había tratado con fosfatasa de intestino de ternero. El plásmido resultante se designó pJfyS1579-30 41-11 (figura 16) y éste se usó como punto de partida para la construcción de los vectores de deleción pyrG, amyA, alpA y dpsI.
Ejemplo 13: generación del vector de deleción pJfyS1604-55-13 de pyrG
35
[0241] La secuencia flanqueante 3' del gen pyrG A3/5 de Fusarium venenatum (SEC ID nº 43 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 44 para la secuencia de aminoácido deducido) se amplificó utilizando un sistema EXPAND® High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE. UU) y cebadores específicos de gen directo e inverso mostrados posteriormente. La parte subrayada es un sitio Sbf I introducido para la clonación y la parte en cursiva es un sitio Not I introducido para la posterior digestión para eliminar la parte del plásmido pCR®2.1 40 antes de la transformación.
Cebador directo:
5'-aaaaaacctacaggATCCTGCGCGGACTCTTGATTATTT-3' (SEC ID nº 45)
45
Cebador inverso:
5'-aaaaaacctgcagggcggccgcAATTCCATTCCTGTAGCTGAGTATA-3' (SEC ID nº 46)
[0242] La reacción de amplificación contenía 125 ng de ADN genómico A3/5 de Fusarium venenatum, 200 µm dNTP, 0,4 µM cebadores, 1X tampón EXPAND® Buffer (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE. UU) con 5 50 mM MgCl2 y 2,5 unidades de ADN polimerasa EXPAND® (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE. UU) en un volumen final de 50 µl.
[0243] La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 10 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 54°C durante 30 segundos y 72°C 55 durante 1 minuto; y 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 54°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto y 10 segundos.
[0244] Los productos PCR se separaron mediante 1% electroforesis en gel de agarosa usando tampón TAE y se escindió un fragmento de 0,7 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel 60 Extraction Kit.
[0245] El producto PCR de 0,7 kb se digirió con Sbf I y se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TAE. Se escindió un fragmento de aproximadamente 0,7 kb del gel y además se purificó utilizando una cápsula giratoria Ultrafree®-DA. El fragmento de 0,7 kb se ligó a pJfyS1579-41-11 (que se había digerido con Sbf I y 65 se había defosforilado utilizando fosfatasa de intestino de ternero) utilizando un equipo de ligamento QUICK
LIGATION™ Kit y la mezcla de ligamiento usada para transformar células químicamente competentes SURE® de E. coli según el protocolo del fabricante. El plásmido resultante se designó pJfyS1604-35-13.
[0246] La secuencia flanqueante 5' de pyrG a partir de pEmY23 (ejemplo 5) se amplificó utilizando un sistema EXPAND® High Fidelity PCR System y cebadores directo e inverso específicos de gen mostrados a continuación. La 5 parte subrayada es un sitio Pme I introducido para la clonación y la parte en cursiva es un sitio Not I introducido para una posterior digestión para eliminar el gen de beta lactamasa antes de la transformación fúngica.
Cebador directo:
5'-aaaaaagtttaaacgcggccgcCTGTTGCCTTTGGGCCAATCAATG-3' (SEC ID nº 47) 10
Cebador inverso:
5'-aaaaaagtttaaacCTAGTTGGAGTATTGTTTGTTCTT-3' (SEC ID nº 48)
[0247] La reacción de amplificación contenía 20 ng pEmY23, 200 µm dNTP, 0,4 µM cebadores, 1X tampón 15 EXPAND® con 15 mM MgCl2 y 2,5 unidades de ADN polimerasa EXPAND®.
[0248] La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado durante 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 10 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 53°C durante 30 segundos y 72°C durante 40 segundos; y 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 53°C durante 30 segundos y 72°C durante 20 40 segundos más 10 segundos adicionales por ciclo posterior.
[0249] El producto PCR se purificó utilizando un equipo de purificación MINELUTE® PCR Purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU). Los productos PCR purificados se digirieron con Pme I y se separaron con 1% electroforesis en gel de agarosa usando tampón TAE. Se escindió un fragmento de aproximadamente 0,5 kb del gel 25 y se extrajo agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit. El fragmento de 0,5 kb se ligó a pJfyS1604-35-13 digerido con Pme I y tratado con fosfatasa de intestino de ternero la utilizando un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ Kit. La reacción de ligamiento contenía 50 ng de vector, 20 ng de inserto, 1X tampón de reacción QUICK LIGATION™ Reaction Buffer (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU) y 10 unidades de ADN ligasa T4 (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU) en 20 µl de volumen de reacción. La reacción se 30 incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se usaron 2 µl del ligamiento para transformar células químicamente competentes SURE® de E. coli según las instrucciones del fabricante. El análisis de secuencias se usó para identificar transformantes que contienen la inserción en la orientación deseada y para confirmar la ausencia de errores de PCR. El plásmido resultante se designó pJfyS1604-55-13 (figura 17) y se usó como el cassette de deleción del gen pyrG. 35
Ejemplo 14: generación de la cepa JfyS1643-18-2 de Δtri5 ΔpyrG de Fusarium venenatum
[0250] Cincuenta y un transformantes putativos de Fusarium venenatum JfyS1604-17-2 (Δtri5), se transformaron con pJfyS1604-55-13 digerido con Not I y purificado con gel según el procedimiento descrito en el ejemplo 1, se 40 transfirieron desde placas de transformación con palillos estériles a nuevas placas que contenían medio VNO3RLMT suplementado con 125 µg de higromicina B por ml y 10 mM uridina y se cultivaron a 24-28°C durante 7 días. Posteriormente se analizaron transformantes fenotípicamente transfiriendo un tapón para cada una de dos placas VNO3RLMT, una con y una sin uridina (10 mM). Nueve transformantes que no mostraban crecimiento o mostraban un crecimiento pobre en las placas sin uridina se analizaron después mediante análisis Southern. El ADN genómico 45 de cada uno de los 9 transformantes se extrajo como se describe en el ejemplo 2 y 2 µg de cada uno se digirieron con 28 unidades de Mfe I y 14 unidades de Dra I. Se generó una muestra PCR a la secuencia flanqueante 3' del gen pyrG como se describe en el ejemplo 11, con los siguientes cebadores directo e inverso:
Cebador directo: 50
5'-GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3' (SEC ID nº 49)
Cebador inverso:
5'-GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3' (SEC ID nº 50)
55
[0251] El análisis Southern indicó que 2 de los 9 auxótrofos de uridina contenían el cassette de deleción en una copia única mientras el resto habían mantenido integraciones ectópicas del cassette. Un transformante, el Fusarium venenatum JfyS1604-85-5, se esporuló como se describe en el ejemplo 1 en medio RA con 10 mM uridina y se colocaron en placas 105 esporas en una placa de 150 mm que contenía medio VNO3RLMT suplementado con 50 µM FdU y 0,1 mM uridina. Los aislados de espora obtenidos se sub-cultivaron a una placa nueva que contenía medio 60 VNO3RLMT suplementado con 10 µM FdU y 0,1 mM uridina y se analizaron posteriormente mediante análisis Southern para aseguran la correcta escisión del genoma.
