ES2527681T3 - Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo - Google Patents

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Abstract

n polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y b) un fragmento a) que tiene actividad celulolítica

Description

Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la producción de productos hidrolizados de azúcares a partir de material celulósico. Más precisamente, la invención se refiere a la producción de azúcares fermentables a partir de material lignocelulósico mediante conversión enzimática. Los azúcares fermentables son, p. ej., útiles en la producción de bioetanol, o para otros fines. En particular, la invención se refiere a un método para el tratamiento de material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, y opcionalmente xilanasa, y a preparaciones enzimáticas y a los usos de las mismas. La invención se refiere adicionalmente a nuevos polipéptidos celulolíticos, los polinucleótidos que los codifican, y a vectores y células anfitrionas que contienen los polinucleótidos. También adicionalmente, la invención se refiere a los usos de los polipéptidos y a un método para su preparación.
Antecedentes de la invención
Los productos hidrolizados de azúcares se pueden utilizar para la producción microbiana de una variedad de sustancias químicas puras o biopolímeros, tales como ácidos orgánicos, por ejemplo ácido láctico, o etanol u otros alcoholes, por ejemplo n-butanol, 1,3-propanodiol, o polihidroxialcanoatos (PHA). Los productos hidrolizados de azúcares también pueden servir como materia prima para otros procesos no microbianos, por ejemplo, para el enriquecimiento, el aislamiento y la purificación de azúcares de alto valor o para diversos procedimientos de polimerización. Uno de los principales usos de los productos hidrolizados de azúcares es en la producción de biocombustibles. La producción de bioetanol y/u otros productos químicos puede tener lugar en un procedimiento integrado en una biorrefinería (Wyman 2001).
Los recursos limitados de combustibles fósiles, y las cantidades crecientes de CO2 liberado de los mismos y que causan el fenómeno de efecto invernadero han planteado la necesidad de utilización de la biomasa como fuente de energía renovable y limpia. Una tecnología prometedora alternativa es la producción de biocombustibles, es decir, etanol a partir de materiales celulósicos. En el sector del transporte los biocombustibles son, por el momento la única opción, lo que podría reducir las emisiones de CO2 en un orden de magnitud. El etanol puede utilizarse en vehículos y sistemas de distribución existentes y por lo tanto no requiere de inversiones en infraestructuras costosas. Los azúcares derivados de materias primas lignocelulósicas renovables se pueden utilizar también como materias primas para una variedad de productos químicos que pueden sustituir los productos químicos con una base oleosa.
La mayor parte de los carbohidratos en las plantas están en forma de lignocelulosa, que consiste esencialmente en celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina. En un procedimiento de lignocelulosa a etanol el material lignocelulósico se pretrata en primer lugar químicamente o físicamente para hacer la fracción de celulosa más accesible a la hidrólisis. La fracción de celulosa es hidrolizada a continuación para obtener azúcares que pueden ser fermentados por levaduras a etanol. La lignina se obtiene en forma de un co-producto principal que se puede utilizar como combustible sólido.
Los costes de producción de bioetanol son altos y la producción de energía es baja, y hay una continua búsqueda de hacer el proceso más económico. La hidrólisis enzimática se considera la tecnología más prometedora para la conversión de biomasa celulósica en azúcares fermentables. Sin embargo, la hidrólisis enzimática se utiliza solo hasta una cantidad limitada a escala industrial, y especialmente cuando se utiliza material fuertemente lignificado como la madera o residuos agrícolas, la tecnología no es satisfactoria. El coste de la etapa enzimática es uno de los principales factores económicos del procedimiento. Se han realizado esfuerzos para mejorar la eficiencia de la hidrólisis enzimática del material celulósico (Badger 2002).
El documento US 2002/019 2774 A1 describe un procedimiento continuo para la conversión de biomasa lignocelulósica sólida en productos carburantes combustibles. Después del pretratamiento por oxidación húmeda o explosión de vapor de agua se separa la biomasa parcialmente en celulosa, hemicelulosa y lignina, y a continuación se somete a hidrólisis parcial utilizando una o más enzimas carbohidrasas (EC 3.2). Se proporciona como ejemplo Celluclast™, un producto comercial de Novo Nordisk A/S que contiene actividades celulasa y xilanasa.
El documento US 2004/000 5674 A1 describe nuevas mezclas de enzimas que se pueden utilizar directamente en el sustrato lignocelulósico, por medio de lo cual se pueden evitar los productos de desecho tóxicos formados durante los procedimientos de pretratamiento, y se puede ahorrar energía. La mezcla de enzimas sinérgica contiene una celulasa y una enzima auxiliar tal como celulasa, xilanasa, ligninasa, amilasa, proteasa, lipidasa o glucuronidasa, o cualquier combinación de las mismas. Se considera que la celulasa incluye endoglucanasa (EG), beta-glucosidasa (BG) y celobiohidrolasa (CBH). Los ejemplos ilustran el uso de una mezcla de preparaciones de xilanasa y celulasa de Trichoderma.
