ES2296606T3 - Metodos de produccion de polipeptidos en celulas deficientes en ciclohexadepsipeptido. - Google Patents

Abstract

Ciclohexadepsipéptido sintetasa aislada, seleccionada a partir del grupo que consiste en: (a) una ciclohexadepsipéptido sintetasa con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65% de identidad con el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO: 2; (b) una ciclohexadepsipéptido sintetasa que está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO: o la cadena complementaria de i), o en condiciones de astringencia muy elevadas con (ii) la secuencia de ADNc de la SEC ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de (ii) o (iii); (c) una variante alélica de (a) o (b); y (d) un fragmento de (a), (b), o (c) que posee una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa.

Description

Métodos de producción de polipétidos en células deficientes en ciclohexadepsipéptido.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de producción de polipéptidos heterólogos en células mutantes fúngicas filamentosas deficientes en ciclohexadepsipéptido. La presente invención se refiere también a mutantes de células fúngicas filamentosas y a métodos para obtener las células mutantes. La presente invención se refiere también a ciclohexadepsipéptido sintetasas y a secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificantes de las ciclohexadepsipéptido sintetasas. La presente invención se refiere también a constructos de ácido nucleico, a vectores, y a células huéspedes comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos, así como a métodos de producción de las ciclohexadepsipéptido sintetasas. La presente invención se refiere además a ciclohexadepsipéptidos producidos por las ciclohexadepsipéptido sintetasas.

Descripción de la técnica relacionada

Los depsipéptidos constituyen una clase importante de compuestos relacionados con un péptido derivados de hidroxi- y aminoácidos unidos por enlaces amidas y ésteres. Muchos miembros de esta clase de compuestos son biológicamente activos e incluyen antibióticos, alcaloides, y proteínas (Shemyakin et al., 1969, Journal of Membrane Biology 1: 402-430). Los ejemplos incluyen eniatinas, beauvericina, y bassianolida.

Las eniatinas son fitoxinas de ciclohexadepsipéptido con propiedades ionoforéticas producidas por varias especies de hongos actinomicetos y filamentosos, particularmente cepas de Fusarium. Estas se componen de residuos de ácido D-2-hidroxiisovalérico alternantes y L-aminoácidos o N-metil-L-aminoácidos para formar un estructura cíclica de 18 miembros y pueden contener más de una especie de aminoácido.

La biosíntesis de las eniatinas es catalizada por la eniatina sintetasa, la cual es una gran enzima multifuncional que tiene todas las funciones esenciales para ensamblar eniatinas a partir de sus precursores primarios, es decir, ácido D-2-hidroxiisovalérico, un L-aminoácido de cadena ramificada (por ejemplo, valina, leucina, isoleucina), S-adenosilmetionina, y ATP (Reper et al., 1995, European Journal of Biochemistry 230: 119-126). Los precursores (ácido D-2-hidroxiisovalérico y L-aminoácido de cadena ramificada) son activados como tioésteres. Los residuos aminoácidos de sustrato enlazados de forma covalente son metilados bajo el consumo de S-adenosilmetionina. Se produce después la formación de enlace de péptido y las reacciones de ciclización.

Se supone que las eniatinas tienen una función en casos tóxicos de marchitez durante una infección por fusaria producida con eniatina (Walton, 1990, Biochemistry of Peptide Antibiotics, H. Kleinkauf and H. von Dohren, editors, W. de Gruytre, Berlin, pp. 179- 203), y presenta también propiedades entomopatogénicas (Grove and Pople, 1980, Mycopathologia 70: 103-105).

El gen de eniatina sintetasa (esyn1) ha sido clonado a partir de Fusarium scirpi (Haese et al., 1993, Molecular Microbiology 7: 905-914).

Se han producido mutantes de eniatina sintetasa de Fusarium avenaceum y no producen eniatinas (Herrmann et al., 1996, Molecular Plant-Microbe Interactions 9: 226-232).

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar métodos de producción de polipéptidos heterólogos en células mutantes fúngicas filamentosas deficientes en ciclohexadepsipéptido.

Resumen de la invención

Un método para la producción de un polipéptido heterólogo, comprendiendo:

(I)

el cultivo de un mutante de una célula fúngica filamentosa madre en condiciones apropiadas para la producción del polipéptido heterólogo, donde (i) el mutante comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo, una segunda secuencia de ácidos nucleicos que comprende una modificación del gen de ciclohexadepsipéptido sintetasa implicado en la producción de ciclohexadepsipéptido sintetasa, dicha ciclohexadepsipéptido sintetasa siendo seleccionada del grupo que consiste en a) - d) tal como se define en la reivindicación 1, y (ii) el mutante produce menos de un ciclohexadepsipéptido con respecto a la célula fúngica filamentosa madre cuando se cultiva en las mismas condiciones; y

(II)

el aislamiento del polipéptido heterólogo del medio de cultivo.

La presente invención se refiere también a una ciclohexadepsipéptido sintetasa aislada, seleccionada del grupo consistente en:

(a)

una ciclohexadepsipéptido sintetasa con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65% de identidad con el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO:2;

(b)

una ciclohexadepsipéptido sintetasa que está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:1 o la cadena complementaria de i), o en condiciones de astringencia muy alta con (ii) la secuencia de ADNc de SEC ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de (ii) o (iii);

(c)

una variante alélica de (a) o (b); y

(d)

un fragmento de (a), (b), o (c) que tiene una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa.

La invención se refiere también a constructos de ácido nucleico, vectores, y células huéspedes comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos así como a métodos de producción de las ciclohexadepsipéptido sintetasas.

La presente invención se refiere también a mutantes de células fúngicas filamentosas y métodos para obtener las células mutantes.

La presente invención se refiere además a ciclohexadepsipéptidos producidos por las ciclohexadepsipéptido sintetasas.

Breve descripción de la figura

La figura 1 muestra la secuencia de ácidos nucleicos genómica y la secuencia de aminoácidos deducida de una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Fusarium venenatum ATCC 20334 (SEC ID NOS: 1 y 2, respectivamente).

La figura 2 muestra la construcción de p\DeltaES-amdS.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a métodos para producir un polipéptido heterólogo, comprendiendo: (a) el cultivo de un mutante de una célula fúngica filamentosa madre en condiciones apropiadas para la producción del polipéptido heterólogo, donde (i) el mutante comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo, una segunda secuencia de ácidos nucleicos que comprende una modificación del gen de ciclohexadepsipéptido sintetasa implicado en la producción de ciclohexadepsipéptido sintetasa, dicha ciclohexadepsipéptido sintetasa siendo seleccionada del grupo que consiste en a) - d) como se define en la reivindicación 1, y (ii) el mutante produce menos de un ciclohexadepsipéptido con respecto a la célula fúngica filamentosa madre cuando se cultiva en las mismas condiciones; y (b) el aislamiento del polipéptido heterólogo del medio de cultivo.

El término "ciclohexadepsipéptido" se define aquí como una familia de compuestos relacionados con un péptido compuestos por hidroxi- y aminoácidos enlazados por enlaces amidas y estéres.

El término "producción de un ciclohexadepsipéptido" se define aquí que incluye cualquier etapa implicada en la producción de un ciclohexadepsipéptido incluyendo, pero sin limitarse a éstos, biosíntesis, regulación de biosíntesis, transporte y secreción.

En los métodos de la presente invención, la célula fúngica filamentosa puede ser una célula de tipo salvaje o un mutante de la misma. Además, la célula fúngica filamentosa puede ser una célula que no produzca ningún ciclohexadepsipéptido(s) detectable, pero que contenga los genes codificantes del (de los) ciclohexadepsipéptido(s). Preferiblemente, la célula fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Beauveria, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Polyporus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma.

En una forma de realización preferida, la célula fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae.

En otra forma de realización preferida, la célula fúngica filamentosa es una célula de Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium bactridioides, Fusarium compactum, Fusarium crookwellense (sinónimo de Fusarium cerealis), Fusarium culmorum, Fusarium equiseti, Fusarium gibbosum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium lateritium, Fusarium moniliforme, Fusarium negundi, Fusarium nivale, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium scirpi, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium tricinctum, o Fusarium venenatum.

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En otra forma de realización preferida, la célula fúngica filamentosa es una célula de Gibberella pulicaris, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Myrothecium roridin, Neurospora crassa, Paeciliomyces fumoso-roseus, Penicillium purpurogenum, o Polyporus sulphureus.

En otra forma de realización preferida, la célula fúngica filamentosa es una célula de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

En una forma de realización más preferida, la Célula de Fusarium venenatum es Fusarium venenatum A3/5, que fue depositada originalmente como Fusarium graminearum ATCC 20334 y recientemente reclasificada como Fusarium venenatum por Yoder y Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80 and O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67; así como los equivalentes taxonómicos de Fusarium venenatum independientemente del nombre de la especie por el que se las conoce actualmente. En otra forma de realización preferida, la Célula de Fusarium venenatum es un mutante morfológico de Fusarium venenatum A3/5 o Fusarium venenatum ATCC 20334, como se ha descrito en WO 97/26330.

La célula fúngica filamentosa también puede ser una célula implicada en la producción de productos comprendiendo (partes de) micelio, por ejemplo, en la producción del producto QUORN^{TM} (Marlow Foods, Ltd., Gran Bretaña), que es producido a partir de una cepa de Fusarium.

En los métodos de la presente invención, la célula mutante comprende una segunda secuencia de ácidos nucleicos que comprende una modificación del gen de ciclohexadepsipéptido sintetasa conteniendo (a) una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65% de identidad con el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO:2; (b) una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:1, o la cadena complementaria de (i), o en condiciones de astringencia muy alta con (ii) la secuencia de ADNc de SEC ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de (ii), o (iii); (c) una variante alélica de (a), (b); y (d) un fragmento de (a), (b), o (c) que tiene actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa. En una forma de realización preferida, el gen es un gen de ciclohexadepsipéptido sintetasa de Fusarium venenatum incluyendo la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:1.

La célula mutante fúngica filamentosa deficiente en ciclohexadepsipéptido puede ser construida reduciendo o eliminando la expresión de uno o más de los genes descritos anteriormente usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, inserciones, interrupciones, sustituciones, o deleciones. El gen que debe ser modificado o inactivado puede ser, por ejemplo, la región codificante o una parte de ésta esencial para la actividad, o un elemento regulador del gen requerido para la expresión de la región codificante. Un ejemplo de tal secuencia reguladora o de control puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, es decir, una parte que es suficiente para afectar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. Otras secuencias de control para una posible modificación incluyen, pero no se limitan a éstas, secuencia líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, secuencia de péptido de señal, terminador de transcripción, y activador transcripcional.

La modificación o inactivación del gen puede ser realizada sometiendo la célula madre a una mutagénesis y seleccionando las células mutantes en las que la expresión del gen se ha reducido o eliminado. La mutagénesis, que puede ser específica o aleatoria, puede ser realizada, por ejemplo, mediante el uso de un agente mutagenizante físico o químico adecuado, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado o sometiendo la secuencia de ADN a una mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis puede ser realizada usando cualquier combinación de estos agentes de mutagenización.

Los ejemplos de agente de mutagenización físico o químico adecuados para este propósito incluyen la irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, etilo metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótido.

