ES2532405T3

ES2532405T3 - Proteínas de fusión basadas en Notch3 humanas como inhibidores señuelo de la señalización de Notch3

Info

Publication number: ES2532405T3
Application number: ES09808518.6T
Authority: ES
Inventors: Jan Kitajewski; Carrie Shawber
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 2008-08-22
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2015-03-26
Anticipated expiration: 2029-08-21
Also published as: ZA201101620B; RU2011110741A; EP2326345B1; NZ591492A; CA2733902A1; SG193873A1; US20110223183A1; AU2009283134B2; US9475855B2; RU2567662C2; EP2326345A2; CN102131520A; BRPI0912912A2; AU2009283134A1; WO2010021729A3; KR20110074846A; IL211232A; IL211232A0; EP2326345A4; MX2011001805A

Abstract

Una proteína de fusión cuya secuencia (a) es idéntica a la secuencia de las repeticiones 1-X de EGF del dominio extracelular de la proteína receptora de Notch3 humana en la que X es cualquier número entero de 1 a 10 o de 12 a 33, seguido de (b) una secuencia idéntica a la secuencia de una parte Fc de un anticuerpo, en la que (b) está localizada en el lado carboxi terminal de (a) y en la que (b) está unida a (a) bien directamente o mediante un conector.

Description

Proteínas de fusión basadas en Notch3 humanas como inhibidores señuelo de la señalización de Notch3

A lo largo de esta descripción, se hace referencia a varias publicaciones por números arábigos en paréntesis o por autor y fecha de publicación en paréntesis. Las citas completas de estas publicaciones pueden encontrarse al final de la especificación.

Antecedentes de la invención

Desarrollo vascular

Durante la embriogénesis de mamíferos, la formación del sistema vascular es un proceso temprano y esencial. En el embrión, el desarrollo vascular se inicia con el hemangioblasto pluripotente derivado del mesodermo de la placa paraxial y lateral. El hemangioblasto tiene el potencial de diferenciarse bien en un progenitor hematopoyético o un progenitor de células endoteliales, conocido como el angioblasto.

El desarrollo vascular empieza con un proceso conocido como vasculogénesis mediante el cual los angioblastos se diferencian en células endoteliales y migran conjuntamente para formar el plexo vascular primitivo. Esta red vascular inicial consiste en vasos que son homogéneos en tamaño y comprenden en su totalidad células endoteliales. El plexo vascular se remodela entonces mediante angiogénesis.

La angiogénesis implica la aparición de nuevos vasos, la migración de estos vasos a regiones avasculares, y el reclutamiento de células accesorias, pericitos y células de músculo liso (Gale y Yancopoulos, 1999). Las células de músculo liso que se diferencian y forman las paredes de los vasos contráctiles se originan de múltiples progenitores incluyendo células de la cresta neural, células mesenquimales e incluso células endoteliales (Owens, 1995). En los adultos, la angiogénesis está implicada en el desarrollo folicular, cicatrización de heridas, y procesos patológicos tales como angiogénesis tumoral y enfermedad cardiaca.

La familia Notch y ligandos Notch

Los estudios de Drosophila, C. elegans, pez cebra y mamíferos han demostrado que la ruta Notch es un mecanismo de señalización evolutivamente conservado que funciona para modular numerosas decisiones del destino celular. La señalización Notch se requiere para la formación del patrón apropiado de células que se originan de las tres capas germinales. Dependiendo del contexto celular, la señalización Notch puede tanto inhibir como inducir la diferenciación, inducir la proliferación, y estimular la supervivencia celular (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Lewis, 1998; Weinmaster, 1997). En Drosophila, una única proteína Notch se activa por dos ligandos, Serrate y Delta. En mamíferos, estas familias se han expandido a cuatro genes Notch (Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4) y cinco ligandos, 2 semejantes a Serrate (Jagged1-2) y 3 Delta (D11, 3, 4) (Bettenhausen et al., 1995; Dunwoodie et al., 1997; Gallahan y Callahan, 1997; Lardelli et al., 1994; Lindsell et al., 1995; Shawber et al., 1996a; Shutter et al., 2000a; Uyttendaele et al., 1996; Weinmaster et al., 1992; Weinmaster et al., 1991). Durante la embriogénesis, los receptores y ligandos Notch se expresan en patrones espaciales y temporales dinámicos. Sin embargo, no se sabe si todos los ligandos activan todos los receptores.

Señalización y función de Notch

La señalización Notch influye en muchos tipos diferentes de decisiones del destino celular proporcionando señales inhibidoras, inductoras o proliferativas dependiendo del contexto medioambiental (revisado en Artavanis-Tsakonas et al., 1996; Greenwald, 1998; Robey, 1997; Vervoort et al., 1997). Esta función pleyotrópica sugiere que Notch modula múltiples rutas de señalización de una manera espacio-temporal.

Consistente con la regulación por Notch de decisiones del destino celular, tanto los receptores como los ligandos son proteínas de la superficie celular con dominios transmembrana únicos (Figura 1). El dominio regulador extracelular de las proteínas Notch consiste en gran medida en repeticiones semejantes a EGF organizadas en tándem que se requieren para la unión del ligando (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Weinmaster, 1998). En el extremo C terminal de las repeticiones semejantes a EGF se encuentran tres repeticiones ricas en cisteína adicionales, designadas las repeticiones LIN12/Notch (LNR) (Greenwald, 1994). Aguas abajo de LNR se encuentra la secuencia de escisión proteolítica (RXRR) que es reconocida por una convertasa semejante a furina. Para Notch1, la escisión en este sitio rinde un péptido extracelular de 180 kilodaltons y un péptido intracelular de 120 kilodaltons que se mantienen juntos para generar un receptor heterodimérico en la superficie celular (Blaumueller et al., 1997; Kopan et al., 1996; Logeat et al., 1998).

El dominio intracelular de Notch (NotchICD, Figura 1), rescata los fenotipos de pérdida de función de Notch lo que indica que esta forma de Notch produce la señal constitutivamente (Fortini y Artavanis-Tsakonas, 1993; Lyman y Young, 1993; Rebay et al., 1993; Struhl et al., 1993).

El dominio citoplásmico de Notch contiene tres dominios identificables: el dominio RAM, el dominio de repetición de anquirina y el dominio PEST C terminal (Figura 1). Después de la activación por el ligando, Notch experimenta dos escisiones proteolíticas adicionales que resultan en la liberación del dominio citoplásmico (Weinmaster, 1998). Este

péptido Notch se transloca al núcleo e interacciona con los represores transcripcionales conocidos como CSL (CBF, Su (H), Lag-2) y lo convierte en activador transcripcional. La interacción CSL/Notch depende de la presencia del dominio RAM de Notch; mientras, la actividad transcripcional también requiere la presencia de las repeticiones de anquirina (Hsieh et al., 1996; Hsieh et al., 1997; Roehl et al., 1996; Tamura et al., 1995; Wettstein et al., 1997). Los estudios tanto in vivo como in vitro indican que los genes HES y Hey son dianas directas de la señalización dependiente de Notch/CSL (Bailey y Posakony, 1995; Eastman et al., 1997; Henderson et al., 2001; Jarriault et al., 1995; Nakagawa et al., 2000; Wettstein et al., 1997). Los genes HES y Hey son represor transcripcional bHLH que se unen al ADN en las cajas N (Nakagawa et al., 2000; Sasai et al., 1992; Tietze et al., 1992). Se ha propuesto que Notch señaliza por una ruta independiente de CSL. De hecho, sólo es necesaria y suficiente la expresión del dominio de repetición de anquirina para algunas formas de señalización de Notch (Lieber et al., 1993; Matsuno et al., 1997; Shawber et al., 1996b).

Finalmente, el dominio PEST se ha implicado en la velocidad de recambio de proteínas por una ruta dependiente de SEL-10/ubiquitina (Greenwald, 1994; Oberg et al., 2001, Rogers et al., 1986; Wu et al., 1998; Wu et al., 2001). De manera similar a los receptores, el dominio extracelular de los ligandos Notch también consiste en gran medida en repeticiones semejantes a EGF organizadas en tándem (Figura 1). Aguas arriba de estas repeticiones se encuentra una repetición semejante a EGF divergente conocida como el DSL (Delta, Serrate, Lag-2) que se requiere para la unión del ligando y la activación de los receptores (Artavanis-Tsakonas et al., 1995).

Señalización Notch y desarrollo vascular

Aunque se han identificado muchos de los genes que funcionan para inducir la vasculogénesis y angiogénesis, poco se sabe acerca de cómo las decisiones del destino celular se especifican durante el desarrollo vascular. Varias de las observaciones sugieren que la ruta de señalización Notch puede jugar un papel en la determinación y formación de patrones del destino celular del sistema vascular.

Notch1, Notch4, Jagged1 y D114 todos se expresan en la vasculatura en desarrollo, mientras Notch3 se expresa en las células del músculo liso accesorias (Krebs et al., 2000; Shuttler et al., 2000b; Uyttendaele et al., 1996; Villa et al., 2001; Xue et al., 1999). Los ratones que carecen de Jagged1 son letales en el estadio embrionario y tienen defectos vasculares graves (Xue et al., 1999). Los ratones nulicigotos para Notch1 son letales en el estadio embrionario y mueren de defectos neuronales graves, pero también tienen defectos en la angiogénesis (Krebs et al., 2000; Swalatek et al., 1994). Los ratones que carecen de Notch4 nacen y parecen normales, pero los embriones que han perdido tanto Notch1 como Notch4 mueren en E9.5 de hemorragias graves y defectos en el patrón vascular indicando que Notch1 y Notch4 pueden ser funcionalmente redundantes durante el desarrollo vascular (Krebs et al., 2000). La expresión exógena de una forma activada de Notch4 en el endotelio también resultó en defectos vasculares similares a los observados pata los ratones nulicigotos dobles Notch1/Notch4, sugiriendo que son críticos niveles apropiados de la señalización Notch para el desarrollo apropiado de la vasculatura embrionaria (Uyttendaele et al., 2001).

Tomados conjuntamente, los datos de ratones mutantes para los componentes de la señalización Notch/Notch descubren varios procesos dependientes de Notch incluyendo remodelado vascular, especificación venosa arterial, reclutamiento de células del músculo liso vascular y desarrollo de vasos de salida de flujo corazón/corazón.

Experimentos recientes han implicado a la señalización Notch en la especificación de células endoteliales arteriales/venosas. El análisis in situ de embriones E13.5 encontró que la expresión de Notch1, Notch3, Notch4, D14, Jagged1 y Jagged2 estaba restringida a las arterias y estaba ausente en las venas (Villa et al., 2001). Consistente con los datos de expresión, la disrupción de la señalización de Notch en el pez cebra se asoció con la pérdida del marcador arterial efrinaB2; mientras, la expresión ectópica de una forma activada de Notch dio lugar a una pérdida en el marcador celular venoso EphB4 en la aorta dorsal (Lawson et al., 2001). Estos datos sugieren que la señalización Notch puede ayudar a especificar los destinos celulares arteriales y venosos durante la angiogénesis.

También se ha sugerido que la señalización Notch funciona en el sistema vascular adulto. En los seres humanos, las mutaciones con cambio de sentido en el dominio extracelular de Notch3 se correlacionan con el desarrollo de la enfermedad vascular degenerativa, CADASIL (US 2003/186290 presentada el 2 de octubre, 2003 de Bach et al.; Caronti et al., 1998; Desmond et al., 1998; Joutel et al., 2000; Joutel et al., 1996). En un modelo de cicatrización de heridas, se observó una expresión incrementada de Jagged1 en el borde de la herida endotelial que se estaba regenerando, lo que sugiere que la señalización Notch puede funcionar durante procesos de angiogénesis en el adulto (Lindner et al., 2001). Tomados conjuntamente, estos datos apoyan que la señalización Notch funciona en varias etapas críticas durante el desarrollo vascular: vasculogénesis, formación de patrones vasculares/angiogénesis, y especificación arterial/venosa. Sin embargo, todavía deben elucidarse el o los mecanismos moleculares por los que las rutas de señalización Notch influyen en estas diferentes etapas.

Significancia

Shimizu et al. (J. Biol. Chem. 274(46): 32961-32969 (1999)) describen el uso de Notch1ECD/Fc, Notch2ECD/Fc y Notch3ECD/Fc en estudios de unión. Sin embargo, Shimizu et al. no mencionan el uso de dichas proteínas para inhibir la angiogénesis.

La Patente U.S. No. 6.379.925 presentada el 30 de abril, 2002 de Kitajewski et al. describe Notch4 murino. Sin embargo, no describe proteínas de fusión basadas en Notch como se muestra en la presente solicitud.

WO 2006/047878 presentada el 11 de mayo, 2006 de Karsan y Leong, US 2006/030694 presentada el 9 de febrero, 2006 de Kitajewski et al. y US 2008/118520 presentada el 22 de mayo, 2008 de Li et al. describen proteínas y proteínas de fusión basadas en Notch, respectivamente, y su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con Notch. Sin embargo, ninguna de ellas describe proteínas de fusión como se muestra en la presente solicitud.

Las proteínas Notch juegan papeles clave en las decisiones de desarrollo que implican la vasculatura, el sistema hematopoyético, y el sistema nervioso. Como tal, una comprensión de su función es clave para entender cómo se controlan las decisiones y compromiso del destino celular durante el desarrollo y en los tejidos adultos. Hasta la fecha, varias publicaciones sobre disrupciones de genes Notch o ligando Notch han descrito fenotipos vasculares proporcionando énfasis en que esta ruta es una parte fundamental de la maquinaria que guía el desarrollo vascular. La actividad de Notch aberrante se ha ligado a patologías humanas; incluyendo tanto cáncer como trastornos vasculares (CADASIL). El análisis de Notch en la angiogénesis tumoral sólo ha empezado recientemente; sin embargo, nuestro descubrimiento de dianas potenciales aguas abajo de Notch sugiere un papel en los procesos patológicos asociados con la angiogénesis. Por ejemplo, VEGFR-3 se ha ligado tanto a angiogénesis tumoral como a linfangiogénesis tumoral. La expresión o función de varias otras dianas potenciales Notch también se ha ligado a angiogénesis tumoral; incluyendo EfrinaB2, Id3, Angiopoyetina 1, y PDGF-B. Una mayor comprensión sobre el papel de estas dianas en las que funciona el gen Notch facilitará claramente el análisis futuro de Notch en las patologías humanas.

Compendio de la invención

La invención se refiere a una proteína de fusión y al uso de ésta como se define en las reivindicaciones. Esta descripción se refiere generalmente a una proteína de fusión que comprende un péptido señal, repeticiones de EGF 1-X del dominio extracelular de la proteína receptora Notch3 humana en la que X es cualquier número entero de 12 a 34, y una parte Fc de un anticuerpo unido a ella.