Kurabi et al. (2005) han investigado la hidrólisis enzimática de abeto de Douglas pretratado mediante explosión de vapor y organosolv con etanol mediante celulasas fúngicas novedosas y comerciales. Sometieron a ensayo dos
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preparaciones de celulasa de Trichoderna reesei comerciales, y dos nuevas preparaciones producidas por cepas mutantes de Trichoderma sp. y Penicillium sp. La preparación de Trichoderma sp. mostró un funcionamiento significativamente mejor que las otras preparaciones. Se creía que el mejor funcionamiento era debido al menos en parte a una actividad beta-glucosidasa significativamente mayor, lo que alivia la inhibición por producto de celobiohidrolasa y endoglucanasa.
El documento US 2004/005 3373 A1 se refiere un método para convertir celulosa en glucosa mediante el tratamiento de un substrato lignocelulósico pretratado con una mezcla de enzimas que comprende celulasa y una celobiohidrolasa I modificada (CBHI). La CBHI se ha modificado mediante la inactivación de su dominio de unión a celulosa (CBD). Las ventajas de la modificación de CBHI son, por ejemplo una mejor recuperación y una mayor tasa de hidrólisis con alta concentración de sustrato. La celulasa se selecciona del grupo que consiste en EG, CBH y BG. La CBHI se obtiene preferiblemente a partir deTrichoderma.
El documento US 2005/016 4355 A1 describe un método para degradar material lignocelulósico con una o más enzimas celulolíticas en presencia de al menos un tensioactivo. También se pueden utilizar enzimas adicionales, tales como hemicelulasas, esterasa, peroxidasa, proteasa, lacasa o mezclas de las mismas. La presencia del agente tensioactivo aumenta la degradación de material lignocelulósico en comparación con la ausencia de tensioactivo. Las enzimas celulolíticas pueden ser cualquier enzima implicada en la degradación de la lignocelulosa incluyendo CBH, EG y BG.
Existe un gran número de publicaciones que describen diversas celulasas y hemicelulasas.
Las celobiohidrolasas (CBHS) se describen por ejemplo en el documento WO 03/000 941, que se refiere a las enzimas CBHI obtenidas a partir de diversos hongos. No se proporcionan propiedades fisiológicas de las enzimas, ni ningún ejemplo de sus usos. Hong et al. (2003b) caracterizan CBHI de Thermoascus aurantiacus producida en levadura. No se describen aplicaciones de la enzima. Tuohy et al. (2002) describen tres formas de celobiohidrolasas de Talaromyces emersonii. El documento WO 2005/001065 describe celobiohidrolasas con mayor termoestabilidad, de Humicola grisea y Scytalidium thermophilum CBH1, que se utilizan junto con endoglucanasa y beta-glucosidasa en la hidrólisis de celulosa para obtener glucosa para la producción de etanol.
Las endoglucanasas de la familia cel5 (fam 5 de EG) se describen p. ej., en el documento WO 03/062 409, que se refiere a composiciones que comprenden al menos dos enzimas termoestables para su uso en aplicaciones de alimentación. Hong et al. (2003a) describen la producción de endo-β-1,4-glucanasa termoestable de T. aurantiacus en levaduras. No se explican las aplicaciones. El documento WO 01/70998 se refiere a β-glucanasa de Talaromyces. También describen β-glucanasas de Talaromyces emersonii. Se comentan las aplicaciones para alimentación, pienso, bebida, cerveza, y detergente. No se menciona la hidrólisis de lignocelulosa. El documento WO 98/06 858 describe beta-1,4-endoglucanasa de Aspergillus niger y comenta las aplicaciones en piensos y alimentos de la enzima. El documento WO 97/13853 describe métodos para escrutar fragmentos de ADN que codifican enzimas en bibliotecas de ADNc. La biblioteca de ADNc es de origen fúngico o de levadura, preferiblemente de Aspergillus. La enzima es preferiblemente una celulasa. Van Petegem et al. (2002) describen la estructura 3D de una endoglucanasa de la familia cel5 de Thermoascus aurantiacus. Parry et al. (2002) describen el modo de acción de una endoglucanasa de la familia cel5 de Thermoascus aurantiacus.
Las endoglucanasas de la familia cel7 (fam 7 de EG) se describen p. ej. en el documento US 5.912.157, que atañe a endoglucanasa de Myceliphthora y sus homólogos y aplicaciones de los mismos en detergentes, tejidos, y pasta de papel. El documento US 6.071.735 describe celulasas que exhiben alta actividad endoglucanasa en condiciones alcalinas. Se comentan los usos como detergente, en aplicaciones de pasta de papel y papel, y tejidos. No se menciona el bioetanol. El documento US 5.763.254 describe enzimas que degradan celulosa/hemicelulosa y que tienen residuos de aminoácidos conservados en el CBD.