[0252] Todas las cepas analizadas habían cortado el cassette correctamente y se esporuló una cepa, Fusarium venenatum JfyS1643-10-3, como se describe en el párrafo precedente. La concentración de esporas se determinó 65 usando un hemocitómetro y la solución madre se diluyó a una concentración de 40 esporas por ml. Se colocó en
placas un ml en placas de 150 mm que contenían medio VNO3RLMT suplementado con 10 mM uridina. Las colonias de espora resultantes se sub-cultivaron en una placa nueva que contenía medio VNO3RLMT suplementado con 10 mM uridina y se usó un aislado de espora, Fusarium venenatum JfyS1643-18-2 (Δtri5 ΔpyrG), como la cepa para la deleción del gen alfa amilasa A (amyA) de Fusarium venenatum.
5
Ejemplo 15: generación del vector de deleción pJfyS1604-17-2 de amyA
[0253] Para obtener información de secuencia flanqueante arriba y abajo para la eliminación completa del gen amyA de Fusarium venenatum (SEC ID nº 51 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 52 para la secuencia de aminoácidos deducida), se usó un equipo universal GENOME WALKER™ Universal Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, EE. UU). Cada 10 biblioteca de ADN genómico A3/5 de Fusarium venenatum, generada con el equipo, se sometió a dos ciclos de PCR para la secuencia flanqueante 5' que utilizaba un cebador 5' específico de gen y un cebador 5' anidado mostrado posteriormente. La secuencia flanqueante 3' se obtuvo utilizando un cebador 3' específico de gen y un cebador 3' anidado mostrado posteriormente.
15
Cebador 5'específico de gen:
5'-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3' (SEC ID nº 53)
Cebador 5' anidado:
5'-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3' (SEC ID nº 54) 20
Cebador 3' específico de gen:
5'-CTACACTAACGGTGAACCCGAGGTTCT-3' (SEC ID nº 55)
Cebador 3' anidado: 25
5'-GCGGCAAACTAATGGGTGGTCGAGTTT-3' (SEC ID nº 56)
[0254] Las primeras reacciones de PCR contenían 1X tampón de reacción HERCULASE® Reaction Buffer, 2 µl cada biblioteca de ADN genómico (generada como se describe en el equipo), 200 nM AP1 suministrado por equipo (cebador adaptador 1), 200 nM cebador específico de gen (anteriormente), 200 µM dNTPs y 2,5 unidades de ADN 30 polimerasa HERCULASE® en 50 µl de volumen de reacción.
[0255] Las amplificaciones primarias se realizaron en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 7 ciclos cada uno a 94°C durante 25 segundos y 72°C durante 3 minutos y 32 ciclos cada uno a 94°C durante 25 segundos y 67°C durante 3 minutos y un ciclo a 67°C durante 7 minutos. 35
[0256] La reacción por PCR secundaria contenía 1X tampón de reacción HERCULASE® Reaction Buffer, 1 µl de cada reacción primaria por PCR (anteriormente), 200 nM AP2 suministrado por equipo (cebador adaptador 2), 200 nM cebador anidado específico al gen (anteriormente), 200 µM dNTPs y 2,5 unidades de ADN polimerasa HERCULASE® en 50 µl volumen de reacción. 40
[0257] Las amplificaciones secundarias se realizaron en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 5 ciclos cada uno a 94°C durante 25 segundos, 72°C durante 3 minutos y 20 ciclos cada uno a 94°C durante 25 segundos y 67°C durante 3 minutos y un ciclo a 67°C durante 7 minutos.
45
[0258] Los productos PCR se separaron con 1% electroforesis en gel de agarosa usando tampón TAE. Se escindió un fragmento de aproximadamente 0,7 kb del gel y se purificó utilizando un equipo de extracción MINIELUTE® Gel Extraction Kit según las instrucciones del fabricante. El producto PCR se ordena directamente utilizando el cebador anidado correspondiente descrito anteriormente y el cebador suministrado por el equipo 2. La secuencia obtenida se usó para diseñar cebadores para amplificar una región de 1 kb de la secuencia flanqueante 5' y una región 0,7 kb de 50 la secuencia flanqueante 3' del gen amyA para la inserción en el vector de deleción pJfyS1579-41-11 vacío.
[0259] La secuencia flanqueante 3' de amyA se amplificó con PCR a partir de ADN genómico A3/5 de Fusarium venenatum utilizando los cebadores directo e inverso mostrados a continuación.
55
Cebador directo:
5'-AAAAAAcctgcaggTAATGGGTGGTCGAGTTTAAAAGTA-3' (SEC ID nº 57)
Cebador inverso:
5'-AAAAAAcctgcagggcgaccacTTTAAGCATCATTTTTGACTACGCAC-3' (SEC ID nº 58) 60
Las letras subrayadas representan un sitio Not I para la posterior eliminación de beta lactamasa y las letras en cursiva representan un sitio Sbf I para la clonación de vectores.
[0260] La reacción por PCR contenía 1X tampón de reacción HERCULASE® Reaction Buffer, 120 ng de modelo de 65 ADN genómico, 400 nm cebadores, 200 µM dNTPs y 2,5 unidades de ADN polimerasa HERCULASE®.
[0261] La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 10 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto; y 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto y 10 segundos. 5
[0262] Los productos PCR se separaron con 1% electroforesis en gel de agarosa usando tampón TAE. Se escindió un fragmento de aproximadamente 0,7 kb del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINIELUTE® Gel Extraction Kit. El fragmento de PCR se digirió con Sbf I para producir extremos adherentes. Este fragmento se insertó en el vector de deleción universal pJfyS1579-41-11 linealizado con Sbf I y tratado con fosfatasa 10 de intestino de ternero. La reacción de ligamiento contenía 80 ng de vector, 80 ng de inserción, 1X tampón de reacción QUICK LIGATION Reaction Buffer y 10 unidades de ADN ligasa T4 en 20 µl volumen de reacción. Se usó un volumen de reacción de ligamiento de 1,5 µl para transformar 100 µl de células químicamente competentes SURE® de E. coli según las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron clones para la orientación de la inserción usando análisis de restricción con Eco RI y análisis de secuencias, que identificaron un clon carente de errores de 15 PCR. Este plásmido se designó pJfyS1579-93-1 (figura 18) y se usó como el receptor para la inserción de la secuencia flanqueante 5' de amyA.
[0263] La secuencia flanqueante 5' de amyA se amplificó por PCR utilizando los cebadores directo e inverso mostrados a continuación. 20
Las bases subrayadas representan un sitio Not I para la eliminación de gen bla y las otras letras minúsculas representan un sitio Pme I para asegurar que el fragmento se desafilaba para la clonación en un sitio de vector desafilado.
Cebador directo:
5'-AAAAAAgtttaaacGCGGCCGCTTGATTATGGGATGACCCCAGACAAGTGGT-3' (SEC ID nº 59) 25
Cebador inverso:
5'-AAAAAAgtttaaacCCGCACGAGCGTGTTTCCTTTTCATCTCG-3' (SEC ID nº 60)
[0264] La amplificación por PCR fue similar a aquella descrita anteriormente salvo por parámetros de ciclo 30 diferentes. La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 10 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto 15 segundos; y 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto 15 segundos con 10 segundos adicionales por ciclo posterior.
35
[0265] Los productos PCR se separaron por 1% electroforesis en gel de agarosa usando tampón TAE. Se escindió un fragmento de aproximadamente 1 kb del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINIELUTE® Gel Extraction Kit. El fragmento de 1 kb se digirió con Pme I para crear extremos desafilados y la inserción se clonó en pJfyS1579-93-1 digerida con Pme I y se defosforiló con fosfatasa de intestino de ternero.