Esta descripción describe una proteína de fusión que comprende un péptido señal, repeticiones de EGF 1-X del dominio extracelular de la proteína receptora Notch3 humana en la que X es cualquier número entero de 1 a 10, y una parte Fc de un anticuerpo unido a ella.

Esta descripción describe una proteína de fusión que comprende un péptido señal, al menos 12 repeticiones de EGF del dominio extracelular del receptor Notch3 humano, y una parte Fc de un anticuerpo unido a ella.

Esta descripción describe una proteína de fusión que comprende un péptido señal, repeticiones de EGF del dominio extracelular de la proteína receptora Notch3 humana, en la que están presentes al menos 12 repeticiones de EGF, y una parte Fc de un anticuerpo unido a ella.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para tratar un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para tratar al sujeto, tratando de esta manera al sujeto que tiene un tumor.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir la angiogénesis en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir la angiogénesis en el sujeto, inhibiendo de esta manera la angiogénesis en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para tratar el cáncer de ovario en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para tratar al sujeto, tratando de esta manera al sujeto que tiene cáncer de ovario.

Esta descripción describe el uso de la proteína de fusión descrita en la presente memoria para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor en un sujeto.

Esta descripción describe el uso de la proteína de fusión descrita en la presente memoria para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis en un sujeto.

Esta descripción describe el uso de la proteína de fusión descrita en la presente memoria para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer de ovario en un sujeto.

Esta descripción describe el uso de la proteína de fusión descrita en la presente memoria para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno metabólico en un sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir la linfangiogénesis fisiológica o linfangiogénesis patológica en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir la linfangiogénesis fisiológica

o linfangiogénesis patológica en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir la metástasis tumoral en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir la metástasis tumoral en el sujeto. Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir el crecimiento de un tumor secundario en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir el crecimiento del tumor secundario en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir la coopción de vasos sanguíneos por un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir la coopción de vasos sanguíneos por un tumor en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF) para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF), cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del receptor de VEGF para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del receptor de VEGF, cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF) para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF), cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un antagonista del receptor de PDGF para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un antagonista del receptor de PDGF, cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor de HER2/neu para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor de HER2/neu, cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para tratar cáncer de mama en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para tratar el cáncer de mama en el sujeto.

Esta descripción describe el uso de la proteína de fusión descrita en la presente memoria para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cáncer de mama en un sujeto.

Descripción breve de las figuras

Figura 1

Esta Figura muestra la estructura esquemática de Notch y ligandos Notch: Notch1, Notch2, Notch3, Notch4, Jagged1, Jagged-2, semejante a Delta 1, semejante a Delta 3, semejante a Delta 4.

Figura 2

Esta Figura muestra el diseño esquemático de proteínas de fusión basadas en Notch (NotchECD/Fc). El dominio extracelular de Notch1, Notch2, Notch3, o Notch4 que contiene las repeticiones de EGF se fusiona con la parte Fc de un anticuerpo.

Figura 3

Esta Figura muestra un ensayo de co-cultivo para ensayar la actividad de las proteínas de fusión basadas en Notch. Notch y los informadores transcripcionales que responden a Notch se expresan en una célula "que responde a

Notch", HeLa. Los ligandos Notch, Jagged-1, semejante a Delta 1, o semejante a Delta 4 se expresan en una célula "presentadora de ligando", 293. La expresión está mediada por la transfección de poblaciones celulares individuales, las células se co-cultivan, y se ensayan para actividad informadora dependiente de Notch.

Figura 4

Esta Figura muestra la actividad inhibidora de la proteína de fusión basada en Notch frente a la activación de la señalización Notch por la interacción entre Notch y ligando Notch. La inducción de la señalización Notch se detectó por co-cultivo tanto del tipo Notch1 como 3 de células que expresan ligando Notch y estas inducciones se inhibieron por co-transfección de un vector que expresa la proteína de fusión basada en Notch en células que expresan Notch1. Por lo tanto, las proteínas de fusión basadas en Notch pueden usarse como inhibidor de Notch tomando como base la inhibición de la interacción entre Notch y ligando Notch.

Figura 5

Esta Figura muestra la expresión de la proteína de fusión basada en Notch1 (Notch1ECD/Fc) en 293. Panel A: expresión en lisados celulares (lys) o secretada en el medio (sup). Panel B: expresión en lisados de 293 de NECD/Fcs, como se lista.

Figura 6

Esta Figura muestra la activación de la señalización Notch en HUVEC infectadas con adenoviral que codifica VEGF

165. La activación de la señalización Notch puede detectarse usando actividad promotora CBF1. La actividad transcripcional del promotor CBF1 se activa por la unión de Notch-1C a CBF1. Medimos la actividad promotora CBF1 en HUVEC que se infectó con adenovirus que codifica VEGF-165 a diferentes MOI. La inducción del promotor CBF1 se detectó claramente en HUVEC infectadas con Ad-VEGF, comparado con células infectadas con Ad-LacZ de una manera dependiente de MOI. Estos datos mostraron que la sobreexpresión de VEGF podía activar la señalización Notch en HUVEC.

Figura 7

Esta Figura muestra el efecto de las proteínas de fusión basadas en Notch en la activación inducida por VEGF de la señalización Notch. La co-infección de la proteína de fusión basada en Ad-Notch con Ad-VEGF redujo claramente la activación de la actividad promotora de CBF1 inducida por la infección con Ad-VEGF solo. En el caso de infección a 40 MOI para cada adenovirus en el panel A, se detectó una inhibición del 60% a las 24 horas y una inhibición del 90% a las 48 horas después de la transfección del gen informador. Esta actividad inhibidora de la trampa Notch fue dependiente de MOI de la proteína de fusión basada en Ad-Notch.

Figura 8

Esta Figura muestra un experimento en el que evaluamos el efecto de las proteínas de fusión basadas en Notch en la inducción de gemación por VEGF-165 sobreexpresado en HUVEC. Cuando HUVEC infectadas con Ad-VEGF se cultivaron en gel de tipo colágeno durante 8 días, se indujo la gemación en el gel de colágeno. Esta inducción de la gemación por VEGF sobreexpresado se inhibió claramente por coinfección de adenovirus que codifican proteínas de fusión basadas en Notch. La proteína de fusión basada en Ad-Notch en sí misma tuvo menos efecto en la morfología.

Figura 9

Esta Figura muestra el resultado del recuento de yemas por campo con microscopio. La infección con Ad-VEGF en HUVEC incrementó el número de yemas dependiendo del MOI usado. Aunque se usó un medio de MOI de proteína de fusión basada en Notch, comparado con Ad-VEGF, la gemación inducida por Ad-VEGF se inhibió claramente. Estos datos sugirieron que VEGF indujo la gemación de HUVEC mediante la activación de la señalización Notch y que la proteína de fusión basada en Notch pudo inhibir la gemación inducida por VEGF.

Figura 10

Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína Notch1 de rata (SEQ ID NO:1) y una secuencia conectora (SEQ ID NO:2).

Figura 11

Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína Notch2 de rata (SEQ ID NO:3) y una secuencia conectora (SEQ ID NO:2).

Figura 12

Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína Notch3 de ratón (SEQ ID NO:4).

Figura 13

Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína Notch4 de ratón (SEQ ID NO:5) y una secuencia conectora (SEQ ID NO:2).

Figuras 14A y 14B

Esta Figura muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular del gen de Notch1 de rata (SEQ ID NO:6).

Figuras 15A y 15B

Esta Figura muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular del gen de Notch2 de rata (SEQ ID NO:7).

Figuras 16A y 16B

Esta Figura muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular del gen de Notch3 de ratón (SEQ ID NO:8).

Figuras 17A y 17B

Esta Figura muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular del gen de Notch4 de ratón (SEQ ID NO:9) y la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:10) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de una secuencia conectora.

Figuras 18A y 18B

Esta Figura muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular del gen de Notch1 humano (SEQ ID NO:11).

Figuras 19A y 19B

Esta Figura muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular del gen de Notch2 humano (SEQ ID NO:12).

Figuras 20A y 20B

Esta Figura muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular del gen de Notch3 humano (SEQ ID NO:13).

Figuras 21A y 21B

Esta Figura muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular del gen de Notch4 humano (SEQ ID NO:14).

Figuras 22A-22I

Estas Figuras muestran que VEGF activa la señalización Notch para inducir la gemación de HUVEC. Se transdujeron HUVEC con Ad-VEGF a 40 MOI (Figs. 22A, 22H, 22I) ó 20 MOI (Figs. 22C, 22G). Ad-LacZ se cotransdujo en HUVEC para conseguir la misma cantidad total de adenovirus 60 MOI (Fig. 22G), 80 MOI (Fig. 22A) y 100 MOI (Figs. 22H, 22I). La Figura 22A muestra el análisis por RT-PCR de la expresión de Notch y ligando Notch. Los números muestran los ciclos de PCR. La Figura 22B muestra el efecto de VEGF transducido en la actividad informadora CSL. La Figura 22C muestra el efecto de SU5416 en la actividad informadora CSL transactivado con Ad-VEGF. La Figura 22D muestra la construcción de señuelo Notch (N1ECDFc). La Figura 22E muestra la secreción de N1ECDFc de HUVEC transducidas con Ad-N1ECDFc. La Figura 22F muestra el efecto de N1ECDFc frente a la actividad informadora CSL inducida por ligando en un ensayo de co-cultivo (□: (-); ■: 0,33 ng pHyTC-NIECDFc; ■: 0,67 ng pHyTC-N1ECDFc). Las Figuras 22G-I muestran el efecto de N1ECDFc frente a HUVEC transducidas con Ad-VEGF. La señalización Notch se activó con la transducción de Ad-VEGF en HUVEC en ausencia o presencia de co-transducción de Ad-N1ECDFc a la dosificación indicada. La Figura 22G muestra el efecto de N1ECDFc en la actividad informadora CSL transactivada por Ad-VEGF. La Figura 22H muestra la inhibición de la gemación de HUVEC transducidas con Ad-VEGF con co-transducción de Ad-N1ECDFc a 40 MOI. La Figura 22I muestra la cuantificación del efecto de N1ECDFc en la gemación de HUVEC transducidas con Ad-VEGF (□: bud; ■: número de células).

Figuras 23A-23J

Estas Figuras muestran que la señalización Notch regula al alza la expresión de Flt1 para inducir la gemación de HUVEC. Se transdujeron HUVEC bien con Ad-LacZ o Ad-N1IC a 40 MOI. Las Figuras 23A-23C muestran el efecto de inhibidores para las tirosina quinasas de receptores en la gemación de HUVEC inducida por Notch. La Figura 23A

es una fotografía de la gemación de HUVEC transducidas con Ad-N1IC tratadas con PD166866, ZD1893 a 1 μM y SU5416 a 0,5 μM. La Figura 23B muestra la cuantificación del efecto de los inhibidores a 1 μM (□: bud; ■: número de células). La Figura 23C muestra la dependencia de la dosis del efecto de SU5416 (□: bud; ■: número de células). Las Figuras 23D-E muestran la inducción de la expresión de Flt-1 en HUVEC transducidas con Ad-NIIC. La Figura 23D muestra el análisis por RT-PCR de la expresión del ARNm de Flt-1. La Figura 23E muestra el análisis W.B. de la expresión de la proteína Flt-1. Las Figuras 23F-G muestran la estimulación de la gemación de HUVEC inducida por Notch con estimulación con P1GF. Se cultivaron HUVEC transducidas con Ad-N1IC en gel de colágeno con SFM, en lugar de medio completo, en ausencia o presencia de 50 ng/ml de P1GF. La Figura 23F muestra la gemación inducida por P1GF de HUVEC transducidas con Ad-N1IC (cabeza de flecha: yemas con filopodia única; flecha: yemas con múltiples filopodias). La Figura 23G muestra la cuantificación del efecto de P1GF en la gemación de HUVEC transducidas con Ad-N1IC (□: multi; E: total). Las Figuras 23H-I muestran el efecto de la transfección de siARN de Flt-1 en la expresión de Flt-1. Se transfectaron HUVEC transducidas con Ad-N1IC con 200 pmoles bien de siARN control (CT) o de Flt-1. La Figura 23H muestra la reducción de la expresión del ARNm de Flt-1. La Figura 23I muestra la reducción de la expresión de la proteína Flt-1. La Figura 23J muestra el efecto de la transfección de siARN de Flt-1 en la gemación de HUVEC inducida por Notch. Se transfectaron HUVEC transducidas con Ad-N1IC bien con 100 ó 200 pmoles de siARN y se cultivaron en gel de colágeno durante 2 días.

Figuras 24A-24E

Estas Figuras muestran que VEGF regula la actividad gelatinasa a través de la señalización Notch por la regulación al alza tanto de MMP-9 como MT1-MMP. Las Figuras 24A-B muestran el análisis de zimografía en gelatina de la actividad de MMP-9 y MMP-2 estimulada por VEGF en HUVEC. La Figura 24A muestra el efecto de N1ECDFc en la actividad de MMP-9. Se cultivaron HUVEC transducidas en gel de fibrina en el día indicado (es decir, D2, D4, D6, D8). También se obtuvieron resultados similares usando gel de colágeno, aunque la inducción de MMP-9 fue mayor en el gel de fibrina que en el gel de colágeno (datos no mostrados). La Figura 24B muestra el efecto de N1ECDFc en la actividad de MMP-2. Se transdujeron HUVEC con Ad-N1ECDFc a las dosis indicadas y se recogió el medio condicionado de HUVEC cultivadas en gel de colágeno en el día 4. Las Figuras 24C-D muestran la regulación al alza de MMP-9 y MT1-MMP con señalización Notch. Se transdujeron HUVEC bien con Ad-LacZ o Ad-N1IC a 40 MOI. Los números muestran los ciclos de PCR. La Figura 24C muestra el análisis por RT-PCR del efecto de la señalización Notch en la expresión de MMP-9 y MMP-2. La Figura 24D muestra la inducción de la expresión de MT1-MMP tanto en el transcrito como la proteína con señalización Notch. La Figura 24E muestra el análisis por RT-PCR de la expresión de MMP-9 y MT1-MMP en ad-VEGF-HUVEC con co-transducción de Ad-N1ECDFc. Se transdujeron HUVEC con Ad-VEGF en ausencia o presencia de co-transducción con Ad-N1ECDFc a 40 MOI cada uno. Se co-transdujo Ad-LacZ para conseguir la misma cantidad total de adenovirus a 80 MOI.

