KR101704893B1 - Gdf-8에 대한 개선된 길항물질 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종래 항-GDF-8 항체에 비해 숙주 세포에서 실질적으로 더 높은 수준으로 발현될 수 있는 개선된 중화 항-GDF-8 항체에 관한 것이다. 또한 근육 질량 또는 강도를 증가시키고, 근육 질환, 신경근 질환, 대사 질환, 지방조직 질환 또는 골 질환을 치료하거나 예방하기 위해서 상기와 같은 항체를 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

GDF-8에 대한 개선된 길항물질 항체 및 그의 용도{IMPROVED ANTAGONIST ANTIBODIES AGAINST GDF-8 AND USES THEREFOR}

본 발명은 GDF-8에 대한 개선된 길항물질 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2012년 6월 15일자로 출원된 미국 가출원 제 61/660,232 호를 우선권 주장하고, 이의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

서열 목록에 대한 참조

37 CFR §1.821 하에서 본 출원과 함께 파일명 PC071914_SEQLIST_ST25.txt로서 EFS 웹을 통해 컴퓨터 판독가능한 형태(CRF)로 제출된 서열 목록이 본 발명에 참고로 인용된다. 상기 서열 목록의 전자 사본은 71 킬로바이트의 파일 크기로, 2013년 5월 14일에 생성되었다.

생물학적 기탁물

본원의 대표적인 물질들이 2012년 6월 14일자로, 미국 버지니아주 20110-2209 만나사스 대학로 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션("ATCC")에 기탁되었다. ATCC 수탁 번호 PTA-12980을 갖는 벡터 OGD1.0.0-HC는 OGD1.0.0 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이고, ATCC 수탁 번호 PTA-12981을 갖는 벡터 OGD1.0.0-LC는 OGD1.0.0 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다.

상기 기탁은 "부다페스트 조약" 하에서 특허 절차 및 조례를 목적으로 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부타페스트 조약의 규정 하에 수행된다. 상기 기탁은 기탁일로부터 30년 동안 상기 기탁의 생육성 배양물의 유지를 보장한다. 상기 기탁은 부다페스트 조약의 기간 하에서 ATCC에 의해서, 화이자 인코포레이티드와 ATCC간의 동의를 조건으로 입수가능하게 수행될 것이며, 이는 적절한 미국 특허의 발핼시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 대중에의 공개시(어느 것이든 먼저 오는 것으로) 상기 대중에게 상기 기탁의 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용성을 보장하고 35 U.S.C.§122에 따라 권한이 주어진 미국 특허상표청장 및 이에 준한 상기 청장의 규정(특히 886 OG 638을 참조로 37 CFR§1.14 포함하여)에 의해 결정된 자에 대한 상기 자손의 이용성을 보장한다.

본 출원의 양수인은 기탁시 물질의 배양물이 죽거나 적합한 조건 하에서 배양시 상실되거나 파괴되는 경우 통지시 상기 물질을 동일한 또 다른 것으로 적합하게 대체할 것임에 동의하였다. 상기 기탁된 물질의 이용성을, 임의의 정부의 권한 하에서 상기 정부의 특허법에 따라 허여된 권리에 위반하여 본 발명을 실시할 허가로서 해석해서는 안 된다.

성장 및 분화 인자-8(GDF-8)(또한 마이오스타틴으로서 공지됨)은 분비 단백질이며 구조적으로 관련된 성장 인자들의 상과인 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β)의 구성원이다. 상기 상과의 구성원들은 성장-조절 및 형태형성 성질을 갖는다(문헌[Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46]; 문헌[Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72]). 인간 GDF-8은 동종이량체 복합체를 형성하는 375 아미노산 전구체 단백질로서 합성된다. 진행 중에, 아미노-말단 프로펩타이드("잠복성 관련 펩타이드"(LAP)로서 공지됨)는 절단되고 상기 동종이량체에 비공유적으로 결합된 채로 남아, "작은 잠복성 복합체"로 표시되는 불활성 복합체를 형성할 수 있다(문헌[Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:6407-15]; 문헌[Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:7646-54]; 문헌[Brown et al. (1999) Growth Factors 3:35-43]; 문헌[Thies et al. (2001) Growth Factors 18:251-59]; 문헌[Gentry et al. (1990) Biochemistry 29:6851-57]; 문헌[Derynck et al. (1995) Nature 316:701-05]; 문헌[Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 12:597-641]). 폴리스타틴 및 그의 동족과 같은 단백질들은 또한 성숙한 GDF-8 동종이량체들을 결합시키며 GDF-8 생물 활성을 억제한다(문헌[Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-32]).

다양한 종들로부터 추론된 GDF-8 아미노산 서열의 정렬은 GDF-8이 고도로 보존됨을 입증한다(문헌[McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-61]). 인간, 마우스, 래트, 돼지 및 닭 GDF-8의 서열들은 C-말단 영역에서 100% 일치하는 반면, 비비, 소 및 양 GDF-8은 C-말단에서 단지 3 개의 아미노산 밖에 차이가 나지 않는다. 종들에 걸쳐 GDF-8의 높은 정도의 보존은 GDF-8이 필수적인 생리 작용을 가짐을 암시한다.

GDF-8은 근원세포 및 위성세포의 증식과 분화를 모두 억제함으로써 근육 발생 및 항상성의 조절에 큰 역할을 하는 것으로 나타났다(문헌[Lee and McPherron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:604-07]; 문헌[McCroskery et al. (2003) J. Cell. Biol. 162:1135-47]). 상기 GDF-8은 발생하는 골격근에서 초기에 발현되며, 다자란 골격근, 우세하게는 속근 유형의 근육에서 발현을 계속한다. 또한, 다자란 마우스에서 과발현된 GDF-8은 현저한 근육 손실을 발생시킨다(문헌[Zimmers et al. (2002) Science 296:1486-88]). 또한, 상기 GDF-8 유전자를 불활성으로 만드는 천연 돌연변이들은 동물과 인간 모두에서 비대 및 과형성을 모두 일으키는 것으로 나타났다(상기 문헌[Lee and McPherron (1997)]). 예를 들어, GDF-8 녹아웃 유전자이식 마우스는 상기 골격근의 현저한 비대 및 과형성 및 변경된 피질골 구조를 특징으로 한다(문헌[McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90]; 문헌[Hamrick et al. (2000) Bone 27:343-49]). 골격근 질량의 유사한 증가는 소의 천연 GDF-8 돌연변이에서 뚜렷하다(문헌[Ashmore et al. (1974) Growth 38:501-07]; 문헌[Swatland et al. (1994) J. Anim. Sci. 38:752-57]; 상기 문헌[McPherron et al.]; 문헌[Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-15]). 또한, 다양한 연구들은 증가된 GDF-8 발현이 HIV-유도된 근육 소모와 관련됨을 가리킨다(문헌[Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 95:14938-43]). GDF-8은 또한 근육-특이성 효소(예를 들어 크레아틴 키나제)의 생산 및 근원세포 증식에 연루되었다(WO 00/43781).

GDF-8은 그의 성장-조절 및 형태형성 성질 외에, 다수의 다른 생리 과정들, 예를 들어 2형 당뇨병 발병 동안 글루코스 항상성, 손상된 글루코스 내성, 대사 증후군(즉, 예를 들어 사람을 2형 당뇨병 및/또는 심장병의 고위험군에 놓는 인슐린 내성, 복부 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 만성 염증, 전혈전 상태 등을 포함할 수 있는, 건강한 상태의 군에서 동시에 존재함을 수반하는, 증후군 X와 같은 증후군), 인슐린 내성(예를 들어 화상 또는 질소 불균형과 같은 외상에 의해 유발되는 내성), 및 지방조직 질환(예를 들어 비만증, 이상지질혈증, 비알콜성 지방간 질병 등)에 관여하는 것으로 여겨진다(문헌[Kim et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 281:902-06]).

다수의 인간 및 동물 질환들이, 기능적으로 손상된 근육 조직, 예를 들어 근위축성 측삭 경화증("ALS"), 근이영양증("MD"; 뒤센 근이영양증), 근위축증, 기관 위축증, 허약, 울혈성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 근육감소증, 악액질, 및 다른 질병 및 상태들에 의해 유발된 근육 소모 증후군과 관련된다. 현재, 이들 질환을 치료하기 위한 신뢰할만하거나 효과적인 치료법들은 거의 존재하지 않는다. 이들 질병의 병리학은 이들 질병의 치료에 표적으로서 GDF-8 신호전달에 대한 잠재적인 역할을 암시한다.

ALS는 중추신경계의 퇴행 및 근육 위축을 특징으로 하는 후발성의 불치성 신경퇴행 질병이다. ALS는 전형적으로 보행 이상 및 민첩성의 상실로 시작하여, 이어서 사지 및 횡경막 마비로 진행된다. ALS의 대부분의 사례는 산발성이고 알지못하는 병인학을 갖는 반면, 사례의 5 내지 10%는 우성 가족성(FALS) 유전으로부터 발생하는 것으로 나타났다. FALS의 약 10 내지 20%는 Cu/Zn 초산화물 디스뮤타제(SOD1) 유전자의 돌연변이에 기인한다(문헌[Bruijn et al. (2004) Ann. Rev. Neurosci. 27:723-49]에 리뷰됨). SOD1은 초산화물의 과산화 수소 및 이원자 산소로의 반응을 촉매화하는 이종이량체성 금속-단백질이며, SOD1의 상실은 운동뉴런 질병을 생성시키지 않으므로(문헌[Reaume et al. (1996) Nat. Genet. 13:43-47]), 질병은 독성 기능획득에 의해 유발되는 것으로 여겨진다(상기 문헌[Bruijn et al.]에 리뷰됨). SOD1-유발된 뉴런세포사의 특이 기전은 불분명하며, 축삭 수송의 변경, 잘못접힌 단백질에 대한 세포 반응, 미토콘드리아 기능장애, 및 흥분독성을 수반할 수 있다(상기 문헌[Bruijn et al.]).

ALS에서 관찰되는 운동 뉴런의 퇴행은 운동 뉴런에 의한 영양 인자의 흡수 또는 수송 붕괴를 포함한 다수의 기전들을 통해 발생할 수 있다(문헌[Holzbaur (2004) Trends Cell Biol. 14:233-40]에 리뷰됨). 따라서, ALS는 최적의 생존 환경을 제공함으로써 퇴행하는 뉴런을 회복시키는 요법에 의해 치료될 수도 있다. 신경의 환경은 비뉴런 세포, 예를 들어 신경아교 및 상기 운동 뉴런에 의해 자극되는 근육 세포를 포함한다. 상기 환경은, 상기 뉴런에 의해 이물흡수되고 역행성 축삭 이동을 통해 세포체로 수송되는 영양 및 성장 인자를 제공한다(문헌[Chao (2003) Neuron 39:1-2]; 상기 문헌[Holzbaur]).

FALS는 돌연변이 SOD1의 과발현에 의해 마우스와 래트 모두에서 설계되었다(문헌[Howland et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.99:1604-09]). 돌연변이 SOD1의 G93A 형태를 과발현하는 유전자이식 마우스는 90 내지 100일의 나이까지 근육 허약 및 위축을 나타내고, 전형적으로는 거의 130일의 나이에 죽는다(문헌[Gurney et al. (1994) Science 264:1772-75]). 그러나, 악력 강도의 허약 및 신경근 접합부의 상실을 포함하는, 근원의 SODG93A-유발된 병리는 50일의 나이정도로 초기에 현저하다(문헌[Frey et al. (2000) J. Neurosci. 20:2534-42]; 문헌[Fisher et al. (2004) Exp. Neuro. 185:232-40]; 문헌[Ligon et al. (2005) NeuroReport 16:533-36]; 문헌[Wooley et al. (2005) Muscle Nerve 32:43-50]). 상기 SODG93A 돌연변이를 발현하는 유전자이식 래트는 퇴행의 유사한 시간 과정을 따른다(상기 문헌[Howland et al.]). 최근의 연구는 상기 병리의 발병이 세포 자율적이지 않고, ALS에서 관찰된 운동 뉴런의 퇴행이 상기 운동 뉴런에 의한 영양 인자의 흡수 및 수송의 붕괴(상기 참조)를 포함하여 다수의 기전을 통해 발생한다는 가설과 일치함을 시사하였다. 클레멘트(Clement)와 동료들은 야생형 비뉴런 세포가 돌연변이 SOD1을 발현하는 운동 뉴런의 생존을 연장시킬 수 있음을 입증하기 위해서 키메릭 마우스를 사용하였다(문헌[Clement et al. (2003) Science 302:113-17]). 이러한 관찰은 생존을 위해 최적의 미세환경을 제공함으로써 뉴런 퇴행을 늦출 수도 있는 요법을 연구하기에 이르렀다. 예를 들어, 바이러스에 의해 발현된 성장 인자(IGF-1, GDNF 및 VEGF 포함)의 직접적인 근육내 주사를 통한 SODG93A 마우스의 치료는 동물 생존을 연장시킨다(문헌[Kaspar et al. (2003) Science 301:839-42]; 문헌[Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-17]; 문헌[Wang et al. (2002) J. Neurosci. 22:6920-28]). 또한, 국소적인 IGF-1 특이성 동형단백질(mIGF-1)의 근육-특이적 발현은 SODG93A 유전자이식 마우스 모델에서 신경근 접합부를 안정화시키고, 운동 뉴런 생존을 증대시키며 질병의 개시 및 진행을 지연시킨다(문헌[Dobrowolny et al. (2005) J. Cell Biol. 168:193-99]). 근육 과다대사와 운동 뉴런 취약성간의 연계가 또한 ALS 마우스에서 보고되었으며, 이는 근육 중 결함이 질병 병인에 기여할 수도 있다는 가설을 지지한다(문헌[Dupois et al. (2004) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 101:11159-64]). 따라서, 근육 성장의 증대는 운동 뉴런에 대한 개선된 국소적 지지를 제공할 것이며, 따라서 치료학적 이점을 생성시킬 것이다.

마이오스타틴 발현의 억제는 근육 비대 및 과형성을 모두 도출한다(상기 문헌[Lee and McPherron]; 상기 문헌[McPherron et al.]). 마이오스타틴은 손상후 근육 재생을 음으로 조절하고, GDF-8 삭제 마우스에서 마이오스타틴의 결여는 가속화된 근육 재생을 생성시킨다(문헌[McCroskery et al., (2005) J. Cell. Sci. 118:3531-41]). 마이오스타틴-중화 항체는 야생형 마우스(문헌[Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71]), 및 근이영양증 모델인 mdx 마우스(문헌[Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21; Wagner et al. (2002) Ann. Neurol. 52:832-36])에서 체중, 골격근 질량, 및 골격근의 근육 크기 및 강도를 증가시킨다. 더욱 또한, 이들 마우스에서 마이오스타틴 항체는 횡경막(ALS 발병학 중 또한 표적화되는 근육)에 대한 손상을 감소시켰다. 근육에 대한 성장 인자, 예를 들어 HGF의 작용은 마이오스타틴 발현의 억제에 기인할 수 있으며(상기 문헌[McCroskery et al.(2005)]), 이에 의해 재생과 퇴행간의 "밀고 당기기" 또는 균형을 양의 방향으로 이동시키는데 일조할 수 있음이 가정되었다. 따라서, GDF-8 억제는 ALS, 근이영양증(MD), 및 다른 GDF-8-관련 질환, 예를 들어 근육 질량, 강도, 크기 등을 증가시키는 것이 바람직한 신경근 질환의 치료를 위한 잠재적인 약물학적 표적으로서 제공된다. ALS의 동물 모델(마우스 및 래트)의 이용성으로, 2 개의 상이한 종들에서 치료제를 시험하는 것이 가능하며, 따라서 인간의 생체내 치료 효과 신뢰도를 증가시키는 것이 가능하다.

인간의 신경근 질환 외에, 골손실과 관련된 성장-인자 관련 상태, 예를 들어 골다공증 및 골관절염(노령 및/또는 폐경후 여성들이 현저하게 걸린다)이 또한 존재한다. 또한, 대사성 골 질병 및 질환은 만성적인 글루코코르티코이드 요법, 조기 생식선 부전, 안드로젠 억제, 비타민 D 결핍, 2차 부갑상선기능항진증, 영양 결핍, 및 신경성 식욕부진증으로 인한 낮은 골 질량을 포함한다. 이들 상태에 대한 다수의 현행 요법들은 골흡수를 억제시킴으로써 작용하지만, 골형성을 촉진하는 요법이 유용한 대안 치료일 것이다. GDF-8은 골 발생뿐만 아니라 근육 발생에 한 역할을 하기 때문에, GDF-8의 조절이 또한 골-퇴행성 질환의 치료에 탁월한 약물학적 표적이다.

GDF-8을 특이적으로 길항하는 쥐 단클론 항체가 ALS에 대한 설치류 모델에서, 다른 생물 효과들 중에서도 근육 질량 및 강도를 증가시키는 것으로서 앞서 개시되었다(문헌[Holzbaur, EL, et al., Myostatin inhibition slows muscle atrophy in rodent models of amyotrophic lateral sclerosis, Neurobiology of Disease (2006) 23(3):697-707]). 따라서 상기 마우스 항체 및 그의 인간화된 대응물이 ALS 대상에서뿐만 아니라, GDF-8의 과잉량을 특징으로 하거나 이에 의해 매개되는 다른 질병 및 질환, 예를 들어 상술한 질병 및 질환에 걸린 대상에서 근육 질량 및 강도를 증가시키는데 효과적인 것으로 예상된다.

상기 언급한 마우스 항-GDF-8 항체의 인간화된 버전은 다수의 단클론 항체 및 다른 단백질-기재 요법들처럼, 그렇게 인간화하는 것이 전형적으로는 살아있는 포유동물 세포에서의 생산을 요하기 때문에 제조가 도전이며 비용이 많이 든다. 따라서 상기 항체, 또는 유사한 특이성을 갖는 다른 항체들의 수율을 개선시키는 것이 보다 적은 투입으로 동일한 양의 활성 약물을 생산할 수 있게 할 것이다. 이는 제조 비용을 감소시키는 동시에 다른 생물학적 약물의 생산을 위한 제한된 제조 설비를 해소시키는 이중의 이점을 가질 것이다. 상기 두 가지 이점은 모두 대상들에 대한 치료학적 항-GDF-8 항체뿐만 아니라 다른 생물학적 약제의 이용성의 증가 목표를 진전시킬 것이다. 따라서, 당해 분야에서는 포유동물 세포에서 보다 높은 생산 수율을 갖는 항-GDF-8 항체의 개선된 버전에 대한 필요성이 존재한다.

본원은 동일한 상보성 결정 영역(CDR)을 공유하는 항체들의 선행 버전에 비해 숙주 세포에서 보다 높은 수준으로 발현될 수 있는 인간화된 항-GDF-8 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 본원의 방법에 사용하기 위한 상기와 같은 항체를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.

몇몇 실시태양에서, 이들 항체는 CDR1이 서열번호 10 또는 서열번호 20의 아미노산 서열에 의해 한정되고, CDR2가 서열번호 11 또는 서열번호 21의 아미노산 서열에 의해 한정되며, CDR3이 서열번호 12의 아미노산 서열에 의해 한정되고, 카밧 위치 108의 아미노산이 메티오닌 대신에 류신이도록 변형된 가변 중쇄(VH) 영역을 갖는다. 다른 실시태양에서, 이들 항체는 동일한 CDR을 포함하는 VH 영역을 가지며 상기 VH 영역의 제 4 프레임워크 영역이 서열번호 44의 아미노산 106 내지 116을 포함한다. 이들 항체의 더욱 다른 실시태양에서, 상기 CDR은 인간 생식계열 VH 유전자 분절 DP-47 상에 그래프트화되고 이어서 JH4 인간 중쇄 J 분절 유전자와 결합한다. 더욱 다른 실시태양들에서, 이들 항체의 VH 영역은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함한다.

카밧 위치 108에서 류신을 갖는 본원의 항체, 예를 들어 상기 예시된 것들은 동일한 위치에서 메티오닌이 존재하는 버전에 비해 증가된 발현 수준을 특징으로 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 류신을 갖는 버전은 상기 메티오닌을 갖는 버전에 비해 유사한 조건 하에서 약 50%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1200%, 1400%, 1600%, 1800% 또는 심지어 2000%를 초과하는 양까지 더 높은 수준으로 발현된다.

본원의 항체의 다른 실시태양들에 따라, 선행 단락에 개시된 VH 영역은 가변 경쇄(VL) 영역(여기에서 CDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열에 의해 한정되고, CDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열에 의해 한정되며, CDR3은 서열번호 15의 아미노산 서열에 의해 한정되고, 상기 VL 영역의 카밧 위치 100에서 아미노산은 글리신 또는 글루타민이다)과 짝을 이룰 수 있다. 다른 실시태양들에서, 상기 VH 영역은, 경쇄 CDR이 인간 생식계열 VL 유전자 분절 DPK-9 상에 그래프트화되고 이어서 JK4 인간 경쇄 J 분절 유전자와 결합하는 VL 영역과 짝을 이룬다. 이들 항체의 일부 다른 실시태양들에 따라, 앞서 개시된 VH 영역은 앞서 개시된 VL 영역 CDR을 갖는 VL 영역과 짝을 이루고 여기에서 상기 VL 영역의 제 4 프레임워크 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 46의 아미노산 98 내지 107을 포함한다. 더욱 다른 실시태양들에서, 앞서 개시된 VH 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역과 짝을 이룬다.

일부 다른 실시태양들에서, 상술한 VH 영역은 IgA, IgG, IgD, IgE 또는 IgM을 포함하는 인간 항체 하위유형들로부터의 중쇄 불변 영역에 결합한다. 상기 중쇄 불변 영역이 IgG로부터의 것인 경우, 더욱 다른 실시태양들에서, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 IgG 하위유형들로부터의 것이다. 중쇄 불변 영역들을 예를 들어 서열번호 57에 예시된 바와 같이, 하나 이상의 Fc 도메인 효과기 작용을 없애도록 변형시킬 수 있다. 다른 실시태양들에서, 상술한 VL 영역을, 람다 또는 카파 하위유형의 것일 수도 있는 경쇄 불변 영역에 결합시킨다.

다른 실시태양들에 따라서, 서열번호 44의 VH 영역은 서열번호 57의 아미노산 서열의 변형된 중쇄 영역과 결합하여 서열번호 58의 아미노산 서열의 전장 항체 중쇄를 생성시킨다. 환언하면, 다른 실시태양들에서, 서열번호 46의 VL 영역을 서열번호 17의 아미노산 서열의 카파 불변 경쇄와 결합시켜 서열번호 59의 아미노산 서열의 전장 항체 경쇄를 생성시킬 수 있다. 다른 실시태양들에서, 이어서 상기 전장 항체 중쇄 및 경쇄 2 개를 각각 결합시켜 2 개의 항원 결합 부위를 갖는 항-GDF-8 항체를 생성시킬 수 있다. 더욱 다른 실시태양들에서, 항체는 상기와 같은 전체 크기의 완전한 항체의 단편 또는 유도체, 예를 들어 Fab, F(ab')₂, scFv, scFv-Fc, scFv-CH, scFab, scFv-지퍼, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, Fv 및 이중특이성 항체를 포함할 수 있다.

본원의 항체는 GDF-8에 대한 일련의 결합 친화성, 예를 들어 약 5000 nM 또는 심지어 더 이상, 예를 들어 약 4000 nM, 3000 nM, 2000 nM, 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM 또는 0.001 nM 이상의 결합 친화성을 가질 수 있다.

본원은 또한 항-GDF-8 항체를 암호화하는 핵산뿐만 아니라, 상기와 같은 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 항체를 발현하기 위한 숙주 세포를 제공한다.

본원은 또한 대상에서 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 근육 질환을 치료하거나 예방하기에 유용한 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 상기와 같은 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양의, GDF-8에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 투여함으로써 수행된다. 이들 방법에 유용한 항체는 상기 및 본원 전체를 통해 개시된 것들을 포함한다.

몇몇 실시태양들에 따라서, 본원의 항체 조성물을 근이영양증, 근위축증, 근육감소증, 악액질, 근육 소모 증후군, 연령-관련된 근육 질량 또는 강도의 손실, 및 허약으로 이루어진 군 중에서 선택된 것들을 포함한 근육 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 다른 실시태양들에서, 상기 근육 질환은 암에 의해 유발된 악액질이다. 더욱 다른 실시태양들에서, 상기 근육 질환은 뒤센 근이영양증이다. 후자의 실시태양들 중 몇몇에서, 항-GDF-8 항체의 투여는 6 분 걷기 시험에서 상기 대상의 동작을 개선시키기에 효과적이다.