40
[0266] La reacción de ligamiento contenía 75 ng de vector, 100 ng de inserción, 1X tampón de reacción QUICK LIGATION Reaction Buffer y 10 unidades de ADN ligasa T4 en 20 µl volumen de reacción. Después de una incubación de 5 minutos, se usaron 2 µl de la reacción de ligamiento para transformar 100 µl de células químicamente competentes SURE® de E. coli según la instrucción del fabricante. Se usó el análisis de secuencias para confirmar que la inserción estaba en la orientación correcta y comprobar la ausencia de errores de PCR. El 45 vector resultante identificado se designó pJfyS1604-17-2 (figura 19).
Ejemplo 16: generación de la cepa JfyS1643-95-4 de Δtri5 ΔpyrG ΔamyA de Fusarium venenatum
[0267] Cinco transformantes putativos de Fusarium venenatum JfyS1643-18-2 (Δtri5 ΔpyrG), transformados con 50 pJfyS1604-17-2 digerido con Not I y purificado con gel según el procedimiento descrito en el ejemplo 1, se transfirieron desde las placas de transformación con palillos estériles a nuevas placas que contienen medio VNO3RLMT suplementado con 125 µg de higromicina B por ml y 10 mM uridina y se incubaron a 24-28°C durante 7 días. Para un análisis Southern, se digirieron 2 µg de ADN genómico con 25 unidades de Ssp I.
Una muestra DIG a la secuencia flanqueante 5' del gen amyA se generó como se describe en el ejemplo 11 con los 55 cebadores directo e inverso mostrados a continuación.
Cebador directo:
5'-GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3' (SEC ID nº 61)
60
Cebador inverso:
5'-GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3' (SEC ID nº 62)
[0268] Se realizó el análisis Southern como se describe en el ejemplo 2 y los resultados indicaron que dos de los cinco transformantes presentaban una secuencia codificante sustituida con una única integración del cassette de 65 deleción. Un transformante primario designado Fusarium venenatum JfyS1643-73-2 se esporuló como se describe
en el ejemplo 1 y se colocaron en placas 105 esporas en una placa de 150 mm de diámetro que contenía medio VNO3RLMT suplementado con 50 µM FdU y 0,1 mM uridina. Los aislados de espora obtenidos se sub-cultivaron en una placa nueva que contenía medio VNO3RLMT suplementado con 10 µM FdU y 0,1 mM uridina.
[0269] Dos aislados de espora de Fusarium venenatum (JfyS1643-83-02 y JfyS1643-83-4) se purificaron mediante 5 esporas una vez dando como resultado cepas JfyS1643-95-1 y JfyS1643-95-2 (de JfyS1643-83-2) y Jfys1643-95-4 (de JfyS1643-83-4). Los aislados de espora originales escogidos de las placas FdU, al igual que sus respectivos aislados purificados por espora una vez, se analizaron mediante análisis Southern para asegurar la escisión correcta del genoma. Todas las cepas analizadas habían cortado el cassette correctamente. Se usó Fusarium venenatum JfyS1643-95-4 (Δtri5 ΔpyrG ΔamyA) como la cepa para la deleción del gen proteasa alcalina (alpA) de Fusarium 10 venenatum.
Ejemplo 17: construcción del plásmido pEJG61
[0270] El plásmido pEJG61 (figura 20) se construyó como se describe en la Patente EEUU nº 7,368,271, con la 15 excepción de que la orientación del cassette bar estaba invertida (es decir, los nucleótidos 5901-5210 codifican el promotor amdS, los nucleótidos 5209-4661 codifican la secuencia codificante bar y los nucleótidos 4660-4110 codifican el terminador glucoamilasa (AMG) de Aspergillus niger).
Ejemplo 18: construcción del plásmido pEJG69 20
[0271] El gen lactosa oxidasa (LOx) de Microdochium nivale (SEC ID nº 63 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 64 para la secuencia de aminoácido deducido) se amplificó por PCR a partir de pEJG33 (Xu et al., 2001, European Journal of Biochemistry 268: 1136-1142) utilizando los cebadores directo e inverso mostrados a continuación.
25
Cebador directo:
5'-CCCGCATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3' (SEC ID nº 65)
Cebador inverso:
5'-GGGTTAATTAATTATTTGACAGGGCG-3' (SEC ID nº 66) 30
Las partes subrayadas representan los sitios de clonación introducidos Sph I (directo) o Pac I (inverso).
[0272] El PCR contenía 200 µM dNTPs, 1 µM de cada cebador, 50 ng pEJG33, 1X tampón Pwo (Promega, Madison, WI, EE. UU) y 1 µl de polimerasa Hot Start Polymerase de Pwo (Promega, Madison, WI, EE. UU) en un volumen 35 final de 50 µl.
[0273] La reacción de amplificación se incubó en un ROBOCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 10 ciclos cada uno a 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto; 20 ciclos cada uno a 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minutos con una 40 extensión adicional de 20 segundos para cada ciclo posterior; y 1 ciclo a 50°C durante 10 minutos.
[0274] Los productos PCR se separaron con 1% electroforesis en gel de agarosa que usa un tampón TAE. Un fragmento de aproximadamente 1,5 kb se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. 45
[0275] El gen de lactosa oxidasa se reamplificó usando las mismas condiciones y se purificó como se ha descrito anteriormente, excepto por que la polimerasa y el tampón se sustituyeron con ADN polimerasa Taq y tampón de ADN polimerasa Taq, respectivamente y el producto PCR purificado con gel anterior se usó como modelo. El producto PCR se clonó en pCR®2.1 utilizando un equipo de clonación TOPO® TA Cloning Kit y se secuenció para 50 asegurar la ausencia de errores de PCR. El plásmido sin errores resultante se digirió con Sph I, se trató con ADN polimerasa T4 (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU), se purificó utilizando un equipo de eliminación QIAQUICK® Nucleotide Removal Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE. UU) y se digirió con Pac I. El fragmento se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió un fragmento de aproximadamente 1,5 kb del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. 55
[0276] El plásmido pEJG61 se digirió con Bsp LU11I, se trató con ADN polimerasa de Klenow (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU) según las indicaciones del fabricante y luego se digirieron con Pac I. El plásmido digerido se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió un fragmento de 8 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. 60
[0277] La secuencia codificante de LOx se ligó al pEJG61 digerido con Bsp LU11I y Pac I usando ADN ligasa T4 según las indicaciones del fabricante. Los plásmidos se visualizaron mediante análisis de secuencias para asegurar la ausencia de errores de PCR y se identificó un plásmido resultante y se designó pEJG69 (figura 21).
65
Ejemplo 19: construcción del plásmido pEJG65
[0278] El plásmido pEJG61 (ejemplo 17) se digirió con Bsp LU11I, se trató con ADN polimerasa de Klenow y se digirió con Pac I. El plásmido digerido se aisló con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió un fragmento de 8,1 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. 5
[0279] La secuencia codificante de lipasa A de Candida antarctica (SEC ID nº 67 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 68 para la secuencia de aminoácido deducida) se amplificó por PCR a partir de pMT1229 (WO 94/01541) utilizando los cebadores directo e inverso mostrados a continuación.
10
Cebador directo:
5'-GCATGCGAGTGTCCTTGCGC-3' (SEC ID nº 69)
Cebador inverso:
5'-TTAATTAACTAAGGTGGTGTGATG-3' (SEC ID nº 70) 15
[0280] La reacción por PCR contenía 200 µM dNTPs, 1 µM cada cebador, 20 ng de pMT1229, 1X tampón Pwo (Promega, Madison, WI, EE. UU) y 1 µl polimerasa Hot Start Polymerase Pwo.