Las endoglucanasas de la familia cel45 (fam 45 de EG) se describen por ejemplo, en el documento US 6.001.639, que se refiere a enzimas que tienen actividad endoglucanasa y que tienen dos secuencias de aminoácidos conservadas. Los usos en aplicaciones textiles, detergentes, y de pasta de papel y papel son comentados generalmente y se menciona el tratamiento de material lignocelulósico pero no se proporcionan ejemplos. El documento WO 2004/053039 se refiere a aplicaciones detergentes de endoglucanasas. El documento US 5.958.082 describe el uso de endoglucanasa, especialmente de Thielavia terrestris en aplicación textil. El documento EP 0495258 se refiere a composiciones detergentes que contienen celulasa de Humicola. El documento US 5.948.672 describe una preparación de celulasa que contiene endoglucanasa, especialmente de Humicola y su uso en aplicaciones textiles y de pasta de papel. No se menciona la hidrólisis de lignocelulosa.
Una pequeña cantidad de beta-glucosidasa (BG) mejora la hidrólisis de la biomasa a glucosa mediante hidrólisis de la celobiosa producida por celobiohidrolasas. La conversión de celobiosa a glucosa es por lo general la principal etapa limitante de la velocidad. Las beta-glucosidasas se describen, por ejemplo en el documento US 2005/021 4920, que se refiere a BG de Aspergillus fumigatus. La enzima ha sido producida en Aspergillus oryzae y Trichoderma reesei. Se comenta generalmente pero no se ilustra el uso de la enzima en aplicaciones de degradación de biomasa o detergentes. El documento WO 02/095 014 describe una enzima de Aspergillus oryzae que tiene actividad celobiasa. Se comenta generalmente pero no se ilustra el uso en la producción de etanol a partir
de biomasa. El documento WO 2005/074656 describe polipéptidos que tienen actividad potenciadora celulolítica derivados por ejemplo de T. aurantiacus; A. fumigatus; T. terrestris y T. aurantiacus. El documento WO 02/26979 describe el procesamiento enzimático de material vegetal. El documento US 6.022.725 describe la clonación y la amplificación del gen de la beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, y el documento US 6.103.464 describe un método para la detección de ADN que codifica una beta-glucosidasa de un hongo filamentoso. No se proporcionan ejemplos de aplicación.
Las xilanasas se describen por ejemplo, en el documento FR2786784, que se refiere a una xilanasa estable al calor, útil, p. ej., en el tratamiento de piensos para animales y en la fabricación de pan. La enzima deriva de un hongo termófilo, particularmente del género Thermoascus.
El documento US 6.197.564 describe enzimas que tienen actividad xilanasa, y obtenidas a partir de Aspergillus aculeatus. Se ilustra su aplicación en panadería. El documento WO 02/24926 se refiere a xilanasas de Talaromyces. Se proporcionan ejemplos en alimentación y panadería. El documento WO 01/42433 describe xilanasas termoestables de Talaromyces emersonii para su uso en aplicaciones para alimentos y piensos.
Las enzimas celulolíticas mejor investigadas y más ampliamente aplicadas de origen fúngico se han obtenido de Trichoderma reesei (el anamorfo de Hypocrea jecorina). En consecuencia también la mayoría de las celulasas fúngicas disponibles comercialmente derivan de Trichoderma reesei. Sin embargo, la mayoría de las celulasas fúngicas menos conocidas no se han aplicado en procedimientos de importancia práctica tales como en la degradación de material celulósico, incluyendo lignocelulosa.
Existe una continua necesidad de nuevos métodos para degradar sustratos celulósicos, en particular sustratos lignocelulósicos, y de nuevas enzimas y mezclas de enzimas, que mejoren la eficacia de degradación. También existe una necesidad de procedimientos y enzimas, que trabajen a altas temperaturas, permitiendo así el uso de alta consistencia de biomasa y conduciendo a altas concentraciones de azúcar y etanol. Este enfoque puede conducir a un importante ahorro en costes de energía e inversiones. La alta temperatura también disminuye el riesgo de contaminación durante la hidrólisis. La presente invención tiene como objetivo satisfacer al menos parte de estas necesidades.
Breve descripción de la invención
Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que las enzimas celulolíticas, y especialmente celobiohidrolasas obtenibles a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum son particularmente útiles en la hidrólisis de material celulósico. Además de celobiohidrolasas estos hongos también tienen endoglucanasas, beta-glucosidasas y xilanasas que son muy adecuadas para degradar material celulósico. Las enzimas son cinéticamente muy eficaces en un amplio intervalo de temperaturas, y aunque tienen una alta actividad a altas temperaturas, también son muy eficientes a temperaturas de hidrólisis convencionales. Esto las hace muy adecuadas para procedimientos de hidrólisis de diversos sustratos celulósicos llevados a cabo tanto a temperaturas convencionales como a temperaturas elevadas.