일부 실시태양들에서, 본원의 항체 조성물은, 본원의 항체를 포함하는 조성물을 근이영양증을 치료하기에 효과적인 또 다른 작용제 전에, 상기 작용제와 동시에, 또는 상기 작용제 후에 투여함으로써, 근이영양증, 예를 들어 뒤센 근이영양증을 앓고 있는 대상을 치료하기에 또한 유용하다. 몇몇 실시태양들에서, 상기와 같은 작용제는 글루코코르티코이드, 예를 들어 프레드니손이다.

포유동물에게 본원의 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 상기 포유동물의 근육의 질량 또는 강도를 증가시키기에 효과적인 양으로 투여함으로써 상기 포유동물의 근육의 질량 또는 강도를 증가시키는 방법을 또한 제공한다. 다수의 실시태양들에서, 상기 근육은 호흡시 활동성인 하나 이상을 포함한 골격근, 또는 심근이다.

신경근계 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양의 본원의 항-GDF-8 항체를 투여함으로써 상기 신경근계 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 또한 제공한다. 몇몇 실시태양들에서, 상기 치료하거나 예방하고자 하는 신경근계 질환은 ALS이다.

대사 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양의 본원의 항-GDF-8 항체를 투여함으로써 상기 대사 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 또한 제공한다. 다수의 실시태양들에서, 상기 치료하거나 예방하고자 하는 대사 질환은 2형 당뇨병, 대사 증후군, 증후군 X, 인슐린 내성 및 손상된 글루코스 내성을 포함한다.

지방조직 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양의 본원의 항-GDF-8 항체를 투여함으로써 상기 지방조직 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 또한 제공한다. 다수의 실시태양들에서, 상기 치료하거나 예방하고자 하는 지방조직 질환은 비만증 및 비정상적으로 높은 체질량 지수를 포함한다.

골손실 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양의 본원의 항-GDF-8 항체를 투여함으로써 상기 골손실 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 또한 제공한다. 다수의 실시태양들에서, 상기 치료하거나 예방하고자 하는 골손실 질환은 골다공증, 골감소증, 골관절염 및 골다공증-관련 골절을 포함한다.

일부 다른 실시태양들에서, 본원의 방법에 유용한 항-GDF-8 항체는 그의 작용 또는 특성을 유용하게 변경시키는, 예를 들어 비제한적으로 혈청 반감기를 증가시키는 부분들에 접합된 항체를 포함한다. 더욱 다른 실시태양들에서, 아미노산 변화를 유사한 목적, 또는 다른 목적을 위해서 수행할 수 있다.

본원의 방법에 사용하기 위한 항체 조성물을 다양한 경로들에 의한 투여, 예를 들어 비제한적으로 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 주입 투여, 또는 일시주사 투여를 위한 상이한 제형들로서, 예를 들어 비제한적으로 수성 현탁액으로서 제조할 수 있다.

일부 실시태양에서, 본원의 항-GDF-8 항체의 유효 용량은 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏의 범위이며, 상기 용량을 1 회 투여, 또는 수회에 걸쳐, 이격된 투여로 제공할 수 있다.

본원은 또한 의사 및 다른 사람들이 대상에게 항-GDF-8 항체 조성물의 투여를 촉진하기 위해 사용하기 위한 약학 키트를 제공한다. 일부 실시태양들에서, 키트는 동결건조된 형태로 또는 수용액으로서 본원의 항-GDF-8 항체, 희석제, 예를 들어 약제 등급의 물 또는 완충제, 및 상기 항-프로가스트린 항체를 투여하기 위한 장치, 예를 들어 주사기 및 바늘을 포함한다. 다른 실시태양들에서, 키트는 제 2 치료제를 추가로 포함할 수 있다.

도 1a는 쥐 항체 VH 영역, 및 쥐 중쇄 CDR을 인간 생식계열 VH 영역 DP-47에 그래프트화시킴으로써 생성된 2 개의 인간화된 항체 VH 영역(즉 VH0 및 VH1)을 포함하는, 본원의 몇몇 항-GDF-8 항체로부터의 VH 영역들의 아미노산 서열들의 정렬을 제공한다. 추가로 인간화된 VH 영역 VH2 내지 VH5의 아미노산 서열의 정렬을 추가로 제공한다. 상기 중쇄 CDR들의 아미노산 서열을 굵은 글자체로 밑줄을 그어 강조한다. 카밧 위치 108의 아미노산은 별표 바로 아래에 굵은 글자체를 사용하여 강조한다.
도 1b는 쥐 항체 VL 영역, 및 쥐 경쇄 CDR을 인간 생식계열 VL 영역 DPK-9에 그래프트화시킴으로써 생성된 2 개의 인간화된 항체 VL 영역(즉 VL0 및 VL1)을 포함하는, 본원의 몇몇 항-GDF-8 항체로부터의 VL 영역들의 아미노산 서열들의 정렬을 제공한다. 추가로 인간화된 VL 영역 VL2 내지 VL5의 아미노산 서열의 정렬을 추가로 제공한다. 상기 경쇄 CDR들의 아미노산 서열을 굵은 글자체로 밑줄을 그어 강조한다. 카밧 위치 100의 아미노산은 별표 바로 아래에 굵은 글자체를 사용하여 강조한다.
도 2a는 비히클 대조군과 비교된, 2 주 동안 10 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 C57Bl/6 마우스로부터의 비복근(GAS) 및 사두근(QUAD) 근육의 질량 증가를 도시하는 그래프를 제공한다. 도 2b는 대조군에 비해 OGD1.0.0 항체로 처리된 마우스에서 근육 질량의 증가 백분율로서 도 2a에서와 동일한 데이터를 보고한다. 도 2b는 추가로 동일한 군의 항체 처리된 대조용 마우스로부터의 장지신근(EDL)의 근육 질량의 증가 백분율을 나타낸다.
도 3은 비히클 대조군과 비교된, 2 주 동안 10 ㎎/㎏ OGD1.0.0 항체로 처리된 C57Bl/6 마우스로부터의 EDL 근육에 의해 생성된 전체 강직성 수축력의 증가를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 4a는 4 주 동안 매주 PBS 비히클로 처리된, 및 0.3, 1, 3, 10 및 30 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 C57Bl/6 마우스로부터의 비복근(Gastroc) 및 사두근(Quad) 근육의 용량 응답성 질량 증가를 도시하는 그래프를 제공한다. 데이터는 4 주의 끝에서 측정된 근육 질량을 나타낸다. 도 4b는 대조군에 비해 OGD1.0.0 항체로 처리된 마우스에서 비복근 및 사두근 근육 질량의 증가 백분율로서 도 4a에서와 동일한 데이터를 보고한다.
도 5a는 4 주 동안 매주 PBS 비히클로 처리된, 및 0.3, 1, 3, 10 및 30 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 C57Bl/6 마우스의 전신 실질 질량의 용량 응답성 증가를 도시하는 그래프를 제공한다. 데이터는 4 주에 걸쳐 각 주의 끝에서 측정된 실질 질량을 나타낸다. 도 5b는 4 주 동안 매주 PBS 비히클로 처리된, 및 상기 4 주 연구의 끝에서 0.3, 1, 3, 10 및 30 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 C57Bl/6 마우스의 전신 실질 질량의 증가를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 6a는 PBS 비히클 투여된 대조용 mdx 마우스에 비해, 8 주 동안 매주 10 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 mdx 마우스의 전신 실질 질량의 증가를 도시하는 그래프를 제공한다. 도 6b는 PBS 비히클 투여된 대조용 mdx 마우스에 비해, 8 주 동안 매주 10 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 mdx 마우스의 최대 절정의 악력의 증가를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 7a는 8 주 동안 매주 PBS 비히클 투여된 대조용 마우스에 비해, 10 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 mdx 마우스 및 C57Bl/6 마우스로부터의 비복근 및 사두근 근육의 질량 증가를 도시하는 그래프를 제공한다. 데이터는 8 주의 끝에서 측정된 근육 질량을 나타낸다. 도 7b는 대조군에 비해 OGD1.0.0 항체로 처리된 mcx 마우스에서 비복근 및 사두근 근육 질량의 증가 백분율로서 도 7a에서와 동일한 데이터를 보고한다.
도 8은 0, 3, 10 및 30 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 사이노몰구스 원숭이의 전신 실질 질량 및 다리 실질 질량의 용량 응답성 증가를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 9는 10 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체 모두로 처리된 사이노몰구스 원숭이의 전신 실질 질량의 증가가 상기 항체 처리를 중단한 후 여러 주일 동안 지속됨을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 10a는 8 주 동안 10 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏의 OGD1.0.0 항체로 처리된 사이노몰구스 원숭이의 L3 내지 L5 척추골 위에 놓인 축상 근육의 부피가 PBS 비히클 투여된 대조용 동물에 비해 증가되었음을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 11은 OGD1.0.0 항체에 의한 4 주 처리 전후의 예시적인 동물 피실험자로부터의 축상 근육의 3D 렌더링을 제공한다.
도 12a는 본 발명에서 VH0으로서 지칭되는 가변 중쇄 영역을 함유하는 예시적인 항-GDF-8 항체 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다.
도 12b는 본 발명에서 VL0으로서 지칭되는 가변 경쇄 영역을 함유하는 예시적인 항-GDF-8 항체 경쇄의 아미노산 서열을 제공한다.

본원은 인간화된 항-GDF-8 항체의 선행 버전에 비해 훨씬 더 높은 수준으로 세포에서 발현될 수 있는 상기 항체의 개선된 버전을 제공한다. 따라서, 본 발명에 개시된 항-GDF-8 항체의 개선된 버전은 선행 버전에 비해, 동일하게 투자된 상품을 보다 다량으로 보다 저렴하게 생산할 수 있게 할 것으로 예상된다. 본원은 또한 상기 개선된 항체를 사용하는 다양한 치료 또는 예방 방법을 개시한다. 따라서, 몇몇 예시적인 비제한적인 실시태양에서, 상기 개선된 항-GDF-8 항체를 사용하여 근이영양증, 악액질, 및 대상의 근육 질량 또는 강도의 증가가 치료학적 이점을 부여할 것으로 예상되는 다른 질환들을 치료할 수 있다.

항체 구조 및 다양성

본 발명에 사용된 바와 같이, 항체란 용어는 완전한 면역글로불린(Ig) 또는 그의 임의의 항원 결합 단편, 부분 또는 일부를 지칭하며, 다른 것들 중에서도, 적어도 일부의 항원 결합 특이성을 유지하는 완전한 또는 부분적인 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 항체는 또한 완전한 항체로부터 유도된 항원 결합 단편, 부분 또는 일부와 또 다른 분자, 예를 들어 상이한 항체, 상기 Ig 상과로부터의 단백질, 또는 면역계에서 기원하지 않는 단백질 또는 다른 유형의 분자와의 조합을 지칭할 수도 있다. 상기와 같은 항체 유도체는 단백질성이 아닌 일부 또는 부분을 포함할 수도 있다.

항원은 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 물질, 단백질 등을 지칭한다. 항원은, 항체에 의해 결합되는 항원의 일부인 하나보다 많은 항원 결정인자 또는 에피토프를 가질 수 있다.

면역글로불린(Ig)은 각각 약 50 kDa의 2 개의 중쇄, 및 각각 약 25 kD의 2 개의 경쇄를 포함하는 이종사량체성 단백질이다. 각각의 쇄는 다수의 Ig 도메인을 포함한다. 아미노 말단에서 출발하여, 상기 중쇄는 단일 가변 영역(VH)에 이어서, Ig 하위유형에 따라, CH1, CH2, CH3, 및 존재하는 경우, CH4라 칭하는 3 개 또는 4 개의 불변 영역을 함유한다. 유사하게, 경쇄에서 단일 가변 영역(VL)이 상기 폴리펩타이드의 아미노 말단에 위치하며, 이어서 단일 불변 영역(CL)이 위치한다. 상기 CH1과 CH2 영역 사이에, 아이소타입에 따라, 가변 길이의 힌지 영역이 존재하며, 이는 상기 분자에 가요성을 부여한다. 힌지를 포함한 CH1, CH2, CH3 및 존재하는 경우, CH4의 중쇄 카복시-말단은 Fc 영역을 구성한다. 각각의 가변 또는 불변 영역은 단일 Ig 도메인을 포함한다.

Ig 경쇄는 Ig 중쇄에 결합하며, Ig 중쇄의 쌍은 서로 다이설파이드 결합을 통해 결합한다. 비-공유 상호작용이 또한 중쇄와 경쇄 사이, 및 짝을 이룬 중쇄 사이의 쇄-간 4차 구조의 안정화에 기여할 수 있다. 완전한 Ig 분자에서, 상기 짝을 이룬 중쇄 및 경쇄의 VH 및 VL 영역이 서로 인접하여 위치하며, 상호작용하고 협력하여 항체 결합 부위를 형성한다. 완전한 Ig 분자들은 두 쌍의 짝을 이룬 중쇄 및 경쇄, 즉 총 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄를 함유하기 때문에, Ig 분자는 2 개의 항원 결합 부위를 함유한다. 상기 힌지 영역의 존재는 상기 분자의 항원 결합 부위와 나머지 사이에 가요성을 부여한다.

중쇄 및 경쇄 불변 영역들은 항원 인식에 직접 참여하지 않는다. 그러나, 중쇄, 특히 Fc 영역은 면역계의 효과기 분자 및 세포와 상호작용할 수 있으며, 이에 의해 상기 중쇄 영역이 상기 Ig 분자의 중요한 생물학적 작용들을 매개할 수 있게 한다.

상기 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역은 고가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)(상기 영역은 상기 CDR을 둘러싸는 보다 고도로 보존된 프레임워크 영역(FR)에 비해 상이한 Ig 분자에 걸쳐 광범위하게 다양하다)이라 칭하는, 증대된 아미노산 가변성의 3 개의 이격된 구역을 함유한다. 가변 영역의 아미노 말단으로부터, FR 및 CDR의 연속적인 순서 및 넘버링은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4이다. 상기 프레임워크 영역은 주로 상기 가변 영역 Ig 도메인의 3차 구조의 결정을 맡고 있다. 대조적으로, 상기 CDR은 각각의 가변 영역으로부터 바깥으로 연장되는 고리를 형성한다. 인접한 VH 및 VL 영역의 CDR들은 협력하여 항원 결합 표면을 형성하며, 상기 표면은 주로 특정한 Ig 분자의 항원 결합 특이성을 한정하는데 책임이 있다.

항체 구조 및 작용을 연구하는 연구자들은 임의의 특정한 VH 또는 VL 영역의 아미노산 서열내에 존재하는 중쇄 및 경쇄 CDR들을 확인하기 위해서 상이한 도해를 개발하였다. 이들 도해 중 다수는 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 주변 프레임워크와 관련된 불변 또는 거의 불변의 패턴에 따라 CDR을 확인한다. 이어서 상기 CDR들을 상기 VH 및 VL 영역의 환경내에서 그들의 구성 잔기들의 위치에 상응하는 숫자 범위를 사용하여 한정한다. CDR, 특히 세 번째 CDR은 길이가 변화할 수 있으므로, 상기 도해는 때때로 구성 잔기들을 한정하기 위해 문자를 또한 사용한다. 첫 번째 상기와 같은 도해 중 하나는 카밧 넘버링 시스템으로서 공지되어 있으며, 상기 시스템은 공지된 VH 및 VL 서열을 정렬시켜 보다 고도로 보존된 프레임워크 영역의 환경내의 가변적인 CDR 하위서열들의 위치를 결정함을 기본으로 하였다. CDR을 한정하기 위한 다른 도해들은 AbM 넘버링 시스템 및 코티아(Chothia) 넘버링 시스템을 포함한다. 다른 도해들도 또한 가능하다. 예를 들어, CDR을 항원과 접촉하는 가변 영역 잔기들(상기와 같은 잔기들이 CDR에 대해 보다 형식화된 정의, 예를 들어 카밧 또는 코티아 넘버링 도해내에 깨끗하게 들지 않는다 하더라도)로서 정의할 수 있다. 예를 들어 문헌[Y. Ofran, et al., Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes, J Immunol. 2008 Nov 1;181(9):6230-5](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 상기 카밧 넘버링 도해 및 몇몇 다른 항체 넘버링 도해들은 예를 들어 문헌[the Handbook of Therapeutic Antibodies (2007), ed. Stefan Dubel, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim](본 발명에 참고로 인용된다)에 보다 상세히 개시되어 있다.

상기 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 CDR 내 아미노산들은 상기 항원 중의 잔기들과 접촉하며 주로 상기 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 한정하는 것을 맡고 있다. 연구 중인 항체-항원 쌍에 따라, 전체 이하의 CDR 잔기들은 상기 항원과 직접 접촉할 수도 있다. 더욱 또한, 몇몇 접촉은 다른 것들보다 더 특이성 및/또는 친화성을 한정하는데 기여할 수 있다.

상기 항체 및 항원 모두에서, 접촉 잔기들의 정체를 x-선 결정학 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다른 방법들을 사용하여 측정할 수 있다. 종종, 항상은 아니지만, 상기와 같은 접촉 잔기들의 돌연변이는 항원 결합 특이성 또는 친화성에 부정적인 영향을 미칠 것이다. 환언하면, 항원 결합 특이성 및/또는 친화성에 실질적인 영향 없이, 비-접촉 CDR 잔기뿐만 아니라 FR 잔기들을 돌연변이시킬 수 있다. 보존적인 아미노산 변화가 좀 더 항원 결합 특이성 및 친화성을 보존할 것으로 예상되기는 하지만, 임의의 특정한 CDR 또는 프레임워크 돌연변이의 실제 영향을 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 친숙한 기법을 사용하여 실험적으로 측정할 수 있다.

각각의 프레임워크 영역들에 의해 지지되는 VH 및 VL 영역의 CDR들이 전형적으로 항원 결합 특이성 및 친화성을 확립시키는데 원인이 될 수 있지만, 예외가 있을 수도 있다. 예를 들어, 몇몇 Ig 분자에서, FR 잔기들은 또한 항원 결합에 기여할 수도 있는 반면, 몇몇 다른 Ig 분자들에서 상기 CDR 중 하나 이상은 항원과 직접 접촉하지 않을 수도 있다. 더욱 또한, 더욱 다른 Ig 분자들에서, 단리된 VH 영역 및 VL 영역의 CDR들은 통상적으로 짝을 이루는 상응하는 가변 영역의 부재 하에서조차 실질적인 항원 결합 특이성을 가질 수도 있다. 몇몇 단리된 Ig 분자 가변 영역의, 항원과 특이적으로 결합하는 능력은 짝을 이룬 중쇄를 포함하는(경쇄는 아닌) 상어 또는 카멜리드 항체의 항원 결합 특이성과 유사하다.

몇몇 종의 Ig 분자들을 상이한 아이소타입에 따라 분류할 수 있다. 예를 들어 인간에서, Ig 아이소타입은 IgA, IgG, IgD, IgE 및 IgM을 포함한다. 더욱이 상기 IgA 및 IgG 아이소타입은 각각 IgA1 및 IgA2, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4라 칭하는 아이소타입들로 분류될 수 있다. 아이소타입 및 하위유형들은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열들의 차이에 의해 한정된다. 결과적으로, 상기 상이한 아이소타입 및 하위유형들은 상이한 면역 세포상의 상이한 효과기 분자들과 상호작용하여 상이한 효과기 작용을 부여할 수 있다. 예를 들어, IgA 분자는 점막 면역성에 기여하는 반면, IgE 분자는 몇몇 기생충에 대한 면역성에 기여한다. IgM 및 IgE의 중쇄는 아미노 말단 CH 영역으로부터 출발하여 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 넘버링되는 4 개의 나란하게 배열된 CH Ig 도메인들을 함유한다. 그러나, IgA, IgD 및 IgG는 오직 3 개의 나란하게 배열된 CH 영역들만을 함유한다. 경쇄 불변 영역은 공지된 생물학적 효과기 작용을 갖지 않는, 카파 및 람다라 칭하는, 2 개의 아이소타입을 포함한다. 천연 Ig 분자는 단지 단일의 경쇄 불변 영역 아이소타입만을 가질 것이다.

항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 유전자들을 생체내에서 V(D)J 재조합으로서 공지된 다수의 유전자 재배열을 통해 제작한다. 상기 과정은 게놈 중에 거주하는 유전자 서열의 비교적 제한된 레퍼토리로부터 항원 결합 단백질의 큰 레퍼토리를 생성시키는 것을 맡고 있다. 상기 과정에 대한 보다 많은 정보가 문헌[Abbas, A.K., Lichtman, A.H. and Pillai, S., 2010, Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Chapter 8, Saunders, Philadelphia, PA](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있다.

인간 생식계열 DNA에서, 3 개의 별도의 유전자 자리들은 면역글로불린 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄를 제작하는데 필요한 엑손들을 암호화한다. 상기 중쇄 자리는 염색체 14상에 존재하고, 상기 카파쇄 자리는 염색체 2상에 존재하며, 상기 람다쇄 자리는 염색체 22상에 존재한다. 각 자리의 5' 단부에 다수의 가변(V) 유전자 분절이 놓이며, 이들은 각각 약 300 염기쌍의 길이이고, 제 1 및 제 2 상보성 결정 영역(CDR1 및 CDR2)을 모두 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 구성하는 아미노산의 대부분을 암호화한다. 인간에서, 중쇄 자리에 약 100 V 유전자가 존재하며, 카파쇄 자리에 약 35 V 유전자가, 람다쇄 자리에 약 30 V 유전자가 존재한다. 상기 V 유전자 분절들은 인트론에 의해 서로 분리된다.

상기 인간 중쇄 자리 및 카파 경쇄 자리 중의 V 분절의 하류 및 불변(C) 유전자 분절의 상류에, 전형적으로 약 30 내지 50 염기쌍 길이의 결합(J) 분절의 클러스터가 위치하며, 서로 및 이웃하는 V 및 C 유전자와 비-암호화 서열에 의해 분리된다. 상기 중쇄 자리는 상이한 Ig 아이소타입과 관련된 9 개의 작용성 C 유전자로부터의 상류에 6 개의 작용성 J 분절의 클러스터를 함유하고, 상기 카파 경쇄 자리는 단일 C_κ 유전자의 상류에 5 개의 J 분절의 클러스터를 함유한다. 상기 인간 람다 경쇄 자리는 또한 4 개의 작용성 J 분절을 함유하지만, 각각은 4 개의 상응하는 작용성 C_λ 유전자들 중 하나의 5'에 위치한다. 상기 인간 중쇄 자리는 또한 상기 V 유전자의 하류 및 상기 J 분절 클러스터의 상류에 위치한 20 개 초과의 다양성(D) 유전자 분절의 클러스터를 함유한다. 상기 경쇄 자리들은 어느 것도 D 유전자 분절을 함유하지 않는다.

성숙한 Ig 경쇄 유전자에서, 상기 V 영역은 V 및 J 유전자 분절에 의해 암호화되는 반면, 상기 Ig 중쇄에서, 상기 V 영역은 V, J 및 D 유전자 분절에 의해 암호화된다. 중쇄 및 경쇄 모두에서 CDR1 및 CDR2는 V 유전자 분절에 의해 암호화된다. 그러나, CDR3의 제작이 더 복잡하다. 중쇄의 경우, CDR3은 D 및 J 분절 및 접합 잔기를 포함하여, VDJ 접합에 의해 암호화된다. 유사하게, 상기 경쇄의 CDR3은 J 분절 및 접합 잔기를 포함하여, VJ 접합에 의해 암호화된다.

미성숙한 B 세포에서, 상기 V, D 및 J 유전자 분절은 모두 상기 생식계열 중에서 분리되어 존재하며 작용성 Ig 단백질의 발현에 사용될 수 없다. 대신에, B 세포가 성숙한 경우, 상기 유전자 분절은, 무작위로 선택된 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절, 또는 경쇄 V 및 J 유전자 분절을 근접하게 만드는 V(D)J 재조합으로서 공지된 복잡한 DNA 재배열 과정을 겪는다. 상기 V, D 및 J 유전자 분절의 결합 중에, V(D)J 재조합의 수행을 맡은 분자는 상기 분절들 사이에 뉴클레오타이드를 무작위로 가하거나 제거한다. 이렇게 하여, 완전한 가변 영역 엑손이 성숙한 B 세포의 게놈에서 생성되고 이어서 상기 엑손은 작용성 Ig 중쇄 및 경쇄 단백질을 암호화하는 mRNA 중의, C 영역을 암호화하는 것들을 포함하여, 다른 엑손과 결합한다.