[0281] La reacción de amplificación se incubó en un ROBOCYCLER® programado para 1 ciclo a 94°C durante 2 20 minutos; 10 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto; 17 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto con una extensión adicional de 20 segundos para cada ciclo posterior; y 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos.
[0282] Los productos PCR se aislaron con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió un 25 fragmento de 1,4 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. El fragmento de PCR se clonó en pCR®2.1 utilizando un equipo de clonación TOPO® TA Cloning Kit y se secuenció para verificar la ausencia de errores de PCR.
[0283] Debido a la presencia de un sitio Sph I interno en la secuencia codificante del gen, la secuencia codificante de 30 la lipasa A de Candida antarctica se liberó de pCR®2,1 como dos fragmentos distintos por digestiones distintas. Para liberar el primer fragmento (1 kb), el plásmido se digirió con Sph I y se trató con ADN polimerasa T4. La polimerasa se inactivó con calor durante 10 minutos a 75ºC y el plásmido se digirió con Nhe I. El segundo fragmento (0,4 kb) se liberó del plásmido con una digestión Nhe I/Pac I. Ambas digestiones se sometieron a 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió un fragmento de 1 kb de la digestión de Sph I/Nhe I y un 35 fragmento de 0,4 kb de la digestión de Nhe I/Pac I y se extrajeron con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. Los dos fragmentos se ligaron a pEJG61 digerido usando ADN ligasa T4. La reacción de ligamiento contenía 1X tampón de unión Ligation Buffer (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE. UU), 100 ng del fragmento de 1 kb anterior, 50 ng del fragmento de 0,4 kb, 50 ng pEJG61 digerido y 10 unidades de ADN ligasa T4. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 16 horas y se usó para transformar células 40 ultra competentes E. coli XL10-GOLD® Ultra-competent según las instrucciones del fabricante. Los transformantes se visualizaron mediante análisis de secuencias y un clon que contenía un plásmido con la secuencia codificante sin errores deseada se identificó y se designó pEJG65 (figura 22).
Ejemplo 20: construcción del plásmido pMStr19 45
[0284] El plásmido pMStr19 se construyó clonando un gen de fosfolipasa de Fusarium oxysporum a partir de pA2Ph10 (WO 1998/26057) en el vector de expresión pDM181 de Fusarium venenatum (WO 2000/56900). La amplificación de PCR se usó para aislar el gen de fosfolipasa en un fragmento de ADN conveniente.
50
[0285] El gen de fosfolipasa de Fusarium oxysporum se amplificó específicamente a partir de pA2Ph10 utilizando condiciones de amplificación estándar con ADN polimerasa Pwo (Roche Molecular Biochemicals, Basilea, Suiza) y una temperatura de recocimiento de 45°C con los cebadores mostrados a continuación.
PLMStr10: 55
5’-TCAGATTTAAATATGCTTCTTCTACCACTCC-3’ (Sec ID nº 71)
Swa I
PLMStr11:
5'-AGTCTTAATTAAAGCTAGTGAATGAAAT-3' (SEC ID nº 72) 60
[0286] El fragmento de ADN resultante se purificó con gel y se digirió con Swa I. El plásmido pDM181 se digirió también con Swa I y se defosforiló. Los fragmentos de ADN se ligaron luego entre sí para producir plásmido pMStr18.
65
[0287] El gen de fosfolipasa en dos transformantes de E. coli individuales de pMStr18, 4 y 17 generados utilizando la
mezcla de ligamiento, se secuenciaron utilizando métodos de walking de cebador estándar. Ambos habían adquirido mutaciones puntuales únicas en posiciones diferentes en el gen. Las mutaciones estaban separadas por un sitio Nar I, que corta el pMStr18 dos veces. Un gen de fosfolipasa sin errores se ensambló por lo tanto en el vector de expresión pDM181 de Fusarium mediante la digestión de ambos pMStr18 4 y pMStr18 17 con Nar I, el aislamiento de los fragmentos sin errores y el ligamiento de éstos entre sí para producir pMStr19 (figura 23). La secuencia de 5 fosfolipasa en pMStr19 se confirmó utilizando métodos estándar.
Ejemplo 21: construcción del plásmido pEJG49
[0288] El vector de expresión pEJG49 de Fusarium venenatum se generó por modificación del pSheB1 (WO 10 2000/56900). Las modificaciones incluían (a) eliminación de un sitio Bsp LU11I dentro de la secuencia de pSheB1 mediante mutagénesis dirigida al sitio; (b) eliminación de 850 pares de bases del promotor de tripsina de Fusarium oxysporum; (c) introducción de un sitio Bsp LU11I, mediante ligamiento de un enlazador, para ayudar en la inserción del promotor de glucoamilasa de 2 kb de Fusarium venenatum; y (d) introducción de un gen fosfolipasa de Fusarium oxysporum. 15
[0289] La eliminación del sitio Bsp LU11I dentro de la secuencia pSheB1 se realizó utilizando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio QUIKCHANGE® Site-Directed Mutagenesis Kit según las instrucciones del fabricante con los siguientes pares de cebadores de mutagénesis:
20
5'-GCAGGAAAGAACAAGTGAGCAAAAGGC-3' (SEC ID nº 73)
5'-GCCTTTTGCTCACTTGTTCTTTCCTGC-3' (SEC ID nº 74)
Esto creó pSheB1 intermedio 1.
25
[0290] La eliminación de 930 pares de bases del promotor de tripsina de Fusarium oxysporum se realizó digiriendo pSheB1 intermedio 1 (6,971 pares de bases) con Stu I y Pac I, sometiendo la digestión a 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TBE, escindiendo el fragmento de vector de 6,040 pares de bases y purificando el fragmento escindido con un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. Para introducir un nuevo sitio Bsp LU11I, se creó un enlazador utilizando los siguientes cebadores: 30
5’-dCCTACATGTTTAAT-3’ (SEC ID nº75)
Bsp Lu11I
5'-dTAAACATGTAGG-3' (SEC ID nº 76) 35
[0291] Cada cebador (2 µg cada uno) se calentó a 70°C durante 10 minutos y luego se enfrió hasta alcanzar la temperatura ambiente durante de una hora. Este enlazador se ligó en el fragmento de vector pSheB1 intermedio 1 digerido con Stu I-Pac I, creando pSheBI intermedio 2. El vector pSheBI intermedio 2 se digirió luego con Bsp Lu11I y Pac I. El vector digerido se purificó por 1% electroforesis en gel de agarosa en tampón TBE, se escindió del gel y 40 se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit.
[0292] El fragmento de gen de fosfolipasa de Fusarium oxysporum también se generó por PCR usando pMSTR19 como modelo. Los siguientes cebadores de PCR se usaron para introducir un sitio Sph I en el extremo 5' y un sitio Pac I en el extremo 3' del gen: 45
5’-GGGGGCATGCTTCTTCTACCACTCC-3’ (SEC ID nº 77)
Sph I
5’-GGGGTTAATTAAGAGCGGGCCTGGTTA-3’ (SEC ID nº 78) 50
Pac I
[0293] Las condiciones para PCR y la purificación se realizaron como anteriormente. El fragmento de gen de fosfolipasa se clonó en el pCR®-TOPO® según las instrucciones del fabricante. Posteriormente el clon de fosfolipasa de pCR®-TOPO® se digirió con Sph I y se trató con ADN polimerasa T4 para eliminar el extremo 3' 55 sobresaliente. El fragmento se purificó usando equipo de eliminación QIAQUICK® Nucleotide Removal Kit y se digirió con Pac I. La digestión se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa en tampón TBE y se escindió una banda de 1 kb del gel y se purificó utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit.