Cuando se usan estos agentes, la mutagénesis se realiza normalmente mediante la incubación de la célula madre que debe ser mutagenizada en presencia del agente de mutagenización seleccionado en condiciones adecuadas, y el control y/o selección de células mutantes exhibiendo una expresión del gen reducida o ninguna.

La modificación o inactivación del gen puede ser realizada por introducción, sustitución o eliminación de uno o más nucleótidos en el gen o un elemento regulador requerido para la trascripción o traslación de éste. Por ejemplo, los nucleótidos pueden ser insertados o eliminados para inducir la introducción de un codón de detención, la retirada del codón de terminación, o un cambio en el marco de lectura abierto. Esta modificación o inactivación puede ser realizada por mutagénesis sitio-dirigida o mutagénesis generada por PCR según los métodos conocidos en la técnica. Aunque, en principio, la modificación puede ser realizada in vivo, es decir, directamente en la célula de expresión del gen que debe ser modificado, se prefiere que la modificación sea realizada in vitro como en el ejemplo más abajo.

Un ejemplo de una forma adecuada de eliminación o de reducción de la producción de un ciclohexadepsipéptido por una célula fúngica filamentosa seleccionada está basado en técnicas de sustitución del gen, deleción del gen, o interrupción del gen. Por ejemplo, en el método de interrupción del gen, una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente al gen endógeno o fragmento de gen en cuestión es mutagenizada in vitro para producir una secuencia de ácidos nucleicos defectuosa que es transformada después dentro de la célula madre para producir un gen defectuoso. Mediante una recombinación homóloga, la secuencia de ácidos nucleicos defectuosa reemplaza el gen endógeno o fragmento de gen. Puede ser deseable que el gen defectuoso o fragmento de gen codifique también un marcador que puede ser usado para la selección de transformantes en los que la secuencia de ácidos nucleicos ha sido modificada o destruida. En una forma de realización particularmente preferida, el gen es interrumpido con un marcador seleccionable como aquellos descritos aquí.

De manera alternativa, la modificación o inactivación del gen puede ser realizada mediante técnicas antisentido establecidas usando una secuencia nucleótida complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos del gen. Más específicamente, la expresión del gen por una célula fúngica filamentosa puede ser reducida o eliminada mediante la introducción de una secuencia nucleótida complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos del gen que puede ser transcrita en la célula y que es capaz de hibridar el ARNm producido en la célula. En condiciones que permiten la hibridación de la secuencia nucleótida antisentido complementaria en el ARNm, la cantidad de proteína trasladada es en consecuencia reducida o eliminada.

Se puede obtener una secuencia de ácidos nucleicos complementaria u homóloga de la secuencia de ácidos nucléicos de un gen implicado en la producción de un ciclohexadepsipéptido a partir de otras fuentes microbianas que producen ciclohexadepsipéptidos.

Las fuentes preferidas para un gen de eniatina sintetasa incluyendo una secuencia de ácidos nucleicos complementaria u homóloga a la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: de Fusarium venenatum incluyen otras cepas de Fusarium. Una fuente preferida es Fusarium scirpi (Haese et al., 1993, supra).

Las fuentes preferidas para los genes de de D-hidroxiisovalerato hidrogenasa que pueden ser complementarias u homólogas a la secuencia de ácidos nucleicos de los genes correspondientes a una célula fúngica filamentosa incluyen otras cepas de Fusarium. Una fuente más preferida para el gen de D-hidroxiisovalerato dehidrogenasa es Fusarium sambucinum (Lee y Zocher, 1996, supra). Además, las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser originadas por la célula fúngica filamentosa.

El nivel de ciclohexadepsipéptidos producidos por una célula fúngica filamentosa mutante de la presente invención puede ser determinada usando el método de Visconti et al., 1992, Journal of Agriculture and Food Chemistry 40: 1076-1082. De manera específica, un ml de caldo de cultivo sin células de Fusarium venenatum es extraído dos veces con 2,0 ml de etilacetato. Los extractos orgánicos combinados son evaporados hasta secarse bajo un flujo de gas nitrógeno y redisueltos en 0,5 ml de hexano. Las muestras de un microlitro son analizadas usando un sistema Hewlett-Packard 6890 GC/Series MSD funcionando en el modo choque de electrones (EI). Las muestras son inyectadas en columna y separadas usando una columna capilar DB-5 (30 m x 0,25 mm, película de 0,25 \mum) empleando un programa de temperatura con un calentamiento de 120 a 300°C a una velocidad de 15°C/min. Por ejemplo, las eniatinas A, A1, B, B1, B2 y B3 son identificadas por proporciones m/z para el ión (M^{+} + H) de 682, 668, 640, 654, 626 y 612, respectivamente.

La célula fúngica filamentosa mutante produce preferiblemente al menos aproximadamente 25% menos, más preferiblemente al menos aproximadamente 50% menos, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 75% menos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% menos, y aún más preferiblemente ningún ciclohexadepsipéptido con respecto a la célula fúngica filamentosa madre correspondiente cuando se cultiva en condiciones idénticas. Las células madres y mutantes pueden ser comparadas con respecto a la producción de un ciclohexadepsipéptido en condiciones apropiadas para la producción de un polipéptido de interés o en condiciones apropiadas para la producción de un ciclohexadepsipéptido.

La célula fúngica filamentosa mutante puede contener también modificaciones de una o más terceras secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas que pueden perjudicar la producción, recuperación, y/o aplicación del polipéptido heterólogo de interés. La modificación reduce o elimina la expresión de una o más terceras secuencias de ácidos nucleicos produciendo una célula mutante que puede producir más polipéptido heterólogo que la célula mutante sin la modificación de la tercera secuencia de ácidos nucleicos cuando se cultiva en las mismas condiciones. La tercera secuencia de ácidos nucleicos puede codificar cualquier proteína o enzima. Por ejemplo, la enzima puede ser una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fosfolipasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, o xilanasa. La tercera secuencia de ácidos nucleicos codifica preferiblemente una enzima proteolítica, por ejemplo, una aminopeptidasa, carboxipeptidasa o endoproteasa.

La célula fúngica filamentosa mutante es cultivada en un medio nutritivo adecuado para la producción de un polipéptido heterólogo de interés mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en frasco de agitación, en fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por Zotes, alimentadas por lotes, o en estado sólido) en laboratorio o fermentadores industriales realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permitan la expresión y/o el aislamiento del polipéptido heterólogo. El cultivo se realiza en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, mediante el uso de procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o pueden ser preparados según las composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos de Colección Americana de Cultivos Tipo). El polipéptido heterólogo segregado puede ser recuperado directamente del medio.

El polipéptido heterólogo puede ser detectado usando métodos conocidos en la técnica que son específicos al polipéptido. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, la desaparición de un sustrato enzimático, o SDS-PAGE. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido heterólogo. Los procedimientos para determinar una actividad enzimática son conocidos en la técnica para muchas enzimas.

El polipéptido heterólogo obtenido puede ser aislado por métodos conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser aislado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a éstos, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación. El polipéptido aislado puede ser después adicionalmente purificado por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a éstos, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, de preparación por isoelectroenfoque), solubilidad diferencial (por ejemplo precipitación por sulfato de amonio), o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

El polipéptido puede ser cualquier polipéptido heterólogo de la célula fúngica filamentosa mutante. El término "polipéptido" no se refiere en la presente a una longitud específica del producto codificado y, por consiguiente, incluye péptidos, oligopéptidos, y proteínas. El término "polipéptido heterólogo" está definido aquí en forma de polipéptido no nativo de la célula fúngica, una proteína nativa en la que se han aplicado modificaciones para alterar la secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión es cuantitativamente alterada como resultado de una manipulación de la célula fúngica por técnicas de ADN recombinante. La célula mutante fúngica puede contener unas o más copias de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido. En una forma de realización preferida, el polipéptido heterólogo es un polipéptido segregado extracelularmente.

Preferiblemente, el polipéptido heterólogo es una hormona, variante de hormona, enzima, receptor o parte de éste, anticuerpo o parte de éste o indicador. En una forma de realización más preferida, el polipéptido heterólogo es una oxidorreductasa, transferasa, hidrolasa, liasa, isomerasa o ligasa. En una forma de realización aún más preferida, el polipéptido heterólogo es una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fosfolipasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.

La secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo que puede ser expresado en una célula fúngica filamentosa puede ser obtenida de cualquier fuente procariótica, eucariótica u otra. En los objetivos de la presente invención, los términos "obtenido de" como se utiliza aquí en relación con una fuente determinada deberían indicar que el polipéptido es producido por la fuente o por una célula en la que se ha insertado un gen a partir de la fuente.

En los métodos de la presente invención, la célula fúngica filamentosa mutante puede ser usada también para la producción recombinante de polipéptidos que son nativos de la célula. Los polipéptidos nativos pueden ser producidos de forma recombinada, por ejemplo, mediante la disposición de un gen codificante del polipéptido controlado por un promotor diferente para aumentar la expresión del polipéptido, para acelerar la exportación de un polipéptido nativo de interés fuera de la célula mediante el uso de una secuencia de señal, y para incrementar el número de copia de un gen codificante del polipéptido producido habitualmente por la célula. La presente invención incluye también, en el ámbito del término "polipéptido heterólogo", tal producción recombinante de polipéptidos homólogos para que dicha expresión implique el uso de elementos genéticos no nativos de la célula, o el uso de elementos nativos que han sido manipulados para funcionar de un modo inhabitual en la célula huésped.

Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento de ADN genómico, la preparación de ADNc, o una combinación de éstas. La clonación de la secuencia de ácidos nucleicos de tal ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Los procesos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento deseado de ácido nucleico comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula vector, y la incorporación del vector recombinante dentro de la célula mutante fúngica donde unas copias múltiples o clones de la secuencia de ácidos nucleicos serán replicados. La secuencia de ácidos nucleicos puede tener un origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinaciones de éstos.

En los métodos de la presente invención, también se pueden incluir polipéptidos heterólogos fusionados o polipéptidos híbridos en los que se fusiona otro polipéptido en el N-terminal o C-terminal del polipéptido o fragmento de éstos. Un polipéptido fusionado es producido por fusión de una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de ésta) codificante de un polipéptido para una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de ésta) codificante de otro polipéptido. Las técnicas para la producción de polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen ligar las secuencias de codificación codificantes de los polipéptidos para que éstas formen parte del marco y la expresión del polipéptido fusionado sea controlada por el(los) mismo(s) promotor(es) y terminador. Los polipéptidos híbridos pueden comprender una combinación de secuencias polipéptidas parciales o completas obtenidas a partir de al menos dos polipéptidos diferentes donde uno o más pueden ser heterólogos a la célula fúngica filamentosa mutante.

Una secuencia de ácidos nucleicos aislada codificante de un polipéptido heterólogo de interés puede ser manipulada en varias formas para proporcionar una expresión del polipéptido. Se entenderá por expresión cualquier fase implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero sin limitarse a éstas, transcripción, modificación postranscripcional, traslación, modificación postraslacional y secreción. La manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos antes de su inserción dentro de un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para la modificación de secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de clonación son muy conocidas en la técnica.