V 영역 엑손을 제작하기 위한 상이한 V, D 및 J 유전자 분절의 무작위 조합, 및 상기 결합하는 유전자 분절들 간의 뉴클레오타이드의 무작위 첨가 또는 제거 모두 중요한 기전들이며, 이 기전을 통해서 면역계는 항원 결합 부위의 큰 다양성을 생성시킨다. 이러한 현상을 각각 조합 다양성 및 접합 다양성이라 칭한다. CDR3은 중쇄의 경우 V, D 및 J 분절에 의해 또는 경쇄의 경우 V 및 J 분절에 의해 기여된 서열들로부터 형성되기 때문에, 접합 다양성은 CDR3이 왜 상기 3 개의 CDR 중 가장 가변적이며 전형적으로 항원과 가장 광범위하게 접촉하는지의 이유를 설명한다.

Ig 분자의 구조는 본질적으로, 상이한 영역이 상이한 작용을 수행하는 모듈 구조이므로, GDF-8 결합 능력을 유지하는 항-GDF-8 항체의 단편 또는 유도체를 제조하는 것이 가능하다. 상기와 같은 단편 또는 유도체는 본 발명에 사용된 바와 같은 항체라는 용어에 의해 포함된다. Ig 분자로부터 제조된 항원 결합 단편 또는 유도체의 비제한적인 예는 VH, CH1, VL 및 CL 영역을 포함하는 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역을 통해 서로 결합된 2 개의 Fab를 포함하는 2가 단편인 F(ab')2; VH 및 CH1 영역을 포함하는 Fd 단편; VL 및 VH 영역을 포함하는 Fv 단편; VH 또는 VL 영역을 포함하는 dAb 단편을 포함한다. 또 다른 예는 단일 폴리펩타이드 쇄 중에 나란히 배열되고, 가변 영역들이 결합되게 하고 1가 항원 결합 부위를 형성되게 하는 폴리펩타이드 링커를 분리시키는 VH 및 VL 영역을 포함하는 단쇄 Fv 영역(scFv)이다. VH 영역이 VL 영역에 선행하거나, 한편으로, VL 영역이 VH 영역에 선행하는 단쇄 Fv 영역을 설계할 수도 있다. 링커의 비제한적인 예는 15-잔기(Gly₄Ser)₃ 펩타이드(서열번호 34)이다. 다른 링커들도 또한 가능하다. 다른 단편 또는 유도체는 Fab', 써로바디(surrobody), 다이설파이드-안정화된 Fv 항체(dsFv), 다이아바디, 트라이아바디, 및 단일 도메인 항체, 예를 들어 상어 항체 또는 카멜리드 항체 또는 나노바디를 포함한다. 다른 단편 또는 유도체도 또한 가능하다. 항원 결합 단편, 부분 또는 일부, 예를 들어 본 발명에 개시된 것들을 재조합적으로 또는 완전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해서 생성시킬 수도 있다.

예시적인 항-GDF-8 항체

GDF-8은 TGF-β 상과의 구성원인 성장 및 분화 인자-8을 지칭한다. 성숙한 인간 GDF-8의 아미노산 서열을 서열번호 1에 설명한다.

선행의 조사는 GDF-8에 특이적으로 결합하고 그의 생물 활성을 중화시키는 능력을 갖는 쥐 단클론 항체를 동정하였다. 상기 항체는 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 마우스 모델을 포함하여, 마우스에서 근육 질량 및 강도를 증가시키는 것으로 입증되었다. 전체 내용이 참고로 인용된 WO 2007/024535를 참조하시오. 상기 마우스 항체의 VH 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고 그의 VL 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 이들 VH 및 VL 영역을 각각 도 1A 및 도 1B에 도시하며, 도면에서 VH 및 VL 영역 CDR 각각의 아미노산 서열을 굵은 글씨체로 묘사한다. 카밧 및 AbM 넘버링 시스템 모두에서 각각의 VH 및 VL CDR과 관련된 서열번호들을 하기에 설명된 표 1에 나열한다. 카밧 넘버링 시스템 하에서 정의된 바와 같은 CDR H1, H2 및 H3을 각각 서열번호 10, 11 및 12로 지정한 반면, CDR L1, L2 및 L3은 각각 서열번호 13, 14 및 15로 지정한다. AbM 넘버링 시스템 하에서, CDR H1, H2 및 H3은 각각 서열번호 20, 21 및 22로 지정한 반면, CDR L1, L2 및 L3은 각각 서열번호 23, 24 및 25로 지정한다.

[표 1]

WO 2007/024535에 추가로 설명된 바와 같이, 상기 쥐 항체는 CDR 그래프트화에 의해 인간화되었다. 구체적으로, 상기 쥐 VH 영역을 인간 수용체 프레임워크(위로 쥐 VH CDR이 그래프트화된다)로서 인간 생식계열 가변 중쇄(VH) 유전자 DP47(VH3-23; 진뱅크 수탁 번호 AB019439)을 사용함으로써 인간화시켰다. 상기 DP47의 아미노산 서열(서열번호 33)을 도 1a에 나타낸다. 상기 쥐 VL 영역은 인간 수용체 프레임워크(위로 쥐 VL CDR이 그래프트화된다)로서 인간 생식계열 가변 경쇄(VL) 유전자 DPK9(O12m Vk1; 진뱅크 수탁 번호 X59315)를 사용하여 인간화시켰다. 상기 DPK9의 아미노산 서열(서열번호 32)을 도 1b에 나타낸다.

상기 DP47 및 DPK9 V 영역 서열들은, 재조합된 V 영역 유전자가 아닌, 상기 생식계열로부터 유래하였기 때문에, 상기 인간화 과정은 CDR3에 대한 각각의 부분적으로 인간화된 VH 및 VL 영역 카복시 말단의 아미노산 서열을 암호화하기 위해서 인간 J 유전자 분절의 선택이 또한 요구되었다. WO 2007/024535에 개시된 바와 같이, 상기 VH 영역(즉 DP47/JH3)의 경우 JH3 중쇄 J 분절(서열번호 35)을 사용하고 상기 VL 영역(즉 DPK9/JK1)의 경우 JK1 경쇄 J 분절(서열번호 39)을 사용하여 인간화를 완성하였다. 이들 J 분절 유전자들에 의해 암호화된 아미노산 서열들은 각각 도 1a 및 도 1b에 도시된 서열 정렬에서 VH CDR3 및 VL CDR3 바로 뒤에 출현한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, WO 2007/024535에 개시된 DP47 및 JH3을 사용하여 제작된 인간화된 항-GDF-8 항체 VH 영역을 VH1(서열번호 7)이라 칭하는 반면, DPK9 및 JK1을 사용하여 제작된 인간화된 항-GDF-8 항체 VL 영역은 VL1(서열번호 9)이라 칭한다. 또한 본 발명에 사용된 바와 같이, VH1 및 VL1을 포함하는 인간화된 항-GDF-8 항체는 OGD1.1.1이라 칭한다. 이러한 명명법에서, 상기 VH 영역 숫자는 항체명 "OGD1" 바로 뒤에 오고 VL 영역 숫자는 상기 VH 영역 바로 뒤에 온다. 따라서, 예를 들어, 항체명 OGD1.0.1은 VH0 영역 및 VL1 영역을 갖는 항체를 지칭할 것인 반면, 항체명 OGD1.1.0은 VH1 영역 및 VL0 영역을 갖는 항체를 지칭할 것이다. 마우스 VH 및 VL 영역, 인간화된 VH1 및 VL1 영역, 및 DPK9 및 DP47 유전자 서열에 의해 암호화된 아미노산간의 정렬을 도 1a 및 도 1b에 예시한다.

높은 친화성으로 GDF-8과 특이적으로 결합하고 GDF-8 활성을 중화시키는 능력을 유지하면서, OGD1.1.1에 비해 실질적으로 더 높은 수준으로 세포에 의해 발현되는 놀라운 성질을 갖는 인간화된 항-GDF-8 항체의 신규 버전을 본 발명에 개시한다.

이들 신규 항체의 몇몇 실시태양들에서, 상이한 중쇄 J 분절, 즉 JH4(진뱅크 수탁 번호 J00256)(서열번호 37)를 VH 영역에서 CDR3 다음에 사용하였다. 이러한 변화의 결과로서, Leu(L)가 VH1에 비해 카밧 넘버링 도해를 사용하여 VH 영역의 108 번 위치에서 Met(M)를 대체한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, L이 카밧 위치 108에 나타나는 상기 신규의 인간화된 VH 영역을 VH0이라 칭한다. VH0의 아미노산 서열(서열번호 44)을 도 1a의 서열 정렬에 예시한다.

상기 카밧 넘버링 도해는 가변적인 길이의 CDR을 가리키기 위해 동일한 숫자들 중 몇몇에 첨부된 문자를 사용하기 때문에, 폴리펩타이드 중 잔기들의 서열에서 잔기의 카밧 넘버와 그의 물리적 위치간에 1 대 1 대응이 반드시 존재하지는 않는다. 이 때문에, VH 영역의 카밧 위치 108은 서열번호 44(즉 VH0)의 아미노산 번호 111 및 본 발명에 개시된 다른 인간화된 VH 영역의 아미노산 서열과 동등하다.

본원의 항체의 다른 실시태양들에서, 상이한 경쇄 J 분절, 즉 JK4(진뱅크 수탁 번호 J00242)(서열번호 41)를 VL 영역에서 CDR3 다음에 사용하였다. 이러한 변화의 결과로서, Gly(G)가 VL1에 비해 카밧 넘버링 도해를 사용하여 VL 영역의 100 번 위치에서 Gln(Q)을 대체한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, G가 카밧 위치 100에 나타나는 상기 신규의 인간화된 VL 영역을 VL0이라 칭한다. VL0의 아미노산 서열(서열번호 46)을 도 1b의 서열 정렬에 예시한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, VH0을 포함하는 중쇄 및 VL0을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화된 항-GDF-8 항체를 OGD1.0.0이라 칭한다.

상술한 VH 및 VL 실시태양과 관련된 유전자 분절, 서열 및 용어를 하기 표 2에 요약한다.

[표 2]

실시예에 추가로 개시된 바와 같이, 놀랍게도, VH0을 포함하는 항-GDF-8 항체는 VH1을 포함하는 항-GDF-8 항체에 비해 훨씬 더 높은 수준으로 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 실시예 1에 개시된 하나의 비제한적인 실시태양에서, 놀랍게도 VH0 및 VL0을 포함하는 완전한 면역글로불린(즉 OGD1.0.0)은 VH1 및 VL1을 포함하는 유사한 항체(즉 OGD1.1.1)보다 12 배 더 큰 수준으로 일시적으로 발현됨이 입증되었다. 안정한 발현 수준도 또한 실시예 2에 논의된 바와 같이, 훨씬 더 높았다. 흥미롭게도, 실시예 3에서 탐구된 바와 같이, 증대된 발현은 VH0이 VL0 또는 VL1과 짝을 이루는지의 여부와 관계 없이 발생하고 오직 VL0이 VH0(VH1은 아닌)과 짝을 이룬 경우에만 발생하기 때문에, VH0의 존재에 기인할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

몇몇 실시태양들에서 본원의 항체는 가변 중쇄 영역이 VH0이고 가변 경쇄 영역은 VL0(OGD1.0.0) 또는 VL1(OGD1.0.1)인 전장 중쇄 및 경쇄를 포함하는 완전한 이종사량체성 Ig 분자인 반면, 다른 실시태양들에서, 상기 항체는 상기와 같은 전장 항체의 GDF-8 특이성 결합 단편 또는 유도체이다.

일부 실시태양들에 따라서, 본원의 항체의 VH 영역은 3 개의 중쇄 CDR, 즉 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하며, 서열번호 44의 아미노산 서열 또는 그의 마우스 대응물, 서열번호 3 중에 존재하고, 여기에서 카밧 위치 108에서 아미노산은 류신이다. 다른 실시태양들에서, 상기 VH 영역은 서열번호 44의 아미노산 서열(즉 VH0)을 포함한다. 다른 실시태양들에서, 본원의 항체의 VL 영역은 3 개의 경쇄 CDR, 즉 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하며, 서열번호 46의 아미노산 서열 또는 그의 마우스 대응물, 서열번호 5 중에 존재하고, 여기에서 카밧 위치 100에서 아미노산은 글리신 또는 글루타민이다. 다른 실시태양들에서, 상기 VL 영역은 서열번호 46(즉 VL0) 또는 서열번호 48(즉 VL1)의 아미노산 서열을 포함한다.

본원의 항체에서, 상기 항체 중쇄 아이소타입은 인간 Ig 아이소타입 또는 하위유형들 중 어느 하나, 즉 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM일 수 있다. 상기 항체 경쇄 아이소타입은 카파 또는 람다일 수 있다. 특정한 비제한적인 실시태양들에서, 상기 항체 불변 중쇄는 서열번호 19 또는 서열번호 57의 아미노산 서열이며, 이들 서열은 모두 IgG1 하위유형이다. 서열번호 19는 힌지 영역 중에 면역 세포상의 Fc 수용체에 대한 결합을 방지하는 2 개의 치환 돌연변이를 함유하는 반면, 서열번호 57은 총 3 개의, 유사한 표현형을 갖는 추가의 힌지 영역 돌연변이를 함유한다. 또 다른 특정한 비제한적인 실시태양에서, 경쇄 CH 영역은 서열번호 17의 아미노산 서열이며, 카파 아이소타입이다.

본원의 특정한 비제한적인 실시태양에서, 항-GDF-8 항체는 서열번호 58의 아미노산 서열에 따른 전장 항체 중쇄 및 서열번호 59의 아미노산 서열에 따른 전장 항체 경쇄를 포함한다. 전자의 서열은 VH0 및 서열번호 57의 아미노산 서열의 중쇄 불변 영역을 포함하는 반면, 후자의 서열은 VL0 및 서열번호 17의 아미노산 서열의 경쇄 카파 불변 영역을 포함한다. 또 다른 예시적인 비제한적인 실시태양에 따라, 본원의 항-GDF-8 항체는 서열번호 58 및 서열번호 59의 아미노산 서열에 따른 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어진 완전한 이종사량체성 항체(즉 OGD1.0.0)를 포함한다.

상기 서술된 바와 같이, 더욱 다른 실시태양들에서, 본원의 항체는 VH0을 포함하는 항-GDF-8 면역글로불린의 항원 결합 단편 또는 유도체를 포함한다. 상기 단편 또는 유도체의 몇몇 실시태양에서, VH0은 VL0 또는 VL1과 짝을 이룰 수 있다. 본원에 따른 비제한적인 단편 또는 유도체의 예는 VH0을 포함하는, Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, scFv, dsFv, 다이아바디, 트라이아바디, 및 단일 도메인 항체, 예를 들어 상어 항체 또는 카멜리드 항체 또는 나노바디를 포함한다. 다른 단편 또는 유도체도 또한 가능하다. 본원에 따른 Ig 유도체의 특정한 비제한적인 예는 서열번호 63, scFv(여기에서 VL0은 VH0에 대해 나란히 배열된 아미노 말단이다)를 포함한다. 또 다른 비제한적인 예는 서열번호 65, scFv(여기에서 V 영역은 역전되며, VH0은 VL0에 대해 나란히 배열된 아미노 말단이다)이다.

본원의 항체를, 쥐 항-GDF-8 항체의 중쇄 CDR이 인간 생식계열 VH 영역 DP47상에 그래프트화된 면역글로불린에 의해 예시하지만, 본원의 인간화된 항-GDF-8 항체를 오직 상기 가변 영역의 사용만으로 제한하지 않는다. 따라서, 예를 들어, 항체는 쥐 중쇄 CDR(즉 서열번호 10 내지 12 또는 20 내지 22)이 DP47과 상이한 인간 VH 영역상에 그래프트화되고 생성되는 VH 영역 폴리펩타이드가 카밧 위치 108에서 Leu(L)를 포함하도록 추가로 변형된 완전한 면역글로불린 및 그의 단편 또는 유도체를 또한 포함한다. 다른 인간 생식계열 VH 영역의 서열은 진뱅크 또는 다양한 공개적으로 접근할 수 있는 인터넷 데이터베이스, 예를 들어 VBASE(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 또는 VBASE2(http://www.vbase2.org/)를 탐색하여 찾을 수 있다.

실시예 10에 추가로 개시된 바와 같이, 각각 GDF-8에 결합된 서열번호 3 및 서열번호 5의 쥐 VH 및 VL 영역을 포함하는 OGD1.0.0 및 키메릭 항-GDF-8 항체의 공-결정 구조를 분석하여, 항원 결합을 맡고 있는 항체 중의 접촉 잔기들을 확인하기 위해 사용하였다. 상기 정보를 사용하여, 실시예 11에 추가로 설명된 바와 같이, VH 및 VL 영역을, 인간 생식계열 가변 서열 중 동일 위치에 존재하는 잔기들을 합치시키기 위해 CDR 중의 비-접촉 잔기들을 돌연변이시킴으로써 추가로 인간화하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 추가로 인간화된 가변 중쇄 영역을 VH2, VH3, VH4 및 VH5라 칭한다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 상기 추가로 인간화된 가변 경쇄 영역을 VL2, VL3, VL4 및 VL5라 칭한다.

본원의 항체의 몇몇 실시태양들에서, 상기 인간화된 VH 영역 중 어느 하나를 상기 인간화된 VL 영역 중 어느 하나와 짝을 지어 완전한 항-GDF-8 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 또는 유도체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, VH0을 상기 VL 영역 VL0, VL1, VL2, VL3, VL4 및 VL5 중 어느 하나와 짝을 지을 수 있다. 다른 실시태양에서, VH1을 상기 VL 영역 VL0, VL1, VL2, VL3, VL4, 및 VL5 중 어느 하나와 짝을 지을 수도 있다. 다른 실시태양에서, VH2를 상기 VL 영역 VL0, VL1, VL2, VL3, VL4 및 VL5 중 어느 하나와 짝을 지을 수도 있다. 다른 실시태양에서, VH3을 상기 VL 영역 VL0, VL1, VL2, VL3, VL4 및 VL5 중 어느 하나와 짝을 지을 수도 있다. 다른 실시태양에서, VH4를 상기 VL 영역 VL0, VL1, VL2, VL3, VL4 및 VL5 중 어느 하나와 짝을 지을 수도 있다. 몇몇 다른 실시태양에서, VH5를 상기 VL 영역 VL0, VL1, VL2, VL3, VL4 및 VL5 중 어느 하나와 짝을 지을 수도 있다.

상기에 설명된 바와 같이, CDR 및 프레임워크 영역내 비-접촉 잔기의 돌연변이는 GDF-8 결합 특이성 및/또는 친화성에 최소로 영향을 미치는 것으로 예상되는 반면, 접촉 잔기의 돌연변이는 큰 영향을 미칠 것으로 예상된다. 돌연변이, 특히 접촉 잔기의 돌연변이는 결합 특이성 및/또는 친화성을 감소시킬 수 있지만, 일부의 경우에 돌연변이는 GDF-8에 대한 특이성 및/또는 친화성을 증가시킴이 관찰될 것이다. 임의의 특정 돌연변이의 특이성 또는 친화성에 대한 실제 영향을 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 친숙한 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 또는 다른 기법을 사용하여 측정할 수 있다.

상기 원리들에 비추어, 몇몇 실시태양들에서, 본원의 항체의 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 또는 프레임워크 영역내 1, 2, 3 또는 그 이상의 비-접촉 잔기들을 상이한 아미노산 잔기로 보존적으로 또는 비-보존적으로 치환시킬 수 있으며 GDF-8에 대한 실질적인 특이성 및 결합 친화성을 유지시킬 수 있다. 다른 실시태양들에서, 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR내 1, 2, 3 또는 그 이상의 접촉 잔기를 보존적으로 치환시킬 수 있으며 실질적인 GDF-8 특이성 및 결합 친화성을 유지시킬 수 있다. 더욱 다른 실시태양들에서, 비-접촉 잔기 또는 접촉 잔기의 돌연변이는 GDF-8에 대한 개선된 특이성 및/또는 친화성을 생성시킨다.

본원의 항체의 다른 실시태양들에서, 상기 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열은 본 발명에 구체적으로 인용된 서열들과 다양한 백분율로 상이할 수 있으며 GDF-8에 대한 실질적인, 또는 심지어 개선된 특이성 및/또는 친화성을 유지할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양들에서, 본원의 항-GDF-8 항체의 VH 영역은 VH0, VH1, VH2, VH3, VH4 또는 VH5의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%까지 상이할 수 있다. 다른 실시태양들에서, 본원의 항-GDF-8 항체의 VL 영역은 VL0, VH1, VH2, VH3, VH4 또는 VH5의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%까지 상이할 수 있다. 더욱 다른 실시태양들에서, 상기 항-GDF-8 항체의 VH 및 VL 영역은 실질적인, 또는 심지어 개선된 GDF-8 특이성 및/또는 결합 친화성을 유지하면서, 본 발명에 구체적으로 인용된 것들과 유사한 백분율까지 상이할 수 있다.

본원의 항체를 또한 그의 성질을 변경시키거나 그의 작용을 개선시키기 위해 유도체화하거나, 공유적으로 변형시키거나, 다른 분자에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 유도체화된 항체는 예를 들어 글리코실화, 퓨코실화, 아세틸화, peg화, 인산화, 아미드화, 폼일화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합 등에 의해 변형된 항체를 포함한다.

일부 실시태양들에서, 본 발명의 항-GDF8 항체의 중쇄의 C-말단 리신을 절단하고 제거할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 몇몇 실시태양에서, 항-GDF-8 항체는 C-말단 리신이 없는 서열번호 19 또는 서열번호 57의 중쇄 불변 영역을 포함하거나, C-말단 리신이 없는 서열번호 58의 항체 중쇄를 포함할 수 있다.

항-GDF-8 항체의 구조에 대한 몇몇 변형은 상기 항체가 생산되는 세포의 유형의 결과로서 자연적으로 발생할 수 있다. 비제한적인 예에서, 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 항체의 합성은 상기 항체 쇄 중의 하나 이상의 아미노산에서의 글리코실화를 생성시킬 수 있다. 항-GDF-8 항체의 예시적인 비제한적인 실시태양에서, 중쇄 중의 아미노산 N296이 글리코실화된다. 다른 부위에서의 글리코실화가 또한 가능할 수도 있다. 통상적인 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 다른 유형의 세포, 예를 들어 세균 세포에서의 항체의 생산은 글리코실화되지 않은 항체 쇄를 생성시킬 수 있다. 다른 유형의 항체 변형은 자연적으로, 또는 항체 정제 도중에 또는 정제 후에 겪은 화학적 또는 효소적 변형을 통해 비-자연적으로 발생할 수 있다.

한편으로, 상기 가변 또는 불변 영역 중 특정한 아미노산들을 변경시켜 작용을 변화시키거나 개선시킬 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 항체의 Fc 영역 중 아미노산 잔기를, FcRn에 대한 그의 결합을 증가시킴으로써 상기 항체의 혈청 반감기가 증가하도록 변경시킬 수 있다. 예를 들어 WO 2000/009560(본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 다른 비제한적인 예에서, 항체 아미노산을, Ig 생물학적 효과기 작용을 매개하는 하나 이상의 Fc 수용체, 보체, 또는 다른 면역 수용체에의 결합을 감소시키도록 변화시킬 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, CDR, 프레임워크 영역 또는 불변 영역 중 아미노산을, GDF-8 결합 친화성을 증가시키거나 면역원성을 감소시키도록 변화시킬 수 있다. 특정한 비제한적인 예에서, 본원의 항체의 VH 또는 VL 영역의 몇몇 인간 프레임워크 잔기를 각각 서열번호 26 및 서열번호 27의 아미노산 서열에서와 같이 그들의 쥐 대응물로 역 변화시킬 수도 있다.