[0294] El plásmido pSheb1 intermedio 2 (arriba) se digirió con Stu I y Bsp Lu11I y se purificó utilizando un equipo de 60 eliminación QIAQUICK® Nucleotide Removal Kit. El fragmento se ligó luego a un fragmento promotor de glucoamilasa de Fusarium venenatum de 2 kb Stu I-Bsp Lu11I (WO 2000/056900). Este vector, conocido como pSheb1 intermedio 3, se digirió con Bsp Lu11I, se trató con fragmento Klenow para llenar el saliente 5', se digirió con Pac I y se purificó utilizando un equipo de eliminación QIAQUICK® Nucleotide Removal Kit. El fragmento se ligó luego al fragmento de fosfolipasa Sph I de Fusarium oxysporum, desafilado por Pac I (descrito arriba). El vector 65 resultante, designado pEJG49 (figura 24), contenía el gen indicador de fosfolipasa bajo el control transcripcional del
promotor de glucoamilasa de Fusarium venenatum.
Ejemplo 22: construcción del plásmido pEmY15
[0295] Se usó mutagénesis dirigida al sitio para eliminar uno de cada uno de los sitios de restricción Eco RI y Not I 5 del plásmido de expresión pEJG49 y dejar estos sitios de restricción flanqueando el marcador de resistencia bialafos (gen bar) único. La mutagénesis se completó utilizando los cebadores directo e inverso mostrados a continuación y un equipo de mutagénesis QUIKCHANGE® Site-Directed Mutagenesis Kit.
Cebador directo: 10
5'-cctgcatggccgcCgccgcCaattcttacaaaccttcaacagtgg-3' (SEC ID nº 79)
Cebador inverso:
5'-ccactgttgaaggtttgtaagaattGgcggcGgcggccatgcagg-3' (SEC ID nº 80)
15
Las letras mayúsculas indican los cambios deseados y el plásmido resultante se designó pEmY15 (figura 25).
Ejemplo 23: construcción del plásmido pEmY24
[0296] Para reemplazar el gen bar en el plásmido de expresión pEmY15 con el gen pyrG de Fusarium venenatum, 20 se llevó a cabo el siguiente protocolo. El plásmido pEmY15 se digirió con Eco RI y Not I y se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE. Se escindió un fragmento de 7,1 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit.
[0297] Un fragmento del gen pyrG de 2,3 kb se amplificó por PCR a partir de pDM156,2 utilizando los cebadores 25 directo e inverso mostrados a continuación.
Cebador directo:
5'-ATAAGAATgcggccgcTCCAAGGAATAGAATCACT-3' (SEC ID nº 81)
30
Cebador inverso:
5'-CGgaattcTGTCGTCGAATACTAAC-3' (SEC ID nº 82)
La secuencia en negrita corresponde a un sitio Not I introducido y un sitio Eco RI para los cebadores directo e inverso, respectivamente. 35
[0298] La reacción de amplificación se componía de 1X tampón ThermoPol (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU), 200 µM dNTPs, 31 ng de pDM156, 2,1 µM cada cebador y 1 unidad de ADN polimerasa VENT® en un volumen final de 50 µl.
40
[0299] La reacción se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado durante 1 ciclo a 95°C durante 3 minutos; 30 ciclos cada uno a 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 minuto; y 72°C durante 3 minutos; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos.
[0300] Los productos PCR se aislaron con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió un 45 fragmento de 2,3 kb y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit. El fragmento se digirió luego con Eco RI y Not I y la reacción de digestión se purificó utilizando un equipo de limpieza MINELUTE® Reaction Cleanup Kit. El fragmento se ligó a pEmY15 digerido con Not I y Eco RI usando ADN ligasa T4 según las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligamiento se transformó en las células competentes de grado de subclonación de E. coli XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU) según las instrucciones del fabricante. 50 Los transformantes se secuenciaron para asegurar la ausencia de errores de PCR y se identificó un plásmido con un fragmento pyrG sin errores. El plásmido resultante se designó pEmY24 (figura 26).
Ejemplo 24: construcción del plásmido pDM257
55
[0301] El plásmido pEmY24 (ejemplo 23) se digirió con Afl II y Sna BI. Un fragmento de 6,5 kb se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE, se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. El plásmido pEJG65 se digirió con Afl II y Sna BI. Un fragmento de 3,3 kb se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE, se escindió del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. 60
[0302] Los dos fragmentos se ligaron entre sí utilizando ADN ligasa T4 según las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligamiento se transformó en células competentes de E. coli de grado subclonación XL1-Blue según las instrucciones del fabricante. Los transformantes se visualizaron mediante análisis de secuencias y se identificó un clon que contenía un plásmido con los fragmentos deseados. El plásmido resultante se designó pDM257 (figura 27). 65
Ejemplo 25: construcción del plásmido pDM258
[0303] El plásmido pDM257 se digirió con Sca I y Afl II y se purificó con 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió un fragmento de 4,1 kb del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción QIAQUICK® Gel Extraction Kit. El plásmido pEJG69 también se digirió con Sca I y Afl II y se purificó con 5 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE y se escindió un fragmento de 5,8 kb del gel y se extrajo con agarosa como anteriormente.
[0304] Los dos fragmentos se ligaron entre sí utilizando ADN ligasa T4 según las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligamiento se transformó en células competentes de E. coli XL1-Blue de grado de subclonación según las 10 instrucciones del fabricante. Los transformantes se seleccionaron mediante análisis de secuencias y el plásmido deseado se identificó y designó pDM258 (figura 28).
Ejemplo 26: expresión de la lactosa oxidasa en la cepa JfyS1643-95- 4 de Fusarium venenatum
15
[0305] Los protoplastos de Fusarium venenatum JfyS1643-95-04 (Δtri5 ΔpyrG ΔamyA) se generaron como se describe en el ejemplo 1. Los protoplastos se transformaron luego según el procedimiento descrito en el ejemplo 1 con pDM258, que contenía el vector de expresión de lactosa oxidasa de Microdochium nivale, para evaluar el potencial de expresión de la cepa JfyS1643-95-04 de Fusarium venenatum. Los transformantes se cultivaron en matraces de agitación como se describe en el ejemplo 21 excepto en que los matraces se incubaron durante cinco 20 días a 28°C con una agitación a 200 r.p.m.