Figuras 25A-25D

Estas Figuras muestran el papel de la señalización Notch e la angiogénesis in vivo dependiente de VEGF. Las Figuras 25A-25D muestran la inhibición de la angiogénesis inducida por VEGF con N1ECDFc en el ensayo DAS en ratón. Se muestran fotografías representativas. La Figura 25A muestra angiogénesis inducida subcutánea con transfectante 293/VEGF frente a 293/VEGF que también expresa el señuelo Notch (proteína de fusión basada en Notch) N1ECDFc. La Figura 25B muestra la cuantificación del grado de vascularización inducido por 293/VEGF en control, frente a 293 que expresan el señuelo Notch (proteína de fusión basada en Notch) N1ECDFc. La Figura 25C muestra la angiogénesis inducida subcutánea con células MDA-MB-231 infectadas con Ad-LacZ frente a células MDA-MB-231 infectadas con Ad-N1ECDFc (proteína de fusión basada en Notch). Las células de cáncer de mama MDA-MB-231 producen VEGF (datos no mostrados). La Figura 25D muestra la cuantificación del grado de vascularización inducido por células MDA-MB-231 infectadas con Ad-LacZ frente a células MDA-MB-231 infectadas con Ad-N1ECDFc (proteína de fusión basada en Notch).

Figuras 26A y 26B

Estas Figuras muestran la proliferación de HUVEC transducidas con Ad-VEGF165. Se transdujeron HUVEC con Ad-VEGF165 a las dosificaciones indicadas. También se co-infectó Ad-LacZ para conseguir la misma cantidad total de adenovirus a una MOI de 40 pfu/célula. Se suspendieron HUVEC en SFM suplementado con 1% FBS y se plaquearon a 1 X 104 células/pocillo en placas multi-pocillo de 24 pocillos con 0,4 ml de medio. Después de 4 días, se determinó el número de células usando el kit CCK-8 y los resultados se indican como la proporción del número de células determinado respecto al número de células control, que se transdujeron con Ad-GFP a una MOI de 40 pfu/célula. La Figura 26A muestra el efecto de VEGF transducido en la proliferación. La Figura 26B muestra el efecto inhibidor de SU5416. Se trataron HUVEC transducidas con Ad-VEGF con SU5416 a las dosificaciones indicadas.

Figuras 27A y 27B

Estas Figuras muestran la inducción de yemas HUVEC en gel de colágeno de tipo I. Se transdujeron HUVEC bien con Ad-VEGF165 o AD-N1IC a las dosificaciones indicadas. También se co-infectó Ad-LacZ para conseguir la misma cantidad total de adenovirus a una MOI de 40 pfu/célula. Se cultivaron HUVEC transducidas en gel de colágeno con medio completo. La cantidad de gemación se evaluó bajo microcopio en el día 7.

Figuras 28A y 28B

Estas Figuras muestran el efecto de la alteración de la señalización Notch en la proliferación celular. Las células se transdujeron con los adenovirus indicados. También se co-infectó Ad-GFP para conseguir la misma cantidad total de adenovirus a una MOI de 60 pfu/célula. Después de 4 días, se determinó el número de células usando el kit CCK-8 y los resultados se indican como la proporción del número de células determinado respecto al número de células control, que se transdujeron con Ad-GFP a una MOI de 60 pfu/célula. La Figura 28A muestra el efecto de N1IC y proteína de fusión Notch transducidas en la proliferación de HUVEC. Se suspendieron HUVEC transducidas en medio completo y se plaquearon a 1 X 104 células/pocillo en placas multipocillo de 24 pocillos con 0,4 ml del medio indicado (□: Ad-N1IC; ■: Ad-N1ECDFc). La Figura 28B muestra el efecto de la proteína de fusión Notch en la proliferación de transfectantes KP1/VEGF. Los transfectantes transducidos KP1/VEGF se suspendieron en medio RPMI 1640 y se plaquearon a 2 X 104 células/pocillo en placas multipocillo de 24 pocillos con 0,5 ml de medio.

Figura 29

Esta Figura muestra el análisis por RT-PCR de la inducción de la expresión de PIGF en HUVEC transducidas con Ad-N1IC. Se infectaron HUVEC bien con Ad-LacZ o Ad-N1IC a una MOI de 40 pfu/célula. El ARN total se aisló de HUVEC transducidas cultivadas en gel de colágeno durante 5 días con medio completo.

Figuras 30A-30C

Estas Figuras muestran la inhibición de la gemación de HUVEC transducidas bien con Ad-N1IC o Ad-VEGF con transfección de siARN de Flk-1. La Figura 30A muestra la reducción de la expresión del ARNm y proteína Flk-1 en Ad-VEGF-HUVEC con transfección de 200 pmoles de siARN de Flk-1. Ad-VEGF-HUVEC a una MOI de 40 pfu/célula se transfectaron con 200 pmoles de siARN control (CT) o de Flk-1. El ARN total se aisló 48 horas después de la transfección. Se recogió el lisado celular total de células desprovistas de suero con SFM durante 48 horas después de la transfección. Las Figuras 30B y 30C muestran el efecto inhibidor de la transfección con siARN de Flk-1 en las yemas de HUVEC inducidas bien con VEGF o Notch. Se transfectó bien Ad-N1IC o Ad-VEGF-HUVEC a una MOI de 40 pfu/célula con 200 pmoles de siARN como se indica y se cultivaron en gel de colágeno durante 5 días. La Figura 30B muestra el efecto de la transfección con siARN de Flk-1 en las yemas HUVEC (□: Ad-VEGF; ■: Ad-N1IC). La Figura 30C muestra la cuantificación del efecto inhibidor de la transfección con siARN de Flk-1.

Figuras 31A y 31B

Estas Figuras muestran la inhibición de la gemación de HUVEC transducidas con Ad-N1IC con tratamiento con el inhibidor de metaloproteinasa de la matriz GM6001. Bien Ad-LacZ o Ad-N1IC-HUVEC a una MOI de 40 pfu/célula se cultivaron en gel de colágeno durante 5 días en ausencia o presencia de GM6001 a 50 μm. La Figura 31A muestra el efecto de GM6001 en yemas HUVEC inducidas con Notch. La Figura 31B muestra la cuantificación del efecto inhibidor de GM6001.

Figura 32A, 32B y 32C:

Esta Figura muestra la secuencia de nucleótidos de longitud completa de Notch3 humano (SEQ ID NO:15), que consiste en ATG de inicio (nt 1) a parada (TGA; nt 6964). El péptido señal y los primeros 34 dominios de repeticiones semejantes a EGF están presentes en nt 1-4158 de esta secuencia. Los nucleótidos 1-4158 se utilizan para el diseño de las proteínas señuelo Notch3 humanas, descritas en la presente memoria. Los nucleótidos que engloban las repeticiones de EGF 1-34 están subrayados.

Figura 33:

Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos (aa) de longitud completa de Notch3 humano (SEQ ID NO:16), que consiste en aa 1 (M= metionina) a aa 2555 (K= lisina). El péptido señal y los primeros 34 dominios de repeticiones semejantes a EGF están presentes en aa 1-1386 de esta secuencia. Los aminoácidos 1-1386 se utilizan para el diseño de las proteínas señuelo Notch3 humanas, descritas en las secciones siguientes. Los aminoácidos que engloban las repeticiones de EGF 1-34 están subrayados.

Figura 34

Esta Figura muestra la esquematización de dos proteínas señuelo Notch3 humanas, señuelo h-Notch3(1-34) y señuelo h-spHC-Notch3(1-34).

Figura 35

Esta Figura muestra la secuencia de nucleótidos de Fc humano utilizada para generar la etiqueta Fc en las proteínas señuelo Notch3 (SEQ ID NO: 17). Los 713 nucleótidos de Fc humano se fusionan en el extremo 3' de la construcción señuelo Notch3, justo aguas abajo de las repeticiones semejantes a EGF de Notch3. Esta región de Fc humano permite la detección y purificación de los señuelos Notch y sirve para estabilizar las proteínas de fusión secretadas Notch3 humana-Fc humana.

Figura 36

Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos de Fc humano utilizada para generar la etiqueta Fc en las proteínas señuelo Notch3 (SEQ ID NO: 18). Los 237 aminoácidos de Fc humano se fusionaron en el extremo C de todas las construcciones señuelo Notch3, justo aguas abajo de las repeticiones semejantes a EGF de Notch3. Esta región de Fc humano permite la detección y purificación de los señuelos Notch y sirve para estabilizar las proteínas de fusión secretadas Notch3 humana-Fc humana.

Figura 37:

Esta Figura muestra la secuencia de la fusión Notch3/Fc humana para todas las construcciones que finalizan después de la repetición 34 de EGF de Notch3 humana.

Figura 38

Esta Figura muestra el análisis de la secuencia señal del péptido señal de Notch3 humano que se predice que engloba los aminoácidos 1-40 de Notch3 humano. Esta determinación se hizo usando el programa SignalP 3.0 Server proporcionado por la Technical University de Dinamarca. Estos resultados predicen un sitio principal de escisión localizado entre alanina 39 (A39) y alanina 40 (A40). El sitio de escisión está indicado por "/" en la secuencia de aminoácidos 1-40 de Notch3 humano como se representa en esta figura.

Figura 39:

Esta Figura muestra el análisis de la secuencia señal del péptido señal de HC humano que se predice que engloba los aminoácidos 1-22 de HC humano. Esta determinación se hizo usando el programa SignalP 3.0 Server proporcionado por la Technical University de Dinamarca. Estos resultados predicen un sitio principal de escisión localizado entre alanina 21 (A21) y arginina 22 (A22). El sitio de escisión está indicado por "/" en la secuencia de aminoácidos 1-22 de HC humano proporcionado anteriormente.

Figura 40A y 40B:

Esta Figura muestra la secuencia de nucleótidos de la proteína señuelo h-Notch3(1-34) (SEQ ID NO: 31). El péptido señal de Notch3 humano predicho está subrayado (nt 1-120). Las repeticiones 1-34 de EGF de Notch3 están codificadas desde nt 121-4158. La unión de fusión, sitio BgIII, está localizada en el nt 4158-4163. La secuencia etiqueta Fc está subrayada y en itálica.

Figura 41

Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína señuelo h-Notch3(1-34) (SEQ ID NO: 32). El péptido señal de Notch3 humano predicho está subrayado (AA 1-40). Las repeticiones 1-34 de EGF de Notch3 están codificadas desde aa 41-1386. La secuencia etiqueta Fc está subrayada y en itálica.

Figura 42

Esta Figura muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína señuelo h-spHCNotch3(1-34) (SEQ ID NO: 33). El péptido señal de Notch3 humano predicho está subrayado (AA 1-22). Las repeticiones 1-34 de EGF de Notch3 están codificadas desde aa 22-1386. La secuencia etiqueta Fc está subrayada y en itálica.

Figura 43A y 43B

Esta Figura muestra la secuencia de nucleótidos de la proteína señuelo h-spHCNotch3(1-34) (SEQ ID NO: 34). El péptido señal de HC humano predicho está subrayado (nt 1-66). Las repeticiones de EGF de Notch3 están codificadas desde nt 67-4104. La unión de fusión, sitio BgIII, es de nt 5004 a 5009. La secuencia etiqueta Fc está subrayada y en itálica.

Figura 44

Esta Figura muestra la expresión de proteínas y ligandos Notch en células endoteliales sanguíneas y linfáticas. Se llevó a cabo RT-PCR para Notch1-4, D114, D114 y Jagged1 en ARN aislado de células endoteliales sanguíneas (BEC) y células endoteliales linfáticas (LEC) purificadas de HMVEC. Notch1, Notch2, Notch4, D114 y Jagged1 se expresaron tanto en BEC como LEC a un nivel similar. La expresión de Notch3 parece estar restringida a LEC lo que sugiere que la señalización de Notch3 funciona en el endotelio linfático.

Figura 45

Esta Figura muestra que Notch3 se co-expresa con el marcador de células endoteliales linfáticas LYVE-1 y Prox1 en embriones e13.5. Se inmunotiñeron secciones seriadas de 10 micrómetros de embriones de ratón de 13.5 días embrionarios bien para LYVE-1, Prox1 y Notch3. Notch3 se expresaba en las células que también expresaban los marcadores de células endoteliales linfáticas, LYVE-1 y Prox1.

Figura 46

Esta Figura muestra que Prox1 induce la expresión de Notch3 en células endoteliales sanguíneas. (A) Se examinó si la expresión ectópica de Prox1 alteraría la expresión de proteínas o ligandos Notch. Veinticuatro horas después de la infección adenoviral bien con Ad-Prox1 o Ad-LacZ, se aisló el ARN total de HUVEC y se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para Notch1-4, D114 y Jagged1. Prox-1 reguló al alza de manera robusta la expresión de Notch3. La expresión de Notch1, Notch2, Notch4, D114 y Jagged1 no se vio afectada significativamente. (B) El compuesto E (cE), inhibidor de presenilina que inhibe la señalización de Notch, se incubó durante 24 horas en HUVEC infectadas bien con Ad-LacZ o Ad-Prox1. Se aisló el ARN total y se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para determinar la expresión de Notch3. Prox1 indujo la expresión de Notch3 y esta inducción se inhibió por la adición del compuesto

E. Esto sugiere que la inducción por Prox1 de Notch3 depende de la activación de la señal Notch.

Figura 47

Esta Figura muestra que Prox1 induce genes diana de Notch en células endoteliales sanguíneas. Se infectaron HUVEC con adenovirus que codifican, LacZ, Prox1, N1IC o N4/int-3 y se aisló el ARN total 24 horas después de la infección. Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para los genes diana de Notch endoteliales, VEGFR-3, EfrinaB2, Hey1 y Hey2. De manera similar a la activación de la señal de Notch1 y Notch4, Prox1 indujo los cuatro genes (A yB). Se desconoce la expresión de Hey1 y Hey2 en el endotelio linfático.

Figura 48

Esta Figura muestra que Prox1 induce genes diana de Notch de manera dependiente de la señalización de Notch en células endoteliales sanguíneas. Se infectaron HUVEC con adenovirus que codifican, LacZ, Prox1, N1IC o N4/int-3. El compuesto E (cE), inhibidor de presenilina que inhibe la señalización de Notch, se incubó durante 24 horas en HUVEC infectadas bien con Ad-LacZ o Ad-Prox1 y se aisló el ARN total. Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para los genes diana de Notch endoteliales, VEGFR-3, EfrinaB2 y Hey2. La inducción mediada por Prox1 de los genes diana de Notch, EfrinaB2, VEGFR-3 y Hey2 se inhibió por la adición del inhibidor de la señalización de Notch, Compuesto E. Así, Prox1 regula la expresión de EfrinaB2, VEGFR-3 y Hey2 a través de Notch.

Figura 49

Esta Figura muestra un esquema de la activación génica de N1IC. Se insertó una forma activada de Notch1 en el locus EFIalfa flanqueado por dos sitios LoxP. Después de la expresión de la recombinasa Cre, el casete neo/tpA se pierde y N1IC se expresa bajo el control del promotor ubicuo EF1 alfa.