다른 실시태양들에서, 항체를, 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 친숙한 방법에 따라, 검출가능한 부분으로 표지하고 검출할 수 있다. 상기와 같은 표지를 본원의 항체에 직접 또는 간접적으로 접합시킬 수 있다. 상기 표지는 자체가 직접 검출가능하거나(예를 들어 방사성핵종 또는 형광 표지), 또는 검출가능한 분자를 생성시키는 그의 능력에 의해 간접적으로 검출가능할 수 있다(예를 들어 직접 검출가능한 생성물을 생성시키는 기재를 촉매화하는 효소 표지). 검출가능한 표지의 예는 효소(예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제 등), 보결분자단(예를 들어 비오틴 등), 형광 염료 또는 부분(예를 들어 FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 발광 부분, 생물발광 부분, 방사성핵종(예를 들어 ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I 등), 양전자 방출 원자 또는 이온, 자기 원자 또는 이온, 상자성 금속 원자 또는 이온, 또는 다른 항체들에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 펩타이드 에피토프를 포함한다. 일부 실시태양들에서, 표지를 다양한 길이의 이격자를 사용하여 부착시켜 항원 결합 부위와의 잠재적인 입체 장애를 감소시키거나 방지할 수도 있다.

본원의 항체를 포유동물 단백질의 발현을 지속시킬 수 있는 임의의 세포 유형으로부터의 배양물 또는 동물 중에서 발현시킬 수 있다. 비제한적인 예는 인간 세포, 마우스, 래트 또는 다른 설치류 세포, 다른 포유동물 세포, CHO 세포, 효모 세포 또는 다른 진균의 세포, 식물 세포, 또는 세균 세포를 포함한다. Ig 분자, 또는 그의 단편 또는 유도체를 암호화하는 DNA를 발현 벡터내로 클로닝하고 이어서 세포를 상기와 같은 벡터로 일시적으로 또는 안정하게 형질감염시키기에 유용한 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 항체 발현 수준을 최대화하기 위해서 배양 조건들을 변경시킬 수 있다. 항체를 또한 통상적인 숙련가들에게 친숙한 기법을 사용하여 동물에서 발현시키고, 이어서 우유 또는 다른 체액으로부터 정제시킬 수 있다. 항체는 또한 완전히 또는 부분적으로 합성될 수도 있다.

본원의 항체는 GDF-8과 높은 친화성으로, 예를 들어 약 1 x 10^-6 M, 1 x 10^-7 M, 1 x 10^-8 M, 1 x 10^-9 M, 1 x 10^-10 M, 1 x 10^-11 M 이상의 평형 해리 상수(K_D)로 결합한다. GDF-8에 대한 항-GDF-8 항체의 K_D를 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 친숙한 다양한 방법들에 따라 측정할 수 있다. 상기와 같은 기법의 비제한적인 예는 표면 플라스몬 공명(SPR) 및 ELISA를 포함한다. 통상적인 숙련가들에게 친숙한 바와 같이, 결합활성 효과로 인해, 2 개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 항-GDF-8 항체의 겉보기 결합 친화성은 1가 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편보다 더 클 수 있다.

본원의 항체는 GDF-8에 특이적이기 때문에, 상기와 같은 항체는 인식된 에피토프 또는 에피토프들에 따라, GDF-11로서 공지된 밀접하게 관련된 성장 및 분화 인자와 높은 친화성으로 또한 결합할 수 있다. 따라서, GDF-8에 특이적인 항체는 GDF-11 분자에 결합할 수 있는 항체를 반드시 제외시키는 것은 아니다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 중화 항-GDF-8 항체는 비-특이적인 대조용 항체 또는 다른 적합한 대조군에 비해 GDF-8의 생물 활성을 감소시키는 것이다. 임의의 특정한 작동 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 적어도 항-GDF-8 항체가 GDF-8에 의해 매개되는 생물학적 작용을 중화시킬 수 있는 한 가지 방식은 성숙한 GDF-8의, 그의 높은 친화성 수용체, 예를 들어 ActRIIB, 또는 그의 낮은 친화성 수용체들 중 하나 이상에 대한 결합을 방지하는 것이다. 그러나, 항-GDF-8 중화 항체가 GDF-8 생물 활성을 방해할 수 있는 다른 기전들도 가능하다.

본원의 중화 항체에 의해 감소될 수 있는 GDF-8에 의해 매개되는 다수의 생물 활성들은 당해 분야에 공지되어 있다. 비제한적인 예는 ActRIIB에 대한 GDF-8 결합(이는 예를 들어 ELISA 기재 분석을 사용하여 측정될 수 있다)을 포함한다. 또 다른 예는 세포 신호전달 경로의 GDF-8에 의한 활성화를 포함하며, 상기 활성화는 예를 들어 소위 CAGA 요소를 포함하는 형질감염된 리포터 유전자를 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어 문헌[Lee, et al., Regulation of muscle growth by multiple ligands signaling through activin type II receptors, PNAS (2005) 102:18117-18122] 및 문헌[Thies, et al., GDF-8 Propeptide Binds to GDF-8 and Antagonizes Biological Activity by Inhibiting GDF-8 Receptor Binding, Growth Factors (2001) 18:251-59](이들은 참고로 인용된다)을 참조하시오. 더욱 또 다른 예는 세포 표면에서 GDF-8 수용체로부터 핵내로 GDF-8 매개된 신호전달의 운반을 맡고 있는 SMAD 단백질의 인산화를 포함한다. 예를 들어 문헌[Philip, et al., Regulation of GDF-8 signaling by the p38 MAPK, Cellular Signalling (2005) 17:365-375](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. SMAD 단백질의 인산화를, 예를 들어 항-포스포-SMAD 항체를 사용하여 정량적인 웨스턴 블럿팅으로 검출할 수 있다. GDF-8에 의해 통상적으로 활성화되거나 억제되는 유전자의 하류 유전자 발현의 변조를 또한 검출할 수 있다. 본 발명의 중화 항체를 사용하여 감소시킬 수 있는 GDF-8 매개된 활성의 더욱 또 다른 예는 근육 질량 또는 강도의 음의 조절이다. 다른 활성들도 또한 가능하다.

본원의 중화 항체는 GDF-8에 의해 매개되는 생물 활성을, 통상적인 숙련가들에 친숙한 변수, 예를 들어 항체 및 항원 농도 및 결합 친화성뿐만 아니라 다른 변수들에 따라 다양한 정도로 감소시킬 수 있다. GDF-8에 대한 항체 결합에 의해 유발되는 GDF-8 매개된 생물 활성의 예시적인 비제한적인 백분율 감소는 적합한 대조군에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상의 감소를 포함한다.

GDF-8 매개된 생물 활성의 항-GDF-8 항체에 의한 억제를 편의상 선택된 임의의 분석 조건 하에서 상기 생물 활성의 50%를 억제시킬 수 있는 상기와 같은 항체의 농도로서 나타낼 수 있다. 상기 농도를 또한 IC₅₀이라 칭한다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 항-GDF-8 항체는 약 500 nM, 250 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM 이하의 IC₅₀ 값을 갖는다.

분비성 리더 서열

몇몇 실시태양들에 따라서, 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에, 새로 합성된 단백질을 분비성 구획으로 향하게 하는 아미노-말단 분비성 리더 펩타이드를 암호화하는 서열을 제공할 수 있다. 이어서 번역-후 가공은 상기 리더 펩타이드를 성숙한 항체가 세포로부터 분비되기 전에 제거한다. 본원의 항체의 특정한 비제한적인 실시태양들에서, VH0, VH1, VL0 및 VL1 영역에 19 아미노산 길이의 분비성 리더 펩타이드를 제공한다. 리더 서열을 포함하는 이들 V 영역에 하기의 서열 식별 번호를 지정한다: VH0(서열번호 50); VL0(서열번호 52); VH1(서열번호 54); 및 VL1(서열번호 56). 다른 분비성 리더 서열들을 또한 사용할 수 있다. 비제한적인 예는 쥐 VH 영역 및 그의 리더 서열의 처음 19 아미노산(서열번호 29) 및 쥐 VL 영역 및 그의 리더 서열의 처음 20 아미노산(서열번호 31)을 포함한다.

항-GDF-8 항체 발현

실시예들에 보다 상세히 설명된 바와 같이, OGD1.0.0은 포유동물 세포에서 OGD1.1.1에 비해 실질적으로 보다 높은 수준으로 발현되었다. 예를 들어 OGD1.0.0 및 OGD1.1.1이 일시적으로 형질감염된 COS 세포에서 발현되었을 때, OGD1.0.0은 OGD1.1.1에 비해 약 12 배 더 높은 수준으로 발현되었다. 유사하게, 이들 항체가 안정하게 형질감염된 CHO 세포에서 발현되었을 때, OGD1.0.0은 OGD1.1.1에 비해 약 6 배 더 높은 수준으로 발현되었다. 또한 실시예들에 설명된 바와 같이, 발현 수준의 차이는 주로 VH1 대신에 VH0의 항체 중 존재에 기인하는 듯하다.

따라서, VH0을 포함하는 본원의 항체들은 유사한 조건 하에서 발현 시 VH1을 포함하는 유사한 항체들에 비해 더 큰 발현을 나타낸다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, VH0을 포함하는 항체의 발현 수준은 유사한 조건 하에서 발현되는 VH1을 함유하는 유사한 항체의 경우보다 약 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 11 배, 12 배, 13 배, 14 배, 15 배, 20 배, 30 배 이상인 양만큼 더 크다. 상기 항체들 간의 발현 수준의 차이 정도는, 예를 들어 상기 항체의 발현에 사용된 숙주 세포의 유형, 예를 들어 COS 세포 또는 CHO 세포에 따라, 또는 상기 숙주 세포가 일시적으로 또는 안정하게 형질감염되었는지에 따라 변할 수 있다. VH0 또는 VH1 가변 중쇄 영역을 함유하는 항체의 상대적인 발현 수준은 다른 성장 조건들이 변함에 따라 변할 수 있으며 이를 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 친숙한 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

다른 실시태양들에서, VH0 항체 발현의 수준은 유사한 조건 하에서 발현되는 VH1을 함유하는 유사한 항체의 경우보다 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1100%, 1200%, 1300%, 1400%, 1500%, 1600%, 1700%, 1800%, 1900%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% 또는 그 이상인 양만큼 더 크다. 발현 수준의 다른 차이들, 예를 들어 본 발명에 인용된 백분율들간의 차이가 또한 가능하다.

항체 발현 수준을 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 친숙한 기법을 사용하여 측정할 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 항체 발현 수준을 정량적인 ELISA 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 다른 정량적인 분석을 또한 통상적인 숙련가들의 지식에 따라 사용할 수 있다.

항-GDF-8 항체를 암호화하는 핵산 분자

본원은 또한 항-GDF-8 항체를 암호화하는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 핵산은 DNA 핵염기 서열 중 U가 T를 대체한 DNA 또는 RNA를 포함한다. 핵산은 또한 변형, 예를 들어 비-표준 핵염기(예를 들어 5 메틸시토신) 또는 변형된 주쇄(예를 들어 포스포로티오에이트)를 함유할 수 있다. 다른 변형들도 가능하다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산을 천연 공급원, 예를 들어 세포 또는 완전한 유기체로부터 수득할 수 있다. 천연 공급된 핵산의 비제한적인 예는 게놈 DNA, 증폭된 플라스미드 DNA 또는 mRNA를 포함한다. 한편으로, 핵산을 합성할 수도 있다. 합성 핵산의 비제한적인 예는 cDNA, PCR 산물 또는 핵산 합성기 상에서 합성된 핵산을 포함한다.

몇몇 실시태양들에서, 본원의 핵산은 VH0을 포함하는 항체 중쇄, 또는 그의 단편 또는 유도체의 아미노산 서열을 암호화한다. 다른 실시태양들에서, 핵산은 VL0을 포함하는 항체 경쇄 또는 그의 유도체 또는 단편의 아미노산 서열을 암호화한다. 더욱 다른 실시태양들에서, VH0 및 VL 영역, 예를 들어 VL0 또는 VL1을 암호화하는 핵산 서열은 상이하거나 동일한 단리된 폴리뉴클레오타이드 중에 존재한다.

본원은 항-GDF-8 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체를 암호화하는 특정한 핵산 서열을 제공하지만, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 유전자 암호의 변성으로 인해 상기와 같은 서열은 단지 예시적이며 제한으로서 해석해서는 안 됨을 알 것이다. 따라서, 쥐 항-GDF-8 항체의 VH 및 VL 영역을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 각각 서열번호 2 및 서열번호 4이다. VH1을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 6 및 서열번호 47이다. VL1을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 8 및 서열번호 48이다. VH0을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 43이다. VL0을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 45이다. 2 개의 힌지 영역 돌연변이를 함유하는 IgG1의 CH 영역을 포함하는, 서열번호 19의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 18이다. 인간 카파 CL 영역을 포함하는, 서열번호 17의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 16이다. 리더 서열이 붙어있는 쥐 항-GDF-8 항체의 VH 및 VL 영역을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 각각 서열번호 28 및 서열번호 30이다. 리더 서열이 붙어있는 VH0, VL0, VH1 및 VL1 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 각각 서열번호 49; 서열번호 51; 서열번호 53 및 서열번호 55이다.

몇몇 실시태양들에 따라서, 핵산 분자는 하기의 서열번호들 중 어느 하나의 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다: 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 50, 52, 54, 56, 57, 58, 59, 63 또는 65. 다른 실시태양들에서, 핵산 분자는 서열번호 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 50, 52, 54, 56, 57, 58, 59, 63 또는 65와 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 일치하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 더욱 다른 실시태양에서, 핵산 분자는 VH0(서열번호 44)과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 일치하고 카밧 위치 108이 류신인 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.

몇몇 실시태양들에 따라서, 핵산 분자는 하기의 서열번호 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다: 6, 8, 16, 18, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 48, 49, 51, 53, 55, 62 또는 64. 다른 실시태양들에서, 핵산 분자는 서열번호 6, 8, 16, 18, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 48, 49, 51, 53, 55, 62 또는 64의 핵산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 일치하는 핵산 서열을 포함한다. 더욱 다른 실시태양들에서, 핵산 분자는 고도로 엄격한 조건 하에서 서열번호 6, 8, 16, 18, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 48, 49, 51, 53, 55, 62 또는 64의 핵산 서열들에 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함한다.

고도로 엄격한 하이브리드화 조건의 비제한적인 예는 65 ℃에서 1xSSC, 또는 42 ℃에서 1xSSC 및 50% 폼아미드에서 하이브리드화에 이어서, 65 ℃에서 0.3xSSC에서 세척인 상기 핵산의 배양이다. 엄격성 조건의 추가적인 예는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chs. 9 & 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)](본 발명에 참고로 인용된다)에 제공되어 있다.

당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, 본원의 핵산 중 몇몇은 함께 인-프레임 연결되어 복합 핵산 서열을 생성시킬 수도 있다. 예를 들어, VH0을 암호화하는 핵산을 CH 영역을 암호화하는 핵산에 인-프레임 연결시켜 완전 중쇄를 암호화하는 복합 핵산을 생성시킬 수 있다. 비제한적인 예에서, VH0을 암호화하는 서열번호 43의 핵산 서열을, 효과기 작용에 영향을 미치는 3 개의 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 중쇄의 불변 부분인 서열번호 57의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열과 인프레임 연결시킬 수 있다. 다른 연결들이 본 발명에 개시된 핵산의 다른 복합체들을 생성시키는 바와 같이, 경쇄를 생성시키는 유사한 연결이 가능하다.

벡터

본원의 핵산을 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 널리 공지된 기법을 사용하여 벡터에 통합시킬 수 있다. 벡터는 몇몇 실시태양에서 플라스미드, 일반적으로 세균 플라스미드, 진핵생물 에피솜, 효모 인공 염색체 및 바이러스 게놈을 포함한다. 예시적인 비제한적인 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 및 식물 바이러스, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스, 및 담배 모자이크 바이러스를 포함한다. 다른 유형의 벡터들도 가능하다. 일부 실시태양들에서, 벡터는 적합한 숙주에서 자발적인 복제가 가능하다. 다른 실시태양들에서, 벡터는 숙주에서 염색체 외에서 유지되거나 숙주의 게놈에 통합되어 상기 벡터가 상기 숙주의 게놈과 함께 복제되게 할 수 있다. 유전자 및 상기 유전자의 전사 및 번역을 유지시키기에 충분한 조절 서열을 포함하는 벡터를 발현 벡터라 칭한다. 본원에 따른 벡터를 당해 분야의 통상적인 숙련가들의 지식에 따라, Ig 유전자의 발현을 지지할 수 있는 임의의 세포 유형, 예를 들어 세균 세포, 다른 원핵생물 세포, 효모 세포, 다른 진균 세포, 식물 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, CHO 세포, 및 인간 세포 등에서 작용하도록 선택하거나 설계할 수 있다.

벡터는 하나 이상의 조절 서열을 임의로 함유할 수도 있다. 몇몇 조절 서열은 복제의 기원과 같이, 복제를 허용한다. 다른 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 부위와 같이 전사를 조절하거나 조정한다. 프로모터 또는 인핸서의 비제한적인 예는 레트로바이러스 LTR, 거대세포바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어 아데노바이러스 주요 말기 프로모터(AdMLP)), 또는 폴리오마 바이러스로부터 유도된 것들이다. 추가의 예는 조직 특이성 프로모터 및 인핸서, 구성적으로 활성인 프로모터 및 인핸서, 유도성 프로모터 및 인핸서, Ig 유전자 프로모터 및 인핸서 및 액틴 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 다른 프로모터 및 인핸서도 또한 가능하다.

몇몇 조절 서열들은 전사-후 RNA 가공, 예를 들어 연접 및 폴리아데닐화 신호, 또는 mRNA 안정성을 증가시키거나 감소시키는 신호를 조절하거나 조정한다. 더욱 다른 조절 서열은 번역 개시 서열(예를 들어 코작 공통 서열)과 같이 단백질 번역, 숙주 세포 밖으로 유전자 산물의 분비를 향하게 하는 신호 펩타이드 서열과 같이 전사-후 가공, 또는 단백질 안정성을 조절하거나 조정한다. 신호 펩타이드 서열은 면역글로불린으로부터 또는 상기 Ig 상과의 부분이 아닌 분비된 단백질로부터 유도될 수 있다. 다른 조절 서열들도 또한 가능하다.

벡터는 또한 선택성 마커 유전자를 포함하여, 상기 벡터를 흡수한 숙주 세포의 선택을 허용할 수 있다. 비제한적인 예는 약물 내성 표현형을 부여하는 선택성 마커 유전자, 예를 들어 다이하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(DHFR)(메토트렉세이트를 사용하여 선택을 허용하는 dhfr^- 숙주 세포에서 사용하기 위해서), neo 유전자(G418 또는 유사 약물에 의한 선택을 허용한다), hph 유전자(하이그로마이신 B에 의한 선택을 허용한다), 및 글루타메이트 신시타제 유전자(메티오닌 설폭스이민에 의한 선택을 허용한다)를 포함한다.

일부 실시태양들에서, 벡터는 단일 Ig 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편(그러나 동일한 벡터에서 상기 두 쇄를 모두 암호화하지는 않는다)을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기와 같은 벡터로부터 완전한 항체의 발현은 상기 중쇄 및 경쇄를 포함하는 별도의 벡터들을 동일한 세포에 도입시킴을 포함한다. 다른 실시태양들에서, 벡터는 Ig 중쇄 및 경쇄 모두, 또는 그의 항원 결합 단편을 동일한 벡터에서 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본원의 핵산 분자, 또는 상기와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 항체 발현을 지지할 수 있는 하나 이상 유형의 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 핵산 또는 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 방법은 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 비제한적인 예는 표적 숙주 세포의 일시적이고 안정한 형질감염, 형질전환, 형질도입 및 바이러스 감염을 포함한다. 다른 예는 덱스트란-매개된 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션, 폴리뉴클레오타이드의 리포솜 중의 캡슐화, 및 DNA의 핵내로의 직접 미세주사를 포함한다. 예시적인 비제한적인 방법들이 예를 들어 미국특허 제 4,399,216 호, 미국특허 제 4,912,040 호, 미국특허 제 4,740,461 호, 및 미국특허 제 4,959,455 호(이들은 참고로 인용된다)에 논의되어 있다. 식물 세포의 형질전환 방법들, 예를 들어 아그로박테리움-매개된 형질전환, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환, 직접 주사, 일렉트로포레이션 및 바이러스 형질전환이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 세균 및 효모 세포의 형질전환 방법들이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

숙주 세포

몇몇 실시태양들에서, 본원의 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체를 암호화하는 핵산을 발현을 목적으로 적합한 숙주 세포에 도입시킨다. 항체를 발현시킬 수 있는 세포는 세균, 진균, 식물, 동물 및 포유동물 세포를 포함한다. 다른 유형의 세포들을 또한 숙련가의 지식에 따라 사용할 수 있다.

항체 발현을 위한 숙주로서 적합한 포유동물 세포주는 당해 분야에 공지되어 있다. 예시적인 비제한적인 예는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 또는 다른 출처로부터 입수할 수 있는 몇몇 불멸화된 세포주, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(예를 들어 COS, CV-1 또는 Vero 세포), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어 HepG2), A549 세포, A431 세포, HeLa 세포, L 세포, BHK21 세포, HL-60 세포, U937 세포, HaK 세포, 주르캣 세포 등을 포함한다. 항체 발현을 위한 숙주로서 적합한 다른 동물, 곤충 또는 포유동물 세포들도 가능하다.

다른 실시태양들에서, 곤충, 식물, 세균 또는 진균으로부터의 세포주를 사용할 수 있다. 예시적인 비제한적인 곤충 세포는 Sf9 또는 Sf21 세포를 포함하며, 이들은 종종 바큘로바이러스 벡터 발현 시스템과 함께 사용된다. 예시적인 비제한적인 식물 세포는 담배, 아기장대, 좀개구리밥, 옥수수, 밀 및 감자 종으로부터의 것들을 포함한다. 예시적인 비제한적인 세균은 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 티피뮤리움 및 스트렙토마이세스 균주를 포함한다. 예시적인 비제한적인 진균은 스키조사카로마이세스 폼베, 사카로마이세스 세레비지아에, 피키아 파스토리스, 클루이베로마이세스 효모 균주 및 칸디다 효모 균주를 포함한다. 다른 곤충, 식물, 세균 및 진균 세포가 가능하다.

항체 발현에 기여하는 조건 하에서 상이한 유형의 숙주 세포를 성장시키고 유지시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 항체 발현이 일어난 후에, 상기와 같이 발현된 항체를 이어서 숙련가의 지식에 따라 상기 숙주 세포로부터 정제할 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체를 상기 숙주 세포가 성장한 배지로부터 정제할 수 있다. 한편으로, 일부 실시태양들에서, 특히 상기 숙주 세포가 세포벽을 갖는 경우, 상기 숙주 세포를 기계적으로, 화학적으로 또는 효소적으로 열어, 상기 세포내에 고립된 발현 항체를 방출시킬 수 있다. 예시적인 비제한적인 항체 정제 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 염 침전 및 젤 여과를 포함한다. 다른 실시태양들에서, 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 불변 영역 서열을 인식하는 마우스 항체를 정제 컬럼에 고정화시킬 수 있다. 한편으로, 항체를 친화성 태그에 단단히 결합된 특이 항체 또는 다른 분자와의 정제를 위해서, 에피토프 태그 또는 보다 큰 친화성 태그, 예를 들어 말토스 결합 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제, 및 티오레독신에 융합시켜 발현시킬 수 있다. 그 후에, 상기 에피토프 또는 친화성 태그를 통상적인 숙련가들에게 친숙한 기법을 사용하여 절단하고 상기 항체를 다른 기법들, 예를 들어 본 발명에 개시된 기법들을 사용하여 정제할 수 있다. 배지 및 숙주 세포로부터 항체를 정제하기 위한 다른 기법들도 또한 가능하다. 항체에 또한 추가적인 가공 단계들을 가하여, 상기 항체를 또한 양호한 제작 관행 또는 다른 규제 요구(상기 경우가 있을 수도 있으므로)에 따라 추가로 정제할 수도 있다. 이를 수행하기에 적합한 정제 및 단계들은 숙련가의 지식내에 있다.

유전자이식 동물 및 식물

본원의 항체를 또한 유전자 변형된 비-인간 동물 또는 식물에서 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 유기체에서 항체의 발현은 구성적이거나 유도성일 수 있다. 이어서 상기와 같은 유기체에서 발현된 항체를 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 기법을 사용하여 단리할 수 있다. 유전자이식 비-인간 유기체에서 항체 및 그의 항원 결합 단편을 발현시키기 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 비제한적인 예에서, 본원의 항체를 염소, 소 또는 다른 비-인간 포유동물의 젖에서 생성시키고 이로부터 회수할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,827,690 호, 미국특허 제 5,756,687 호, 미국특허 제 5,750,172 호, 및 미국특허 제 5,741,957 호(본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 항체가 존재할 수 있는 유전자이식 포유동물의 다른 비제한적인 예는 마우스, 래트, 양, 돼지 또는 말일 수 있다. 항체가 단리될 수 있는 체액의 추가의 비제한적인 예는 혈액이다. 다른 체액도 또한 가능하다. 본원의 항체를 또한 식물에서 생성시키고 이로부터 회수할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 6,417,429 호, 미국특허 제 6,046,037 호 및 미국특허 제 5,959,177 호(본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오.