La presente invención proporciona un método para el tratamiento de material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa y beta-glucosidasa, con lo que dicha celobiohidrolasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 6, o con un fragmento del mismo que tiene actividad celulolítica.
La invención proporciona adicionalmente una preparación enzimática que comprende celobiohidrolasa, endoglucanasa y beta-glucosidasa, en donde dicha celobiohidrolasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 6, o con un fragmento del mismo que tiene actividad celulolítica.
También se proporciona el uso de dicha preparación enzimática para degradar material celulósico, así como el uso de dicho método en un procedimiento para la preparación de etanol a partir de material celulósico.
La invención también se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y
b) un fragmento de a) que tiene actividad celulolítica.
Un objeto adicional de la invención es un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o una secuencia que codifica un polipéptido de la invención;
b) una cadena complementaria de a); y
c) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético con una cualquiera de las secuencias como se define en a) o b).
La invención también proporciona adicionalmente un vector, que comprende dicho polinucleótido en forma de una secuencia heteróloga, y una célula anfitriona que comprende dicho vector. La cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 16729 también se incluyen en la invención.
Otros objetos de la invención son las preparaciones enzimáticas que comprenden al menos el nuevo polipéptido, y el uso de dicha preparación de polipéptido o enzimática en la industria de combustibles, tejidos, detergentes, pasta de papel y papel, alimentos, piensos o bebidas.
Adicionalmente se proporciona un método para preparar un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y
b) un fragmento de a) que tiene actividad celulolítica,
comprendiendo dicho método transformar una célula anfitriona con un vector que codifica dicho polipéptido, y cultivar dicha célula anfitriona en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido, y opcionalmente recuperar y purificar el polipéptido producido.
También se proporciona adicionalmente un método de tratamiento de material celulósico con un medio de cultivo gastado de al menos un microorganismo capaz de producir un polipéptido como se ha definido anteriormente, en donde el método comprende hacer reaccionar el material celulósico con el medio de cultivo gastado para obtener material celulósico hidrolizado.
Las realizaciones específicas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Dependencias de la temperatura de las actividades celulasa y beta-glucosidasa en los sobrenadantes de las seis cepas fúngicas sometidas a ensayo. El tiempo de incubación en el análisis fue de 60 min a la temperatura dada, el análisis de pH fue de 5,0 (actividad MUL) o 4,8 (CMCasa o BGU). La actividad obtenida a 60°C se establece como la actividad relativa de 100%. A) Thermoascus aurantiacus ALKO4239, B) Thermoascus aurantiacus ALKO4242, C) Acremonium thermophilum ALKO4245, D) Talaromyces thermophilus ALKO4246, E) Chaetomium thermophilum ALKO4261, F) Chaetomium thermophilum ALKO4265.
Figura 2. Imagen esquemática de los casetes de expresión utilizados en la transformación de protoplastos de Trichoderma reesei para producir las proteínas recombinantes fúngicas. Los genes recombinantes estaban bajo el control del promotor de T. reesei cbh1 (cel7A) (prom cbh1) y la terminación de la transcripción se garantizó mediante el uso de una secuencia de terminación de T. reesei cbh1 (term cbh1). El gen amdS se incluyó como marcador de transformación.
Figura 3 . A) Óptimos de pH de las preparaciones de proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 determinados sobre 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) a 50°C, 10 min. Los resultados se proporcionan como media (± DT) de tres mediciones separadas. B) Estabilidad térmica de las preparaciones de proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 determinada sobre 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) al pH óptimo durante 60 min. Los resultados se expresan como media (± DT) de tres mediciones separadas. Ambas reacciones contenían BSA (100 µg/ml) como estabilizador.
Figura 4. Hidrólisis de celulosa cristalina (Avicel) por las celobiohidrolasas recombinantes purificadas a 45°C. Concentración de sustrato 1% (p/v), pH 5,0, concentración de enzima 1,4 µM. A) Celobiohidrolasas que albergan un CBD, B) celobiohidrolasas (núcleo) sin un CBD.
Figura 5. Hidrólisis de celulosa cristalina (Avicel) por las celobiohidrolasas recombinantes purificadas a 70°C. Concentración de sustrato 1% (p/v), pH 5,0, concentración de enzima 1,4 µM. A) Celobiohidrolasas que albergan un CBD, B) celobiohidrolasas (núcleo) sin un CBD.
Figura 6. A) La dependencia del pH de la actividad de EG_40/Cel45A, de tipo_EG_40/Cel45B de Acremonium y EG_28/Cel5A de Thermoascus producidas de forma heteróloga se determinó con sustrato CMC en una reacción de 10 min a 50°C. B) El óptimo de temperatura de EG_40/Cel45A, de tipo_EG_40/Cel45B de Acremonium y EG_28/Cel5A de Thermoascus se determinó a pH 5,5, 4,8, y 6,0, respectivamente. Se realizó la reacción que contenía CMC como sustrato durante 60 minutos, a excepción de EG_28/Cel5A durante 10 min. Se añadió BSA (100 µg/ml) como estabilizador.