"Constructo de ácido nucléico" se define aquí como una molécula de ácido nucleico, sea mono o bicatenaria, aislada de un gen de origen natural o modificado para contener segmentos de ácido nucléico que son combinados y superpuestos en una forma que, de otra manera, no existiría en la naturaleza. El término constructo de ácido nucléico es sinónimo del término cassette de expresión cuando el constructo de ácido nucléico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante. El término "secuencia codificante" tal como se define aquí representa una secuencia transcrita en ARNm y trasladada a un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante son generalmente determinados por el codón de inicio ATG situado justo arriba del marco de lectura abierto en el extremo 5' del ARNm y una secuencia terminadora de transcripción situada justo debajo del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, sin limitarse a éstas, combinaciones genómicas, de ADNc, ARN, semisintéticas sintéticas, recombinantes, o cualquier combinación de éstas.

El término "secuencias de control" como se define aquí incluye todos los componentes necesarios o apropiados para la expresión de un polipéptido heterólogo. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a secuencia líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal, y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación transcripcional y traslacional. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlaces con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten ligar las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo. El término "enlazado operativamente" se define aquí como una configuración en la que una secuencia de control está dispuesta de forma apropiada en una posición con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de ADN para que la secuencia de control dirija la producción de un polipéptido heterólogo.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos reconocida por una célula fúngica filamentosa para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido heterólogo. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre una actividad transcripcional en la célula fúngica filamentosa incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede ser obtenido de genes codificantes de polipéptidos extracelulares o intracelulares sean homólogos o heterólogos a la célula.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico en los métodos de la presente invención son promotores obtenidos de genes codificantes de amilasa de Aspergillus oryzae TAKA, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus Niger o Aspergillus awamori (glaA), lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, Acetamidasa de Aspergillus nidulans, Acetamidasa de Aspergillus oryzae (amdS), proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (Patente U.S. n°. 4,288,627), y promotores mutantes, truncados e híbridos de éstos. Los promotores particularmente preferidos son el NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes codificantes de alfa-amilasa neutra de Aspergillus Niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), glucoamilasa, y promotores de amilasa TAKA.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula fúngica filamentosa para terminar la transcripción. La secuencia terminadora es enlazada de forma operativa al terminal 3' de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo. Cualquier terminador funcional en la célula fúngica filamentosa puede ser usado en la presente invención.

Se obtienen terminadores preferidos a partir de los genes codificantes de amilasa de Aspergillus oryzae TAKA, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintetasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus Niger, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

La secuencia de control puede ser también una secuencia líder adecuada, una región no trasladada de un ARNm importante para la traslación por la célula fúngica filamentosa. La secuencia líder es enlazada de forma operativa al terminal 5' de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo. Cualquier secuencia líder funcional en la célula fúngica filamentosa puede ser usada en la presente invención.

Unas secuencias líder preferidas son obtenidas de genes codificantes de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada de forma operativa al terminal 3' de la secuencia de ácidos nucleicos y, una vez transcrita, es reconocida por una célula fúngica filamentosa como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación funcional en la célula fúngica filamentosa puede ser usada en la presente invención.

Se pueden obtener secuencias de poliadenilación preferidas de los genes de codificación de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus Niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans y alfa glucosidasa de Aspergillus Niger.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido de señal que codifique una secuencia de aminoácidos enlazada al terminal amino del polipéptido heterólogo y dirija el polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos puede contener de manera intrínseca una región codificante del péptido de señal enlazada naturalmente en un marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido segregado. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido de señal que sea extraña a la secuencia codificante. La región codificante de péptido de señal extraña puede ser necesaria cuando la secuencia codificante no contenga naturalmente una región codificante del péptido de señal. De manera alternativa, la región codificante del péptido de señal extraña puede reemplazar simplemente la región codificante del péptido de señal natural para aumentar la secreción del polipéptido. La región codificante de péptido de señal puede ser obtenida de una glucoamilasa o un gen amilasa de una especie Aspergillus, o un gen de lipasa o de proteinasa de una especie Rhizomucor. No obstante, cualquier región codificante del péptido de señal que dirija el polipéptido heterólogo expresado a la vía secretora de una célula fúngica filamentosa puede ser usada en la presente invención.

Una región codificante eficaz del péptido de señal es la región codificante del péptido de señal obtenida de los genes codificantes de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus Niger, gen de proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y celulasa de Humicola lanuginosa.

La secuencia de control puede ser también una región codificante de un propéptido que codifique una secuencia de aminoácidos situada en el terminal amino de un polipéptido. El polipéptido obtenido es conocido en forma de proenzima o propolipéptido (o de zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo maduro por seccionamiento catalítico o autocatalítico del propéptido a partir del propolipéptido. La región codificante del propéptido puede ser obtenida de los genes codificantes de proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Cuando el péptido de señal y las regiones propéptidas están presentes en el terminal amino de un polipéptido, la región propéptida se sitúa junto al terminal amino del polipéptido y la región del péptido de señal se situa junto al terminal amino de la región propéptida.

Los constructos de ácido nucleico pueden comprender también una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen uno o más factores apropiados para dirigir la expresión del polipéptido heterólogo, por ejemplo, un activador transcripcional (por ejemplo, un factor de transacción), chaperona, y proteasa de tratamiento. Cualquier factor funcional en una célula fúngica filamentosa puede ser usado en la presente invención. Los ácidos nucleicos codificantes de uno o más de estos factores no están necesariamente dispuestos en tándem con la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido heterólogo con respecto al crecimiento de la célula fúngica filamentosa. Ejemplos de sistemas reguladores son los que hacen que la expresión del gen se active o no en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. El promotor de alfa-amilasa TAKA, promotor de glucoamilasa Aspergillus niger, y promotor de glucoamilasa Aspergillus oryzae pueden ser usados como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten una amplificación génica, por ejemplo, los genes de metalotioneina que son ampliados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo será enlazada operativamente a la secuencia reguladora.

Las distintas secuencias de ácidos nucleicos y de control descritas anteriormente pueden ser unidas para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción adecuados para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo en tales sitios. De manera alternativa, la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo puede ser expresada por inserción de la secuencia o de un constructo de ácido nucléico comprendiendo la secuencia en un vector apropiado de expresión. Con la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación es situada en el vector para que la secuencia de codificación sea enlazada de forma operativa con las secuencias de control apropiadas para la expresión, y posiblemente la secreción.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo un plásmido o un virus) que pueda ser sometido de manera adecuada a procesos de ADN recombinante y que pueda provocar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula fúngica filamentosa en la que debe ser introducido el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe en forma de entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de una replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o una cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar una autorreplicación. De manera alternativa, el vector puede ser un vector que, cuando se introduce en la célula fúngica filamentosa, se integre en el genoma y sea replicado junto con
el(los) cromosoma(s) en el que se ha integrado. El sistema de vector puede ser un vector o plásmido único o dos o más vectores o plásmidos que contengan juntos el ADN total que debe ser introducido en el genoma de la célula fúngica filamentosa o un transposón.

El vector contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células fúngicas filamentosas transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos y similares. Un marcador seleccionable para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica puede ser seleccionado del grupo incluyendo, pero sin limitarse a éstos, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de éstos. Se prefiere para el uso en una célula fúngica filamentosa los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

El vector contiene preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en una genoma de célula fúngica filamentosa o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma de la célula.

"Introducción" significa la introducción de un vector comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos en una célula fúngica filamentosa tal que el vector se mantenga en forma de integrante cromosómico o vector extracromosómico autoreplicante. La integración es considerada en general como una ventaja ya que la secuencia de ácidos nucleicos tiende más bien a mantenerse estable en la célula. La integración del vector en el cromosoma ocurre por recombinación homóloga, recombinación no homóloga o trasposición.

La introducción de un vector de expresión en una célula fúngica filamentosa puede implicar un proceso consistente en la formación de protoplasto, transformación de protoplastos y regeneración de la pared celular de una forma conocida en sí. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus están descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Un método adecuado para transformar una especie Fusarium ha sido descrito por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 o en WO 96/00787.

Para la integración en el genoma de una célula fúngica filamentosa, el vector puede depender de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo o de cualquier otro elemento del vector para una integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De manera alternativa, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula fúngica filamentosa. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales permiten que el vector sea integrado en el genoma en un(os) lugar(es) preciso(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 1,500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1,500 pares de bases, y más preferiblemente 800 a 1,500 pares de bases, que son altamente homólogos con la secuencia de destino correspondiente para aumentar la probabilidad de una recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia de destino en el genoma de la célula fúngica filamentosa. Además, los elementos integrantes pueden ser secuencias de ácidos nucleicos no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula por recombinación no homóloga.

Para una replicación autónoma, el vector también puede comprender un origen de replicación que permita que el vector replique de forma autónoma en la célula fúngica filamentosa en cuestión.

Se entenderá que los métodos de la presente invención no se limitan a un orden particular para obtener la célula fúngica filamentosa mutante. La modificación de un gen implicado en la producción de un ciclohexadepsipéptido puede ser introducida en la célula madre en cualquier etapa en la construcción de la célula para la producción de un polipéptido heterólogo. Es preferible formar el mutante fúngico filamentoso deficiente en ciclohexadepsipéptido usando los métodos de la presente invención antes de introducir un gen codificante de un polipéptido heterólogo.

Los procedimientos usados para enlazar los elementos descritos aquí para construir los vectores de expresión recombinantes son conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

La presente invención se refiere también a un método para obtener la célula mutante según la invención, comprendiendo:

(a)

introducir en una célula fúngica filamentosa madre una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo y una segunda secuencia de ácidos nucleicos comprendiendo una modificación del gen de ciclohexadepsipéptido sintetasa implicado en la producción de ciclohexadepsipéptido sintetasa; y

(b)

identificar el mutante de la etapa (a) donde el mutante produce menos ciclohexadepsipéptido que la célula fúngica filamentosa madre de la célula mutante cuando se cultiva en las mismas condiciones.

La presente invención se refiere también a mutantes deficientes en ciclohexadepsipéptido de células fúngicas filamentosas para la producción de un polipéptido heterólogo comprendiendo (i) una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo, y (ii) un gen de ciclohexadepsipéptido sintetasa implicado en la producción de ciclohexadepsipéptido sintetasa que está modificada, donde dicha ciclohexadepsipéptido sintetasa es seleccionada del grupo consistente en a) - d) tal como se define en la reivindicación 1, donde el mutante produce menos de un ciclohexadepsipéptido con respecto a la célula fúngica filamentosa madre de la célula mutante cuando se cultiva en las mismas condiciones.