약학 조성물

본원의 치료학적 및 예방학적 방법에 사용하기 위해서, 본 발명에 개시된 항체를 조성물로서 제형화할 수 있다. 임의로, 상기 조성물은 하나 이상의 추가적인 작용제, 예를 들어 GDF-8 매개된 질환에 대해 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인, 본 발명에 개시된 것들과 상이한 GDF-8 에피토프 결합 항체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 대개, 통상적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 멸균의 약학 조성물 부분으로서 공급될 것이다. 상기 조성물은 대상에게 목적하는 투여 방법에 따라 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다.

본원의 항체를 대상에게 다양한 경로, 전형적으로는 비경구적으로, 예를 들어 피하, 정맥내, 복강내 또는 근육내 주사를 통해서 투여할 수 있다. 투여를 하나 이상의 일시주사로서, 또는 하나 이상의 주입으로서 수행할 수 있다. 다른 투여 경로들도 또한 당해 분야의 통상적인 숙련가들의 지식에 따라 가능하다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 투여 경로는 투여되는 특정한 조성물 및 대상의 특성, 예를 들어 치료하려는 질환, 연령 또는 성별에 따라 변할 수 있다.

약학 조성물을 편의상 용량당 소정량의 항체를 함유하는 단위 투여형으로 제공할 수 있다. 상기와 같은 단위는 예를 들어 비제한적으로 5 ㎎ 내지 5 g, 10 ㎎ 내지 1 g, 또는 20 내지 50 ㎎을 함유할 수 있다. 본원에 사용하기 위해 약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 투여 경로에 따라 광범위하게 다양한 형태를 취할 수 있다.

본원의 약학 조성물을 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 보관하기 위해, 목적하는 순도를 갖는 항체를 당해 분야에 전형적으로 사용되는 임의의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(이들 모두 본 발명에서 "담체"로서 지칭된다), 즉 완충제, 안정제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 산화방지제 및 다른 잡다한 첨가제들과 혼합함으로써 제조할 수 있다. 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]을 참조하시오. 상기와 같은 첨가제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이어야 한다.

완충제는 pH를 생리 조건에 근접한 범위에서 유지시키는 것을 돕는다. 상기 완충제는 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 본원에 사용하기에 적합한 완충제는 유기 및 무기산 및 그의 염 모두, 예를 들어 시트레이트 완충제(예를 들어 일나트륨 시트레이트-이나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-삼나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-일나트륨 시트레이트 혼합물 등), 숙시네이트 완충제(예를 들어 숙신산-일나트륨 숙시네이트 혼합물, 숙신산-수산화 나트륨 혼합물, 숙신산-이나트륨 숙시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제(예를 들어 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-수산화 나트륨 혼합물 등), 퓨마레이트 완충제(예를 들어 퓨마르산-일나트륨 퓨마레이트 혼합물, 퓨마르산-이나트륨 퓨마레이트 혼합물, 일나트륨 퓨마레이트-이나트륨 퓨마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제(예를 들어 글루콘산-나트륨 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화 나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제(예를 들어 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화 나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제(예를 들어 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화 나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제(예를 들어 아세트산-나트륨 아세테이트 혼합물, 아세트산-수산화 나트륨 혼합물 등)를 포함한다. 또한, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트라이메틸아민 염, 예를 들어 트리스를 사용할 수 있다.

보존제를 첨가하여 미생물 생육을 저지할 수 있으며, 0.2% 내지 4%(w/v) 범위의 양으로 첨가할 수 있다. 본원에 사용하기에 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다. 등장화제(때때로 "안정제"로서 공지됨)를 가하여 본원의 액체 조성물의 등장성을 보장할 수 있으며 다가 당 알콜, 예를 들어 3가 또는 보다 고차 당 알콜, 예를 들어 글리세린, 에리쓰리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨 및 만니톨을 포함할 수 있다. 안정제는 작용상 벌크화제에서부터, 치료제를 용해하거나 변성 또는 용기벽에의 부착을 방지하는데 도움이 되는 첨가제에 이르는 범위일 수 있는 광범위한 범주의 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정제는 다가 당 알콜(상기 열거됨); 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 쓰레오닌 등, 유기 당 또는 당 알콜, 예를 들어 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등(사이클리톨, 예를 들어 이노시톨 포함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 함유 환원제, 예를 들어 유레아, 글루타치온, 티옥산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, a-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 설페이트; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들어 10 잔기 이하의 펩타이드); 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈 모노사카라이드, 예를 들어 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 다이사카라이드, 예를 들어 락토스, 말토스, 슈크로스 및 트라이사카라이드, 예를 들어 라피노스; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트란일 수 있다. 안정제는 활성 단백질의 중량부당 0.1 내지 10,000 중량의 범위로 존재할 수있다.

비-이온성 계면활성제 또는 세제(또한 "습윤제"로서 공지됨)를 가하여 항체, 및 포함시킬 수 있는 임의의 다른 치료제를 교반-유발된 응집에 대해 안정화시키는 것을 도울 수 있으며, 이는 또한 상기 조성물이 단백질의 변성을 유발시키지 않으면서 전단 표면 응력에 노출될 수 있게 한다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리솔베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉 폴리올, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에테르(트윈(등록상표)-20, 트윈(등록상표)-80 등)를 포함한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 1.0 ㎎/㎖, 예를 들어 약 0.07 ㎎/㎖ 내지 약 0.2 ㎎/㎖의 범위로 존재할 수 있다.

추가적인 잡다한 부형제들은 킬레이트화제(예를 들어 EDTA), 산화방지제(예를 들어 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 공-용매를 포함할 수 있다.

예시적인 비제한적인 실시태양에서, 본원의 항체를 pH 5.8에서 20 mM L-히스티딘, 85 ㎎/㎖ 슈크로스, 0.2 ㎎/㎖ PS-80, 0.05 ㎎/㎖ EDTA를 포함하는 용액 중에서 제형화한다. 다른 실시태양에서, 상기 제형 중 항체의 농도는 100 ㎎/㎖이다. 더욱 다른 실시태양들에서, 상기 제형 중 항체를 동결건조시킨다.

약학 키트

몇몇 실시태양들에서, 본 발명은 의사 등에 의해 사용되는 약학 키트를 제공한다. 상기 약학 키트는 본원의 항-GDF-8 항체(예를 들어 동결건조된 형태든 또는 수용액으로서든) 및 하기 중 하나 이상을 포함하는 패키지이다: 적어도, 본원의 어딘가에 개시된 바와 같은 제 2 치료제; 상기 항체를 투여하기 위한 기구, 예를 들어 바늘 및/또는 주사기; 및 상기 항체가 동결건조된 또는 농축된 형태로 존재하는 경우 상기 항체를 재현탁하거나 희석하기 위한 약제 등급의 물 또는 완충제. 키트는 또한 상기 항체 조성물의 제조 및/또는 상기 조성물의 대상에의 투여를 위한 설명서를 포함할 수도 있다.

상기 항-GDF-8 항체의 각 단위 용량을 별도로 패키징할 수 있으며, 키트는 하나 이상의 단위 용량(예를 들어 2 단위 용량, 3 단위 용량, 4 단위 용량, 5 단위 용량, 7 단위 용량, 8 단위 용량, 10 단위 용량, 또는 그 이상)을 함유할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 하나 이상의 단위 용량들은 각각 하나의 주사기에 수용되며, 또 다른 실시태양에서, 상기 하나 이상의 단위 용량들은 각각 I.V. 라인에 연결하기에 적합한 주머니 또는 유사한 용기 중에 함유된다.

치료 및 예방 방법

본원은 GDF-8 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시켜 치료 이점을 생성시키는 상태 및 질환의 치료 및 예방 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 대상에게 효과량의, 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 이들 실시태양 중 몇몇에서, 상기 항체는 OGD1.0.0 또는 그의 GDF-8 결합 단편, 부분, 일부 또는 유도체이다.

항-GDF-8 항체 조성물이 투여될 수 있는 대상은 포유동물, 예를 들어 비-영장류(예를 들어 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어 원숭이, 침팬지, 유인원 또는 인간)일 수 있다. 상기 대상은 인간, 예를 들어 성인 대상 또는 소아 대상일 수 있다.

본원의 항체 조성물로 치료될 수 있는 상태 및 질환은 적어도 부분적으로 GDF-8에 의해 매개되는 것들, 또는 대상에서 GDF-8 활성의 감소가 치료 이점을 부여함을 암시하는 과학적 근거가 존재하는 경우이다.

치료 이점이 부분적으로 특정한 상태 또는 질환에 따르지만, 상기 치료 이점은 대상에서 GDF-8 활성의 감소가 상기 상태 또는 질환의 증상, 징후 또는 중증도의 임의의 개선을 생성시키거나, 상기와 같은 증상, 징후 또는 중증도의 점진적인 악화를 멈추거나 늦추는 경우 존재한다. 치료 이점은 또한 GDF-8 활성의 감소가 대상의 기대 수명, 편안함 또는 삶의 질을 증가시키는 경우 존재한다. 치료 이점은 또한 GDF-8 활성의 감소가 대상의 하나 이상의 신체적 또는 생리적 기능의 열화, 또는 상기와 같은 기능을 반영하는 시험에 대한 대상의 동작을 개선시키거나 멈추거나 늦추는 경우 존재한다.

치료 이점은 몇몇 임무를 수행하는 대상을 관찰하거나, 상기 대상에게 그의 느낌에 관한 질문을 하거나, 임상에서 상기 대상에 대해 또는 상기 대상으로부터 수득된 샘플에 대해 실험실에서 하나 이상의 시험을 수행함으로써 추론될 수 있다. 치료 이점은 또한 GDF-8 억제의 마커들에 의해 입증될 수 있다. 예로서, 비제한적으로, 치료중인 대상으로부터의 근육을 생검하고 GDF-8에 의해 자극된 신호 전달 경로의 하향 조절, 예를 들어 인산화된 SMAD2 또는 SMAD3 단백질 수준의 감소와 관련된 마커의 존재 또는 부재에 대해 시험할 수 있다. 본원의 항체를 포함하는 조성물로 치료 중인 대상에서 치료 이점을 검출하기에 적합한 다른 시험들은 당해 분야의 통상적인 숙련가들의 지식내에 있다. 치료되거나 예방되는 상태 또는 질환의 완전한 치유 또는 역전은 바람직할 수는 있지만, 치료 이점이 존재하기 위해 요구되지는 않는다.

몇몇 실시태양에서, 본원의 항체를 포함하는 조성물을 사용하여 골격근 질량 및/또는 강도의 손실을 특징으로 하는 상태 또는 질환, 또는 상기와 같은 근육 질량 및/또는 강도의 증가가 치료 이점을 부여하는 경우를 치료하거나 예방할 수 있다. 이들 실시태양 중 몇몇에서, 상기 항체는 OGD1.0.0, 또는 그의 GDF-8 결합 단편 또는 유도체이다.

본 발명에 개시된 항체의 투여에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 감소된 근육 질량 및/또는 강도와 관련된 상태 또는 질환은 비제한적으로 근육 질량 또는 강도의 연령-관련된 손실, 허약, 근육감소증, 및 근위축증, 고정화 또는 폐지에 의해 유발된 근육 질량 또는 강도의 손실, 예를 들어 손상, 탈신경, 또는 무중력 환경에의 지속된 노출 후의 손실을 포함한다. 다른 실시태양들에서, 치료되거나 예방될 수 있는 상태 또는 질환은 골절, 특히 노인 또는 골절, 예를 들어 고관절 골절, 또는 다른 뼈의 골절에 민감한 다른 사람들에서의 골절, 또는 관절 대체의 안정화를 포함한다. 일부 다른 실시태양들에서, 치료되거나 예방될 수 있는 상태 또는 질환은 근육 소모 증후군, 예를 들어 1차 질병 과정에 기인할 수 있는 것들이다. 근육 소모 증후군의 비제한적인 예는 악액질, 예를 들어 암, 식욕 부진 또는 다른 유형의 영양실조에 의해 유발되는 것, 및 AIDS, 패혈증, 화상, 만성 신부전, 울혈성 심부전(CHF), 및 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD)에 의해 유발된 근육 소모를 포함한다.

예로서, 비제한적으로, 본원의 항체를 포함하는 조성물이 투여된 대상에서 치료 이점은 일반적으로 근육 질량 또는 강도의 증가를 통해서, 또는 특정 근육의 증가를 통해서 입증될 수 있다. 항-GDF-8 항체에 의한 치료에 의해 질량 및/또는 강도가 증가될 수 있는 근육의 비제한적인 예는 골격근 및 심근을 포함한다. 다른 예는 호흡을 조절하는 근육, 예를 들어 횡경막 및 늑간근뿐만 아니라, 목빗근 등을 포함한 호흡의 부속 근육을 포함한다. 골격근의 더욱 다른 예는 비복근, 후경골근, 족저근, 전경골근, 장근, 단근, 대둔근, 대퇴이두근, 반건양근, 반막양근, 장요근, 대퇴사두근, 대퇴내전근, 견갑거근, 승모근, 복직근, 복횡근, 외복사근, 내복사근, 척추기립근, 대흉근, 상완이두근, 상완삼두근, 상완근, 원회내근, 상완요골근, 능형근, 삼각근 및 광배근을 포함한다. 본원의 항-GDF-8 항체에 의한 치료에 의해 질량 및/또는 강도가 증가될 수 있는 다른 골격근들도 또한 가능하다.

근육 질량 또는 강도의 증가를, 예를 들어 힘에 저항하거나 중량을 들어올리는 대상의 능력을 관찰함으로써 직접적으로, 또는 예를 들어 MRI, CT 또는 이중-에너지 X-선 흡광분석법(DEXA)을 사용하여 대상의 신체를 스캐닝함으로써 간접적으로 평가할 수 있다. 다른 기법들도 또한 가능하다.

한편으로, 치료 이점을 달리 증상을 점차적으로 악화시키는 것의 중증도의 감소로부터 추론할 수 있다. 이점을 또한 근육 기능의 생리학적 시험, 예를 들어 근전도검사법, 생검 근육 구조의 조직병리학적 시험, 및 생화학적 시험, 예를 들어 손상된 근육에 의해 방출되는 효소인 혈청 크레아틴 키나제의 존재를 사용하여 입증할 수 있다. 치료 이점의 검출에 유용한 근육 구조 및 기능의 다른 시험도 또한 가능하다.

근육 질량 및/또는 강도에 관한 다른 실시태양들에서, 본원은 근이영양증("MD")의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써, 상기 근이영양증을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 일부 실시태양들에서, 상기 항체는 OGD1.0.0, 또는 그의 항-GDF-8 결합 단편 또는 유도체이다. 몇몇 실시태양들에 따라, 상기 대상은 근이영양증을 앓고 있는 인간 소아 대상이며, 다른 실시태양들에서, 상기 대상은 근이영양증이 있는 인간 성인 대상이다.

당해 분야에 공지된 바와 같이, 근이영양증의 원인이 되는 유전자 병변 또는 병변들의 성질, 및 근원적인 유전자 결함으로부터 생성되는 표현형이 상이한, 다양한 유형의 근이영양증이 존재한다. 본원의 항체를 포함하는 조성물의 투여에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 근이영양증의 유형의 비제한적인 예는 뒤센 근이영양증(DMD)(또한 가성근비대성 MD), 베커 근이영양증(BMD), 에머리-드레이퍼스 근이영양증(EDMD), 지대형 근이영양증(LGMD), 안면견갑상완 근이영양증(FSH 또는 FSHD)(또한 진행성 근위축 MD로서 공지됨), 근긴장성 이영양증(MMD)(또한 DM 또는 슈타이너트 질병으로서 공지됨), 안구인두 근이영양증(OPMD), 원위 근이영양증(DD)(또한 미요시 MD로서 공지됨), 및 선천성 근이영양증(CMD)을 포함한다.

상술한 근육 질량 및/또는 강도의 개선을 평가하기 위한 기법들 외에, 본원의 항체를 포함하는 조성물을 MD가 있는 대상에게 투여하는 치료 이점을 6 분 걷기 시험("6MWT")을 사용하여 정량화할 수 있다. 예를 들어 문헌[McDonald, et al., The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy, Muscle Nerve (2010) 41:500-510](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.

상기 6MWT에서, 대상들을, 이들이 6 분 이내에 미리설치된 코스를 따라 얼마나 멀리 걸을 수 있는지를 측정하기 위해 시험한다. 전형적으로, 대상을 치료 시작 전에 시험하여 기준선을 확립시키고 이어서 그 후에 치료가 진행함에 따라 간격을 두고 시험할 것이다. 치료 이점은 상기 6MWT에서 상기 MD 대상의 동작이 일정하게 유지되거나 실제로 치료에 따라 개선되거나, 한편으로 상기 대상의 동작이 평균 치료되지 않은 대상만큼 빨리 감퇴하지 않는 경우 나타난다. 상기 6MWT에 대한 동작의 예시적인 비제한적인 개선은 치료되지 않은, 또는 위약 처리된 대조군에 비해 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상의 백분율 개선을 포함한다. 상기 6MWT를 또한 MD 이외에 보행에 영향을 미치는 상태 또는 질환에 대해 치료되는 대상에서 치료 이점을 검출하기 위해 사용할 수 있다.

다른 실시태양들에서, 본원은 운동-뉴런 질병의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 일부 실시태양들에서, 상기 항체는 OGD1.0.0, 또는 그의 항-GDF-8 결합 단편 또는 유도체이다. 본원의 항체를 포함하는 조성물의 투여에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 운동-뉴런 질병의 유형의 비제한적인 예는 근위축성 측삭 경화증(ALS)(또한 루게릭병으로서 공지됨), 1형 척수 근위축증(SMA1)(또한 베르드니히 호프만병으로서 공지됨), 2형 척수 근위축증(SMA2), 3형 척수 근위축증(SMA3)(또한 쿠겔베르크 벨란더병으로서 공지됨), 및 척수연수성 근위축증(SBMA)(또한 케네디병으로서 공지됨)을 포함한다.

선행 연구에서, 쥐 항-GDF-8 항체는 SOD1 마우스 및 래트(이들은 인간 ALS의 소동물 모델들이다)에서 근육 질량 및 강도를 증가시키기에 효과적인 것으로 입증되었다. WO 2007/024535 및 문헌[Holzbauer, et al., Myostatin inhibition slows muscle atrophy in rodent models of amyotrophic lateral sclerosis, Neurobiology of Disease (2006) 23:697-707](이들은 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 보고된 바와 같이, 상기 쥐 항체에 의한 처리는 PBS 처리된 대조군에 비해 SOD1 마우스 및 래트의 횡경막 및 골격근에서 근육 질량을 증가시켰다. 유사하게, 항체 처리는 PBS를 제공받은 대조군에 비해, SOD1 마우스에서 비복근 및 횡경막의 근육 위축을 감소시켰다. 항체 처리의 영양 효과는 주로 말기 단계와 상반되게 상기 질병 과정의 초기 단계 동안 분명하였지만, 횡경막 위축의 억제는 상기 두 시기 모두 중에 분명하였다. 항체 처리는 또한 SOD1 마우스 및 래트에서 전체 체중뿐만 아니라 사지 근육 강도를 증가시키는 것으로 관찰되었지만, 상기 항체는 비히클만으로 처리된 대조용 동물에 비해 생존을 연장시키지는 않았다. 본원의 인간화된 항-GDF-8 항체, 예를 들어 OGD1.0.0은 상기 논의된 쥐 항체와 동일한 항원 결합 결정인자를 공유하기 때문에, 이들 항체는 또한 인간에서 ALS의 치료 또는 예방에 유효할 것이다.

근육 질량, 기능 및/또는 강도에 영향을 미치는 근육, 중추 신경계 및 말초 신경계의 다른 선천적 또는 후천적 질병 및 질환을 또한, 상기 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 본원의 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 치료 또는 예방할 수 있다.

본원은 또한 대사 질환의 치료가 필요한 대상에게 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 상기 대사 질환을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 이들 실시태양 중 몇몇에서, 상기 항체는 OGD1.0.0, 또는 그의 항-GDF-8 결합 단편 또는 유도체이다.

본원의 항체를 투여함으로써 치료되거나 예방될 수 있는 대사 질환의 비제한적인 예는 2형 당뇨병, 대사 증후군, 예를 들어 증후군 X, 인슐린 내성, 및 손상된 글루코스 내성을 포함한다.

다른 실시태양들에서, 본원은 지방조직 질환의 치료가 필요한 대상에게 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 상기 지방 조직 질환을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 이들 실시태양 중 몇몇에서, 상기 항체는 OGD1.0.0, 또는 그의 항-GDF-8 결합 단편 또는 유도체이다.

본원의 항체를 투여함으로써 치료되거나 예방될 수 있는 지방조직 질환의 비제한적인 예는 비만증 및 특정 대상의 성별, 연령 및 상태에 대해 정상 체질량 지수(BMI)보다 높음을 포함한다.

다른 실시태양들에서, 본원은 골손실 질환의 치료가 필요한 대상에게 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 상기 골손실 질환을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 이들 실시태양 중 몇몇에서, 상기 항체는 OGD1.0.0, 또는 그의 항-GDF-8 결합 단편 또는 유도체이다.

본원의 항체를 투여함으로써 치료되거나 예방될 수 있는 골손실 질환의 비제한적인 예는 골다공증, 호르몬-관련된 골다공증, 골감소증, 골관절염, 및 골다공증-관련 골절을 포함한다.

복합 요법

본원의 방법의 몇몇 실시태양들에 따라, 항-GDF-8 항체를 단독요법으로서 또는 적어도 제 2 치료제와 함께 복합 요법으로서 투여할 수 있다. 전형적으로, 비제한적으로, 상기 2차 치료제를 상기 항-GDF-8 항체에 의해 표적화된 동일한 상태 또는 질환을 치료하거나 예방하도록 선택한다. 그러나, 다른 실시태양들에서, 상기 제 2 작용제를 상이한 상태 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 선택할 수 있다. 복합 요법에 사용하기 위한 항체 및 제 2 치료제의 용량을, 효능은 최대화하고 부작용은 최소화하도록 당해 분야의 통상적인 숙련가들의 지식에 따라 선택한다.

본원의 항-GDF-8 항체 조성물을 제 2 치료제와 동일하거나 상이한 투여 방식을 사용하여 대상에게 투여할 수 있다. 상기 항-GDF-8 항체 또는 제 2 치료제의 화학적 및 물리적 특성에 따라, 이들 항체 및 치료제를 동일한 조성물 중에 병용할 수도 있다. 대안의 실시태양들에서, 이들 항체 및 치료제를 별도의 조성물로서 투여한다. 항체 및 제 2 치료제의 조성물을 편의상 본원에 따른 키트에 포함시킬 수 있다.

복합 요법으로서 투여되는 경우, 상기 항체 및 제 2 치료제를 동시에, 연속적으로 또는 별도로 투여할 수 있다.

동시 투여는 2 개 이상의 작용제를, 각각의 투여가 중복되지만 상이한 시기에 시작하거나 끝나는 경우에조차 동시에 투여될 때 발생한다. 연속 투여는 2 개 이상의 작용제를 같은 날에, 예를 들어 동일한 병원 방문 중에, 그러나 동시는 아니게 대상에게 투여한다.

연속 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 시간 간격으로 발생할 수 있다. 항-GDF-8 항체 조성물을 먼저 투여한 다음 제 2 작용제를 투여하거나, 이와 역으로 투여할 수 있다.

별도의 투여는 상기 작용제들을 대상에게 상이한 날에 투여할 때 발생한다. 작용제들의 별도의 투여간의 예시적인 간격은 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주 또는 한 달 이상일 수 있다. 연속적인 투여와 같이, 상기 항-GDF-8 항체 조성물의 투여는 상기 제 2 작용제의 별도의 투여에 선행하거나 후행할 수 있다.

본원의 몇몇 다른 실시태양들에서, 항-GDF-8 항체 조성물 및 제 2 치료제를, 연속적으로 투여하든지 별도로 투여하든지 간에, 교번 패턴으로 반복해서 투여할 수 있다.