[0306] Los caldos del matraz de agitación se evaluaron para la actividad de la lactosa oxidasa que utiliza un ensayo de actividad conjuntamente con un BIOMEK® 3000, (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, EE.UU). El ensayo de lactosa oxidasa era una versión modificada del procedimiento Glucosa Oxidase Assay Procedure (K-Glox), 25 (Megazyme, Wicklow, Irlanda). Los sobrenadantes de cultivo se diluyeron apropiadamente en un 0,1 M tampón MOPS a pH 7,0 (tampón de muestra) seguido de una dilución en serie desde el pliegue 0 hasta el pliegue 1/3 hasta el pliegue 1/9 de la muestra diluida. Un estándar de lacatosa oxidasa (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) se diluyó usando pasos de 2 pliegues empezando con 0,056 mg/ml de concentración y finalizando con un 0,007 mg/ml de concentración en el tampón de muestra. Un total de 20 µl de cada dilución incluyendo la estándar se transfirió a 30 una placa de 96 pocillos con fondo plano. Cien microlitros de una solución POD (peroxidasa, 4AA, estabilizadores en el tampón de fosfato potásico a pH 7 más ácido p-hidroxibenzoico y azida sódica) se añadieron a cada pocillo seguidos de la adición de 100 µl de sustrato de glucosa (0,5 M glucosa en el tampón de muestra). La velocidad de reacción se midió a temperatura ambiente (aproximadamente 26°C) en 510 nm para un total de 10 minutos. Las concentraciones de muestra se determinaron por extrapolación a partir de una curva estándar generada utilizando 35 lactosa oxidasa como estándar. Los máximos transformantes productores de lactosa oxidasa se seleccionaron para el crecimiento y análisis en fermentadores de 2 litros.
[0307] El medio de fermentación (pH 6) estaba compuesto por litro por 20 g harina de soja, 20 g sacarosa, 2,0 g MgSO4·7H2O, 2,0 g anhidro KH2PO4, 2,0 g K2SO4, 5,0 g (NH4)2SO4, 1,0 g ácido cítrico, 0,5 ml 200X solución de 40 metales traza AMG (sin níquel) y 0,5 ml de ácido plurónico con un 20% alimentación de maltosa. Las fermentaciones se sometieron a 29.0 +/-1.0°C, 1200 r.p.m. y 1,0 vvm ventilación donde el % de oxígeno disuelto (OD) se mantuvo por encima del 30%.
[0308] Los caldos de fermentación se evaluaron para la actividad de alfa amilasa utilizando un equipo de ensayo 45 Alpha-Amylase Assay Kit (Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Irlanda) conjuntamente con un BIOMEK® 3000 y BIOMEK® NX (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, EE.UU). Los caldos de fermentación se evaluaron para la actividad de lactosa oxidasa como se ha descrito anteriormente.
[0309] El transformante de la parte superior resultante, Fusarium venenatum JfyS1643-95-04, tenía niveles de 50 producción de lactosa oxidasa equivalentes a otros transformantes de Fusarium venenatum sin las deleciones en 2 litros de fermentadores (figura 29) que indican que la deleción del gen amyA no había tenido un impacto negativo en la producción de proteína heteróloga. La deleción hizo, no obstante, abolir la actividad de alfa amilasa en el caldo de cultivo de esta cepa y todas las cepas posteriores de este linaje (figura 30). Como este transformante tenía capacidad de producción de proteína heteróloga equivalente a la cepa de producción actual y redujo los niveles de 55 alfa amilasa durante la fermentación, la cepa huésped Fusarium venenatum JfyS1643-95-04 se seleccionó para la deleción de un gen de proteasa alcalina A (alpA).
Ejemplo 27: generación del vector de deleción pJfyS1698-72-10 de la proteasa alcalina A (alpA) de Fusarium venenatum 60
[0310] La secuencia flanqueante hacia arriba para su uso en la eliminación completa de la proteasa alcalina A del gen A3/5 de Fusarium venenatum (SEC ID nº 83 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 84 para la secuencia de aminoácidos deducida) se obtuvo utilizando un equipo universal GENOME WALKER™ Universal Kit. Cada biblioteca generada con el equipo se sometió a dos ciclos de PCR para la secuencia flanqueante 5' que utiliza un cebador 65 específico de gen 5' y un cebador anidado 5' mostrados a continuación.
Cebador 5' específico de gen:
5'-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3' (SEC ID nº 85)
Cebador 5' anidado: 5
5'-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3' (SEC ID nº 86)
[0311] La información de secuencia se obtuvo del producto PCR utilizando un cebador adaptador anidado suministrado con el equipo universal GENOME WALKER™ Universal Kit y el cebador 5' anidado anterior.
10
[0312] La secuencia flanqueante 5' de alpA se amplificó por PCR a partir de ADN genómico A3/5 de Fusarium venenatum usando los cebadores directo e inverso específicos de la región mostrados a continuación. Las letras subrayadas representan un sitio Not I, para la posterior eliminación de la porción del vector pCR®2.1 y las letras en cursiva representan un sitio Asc I para la clonación del vector.
15
Cebador directo:
5'-aaaaaaggcgcgccgcggccgcGTTACGGTGTTCAAGTACATCTTACA-3' (SEC ID nº 87)
Cebador inverso:
5'-aaaaaaggcgcgccATTGCTATCATCAACTGCCTTTCTT-3' (SEC ID nº 88) 20
[0313] La reacción de amplificación contenía 1X tampón de reacción HERCULASE® Reaction Buffer, 120 ng ADN genómico, 400 nm cebadores, 200 µM dNTPs y 2,5 unidades de ADN polimerasa HERCULASE®.
[0314] La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado durante 1 25 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto 10 segundos; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos.
[0315] Una parte de 5 µl de la reacción amplificada se visualizó mediante 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TAE para asegurar que la reacción había producido la banda de 1 kb deseada. Posteriormente la 30 inserción se clonó directamente en pCR®2.1 a partir de la reacción de amplificación utilizando un equipo de clonación TOPO® TA Cloning Kit según las instrucciones del fabricante. Los transformantes se visualizaron mediante análisis de restricción con Eco RI para asegurar la presencia de la inserción y se combinaron 5 preparaciones correctas. La inserción se liberó a partir de pCR®2.1 mediante digestión con Asc I y el fragmento se purificó por electroforesis en gel de agarosa como se ha descrito anteriormente. La inserción se clonó en pJfyS1579-35 41-11 linealizado con Asc I utilizando un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ Kit y la mezcla de ligamiento se usó para transformar células químicamente competentes SURE® de E. coli según el protocolo del fabricante. Los transformantes se seleccionaron mediante análisis de secuencias para asegurar la ausencia de errores de PCR. Un plásmido que contiene la secuencia flanqueante sin errores se designó pJfyS1698-65-15 (figura 31) y se usó para insertar la secuencia flanqueante 3'. 40
[0316] La secuencia flanqueante 3' del gen alpA se amplificó a partir de ADN genómico A3/5 de Fusarium venenatum usando los cebadores directo e inverso específicos de región mostrados a continuación. Las letras subrayadas representan un sitio Not I, para la posterior eliminación de beta lactamasa y las letras en cursiva representan un sitio Sbf I para la clonación de vector. 45
Cebador directo:
5'-aaaaacctgcaggGGATGTGTGTGGAATAGGATATG-3' (SEC ID nº 89)
Cebador inverso: 50
5'-aaaaacctgcagggcaaccgcCCTCAAGGTGGAGAAATAATCTGT-3' (SEC ID nº 90)
[0317] La reacción por PCR contenía 1X tampón de reacción HERCULASE® Reaction Buffer, 120 ng modelo de ADN genómico, 400 nm cebadores, 200 µM dNTPs y 2,5 unidades de ADN polimerasa HERCULASE®.
55
[0318] La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto 10 segundos; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos.
[0319] Una parte de 5 µl de la reacción amplificada se visualizó en un 1% gel de agarosa en el tampón TAE para 60 asegurar que la reacción había producido la banda de 1 kb deseada. La inserción de 1 kb, directamente de la reacción por PCR, se clonó posteriormente en pCR®2.1 utilizando un equipo de clonación TOPO® TA Cloning Kit. El plásmido resultante se secuenció para identificar una colonia que contenía la secuencia correcta. El fragmento se liberó luego a partir de este plásmido mediante digestión con Sbf I y se purificó mediante 1% electroforesis en gel de agarosa en el tampón TAE. Una banda de 1 kb se escindió y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de 65 extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit.