La presente invención se refiere también a las ciclohexadepsipéptido sintetasas aisladas. El término "actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa" se define aquí como una actividad sintetasa que cataliza la producción de un ciclohexadepsipéptido de ácido D-2-hidroxiisovalérico, un L-aminoácido de cadena ramificada (por ejemplo valina, leucina, isoleucina), S-adenosilmethionina, y ATP. Para los objetivos de la presente invención, la actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa es determinada midiendo la producción de un ciclohexadepsipéptido según el procedimiento de Zocher et al., 1982, Biochemistry 21: 43-48. Específicamente, la ciclohexadepsipéptido sintetasa es incubada con 1 mM de valina, 0,2 mM de S-adenosilmethionina, 0,2 mM de ácido D-2-hidroxiisovalérico, 4 mM de ATP, y 4 mM de Mg(OAc)_{2} en un volumen total de 100 \mul durante 10 minutos a 37°C en 50 mM de MOPS pH 7.0. La cantidad de ciclohexadepsipéptido es determinada como se describe aquí en base al método de Visconti et al., 1992, supra. Una unidad de actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa está definida como 1,0 \mumol de ciclohexadepsipéptido producido por minuto a 37°C, pH 7.0.

En una forma de realización, la presente invención se refiere a las ciclohexadepsipéptido sintetasas aisladas con una secuencia de aminoácidos que posee un grado de identidad con respecto al polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO:2 de al menos aproximadamente el 65%, preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 97%, con una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa (a continuación "ciclohexadepsipéptido sintetasas homólogas"). En una forma de realización preferida, las ciclohexadepsipéptido sintetasas homólogas tienen una secuencia de aminoácidos con una diferencia de cinco aminoácidos, preferiblemente cuatro aminoácidos, más preferiblemente tres aminoácidos, incluso más preferiblemente dos aminoácidos, y más preferiblemente un aminoácido del polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO:2. Para los objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es determinado por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando el software LASERGENE^{TM} MEGALIGN^{TM} (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiple: Penalización de espacio de 10, y penalización de longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineamiento por pares eran Ktuple=1, penalización por espacio=3, ventanas=5, y diagonales=5.

Preferiblemente, las ciclohexadepsipéptido sintetasas de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de ésta con una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa. En una forma de realización más preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. En otra forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención comprende el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO:2, o una variante alélica de ésta; o un fragmento de ésta con una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa. En otra forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención comprende el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO:2. En otra forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2 o en una variante alélica de ésta; o un fragmento de ésta con una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa. En otra forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. En otra forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa consiste en el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO:2 o en una variante alélica de ésta; o un fragmento de ésta con una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa. En otra forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa consiste en el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO:2.

Un fragmento de la SEC ID NO:2 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos eliminados del término amino y/o carboxilo de esta secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, un fragmento contiene al menos 2854 residuos aminoácidos, más preferiblemente al menos 2954 residuos aminoácidos, y más preferiblemente al menos 3054 residuos aminoácidos.

Una variante alélica indica cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de una mutación, y puede producir un polimorfismo entre poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio del polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que poseen secuencias de aminoácidos alterados. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Las secuencias de aminoácidos de las ciclohexadepsipéptido sintetasas homólogas pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o del polipéptido maduro de ésta mediante una inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por diferentes residuos de aminoácidos. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de naturaleza inferior, es decir son sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan de manera significativa al plegamiento y/o a la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina amino terminal; un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilite la purificación mediante un cambio de carga de red u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de enlace.

Unos ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran en el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina y histidina), aminoácidos acidicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y pequeños aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Unas sustituciones de aminoácido que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R. L. Hill, 1979, En, The Proteins, Academic Press, New York. Los cambios que ocurren más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly así como éstos a la inversa.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a las ciclohexadepsipéptido sintetasas codificadas por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridizan en condiciones de astringencia media, incluso más preferiblemente condiciones de astringencia alta, y más preferiblemente condiciones de astringencia muy alta con una sonda de ácidos nucleicos que se hibridiza en las mismas condiciones con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO:1, o la cadena complementaria de (i), o en condiciones de astringencia muy altas con (ii) la secuencia de ADNc de la SEC ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de (ii), o (iii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor, New York). La subsecuencia de la SEC ID NO:1 puede comprender al menos 100 nucleótidos o preferiblemente al menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento polipeptídico que tenga una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa. Las ciclohexadepsipéptido sintetasas también pueden ser variantes alélicas o fragmentos que tengan una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa.

La secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de ésta, así como la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o un fragmento de ésta, puede ser usada para diseñar una sonda de ácidos nucleicos para identificar y clonar el ADN codificante de ciclohexadepsipéptido sintetasas de cepas de distintos géneros o especies según unos métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas pueden ser usadas para una hibridación con el ADNc genómico o ADNc del género o especie de interés, siguiendo los procesos estándar de transferencia de Southern, para identificar y aislar el gen correspondiente en éste. Este tipo de sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, aunque deberían tener de una longitud de al menos 15, preferiblemente de al menos 25, y más preferiblemente de al menos 35 nucleótidos. Unas sondas más largas pueden ser usadas también. Ambas sondas de ADN y ARN pueden ser usadas. Las sondas son marcadas normalmente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S, biotina, o avidina). Tales sondas se incluyen en la presente
invención.

De esta manera, un ADN genómico o biblioteca de ADNc preparados a partir de estos otros organismos pueden ser seleccionados para el ADN que se hibridiza con las sondas descritas anteriormente y que codifica una ciclohexadepsipéptido sintetasa. El ADN genómico u otro ADN de tales organismos pueden estar separados por electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, o por otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado pueden ser transferidos hacia e inmovilizados en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo a la SEC ID NO: o a una subsecuencia de ésta, el material portador es usado en un Southern blot. Para los objetivos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácidos nucléicos hibridiza una sonda de ácido nucleico correspondiente a (i) la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la SEC ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una cadena complementaria de (i), (ii), o (iii) en condiciones de astringencia baja a muy alta. Las moléculas con las que la sonda de ácidos nucleicos se hibridiza en tales condiciones son detectadas mediante el uso de una película radiográfica.

En una forma de realización preferida, la sonda de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucléicos que codifica la ciclohexadepsipéptido sintetasa de la SEC ID NO:2, o una subsecuencia de ésta. En otra forma de realización preferida, la sonda de ácidos nucleicos es la SEC ID NO: 1. En otra forma de realización preferida, la sonda de ácidos nucleicos es la región de codificación del polipéptido maduro contenida en la SEC ID NO: 1. En otra forma de realización preferida, la sonda de ácidos nucleicos representa las secuencias de ácidos nucleicos contenidas en el plásmido pZL-ESA, contenido en Escherichia coli NRRL B-30068, en el plásmido pZL-ESB, contenido en Escherichia coli NRRL B-30069, y en el plásmido pZL-ESC, contenido en Escherichia coli NRRL B-30070, donde las secuencias de ácidos nucleicos codifican la ciclohexadepsipéptido sintetasa de la SEC ID NO:2. En otra forma de realización preferida, la sonda de ácidos nucleicos es la secuencia de ácidos nucléicos de codificación de la ciclohexadepsipéptido sintetasa madura de la SEC ID NO:2 contenida en el plásmido pZL-ESA, contenido en Escherichia coli NRRL B-30068, en el plásmido pZL-ESB, contenido en Escherichia coli NRRL B-30069, y en el plásmido pZL-ESC, contenido en Escherichia coli NRRL B-30070.

Para las sondas largas de al menos una longitud de 100 nucleótidos, unas condiciones de astringencia baja a muy alta son definidas en forma de prehibridación e hibridación a 45°C en 5X de SSPE, 0,3% de SDS, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y sea el 25% de formamida para astringencias baja y muy baja, el 35% de formamida para astringencias media y media-alta, o sea el 50% de formamida para astringencias alta y muy alta, después de procesos estándar de transferencia de Southern.

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces cada vez durante 15 minutos usando 2 X SSC, 0,2% SDS preferiblemente al menos a 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50°C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55°C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60°C (astringencia media-alta), incluso más preferiblemente al menos a 65°C (astringencia alta), y más preferiblemente al menos a 70°C (astringencia muy alta).

Para sondas cortas que poseen una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, las condiciones de astringencia se definen en forma de prehibridación, hibridación, y post-hibridación de lavado a 5°C a 10°C inferiores a la T_{m} calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0,9 M de NaCl, 0,09 M tris-HCl pH 7.6, 6 mM de EDTA, 0,5% NP-40, 1X de solución de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por ml después de los procesos estándar de transferencia de Southern.

Para sondas cortas que poseen una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, el material portador es lavado una vez en 6X de SCC más 0,1% de SDS durante 15 minutos y dos veces durante 15 minutos cada vez usando 6X de SSC a 5°C hasta 10°C por debajo de la T_{m} calculada.

Las ciclohexadepsipéptido sintetasas aisladas de la presente invención tienen al menos el 20%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 60%, incluso más preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 90%, y más preferiblemente al menos el 100% de la actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa del polipéptido maduro de la SEC ID NO:2.

En una forma de realización preferida, una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención es obtenida a partir de una cepa de Fusarium venenatum, y más preferiblemente de Fusarium venenatum ATCC 20334 o una cepa mutante de ésta, por ejemplo, el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2.

Tal y como está definido aquí, una ciclohexadepsipéptido sintetasa "aislada" es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo, siendo puro al menos aproximadamente al 20%, preferiblemente al menos aproximadamente al 40%, más preferiblemente aproximadamente al 60%, incluso más preferiblemente aproximadamente al 80%, más preferiblemente aproximadamente al 90%, e incluso más preferiblemente aproximadamente al 95%, según está determinado por SDS-PAGE.

Una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención puede ser obtenida a partir de cualquier género de microorganismos.

Una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención puede ser una ciclohexadepsipéptido sintetasa bacteriana. Por ejemplo, la ciclohexadepsipéptido sintetasa puede ser una ciclohexadepsipéptido sintetasa bacteriana gram positiva tal como una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Bacillus, por ejemplo, una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus thuringiensis; o una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Streptomyces, por ejemplo, una Streptomyces lividans o ciclohexadepsipéptido sintetasa de Streptomyces murinus; o ciclohexadepsipéptido sintetasa bacteriana gram negativa, por ejemplo, una ciclohexadepsipéptido sintetasa de E. coli o de Pseudomonas sp.

Una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención puede ser una ciclohexadepsipéptido sintetasa fúngica, y más preferiblemente una ciclohexadepsipéptido sintetasa de levadura tal como una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Candida, Kluyveromices, Pichia, Saccharomyces, Schizosacaromices, o Yarrowia; o más preferiblemente una ciclohexadepsipéptido sintetasa fúngica filamentosa tal como una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma.

En una forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa es una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.

En otra forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa es una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

En otra forma de realización preferida, la ciclohexadepsipéptido sintetasa es una ciclohexadepsipéptido sintetasa de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum.

La presente invención se refiere también a secuencias de ácidos nucleicos que codifican una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención. En una forma de realización preferida, la secuencia de ácidos nucléicos está expuesta en la SEC ID NO: 1. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de ácidos nucléicos representa las secuencias contenidas en el plásmido pZL-ESA, contenido en Escherichia coli NRRL B-30068, en el plásmido pZL-ESB, contenido en Escherichia coli NRRL B-30069, y en el plásmido pZL-ESC, contenido en Escherichia coli NRRL B-30070. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de ácidos nucléicos representa las secuencias de codificación del polipéptido maduro contenidas en la SEC ID NO:2 contenida en el plásmido pZL-ESA, contenido en Escherichia coli NRRL B-30068, en el plásmido pZL-ESB, contenido en Escherichia coli NRRL B-30069, y en el plásmido pZL-ESC, contenido en Escherichia coli NRRL B-30070. En otra forma de realización preferida, la secuencia de ácidos nucléicos es la región de codificación del polipéptido maduro contenida en la SEC ID NO: 1. La presente invención incluye también secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o el polipéptido maduro de ésta, que difiere de la SEC ID NO: 1 con respecto a la degeneración del código genético. La presente invención se refiere también a subsecuencias de la SEC ID NO: 1 que codifican fragmentos de la SEC ID NO: 2, que presentan una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa.