Figura 7. A) La dependencia del pH de la actividad de BG_101/Cel3A de Acremonium, BG_76/Cel3A de Chaetomium, y BG_81/Cel3A de Thermoascus producidas de forma heteróloga se determinó con sustrato 4nitrofenil-β-D-glucopiranósido en una reacción de 10 min a 50°C. B) El óptimo de temperatura de βG_101/Cel3A de
Acremonium, βG_76/Cel3A de Chaetomium y βG_81/Cel3A de Thermoascus se determinó a pH 4,5, 5,5, y 4,5, respectivamente. Se realizó la reacción que contenía 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato durante 60 min, se añadió BSA (100 µg/ml) como estabilizador.
Figura 8. A) La dependencia del pH de la actividad xilanasa de XYN_30 /Xyn10A de Thermoascus producida de forma heteróloga se determinó con sustrato de xilano de abedul en una reacción de 10 min a 50°C. B) El óptimo de temperatura de XYN_30/Xyn10A se determinó a pH 5,3 en una reacción de 60 min, se añadió BSA (100 µg/ml) como estabilizador.
Figura 9. Hidrólisis de fibra de abeto sometida a explosión de vapor de agua lavada (10 mg/ml) con una mezcla de enzimas termófilas (MEZCLA 1) y enzimas de T. reesei a 55 y 60°C. La dosis de enzima se proporciona en en FPU/g de materia seca de substrato, FPU analizada a 50°C, pH 5. La hidrólisis se llevó a cabo durante 72 horas a pH 5, mezclando. Los resultados se expresan como media (± DT) de tres mediciones separadas.
Figura 10. Hidrólisis de rastrojo de maíz sometido a explosión de vapor de agua (10 mg/ml) con una mezcla de enzimas termófilas (MEZCLA 2) y enzimas de T. reesei a 45, 55 y 57,5°C. La dosis de enzima fue para la "MEZCLA 2" de 5 FPU/g de materia seca de sustrato y para las enzimas de T. reesei 5 FPU/g de materia seca Celluclast con un suplemento de 100 nkat/g de materia seca Novozym 188 (la actividad de papel de filtro se analizó a 50°C, pH 5). La hidrólisis se llevó a cabo durante 72 horas a pH 5, mezclando. Los resultados se expresan como media (± DT) de tres mediciones separadas. El sustrato contenía azúcares reductores solubles (aprox. 0,7 mg/ml). Este contenido de azúcar de fondo se restó de los azúcares reductores formados durante la hidrólisis.
Figura 11. Hidrólisis de rastrojo de maíz sometido a explosión de vapor de agua (10 mg/ml) con una mezcla de enzimas termófilas que contenían una nueva xilanasa termófila de Thermoascus aurantiacus (MEZCLA 3) y enzimas de T. reesei a 45, 55 y 60°C. La dosis de enzima fue para la "MEZCLA 3" 5 FPU/g de materia seca de sustrato y para las enzimas de T. reesei 5 FPU/g de materia seca Celluclast un suplemento de 100 nkat/g de materia seca Novozym 188 (la actividad de papel de filtro se analizó a 50°C, pH 5). La hidrólisis se llevó a cabo durante 72 horas a pH 5, mezclando. Los resultados se expresan como media (± DT) de tres mediciones separadas. El sustrato contenía azúcares reductores solubles (aprox. 0,7 mg/ml). Este contenido de azúcar de fondo se restó de los azúcares reductores formados durante la hidrólisis.
Figura 12. Hidrólisis de fibra de abeto sometida a explosión de vapor de agua (10 mg/ml) con una mezcla de enzimas termófilas que contenían una nueva xilanasa termófila XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus (MEZCLA 3) y enzimas de T. reesei a 45, 55 y 60°C. La dosis de enzima para la "MEZCLA 3" fue 5 FPU/g de materia seca de sustrato y para las enzimas de T. reesei 5 FPU/g de materia seca Celluclast con un suplemento de 100 nkat/g de materia seca Novozym 188 (la actividad de papel de filtro se analizó a 50°C, pH 5). La hidrólisis se llevó a cabo durante 72 horas a pH 5, mezclando. Los resultados se expresan como media (± DT) de tres mediciones separadas.
Figura 13. Efecto de la glucosa sobre la actividad de diferentes preparaciones de β-glucosidasa. El análisis normalizado utilizando p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato se llevó a cabo en presencia de glucosa en la mezcla de ensayo. La actividad se presenta como porcentaje de la actividad obtenida sin glucosa.
Figura 14. Actividades FPU de las mezclas de enzimas a temperaturas de 50°C a 70°C, presentadas como un porcentaje de la actividad bajo condiciones convencionales (50°C, 1 h).