Figura 50:

Esta Figura muestra que la activación de Notch en células de músculo liso vascular que expresan SM22 resulta en letalidad embrionaria antes de E10.5. No se observaron ratones SM22Cre/+; EF1αN1IC/ viables en el día postnatal 21 (P21) con un valor de p menor de 0,001. En el día embrionario E9.5, se observó un número predicho de embriones SM22Cre/+; EF1αN1IC/+, pero tenían un retraso grave en el crecimiento comparado con sus compañeros de camada control (Panel inferior).

Figura 51:

Esta Figura muestra que la activación de Notch en células de músculo liso vascular que expresan SM22 altera la expresión de actina alfa en células de músculo liso. Los embriones E9.5 se inmunotiñeron íntegramente para actina alfa de células de músculo liso. La expresión de actina alfa de células de músculo liso se alteró en los embriones SM22Cre/+; EF1αN1IC/+ comparado con los controles WT. Así, la activación de la señal Notch en las células de músculo liso vascular interrumpe el desarrollo cardiovascular.

Descripción detallada de la invención

Términos

Tal y como se usa en esta descripción, excepto cuando se proporciona expresamente de otra forma en la presente memoria, cada uno de los términos siguientes tendrá el significado mostrado a continuación.

"Administrar" puede efectuarse o llevarse a cabo usando cualquiera de los métodos conocidos para un experto en la técnica. Los métodos comprenden, por ejemplo, medios de administración intralesional, intramuscular, subcutáneo, intravenoso, intraperitoneal, mediado por liposomas, transmucosal, intestinal, tópico, nasal, oral, anal, ocular u ótico.

"Fijado" significará unido por cualquier medio. En una realización, fijado significa unido por un enlace covalente. En otra realización, fijado significa unido no covalentemente.

"Aminoácido", "residuo de aminoácido" y "residuo" se usan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a un aminoácido que está incorporado en una proteína, polipéptido o péptido. El aminoácido puede ser,

por ejemplo, un aminoácido natural o un análogo de un aminoácido natural que puede funcionar de una manera similar a la del aminoácido natural.

"Anticuerpo" incluirá, sin limitación, (a) una molécula de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y que reconoce un antígeno; (b) una molécula de inmunoglobulina policlonal o monoclonal; y (c) un fragmento monovalente o divalente de ésta. Las moléculas de inmunoglobulina puede derivar de cualquiera de las clases comúnmente conocidas, incluyendo pero no limitado a IgA, IgA secretora, IgG, IgE e IgM. Las subclases de IgG son muy conocidas para los expertos en la técnica e incluyen, pero no están limitadas a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Los anticuerpos pueden ser tanto naturales como no naturales. Además, los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente sintéticos, anticuerpos de cadena única, y fragmentos de éstos. Los anticuerpos pueden ser humanos o no humanos. Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse por métodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en los seres humanos. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, sin limitación, fragmentos Fab y Fc. La "parte Fc de un anticuerpo", en una realización, es un fragmento cristalizable obtenido por digestión con papaína de inmunoglobulina que consiste en la mitad C terminal de dos cadenas pesadas unidas por enlaces disulfuro y conocida como la "región efectora" de la inmunoglobulina. En otra realización, la "parte Fc de un anticuerpo" significa toda, o sustancialmente toda, de una mitad C terminal de una cadena pesada.

"Humanizado", respecto a un anticuerpo, significa un anticuerpo en el que parte, la mayor parte o todos los aminoácidos fuera de la región CDR se reemplazan con los aminoácidos correspondientes derivados de una molécula de inmunoglobulina humana. Son permisibles pequeñas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos siempre que no supriman la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno dado. Las moléculas de inmunoglobulina humanas adecuadas incluyen, sin limitación, moléculas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Varias publicaciones describen cómo preparar anticuerpos humanizados, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.816.567, 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, y la Publicación PCT Internacional No. WO 90/07861.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "composición", como en composición farmacéutica, se pretende que englobe un producto que comprende el o los ingredientes activos y el o los ingredientes inertes para preparar el vehículo, así como cualquier producto que resulta, directamente o indirectamente de la combinación formación de complejos, o agregación de dos cualesquiera o más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes.

Tal y como se usa en la presente memoria, "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad que es capaz de tratar a un sujeto que tiene un tumor, una enfermedad o un trastorno. De acuerdo con esto, la cantidad efectiva variará con el sujeto que se está tratando, así como la afección que se va a tratar. Un experto en la técnica puede llevar a cabo experimentos rutinarios de titulación para determinar dicha cantidad suficiente. La cantidad efectiva de un compuesto variará dependiendo del sujeto y de la ruta particular de administración usada. Tomando como base el compuesto, la cantidad puede administrarse continuamente, tal como por una bomba continua, o a intervalos periódicos (por ejemplo, en una o más ocasiones separadas). Un experto en la técnica puede determinar los intervalos de tiempo deseados de múltiples cantidades de un compuesto particular sin experimentación innecesaria. En una realización, la cantidad efectiva es entre aproximadamente 1 μg/kg-10 mg/kg. En otra realización, la cantidad efectiva es entre aproximadamente 10 μg/kg-1 mg/kg. En una realización adicional, la cantidad efectiva es 100 μg/kg.

"Dominio extracelular" tal y como se usa en conexión con la proteína receptora Notch significa todo o una parte de Notch que (i) existe extracelularmente (es decir, no existe ni como parte transmembrana ni como parte intracelular) y

(ii) se une a ligandos extracelulares a los que se une la proteína receptora Notch intacta. El dominio extracelular de Notch puede incluir opcionalmente un péptido señal. "Dominio extracelular", "ECD" y "Ectodominio" son sinónimos.

"Resto que incrementa la vida media" significa un resto que, cuando se fija de forma operativa a un segundo resto, incrementa la vida media in vivo del segundo resto. Los restos que incrementan la vida media incluyen, por ejemplo, partes Fc de anticuerpos, etiquetas de glicosilación (es decir, polipéptidos glicosilados), polietilen glicol (PEG), polipéptidos que tienen PEG fijado a ellos, y polipéptidos modificados con lípidos.

"Inhibir" el inicio de un trastorno o proceso biológico no deseado significará bien disminuir la probabilidad del inicio del trastorno o proceso, o prevenir el inicio del trastorno o proceso completamente. En la realización preferida, inhibir el inicio de un trastorno o proceso significa prevenir su inicio totalmente.

"Notch", "proteína Notch", y "proteína receptora Notch" son sinónimos. Además, los términos "proteína de fusión basada en Notch" y "señuelo Notch" son sinónimos. Se conocen las secuencias de aminoácidos de Notch siguientes:

Notch1 (no. de registro Genbank S18188 (rata)); Notch2 (no. de registro Genbank NP_077334 (rata)); Notch3 (no. de registro Genbank Q61982 (ratón)); y Notch4 (no. de registro Genbank T09059 (ratón)). Se conocen las secuencias de ácido nucleico de Notch siguientes:

Notch1 (no. de registro Genbank XM_342392 (rata) y NM_017617 (humano)); Notch2 (no. de registro Genbank NM_024358 (rata), M99437 (humano y AF308601 (humano)); Notch3 (no. de registro Genbank NM_008716 (ratón) y XM_009303 (humano)); y Notch4 (no. de registro Genbank NM_010929 (ratón) y NM_004557 (humano)).

Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "secuencia de ácido nucleico" se usan indistintamente en la presente memoria, y cada uno se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos. Los desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos pueden ser naturales o análogos sintéticos de éstos. "Ácido nucleico" significará cualquier ácido nucleico, incluyendo, sin limitación, ADN, ARN e híbridos de éstos. Las bases de ácido nucleico que forman moléculas de ácido nucleico pueden ser las bases A, C, G, T y U, así como derivados de éstas. Los derivados de estas bases son muy conocidos en la técnica, y se ejemplifican en PCR Systems, Reagents and Consumables (Perkin Elmer Catálogo 1996-1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, Nueva .Jersey, EEUU). Los ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, moléculas anti-sentido y moléculas de ácido nucleico catalíticas tales como ribozimas y ADNzimas. Los ácidos nucleicos también incluyen ácido nucleicos que codifican análogos de péptido, fragmentos o derivados que se diferencian de las formas naturales en términos de la identidad de uno o más residuos de aminoácidos (análogos de deleción que contienen menos de todos los residuos especificados; análogos de sustitución en los que uno o más residuos se reemplazan por uno o más residuos; y análogos de adición, en los que uno o más residuos se añaden a una parte terminal o mediana del péptido) que comparten parte

o todas las propiedades de las formas naturales.

"Fijado de forma operativa" significa, respecto a un primer resto fijado a un segundo resto, fijado de una manera que permite al primer resto funcionar (por ejemplo, propiedades de unión) como si no estuviera fijado.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria, y cada uno significa un polímero de residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos pueden ser naturales o análogos químicos de éstos. Los polipéptidos, péptidos y proteínas también pueden incluir modificaciones tales como glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, hidroxilación y ADP-ribosilación.

Tal y como se usa en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa que el vehículo es compatible con los demás ingredientes de la formulación y que no es perjudicial para el receptor de éstos, y engloba cualquiera de los vehículos estándar farmacéuticamente aceptados. Dichos vehículos incluyen, por ejemplo, 0,01

0.1 M y preferiblemente 0,05 M tampón fosfato ó 0,8% disolución salina. Además, dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones y suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo disolución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lactosa y aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer, y semejantes. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y semejantes.

"Sujeto" significará cualquier organismo incluyendo, sin limitación, un mamífero tal como un ratón, una rata, un perro, una cobaya, un hurón, un conejo y un primate. En la realización preferida, el sujeto es un ser humano.

"Tratar" significará ralentizar, parar o revertir la progresión de una enfermedad o trastorno. Tal y como se usa en la presente memoria, "tratar" también significa la mejora de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno. Las enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, Angiogénesis Tumoral, Aterosclerosis, Cicatrización de Heridas, Degeneración macular, Retinopatía de los Prematuros, Pre-eclampsia, Retinopatía diabética, Isquemia, Ictus, Enfermedad Cardiovascular y Psoriasis.

La angiogénesis se produce durante los procesos de cicatrización de heridas, el ciclo menstrual femenino y el remodelado endometrial, así como durante el desarrollo embrionario y el crecimiento de los órganos. En el entorno patológico, la angiogénesis juega un papel importante en diferentes enfermedades como artritis reumatoide, psoriasis, degeneración macular, retinopatía diabética, y crecimiento tumoral.

Ha habido una evidencia considerable in vivo, incluyendo observaciones clínicas, de que la angiogénesis anormal está implicada en varias afecciones patológicas, que incluyen artritis reumatoide, inflamación, cáncer, psoriasis, afecciones oculares degenerativas y otras.

Las unidades, prefijos y símbolos pueden indicarse en su forma aceptada por el SI. A no ser que se indique otra cosa, las secuencias de ácido nucleico se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3' y las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi terminal. Los aminoácidos pueden referirse en la presente memoria bien por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, asimismo, pueden referirse por sus códigos de una letra comúnmente aceptados.

En la presente memoria se usan las abreviaturas siguientes: ECD: dominio extracelular; IC: dominio intracelular; NECD/Fc: proteína de fusión basada en Notch; N1: Notch1; N2: Notch2; N3: Notch3; N4: Notch4; D11: semejante a

Delta; EC: células endoteliales; FGF: factor de crecimiento de fibroblastos; FGFR: receptor del factor de crecimiento de fibroblastos; HUVEC: célula endotelial de la vena umbilical humana; m.o.i.; multiplicidad de infección; VMC: células murales vasculares; VEGF: factor de crecimiento de las células del endotelio vascular; VEGFR: receptor del factor de crecimiento de las células del endotelio vascular; sp: péptido señal; HC o Hc: Cadena pesada de IgG; PDGF; factor de crecimiento derivado de plaquetas; PIGF: factor de crecimiento placentario;

Realizaciones de la invención

Esta descripción se refiere generalmente a una proteína de fusión que comprende un péptido señal, repeticiones de EGF 1-X del dominio extracelular de la proteína receptora Notch3 humana en el que X es cualquier número entero de 12 a 34, y una parte Fc de un anticuerpo unida a éste.

Esta descripción describe una proteína de fusión que comprende un péptido señal, repeticiones de EGF 1-X del dominio extracelular de la proteína receptora Notch3 humana en el que X es cualquier número entero de 1 a 10, y una parte Fc de un anticuerpo unida a éste.

Esta descripción describe una proteína de fusión que comprende un péptido señal, al menos 12 repeticiones de EGF del dominio extracelular del receptor Notch3 humano, y una parte Fc de un anticuerpo unida a éste.

Esta descripción describe una proteína de fusión que comprende un péptido señal, repeticiones de EGF del dominio extracelular de la proteína receptora Notch3 humana, en el que están presentes al menos 12 repeticiones de EGF, y una parte Fc de un anticuerpo unida a éste.

En una realización de la proteína de fusión, el dominio extracelular de la proteína receptora Notch3 comprende repeticiones semejantes a EGF 1-34.

En una realización de la proteína de fusión, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano.

En una realización de la proteína de fusión, el péptido señal es el péptido señal de Notch3 o la parte Hc (HC; Cadena Pesada) de un anticuerpo.

En una realización, la proteína de fusión comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 32. En otra realización, la proteína de fusión comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 33.

En una realización, la proteína de fusión está codificada por nucleótidos consecutivos, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 31. En otra realización, la proteína de fusión está codificada por nucleótidos consecutivos, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 34.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para tratar cáncer de ovario en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para tratar al sujeto, tratando de esta manera al sujeto que tiene cáncer de ovario.

Esta descripción describe el uso de la proteína de fusión descrita en la presente memoria para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad cardiovascular en un sujeto. En una realización, la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis, isquemia o ictus.

Esta descripción describe el uso de la proteína de fusión descrita en la presente memoria para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cáncer de ovario en un sujeto.