Una subsecuencia de la SEC ID NO: 1 es una secuencia de ácidos nucléicos incluida en la SEC ID NO:1 con la excepción de que uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o 3' han sido delecionados. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos 8562 nucleótidos, más preferiblemente al menos 8862 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 9162 nucleótidos.

La presente invención se refiere también a secuencias de ácidos nucleicos mutantes comprendiendo al menos una mutación en la secuencia de codificación de polipéptido maduro de SEC ID NO:1, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que consiste en el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO: 2.

Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una ciclohexadepsipéptido sintetasa pueden incluir el aislamiento del ADN genómico, la preparación de ADNc, o una combinación de éstas, como se ha descrito en la presente. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención de tal ADN genómico puede ser realizada, por ejemplo, por PCR u otros procesos de amplificación de ácidos nucleicos tal como una reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en una secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). La secuencia de ácidos nucleicos puede ser clonada a partir de una cepa de Fusarium, u otro organismo o uno relacionado y por consiguiente, por ejemplo, ser una variante alélica o de especies de la región codificante del polipéptido de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, de ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de éstos.

Los términos "secuencia aislada de ácidos nucleicos" como se utilizan aquí se refieren a una secuencia de ácidos nucleicos que esencialmente no incluye ninguna secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, siendo pura al menos aproximadamente al 20%, preferiblemente al menos aproximadamente al 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente al 60%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente al 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente al 90% tal como se ha determinado por electroforesis en agarosa.

Las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de un polipéptido activo de la invención pueden tener un grado de homología con respecto a la región de codificación del polipéptido maduro contenida en la SEC ID NO: 1 de al menos aproximadamente un 65%, preferiblemente aproximadamente un 70%, preferiblemente aproximadamente un 80%, más preferiblemente aproximadamente un 90%, incluso más preferiblemente aproximadamente un 95%, y más preferiblemente aproximadamente un 97% de homología, que codifica un polipéptido activo. Para los objetivos de la presente invención, el grado de homología entre dos secuencias de ácidos nucleicos es determinado por el método Wilbur-Lipman (Wilbur y Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) usando el software LASERGENE^{TM} MEGALIGN^{TM} (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiple: Penalización de espacio de 10, y penalización de longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineamiento por pares fueron Ktuple=3, penalización de espacio=3, y ventanas=20.

Una modificación de una secuencia de ácidos nucleicos de codificación de una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similar a la ciclohexadepsipéptido sintetasa. Los términos "sustantialmente similar" a la ciclohexadepsipéptido sintetasa se refiere a formas enzimáticas producidas de forma no natural. Estos polipéptidos pueden ser diferentes en alguna forma modificada de la 'ciclohexadepsipéptido sintetasa aislada de su fuente nativa, por ejemplo, en variantes de la ciclohexadepsipéptido sintetasa que son diferentes en cuanto a su actividad específica, termostabilidad, pH óptimo, o similar. La secuencia de la variante puede ser construida en base a la secuencia de ácidos nucleicos presentada como la parte codificante del polipéptido de la SEC ID NO: 1, por ejemplo, una subsecuencia de la misma y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no producen otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos, sino que corresponden al uso de codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden producir una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase, por ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Los expertos en la técnica entenderán claramente que estas sustituciones puedan ser realizadas al exterior de las regiones fundamentales para la función de la molécula y sigan produciendo un polipéptido activo. Los residuos aminoácidos esenciales para la actividad la ciclohexadepsipéptido sintetasa codificada por la secuencia de ácidos nucleicos aislada de la invención, y en consecuencia preferiblemente no expuesta a una sustitución, pueden ser identificados según unos procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis sitio-dirigida o la mutagénesis de barrido de alanina (véase, por ej., Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta técnica, se han introducido mutaciones en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa para identificar residuos aminoácidos esenciales para la actividad de la molécula. Unos sitios de interacción sustrato-enzima pueden ser determinados también por análisis de la estructura tridimensional tal como se determina por tales técnicas en forma de análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (véase, por ejemplo., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309:
59-64).

La presente invención se refiere también a secuencias de ácidos nucleicos codificantes de una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención, que se hibridizan en condiciones de astringencia media, incluso más preferiblemente en condiciones de astringencia alta, y más preferiblemente en condiciones de astringencia muy alta tal como se ha definido en la presente con una sonda de ácidos nucleicos que se hibridiza en las mismas condiciones con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO:1, o la cadena complementaria de (i) o en condiciones de astringencia muy alta con (ii) la secuencia de ADNc de la SEC ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de (ii), o (iii); o variantes alélicas de las mismas (Sambrook et al.,1989, supra), tal como se ha definido en la presente.

La presente invención se refiere también a métodos de producción de una secuencia de ácidos nucleicos mutante, comprendiendo la introducción de al menos una mutación en la secuencia de codificación del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de ésta, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que consiste en el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO: 2 o un fragmento de éste con una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa.

La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser realizada por mutagénesis sitio-dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. El procedimiento es particularmente útil y utiliza un vector de ADN bicatenario superenrollado con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos conteniendo la mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario a las cadenas opuestas del vector, se extienden durante un ciclo de temperatura por medio de la Pfu ADN polimerasa. Mediante la incorporación de los cebadores, se genera un plásmido mutado comprendiendo nicks alternados. Después de la variación de la temperatura, el producto es tratado con DpnI específico al ADN metilado e hemimetilado para digerir el molde de ADN parental y seleccionar el ADN sintetizado contenedor de la mutación. Otros procedimientos conocidos pueden ser usados también en la técnica.

La presente invención se refiere también a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, y células huésped conteniendo la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO: 1, subsecuencias u homólogos de éstas, para la expresión de las secuencias. Los constructos y vectores pueden ser construidos como se describe en este caso. La célula huésped puede ser cualquier célula adecuada para la expresión de la secuencia de ácidos
nucleicos.

La célula huésped puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula fúngica. Unas células mamíferas útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámsters bebés (BHK), células COS, o cualquier número de otras líneas celulares imortalizadas disponibles, por ejemplo, de The American Type Culture Collection.

En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica. En una forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula de levadura o una célula fúngica filamentosa.

En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de levadura es una célula Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.

En una forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolipocladium, o Trichoderma.

En una forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium crookwellense (sinónima de Fusarium cerealis), Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium solani, Fusarium sporotrichioides, Fusarium suiphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, (por ejemplo, Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.), Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophilum, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Las células fúngicas pueden ser transformadas mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular según una manera conocida per se. Unos procesos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus y Fusarium están descritos aquí. La levadura puede ser transformada usando los procesos descritos por Becker y Guarente, En Abelson, J. N. y Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

La presente invención se refiere también a métodos para producir una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una célula de Fusarium sp., la cual en su forma de tipo salvaje es capaz de producir la ciclohexadepsipéptido sintetasa, para producir un sobrenadante comprendiendo la ciclohexadepsipéptido sintetasa; y (b) la recuperación de la ciclohexadepsipéptido sintetasa. Preferiblemente, la célula de Fusarium es Fusarium Venenatum.

La presente invención se refiere también a métodos para producir una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped en condiciones apropiadas para la producción de la ciclohexadepsipéptido sintetasa; y (b) la recuperación de la ciclohexadepsipéptido sintetasa.

En los métodos de producción de la presente invención, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción de la ciclohexadepsipéptido sintetasa mediante el uso de métodos conocidos en la técnica tal y como se ha descrito en la presente. La ciclohexadepsipéptido sintetasa puede ser detectada usando métodos conocidos en la técnica específicos para la enzima (véase, por ejemplo., Visconti et al., 1992, supra). La ciclohexadepsipéptido sintetasa obtenida puede ser recuperada y purificada mediante unos métodos conocidos en la técnica tal y como se ha descrito en la presente.

La producción de un ciclohexadepsipéptido puede ser realizada con la sintetasa aislada o por fermentación de una célula conteniendo el gen codificante de la sintetasa (véase, por ejemplo, Madry et al., 1983, European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 17: 75-79). La célula puede ser una célula de tipo salvaje o una célula recombinante. Los ciclohexadepsipéptidos pueden ser aislados y purificados mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n°. 5,656,464; Visconti et al., 1992,
supra.

En una forma de realización preferida, el método para producir un ciclohexadepsipéptido, comprende: (a) la reacción de una ciclohexadepsipéptido sintetasa de la presente invención con ácido D-2-hidroxiisovalérico, un ácido L-amino de cadena ramificada, S-adenosilmethionina, y ATP; y (b) el aislamiento del ciclohexadepsipéptido a partir de la reacción.

En otra forma de realización preferida, el método para producir un ciclohexadepsipéptido, comprende: (a) el cultivo de una célula en condiciones adecuadas para la producción del ciclohexadepsipéptido, donde la célula comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de (i) una ciclohexadepsipéptido sintetasa con una secuencia de aminoácidos que posee al menos el 65% de identidad con el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO: 2. (ii) una ciclohexadepsipéptido sintetasa que está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO: 1 o su cadena complementaria, o en condiciones de astringencia muy altas con una subsecuencia de SEC ID NO: 1 de al menos 100 nucleótidos; (iii) una variante alélica de (a) o (b); o (iv) un fragmento de (a), (b), o (c) que posee una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa; y (b) el aislamiento del ciclohexadepsipéptido de la reacción.

La presente invención está descrita también por los ejemplos siguientes que no se deben interpretar de forma limitada en el ámbito de aplicación de la invención.

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Ejemplos Cepas

Una cepa ATCC 20334 de Fusarium venenatum fue usada como la fuente de ADN genómico para estos experimentos. Unas bibliotecas de ADN genómico fueron construidas usando el sistema de clonación de \lambdaZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD) con E. coli Y1090ZL como huésped para la deposición y la purificación del bacteriófago recombinante y E. coli DH10Bzip para la escisión de derivados pZL1 recombinantes. Fusarium torulosum R-5690 (Fusarium Research Center, Penn State University, State College, PA) y Aspergillus Niger Bo-1 (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) fueron usadas como fuentes de ADN de control para experimentos de hibridación. La cepa LyMC1A de Fusarium venenatum sin tri5 (WO 99/60137) fue usada como el receptor para experimentos de transformación. La cepa TOP10 de Escherichia coli (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y cepas DH5-alfa de E. coli (Gibco-BRL Life Technologies, Bethesda, MD) fueron usadas para la construcción de vector y la propagación del plásmido de rutina.

Medios

El medio de esporulación de RA estaba compuesto por 50 g por litro de ácido succinico (sal de disodio), 20 ml de 50X de sales de Vogels, 12,1 g de NaNO_{3}, y 1 g de glucosa.