Figura 15. Actividad celulasa relativa de dos cepas de T. reesei diferentes cultivadas en medios que contienen Nutriose sin tratar (N0) o Nutriose pretratada con BG_81/Cel3A (NBG81) como fuente de carbono.
Descripción detallada de la invención
La celulosa es el componente estructural principal de las plantas superiores. Proporciona a las células vegetales alta resistencia a la tracción ayudándolas a resistir la tensión mecánica y la presión osmótica. La celulosa es un β-1,4glucano compuesto por cadenas lineales de residuos de glucosa unidos por enlaces β-1,4-glucosídicos. La celobiosa es la unidad repetitiva más pequeña de la celulosa. En las paredes celulares la celulosa se empaqueta en láminas orientadas diversamente, que están embebidas en una matriz de hemicelulosa y lignina. La hemicelulosa es un grupo heterogéneo de polímeros de carbohidratos que contienen principalmente diferentes glucanos, xilanos y mananos. La hemicelulosa se compone de una cadena principal lineal con residuos unidos mediante enlaces β-1,4 sustituidos con cadenas laterales cortas que contienen usualmente acetilo, glucuronilo, arabinosilo y galactosilo. La hemicelulosa puede ser entrecruzada químicamente con la lignina. La lignina es un polímero entrecruzado complejo de unidades de p-hidroxifenilpropano diversamente sustituido que proporciona fuerza a la pared celular para resistir la tensión mecánica, y también protege la celulosa de la hidrólisis enzimática.
La lignocelulosa es una combinación de celulosa y hemicelulosa y polímeros de unidades de fenol propanol y lignina. Es físicamente dura, densa, e inaccesible y la sustancia bioquímica más abundante en la biosfera. Los materiales que contiene lignocelulosa son, por ejemplo: virutas de madera dura y blanda, pasta de madera, serrín y residuos forestales y de la industria de la madera; biomasa agrícola como paja de cereales, pasta de remolacha azucarera, rastrojo y mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, tallos, hojas, cáscaras, cascarillas, y similares; productos
de desecho como residuos sólidos urbanos, periódicos y papel de desecho de oficina, residuos de la molienda de p. ej. cereales; cultivos energéticos (por ejemplo, sauce, álamo, pasto varilla (Panicum virgatum) o alpiste arundináceo, y similares). Los ejemplos preferidos son el rastrojo de maíz, el pasto varilla, la paja de cereales, el bagazo de caña de azúcar y los materiales derivados de la madera.
"Material celulósico" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier material que comprende celulosa, hemicelulosa y/o lignocelulosa como componente significativo. "Material lignocelulósico" significa cualquier material que comprende lignocelulosa. Tales materiales son, por ejemplo materiales vegetales tales como madera incluyendo madera blanda y dura, cultivos herbáceos, residuos agrícolas, residuos de pasta de papel y papel, papel de desecho, desechos de la industria alimenticia y de piensos, etc. Son ejemplos específicos de materiales celulósicos fibras textiles tales como el algodón, fibras derivadas de algodón, lino, cáñamo, yute y fibras celulósicas elaboradas por el hombre como modal, viscosa, liocel.
El material celulósico es degradado en la naturaleza por algunos organismos diversos, incluyendo bacterias y hongos. La celulosa es degradada típicamente por diferentes celulasas que actúan sucesivamente o simultáneamente. La conversión biológica de celulosa en glucosa requiere por lo general tres tipos de enzimas hidrolíticas: (1) Endoglucanasas que cortan enlaces beta-1,4-glucosídicos internos; (2) Exocelobiohidrolasas que cortan el disacárido celobiosa del extremo de la cadena polimérica de celulosa; (3) Beta-1,4-glucosidasas que hidrolizan la celobiosa y otros celo-oligosacáridos cortos a glucosa. En otras palabras, los tres grupos principales de celulasas son celobiohidrolasas (CBH), endoglucanasas (EG) y beta-glucosidasas (BG).
La degradación de los sustratos que contienen celulosa más complejos requiere una amplia gama de diversas enzimas. Por ejemplo la lignocelulosa es degradada por hemicelulasas, como xilanasas y mananasas. La hemicelulasa es un enzima que hidroliza hemicelulosa.
Las "enzimas celulolíticas" son enzimas que tienen "actividad celulolítica", lo que significa que son capaces de hidrolizar sustratos celulósicos o derivados de los mismos a sacáridos más pequeños. Por lo tanto las enzimas celulolíticas incluyen tanto celulasas como hemicelulasas. Las celulasas utilizadas en la presente memoria incluyen celobiohidrolasa, endoglucanasa y beta-glucosidasa.