대사 질환의 치료 또는 예방 방법에서, 본원의 항-GDF-8 항체를 상기와 같은 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 제 2 작용제와 병용할 수 있다. 상기 목적에 효과적인 제 2 작용제의 비제한적인 예는 메트포민, 설포닐유레아, 인슐린, 프람린티드, 티아졸리딘디온, 예를 들어 로시글리타존 및 피오글리타존, GLP-1 유사체, 예를 들어 엑세니티드, 및 DPP-IV 억제제, 예를 들어 빌다글립틴을 포함한다.

골손실 질환의 치료 또는 예방 방법에서, 본원의 항-GDF-8 항체를 상기와 같은 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 제 2 작용제와 병용할 수 있다. 상기 목적에 효과적인 제 2 작용제의 비제한적인 예는 비스포스포네이트, 예를 들어 알렌드로네이트 및 리세드로네이트, 칼시토닌, 랄록시펜, 및 호르몬제, 예를 들어 에스트로젠 또는 부갑상선 호르몬(PTH)을 포함한다.

근이영양증의 치료 또는 예방 방법에서, 본원의 항-GDF-8 항체를 근이영양증의 치료 또는 예방에 효과적인 제 2 작용제, 예를 들어 코르티코스테로이드와 병용할 수 있다. 근이영양증의 치료 또는 예방에 효과적인 다른 작용제는 당해 분야에 공지되어 있다. 근이영양증의 치료에 효과적인 코르티코스테로이드의 비제한적인 예는 메틸프레드니솔론, 델플라자코트, 베타메타손, 프레드니솔론, 하이드로코르티손, 코르티손, 베클로메타손, 부데소니드, 콜티솔, 덱사메타손, 플루티카손, 프레드니손, 모메타손, 트라이암시놀론, 및 이들의 유도체를 포함한다. 다른 실시태양들에서, 항-GDF-8 항체를 종종 DMD 대상, 특히 노령의 DMD 대상에서 발생하는 심근병증의 치료제와 함께 투여할 수 있다. 상기와 같은 작용제는 비제한적으로 베타 아드레날린 효능 차단제 및 안지오텐신-전환 효소의 억제제를 포함한다.

ALS의 치료 또는 예방 방법에서, 본원의 항-GDF-8 항체를 ALS의 치료 또는 예방에 효과적인 제 2 작용제, 예를 들어 비제한적으로 릴루졸, 탈람파넬, 글리코피롤레이트, 벤즈트로핀, 스코폴아민, 아트로핀, 트라이헥시페니딜 하이드로클로라이드, 아미트립틸린, 플루복사민, 바클로펜, 티자니딘, 단트롤렌, 다이아제팜, 퀴닌, 페니토인, 벤조다이아제핀, 가바펜틴, 항경련제, 항우울제, 및 몰핀 또는 다른 통증 경감제와 병용할 수 있다.

더욱 다른 실시태양들에 따라, 본원의 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 비-약물 기재 요법, 예를 들어 비제한적으로 운동, 물리적 요법, 호흡 요법, 환기 보조, 심장병요법, 및 영양 보충제과 협력하여 투여할 수 있다.

효과적인 투여량

상술한 바와 같이, 본원의 항-GDF-8 항체를 포함하는 조성물을 몇몇 상태 또는 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 목적하는 치료 이점을 적어도 부분적으로 성취하기에 효과적인 투여량으로 투여할 수 있다.

모든 GDF-8의 결합이 치료 효능을 성취하기 위해 반드시 필요한 것은 아니다. 오히려, 체액, 예를 들어 혈액 또는 혈청 중에, 또는 체조직, 예를 들어 근육 또는 다른 체조직 또는 기관내에, 성숙한 활성 GDF-8의 농도를 감소시키는 것이 또한 유효할 수도 있다.

당해 분야의 통상적인 숙련가들의 지식에 따라, 항-GDF-8 항체 조성물의 용량을 투여후 소정의 시간에 관심 조직 또는 체액 중 활성 GDF-8 농도를 감소시키기 위해서 대상에서 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 또는 약 5% 내지 10%, 약 10% 내지 45%, 약 15% 내지 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%, 약 30% 내지 35%, 약 35% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 50% 내지 55%, 약 55% 내지 60%, 약 60% 내지 65%, 약 65% 내지 70%, 약 70% 내지 75%, 약 75% 내지 80%, 약 80% 내지 85%, 약 85% 내지 90%, 약 90% 내지 95%, 약 95% 내지 99%, 또는 상기 값들 중 임의의 값들 사이 범위의 활성 GDF-8 농도의 백분율 감소로 적정할 수 있다.

대상에게 투여되는 항-GDF-8 항체의 양은 치료하거나 예방하려는 상태 또는 질환, 대상의 크기 및 체중, 투여 형태, 경로 및 부위, 치료 섭생(예를 들어 제 2 치료제의 사용 여부), 특정 대상의 연령 및 상태, 치료 시작전 상기 대상의 관심 조직 또는 체액 중에서 검출되는 활성 GDF-8의 수준, 및 상기 항체 조성물의 효과에 대한 상기 대상의 반응 또는 민감성을 포함한 다수의 인자들에 따라 변할 것이다. 적합한 투여량을 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 측정할 수 있다. 최종적으로, 의사 또는 유사한 요양 보호사는 사용되는 적합한 투여량을 결정할 것이다. 상기 투여량을 적합한 만큼 종종 반복할 수 있다. 부작용이 발생하는 경우 상기 투여량의 양 및/또는 빈도를 통상적인 임상 관행에 따라 변경시키거나 감소시킬 수 있다. 적합한 투여량 및 치료 섭생을, 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 방법을 사용하여 요법의 진행을 모니터링함으로써 확립시킬 수 있다.

효과적인 투여량을 시험관내 분석으로부터 초기에 추정할 수 있다. 예를 들어 동물에 사용하기 위한 초기 용량은 시험관내에서 측정된 바와 같은 GDF-8에 대한 항체의 결합 친화성 또는 그 이상에서 항-GDF-8 항체의 순환하는 혈액 또는 혈청 농도를 성취하도록 제형화될 수 있다. 특정 항체의 생물학적 이용효능을 고려하여 상기와 같은 순환하는 혈액 또는 혈청 농도를 성취하기 위한 투여량을 계산하는 것은 숙련가의 능력내에 있다. 지침을 위해서, 문헌[Part 1: General Principles in “Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,” 11th Ed., Hardman, J. G., et al., Eds., McGraw-Hill Professional](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 초기 투여량을 또한 생체내 데이터, 예를 들어 동물 모델로부터 추정할 수 있다. 통상적인 숙련가는 상기와 같은 정보를 인간 투여에 적합한 투여량을 측정하기 위해서 통상적으로 적용할 수 있다.

몇몇 실시태양들에서, 용량을, 포화되는 항-GDF-8 항체의 양, 즉 필수적으로 모든 활성 GDF-8이 결합하기에 충분한 양을 계산하기 위해서 상기 항체 조성물의 투여에 앞서 수일 내지 수주 동안 수회 관심 혈청, 근육 또는 다른 체액 또는 조직 중 상기 활성 GDF-8 농도를 측정함으로써 개인 대상에 대해 결정할 수 있다. 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 혈청, 근육 또는 달리 어느 곳에서의 GDF-8의 주어진 양에 대한 포화를 성취하기에 필요한 임의의 특이적인 항체의 양은 부분적으로, GDF-8에 대한 특정 항체의 친화성에 따라 변할 것이다. 필요한 경우 특정 항체의 약동학적 성질 및 생물학적 이용효능을 고려하여, 특이적인 항-GDF-8 항체의 포화량을 계산하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 포화를 확실히 하기 위해서, 계산된 포화량보다 더 큰 양을 투여할 수 있다, 예를 들어 상기 계산된 포화량보다 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 심지어 10 배 이상을 투여할 수도 있다.

항-GDF-8 항체 조성물의 유효 용량은 인자들, 예를 들어 상기 논의된 치료하거나 예방하려는 상태 또는 질환 등에 따라, 단일(예를 들어 일시주사) 투여, 수회 투여 또는 연속(예를 들어 주입) 투여당 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏의 범위, 또는 이 사이의 임의의 유효 범위 또는 값일 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 각각의 용량은 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 0.5 ㎎/㎏; 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 0.75 ㎎/㎏; 약 0.5 ㎎/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏; 약 2 ㎎/㎏; 약 1.5 ㎎/㎏ 내지 약 2.5 ㎎/㎏; 약 2 ㎎/㎏ 내지 약 3 ㎎/㎏; 약 2.5 ㎎/㎏ 내지 약 3.5 ㎎/㎏; 약 3 ㎎/㎏ 내지 약 4 ㎎/㎏; 약 3.5 ㎎/㎏ 내지 약 4.5 ㎎/㎏; 약 4 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏; 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 7 ㎎/㎏; 약 6 ㎎/㎏ 내지 약 8 ㎎/㎏; 약 7 ㎎/㎏ 내지 약 9 ㎎/㎏; 약 8 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏; 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 15 ㎎/㎏; 약 12.5 ㎎/㎏ 내지 약 17.5 ㎎/㎏; 약 15 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏; 약 17.5 ㎎/㎏ 내지 약 22.5 ㎎/㎏; 약 20 ㎎/㎏ 내지 약 25 ㎎/㎏; 약 22.5 ㎎/㎏ 내지 약 27.5 ㎎/㎏; 약 25 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏; 약 30 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏; 약 35 ㎎/㎏ 내지 약 45 ㎎/㎏; 약 40 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏; 약 45 ㎎/㎏ 내지 약 55 ㎎/㎏; 약 50 ㎎/㎏ 내지 약 60 ㎎/㎏; 약 55 ㎎/㎏ 내지 약 65 ㎎/㎏; 약 60 ㎎/㎏ 내지 약 70 ㎎/㎏; 약 65 ㎎/㎏ 내지 약 75 ㎎/㎏; 약 70 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏; 약 75 ㎎/㎏ 내지 약 85 ㎎/㎏; 약 80 ㎎/㎏ 내지 약 90 ㎎/㎏; 약 85 ㎎/㎏ 내지 약 95 ㎎/㎏; 약 90 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏; 약 95 ㎎/㎏ 내지 약 105 ㎎/㎏; 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 150 ㎎/㎏; 약 125 ㎎/㎏ 내지 약 175 ㎎/㎏; 약 150 ㎎/㎏ 내지 약 200 ㎎/㎏; 약 175 ㎎/㎏ 내지 약 225 ㎎/㎏; 약 200 ㎎/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏의 범위일 수 있다. 다른 투여량 범위도 또한 가능하다.

상기 투여의 양, 빈도, 및 지속기간은 대상의 연령, 체중, 및 질병 상태와 같은 다양한 인자들에 따라 변할 것이다. 따라서, 비제한적인 예에서, 투여를 위한 치료 섭생을 하루 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 1주일 이상, 2주일 내지 무한으로, 2주일 내지 6개월, 3개월 내지 5년, 6개월 내지 1 또는 2년, 8개월 내지 18개월 동안 등으로 계속할 수 있다. 임의로, 상기 치료 섭생은, 예를 들어 하루에 2회, 하루에 1회, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일마다, 매주 1회, 2주에 1회 또는 한 달에 1회 반복 투여를 제공한다. 상기 반복 투여는 동일한 용량이거나 상이한 용량일 수 있다. 상기 투여를 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 이상 반복할 수 있다. 치료 효과량의 항-GDF-8 항체 조성물을 단일 용량으로서 또는 치료 섭생의 과정에 걸쳐, 예를 들어 1주일, 2주일, 3주일, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 또는 그 이상에 걸쳐 투여할 수 있다. 특정 대상에서 항-GDF-8 항체 조성물의 유효 용량을 구성하는 것은 상기 대상의 상태가 변하거나 다른 건강 문제가 발생하기 때문에 시간에 따라 변할 수도 있다.

실시예

실시예 1

OGD1.0.0 및 OGD1.1.1의 일시적인 발현 분석

완전한 이종사량체성 OGD1.1.1 및 OGD1.0.0의 일시적인 발현을 COS-1 M6 세포에서 시험하였으며, OGD1.0.0이 실질적으로 보다 높은 수준으로 발현됨을 입증하였다.

간단히, VH0 및 VH1(각각 서열번호 49 및 53)을 암호화하는 DNA를, 상기 VH 영역들이 각각, VH0 또는 VH1을 포함하는 전장 항체 중쇄를 발현하도록 효과기 작용을 없애는 3 개의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1의 불변 중쇄 영역(서열번호 57)을 암호화하는 핵산 서열과 인프레임 결합되도록 포유동물 IgG 발현 벡터에 클로닝하였다. 유사하게, VL0 및 VL1(각각 서열번호 51 및 55)을 암호화하는 DNA를, 상기 VL 영역들이 각각, VL0 또는 VL1을 포함하는 전장 항체 중쇄를 발현하도록 서열번호 17의 인간 카파 불변 경쇄 영역을 암호화하는 핵산 서열과 인프레임 결합되도록 포유동물 IgG 발현 벡터에 클로닝하였다.

상기 발현 벡터의 생성 후에, 맥시프렙(maxiprep) DNA를 표준 기법을 사용하여 제조하였다. 세포를 100 ㎜ 조직 배양 디쉬상에 도말하고 이어서 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 일시적으로 동시-형질감염시켰다(즉 VH0 및 VL0을 하나의 플레이트에서 합하고 VH1 및 VL1은 두 번째 플레이트에서 합하였다). 트랜스IT(미루스(Mirus) MIR2306) 형질감염 시약(40 ㎕)을 실온에서 2 ㎖ OptiMEM 생육 배지 + 글루타민(2 mM 최종 농도)에 가하고, 와동에 의해 혼합하고 이어서 실온에서 15 분 동안 배양하였다. 맥시프렙 DNA(중쇄 및 경쇄 DNA 각각 8 ㎍)를 상기 혼합물에 가하고 실온에서 15 분 동안 배양하였다. 이어서 상기 형질감염 용액을 8 ㎖의 생육 배지(DMEM, HIFBS, pen, strep, 글루타민)를 함유하는 조직 배양 디쉬에 가하였다. 37 ℃, 10% CO₂에서 24 시간 동안 배양 후에, 상기 세포를 R1CD1 무혈청 생육 배지로 세척하고 이어서 10 ㎖ R1CD1(pen, strep, 글루타민이 첨가됨) 중에서 37 ℃, 10% CO₂에서 48 시간 동안 증식시켰다. 상기 처리된 배지를 상기 세포로부터 제거하고, 원심분리시켜 임의의 찌꺼기를 펠릿화하고, 상등액을 새로운 튜브로 제거하였다.

일시적으로 형질감염된 COS-1 세포에 의해 생성된 항체의 농도를 전체 인간 IgG-Fc 특이성 ELISA를 사용하여 정량분석하였다. 간단히, 편평 바닥 ELISA 플레이트를, PBS 중의 항체(1 ㎍/㎖) 100 ㎕를 각 웰에 가하고 실온에서 밤새 배양함으로써 염소 항-인간 IgG(피어스(Pierce) 31125)로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 3 내지 24 시간 동안 PBS 중의 0.02% 카제인 용액 100 ㎕/웰로 차단하고 이어서 세척하였다. 표준 및 샘플을 분석 완충제(PBS 중의 0.5% BSA, 0.02% 트윈-20)로 희석하고, ELISA 플레이트에 분배하고(100 ㎕/웰), 실온에서 3 내지 24 시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 분석 완충제 중에서 1:5000 희석된 염소 항-인간 IgG(피어스 31413)를 분배하고(100 ㎕/웰), 상기 플레이트를 실온에서 15 분간 배양하였다. 세척 후에, 상기 플레이트를 BioFX TMB(TMBW-0100-01)(100 ㎕/웰)의 첨가에 의해 전개시켰다. 상기 반응을 0.18 N H₂SO₄(100 ㎕/웰)로 정지시킨 후에, 상기 플레이트를 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices) vMax 플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚에서 판독하였다. 샘플 농도를 상기 표준의 일련의 희석물로부터 측정된 곡선의 선형 범위를 사용하여 계산하였다.

상기 일시적인 형질감염 실험의 결과를 하기 표에 나타내며, 표에서 POI는 단백질 A 정제후 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 관심 피크를 나타낸다. POI는 고분자량 응집체 또는 분해 산물에 의한 것과 상반되게, 세포에 의해 발현된 완전한 전체 크기 항체의 비율을 나타낸다.

뜻밖에도, 상기 OGD1.0.0 항체는 일시적인 형질감염후 동일한 조건 하에서 상기 OGD1.1.1 항체보다 훨씬 더 높은 수준(즉 10 배 더 높은)으로 발현되었다. 중요하게도, 상기 POI 값에 의해 지시된 바와 같이, 상기 관찰된 크게 증가된 발현 수준은 고분자량 복합체 또는 분해 산물과 상반되게 거의 전적으로 완전한 전체 크기 항체와 관련된다. 이러한 발현의 차이는, OGD1.0.0과 OGD1.1.1 간에, 상기 VH 영역(즉 서열번호 44와 7의 잔기 번호 111)의 카밧 위치 108에 단지 하나의 아미노 차이 및 상기 VL 영역(즉 서열번호 46과 9의 잔기 번호 100)의 카밧 위치 100에 하나의 아미노산 차이가 존재한다는 점에 비추어 훨씬 더 놀랍다. 도 1a 및 도 1b를 참조하시오.

상기 설명된 바와 같이, 이러한 구조 및 작용상 차이는 각각 VH1 및 VL1에 비해 VH0 및 VL0의 상이한 J 분절의 사용에 기인한다. 하기에 설명하는 바와 같이, 가장 중요한 차이는 상기 VH 영역에 대한 변화인 듯하다. 현저하게도, 이는 여기에서 관찰된 대단히 증가된 정도는 고사하고, 인간화된 항체를 제작하기 위해 사용된 J 분절의 선택이 어쨌든 항체 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다는 최초의 증거인 것으로 여겨진다. 이러한 발견은 OGD1.0.0의 생산에 필요한 상품의 비용을 현저하게 감소시킬 것이 예상되기 때문에 특히 중요하다. 이러한 발견 없이는, 상기 항체를 시중에 필요한 양으로 생산하는 것이 상기 항체로 처리되는 것으로부터 이익을 얻는 대상 집단에 손해를 입힐 정도로 경제적이지 않을 것이다.

[표 3]

실시예 2

OGD1.0.0 및 OGD1.1.1의 안정한 발현 분석

OGD1.0.0 및 OGD1.1.1의 안정한 발현을 CHO-DUKX 세포에서 시험하였다. 간단히, 세포를 80% 세포밀집도로 증식시키고 이어서 선행 실시예에 개시된 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 각각 25 ㎍(총 50 ㎍)(즉 한 세트의 세포에 대해서 VH0 및 VL0, 및 또 다른 세트의 세포에 대해서 VH1 및 VL1)과 함께 리포펙타민 형질감염 시약을 사용하여 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, 소비된 배지를 매 3 내지 4 일마다 새로운 R1CD1 배지 + 10% FBS로 교환하였으며 이러는 동안 안정한 풀이 확립되었다.

안정한 형질감염체가 확립된 후에, 세포가 무혈청 R5CD1 배지 중에 부착된 세포로서 증식되었을 때 상기 세포가 항-GDF-8 항체를 발현하는 능력을 시험하였다. 이러한 조건 하에서, OGD1.0.0을 발현하는 세포는 96 시간의 증식 후에 47.3 ㎎/L의 항체를 발현한 반면, OGD1.1.1을 발현하는 세포는 72 시간의 증식 후에 41 ㎎/L의 항체를 발현하였다. 항체를 1 ㎖ 단백질-A 컬럼을 사용하여 정제하고 이어서 농도를 HPLC를 사용하여 정량분석하였다.

부착된 세포가 무혈청 배지에서 현탁 증식에 적합하게 되었으면, OGD1.0.0 및 OGD1.1.1 항체의 발현을 다시 측정하였다. AS1 무혈청 배지를 3.0 x 10⁵ 생육성 세포/㎖로 시딩하고 37 ℃에서 배양하였다. 네 번째 날에, pH를 7.3으로 조절하고, 공급물 농축물을 가하고, 상기 배양 온도를 추가로 3 일 증식을 위해 31 ℃로 낮추었다. OGD1.0.0 발현 세포를 100 L 배양 부피에서 증식시킨 반면, OGD1.1.1 발현 세포는 50 ㎖ 배양 부피에서 증식시켰다. 모든 다른 생육 조건들은 세포들간에 동일하였다. 일곱 번째 날에, OGD1.0.0 발현 세포는, 단백질-A 정제 및 HPLC 정량분석에 의해 측정된 바와 같이, 66.12 ㎎/L 항체를 발현한 반면, OGD1.1.1 발현 세포는 10.6 ㎎/L 항체를 발현하였다. OGD1.0.0 세포를 사용하는 실험을, 상기 세포를 100 L 배양물에서, 31 ℃에서 5 일을 포함하여 9 일 동안 증식시킴으로써 반복한 경우, 상기 항체 농도가 207.2 ㎎/L까지 증가하였다. OGD1.0.0 발현 세포를 25 L 배양물에서, 31 ℃에서 7 일을 포함하여 11 일 동안 증식시킨 또 다른 실험에서, 상기 항체 농도는 145 ㎎/L이었다. OGD1.1.1 발현 세포를 무혈청 R5CD1 배지 중의 50 ㎖ 배양물에서, 31 ℃에서 3 일을 포함하여 7 일 동안 증식시킨 별도의 실험에서, 상기 항체 농도는 39.3 ㎎/L이었다.

상기 안정한 형질감염 실험의 결과를 하기 표에 나타내며, 표에서 POI는 단백질 A 정제후 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 관심 피크를 나타낸다. OGD1.0.0 및 OGD1.1.1이 일시적으로 형질감염된 COS-1 세포에서 발현되었을 때 획득된 결과와 일관되게, 상기 OGD1.0.0 항체의 발현 수준은 유사한 조건 하에서 안정하게 형질감염된 CHO 세포에서 OGD1.1.1의 발현에 비해 실질적으로 더 높았다. 이러한 놀라운 결과는 상기 일시적인 형질감염 실험에서 관찰된 발현 수준의 증가와 일치한다. 상기 결과는 또한 상기 발현 세포를 배양하는 방식이, 부착성이든 현탁액 중이든, 세포 유형에 관계 없이, OGD1.1.1에 비해 OGD1.0.0 항체의 증대된 발현에 실질적인 영향을 미치지는 않음을 암시한다.

[표 4]

실시예 3

OGD1.0.1 및 OGD1.1.0의 일시적인 발현 분석

상기 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중의 J 분절들이 변하였기 때문에, 어느 변화가 단독으로, 관찰된 OGD1.0.0의 현저하게 더 높은 발현 수준을 유발하기에 충분했는지, 또는 가능하게는 두 변화가 모두 증가된 항체 발현에 기여했는지의 여부는 불분명하였다.

이를 연구하기 위해서, 출원인들은 상술한 일시적인 형질감염 실험을 반복하였으나, 추가로 하나의 플레이트에서는 VH0 및 VL1 구조물을 병용하고 또 다른 플레이트에서는 VH1 및 VL0 구조물을 병용하였으며, 이어서 ELISA를 사용하여 항체 발현 수준을 정량분석하였다. 하기 표에 나타낸 상기 실험의 결과는 상기 VH 영역 중 JH3 J 분절에 대한 JH4의 치환이 출원인에 의해 관찰된 대단히 증가된 항체 발현을 부여하기에 충분함을 입증한다. 환언하면, 상기 카파 J 분절의 변화(즉 JK1 대신 JK4)는 발현 수준에 실질적으로 영향을 미치지 않는 듯하다.

[표 5]

실시예 4

항-GDF-8 항체에 의한 GDF-8 결합

모 쥐 항체, 키메릭 마우스-인간 항체(쥐 가변 도메인 및 인간 불변 도메인) 및 인간화된 항체 OGD1.0.0 및 OGD1.1.1에 의한 GDF-8 결합을 정량적인 ELISA 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 분석하였다. 상기 ELISA 실험에서, GDF-8의 그의 동족 고 친화성 수용체 ActRIIB에 대한 결합을 억제하는 상기 항체들의 능력을 IC₅₀ 값을 계산하여 측정하였다. SPR 분석을 사용하여 겉보기 K_D 값을 계산하였다. 결과를 표 6에 나타낸다.