50X de sales de Vogels estaban compuestas por 125 g de citrato sódico por litro, 250 g de KH_{2}PO_{4}, 10 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 g de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (predisuelto en 20 ml de agua), y 5 ml de 200X de elementos de traza de Vogels. (Cada ingrediente fue disuelto por completo antes de añadir el siguiente). Filtro esterilizado.

200 X de elementos de traza de Vogels estaban compuestos por 100 ml de 5 g de ácido cítrico\cdot1H_{2} 0,5 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1 g de Fe(NH_{4})_{2} (SO_{4})_{2}\cdot6H_{2}O, 0,25 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,05 g de MnSO_{4}\cdot1H_{2}O, 0,05 g de H_{3}BO_{3}, y 0,05 g de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O.

El agar de fluoroacetamida (FA) estaba compuesto por 12 g de acetato sódico por litro, 2 g de cloruro sódico, 0,5 g de MgSO_{4}, 3 g de KH_{2}PO_{4}, 0,3 g de úrea, 2 g de fluoroacetamida, 1 ml de sales de Vogels y 15 g de agar Noble (pH 6.1).

El medio Cove estaba compuesto por 342,3 g de sacarosa por litro, 20 ml de 50X de solución salina Cove, 10 ml de acetamida 1M, 10 ml de CsCl 1,5 M, y 25 g de agar Noble.

50X de sales de Cove incluían 26 g de KCl por litro, 26 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 76 g de KH_{2}PO_{4}, y 50 ml de 20X de elementos traza de Cove.

20X de elementos traza de Cove estaban compuestos por litro de 0,04 g de Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O, 0,4 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 1,2 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,7 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 0,8 g de Na_{2}MoO_{2}\cdot2H_{2}O, y 10 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O.

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Ejemplo 1

Extracción de ADN genómico de Fusarium venenatum, Fusarium torulosum, y Aspergillus niger

Fusarium venenatum, Fusarium torulosum, y Aspergillus niger crecieron cada una durante 24-36 horas a 28°C y 150 rpm en 25 ml de medio de YEG compuesto por litro de 5 g de extracto de levadura y 20 g de glucosa. Los micelios fueron recuperados después por filtración a través de Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) y lavados una vez con 25 ml de 10 mM de tampón Tris-1 mM EDTA (TE). El exceso de tampón fue drenado a partir de los micelios que fueron posteriormente congelados en nitrógeno líquido. Los micelios congelados fueron molidos en un polvo fino en un molinillo de café eléctrico, y cada polvo fue añadido a 20 ml de tampón TE y 5 ml de 20% en p/v de dodecilsulfato de sodio (SDS) en un tubo centrífugo desechable de plástico. Las mezclas fueron invertidas cuidadosamente varias veces para asegurar la mezcla, y extraídas dos veces con un volumen idéntico de fenol:cloroformo: isoamil alcohol (25:24:1 v/v/v). El acetato sódico (solución 3 M) fue añadido para formar una concentración final de 0,3 M y los ácidos nucleicos fueron precipitados con 2,5 volúmenes de etanol helado. Los tubos fueron centrifugados a 15,000 x g durante 30 minutos y los gránulos fueron secados con aire seco durante 30 minutos antes de su resuspensión en 0,5 ml de tampón TE. La ribonucleasa sin DNasa fue añadida a una concentración de 100 \mug/ml y las mezclas fueron incubadas a 37°C durante 30 minutos. La proteinasa K (200 \mug/ml) fue añadida después y las mezclas fueron incubadas durante otra hora a 37°C. Finalmente, las mezclas fueron extraídas dos veces con fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1 v/v/v) antes de la precipitación del ADN con acetato sódico y etanol según unos procesos estándar. Los gránulos de ADN fueron secados al vacío, resuspendidos en un tampón TE, y almacenados a 4°C.

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Ejemplo 2

Experimentos de hibridación

Las preparaciones de ADN genómico descritas en el ejemplo 1 fueron evaluadas por la presencia de secuencias génicas de ciclohexadepsipéptido sintetasa mediante el uso de una hibridación de Southern. Unas partes alícuotas de ADN fueron digeridas con BamHI o BamHI más XbaI y fraccionadas por electroforesis en gel de agarosa. El ADN en el gel fue manchado en un filtro de membrana Hybond N+^{TM} (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) según el método de Davis et al. (1980, Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), y probado con un fragmento radiomarcado codificante de la parte 5' del gen esyn1 de Fusarium torulosum (obtenido por Dr. Tomás Hohn, USDA Peoria, IL) en condiciones de hibridación de astringencia baja, media, y alta a 45°C tal y como se ha descrito en la presente. El fragmento de la sonda específico de la ciclohexadepsipéptido sintetasa de Fusarium torulosum fue radiomarcado por translación de nicks (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) con
\alpha[^{32}P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL), desnaturalizado por adición de NaOH a una concentración final de 0,1 M, y añadido al tampón de hibridación en una actividad de aproximadamente 1 X 10^{6} cpm por ml. Después de la hibridación, los filtros fueron lavados una vez en 0,2X de SSPE con 0,1% de SDS a 45°C seguido de dos lavados en 0,2X de SSPE (sin SDS) a la misma temperatura. Los filtros fueron secados en toallas de papel durante 15 minutos, posteriormente envueltos en Saran-wrap^{TM} y expuestos a una película radiográfica durante toda la noche a -70°C con filtros intensificadores (Kodak, Rochester NY).

Los análisis de hibridación de Southern mostraron que las secuencias de ADN específicas para la ciclohexadepsipéptido sintetasa podían ser detectadas en el genoma de Fusarium venenatum con la sonda de esyn1 de Fusarium torulosum en condiciones de astringencia baja y media. El ADN de control positivo de Fusarium torulosum mostraba señales de hibridación importantes en todas las condiciones, y el ADN de control negativo de Aspergillus Niger no consiguió hibridizarse en las todas las condiciones probadas. Estos resultados indicaron que Fusarium venenatum contenía secuencias de ADN genómico homólogas al gen de la eniatina sintetasa de Fusarium torulosum.

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Ejemplo 3

Construcción y selección de una biblioteca de ADN genómico

Unas bibliotecas genómicas de Fusarium Venenatum fueron construidas en \lambdaZipLox según las instrucciones del fabricante (Life Technologies, Gaithersburg, MD). El ADN genómico de Fusarium venenatum fue parcialmente digerido con Tsp509I y dividido por tamaños en geles de agarosa al 1%. Unos fragmentos de ADN que variaban en la gama de tamaños de 3-7 kb fueron cortados y eluidos a partir de las bandas de gel de agarosa usando reactivos Prep-a-Gene (BioRad, Hercules, CA). Los fragmentos de ADN eluidos fueron ligados con brazos del vector \lambdaZipLox seccionados con EcoRI y desfosforilados (Life Technologies, Gaithersburg, MD), y las mezclas de ligación fueron envasadas usando extractos de embalaje comercial (Stratagene, la Jolla, CA). Las bibliotecas de ADN empaquetadas fueron depositadas y amplificadas en células Y1090ZL de E. coli.

Aproximadamente 50.000 placas de la biblioteca fueron seleccionadas por hibridación en placas (Davis et al., 1980, supra) con el fragmento de sonda radiomarcada por el gen esyn1 de Fusarium torulosum usando las condiciones de astringencia baja descritas en el ejemplo 2. Unas placas, con señales de hibridación, fueron purificadas dos veces en células de E. coli Y1090ZL, y los clones individuales fueron posteriormente cortados a partir del vector \lambdaZipLox como un derivado de pZL1 (D'Alessio et al., 1992, Focus®14: 7). El cromosoma "dispuesto" para obtener secuencias de ADN contiguas fue formado mediante el uso de sondas de Fusarium Venenatum homólogas con una astringencia alta.

Se identificaron cuatro placas que se hibridaban en gran medida la sonda de gen de Fusarium torulosum esyn1, y cada uno de los clones potenciales fue posteriormente eliminado del vector \lambdaZipLox en forma de derivado de pZL1 (D'Alessio et al., 1992, supra). El ADN plásmido fue aislado de los clones pasando por células DH10B de E. coli usando métodos estándares. Los tamaños de los insertos clonados fueron determinados por electroforesis en gel de agarosa. El mayor inserto incluía un segmento de ADN de aproximadamente 3 kb. El clon fue designado E. coli DH 10B pZL-ESA.

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Ejemplo 4

Clonación y análisis de un gen de la ciclohexadepsipéptido sintetasa de Fusarium Venenatum

Una secuenciación de ADN del segmento de ADN de aproximadamente 3 kb fue realizada con un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosystems Modelo 377 XL usando la química de tinción terminal. Unas secuencias contiguas fueron generadas usando una estrategia de inserción de transposón (Primer Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). La región clonada entera fue ordenada con una redundancia media de 6,9.

Una secuenciación nucleótida reveló que el segmento de 3 kb contenía un marco de lectura abierto codificante de al menos 900 aminoácidos. No obstante, este fragmento (llamado Fragmento A, pZL-ESA) no codificó el producto genético entero. En consecuencia, la biblioteca fue reseleccionada usando una sonda comprendiendo la parte 3' del Fragmento A (aprox. 1 kb del fragmento HindIII). Diferentes clones fueron posteriormente identificados y analizados por cartografía de restricción. El mayor de estos clones secundarios contenía un ADN genómico insertado de aproximadamente 4,6 kb (denominado Fragmento B, pZL-ESB). El clon se denominó E. coli DH10B
pZL-ESB.

El examen de la secuencia nucleótida del Fragmento B amplió el marco de lectura abierto del Fragmento A de los aminoácidos 777 hasta 2311. No obstante, esta secuencia no alcanzó el codón de terminación del marco de lectura abierto, necesitando así el aislamiento de un tercer segmento genómico. El tercer clon genómico fue aislado por recribado de la biblioteca genómica con una sonda amplificada por PCR derivada del Fragmento B. Dos cebadores de PCR mostrados a continuación fueron usados para amplificar un segmento de sonda de 586 bp usado para cribar la biblioteca.

(SEC ID NO:3)5'-dAATTGATTCGCTTGAAAGTCGAT-3'

(SEC ID NO:4)5'-dCTTGAGAGTTACGTTGGTCTTGAAC-3'

La reacción de amplificación (100 \mul) contenía los componentes siguientes: 0,2 \mug de ADN de pZL-ESB, 48,4 pmol del cebador directo, 48,4 pmol del cebador inverso, 1 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 1 x un tampón Taq polimerasa, y 2,5 U de Taq polimerasa (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ). La reacción fue incubada en un variador Ericomp Twin Block System Easy Cycler programado para 1 ciclo a 95°C durante 5 minutos seguido por 30 ciclos cada uno a 95°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos.

La reacción fue sometida a una electroforesis en gel de agarosa, y se obtuvo el producto previsto de 586 pares de bases. La reacción se efectuó sobre un gel preparatorio, una banda de gel comprendiendo el producto deseado fue cortada, y el ADN fue aislado del gel usando un Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA).