[0320] Este fragmento se ligó luego a pJfyS1698-65-15 linealizado con Sbf I (tratado con fosfatasa de intestino de ternero) utilizando un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ Kit y la mezcla de ligamiento se usó para transformar células químicamente competentes SURE® de E. coli según las instrucciones del fabricante. Los transformantes se visualizaron mediante análisis de restricción con Not I para asegurar que el fragmento se había 5 insertado en la orientación correcta y se secuenció para asegurar que no había ninguna de las desviaciones de la secuencia previstas. El plásmido resultante pJfyS1698-72-10 (figura 32) se usó para la deleción del gen alpA.
Ejemplo 28: generación de la cepa JfyS1763-11-1 de Δtri5 ΔpyrG ΔamyA ΔalpA de Fusarium venenatum
10
[0321] Tres transformantes de Fusarium venenatum JfyS1643-95-4 (Δtri5 ΔpyrG ΔamyA) (Example 16) transformados con pJfyS1698-72-10 digerido con Not-I y purificado con gel según el procedimiento descrito en ejemplo 1 se transfirieron desde placas de transformación con palillos estériles a nuevas placas que contenían medio VNO3RLMT suplementado con 125 µg higromicina B por ml y 10 mM uridina y se incubaron a temperatura ambiente durante 7 días. Para el análisis Southern, se digirieron 2 µg de ADN genómico de Fusarium venenatum de 15 cada uno de los 3 transformantes con 34 unidades de Sph I. Una muestra DIG a la secuencia flanqueante 5' del gen alpA se generó según el método descrito en el ejemplo 11 usando los cebadores directo e inverso mostrados a continuación.
Cebador directo: 20
5'-GCACGTTAGGCTCAAGCCAGCAAGG-3' (SEC ID nº 91)
Cebador inverso:
5'-GAGGCTCATGGATGTGGCGTTAATG-3' (SEC ID nº 92)
25
[0322] El análisis Southern realizado como se describe en el ejemplo 11 indicó que uno de los tres transformantes contenía una única copia del cassette de deleción en el locus del gen alpA y este transformante se designó Fusarium venenatum JfyS1698-83-2.
[0323] Se esporuló Fusarium venenatum JfyS1698-83-2 como se describe en el ejemplo 1 y se colocaron en placas 30 105 esporas sobre una placa de 150 mm de diámetro que contenía medio VNO3RLMT suplementado con 50 µM FdU y 0,1 mM uridina. Los aislados de espora obtenidos se subcultivaron a una placa nueva que contenía medio VNO3RLMT suplementado con 10 µM FdU y 0,1 mM uridina. Los aislados de espora resultantes se analizaron mediante análisis Southern como se describe en el ejemplo 2 y se identificó un aislado de espora que había escindido el cassette. El aislado se designó Fusarium venenatum JfyS1698-94-04. Se purificó por espora Fusarium 35 venenatum JfyS1698-94-04 una vez como se describe en el ejemplo 11 y se escogió un aislado de espora y se designó Fusarium venenatum JfyS1763-11-01 (Δtri5 ΔpyrG ΔamyA ΔalpA).
[0324] Los protoplastos de Fusarium venenatum JfyS1763-11-01 se generaron y transformaron como se describe en el ejemplo 1 con pDM258. Los transformantes se analizaron como se describe en el ejemplo 26 y los caldos de 40 matraz de agitación se evaluaron para la actividad de proteasa alcalina. Una tableta PROTAZYME® AK (Megazyme, Wicklow, Irlanda) se suspendió en 2,0 ml de 0,01 % TRITON® X-100 mediante agitación suave. Se mezclaron quinientos microlitros de esta suspensión y 500 µl de tampón de ensayo provisto de la tableta PROTAZYME® AK en un tubo EPPENDORF® y se colocaron en hielo. Se añadieron veinte microlitros de muestra de proteasa (diluidos en 0,01% TRITON® X-100). El ensayo se inició mediante transferencia del tubo EPPENDORF® a un termomezclador 45 EPPENDORF®, el cual se estableció a temperatura de ensayo. El tubo se incubó durante 15 minutos en el termomezclador EPPENDORF® a 1300 r.p.m. La incubación se detuvo mediante la transferencia del tubo de nuevo a un baño de hielo. Posteriormente el tubo se centrifugó a 16,000 x g en un centrifugador a muy baja temperatura durante unos minutos y se transfirieron 200 µl de sobrenadante a una placa de microtitulación. Se leyó la absorbancia a 650 nm como una medida de actividad de proteasa. 50
[0325] Como con la deleción de amyA, la deleción del gen alpA no tuvo un impacto positivo en la expresión de lactosa oxidasa. No obstante, la actividad secundaria de proteasa alcalina en los sobrenadantes de fermentación se redujo a la décima parte (figura 33).
55
Ejemplo 29: generación del vector de deleción pJfyS111 de dps1
[0326] La secuencia flanqueante 3' para el gen depsipéptido sintasa (dps1) de Fusarium venenatum (SEC ID nº 93 para la secuencia de ADN y SEC ID nº 94 para la secuencia de aminoácidos deducida) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de Fusarium venenatum JfyS1763-11-01 utilizando los cebadores directo e inverso mostrados a 60 continuación. La parte subrayada en el cebador representa el sitio Sbf I introducido para la clonación y la parte en cursiva corresponde a un sitio Not I introducido para la posterior eliminación de beta lactamasa.
Cebador directo:
5'-GACTAAGCCCTGCAGGTTGGTCTCAATCGTCGCGACAG-3' (SEC ID nº 95) 65
Cebador inverso:
5'-AGTCTACCCCTGCAGGCGGCCGCTGGCATCGGTGGACGTAACACGC-3' (SEC ID nº 96)
[0327] La reacción de amplificación contenía 1X tampón de reacción HERCULASE® Reaction Buffer, 400 nM de 5 cada cebador, 200 µM dNTPs, 100 ng ADN genómico y 1,5 unidades de ADN polimerasa HERCULASE® en un volumen final de 50 µl. La reacción de amplificación se incubó en un MASTERCYCLER® de EPPENDORF® programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 25 ciclos cada uno a 95°C durante 30 segundos, 57°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto y 20 segundos; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos.
10
[0328] La reacción de amplificación se purificó utilizando un equipo de purificación MINELUTE® PCR Purification Kit. La reacción purificada se digirió luego con Sbf I y se sometió a 1% electroforesis en gel de agarosa que usa tampón TAE. Se escindió una banda de 1 kb del gel y se extrajo con agarosa utilizando un equipo de extracción MINELUTE® Gel Extraction Kit. El vector digerido se ligó luego a pJfyS1579-41-11 digerido con Sbf I (ejemplo 12) (que había sido defosforilado con fosfatasa de intestino de ternero) utilizando un equipo de ligamiento QUICK 15 LIGATION™ Kit según los protocolos sugeridos por el fabricante. Los clones resultantes se analizaron mediante análisis de restricción con Eco RI (para controlar la presencia y orientación de la inserción) y análisis de secuencias (para asegurar la ausencia de errores de PCR) y el plásmido resultante se designó pJfyS1879-32-2 (figura 34).