Esta descripción describe el uso de la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir la linfangiogénesis fisiológica o linfangiogénesis patológica en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir la linfangiogénesis fisiológica o linfangiogénesis patológica en el sujeto. En una realización, la linfangiogénesis patológica es

linfangiogénesis tumoral o metástasis en ganglios linfáticos que puede ser dependiente de la linfangiogénesis tumoral.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir la metástasis tumoral en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir la metástasis tumoral en el sujeto. En una realización, la metástasis ocurre a través de un vaso sanguíneo, la vasculatura linfática o un ganglio linfático. La metástasis tumoral es la diseminación del cáncer de un órgano a otro órgano no adyacente.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir el crecimiento de un tumor secundario en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir el crecimiento del tumor secundario en el sujeto. La inhibición también puede ser de la angiogénesis tumoral asociada con el tumor secundario o metastásico. En otra realización, el crecimiento del tumor secundario se inhibe por la inhibición de la angiogénesis asociada con el tumor secundario.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria para uso en un método para inhibir la coopción de los vasos sanguíneos por un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión descrita en la presente memoria efectiva para inhibir la coopción de los vasos sanguíneos por un tumor en el sujeto. El proceso de coopción de los vasos es un proceso mediante el cual las células tumorales se asocian con vasos pre-existentes y crecen con la ayuda de los vasos que experimentan coopción. Este crecimiento de tumores en vasos que experimentan coopción puede ser en ausencia de, preceder, o estar en conjunción con la angiogénesis tumoral. Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF) para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF), cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto. En una realización, el inhibidor de VEGF es un inhibidor de VEGF-A, un inhibidor de PGIF, un inhibidor de VEGF-B, un inhibidor de VEGF-C, o un inhibidor de VEGF-D. Los ejemplos de inhibidores de VEGF incluyen, pero no están limitados a, bevacizumab, PTK787, Bay43-9006, SU11248, AG013676, ZD6474, trampa de VEGF y Anti-VEGFR2. Los ejemplos de dichos inhibidores se describen completamente en Ferrara et al., (2004) Nature Reviews Drug Discovery, Vol. 3: 391-400 y Ellis et al. (2008) Nature Reviews Cancer Vol. 8: 579-591.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del receptor de VEGF para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del receptor de VEGF, cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto. En una realización, el inhibidor del receptor de VEGF es un inhibidor de VEGFR-1, un inhibidor de VEGFR-2, un inhibidor de VEGFR-3 o un inhibidor de cualquier combinación de VEGFR. Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF) para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un inhibidor del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF), cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto. En una realización, el inhibidor de los Factores de Crecimiento Derivados de Plaquetas es un inhibidor de PDGF-A o un inhibidor de PDGF-B.

Esta descripción describe la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un antagonista del receptor de PDGF para uso en un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto la proteína de fusión descrita en la presente memoria y un antagonista del receptor de PDGF, cada uno en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto. En una realización, el antagonista del receptor de PDGF es un antagonista del receptor PDGF B.

Esta descripción describe una composición de materia que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media para uso en un primer método para tratar un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición de materia que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media, de forma que de esta manera se trata al sujeto.

Esta descripción describe una composición de materia que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media para uso en un segundo método para inhibir la angiogénesis en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición de materia que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media, de forma que de esta manera se inhibe la angiogénesis en el sujeto.

En una primera realización de los métodos anteriores, la proteína receptora Notch es una proteína receptora Notch1. En una realización, la proteína receptora Notch1 es una proteína receptora Notch1 humana. En otra realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano. En una realización adicional, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

En una segunda realización de los métodos anteriores, la proteína receptora Notch es una proteína receptora Notch2. En una realización, la proteína receptora Notch2 es una proteína receptora Notch2 humana. En otra realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano. En una realización adicional, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

En una tercera realización de los métodos anteriores, la proteína receptora Notch es una proteína receptora Notch3. En una realización, la proteína receptora Notch3 es una proteína receptora Notch3 humana. En otra realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano. En una realización adicional, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

En una cuarta realización de los métodos anteriores, la proteína receptora Notch es una proteína receptora Notch4. En una realización, la proteína receptora Notch4 es una proteína receptora Notch4 humana. En otra realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano. En una realización adicional, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

En una quinta realización de los métodos anteriores, el sujeto es un mamífero. En una realización, el mamífero es un ser humano.

En una sexta realización de los métodos anteriores, la angiogénesis es angiogénesis tumoral.

En una realización adicional del segundo método, el sujeto tiene un tumor. En otra realización, el sujeto padece una hiperplasia vascular patológica. En una realización, la hiperplasia vascular patológica es un hemangioma benigno. En una realización adicional, el sujeto padece una enfermedad proliferativa vascular linfática.

Esta descripción describe una primera composición de materia que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch4 fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media. En una realización, el dominio extracelular está unido covalentemente al resto que incrementa la vida media. En otra realización, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

Esta descripción describe una segunda composición de materia que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch4 fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Esta descripción describe un artículo de fabricación que comprende (i) un material de envasado que tiene en él una composición de materia que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media y (ii) una etiqueta que indica que la composición se pretende para uso en un método para tratar un tumor en un sujeto u otro trastorno tratable mediante la inhibición de la angiogénesis en el sujeto.

En una primera realización del artículo anterior, la proteína receptora Notch es una proteína receptora Notch1. En una realización, la proteína receptora Notch1 es una proteína receptora Notch1 humana. En otra realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano. En una realización adicional, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

En una segunda realización del artículo anterior, la proteína receptora Notch es una proteína receptora Notch2. En una realización, la proteína receptora Notch2 es una proteína receptora Notch2 humana. En otra realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano. En una realización adicional, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

En una tercera realización del artículo anterior, la proteína receptora Notch es una proteína receptora Notch3. En una realización, la proteína receptora Notch3 es una proteína receptora Notch3 humana. En otra realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano. En una realización adicional, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

En una cuarta realización del artículo anterior, la proteína receptora Notch es una proteína receptora Notch4. En una realización, la proteína receptora Notch4 es una proteína receptora Notch4 humana. En otra realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano. En una realización adicional, el dominio extracelular y el resto que incrementa la vida media están en la misma cadena polipeptídica.

En otra realización del artículo anterior, la composición se mezcla con un vehículo farmacéutico. En una realización final, el sujeto es un ser humano.

Esta descripción describe un vector replicable que codifica un polipéptido que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch3 fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media. En una realización, el resto que incrementa la vida media es una parte Fc de un anticuerpo. En otra realización, el vector incluye, sin limitación, un plásmido, un cósmido, un retrovirus, un adenovirus, un fago lambda o un YAC.

Esta descripción también se refiere a un sistema de huésped vector que comprende un vector replicable que codifica un polipéptido que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media y una célula huésped adecuada. En una realización, la célula huésped es una célula eucariota. En otra realización, la célula eucariota es una célula CHO. En otra realización, la célula eucariota es una célula HeLa. En una realización adicional, la célula huésped es una célula bacteriana.

Finalmente, esta descripción describe un tercer método para producir un polipéptido que comprende crecer un sistema huésped vector que comprende un vector replicable que codifica un polipéptido que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora Notch fijado de forma operativa a un resto que incrementa la vida media y una célula huésped adecuada en condiciones que permitan la producción del polipéptido, y recuperar el polipéptido así producido.

La invención se ilustra en la sección de Detalles Experimentales que sigue. Esta sección se muestra para ayudar en la comprensión de la invención.

Detalles experimentales

Primera serie de experimentos

Proteínas de fusión Notch3 humanas (señuelos Notch)

Los señuelos Notch3 se ensamblan usando secuencias que codifican un péptido señal, una parte del dominio extracelular de Notch3 que engloba todos los dominios de repetición semejantes a EGF, y una parte de la región Fc humana (aminoácidos 1-237). La secuencia de nucleótidos completa de longitud completa de Notch3 humano se proporciona en la Figura 32. La secuencia de aminoácidos completa de longitud completa de Notch3 humano se proporciona en la Figura 33.

Los péptidos señal utilizados son bien el péptido señal nativo de Notch3 o el péptido señal de Hc humano, cada uno fusionado a una región de Notch3. El péptido señal permite la secreción de las proteínas señuelo Notch.

Los dominios extracelulares de Notch3 usados se diseñan para unirse a los ligandos Notch y consisten en todo o un subconjunto de los 34 dominios de repetición semejante a EGF de la proteína Notch humana.

La etiqueta Fc se fusiona al extremo C de una repetición semejante a EGF dada de Notch3 humano y sirve para permitir la purificación, detección, y estabilización de las proteínas señuelo Notch3.

El diseño global de los señuelos Notch3 humanos, dos formulaciones, es para codificar; (1) un péptido señal para permitir la secreción de las proteínas señuelo Notch3 en el medio extracelular de células eucariotas que se usan para producir las proteínas, (2) una parte del dominio extracelular de todas las repeticiones semejantes a EGF de Notch3 humano para permitir la asociación con ligandos Notch, y (3) una parte de la proteína Fc humana para permitir la detección.

Se describirán las dos formulaciones siguientes de señuelos Notch3 humanos y se esquematizan en la Figura 34.

1) Señuelo h-Notch3(1-34)

2) Señuelo h-spHCNotch3(1-34)

Secuencia de Notch3 humano

La secuencia de nucleótidos (nt) de longitud completa de Notch3 humano, que consiste en ATG de inicio (nt 1) hasta la parada (TGA; nt 6964) se muestra en la Figura 32. El péptido señal y los primeros 34 dominios de repetición semejantes a EGF están presentes en nt 1-4158 de esta secuencia. Los nucleótidos 1-4158 se utilizan para el diseño de las proteínas señuelo Notch3 humanas, descritas en las secciones siguientes. Los nucleótidos que engloban las repeticiones 1-34 de EGF están subrayados.

La secuencia de aminoácidos (aa) de longitud completa de Notch3 humano, que consiste en aa 1 (M= metionina) hasta aa 2555 (K= lisina) se muestra en la Figura 33. El péptido señal y los primeros 34 dominios de repetición semejantes a EGF están presentes en aa 1-1386 de esta secuencia. Los aminoácidos 1-1386 se utilizan para el diseño de las proteínas señuelo Notch3 humanas, descritas en las secciones siguientes. Los aminoácidos que engloban las repeticiones 1-34 de EGF están subrayados.

Secuencia de Fc humano utilizado para generar la etiqueta Fc en las proteínas señuelo Notch3

Los 713 nucleótidos de Fc humano, que se muestran en la Figura 35, se fusionan en el extremo 3' de la construcción señuelo Notch3, justo aguas abajo de las repeticiones de Notch3 semejantes a EGF. Esta región de Fc humano permite la detección y purificación de los señuelos Notch y sirve para estabilizar las proteínas de fusión secretadas Notch3 humano-Fc humano.

Los 237 aminoácidos de Fc humano, mostrados en la Figura 36, se fusionan en el extremo C de todas las construcciones señuelo Notch3, justo aguas abajo de las repeticiones de Notch3 semejantes a EGF. Esta región de Fc humano permite la detección y purificación de los señuelos Notch y sirve para estabilizar las proteínas de fusión secretadas Notch3 humano-Fc humano.

Péptidos señal utilizados en las proteínas señuelo Notch3

Dos secuencias de péptido señal distintas se incorporaron en el diseño de las proteínas señuelo Notch1 humanas. La primera es el péptido señal de Notch3 humano que se predice que engloba los aminoácidos 1-40 de Notch3 humano.

Esta determinación se hizo usando el programa Signal IP 3.0 Server proporcionado por la Technical University de Dinamarca. La segunda es el péptido señal de Hc humano que se predice que engloba los aminoácidos 1-22 del péptido señal de la cadena pesada (HC) de IgG humana.

1. Péptido señal de Notch3 humano (nt 1-20)

La secuencia de aminoácidos del péptido señal predicho Notch3 humano se esquematiza en la Figura 37. Los resultados de la predicción del análisis utilizando el SignalIP 3.0 Server proporcionado en línea por la Technical University de Dinamarca se muestran en la Figura 37. Estos resultados predicen un sitio de escisión principal localizado entre la alanina 39 (A39) y alanina 40 (A40). Este sitio de escisión se indica por "/" en la secuencia de aminoácidos 1-40 de Notch3 humano, proporcionada anteriormente.

2. Péptido señal de HC humano (aa 1-22)

La secuencia de aminoácidos del péptido señal predicho de Hc humano es

La secuencia de nucleótidos del péptido señal predicho de Hc humano es:

Los resultados de la predicción del análisis utilizando el SignalIP 3.0 Server proporcionado en línea por la Technical University de Dinamarca se muestran anteriormente. Estos resultados predicen un sitio de escisión principal localizado entre la alanina 21 (A21) y arginina 22 (22). Este sitio de escisión se indica por "/" en la secuencia de aminoácidos 1-22 de Hc humano proporcionada anteriormente.

Señuelo h-Notch3(1-34)

El señuelo h-Notch1(1-34) indica el señuelo Notch3 humano que engloba las repeticiones 1-34 semejantes a EGF de Notch3.

La secuencia de aminoácidos de la proteína señuelo h-Notch3(1-34) se muestra en la Figura 41. El péptido señal predicho de Notch3 humano está subrayado (AA 1-40). Las repeticiones 1-34 de EGF de Notch3 están codificadas desde aa 41-1386. La secuencia de la etiqueta Fc está subrayada y en itálica.

La secuencia de nucleótidos de la proteína señuelo h-Notch3(1-34) se muestra en la Figura 40. El péptido señal predicho de Notch3 humano está subrayado (nt 1-120). Las repeticiones 1-34 de EGF de Notch3 están codificadas desde nt 121-4158. La unión de fusión, sitio BgIII, es nt 4158 a 4163. La secuencia de la etiqueta Fc está subrayada y en itálica.

Señuelo h-spHcNotch1(1-34)

El señuelo h-spHcNotch1(1-34) indica el señuelo Notch3 humano que engloba las repeticiones 1-34 semejantes a EGF. La abreviatura spHc indica que se usa el péptido señal de Hc humano en esta formulación.

La secuencia de aminoácidos de la proteína señuelo h-Notch3(1-34) se muestra en la Figura 42. El péptido señal predicho de Hc humano está subrayado (AA 1-22). Las repeticiones 1-34 de EGF de Notch3 están codificadas desde aa 22-1386. La secuencia de la etiqueta Fc está subrayada y en itálica.

La secuencia de nucleótidos de la proteína señuelo h-Notch3(1-34) se muestra en la Figura 43. El péptido señal predicho de Hc humano está subrayado (nt 1-66). Las repeticiones 1-34 de EGF de Notch3 están codificadas desde nt 67-4104. La unión de fusión, sitio BgIII, es nt 4104 a 4109. La secuencia de la etiqueta Fc está subrayada y en itálica.

Métodos

Construcción de señuelos Notch3 humanos

Se usó el ARN total bien de células de músculo liso aórtico humano (AoSMC) o células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) que sobreexpresaban Prox1 para generar variantes señuelo Notch3 humanas. El ARN total se transcribió de forma inversa con la transcriptasa inversa M-MLV y bien cebadores hexaméricos aleatorios o cebadores específicos del señuelo Notch3. El ADNc sintetizado se amplificó con cebadores específicos del señuelo Notch3 aguas arriba (con sentido) y aguas baja (antisentido). El señuelo Notch3 se construyó a partir de 4 amplicones individuales. El amplicón 3' se amplificó con un cebador aguas abajo que codificaba un sitio de restricción BgIII en el extremo 5' para ligación en el sitio BgIII en la secuencia Fc para generar una quimera Notch3/Fc humana en marco.