De siete clones que fueron identificados con esta sonda, el mayor (Fragmento C, pZL-ESC) contenía un inserto de 5,5 kb. Un análisis de secuencia de ADN posterior reveló que el Fragmento C codificaba los aminoácidos 1617 hasta 3129, un codón de detención potencial, y 1553 pares de bases de ADN flanqueante 3'. El clon era denominado DH10B pZL-ESC. La secuencia de ADN entera del gen de la ciclohexadepsipéptido sintetasa fue ensamblada a partir de los tres clones de superposición (Fragmentos A, B, y C). Una estrategia de inserción del transposón permitía una secuenciación rápida de alta redundancia.

La secuencia de ADN completa y la secuencia de aminoácidos deducida están mostradas en la figura 1. La secuencia de ADN del gen de la ciclohexadepsipéptido sintetasa (SEC ID NO: 1) fue determinada en una redundancia promedio de 6,9. El gen de la ciclohexadepsipéptido sintetasa contenía una longitud del marco de lectura abierto de 9387 pares de bases sin intrones, codificante de un polipéptido de 3129 aminoácidos (PM = 346,852).

La secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 2) del producto genético de la ciclohexadepsipéptido sintetasa compartía aproximadamente el 59% de identidad a la eniatina sintetasa de Fusarium scirpi (Haese et al., 1993, Mol. Microbiol. 7: 905-914; secuencia de ADN catalogada en la base de datos EMBL con el número de acceso Z18755). La identidad porcentual fue determinada por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando el software LASERGENE^{TM} MEGALIGN^{TM} (DNASTAR Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiple: Penalización de espacio de 10 y penalización de longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineamiento por pares fueron Ktuple=1, penalización de espacio=3, ventanas=5, y
diagonales=5.

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Ejemplo 5

Construcción p\DeltaES-amdS

La construcción de los vectores p\DeltaES-amdS1 y p\DeltaES-amdS2 de deleción dps1 está mostrada en la figura 2. En resumen, un segmento de ADN de 0,2 kb comprendiendo una parte de la región codificante de dps1 fue eliminada del plásmido pZL-ESA (designado como fragmento A) por digestión con endonucleasas de restricción Stul y Nrul. Ambas enzimas generaban fragmentos de ADN de extremos romos. El vector pESA digerido fue tratado con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) para prevenir la autoligación. Finalmente, un fragmento codificante de 3,2 kb del gen amdS de Aspergillus nidulans (con secuencias de repetición flanqueantes derivadas del gen pyrG de Aspergillus oryzae) fue obtenido por digestión de pJRoy47 (WO 99/60137) con SmaI y PmeI. Este fragmento amdS fue posteriormente ligado al fragmento de vector pZL-ESA descrito anteriormente para generar los plásmidos de deleción p\DeltaES-amdS1 y p\DeltaES-amdS2 (que difieren sólo en la orientación del segmento del gen amdS).

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Ejemplo 6

Transformación de LyMCIA de Fusarium Venenatum y selección preliminar para deleciones del gen dps1

El plásmido p\DeltaES-amdSl fue digerido con SpeI, y el fragmento de deleción de 5,7 kb (comprendiendo partes del gen dps1 de Fusarium venenatum con el gen amdS de Aspergillus nidulans y repeticiones de sustitución de 0,2 kb de región de codificación del dps1) fue posteriormente extirpado y purificado para su uso en experimentos de transformación. La preparación y transformación de protoplastos LyMC1A de Fusarium Venenatum se realizó según el método de Royer, 1995, Bio/Technology 13: 1479-1483.

\newpage

Protoplastos LyMCIA de Fusarium Venenatum fueron transformados con el fragmento SpeI \DeltaES-amdS de 5,7 kb con una selección en placas COVE. Quince transformantes fueron obtenidos y purificados en una única espora. El ADN fue extraído de los transformantes purificados a partir de una única espora generada con el fragmento SpeI \DeltaES-amdS, así como a partir de LyMC 1A de Fusarium venenatum, usando el mini kit Qiagen DNeasi Plant (Qiagen, Chatsworth, CA) (con una incubación lítica de 2 horas en el sitio de 10 minutos recomendados según el protocolo del fabricante). Uno de los dos microgramos de cada ADN fue digerido durante siete horas con XhoI o SpeI (10 U/\mug de ADN en reacciones de 30 \mul). Los digeridos fueron sometidos a una electroforesis en geles de agarosa al 1% en un tampón de TAE, y los ADNs fueron transferidos a Hybond N^{+} en 0,4 N de NaOH. Los borrones fueron entrecruzados por UV y probados como se describe a continuación.

Las sondas fueron preparadas mediante el uso del Prime-It Labeling Kit (Stratagene, la Jolla, CA) y \alpha[^{32}P]-dCTP. Después del marcado, las sondas fueron separadas del marcador no incorporado mediante el uso de una columna G 50 TE Midi (5' a 3', Boulder, CO).

Los borrones fueron prehibridizados a 65°C en un tampón Rapid Hyb (Amersham, Arlington Heights, IL) durante 45 minutos. Unas sondas desnaturalizadas fueron añadidas a la solución Rapid Hyb y las hibridaciones fueron formadas durante toda la noche a 65°C. Después de la hibridación, los borrones fueron lavados una vez a temperatura ambiente en 2X de SSC durante 5 minutos y en 0,2X de SSC, 0,1% de SDS a 65°C durante 5 minutos dos veces. Los borrones lavados fueron lavados en 2X de SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Unos borrones de Southern de ADN genómico digerido con XhoI y SpeI fueron probados dos veces. En primer lugar, estos fueron probados con un fragmento de 800 pares de bases de NsiI/SpeI de p\DeltaES-amdS1. Cuatro de los quince transformantes tenían la banda de 5,2 kb (ADN digerido con XhoI) y la banda de 5,7 kb (ADN digerido con SpeI) previstas para una sustitución de genes cuando se probó con el fragmento NsiI/SpeI de 800 pares de bases. La mayor parte de los otros transformantes tenían la banda 2,2 kb (ADN digerido con XhoI) o las bandas de tipo salvaje 2,7 kb (ADN digerido con SpeI), y bandas adicionales, correspondiendo más probablemente a una integración ectópica del ADN transfomante.

En segundo lugar, los mismos borrones de Southern fueron probados con pDSY176 linearizado con HindIII, un plásmido comprendiendo la parte StuI/NruI 0,2 kb de la región de codificación de dps1. El pDSY176 fue construido como indicado a continuación: pZL-ESA fue digerido con StuI/NruI, y el fragmento de 0,2 kb fue aislado por electroforesis preparatoria. El fragmento aislado fue clonado en pZERO-Blunt (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante para producir pDSY176. Unos análisis de hibridación usando esta segunda sonda (pDSY176) confirmaban que ninguna de las cuatro cepas putativas delecionadas (Fusarium venenatum \DeltaES 4, 6, 8, y 10) contenía la región 0,2 kb del gen dps 1 que ha sido delecionada.

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Ejemplo 7

Eliminación del gen amdS

Dos de los transformantes confirmados como suprimidos, \DeltaES4A y \DeltaESEA, fueron esporulados en 500 ml de medio RA, en frascos Fembach de 2 litros. Estos fueron inoculados con 12 tapones miceliales cortados de placas Cove e incubados a 24°C, a 150 rpm durante 53 horas. Después de este tiempo, unas esporas fueron recogidas por medio de un Miracloth estéril (Calbiochem, San Diego, CA) y centrifugadas durante 30 minutos a 7.000 rpm en un rotor Sorval GS3 y lavadas tres veces con agua estéril. Esporas recientes recogidas fueron colocadas en placas a 10^{4}, 10^{5} y 10^{6} por placa (cinco placas para cada concentración) de FA. Las colonias que crecieron en estas placas fueron recogidas en placas FA y Cove.

Varias colonias fueron obtenidas en placas FA (principalmente a partir de placas sembradas con 10^{5} y 10^{6} esporas/placa) las cuales, en subcultivo, crecieron adecuadamente en FA pero sólo escasamente en Cove. Treinta y dos colonias derivadas de \DeltaES4A (denominadas Fusarium venenatum WTY700-3-4) y 128 colonias derivadas de \DeltaES8A (denominadas Fusarium venenatum WTY700-3-8) tienen todas un fenotipo con menos amdS.

El ADN fue extraído de cinco aislados de Fusarium Venenatum WTY700-3-4 (WTY700-3-4a hasta 4e) y diez cepas de Fusarium venenatum WTY700-3-8 (WTY700-3-8a hasta 8j) así como LyMC1A, \DeltaES4A y \DeltaES8A usando el Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (con una incubación lítica de 2 horas en lugar de 10 min recomendada por el protocolo del fabricante). Un microgramo de cada ADN fue digerido durante toda la noche con XhoI y SpeI (20 U/\mug de ADN en reacciones de 50 \mul). Los digeridos fueron concentrados en 10 \mul y formados en geles de agarosa al 1% en TBE. Los ADNs fueron transferidos a membranas Hybond N+ según el protocolo del fabricante, y fueron posteriormente probados con las sondas descritas en el Ejemplo 6.

Un análisis de hibridación de ADNs genómicos extraídos de estas cepas (usando el fragmento de 800 bp NsiI-SpeI y pDSY176 digerido con \DeltaES-amdS1 y HindIII (que contiene la parte de 200 bp de StuI-NruI del marco de lectura abierto de dps1) reveló que ninguno de los aislados de WTY700-3-4 había perdido el gen amdS, pero el 50% (5/10) de los aislados de Fusarium venenatum WTY700-3-8 mostraron un modelo de bandas uniforme con la eliminación del gen amdS. Un análisis de hibridación, en consecuencia, confirmó que las Fusarium venenatum WTY700-3-8a, b, c, d, y e fueron delecionados para la parte de 200 bp de StuI/NruI del marco de lectura abierto de dpsl. Como se espera para una deleción, una señal de hibridación fue observada usando la sonda pDSY176 descrita anteriormente para la cepa parental de Fusarium venenatum LyMCIA pero no para cualquiera de las cinco cepas de Fusarium venenatum WTY700-3-8a-e.

Depósito de materias biológicas

Las materias biológicas siguientes han sido depositadas según las condiciones del tratado de Budapest con The Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL), Peoria, Illinois, y se les dió los siguientes números de acceso:

100

Las cepas han sido depositadas en condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos esté disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente a una determinada por el Comisiario de Patentes y Marcas Registradas que será denominada bajo 37 C.F.R. \NAK 1.14 y 35 U.S.C. \NAK 122. Los depósitos representan substancialmente cultivos puros de las cepas depositadas. Los depósitos están disponibles según está requerido por las leyes de patentes extranjeras en países donde se han depositado equivalentes de la presente aplicación, o de la misma familia. No obstante, se entenderá que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para la práctica de la presente invención como excepción de derechos de patente concedida por la acción gubernamental.