ELISA를 위해서, ActRIIB-Fc 융합 단백질(0.2 M 나트륨 카보네이트 완충제 중의 1 ㎍/㎖)을 4 ℃에서 밤새 96 웰 편평-바닥 분석 플레이트상에 코팅하였다. 이어서 코팅된 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 PBS 0.1% 트윈(200 ㎕/웰) 중의 1 ㎎/㎖ BSA로 차단하고 이어서 세척하였다. 상이한 항체 농도를 비오틴에 접합된 10 ng/㎖ GDF-8과 병용하고 실온에서 45 분 동안 배양하였다. 배양 후에, 상기 시험 용액을 상기 차단된 ELISA 플레이트(100 ㎕/웰)에 가하고 실온에서 1 시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 웰을 세척한 후에, 대조군에 비해 상기 고정화된 ActRIIB-Fc에 결합된 GDF-8의 양을 스트렙트아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제(30 분 배양) 및 TMB로 검출하였다. 450 ㎚에서 비색측정 측정치를 미세플레이트 판독기에 기록하였다. 쥐 및 키메릭 항체를 사용하는 실험을 각각 4 회 반복하고 평균하였다.

SPR을 25 ℃에서 BIACORE 3000(GE 헬쓰케어) 기계를 사용하여 수행하였다. 쥐 항체를 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 포획한 반면, 인간화된 항체는 단백질 A를 사용하여 포획하였다. 단백질 A를 아민 커플링 화학을 사용하여 CD5 센서칩의 4 개의 유동 셀 모두상에 고정화시켰다. 상기 표면을, 7 분간 0.2M N-에틸-N-다이메틸-아미노-프로필-카보다이이미드(EDC) 및 50 mM N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 용액을 주입하여 활성화시켰다. 단백질 A를 pH 5.0에서 10 mM 나트륨 아세테이트 완충제 중에서 50 ㎍/㎖로 희석하고 3 분간 분당 10 ㎕의 유속으로 주입하였다. 이어서 상기 표면을 1 M 에탄올아민(ETH)으로 7 분간 차단시켰다. 단백질 A의 최종 고정화 수준은 1000 내지 1200 응답 단위(RU)였다. 상기 고정화 과정에 이어서 실행 완충제(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P20)로 수회 세척하여 표면을 평형화시켰다. 항체들을 HBS-EP 완충제로 0.25 ㎍/㎖로 희석하였다. 각 항체(5 ㎕)의 용액을 단백질 A 코팅된 유동 셀 2, 3 또는 4 위에 10 ㎕/분의 속도로 주입하여, 약 200 RU의 포획 항체를 제공하였다. 일련의 GDF-8 적정물(4.0 nM에서부터 0.125 nM까지 2-배 희석물)을 pH 5.0의 0.01 M 나트륨 아세테이트, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P20 중에서 제조하였다. 후자의 용액을 또한 실행 완충제로서 사용하였다. GDF-8 용액을 2 분간 50 ㎕/분의 유속으로 포획 황체 상에 주입하고 30 분간 용해시켰다. 각 주기의 주입 및 포획 후 상기 센서칩 표면을 pH 2.5에서 50 ㎕/분의 유속으로 30 ㎕의 10 mM NaPO₄, 0.5 M NaCl로 재생시켰다. BIA평가 소프트웨어(ver.4.1.1, GE 헬쓰케어)를 데이터 분석에 사용하였다. 데이터를, 상기 완충제 및 기준 표면에 의해 부여된 신호를 감하여 이중참조하였다. 랭뮤어 1:1 모델을 사용하여 상기 센서그램 데이터를 전체적으로 적합화하고 K_D 값을 계산하였다. OGD1.0.0을 사용하는 실험을 각각 3 회 반복하고 평균하였다.

ELISA를 사용하여 측정된 IC₅₀ 값은 시험된 항체 버전들간에 필적할만하다. 보다 정확한 SPR 분석에서, OGD1.0.0은 OGD1.1.1에 비해 GDF-8에 대한 실질적으로 더 큰 결합 친화성을 가졌다.

[표 6]

실시예 5

OGD1.0.0 항체의 GDF-8 중화 능력

GDF-8 매개된 신호전달을 중화하는 항-GDF-8 항체의 능력을 리포터 유전자 분석을 사용하여 확인하였다. pGL3(CAGA)₁₂라 칭하는 리포터 구조물을, TATA 상자의 상류에 12 CAGA 상자, 및 루시페라제 리포터 벡터 pGL3(프로메가(Promega)) 중의 아데노바이러스 주요 말기 프로모터로부터 전사 개시 부위를 놓아 제작하였다. PAI-1 유전자의 프로모터에서 발견되는 상기 CAGA 상자는, GDF-8에 또한 응답하는 TGFβ 응답 요소이다. 인간 횡문근육종 세포주 A204(ATCC HTB-82)를 pGL3(CAGA)₁₂로 일시적으로 형질감염시키고, 2 mM 글루타민, 100 U/㎖ 스트렙토마이신, 100 ㎍/㎖ 페니실린 및 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 맥코이(McCoy)의 5A 배지 중에서 16 시간 동안 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 항체들을 실온에서 1 시간 동안 1 ㎎/㎖ BSA가 보충된 배지에서 GDF-8(10 ng/㎖)과 함께 예비배양하였다. 이어서 세포를 37 ℃에서 6 시간 동안 시험 샘플 및 대조군(GDF-8 없이 및 항체가 첨가되지 않은 GDF-8(10 ng/㎖) 포함)로 처리하였다. 루시페라제 활성을 루시페라제 분석 시스템(프로메가)을 사용하여 측정하였다. 쥐 및 키메릭 항체를 사용하는 실험을 각각 2 회 반복하고 평균한 반면, OGD1.0.0을 사용하는 실험은 3 회 반복하여 평균하였다. 리포터 유전자 분석을 사용하여 측정한 EC₅₀ 값은 시험된 항체 버전들간에 필적할만하다.

[표 7]

실시예 6

마우스에서 OGD1.0.0 항체는 근육 질량, 근력 및 실질 질량을 증가시킨다

8주된 수컷 C57Bl/6 마우스에게 2 주 동안 주당 1 회 OGD1.0.0(10 ㎎/㎏) 또는 비히클 대조군(PBS)을 복강내(IP) 투여하였다. 총 8 마리의 마우스를 각 군에 사용하였다. 14 일째에, 전신 실질 질량을 소동물 NMR 영상화에 의해 측정하였다. 실질 질량을 측정한 후에, 상기 동물을 안락사시키고 비복근, 사두근 및 장지 신근(EDL)을 절제하고 칭량하였다. 상기 EDL 근육을 또한 생체외에서 힘을 발생시키는 그의 능력에 대해 시험하였다.

2 주 처리 후에, 대조용 동물의 실질 질량은 1.66 ±0.56 g까지 증가한 반면 OGD1.0.0으로 처리된 동물의 실질 질량은 3.36±0.62 g까지 증가하였으며, 이는 대조군에 비해 102% 증가를 나타낸다.

도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 사두근 질량은 OGD1.0.0 항체로 처리된 동물에서 대조군에 비해 14.8% 증가하였고, 비복근 질량은 대조군에 비해 10.3% 증가하였으며, EDL 근육 질량은 대조군에 비해 10.8% 증가하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, OGD1.0.0 항체로 처리된 동물에서, 상기 EDL 근육에 의해 발휘된 전체 강직성 수축력은 비히클 대조군으로 처리된 마우스로부터의 EDL 근육에 의해 발생한 힘에 비해 14.8% 증가하였다. 데이터를 평균±SEM으로서 나타낸다.

OGD1.0.0 처리에 응답하는 사두근 및 비복근의 전신 실질 질량 및 근육 질량의 용량 반응성을 또한 측정하였다. 이들 실험에서, 12 주된 암컷 C57Bl/6 마우스를 군들(n=6)로 분할하고 4 주 동안 매주 비히클 또는 0.3, 1, 3, 10 또는 30 ㎎/㎏의 OGD1.0.0으로 처리하였다. 상기 처리 기간의 7, 14, 21 및 28 일째에, 실질 질량을 NMR 영상화를 사용하여 측정하였다. 상기 연구 기간의 끝에서, 상기 시험 동물을 안락사시킨 후에 사두근 및 비복근을 절제하고 칭량하였다. 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 상기 사두근 및 비복근의 근육 질량은 약 10 ㎎/㎏까지 항체 용량의 상승에 따라 증가하였다. 유사하게, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 전신 실질 질량은 약 10 ㎎/㎏까지 항체 용량의 상승에 따라 증가하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다.

실시예 7

OGD1.0.0 항체는 mdx 마우스에서 근육 질량 및 실질 질량을 증가시킨다

X-결합된 디스트로핀 유전자(Dmd)의 mdx 돌연변이가 C57BL/10ScSn 마우스에서 자발적으로 발생하였으며 글루타민 코돈을 종결 코돈으로 전환시키는 유전자 위치 3185에서 엑손내에 점 돌연변이를 유발시키고 상기 디스트로핀 단백질을 조기 종결시켰다. 그 결과, mdx 마우스는 작용성 디스트로핀이 결여되고 인간 뒤센 근이영양증의 소동물 모델로서 작용한다. 약 3 주 정도에 출발하여 근육 괴사가 일부 가시적인 근육 허약과 함께 발생한다. 골격 사지 근육은 지속적이고 점진적인 퇴행과 괴사를 특징으로 하는 반면, 이는 위성세포에 의해 활성화되는 재생 반응 및 근육 비대에 의해 상쇄된다. 상기 mdx 돌연변이체의 근육은 탄성의 전체적인 감소를 가지며, 이는 상기 근육을 늘임-활성화로 인한 손상에 보다 민감하게 한다. 돌연변이 마우스에서 다리 근육은 처음에 정상적으로 발생하지만, 빠르고 느린 섬유 유형 모두로의 재생된 근관세포의 분화가 현저하게 억제된다. 상기 mdx 마우스의 비교적 순한 표현형은 부분적으로 상기 디스트로핀-관련 단백질 유트로핀(이는 다자란 mdx 돌연변이체에서 근섬유 재생에 있어서 고도로 상향조절된다)의 보상 작용에 기여할 수 있다. 사지 근육과 상반되게, mdx 마우스의 횡경막 근육은 현저한 재생 단계를 겪지 않으며, 따라서 연속적인 영양불량은 상기 근육을 나이에 따라 약화시킨다. 특정한 수축력, 특정한 강직성 수축력 및 최대 출력 모두 상기 mdx 돌연변이체의 횡경막에서는 감소된다.

8주된 수컷 mdx 및 대조용 C57Bl/6 마우스에게 8 주 동안 주당 1 회 OGD1.0.0(10 ㎎/㎏) 또는 비히클 대조군(PBS)을 복강내(IP) 투여하였다. 이들 실험에서, 10 마리의 mdx 마우스를 항체로 처리하고, 8 마리에게는 비히클 대조군을 투여하고, 6 마리의 C57Bl/6 마우스는 각각 항체 또는 PBS로 처리하였다. 상기 처리 기간의 끝에서, 전신 실질 질량, 악력 강도, 및 근육 질량을 측정하였다. 전신 실질 질량을 소동물 NMR 영상화에 의해 측정하였다. 악력 강도는 시험 동물을 철망상에 놓고, 상기 동물이 상기 망을 사지로 잡게 하고, 이어서 꼬리를 잡아당기고 상기 동물이 그의 악력을 풀때의 최대 절정의 힘을 측정함으로써 시험하였다. 동물당 데이터를 3 내지 5 회의 시험으로부터 평균하였다. 실질 체질량 및 악력 강도를 측정한 후에, 상기 마우스를 안락사시키고 사두근 및 비복근을 절제하고 칭량하였다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, OGD1.0.0 항체에 의한 처리는 상기 mdx 마우스에서 실질 질량을, PBS로 처리된 mdx 마우스에서 평균 4.83±0.4 g에 비해 평균 7.28±0.4 g으로 증가시켰다. 상기 차이는 p<0.05에서 통계학적으로 유의수준이었다. 따라서, 실질 질량은 상기 8 주 연구에서 비히클 처리된 대조군에 비해 mdx 마우스에서 50%±8.2%까지 증가하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 항체 처리는 또한 mdx 마우스에서 비히클 처리된 대조군에 비해 악력 강도를 증가시켰다. 상기 차이는 p<0.05에서 통계학적으로 유의수준이었다.

도 7a에 나타낸 바와 같이, 항체 처리는 mdx 및 C57Bl/6 마우스에서 PBS로 처리된 동일한 유형의 마우스에 비해 비복근 및 사두근의 질량을 증가시켰다. 상기 증가는 통계학적으로 유의수준이었다(mdx 사두근 및 비복근에 대해서 각각 p = 0.005 및 p = 0.002, 및 C57Bl/6 사두근 및 비복근에 대해서 각각 p = 0.001 및 p = 0.003). 도 7b에 나타낸 바와 같이, 항체 처리된 mdx 마우스로부터 비복근 및 사두근의 질량은 비히클 처리된 대조용 마우스에 비해, 각각 12.2% 및 12.1% 증가하였다. C57Bl/6 마우스로부터의 동일한 유형의 근육의 질량은 비히클 처리된 대조군에 비해 항체로 처리후 15.2% 및 12.8%까지 또한 증가하였다(도시 안 됨).

실시예 8

OGD1.0.0 항체는 비-인간 영장류에서 근육 부피 및 실질 질량을 증가시킨다

실질 체질량 및 근육 부피에 대한 사이노몰구스 원숭이의 OGD1.0.0 항체 투여 효과를 조사하는 2 개의 연구를 설계하고 수행하였다.

각각의 연구를 8 주 지속하였으며, 이때 동물에게 항체를 매주 IV 투여에 의해 투여하고 양의 질소 균형을 보장하기 위해서 과도한 먹이를 제공하였다. 첫 번째 연구에서, 3 마리의 수컷 및 3 마리의 암컷 원숭이들 각각에게 PBS 비히클 또는 OGD1.0.0 항체를 3.0 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였다. 상기 첫 번째 처리 전 및 이어서 4 주 및 8 주째에, 동물들을 마취시키고 이어서 이중-에너지 X-선 흡수분석(DEXA), 컴퓨터 x-선 단층촬영(CT) 및 자기 공명 영상화(MRI)를 사용하여 영상화하여 실질 질량 및 지방 함량을 포함한 체 조성을 검출하고 측정하였다. 이어서 연구 1로부터의 실험 동물을 안락사시키고 해부하였다. 두 번째 연구에서, 오직 수컷 원숭이만을 사용하였으며 비히클만(n=5) 또는 10 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏(각각 n=5 및 n=3 원숭이)의 용량의 OGD1.0.0 항체를 제공하였다. 상기 실험 동물들을 상기 첫 번째 연구에서와 같이 8 주째에 영상화하였다. 그 후에, 상기 동물들을 보충된 식이요법으로 유지시키고 12, 17 및 26 주째에 다시 영상화하였다.

상기 두 연구로부터 DEXA에 의해 측정된 실질 체중에 대한 8 주 데이터를 합하여 분석하였다. 결과를 도 8에 나타내며, 상기 도면은 OGD1.0.0 항체로 8 주 처리 후에, 전체 실질 질량 및 다리 실질 질량의 용량 반응성 증가가 존재하였음을 입증한다. 데이터를 평균±SEM으로서 나타낸다. 상기 연구에 포함된 원숭이의 수는 비히클 단독의 경우 n=11, 3 ㎎/㎏ 항체의 경우 n=6, 10 ㎎/㎏의 경우 n=10, 및 30 ㎎/㎏의 경우 n=8이었다. 비히클 처리된 대조군에 대한 전신 실질 질량 및 다리 실질 질량의 증가는 시험된 모든 항체 용량에서 통계학적으로 유의수준이었다(p<0.05). 더욱이, 10 ㎎/㎏에 비해 30 ㎎/㎏으로 처리된 원숭이의 다리 실질 질량의 증가가 또한 통계학적 유의수준(p<0.05)에 도달하는 것으로 밝혀졌다.

흥미롭게도, 도 9에 나타낸 바와 같이, 10 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏ OGD1.0.0 항체로 처리된 두 번째 연구에서 원숭이들간의 실질 체중의 증가는 7 주째에 최종 항체 투여에 이어서 몇주의 기간 동안 지속되었다. 상기 데이터를 매 시점에서 PBS 비히클과 비교된 차이로서 나타낸다. 보다 높은 용량에 대해서 대조군에 대한 증가는, 나타낸 모든 주에서 p<0.05로 통계학적 유의수준이었다. 보다 낮은 용량에 대한 증가는 p<0.09로 4 주 및 8 주째에 통계학적으로 유의수준이었다.

요추 L3-L5에 비해 척추 등쪽에 놓인 축상 근육의 부피에 대한 OGD1.0.0 항체 처리의 효과를 CT 스캔에 의해 측정하였다. 도 10a 및 도 10b에 나타낸 바와 같이, 축상 부피는 PBS 투여된 대조군에 비해 8 주간 10 ㎎/㎏(n=5) 및 30 ㎎/㎏(n=3) OGD1.0.0 항체로 처리된 시험 동물에서 실질적으로 증가하였다. 근육 부피의 증가는 p<0.05에서 통계학적으로 유의수준이었다.

도 11은 30 ㎎/㎏ OGD1.0.0 항체로 4주 처리 후에 예시적인 시험 대상자로부터의 축상 근육의 3D 렌더링이다. 기준선(좌측)에 비해 생성된 근육 부피의 증가(실질적으로 명백하다)(우측)는 22%였다.

실시예 9

OGD1.0.0 항체는 Fc 도메인 효과기 작용이 없다

Fcγ 수용체의 패널에 대한 Fcγ 수용체(FcγR) 결합을 없애는 것으로 공지된 Fc 영역 중 3 개의 돌연변이를 포함하는 OGD1.0.0 항체에 의한 결합을 표면 플라스몬 공명을 사용하여 시험하였다. 모든 실험을 바이아코어 T200 장비(GE 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. 간단히, 100 RU의 GDF-8을 비오틴 태그(여기에 약 100 RU의 OGD1.0.0 항체가 포획된다)를 통해 센서칩-SA상에 포획한 다음, CD32a-131H, CD16a-158V, CD32b에 대해서 1 내지 21 μM 및 CD64에 대해서 0 내지 270 nM의 농도 범위로 FcγR을 유동시켰다. 각각의 FcγR 결합 실험에 대해서, 주입은 단일-주기 동역학 모드를 사용하여 연속해서 수행하였다. 결합 및 해리 단계들을 각각 120 초간 지속시켰다. 최종 주입에 이은 해리 단계의 끝에서, GDF-8을 함유하는 표면을 0.1% TFA 용액의 20 초 펄스를 사용하여 재생시켰다.

CD16, CD32a 및 CD64에 대한 결합은 없는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, CD32b에 대한 결합이 관찰되었으나, 단지 시험된 최고의 농도(21 μM)에서만 관찰되었다. 21 μM 이상에서 데이터 점의 결여로 인해, 정확한 Kd는 측정되지 않았으나, 21 μM 이상인 것으로 추정할 수 있으며, 이는 야생형 IgG1 분자의 Kd(즉 2 내지 4 μM)에 비해 매우 약한 것으로 생각된다. 이러한 결과는 OGD1.0.0 항체가 효과기 작용을 유도하는 능력을 실질적으로 또는 전혀 감소시키지 않을 것임을 가리킨다.

실시예 10

GDF-8에 결합된 항-GDF-8 항체의 결정 구조

본 실시예에 설명된 바와 같이, 인간 GDF-8에 결합된 키메릭 마우스 및 인간화된 항-GDF-8 항체의 결정 구조를 분석하고 이를 사용하여 서로 접촉하는 항체 및 GDF-8내 아미노산들의 정체를 측정하였다.

Fab 단편을 인간 IgG1 불변 영역과 결합된 쥐 VH 및 VL 영역(각각 서열번호 3 및 서열번호 5)을 함유하는 키메릭 항-GDF-8 항체로부터 제조하였다. 이어서 상기 Fab 단편을 인간 GDF-8 단백질과 혼합하여 결합된 복합체를 형성시켰다. 단백질 복합체를 50 mM 트리스 하이드로클로라이드 pH 7.5 및 100 mM 염화 나트륨 중에서 10.75 ㎎/㎖로 농축시켰다. 20% PEG MME 5000 및 100 mM 비스-트리스 pH 6.5를 함유하는 용액에 대해 18 ℃에서 평형화된 현적법(hanging drop)을 사용하여 결정을 형성시켰다. 인간화된 항-CDF-8 항체 OGD1.0.0 및 GDF-8로부터 제조된 Fab를 함유하는 결정을, 상기 단백질 용액을 20% PEG 3350 및 200 mM 염화 나트륨을 함유하는 완충되지 않은 용액에 대해 평형화시킴을 제외하고 유사하게 제조하였다.

각각의 결정에 대한 단일-파장(1.0 Å) 데이터를 ID 빔라인(SER-CAT, 어드밴스드 포톤 소스, 아르곤 내셔널 래보러토리(Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory)에서)상에 수집하였다. -180 ℃로 냉각시킨 단결정을 각각의 데이터 세트에 사용하였다. 데이터를 덴조(DENZO) 및 스케일팩(Scalepack)(문헌[Z. Otwinowski and W. Minor, "Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode", Methods in Enzymology, Volume 276: Macromolecular Crystallography, part A, p.307-326, 1997,C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet, Eds., Academic Press (New York)](참고로 인용된다))을 사용하여 처리하였다. GDF-8과 복합체를 이룬 키메릭 항체의 구조를 프로그램 아모레(AMORE)(문헌[Navaza, J. (2001). Implementation of molecular replacement in AMoRe. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 57, 1367-1372](참고로 인용된다))를 사용하여 분자 치환에 의해 분석하였다. 상기 분자 치환 연구에 사용된 탐침은 PDB 진입 1HZH이었다. 정제에 앞서, 상기 데이터의 5%를 무작위로 선택하여, 상기 정제의 진행을 모니터하기 위한 R_free 시험 세트로서 지정하였다. 이어서 각 복합체의 구조를 일련의 생략 지도를 사용하여 쿠트(Coot) 내에서 재건하였다(문헌[Emsley, P. & Cowtan, K. (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132](참고로 인용된다)). 상기 정제로부터의 통계를 표 8에 나열한다. GDF-8과 복합체를 이룬 인간화된 OGD1.0.0의 구조를 유사하게 분석하였으나, 단 사용된 탐침은 키메릭 항체의 구조였다.

[표 8]

기 공-결정 구조에 근거하여 서로 접촉하는 것으로 추론된 항체 및 GDF-8 중 잔기들을 표 9에 나열하며, 표에서 VH 쇄로부터의 항체 잔기는 "H"가 선행하며 서열번호 3과 관련하여 넘버링된다. VL 쇄로부터의 잔기는 "L"에 의해 선행되며 서열번호 5와 관련하여 넘버링된다. 성숙한 인간 GDF-8로부터의 숫자는 서열번호 1과 관련하여 넘버링된다. 잔기들은 이들이 한쌍 이상의 접촉 원자들을 함유하는 경우 서로 접촉하는 것으로 정의되었다. 원자들은 이들이 접촉비 C < 1.3(여기에서 C = D₁₂ ÷ (R₁ + R₂), D₁₂는 상기 원자들간의 거리이고, R₁은 원자 1의 vdW 반경이고, R₂는 원자 2의 vdW 반경이다)을 갖는 경우 접촉으로서 정의되었다. 실제로, 접촉 원자들간의 평균 거리는 약 4.7 Å이지만, 임의의 특정한 경우에 실제 거리는 문제 원자의 유형에 따라 변하였다.

[표 9]

실시예 11

항체 VH 및 VL 영역의 추가적인 인간화

GDF-8과 공-결정화된 항-GDF-8 항체의 서열 분석 및 구조를 근거로, 항체 VH 및 VL 영역을 그들의 서열을 추가로 인간화하기 위한 노력으로 변형시켰다. 추가로 인간화된 VH 영역의 서열 정렬을 도 1a에 나타낸다. 추가로 인간화된 VL 영역의 서열 정렬을 도 1b에 나타낸다. 새로운 VH 및 VL 영역을 함유하는 발현 구조물을 생성시킨 후에 항체를 일시적으로 형질감염된 COS-1 세포에서 생성시키고 표준 기법을 사용하여 정제하였다. 이어서 GDF-8에 대한 결합 친화성 및 상기 항체의 중화 활성을 본 발명에 개시된 바와 같이 시험하였다. 결과를 표 10에 기록한다.