T. reesei tiene un sistema de celulasa bien conocido y eficaz, con dos CBH, dos principales y varias secundarias EG y BG. CBHI (Cel7A) de T. reesei corta el azúcar desde el extremo reductor de la cadena de celulosa, tiene un dominio de unión a celulosa C-terminal (CBD) y puede constituir hasta 60% de la proteína secretada total. CBHII (Cel6A) de T. reesei corta el azúcar desde el extremo no reductor de la cadena de celulosa, tiene un dominio de unión a celulosa N-terminal y puede constituir hasta 20% de la proteína total secretada. Las endoglucanasas EGI (Cel7B), y EGV (Cel45A) tienen un CBD en su extremo C, EGII (Cel5A) tiene un CBD N-terminal y EGIII (Cel12A) no tiene ningún dominio de unión a celulosa. CBHI, CBHII, EGI y EGII son las llamadas "celulasas principales" de Trichoderma que comprenden en conjunto 80-90% del total de proteínas secretadas. Es conocido por un experto en la técnica que una enzima puede ser activa sobre varios sustratos y las actividades enzimáticas se pueden medir utilizando diferentes sustratos, métodos y condiciones. La identificación de las diferentes actividades celulolíticas es comentada, por ejemplo, por van Tilbeurgh et al. 1988.
Además de un dominio catalítico/núcleo que expresa la actividad celulolítica, las enzimas celulolíticas pueden comprender uno o más dominios de unión a celulosa (CBD), también denominados dominios/módulos de unión a carbohidratos (CBD/CBM), que pueden estar situados en el extremo N o C del dominio catalítico. Los CBD tienen actividad de unión a carbohidratos y median la unión de la celulasa a la celulosa cristalina, pero tienen poco o ningún efecto sobre la actividad hidrolítica celulasa de la enzima sobre sustratos solubles. Estos dos dominios están conectados típicamente a través de una región conectora flexible y altamente glicosilada.
"Celobiohidrolasa" o "CBH" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a las enzimas que escinden la celulosa desde el extremo de la cadena de glucosa y producen principalmente celobiosa. También se denominan 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasas o celulosa 1,4-beta-celobiosidasas. Hidrolizan los enlaces 1,4-beta-Dglucosídicos de los extremos reductores o no reductores de un polímero que contiene dichos enlaces, tal como celulosa, con lo que se libera celobiosa. Se han aislado dos CBH diferentes de Trichoderma reesei, CBHI y CBHII. Tienen una estructura modular que consiste en un dominio catalítico conectado a un dominio de unión a celulosa (CBD). También hay celobiohidrolasas en la naturaleza que carecen de CBD.
"Endoglucanasa" o "EG" se refiere a enzimas que cortan enlaces glucosídicos internos de la cadena de celulosa. Se clasifican como EC 3.2.1.4. Son 1,4-beta-D-glucano 4-glucanohidrolasas y catalizan endohidrólisis de enlaces 1,4beta-D-glucosídicos en los polímeros de glucosa tales como la celulosa y sus derivados. Algunas endoglucanasas de origen natural tienen un dominio de unión a celulosa, mientras que otras no lo tienen. Algunas endoglucanasas también tienen actividad xilanasa (Bailey et al., 1993).
"Beta-glucosidasa" o "BG" o "βG" se refiere a enzimas que degradan pequeños oligosacáridos solubles incluyendo celobiosa a glucosa. Se clasifican como EC 3.2.1.21. Son beta-D-glucósido glucohidrolasas, que típicamente catalizan la hidrólisis de residuos beta-D-glucosa no reductores terminales. Estas enzimas reconocen oligosacáridos de glucosa. Los sustratos típicos son celobiosa y celotriosa. La celobiosa es un inhibidor de celobiohidrolasas, por lo
cual la degradación de celobiosa es importante para superar la inhibición por producto final de las celobiohidrolasas.
Las xilanasas son enzimas que son capaces de reconocer e hidrolizar hemicelulosa. Incluyen enzimas tanto exohidrolíticas como endohidrolíticas. Típicamente tienen actividad endo-1,4-beta-xilanasa (EC 3.2.1.8) o beta-Dxilosidasa (EC 3.2.1.37) que rompe la hemicelulosa a xilosa. "Xilanasa" o "Xyn" con respecto a la presente invención se refiere especialmente a una enzima clasificada como EC 3.2.1.8 que hidroliza polímeros de xilosa de sustrato lignocelulósico o xilano purificado.
Además de esto las celulasas se pueden clasificar en varias familias de glicosil hidrolasas de acuerdo con su secuencia primaria, apoyada por el análisis de la estructura tridimensional de algunos miembros de la familia (Henrissat 1991, Henrissat y Bairoch 1993, 1996). Algunas glicosil hidrolasas son enzimas multifuncionales que contienen dominios catalíticos que pertenecen a diferentes familias de glicosilhidrolasas. La familia 3 consta de betaglucosidasas (CE 3.2.1.21) tales como Ta BG_81, At BG_101 y Ct BG_76 descritas en la presente memoria. La familia 5 (anteriormente conocida como celA) consiste principalmente de endoglucanasas (EC 3.2.1.4) tales como Ta EG_28 descrita en la presente memoria. La familia 7 (anteriormente familia celC de celulasas) contiene endoglucanasas (EC 3.2.1.4) y celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) tales como Ct EG_54, Ta CBH, At CBH_A, At CBH_C y Ct CBH descritas en la presente memoria. La familia 10 (anteriormente celF) consiste principalmente en xilanasas (EC 3.2.1.8) tales como Ta XYN_30 y At XYN_60 descritas en la presente memoria. La familia 45 (anteriormente celK) contiene endoglucanasas (EC 3.2.1.4) tales como At EG_40 y de tipo_At EG_40 descritas en la presente memoria.