La invención descrita y reivindicada aquí no debe estar limitada en su alcance por las formas de realización específicas descritas aquí, ya que estas formas de realización están provistas en forma de ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se prevé que cualquier forma de realización equivalente forme parte del alcance de esta invención. De esta manera, varias modificaciones de la invención añadidas a las que se han mostrado y descrito aquí serán evidentes para los expertos en la técnica de la descripción anterior. Estas modificaciones también están destinadas a formar parte del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, predominará la presente descripción incluidas las definiciones.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Documentos de patente citados en la descripción

- WO 9726330 A [0023]

- US 5656464 A [0123]

- US 4288627 A [0052]

- WO 9960137 A [0127] [0149]

- WO 9533836 A [0061]

- WO 5778204 A, 2000 [0163]

- EP 238023 A [0070]

- WO 09229862 A, 1999 [0163]

- WO 9600787 A [0070]

Documentos no patentados citados en la descripción

\bulletSHEMYAKIN et al. Journal of Membrane Biology, 1969, vol. 1, 402-430 [0002]

\bulletREPER et al. European Journal of Biochemistry, 1995, vol. 230, 119.126 [0004]

\bulletWALTON. Biochemistry of Peptide Antibiotics. W. de Gruytre, 1990, 179-203 [0005]

\bulletGROVE; POPLE. Mycopathologia, 1980, vol. 70, 103-105 [0005]

\bulletHAESE et al. Molecular Microbiology, 1993, vol. 7, 905-914 [0006]

\bulletHERRMANN et al. Molecular Plant-Microbe Interactions, 1996, vol. 9, 226-232 [0007]

\bulletYODER; CHRISTIANSON. Fungal Genetics and Biology, 1998, vol. 23, 62-80 [0023]

\bulletO'DONNELL et al. Fungal Genetics and Biology, 1998, vol. 23, 57-67 [0023]

\bulletVISCONTI et al. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1992, vol. 40, 1076-1082 [0036]

\bullet Protein Purification. VCH Publishers, 1989 [0041]

\bulletINNIS et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Application. Academic Press, 1990 [0046]

\bulletYELTON et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1984, vol. 81, 1470-1474 [0070]

\bulletMALARDIER et al. Gene, 1989, vol. 78, 147-156 [0070]

\bullet J. SAMBROOK; E. F. FRITSCH; T. MANIATUS. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, 1989 [0074] [0084]

\bulletZOCHER et al. Biochemistry, 1982, vol. 21, 43-48 [0077]

\bulletHIGGINS. CABIOS, 1989, vol. 5, 151-153 [0078] [0148]

\bullet H. NEURATH; R. L. HILL. The Proteins. Academic Press, 1979 [0083]

\bulletBOLTON; MCCARTHY. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1962, vol. 48, 1390 [0090]

\bulletWILBUR; LIPMAN. Proceedings of the National Academy of Science USA, 1983, vol. 80, 726-730 [0106]

\bulletFORD et al. Protein Expression and Purification, 1991, vol. 2, 95-107 [0107]

\bulletCUNNINGHAM; WELLS. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0108]

\bullet DE VOS et al. Science, 1992, vol. 255, 306-312 [0108]

\bulletSMITH et al. Journal of Molecular Biology, 1992, vol. 224, 899-904 [0108]

\bulletWLODAVER et al. FEBS Letters, 1992, vol. 309, 59-64 [0108]

\bullet Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. BECKER; GUARENTE. Methods in Enzymology. Academic Press, Inc, vol. 194, 182-187 [0119]

\bulletITO et al. Journal of Bacteriology, 1983, vol. 153, 163 [0119]

\bulletHINNEN et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1978, vol. 75, 1920 [0119]

\bulletMADRY et al. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 1983, vol. 17, 75-79 [0123]

\bulletDAVIS et al. Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering. Cold Spring Harbor Press, 1980 [0136]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 [0136]

\bulletHAESE et al. Mol. Microbiol, 1993, vol. 7, 905-914 [0148]

\bulletROYER. Bio/Technology, 1995, vol. 13, 1479-1483 [0150]

<110> Randy M. Berka

\hskip1cm

Michael W. Rey

\hskip1cm

Wendy T. Yoder

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<120> Métodos para producir polipéptidos en células carentes de ciclohexadepsipéptido

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<130> 5778.204-WO

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<140> Por asignar

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<141> 2000-01-13

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<150> 09/229,862

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<151> 1999-01-13

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<160> 4

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<170> FastSEC para versión Windows 3.0

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<210> 1

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<211> 11212

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<212> ADN

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<213> Fusarium

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<400> 1

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1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 3129

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<212> PRT

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<213> Fusarium

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<400> 2

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5

6

7

8

9

10

11

12

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<210> 3

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Fusarium

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

aattgattcg cttgaaagtc gat

\hfill

23

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<210> 4

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Fusarium

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

cttgagagtt acgttggtct tgaac

\hfill

25

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Claims (20)

1. Ciclohexadepsipéptido sintetasa aislada, seleccionada a partir del grupo que consiste en:

(a)

una ciclohexadepsipéptido sintetasa con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65% de identidad con el polipéptido maduro contenido en la SEC ID NO: 2;

(b)

una ciclohexadepsipéptido sintetasa que está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO: o la cadena complementaria de i), o en condiciones de astringencia muy elevadas con (ii) la secuencia de ADNc de la SEC ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de (ii) o (iii);

(c)

una variante alélica de (a) o (b); y

(d)

un fragmento de (a), (b), o (c) que posee una actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa.

2. Secuencia de ácidos nucléicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la ciclohexadepsipéptido sintetasa según la reivindicación 1.

3. Constructo de ácidos nucléicos comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 2 enlazada de forma operativa a una o más secuencias de control que dirigen la producción de ciclohexadepsipéptido sintetasa en un huésped de expresión adecuado.

4. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 3.

5. Célula huésped recombinante aislada comprendiendo el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 3.

6. Método para la producción de un polipéptido heterólogo, comprendiendo:

(I) el cultivo de un mutante de una célula fúngica filamentosa parental bajo condiciones apropiadas para la producción del polipéptido heterólogo, donde (i) el mutante comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo, y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que comprende una modificación del gen de la ciclohexadepsipéptido sintetasa implicado en la producción de la ciclohexadepsipéptido sintetasa, dicha ciclohexadepsipéptido sintetasa siendo seleccionada a partir del grupo comprendiendo a) - d) tal como se ha definido en la reivindicación 1, y (ii) el mutante produce menos ciclohexadepsipéptido que la célula fúngica filamentosa parental cuando se cultiva bajo las mismas condiciones; y

(II) el aislamiento del polipéptido heterólogo del medio de cultivo.

7. Método según la reivindicación 6, donde la célula mutante produce al menos aproximadamente un 25% menos ciclohexadepsipéptido que la célula fúngica filamentosa parental cuando se cultiva bajo condiciones idénticas.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde el polipéptido heterólogo es una hormona, variante de hormona, enzima, receptor o parte de éste, anticuerpo o parte de éste, o indicador.

9. Mutante deficiente en ciclohexadepsipéptido de una célula fúngica filamentosa, comprendiendo (i) una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo, y (ii) un gen de ciclohexadepsipéptido sintetasa implicado en la producción de ciclohexadepsipéptido sintetasa modificada, donde dicha ciclohexadepsipéptido sintetasa está seleccionada a partir del grupo consistiendo en a) - d) tal como se ha definido en la reivindicación 1, donde el mutante produce menos ciclohexadepsipéptido que la célula fúngica filamentosa parental de la célula mutante cuando se cultiva en las mismas condiciones.

10. Célula mutante según la reivindicación 9, donde la célula es una célula de Fusarium.

11. Célula mutante según la reivindicación 10, donde la célula de Fusarium es una Fusarium venenatum.

12. Célula mutante según la reivindicación 11, donde la célula de Fusarium venenatum es Fusarium Venenatum ATCC 20334.

13. Método para obtener la célula mutante según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, comprendiendo:

(a)

la introducción en una célula fúngica filamentosa parental de una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo y una segunda secuencia de ácidos nucleicos comprendiendo una modificación del gen de la ciclohexadepsipéptido sintetasa implicado en la producción de ciclohexadepsipéptido sintetasa; y

(b)

la identificación del mutante de la etapa (a), donde el mutante produce menos ciclohexadepsipéptido que la célula fúngica filamentosa parental de la célula mutante cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.

14. Método para la producción de una secuencia de ácidos nucleicos mutante, comprendiendo (a) la introducción de al menos una mutación al interior de la secuencia codificante de la ciclohexadepsipéptido sintetasa madura de la SEC ID NO: 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica una ciclohexadepsipéptido sintetasa consistiendo en el polipéptido maduro contenido dentro de la SEC ID NO-2; y (b) la recuperación de la secuencia de ácidos nucléicos mutante.

15. Método de producción de una ciclohexadepsipéptido sintetasa, comprendiendo (a) el cultivo de una célula comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos mutante obtenida por el método según la reivindicación 14 codificante de la ciclohexadepsipéptido sintetasa para producir un sobrenadante comprendiendo la ciclohexadepsipéptido sintetasa; y (b) recuperación de la ciclohexadepsipéptido sintetasa.

16. Método para la producción de la ciclohexadepsipéptido sintetasa según la reivindicación 1 comprendiendo (a) el cultivo de una célula de Fusarium sp, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir la ciclohexadepsipéptido sintetasa, para producir un sobrenadante comprendiendo la ciclohexadepsipéptido sintetasa; y (b) la recuperación de la ciclohexadepsipéptido sintetasa.

17. Método para la producción de la ciclohexadepsipéptido sintetasa según la reivindicación 1 comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped comprendiendo un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos codificante de la ciclohexadepsipéptido sintetasa bajo las condiciones adecuadas para la producción de la ciclohexadepsipéptido sintetasa; y (b) la recuperación de la ciclohexadepsipéptido sintetasa.

18. Método para la producción de una ciclohexadepsipéptido sintetasa comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped bajo las condiciones apropiadas para la producción de la ciclohexadepsipéptido sintetasa, donde la célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutante teniendo al menos una mutación en la secuencia codificante de la ciclohexadepsipéptido sintetasa madura de la SEC ID NO: 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica una ciclohexadepsipéptido sintetasa consistiendo en el polipéptido maduro contenido dentro de la SEC ID NO: 2, y (b) la recuperación de la ciclohexadepsipéptido sintetasa.

19. Método para la producción de un ciclohexadepsipéptido, comprendiendo:

(a)

la reacción de la ciclohexadepsipéptido sintetasa según la reivindicación 1 con ácido D-2-hidroxiisovalérico, un L-aminoácido de cadena ramificada, S-adenosilmethionina, y ATP; y

(b)

el aislamiento del ciclohexadepsipéptido de la reacción.

20. Método para la producción de un ciclohexadepsipéptido, comprendiendo:

(a)

el cultivo de una célula bajo las condiciones adecuadas para la producción del ciclohexadepsipéptido, donde la célula comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de (i) una ciclohexadepsipéptido sintetasa con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65% de identidad con el polipéptido maduro contenido dentro de la SEC ID NO: 2. (ii), una ciclohexadepsipéptido sintetasa que está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza bajo condiciones de astringencia media con la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO: 1 o su cadena complementaria, o en condiciones de astringencia muy elevada con una subsecuencia de la SEC ID NO: 1 de al menos 100 nucleótidos; (iii) una variante alélica de (a) o (b); o (iv) un fragmento de (a) (b), o (c) que presente actividad ciclohexadepsipéptido sintetasa, y

(b)

el aislamiento del ciclohexadepsipéptido de la reacción.