상기 인간화된 VH0 및 VL0 영역(쥐 항체로부터 기원하였다)으로부터의 CDR2 아미노산 서열을 각각 인간 생식계열 VH 영역 DP-47 및 VL 영역 DPK-9로부터의 CDR2 서열과 비교하였다. 상기 인간 서열과 상이한 VH0 및 VL0 CDR2 서열 중 모든 잔기들은 인간으로 변화하였다. 새로운 VH 및 VL 영역을 각각 VH2(서열번호 66) 및 VL2(서열번호 67)로 지정하였다. VH2 및 VL0 영역 및 VH0 및 VL2 영역을 사용하여 생성시킨 완전 항체를, 경쟁 ELISA 실험에서 GDF-8에 대한 결합에 대해 시험하였다. 상기 결과는 완전한 인간화 VH CDR2가 GDF-8 결합을 실질적으로 감소시키는 반면, 완전한 인간화 VL CDR2가 항원 결합을 상실시키지 않음을 나타내었다.

VH 및 VL 영역의 추가적인 인간화는 상기 공-결정 구조를 기본으로 하였다. 여기에서, 상기 VH 및 VL 영역의 CDR 중 마우스-유래된 잔기는 오직 상기 공-결정 구조 중의 GDF-8 잔기들이 접촉하는 것으로 관찰된 경우에만 유지되었다. 달리, 모든 VH 및 VL CDR 잔기는 각각 DP-47 및 DKP9 중 상응하는 인간 잔기로 변화하여 VH3(서열번호 68) 및 VL3(서열번호 69)을 생성시켰다. 경쟁 ELISA 실험에서 VH3 및 VL0을 포함하는 항체(즉 OGD1.3.0)는 현저한 활성 손실을 나타낸 반면, VH0 및 VL3을 포함하는 항체(즉 OGD1.0.3)는 완전한 활성을 유지하는 것으로 나타났다.

VL2 중 CDR2의 서열을 기본으로, VL3의 위치 50을 알라닌(즉 S50A)으로 치환시켜 VL4(서열번호 71)를 생성시켰다. 상기 VL 영역을 사용하여 제조된 VH0 및 VL4를 포함하는 항체(즉 OGD1.0.4)는 상당한 활성을 유지하였다. 상이한 돌연변이, W96L을 VL3의 CDR3에 도입시켜 VL5(서열번호 73)를 생성시켰다. 그러나, 상기 VL 영역을 사용하여 제조된 VH0 및 VL5를 포함하는 항체(즉 OGD1.0.5)는 OGD1.0.0에 비해 감소된 활성을 나타내었다.

새로운 돌연변이들을 또한 상기 중쇄 가변 영역에 도입시켰다. 2 개의 치환, 즉 M99F 및 N101D를 CDR3에 도입시켜 VH4(서열번호 70)를 형성시켰다. 상기 VH 영역을 사용하여 제조한 VH4 및 VL0을 포함하는 항체(즉 OGD1.4.0)는 실질적으로 감소된 활성을 가졌으며 이는 GDF-8에 대한 감소된 결합 친화성과 상관있다. CDR2에서, G53S 치환을 수행하여 VH5(서열번호 72)를 생성시켰다. 상기 VH 영역을 사용하여 제조된 VH5 및 VL0을 포함하는 항체(즉 OGD1.5.0)는 상당한 활성을 유지하였다.

[표 10]

본 출원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 다른 서류들은 각각의 개별적인 공보, 특허, 특허 출원 또는 다른 서류가 개별적으로 모든 목적을 위해 참고로 인용되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해서 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

다양한 특정한 실시태양들을 예시하고 개시하였지만, 다양한 변화들을 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있음을 알 것이다.

ATCC PTA-12980 20120614 ATCC PTA-12981 20120614

SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. <120> IMPROVED ANTAGONIST ANTIBODIES AGAINST GDF-8 AND USES THEREFOR <130> PC071914 <140> PCT/IB2013/054810 <141> 2013-06-12 <150> 61/660,232 <151> 2012-06-15 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 2 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctcctat 180 ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacaagac 300 tatgctatga actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 gacattgaga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggacaatctc ctaaactact gctttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180 cggttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Leu 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CDRs and human VH & J segment <400> 6 gaggtccaac tattagaatc gggaggcggt ctggttcagc caggagggag tctcaggctt 60 agttgcgctg cgtcgggatt caccttttca agttacgcaa tgtcatgggt tcgtcaggca 120 ccggggaaag gcttagagtg ggtgtcaact attagctctg gcggtagcta tacgtcgtat 180 cctgactctg tgaagggacg atttacaata agccgggaca attctaaaaa cactttgtac 240 ctacagatga attccttgag agccgaagat accgccgtct actattgtgc gaagcaagat 300 tacgctatga actattgggg tcaagggaca atggtaacgg tatcctcc 348 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CDRs and human VH & J segment <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CDRs and human VH & J segment <400> 8 gacattcaaa tgacccaaag cccttcttcc ttaagcgcat cagtaggtga ccgagttaca 60 ataacgtgta aagcgagcca agatgtgagt actgcagtag cgtggtatca gcaaaagcca 120 gggaaggctc cgaaactatt gatttactcc gcctcttaca gatatacggg cgttcctgat 180 aggtttagtg gaagtgggtc gggtacggac tttaccctga ctatatcgtc acttcagcca 240 gaggattttg ctacctacta ttgccaacag cattattcaa caccgtggac attcggccag 300 ggaactaagg tcgaaataaa a 321 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CDRs and human VH & J segment <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 16 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 cgaaccgtag cggcaccgtc agtattcata ttccctccat cggacgagca attgaaaagt 60 gggacagctt cggtcgtgtg tctcttgaat aacttttacc ccagagaagc taaggtccag 120 tggaaagttg acaatgcgtt acagagcgga aattctcaag aatccgttac tgaacaggat 180 agtaaggatt ctacgtattc acttagcagt actctgaccc tatcaaaggc agattatgaa 240 aaacacaagg tatacgcctg cgaggtgacg catcaaggct tatccagccc agttacaaaa 300 tcttttaaca ggggtgagtg t 321 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 18 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human sequence with substitution mutations <400> 18 gcctccacaa aaggaccatc tgtttttccc ttggcgccat caagtaaatc tacttccgga 60 ggtaccgctg cgcttggctg cctcgtgaaa gactatttcc cagaacctgt cacagtctcg 120 tggaatagtg gtgctttaac ctcgggcgta catacttttc ctgctgtact tcaatcaagc 180 ggactgtact cattatcgtc tgtagtcacg gtcccgagtt cttcactcgg aacacagact 240 tatatatgca acgttaatca taagcctagc aacaccaagg ttgacaaaaa ggtggaacca 300 aaatcgtgcg ataagacgca cacatgtcca ccctgtcctg caccagaagc tctgggcgcg 360 ccatcggttt tcttgttccc acccaaacct aaggacacgt taatgataag tcgaacgcca 420 gaggtgacat gtgttgtagt ggatgtgagc cacgaagatc cggaagtaaa attcaattgg 480 tatgtagatg gtgttgaagt ccataacgca aaaactaagc cgagggaaga gcagtacaac 540 tctacttata gggtagtctc cgtactaact gtcttgcacc aagattggct aaatgggaag 600 gaatataaat gtaaggtttc aaataaggca ctaccagccc cgatagagaa gacaataagc 660 aaagcgaagg ggcaaccaag agagccccaa gtgtacacct tgcctccgag cagagaggaa 720 atgacaaaaa atcaagtatc ccttacgtgt ctggtaaagg gattttatcc aagtgacata 780 gcagtggagt gggagagtaa cggccagcca gaaaacaatt acaaaaccac tcccccggtt 840 ttagatagcg atgggagttt ctttttgtac tcaaagttga ccgttgacaa gtcacgatgg 900 cagcaaggta atgtatttag ttgttctgtt atgcatgagg ccttacataa tcactacacg 960 cagaaatctc tctccttaag ccccgggaaa 990 <210> 19 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CH region with substitution mutations <400> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr 1 5 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 26 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH, murine CDRs <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL, murine CDRs <400> 27 Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 405 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 atgaactttg tgctcagctt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgccatgt cttgggttcg ccagactccg 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctcctatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acaagactat 360 gctatgaact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 405 <210> 29 <211> 135 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 30 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 30 atggagtcac agattcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60 gacattgaga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180 ggacaatctc ctaaactact gctttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 240 cggttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 300 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa a 381 <210> 31 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 32 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 33 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic protein sequence <400> 34 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 gcttttgata tctggggcca agggacaatg gtcaccgtct cttca 45 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 37 <211> 46 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tactttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctcag 46 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaac 37 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaac 37 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 43 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH, murine CDRs <400> 43 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctcctat 180 ccagacagtg tgaagggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaacaagac 300 tatgctatga actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tgtcctcc 348 <210> 44 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CDRs and human VH & J segment <400> 44 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL, murine CDRs <400> 45 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc gcatcctacc ggtacactgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcaa cattatagta ctccatggac ctttggcggt 300 ggaacaaagg tggaaatcaa a 321 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CDRs and human VH & J segment <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH, murine CDRs <400> 47 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctcctat 180 ccagacagtg tgaagggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaacaagac 300 tatgctatga actactgggg ccagggcacc atggtcaccg tgtcctcc 348 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL, murine CDRs <400> 48 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc gcatcctacc ggtacactgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcaa cattatagta ctccatggac ctttggccaa 300 ggaacaaagg tggaaatcaa a 321 <210> 49 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH, murine CDRs <400> 49 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgc gcactccgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctcctatcca 240 gacagtgtga agggtcggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa acaagactat 360 gctatgaact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtgt cctcc 405 <210> 50 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH, murine CDRs <400> 50 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 51 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL, murine CDRs <400> 51 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgc gcactccgac 60 atccagatga cccagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgcaagg ccagtcagga tgtgagtact gctgtggcct ggtatcagca gaagcctggc 180 aaggccccta agctgctgat ctactccgca tcctaccggt acactggcgt gccttcccgg 240 ttctccggct ccggctctgg caccgacttc accctgacca tctcctccct gcagcctgag 300 gacttcgcca cctactactg ccagcaacat tatagtactc catggacctt tggcggtgga 360 acaaaggtgg aaatcaaa 378 <210> 52 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL, murine CDRs <400> 52 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser 100 105 110 Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 53 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH, murine CDRs <400> 53 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgc gcactccgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctcctatcca 240 gacagtgtga agggtcggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa acaagactat 360 gctatgaact actggggcca gggcaccatg gtcaccgtgt cctcc 405 <210> 54 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH, murine CDRs <400> 54 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 55 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL, murine CDRs <400> 55 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgc gcactccgac 60 atccagatga cccagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgcaagg ccagtcagga tgtgagtact gctgtggcct ggtatcagca gaagcctggc 180 aaggccccta agctgctgat ctactccgca tcctaccggt acactggcgt gccttcccgg 240 ttctccggct ccggctctgg caccgacttc accctgacca tctcctccct gcagcctgag 300 gacttcgcca cctactactg ccagcaacat tatagtactc catggacctt tggccaagga 360 acaaaggtgg aaatcaaa 378 <210> 56 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL, murine CDRs <400> 56 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser 100 105 110 Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 57 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CH region with substitution mutations <400> 57 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 58 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CDRs and human VH & J segment; Human CH region with substitution mutations <400> 58 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 59 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CDRs and human VH, J segment and CH <400> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 60 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 60 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgc gcactccgac 60 attgagatga cccagtctca caaattcatg tccacatcag taggagacag ggtcagcatc 120 acctgcaagg ccagtcagga tgtgagtact gctgtagcct ggtatcaaca gaaaccagga 180 caatctccta aactactgct ttactcggca tcctaccggt acactggagt ccctgatcgg 240 ttcactggca gtggatctgg gacggatttc actttcacca tcagcagtgt gcaggctgaa 300 gacctggcag tttattactg tcagcaacat tatagtactc cgtggacgtt tggcggtgga 360 acaaaggtgg aaatcaaagg aggcggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga 420 agctccgaag tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 480 aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagct atgccatgtc ttgggttcgc 540 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gcaaccatta gtagtggtgg tagttacacc 600 tcctatccag acagtgtgaa gggtcgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 660 ctgtacctgc aaatgagcag tctgaggtct gaggacacgg ccatgtatta ctgtgcaaga 720 caagactatg ctatgaacta ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtgtc ctctgatcag 780 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgct 840 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1260 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1380 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440 tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1476 <210> 61 <211> 492 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 61 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser 100 105 110 Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 165 170 175 Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr 180 185 190 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 195 200 205 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 210 215 220 Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 225 230 235 240 Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 245 250 255 Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 260 265 270 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 275 280 285 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 290 295 300 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 305 310 315 320 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 325 330 335 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 340 345 350 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 355 360 365 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 370 375 380 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 385 390 395 400 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 405 410 415 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 420 425 430 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 435 440 445 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 450 455 460 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 465 470 475 480 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 <210> 62 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 62 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgc gcactccgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctcctatcca 240 gacagtgtga agggtcggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa acaagactat 360 gctatgaact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtgt cctctggagg cggcggttca 420 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggaagc tccgacatcc agatgaccca gtccccctcc 480 tccctgtccg cctccgtggg cgacagagtg accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg 540 agtactgctg tggcctggta tcagcagaag cctggcaagg cccctaagct gctgatctac 600 tccgcatcct accggtacac tggcgtgcct tcccggttct ccggctccgg ctctggcacc 660 gacttcaccc tgaccatctc ctccctgcag cctgaggact tcgccaccta ctactgccag 720 caacattata gtactccatg gacctttggc ggtggaacaa aggtggaaat caaagatcag 780 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgct 840 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1260 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1380 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440 tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1476 <210> 63 <211> 492 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 63 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 145 150 155 160 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala 165 170 175 Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 180 185 190 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly 195 200 205 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 210 215 220 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 225 230 235 240 Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 245 250 255 Ile Lys Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 260 265 270 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 275 280 285 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 290 295 300 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 305 310 315 320 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 325 330 335 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 340 345 350 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 355 360 365 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 370 375 380 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 385 390 395 400 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 405 410 415 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 420 425 430 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 435 440 445 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 450 455 460 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 465 470 475 480 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 <210> 64 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 64 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgc gcactccgac 60 atccagatga cccagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgcaagg ccagtcagga tgtgagtact gctgtggcct ggtatcagca gaagcctggc 180 aaggccccta agctgctgat ctactccgca tcctaccggt acactggcgt gccttcccgg 240 ttctccggct ccggctctgg caccgacttc accctgacca tctcctccct gcagcctgag 300 gacttcgcca cctactactg ccagcaacat tatagtactc catggacctt tggcggtgga 360 acaaaggtgg aaatcaaagg aggcggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga 420 agctccgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 480 agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc 540 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcaaccatta gtagtggtgg tagttacacc 600 tcctatccag acagtgtgaa gggtcggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 660 ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaaa 720 caagactatg ctatgaacta ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtgtc ctctgatcag 780 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgct 840 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1260 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1380 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440 tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1476 <210> 65 <211> 492 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 65 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser 100 105 110 Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 165 170 175 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr 180 185 190 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 195 200 205 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 210 215 220 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 225 230 235 240 Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 245 250 255 Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 260 265 270 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 275 280 285 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 290 295 300 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 305 310 315 320 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 325 330 335 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 340 345 350 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 355 360 365 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 370 375 380 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 385 390 395 400 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 405 410 415 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 420 425 430 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 435 440 445 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 450 455 460 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 465 470 475 480 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 <210> 66 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human with mouse CDRs. <400> 66 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human with mouse CDRs. <400> 67 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 68 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human with mouse CDRs. <400> 68 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human with mouse CDRs. <400> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 70 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human with mouse CDRs. <400> 70 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human with mouse CDRs. <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 72 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human with mouse CDRs. <400> 72 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human with mouse CDRs. <400> 73 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (61)

1. GDF-8에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
   서열번호 44의 아미노산 서열에 의해 한정되는 VH 영역으로부터의 제 1, 제 2 및 제 3 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 가변 중쇄(VH) 영역; 및
   서열번호 46의 아미노산 서열에 의해 한정되는 VL 영역으로부터의 제 1, 제 2 및 제 3 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 가변 경쇄(VL) 영역
   을 포함하고, 상기 VH 영역이 서열번호 44의 잔기 번호 111에 상응하는 아미노산 위치(카밧 위치 108)에서 류신을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 제 1 항에 있어서,
   VH CDR1이 서열번호 10 또는 서열번호 20을 포함하고, VH CDR2가 서열번호 11 또는 서열번호 21을 포함하고, VH CDR3이 서열번호 12를 포함하고, VL CDR1이 서열번호 13을 포함하고, VL CDR2가 서열번호 14를 포함하고, VL CDR3이 서열번호 15를 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   VH 영역의 제 4 프레임워크 영역(FR4)이 서열번호 44의 아미노산 106 내지 116을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
5. 제 1 항에 있어서,
   VL 영역이 서열번호 46의 잔기 번호 100에 상응하는 아미노산 위치(카밧 위치 100)에서 글리신을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
6. 제 1 항에 있어서,
   VL 영역이 서열번호 46의 잔기 번호 100에 상응하는 아미노산 위치(카밧 위치 100)에서 글루타민을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
7. 제 5 항에 있어서,
   VL 영역의 제 4 프레임워크 영역이 서열번호 46의 아미노산 98 내지 107을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
8. 제 6 항에 있어서,
   VL 영역의 제 4 프레임워크 영역이 서열번호 9의 아미노산 98 내지 107을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
9. 제 1 항에 있어서,
   VH 영역이 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
10. 제 9 항에 있어서,
    VL 영역이 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
11. 제 9 항에 있어서,
    VL 영역이 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
12. 제 1 항에 있어서,
    IgA, IgG, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군 중에서 선택되는 항체 하위유형으로부터 유래된 항체 불변 중쇄(CH) 영역을 또한 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
13. 제 12 항에 있어서,
    IgG 하위유형이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군 중에서 선택되는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
14. 제 13 항에 있어서,
    IgG 하위유형이 IgG1인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
15. 제 13 항에 있어서,
    IgG 하위유형이, Fc 도메인 작용을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
16. 제 12 항에 있어서,
    중쇄가 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
17. 제 1 항에 있어서,
    항체 불변 경쇄(CL) 영역을 또한 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
18. 제 17 항에 있어서,
    CL 영역이 카파 또는 람다 CL 영역인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
19. 제 17 항에 있어서,
    경쇄가 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
20. 제 9 항에 있어서,
    VH 영역이 서열번호 43의 핵산 서열에 의해 암호화되는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
21. 제 1 항에 있어서,
    GDF-8과 10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M 또는 10^-11 M 이상의 Kd로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
22. 제 1 항에 있어서,
    Fab, F(ab')₂, scFv, scFv-Fc, scFv-CH, scFab, scFv-지퍼, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, Fv 및 이중특이성 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
23. 제 1 항에 있어서,
    형질감염된 세포에 의해 생성되는 항체의 양이, VH 영역이 카밧 위치 108에서 메티오닌을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체의 유사한 조건 하에서 생성되는 양보다 더 많은, 항체.
24. 제 23 항에 있어서,
    형질감염된 세포에 의해 생성되는 항체의 양이, VH 영역이 카밧 위치 108에서 메티오닌을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체의 유사한 조건 하에서 생성되는 양을 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 11 배, 12 배, 13 배, 14 배, 15 배, 20 배 및 30 배 이상으로 이루어진 군 중에서 선택되는 양 이상만큼 초과하는, 항체.
25. 삭제
26. GDF-8에 특이적으로 결합하는 항체로서, 서열번호 58의 아미노산 서열에 의해 한정되는 항체 중쇄 및 서열번호 59의 아미노산 서열에 의해 한정되는 항체 경쇄를 포함하는 항체.
27. 제 26 항에 있어서,
    각각의 중쇄가 서열번호 58의 아미노산 서열에 의해 한정되는 2 개의 항체 중쇄, 및 각각의 경쇄가 서열번호 59의 아미노산 서열에 의해 한정되는 2 개의 항체 경쇄로 필수적으로 이루어진 항체.
28. 삭제
29. GDF-8에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편의 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
    상기 항체 또는 단편이
    서열번호 44의 아미노산 서열에 의해 한정되는 VH 영역으로부터의 제 1, 제 2 및 제 3 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 가변 중쇄(VH) 영역; 및
    서열번호 46의 아미노산 서열에 의해 한정되는 VL 영역으로부터의 제 1, 제 2 및 제 3 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 가변 경쇄(VL) 영역
    을 포함하고,
    상기 VH 영역이 서열번호 44의 잔기 번호 111에 상응하는 아미노산 위치(카밧 위치 108)에서 류신을 포함하고, 상기 VL 영역이 서열번호 46의 잔기 번호 100에 상응하는 아미노산 위치(카밧 위치 100)에서 글리신을 포함하는
    단리된 폴리뉴클레오타이드.
30. 제 29 항에 있어서,
    VH 영역을 암호화하는 핵산 서열이 서열번호 43 또는 서열번호 49의 핵산 서열이고, VL 영역을 암호화하는 핵산 서열이 서열번호 45 또는 서열번호 51의 핵산 서열인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
31. 제 29 항에 있어서,
    인간 항체 CH 영역을 암호화하는 핵산 서열을 또한 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
32. 제 29 항에 있어서,
    인간 항체 CL 영역을 암호화하는 핵산 서열을 또한 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
33. 제 32 항에 있어서,
    CL 영역이 서열번호 16의 핵산 서열에 의해 암호화되는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
34. 제 29 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
35. 조절 서열에 작동적으로 연결된 제 29 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
36. GDF-8에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편의 생성 방법으로서, 제 35 항에 따른 숙주 세포를 배양하고 이에 의해 생성된 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는 생성 방법.
37. 포유동물의 근육의 질량 또는 강도를 증가시키기에 효과적인 양의 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 포유동물의 근육의 질량 또는 강도를 증가시키는 약학 조성물.
38. 제 37 항에 있어서,
    근육이 골격근 또는 심근인, 약학 조성물.
39. 제 37 항에 있어서,
    골격근이 호흡시 활동성인, 약학 조성물.
40. 치료 효과량의 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 근육 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
41. 제 40 항에 있어서,
    근육 질환이 근이영양증, 근위축증, 근육감소증, 악액질, 근육 소모 증후군, 연령-관련된 근육 질량 또는 강도의 손실, 및 허약으로 이루어진 군 중에서 선택되는, 약학 조성물.
42. 제 41 항에 있어서,
    근육 질환이 근이영양증인, 약학 조성물.
43. 제 42 항에 있어서,
    근이영양증이 뒤센 근이영양증인, 약학 조성물.
44. 제 43 항에 있어서,
    치료가 6 분 걷기 시험에서 대상의 시험결과를 증가시키기에 효과적인, 약학 조성물.
45. 제 43 항에 있어서,
    항체가 글루코코르티코이드로 또한 치료 중인 대상에게 투여되는, 약학 조성물.
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 치료 효과량의 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 신경근 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
51. 제 50 항에 있어서,
    신경근 질환이 근위축성 측삭 경화증(ALS)인, 약학 조성물.
52. 치료 효과량의 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 대사 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
53. 제 52 항에 있어서,
    대사 질환이 2형 당뇨병, 대사 증후군, 증후군 X, 인슐린 내성 및 손상된 글루코스 내성으로 이루어진 군 중에서 선택되는, 약학 조성물.
54. 치료 효과량의 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 지방조직 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
55. 제 54 항에 있어서,
    지방조직 질환이 비만증인, 약학 조성물.
56. 치료 효과량의 제 1 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 골손실 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
57. 제 56 항에 있어서,
    골손실 질환이 골다공증, 골감소증, 골관절염 및 골다공증-관련 골절로 이루어진 군 중에서 선택되는, 약학 조성물.
58. 서열번호 44로 이루어진 항체 VH 영역 및 서열번호 46으로 이루어진 항체 VL 영역을 포함하는, GDF-8에 특이적으로 결합하는 항체로서,
    서열번호 7로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 9로 이루어진 VL 영역을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 제 2 항체에 비해 유사한 조건 하에서 더 높은 수준으로 발현되는 항체.
59. 제 58 항에 있어서,
    제 2 항체에 비해 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 11 배, 12 배, 13 배, 14 배, 15 배, 20 배 또는 30 배 이상의 양만큼 더 높은 수준으로 발현되는 항체.
60. 제 59 항에 있어서,
    COS 세포에서 발현시 제 2 항체보다 12 배 더 높게 발현되는 항체.
61. 제 59 항에 있어서,
    CHO 세포에서 발현시 제 2 항체보다 6 배 더 높게 발현되는 항체.
    

Images