En el caso de los señuelos Notch3 que generan la fusión después de la secuencia de nucleótidos que codifica la repetición 35 semejante a EGF, se generará un sitio BgIII para crear el sitio de fusión y se proporciona esta secuencia de fusión (Notch3, Figura 37). Esto se aplica a las formulaciones señuelo h-Notch3(1-34) y señuelo hspHCNotch3 (1-34).

Los productos de PCR amplificados se subclonaron en pBluescript SK II Fc para generar las diferentes quimeras Notch3/Fc humanas. Las secuencias señuelo Notch3/Fc humanas se trasladan a vectores de expresión de mamíferos (pAd-lox, pCCL o pcDNA3) para la expresión y purificación de las proteínas señuelo Notch3 humanas.

Segunda serie de experimentos

Materiales y métodos

Construcciones de plásmido

Las construcciones de adenovirus que codifican LacZ, Notch4 de longitud completa, o la forma activada de Notch4/int3 se han descrito previamente (Shawber et al., 2003). Una forma activada de ADNc de Notch1 fusionado en marco con 6 etiquetas myc (Kopan et al., 1994) se clonó en el vector de expresión de adenovirus, pAd-lox. Tanto VEGF165 como N1ECDFc también se clonaron en el pAd-lox. Se generaron preparaciones madre de adenovirus y se titularon como se ha descrito previamente (Hardy et al., 1997). El vector de expresión retroviral pHyTc que codifica bien LacZ, la forma activada de Notch4/int3, J1, D111 y D114 se han descrito previamente (Uyttendaele et al., 2000, Shawber et al., 2003, Das et al., 2004 en prensa). Los plásmidos que codifican el dominio extracelular de Notch1 (pb 5479-7833, registro Genbank# X57405) y el dominio extracelular de D114 (pb 1-1545, registro Genbank# AF253468, proporcionado por Chiron) fusionados en marco con una etiqueta myc/His, se prepararon por ingeniería en pHyTC.

Notch1ECD, Notch2ECD, Notch3ECD y Notch4ECD se prepararon por ingeniería en el plásmido pCMX-sFR1-IgG que contiene Fc usando los métodos mostrados en Clin. Exp. Immunol. (1992) 87(1): 105-110 para crear las proteínas de fusión basadas en Notch, es decir, Notch1ECD/Fc, Notch2ECD/Fc, Notch3ECD/Fc y Notch4ECD/Fc.

Transferencia génica adenoviral

Se sembraron 7,5 X 105 células de HUVEC en el subcultivo 3 en placas de 6 pocillos recubiertas con colágeno de tipo I el día antes de la infección adenoviral. La infección adenoviral con Ad-lacZ, Ad-VEGF165 o Ad-N1ECDFc se llevó a cabo a las m.o.i. indicadas, y se incubó a 370C durante 1 hr mezclando con movimientos circulares ocasionales de las placas.

Ensayos informadores con luciferasa

Para determinar la señalización Notch inducida por ligando, se llevaron a cabo ensayos de co-cultivo usando células HeLa y Bosc derivadas de 293. Se llevaron a cabo transfecciones transitorias por precipitación con fosfato de calcio. Las células HeLa plaqueadas 1 día antes en placas de 10 cm a 1,5 X 106 se transfectaron con 333 ng de pBOS Notch1, 333 ng de pGA981-6, y 83 ng de pLNC lacZ bien con 666 ng de pCMV-Fc o pHyTC-N1ECDFc (333 ng para xl, 666 ng para x2). Las células Bosc plaqueadas 1 día antes en placas de 10 cm a 4 X 106 se transfectaron bien con 680 ng de pHyTc-Jagged1, pHyTc-D111, pHyTc-D114 o pHyTc-x (vector vacío). Un día después de la transfección, las células se co-cultivaron en triplicado (HeLa:Bosc, 1:2) en placas de 12 pocillos durante 24 horas. Las células se recogieron y se determinó la actividad luciferasa 2 días después de la transfección usando el kit de ensayo Enhanced Luciferase (BD PharMingen), y se determinó la actividad β-galactosidasa usando el kit Galacto-Light Plus (PE Biosystems). Todos los ensayos se llevaron a cabo en un luminómetro de inyección dual Berthold.

Para determinar la señalización Notch inducida por VEGF, se usaron HUVEC que se habían infectado con adenovirus. Se infectaron HUVEC plaqueadas 1 día antes en placas de 6 pocillos a 8,0 X 105 bien con Ad-LacZ como control o Ad-VEGF a las m.o.i. indicadas en presencia o ausencia de Ad-N1ECD/Fc. Dos días después de la infección, las HUVEC infectadas se volvieron a sembrar en placas de 24 pocillos a 1,5 X 105 células en triplicado y se cultivaron durante 24 horas, y se transfectaron con 12,5 ng de pRL-SV40 (Promega) y 137,5 ng de pGA981-6 usando reactivo de transfección Effectene (Qiagen). Las células se recogieron bien 1 ó 2 días después de la transfección y se determinó la actividad luciferasa usando el Sistema de Ensayo Informador Dual-Luciferase® (Promega).

Ensayo de formación de brotes

Para preparar geles de colágeno, se mezcló una disolución helada de colágeno porcino de tipo I (Nitta gelatin, Tokio, Japón) con medio 10X RPMI1640 y tampón de neutralización en la proporción de 8:1:1. Se añadieron alicuotas de 400 μl de gel de colágeno a placas de 24 pocillos y se dejó que gelificara durante al menos 1 hora a 370C. Después de la infección adenoviral (anteriormente), las HUVEC se recogieron y plaquearon a 1,3 X 105 células por pocillo en la parte superior del gel de colágeno en placas de 24 pocillos en 0,8 ml de medio EGM2. Las HUVEC estaban casi confluentes 48 horas después de la siembra. Después de la siembra, el medio se cambió cada 2 días durante 1 semana. Se observó la formación de brotes y se hicieron fotografías después de 8 días con una cámara digital Olympus montada en un microscopio. Para la cuantificación del número de brotes, se seleccionaron aleatoriamente 5 campos para cada pocillo y dos investigadores contaron los brotes con microscopio de una manera ciega.

Resultados y discusión

Las proteínas de fusión NOTCHECD/Fc funcionan como antagonistas de Notch

Antagonistas de Notch-proteínas de fusión NotchECD/Fc

Hemos preparado varios antagonistas de Notch (Figura 2). Nuestra estrategia fue fusionar la secuencia codificadora de las repeticiones de EGF de Notch en el Dominio Extracelular (ECD) con el dominio Fc humano o de ratón. Este diseño resulta en una proteína secretada sin función de señalización pero que retiene el dominio de unión a ligando y así debería unirse a e inhibir la función del ligando. Nos referimos a estas proteínas como "NotchECD/Fc" y se han preparado las cuatro Notch1-4ECD/Fc. El dominio Fc facilita la purificación por afinidad y la detección de la proteína por inmunotransferencia o inmunohistoquímica.

Ensayo de los antagonistas de Notch

Se usó un sistema de co-cultivo in vitro (Figura 3) con ligandos expresados en una célula y activación del receptor Notch valorada en otra célula para medir la activación transcripcional de la ruta Notch. Usamos este ensayo de cocultivo para mostrar que Notch1ECD/Fc funciona para bloquear la señalización de Notch dependiente de ligando (Figura 4). El vector de expresión N1ECD/Fc se co-transfectó a diferentes proporciones con Notch1 de longitud completa y el informador de luciferasa CSL en células HeLa, seguido de co-cultivo con células 293 que expresaban el ligando. Observamos que la activación de la señalización de Notch1 por los ligandos Notch se redujo por la expresión de N1ECD/Fc. Este efecto presentó dependencia de la concentración; una proporción 2:1 de N1ECD/Fc a Notch1 fue más efectiva para inhibir la señalización que una proporción 1:1. Notch1ECD/Fc pudo bloquear la señalización mediada por Jagged1, semejante a Delta 1 o semejante a Delta 4.

Expresión y purificación de los antagonistas de Notch

Hemos preparado líneas celulares CHO y HeLa que expresan NotchECD/Fc usando vectores retrovirales para el propósito de la purificación de proteínas. Las proteínas N1ECD/Fc se secretan (Figura 5); como se muestra en el medio condicionado recogido de las líneas HeLa-NotchECD/Fc y purificado con Proteína A(pA) agarosa. La muestra purificada por pA (Sup) y lisados celulares completos (Lys) se inmunotransfirieron con anticuerpo α-Fc (Figura 5, panel A) demostrando que N1ECD/Fc se secreta en el medio. Los vectores de adenovirus para NotchECD/Fc se usaron para infectar células HeLa y los lisados de estas células se inmunotransfirieron con anticuerpos α-Fc

demostrando que expresan proteínas NotchECD/Fc (1, 2, 3, 4) (Figura 5, panel B). Actualmente estamos purificando N1ECD/Fc del medio condicionado de células CHO usando cromatografía de afinidad con pA.

Definición de la inhibición angiogénica usando proteínas de fusión Notch

La activación de la señalización Notch puede detectarse usando la actividad promotora CBF1

5 Se puede medir la función de señalización de Notch midiendo la actividad transcripcional del promotor CBF1, que se activa por la unión de Notch-IC a CBF1. Medimos la actividad promotora de CBF1 en HUVEC que se infectaron con adenovirus que codificaban VEGF-165 a diferentes MOI (Figura 6). La inducción del promotor CBF1 se detectó claramente en HUVEC infectadas con Ad-VEGF, comparado con células infectadas con Ad-LacZ de una manera dependiente de MOI. Estos datos mostraron que la sobreexpresión de VEGF podía activar la señalización de Notch

10 en HUVEC. Así, VEGF indujo la actividad de señalización de Notch.

Nos preguntamos si las proteínas de fusión Notch podían bloquear la activación inducida por VEGF de la señalización de Notch. La co-infección de la proteína de fusión Ad-Notch con Ad-VEGF redujo claramente la activación de la actividad promotora de CBF1 inducida por la infección con Ad-VEGF solo (Figura 7). En el caso de la infección a 40 MOI para cada adenovirus en la Figura 7 (panel A), se detectaron una inhibición del 60% a las 24 hr

15 y una inhibición del 90% a las 48 hr después de la transfección del gen informador y también la actividad inhibidora del señuelo Notch fue dependiente de MOI de la proteína de fusión Ad-Notch.

Las proteínas de fusión Notch bloquean el inicio del brote angiogénico inducido por VEGF

En este experimento, evaluamos el efecto del señuelo Notch en la inducción de la gemación (inicio de brote) por VEGF-165 sobreexpresado en HUVEC. Cuando HUVEC infectadas con Ad-VEGF se cultivaron en gel de tipo de

20 colágeno durante 8 días, la gemación se indujo en el gel de colágeno. Esta inducción de la gemación por VEGF sobreexpresado se inhibió claramente por coinfección de adenovirus que codificaban la proteína de fusión Notch (Figura 8). La proteína de fusión Ad-Notch en sí misma tuvo menos efecto en la morfología.

En la Figura 9, contamos las yemas por campo usando el microscopio. La infección de Ad-VEGF en HUVEC incrementó el número de yemas dependiendo de la MOI usada. La gemación inducida por Ad-VEGF se inhibió

25 claramente. Estos datos sugieren que VEGF indujo la gemación de HUVEC a través de la activación de la señalización de Notch y que la proteína de fusión Notch podía inhibir la gemación inducida por VEGF.

Referencias citadas en la segunda serie de experimentos

Tercera serie de experimentos

VEGF inicia la angiogénesis mediante una activación de la señalización Notch

Las rutas de señalización tanto de VEGF como de Notch son críticas para el desarrollo vascular. Aquí mostramos

5 que VEGF activa la señalización Notch para iniciar la angiogénesis. VEGF incrementó la expresión de Delta4 y Notch4 causando la activación de la señal Notch e induciendo filopodia en células endoteliales primarias cultivadas. Los estudios usando inhibidores del receptor de VEGF muestran que la activación de la señal Notch a su vez aumenta la acción de VEGF induciendo la expresión de VEGFR-1 (Flt-1). Otros elementos de la acción de VEGF, incluyendo la inducción de MMP-9 y MT1-MMP, están mediados por Notch. Usando ensayos in vivo para modelizar

10 la neo-vascularización de la piel inducida por VEGF, encontramos que un inhibidor de Notch secretado (proteína de fusión basada en Notch) bloquea la neo-vascularización inducida por VEGF y la inducción de la expresión de VEGFR-1. Así, la señalización de Notch es un requisito para la angiogénesis regulada por VEGF, probablemente a nivel del inicio.

VEGF es un regulador clave de la progresión de la angiogénesis que consiste en múltiples procesos, tales como la

15 degradación de ECM, gemación (formación de filopodia), proliferación, supervivencia y migración de las células endoteliales. Aunque la mayor parte de las etapas podrían co-operar con moléculas aguas abajo de la señalización de VEGF, no se sabe cómo estas etapas están reguladas de forma coordinada para resultar en eventos

morfogenéticos más complejos, tales como brote angiogénico. La señalización Notch es un mecanismo de señalización conservado evolutivamente que funciona para regular las decisiones sobre el destino celular (1). Después de la unión por un ligando, tal como Jagged y semejante a Delta, el dominio citoplásmico de Notch (NotchIC) se libera por presenilina/γ-secretasa, se transloca al núcleo, interacciona con el represor transcripcional CSL (CBF1/Su(H)lag2) y lo convierte en un activador transcripcional (1). Los papeles de la señalización Notch en el desarrollo vascular fueron sugeridos por estudios de ratones con mutación dirigida (2). Como la activación de Notch en el endotelio también altera el remodelado vascular, la señalización Notch apropiada es esencial para el desarrollo vascular (3). Aunque se sugiere la relevancia de Notch para la señalización de VEGF (4-6), todavía no está claro cómo la señalización Notch tiene un papel en la angiogénesis regulada por VEGF y si la señalización Notch participa en la angiogénesis fisiológica y patológica en la vasculatura adulta.