[0329] Para obtener la secuencia flanqueante en el extremo 5' del gen dps1, un equipo universal GENOME 20 WALKER™ Universal Kit se usó como se describe en el ejemplo 15 con los cebadores anidados específicos de gen y específicos de gen mostrados a continuación.
Cebador específico de gen:
5'-GCTATTGAGGGGACTATCTCCATGACTACA-3' (SEC ID nº 97) 25
Cebador anidado específico de gen:
5'-GCCTACCATCGACAGCAGTAAGATATTCC-3' (SEC ID nº 98)
[0330] La secuencia flanqueante 5' de dps1 se amplificó a partir del ADN genómico de Fusarium venenatum 30 JfyS1763-11-1 utilizando los cebadores directo e inverso indicados a continuación. La parte subrayada en el cebador directo representa un sitio Asc I introducido para la clonación y la parte en cursiva corresponde a un sitio Not I introducido para la posterior eliminación de beta lactamasa.
La reacción de amplificación y los parámetros de ciclo fueron idénticos a los descritos anteriormente excepto en que los cebadores usados fueron aquellos a continuación, la temperatura de recocimiento usada fue 53°C y el tiempo de 35 extensión fue 1 minuto y 15 segundos.
Cebador directo:
5'-ATGTGCTACAGGCGCGCCGCGGCCGCGAGTTCCAACATGTCTTATTATCC-3' (SEC ID nº 99)
40
Cebador inverso:
5'-TACTGTACCGGCGCGCCATCTGAGCCAAGAGACTCATTCAT-3' (SEC ID nº 100)
[0331] La reacción por PCR se purificó utilizando un equipo de purificación MINELUTE® PCR Purification Kit. La reacción purificada se digirió con Asc I y se sometió a 1% electroforesis en gel de agarosa que usa un tampón TAE. 45 Se escindió una banda de 0,7 kb del gel y se extrajo con agarosa como se ha descrito anteriormente. La banda de 0,7 kb se ligó a pJfyS1879-32-2 (digiriéndola con Asc I y defosforilándola con fosfatasa de intestino de ternero) utilizando un equipo de ligamiento QUICK LIGATION™ Kit. Los clones resultantes se analizaron mediante análisis de secuencias para asegurar la ausencia de errores de PCR y el plásmido resultante se designó pJfyS111 (figura 35) y se usó para eliminar el gen dps1 de Fusarium venenatum. 50
Ejemplo 30: generación de la cepa JfyS1879-57-01 de Δtri5 ΔpyrG ΔamyA ΔalpA Δdps1 de Fusarium venenatum
[0332] Cuando se transformaron los protoplastos de Fusarium venenatum JfyS1763-11-01 con pJfyS111 digerido con Not I y purificado con gel (según el procedimiento descrito en ejemplo 1), se obtuvieron 77 transformantes. De 55 ellos, 48 se transfirieron desde las placas de transformación con palillos estériles a nuevas placas que contenían medio VNO3RLMT suplementado con 125 µg de higromicina B por ml y 10 mM uridina y se incubaron a temperatura ambiente durante 7 días.
[0333] Se produjo biomasa fúngica inoculando 25 ml de medio M400 suplementado con 10 mM uridina con cuatro 60 tapones de agar de 1 cm a partir de transformantes de 7 días de antigüedad generados como se describe en el ejemplo 1. Los cultivos se incubaron durante 3 días a 28°C con agitación a 150 r.p.m. Los tapones de agar se retiraron y los cultivos se filtraron a través de MIRACLOTH™. La biomasa cosechada se congeló con nitrógeno líquido y los micelios se molieron utilizando mortero y mano de mortero.
65
[0334] El ADN genómico se aisló utilizando un equipo DNEASY® Plant Maxi Kit según las instrucciones del

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para producir un polipéptido, que comprende:
    (a) cultivo de un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum en un medio para la producción del 5 polipéptido, donde la cepa mutante comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas; y
    (b) recuperación del polipéptido del medio de cultivo. 10
  2. 2. Método según la reivindicación 1, donde la cepa mutante comprende además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el uno o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. 15
  3. 3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el polipéptido es nativo o foráneo a la cepa de Fusarium venenatum.
  4. 4. Mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum, que comprende un polinucleótido que codifica un 20 polipéptido y pyrG, amyA y alpA, donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
    25
  5. 5. Cepa mutante según la reivindicación 4, que comprende además uno o ambos de los genes tri5 y dps1, donde el uno o ambos de los genes se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricoodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas.
    30
  6. 6. Cepa mutante según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde el polipéptido es nativo o foráneo a la cepa de Fusarium venenatum.
  7. 7. Método para obtener un mutante de una cepa madre de Fusarium venenatum, que comprende:
    35
    (a) modificación de pyrG, amyA y alpA; y
    (b) identificación de una cepa mutante del paso (a) donde pyrG, amyA y alpA se modifican provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de orotidina-5'-monofosfato decarboxilasa, alfa amilasa y proteasa alcalina, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. 40
  8. 8. Método según la reivindicación 7, que comprende además la modificación de uno o ambos de los genes tri5 y dps1, provocando la deficiencia de la cepa mutante en la producción de una o ambas enzimas tricodieno sintasa y ciclohexadepsipéptido sintetasa, respectivamente, en comparación con la cepa madre de Fusarium venenatum cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. 45
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2010039840A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Novozymes, Inc. Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of fusarium venenatum
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FI123425B (fi) 2011-03-31 2013-04-30 Ab Enzymes Oy Proteaasientsyymi ja sen käytöt
WO2013028912A2 (en) 2011-08-24 2013-02-28 Novozymes, Inc. Methods for producing multiple recombinant polypeptides in a filamentous fungal host cell
CN108179139A (zh) 2011-08-24 2018-06-19 诺维信股份有限公司 纤维素分解酶组合物及其用途
EP2748314B1 (en) 2011-08-24 2016-12-28 Novozymes, Inc. Aspergillus fumigatus cellulolytic enzyme compositions and uses thereof
AU2013207165B2 (en) 2012-01-05 2018-10-04 Glykos Finland Oy Protease deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
WO2013174927A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Novartis International Pharmaceutical Limited Production of fucosylated glycoproteins
CN102787148A (zh) * 2012-08-07 2012-11-21 华中科技大学 一种真菌发酵生产恩镰孢菌素类化合物的方法
CN105980552A (zh) 2013-07-10 2016-09-28 诺华股份有限公司 多种蛋白酶缺陷的丝状真菌细胞及其使用方法
EP3074513A1 (en) 2013-11-26 2016-10-05 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
SG11201700446XA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
BR112021010338A2 (pt) 2018-11-28 2021-11-16 Novozymes As Células hospedeiras fúngicas filamentosas modificadas
WO2023094703A1 (en) * 2021-11-29 2023-06-01 Mycofood Us Llc Production of fungal biomass from simple carbon sources
CN114774456A (zh) * 2022-04-19 2022-07-22 中国农业科学院农产品加工研究所 一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4091119B2 (ja) * 1996-09-19 2008-05-28 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規な宿主細胞およびタンパク質生産方法
ATE395424T1 (de) * 1998-05-20 2008-05-15 Novozymes Inc Verfahren zur herstellung von heterologen polypeptiden in trichothecene mangelmutanten filamentlösen pilzen
ES2296606T3 (es) * 1999-01-13 2008-05-01 Novozymes, Inc. Metodos de produccion de polipeptidos en celulas deficientes en ciclohexadepsipeptido.
WO2010039840A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Novozymes, Inc. Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of fusarium venenatum

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