El crecimiento de HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana) depende de VEGF (Figs, 26A y 26B) y las respuestas biológicas relacionadas con la diferenciación, tales como brote, y puede evaluarse en un estadio temprano (7). En primer lugar, examinamos si VEGF transducido adenoviralmente inducía la expresión tanto de Notch como de ligando Notch en HUVEC cultivadas con medio completo que contenía bFGF (Fig. 22A), como se indica (5). Los análisis por RT-PCR mostraron que el ARNm tanto de D14 como de Notch4 se reguló al alza en HUVEC transducidas con VEGF adenoviralmente (Ad-VEGF-HUVEC), comparado con HUVEC transducidas con LacZ adenoviralmente (Ad-LacZ-HUVEC) (Fig. 22A). El VEGF transducido no pareció inducir la expresión de Jagged1 y Notch1. El VEGF transducido también activó la señalización Notch de una manera dependiente de la dosis midiendo la actividad informadora luciferasa CSL (Fig. 22B), que se transactivó con la señalización Notch (8). La señalización Notch se activó a una dosificación mayor de Ad-VEGF, comparado con la proliferación (Fig. 26A). Como SU5416, que es un inhibidor de las quinasas de VEGFR, disminuyó la actividad informadora luciferasa CSL inducida por VEGF (Fig. 22C), VEGF indujo la señalización Notch a través de la activación de la quinasa del receptor. Como los mutantes de Notch que carecían de los dominios tanto transmembrana como citoplásmico funcionaban como inhibidores dominantes negativos frente a la señalización Notch (9), preparamos una proteína de fusión basada en Notch o señuelo (N1ECDFc) para inhibir la señalización Notch (Fig. 22D). El análisis por transferencia Western del medio condicionado de HUVEC transducidas con Ad-N1ECDFc (Ad-N1ECDFc-HUVEC) demostró que N1ECDFc se expresaba y se secretaba bien (Fig. 22E). Usando un ensayo de co-cultivo, en el que las células Bosc que expresaban ligandos Notch (bien J1, D11 o D14) activaban la señalización Notch en células HeLa que expresaban Notch1 comparado con células Bosc control, determinamos la inhibición de la señalización Notch con la transfección de un plásmido de expresión de N1ECDFc (Fig. 22F). Después, examinamos si N1ECDFc inhibía la activación de la señalización Notch por VEGF transducido en HUVEC (Fig. 22G). La co-transducción de Ad-N1ECDFc con Ad-VEGF en HUVEC disminuyó claramente la actividad luciferasa CSL inducida por VEGF. Gerhardt et al. reportaron que VEGF controlaba la angiogénesis en la retina postnatal temprana guiando la extensión de filopodia a las puntas de los brotes vasculares (10). Durante el brote angiogénico, la formación de una célula endotelial especializada que hace proyecciones de filopodia entre células endoteliales quiescentes, podría ser uno de los eventos tempranos. Aquí queremos decir formación de una única célula endotelial que hace protrusiones de filopodia como gemación. La gemación de las células endoteliales primarias se induce cultivándolas tridimensionalmente en gel de fibrina o colágeno (11). En el caso en el que Ad-VEGF-HUVEC se cultivaron en gel de colágeno con medio completo, HUVEC transducidas hicieron extensiones de filopodia en el gel de colágeno durante 5 días (Fig. 22H) y el número de yemas se incrementó de una manera dependiente de la dosis (Fig. 27A). La activación de la señalización Notch por adenovirus que codifican la forma activada de Notch4 (Ad-Notch4/int3) indujo la gemación de HUVEC (12) y la de Notch1 (Ad-N1IC) también indujo la gemación de HUVEC (Fig. 23A y 27B). Como tanto la señalización de VEGF como de Notch inducen la gemación de HUVEC, examinamos si N1ECDFc inhibía la gemación de HUVEC inducida por VEGF (Fig. 22H-I). La gemación de Ad-VEGF-HUVEC se inhibió claramente por co-transducción de Ad-N1ECDFc. Ni HUVEC transducidas con Ad-Lac ni Ad-N1ECDFc formaron yemas (Fig. 22H). N1ECDFc inhibió la gemación de HUVEC inducida por VEGF sin afectar el número de células (Fig. 22). N1ECDFc transducido no alteró claramente la proliferación de HUVEC, mientras la de HUVEC transducidas con Ad-N1IC se inhibió de una manera dependiente de la dosis (Fig. 28A), consistente con la eficacia inhibidora de la señalización Notch frente a la proliferación endotelial (13).

Para ensayar si la señalización Notch está aguas abajo de VEGF, evaluamos tres inhibidores distintos para tirosina quinasas de receptor, incluyendo VEGFR en la gemación de HUVEC inducida por N1IC, porque existían tres factores de crecimiento en el medio completo (Fig. 23A-C). A una concentración de 1 μM, cada compuesto mostró una inhibición selectiva frente a cada quinasa (datos no mostrados). Ni PD166866 ni ZD1893 afectaron la gemación de Ad-N1IC-HUVEC, mientras SU5416 la inhibió claramente (Fig. 23A-B). SU5416 inhibió selectivamente la gemación de Ad-N1IC-HUVEC con menor reducción de viabilidad a concentraciones menores (Fig. 23C). Como Taylor et al. reportaron que Notch regulaba a la baja la expresión de Flk1/KDR/VEGFR2 (14), era improbable que Notch co-operara con Flk1 para estimular la gemación. Así, examinamos si la activación de la señalización Notch afectaba la expresión de Flt1/VEGFR1 en HUVEC, porque SU5416 inhibe la actividad quinasa tanto de Flt1 como Flk1 (15). El análisis por RT-PCR demostró que la expresión del ARNm de Flt1 estaba regulada al alza en Ad-N1IC-HUVEC, mientras la expresión del marcador de célula endotelial, ARNm de CD31, no lo hizo comparado con la que se producía en Ad-LacZ-HUVEC (Fig. 23D). El análisis por transferencia Western también mostró que la expresión de la proteína Flt1 estaba regulada al alza en Ad-N1IC-HUVEC (Fig. 23E). Así, examinamos si P1GF, que es un ligando selectivo para Flt1, estimulaba la gemación de HUVEC en las que Flt1 estaba regulado al alza mediante la activación de la señalización Notch (Fig. 23F-G). PIGF incrementó el número de yemas Ad-N1IC-HUVEC un 150%,

comparado con la ausencia de PIGF (Fig. 23F). Además, PIGF incrementó las yemas de HUVEC que contenían múltiples filopodias un 250% (Fig. 23G). Mientras la reducción de la expresión de Flt1 usando ARN de interferencia pequeños (siARN) para Flt1 inhibió la gemación de Ad-N1IC-HUVEC (Fig. 23J), la transfección de éstos disminuyó selectivamente la expresión del ARNm de Flt1 (Fig. 23H) y la de la proteína Flt1 (Fig. 23I). Aunque la reducción de la expresión de Flk1 con siARN de Flk1 también inhibió la gemación de Ad-N1IC-HUVEC (Fig. 30B), la eficacia inhibidora del siARN de Flk1 fue menor que la del siARN de Flt1 (Fig. 23J). Los efectos del siARN de Flk1 fueron más efectivos en la gemación de Ad-VEGF-HUVEC que en la de Ad-N1IC-HUVEC (Fig. 30B-C). La transfección con siARN de Flt1 inhibió la gemación tanto de Ad-N1IC-como Ad-VEGF-HUVEC en un grado similar (datos no mostrados).

Varios estudios demostraron que VEGF regulaba las actividades gelatinasa en células endoteliales y la significancia de la actividad gelatinasa como MMP-2 y MMP-9 se ha establecido firmemente en la inducción del brote angiogénico (16). Examinamos si VEGF regulaba la actividad gelatinasa mediante la señalización Notch en HUVEC.

En zimografía de gelatina, el medio condicionado de Ad-VEGF-HUVEC mostró tanto inducción como activación de MMP9, que empezó a detectarse en el día 6 (Fig. 24A) y activación de MMP2, que se detectó en el día 4 (Fig. 24B), comparado con los de Ad-LacZ-HUVEC. La co-transducción de Ad-N1ECDFc con Ad-VEGF mostró inhibición tanto de la inducción como de la activación de MMP9 (Fig. 24A) y una activación de MMP2 (Fig. 24B). El análisis por RT-PCR demostró que la expresión del ARNm de MMP9 estaba regulada al alza en Ad-N1IC-HUVEC, pero la expresión del ARNm de MMP2 estaba disminuida en Ad-N1IC-HUVEC (Fig. 24C). Como la inducción de la actividad de MMP2 no se detectó en zimografía de gelatina (Fig. 24B), este resultado fue una consecuencia probable. Mientras, la expresión de MT1-MMP, que es capaz de activar MMP2 en la superficie celular (17), estaba regulada al alza tanto a nivel de transcrito como de proteína en Ad-N1IC-HUVEC (Fig. 24D). Como VEGF puede regular tanto la expresión de gelatinasa como MT1-MMP (16), el análisis por RT-PCR demostró que tanto MMP9 como MT1-MMP estaban regulados al alza en Ad-VEGF-HUVEC, comparado con Ad-LacZ-HUVEC y esta inducción se inhibió con la cotransducción de Ad-N1ECDFc (Fig. 24E). La infección con Ad-N1ECDFc solo no afectó la expresión ni de MMP9 ni de MT1-MMP en HUVEC infectadas con Ad-LacZ (datos no mostrados). El requisito de los MMP para el brote angiogénico se ha establecido por inhibidores sintéticos de MMP (16). GM6001 es un inhibidor general frente a los MMP incluyendo MMP2, MMP9 y MT1-MMP (18). GM6001 disminuyó claramente la gemación de Ad-N1IC-HUVEC tanto en gel de colágeno (Fig. 31A-B) como de fibrina (datos no mostrados).

En el ensayo en ratón de Saco de Aire Dorsal (DAS) (19), transfectantes estables de células 293 que sobreexpresan VEGF121 (293/VEGF) indujeron significativamente angiogénesis in vivo (Fig. 25A, panel izquierdo). Esta angiogénesis inducida por VEGF se inhibió claramente por la coexpresión de N1ECDFc, comparado con 293/VEGF solo (Fig. 25A). Se midió la densidad de los vasos y en la Fig. 25B se proporciona un índice de angiogénesis, demostrando que la angiogénesis inducida por 293/VEGF se inhibe por la co-expresión de 293/N1ECDFc (Fig. 25B).

También, en el ensayo en ratón de Saco de Aire Dorsal (DAS) (19), la línea celular de cáncer de mama humano, MDA-MB-231 indujo significativamente angiogénesis in vivo, presumiblemente mediante la secreción de VEGF (Fig. 25C, panel izquierdo). Esta angiogénesis inducida por VEGF se inhibió claramente por la expresión de N1ECDFc mediada por adenovirus, comparado con adenovirus que expresan LacZ (Fig. 25C). Se midió la densidad de los vasos y en la Fig. 25D se proporciona un índice de angiogénesis, demostrando que la angiogénesis inducida por MDA-MB-231 se inhibe por la expresión de N1ECDFc.

Flk1 es un transductor de la señal positivo principal para la angiogénesis a través de su fuerte actividad tirosina quinasa en el embrión, mientras se piensa que Flt1 es un transductor de la señal negativo para la angiogénesis. Sin embargo, se demostró un papel positivo para Flt-1 en ratones adultos, ya que el crecimiento in vivo de LLC que sobreexpresaban P1GF2 se comprometió severamente en ratones que carecían de dominio quinasa de Flt-1 citoplásmico (20). Notch podría funcionar para alterar la señalización de VEGF induciendo la señalización de Flt-1 y señalización de Flk-1 moderada bien para inducir extensión de filopodia o potenciar el brote angiogénico, ya que la señalización PIGF/Flt-1 alteró el sitio de fosforilación de Flk-1 y potenció angiogénesis miocárdica isquémica (21). De forma interesante, la señalización de Notch también reguló al alza la expresión de PIGF (Fig. 29). Sin embargo, la activación continua de la señalización de Notch inhibe la formación de brotes angiogénicos que contienen lumen multi-celular, como se ha reportado previamente (22). La señalización de Notch debería desactivarse después de la gemación/formación de filopodia y podría requerirse la activación transitoria de la ruta Notch. En un modelo de ratón transgénico de carcinogénesis de células beta pancreáticas (ratones RipITag2) en los que la angiogénesis tumoral depende de VEGF, el nivel de la expresión de VEGF no se incrementa, pero ocurre la movilización de VEGF extracelular almacenado en la matriz hacia los receptores de VEGF. MMP-9 es responsable de esta movilización y la progresión tumoral se inhibió en ratones transgénicos doble nulos Rip1Tag23MMP-9 (23). La expresión de MMP-9 regulada al alza por Notch podría incrementar el nivel local de VEGF en el sitio del brote angiogénico. Mientras Notch también regula al alza la expresión de MT1-MMP, el MMP-2 extracelular podría ser dirigido a la membrana celular de las células endoteliales activadas por Notch. Notch podría determinar el sitio para le brote angiogénico regulando la actividad gelatinasa y la concentración de VEGF. Como MMP-9 endotelial estaba regulado por Flt-1 en metástasis específicas de pulmón (20), Flt-1 podría participar en la inducción de MMP-9 indirectamente.

Referencias citadas en la tercera serie de experimentos

Cuarta serie de experimentos

Expresión de proteínas y ligandos Notch en células endoteliales sanguíneas y linfáticas

Se llevó a cabo RT-PCR para Notch1-4, D111, D114 y Jagged1 en ARN aislado de células endoteliales sanguíneas

5 (BEC) y células endoteliales linfáticas (LEC) purificadas de HMVEC. Como se muestra en la Figura 44, Notch1, Notch2, Notch4, D114 y Jagged1 se expresaban tanto en BEC como LEC a un nivel similar. La expresión de Notch3 parece estar restringida a las LEC lo que sugiere que la señalización de Notch3 funciona en el endotelio linfático.

Notch3 se co-expresa con el marcador de células endoteliales linfáticas LYVE-1 y Prox1 en embriones e13.5

Se inmunotiñeron secciones de 10 micrómetros de embriones de ratón en el día embrionario 13.5 bien para LYVE-1, 10 Prox1 y Notch3. Como se muestra en la Figura 45, Notch3 se expresó en las células que también expresaron los marcadores de células endoteliales linfáticas, LYVE-1 y Prox1.

Prox1 indujo la expresión de Notch3 en células endoteliales sanguíneas

Se examinó si la expresión ectópica de Prox1 alteraría la expresión de proteínas o ligandos Notch. Como se muestra en la Figura 46, sección A, veinticuatro horas después de la infección adenoviral bien con Ad-Prox1 o Ad-LacZ, se 15 aisló el ARN total de HUVEC y se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para Notch1-4, D114 y Jagged1. Prox-1 reguló al alza de manera robusta la expresión de Notch3. La expresión de Notch1, Notch2, Notch4, D114 y Jagged1 no se vio afectada significativamente. Como se muestra en la Figura 46, sección B, el Compuesto E (cE), inhibidor de presenilina que inhibe la señalización de Notch, se incubó durante 24 horas en HUVEC infectadas bien con Ad-LacZ

o Ad-Prox1. Se aisló el ARN total y se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para determinar la expresión de Notch3. 20 Prox1 indujo la expresión de Notch3 y esta inducción se inhibió por la adición del compuesto E.

Esto sugiere que la inducción por Prox1 de Notch3 depende de la activación de la señal Notch.

Prox1 induce genes diana de Notch en células endoteliales sanguíneas

Se infectaron HUVEC con adenovirus que codifican, LacZ, Prox1, N1IC o N4/int-3 y se aisló el ARN total 24 horas después de la infección. Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para los genes diana de Notch endoteliales. VEGFR-3, 25 EfrinaB2, Hey1 y Hey2. De manera similar a la activación de la señal de Notch1 y Notch4, Prox1 indujo los cuatro genes (Figura 47, secciones A y B). Se desconoce la expresión de Hey1 y Hey2 en el endotelio linfático.

La inducción de genes diana de Notch por Prox1 depende de la señalización de Notch en las células endoteliales sanguíneas

Se infectaron HUVEC con adenovirus que codifican, LacZ, Prox1, N1IC o N4/int-3. El compuesto E (cE), inhibidor de presenilina que inhibe la señalización de Notch, se incubó durante 24 horas en HUVEC infectadas bien con Ad-LacZ

o Ad-Prox1 y se aisló el ARN total. Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para los genes diana de Notch endoteliales. VEGFR-3, EfrinaB2 y Hey2. La inducción mediada por Prox1 de los genes diana de Notch, EfrinaB2, VEGFR-3 y Hey2 se inhibió por la adición del inhibidor de la señalización de Notch, Compuesto E, como se muestra en la Figura

48. Así, Prox1 regula la expresión de EfrinaB2, VEGFR-3 y Hey2 a través de Notch.

Quinta serie de experimentos

Antecedentes

Pueden trazarse avances sobre una función para Notch en la homeostasis vascular a partir del trastorno neurovascular humano, Arteriopatía Cerebral Autosómica Dominante con Infartos Subcorticales y Leucoencefalopatía (CADASIL). En la mayoría de los pacientes, se ha encontrado que CADASIL se correlaciona con mutación con cambio de sentido en Notch3. CADASIL es un trastorno autosómico dominante de inicio tardío (edad media de 45) caracterizado por migrañas con aura e ictus recurrentes que dan lugar a síntomas psiquiátricos, disminución cognitiva progresiva, demencia y muerte (81). Estos síntomas neuropatológicos surgen secundariamente a una arteriopatía con desarrollo lento, asociada con la desorganización y destrucción de las células de músculo liso vascular que rodean las arterias y arteriolas cerebrales. La regresión de las células de músculo liso vascular está asociada con una disminución en el espesor de la pared de los vasos, una pérdida de la matriz extracelular y debilidad de la pared de los vasos (82). En las células de músculo liso vascular, existe una acumulación del dominio extracelular de Notch3 y en la matriz extracelular, una deposición anormal de partículas referidas como materiales osmofílicos granulares (GOM) (83). En este trastorno, las lesiones arteriales no están restringidas al cerebro y se encuentran en arterias de la piel y la retina (83-85).

El fenotipo de CADASIL se correlaciona con la expresión de Notch3 en las células de músculo liso vascular (70, 81). Siendo la hipótesis que Notch3 funciona para mantener las interacciones célula-célula o la comunicación entre las células de músculo liso vascular y las células endoteliales arteriales. Un estudio reciente ha recreado la patología de los vasos en CADASIL en ratones transgénicos que expresan un transgén Notch3 que codifica la mutación R90C de CADASIL específicamente en las células de músculo liso vascular (86). La vasculatura de estos ratones mostró una arteriopatía clásica de CADASIL, incluyendo depósitos de GOM y acumulación de Notch3. Sin embargo, estas características estuvieron precedidas de la alteración del anclaje y adhesión de células de músculo liso vascular a células vecinas seguido de degeneración de las células de músculo liso vascular. Así, CADASIL resulta del contacto y viabilidad reducidos de las células de músculo liso vascular y la deposición de GOM y acumulación del dominio extracelular de Notch3 son consecuencias secundarias de este deterioro celular. Consistente con un papel para Notch3 en la supervivencia celular, la expresión de una forma constitutivamente activa de Notch3 en células de músculo liso aórtico de rata resultó en la inducción de cFlip, un antagonista de la apoptosis dependiente de Fas (87). Además, la expresión ectópica de Hey1 en células de músculo liso vascular cultivadas estimuló la supervivencia celular a través de Akt e inhibió así la apoptosis en respuesta a ausencia de suero y ligando Fas (88). Tomados conjuntamente, estos datos indican que Notch3 mantiene la homeostasis de los vasos arteriales estimulando la supervivencia de las células de músculo liso vascular. La permeabilidad de la pared de los vasos arteriales resultante podría surgir de la muerte de las células de músculo liso vascular o un fallo de las células de músculo liso vascular para comunicarse con sus células endoteliales vecinas. La alteración de la actividad de Notch3 en ratones puede ayudar a definir la naturaleza de este defecto.

La actividad específica de las proteínas Notch3 mutantes de CADASIL todavía se entiende poco. Una complicación en la interpretación de la función de Notch3 mutante surge de estudios in vitro conflictivos que han mostrado que Notch3 citoplásmico truncado puede bien inhibir o activar el factor de transcripción CSL (89.,90).

La activación de la señalización de Notch en las células de músculo liso vascular resulta en letalidad embrionaria.

Notch3 se expresa y es activo en células que rodean los vasos sanguíneos, las células de músculo liso y pericitos. Las células de músculo liso son importantes para la función cardiovascular y deben estar sanas para prevenir el ictus. Los pericitos pueden contribuir al crecimiento de los vasos tumorales. No se piensa que Notch1 y Notch4 funcionen en estos tipos celulares.

Por lo tanto, las proteínas de fusión Notch3 descritas en la presente memoria pueden ser útiles para prevenir el ictus mediante la prevención de la actividad anormal de Notch3. Además, las proteínas de fusión Notch3 pueden ser útiles para mantener las células de músculo liso vascular, para restringir el crecimiento o función de los pericitos tumorales, o para influir en la angiogénesis retiniana mediante la modulación de la función de los pericitos.

Hemos construido un ratón transgénico que expresa una forma activada de Notch1 (N1IC) bajo el control del promotor alfa del factor de elongación 1 (EF1α) en tejidos que expresan la recombinasa Cre, referido como

EF1αN1ICI+

(Fig. 49). EF1αN1ICI+ es viable y fértil (Fig. 50). Hemos expresado N1IC en células de músculo liso vascular cruzando EF1αN1ICI+ con una línea de ratón SM22-Cre (SM22CreI+). Los dobles transgénicos resultantes

SM22CreI+

, EF1αN1ICI+ mueren a E9.5 (Fig. 50), Los embriones SM22CreI+, EF1αN1ICI+ presentan defectos miocárdicos que creemos son los responsables de la letalidad embrionaria. Consistente con estos defectos en las células de músculo liso miocárdico, observamos una alteración en la expresión del marcador de las células de músculo liso vascular, actina alfa de células de músculo liso en animales transgénicos SM22CreI+, EF1αN1ICI+ E9.5 (Fig. 51). Estos resultados demuestran que una señalización de Notch incrementada en las células de músculo liso vascular altera el desarrollo cardiovascular embrionario.

Referencias citadas en la quinta serie de experimentos

Listado se Secuencias

<110> The Trustees of columbia University in The City of New York Kitajewski, Jan Shawber, carrie

<120> Proteínas de fusión basadas en Notch3 humanas como inhibidores señuelo de la señalización de Notch3 5

<130> 79285-PCT/JPW/WS

<160> 34 10 <170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1433

<212> PRT 15 <213> Rattus norvegicus

<400> 1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Rattus norvegius

<400> 2

<210> 3

<211> 1419

<212> PRT 15 <213> Rattus nowegicus

<400> 3

<210> 4

<211> 1379

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 1170

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

<210> 6

<211> 4293

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus

<400> 6

<210> 7

<211> 4257

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus

<400> 7

<210> 8

<211> 4137

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 8

5 <210> 9

<211> 3510

<212> DNA

<213> Mus musculus

10 <400> 9

5: <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus

<400> 10

10: gatctgggcc cgggc 15

15: <210> 11 <211> 4299 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 4213

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 3974

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 3522

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 6966

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

5: <210> 16 <211> 2321 <212> PRT <213> Homo sapiens

10: <400> 16

73

<210> 17

<211> 714

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18 10 <211> 237

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18 15

<210> 19

<211> 12

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

gaggagccgc gg 12

<210> 20

<211> 12

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

ccgcggctcc tc 12

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 17

<212> DNA <213> Homo sapiens

5: <400> 22 gaggagccgc gagatct 17

<210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 23

15: agatctcgcg gctcctc 17

<210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 24

25: gaggagccgc gagatctggg cccg <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens 24

<400> 25

cgggcccaga tctcgcggct cctc: 24

35: <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 26

<210>: 27 45 <211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

55 <210> 28

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29 5 <211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29 10

<210> 30

<211> 66 15 <212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 4872

<212> DNA 25 <213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 1623

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 1605

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 4818

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una proteína de fusión cuya secuencia (a) es idéntica a la secuencia de las repeticiones 1-X de EGF del dominio extracelular de la proteína receptora de Notch3 humana en la que X es cualquier número entero de 1 a 10 o de 12 a 33, seguido de (b) una secuencia idéntica a la secuencia de una parte Fc de un anticuerpo, en la que (b) está localizada en el lado carboxi terminal de (a) y en la que (b) está unida a (a) bien directamente o mediante un conector.
2.

Una proteína de fusión que comprende la secuencia que (a) es idéntica a la secuencia de las repeticiones de EGF del dominio extracelular de la proteína receptora de Notch3 humana, en la que están presentes X repeticiones de EGF, en la que X es cualquier número entero de 12 a 33 seguido de (b) una secuencia idéntica a la secuencia de una parte Fc de un anticuerpo, en la que (b) está localizada en el lado carboxi terminal de (a) y en la que (b) está unida a (a) bien directamente o mediante un conector.
3.

La proteína de fusión de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano.
4.

La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que (b) está unida a (a) mediante una secuencia conectora.
5.

La proteína de fusión de la reivindicación 3, en la que (b) está unida directamente a (a).
6.

La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de un trastorno metabólico.
7.

La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de un tumor.
8.

La proteína de fusión de la reivindicación 7, en la que el tumor es un cáncer de ovario o un cáncer de mama.
9.

La proteína de fusión de la reivindicación 6, en la que el trastorno metabólico es diabetes, obesidad, aterosclerosis, isquemia , ictus, o enfermedad cardiovascular.
10.

La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en la inhibición de la angiogénesis, linfangiogénesis fisiológica, linfangiogénesis patológica, metástasis tumoral, crecimiento de un tumor secundario, o coopción de vasos sanguíneos.
11.

La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de un sujeto que padece un cáncer en el que la proteína de fusión se va a administrar además de (i) un inhibidor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF), (ii) un inhibidor del receptor de VEGF, (iii) un inhibidor de PDGF, (iv) un antagonista del receptor de PDGF, o (v) un inhibidor de HER2/neu.
12.

La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que el inhibidor de VEGF es un inhibidor de VEGF-A, PGIF, VEGF-B, VEGF-C, o VEGF-D.
13.

La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que el inhibidor del receptor de VEGF es un inhibidor de VEGFR-1 o un inhibidor de VEGFR-2.
14.

La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que el inhibidor de PDGF es un inhibidor de PDGF-A o un inhibidor de PDGF-B.
15.

La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que el antagonista del receptor de PDGF es un antagonista del receptor de PDGF B.

Expresión de proteínas y ligandos Notch en células endoteliales sanguíneas y linfáticas.

Se llevó a cabo RT-PCR para Notch1-4, DII1, DII4 y Jagged1 en ARN aislado de células endoteliales sanguíneas (BEC) y células endoteliales linfáticas (LEC) purificadas de HMVEC (Fig. 4A). Notch1, Notch2, Notch4, DII4 y Jagged1 se expresaron tanto en BEC como LEC a un nivel similar. La expresión de Notch3 parece estar restringida a LEC lo que sugiere que la señalización de Notch3 funciona en el endotelio linfático.

Notch3 se co-expresa con los marcadores de células endoteliales linfáticas LYVE-1 y Prox1 en embriones e13.5. Se inmunotiñeron secciones seriadas de 10 micrómetros de embriones de ratón de 13.5 días embrionarios bien para LYVE-1, Prox1 y Notch3. Notch3 se expresaba en las células que también expresaban los marcadores de células endoteliales linfáticas, LYVE-1 y Prox1.

Prox1 induce la expresión de Notch3 en células endoteliales sanguíneas. A. Examinamos si la expresión ectópica de Prox1 alteraría la expresión de proteínas o ligandos Notch. Veinticuatro horas después de la infección adenoviral bien con Ad-Prox1 o Ad-LacZ, se aisló el ARN total de HUVEC y se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa 5 para Notch1-4, DII4 y Jagged1. Prox-1 reguló al alza de manera robusta la expresión de Notch3. La expresión de Notch1, Notch2, Notch4, DII4 y Jagged1 no se vio afectada significativamente. B. El Compuesto E (cE), inhibidor de presenilina que inhibe la señalización de Notch, se incubó durante 24 horas en HUVEC infectadas bien con Ad-LacZ

o Ad-Prox1. Se aisló el ARN total y se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para determinar la expresión de Notch3.

Prox1 indujo la expresión de Notch3 y esta inducción se inhibió por la adición del Compuesto E. Esto sugiere que la 10 inducción por Prox1 de Notch3 depende de la activación de la señal Notch.

Prox1 induce genes diana de Notch en células endoteliales sanguíneas. Se infectaron HUVEC con adenovirus que codifican, LacZ, Prox1, N1IC o N4/int-3 y se aisló el ARN total 24 horas después de la infección. Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para los genes diana de Notch endoteliales, VEGFR-3, EfrinaB2, Hey1 y Hey2. De manera similar a la activación de la señal de Notch1 y Notch4, Prox1 indujo los cuatro genes (A y B). Se desconoce la expresión de Hey1 y Hey2 en el endotelio linfático.

Prox1 induce genes diana de Notch de manera dependiente de la señalización de Notch en células endoteliales sanguíneas. Se infectaron HUVEC con adenovirus que codifican, LacZ, Prox1, N1IC o N4/int-3. El Compuesto E (cE), inhibidor de presenilina que inhibe la señalización de Notch, se incubó durante 24 horas en HUVEC infectadas bien con Ad-LacZ o Ad-Prox1 y se aisló el ARN total. Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para los genes diana de Notch endoteliales, VEGFR-3, EfrinaB2 y Hey2. La inducción mediada por Prox1 de los genes diana de Notch, efrinaB2, VEGFR-3 y Hey2 se inhibió por la adición del inhibidor de la señalización de Notch, Compuesto E. Así, Prox1 regula la expresión de efrinaB2, VEGFR-3 y Hey2 a través de Notch.