Las enzimas celulolíticas útiles para hidrolizar material celulósico se pueden obtener de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum. "Obtenibles a partir de" significa que pueden ser obtenidas de dicha especie, pero no excluye la posibilidad de obtenerlas de otras fuentes. En otras palabras pueden proceder de cualquier organismo, incluidas las plantas. Preferiblemente se originan a partir de microorganismos, por ejemplo bacterias u hongos. Las bacterias pueden ser, por ejemplo, de un género seleccionado entre Bacillus, Azospirillum y Streptomyces. Más preferiblemente, la enzima se origina a partir de hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras), por ejemplo de un género seleccionado del grupo que consiste en Thermoascus, Acremonium, Chaetomium, Achaetomium, Thielavia, Aspergillus, Botrytis, Chrysosporium, Collybia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melanocarpus, Myceliophthora, Myriococcum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes y Trichoderma.
Las enzimas descritas se pueden obtener de la cepa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 depositada como CBS 116239, la cepa ALKO4245 depositada como CBS 116240 actualmente clasificada como Acremonium thermophilium, o la cepa de Chaetomium thermophilum ALK04265 depositada como CBS 730.95.
Otras celobiohidrolasas descritas en la presente memoria comprenden preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 2, 4, u 8, o un fragmento enzimáticamente activo de los mismos.
Estas CBH tienen una constante de inhibición de celobiosa ventajosa en comparación con la de las CBH de Trichoderma reesei, y muestran mejores resultados de hidrólisis cuando se someten a ensayo diversos sustratos celulósicos. Las SEQ ID NO: 2 y 4 no comprenden un CBD. Se pueden obtener resultados de hidrólisis particularmente mejorados cuando un dominio de unión a celulosa (CBD) está unido a una CBH que no tiene CBD propio. El CBD se puede obtener por ejemplo a partir de una especie de Trichoderma o Chaetomium, y se ancla preferiblemente a la CBH través de un conector. La proteína de fusión resultante que contiene una región núcleo de CBH unida a un CBD a través de un conector puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 28 o 30. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 27 o 29 codifican tales proteínas de fusión.
La endoglucanasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o un fragmento enzimáticamente activo de los mismos. Estas endoglucanasas tienen buena termoestabilidad.
La beta-glucosidasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o un fragmento enzimáticamente activo de los mismos. Estas beta-glucosidasas tienen buena resistencia a la inhibición por glucosa, lo que es ventajoso para evitar la inhibición por producto final durante la hidrólisis enzimática de material celulósico. Las beta-glucosidasas también se pueden utilizar en la preparación de soforosa, un inductor de celulasa utilizado en el cultivo de T. reesei.
La xilanasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID 10 NO: 18 o 20, o un fragmento enzimáticamente activo de los mismos.
Mediante el término "identidad" se quiere significar en la presente memoria la identidad global entre dos secuencias de aminoácidos en comparación con la otra desde el primer aminoácido codificado por el gen correspondiente hasta el último aminoácido. La identidad de las secuencias completas se mide mediante el uso del programa de 15 alineamiento global de Needleman-Wunsch en el paquete de programa EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice et al., 2000), versión 3.0.0, con los siguientes parámetros: EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, Penalización por extensión 0,5. El algoritmo es descrito por Needleman y Wunsch (1970). El experto en la técnica es consciente del hecho de que los resultados que utilizan el algoritmo de Needleman-Wunsch solo son comparables cuando se alinean los dominios correspondientes de la secuencia. Por consiguiente no se puede
20 realizar la comparación p. ej. de secuencias de celulasas que incluyen CBD o secuencias señal con secuencias que carecen de esos elementos.
De acuerdo con una realización de la invención, se utiliza un polipéptido celulolítico que tiene al menos 95 o 99% de identidad con SEQ ID NO: 6, o un fragmento del mismo que tiene actividad celulolítica. Otros polipéptidos celulolíticos descritos tienen 80, 85, 90, 95 o 99% de identidad con SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24
25 o 26 o al menos con su fragmento enzimáticamente activo.
Mediante el término "fragmento enzimáticamente activo" se entiende cualquier fragmento de una secuencia definida que tiene actividad celulolítica. En otras palabras un fragmento enzimáticamente activo puede ser la porción de proteína madura de la secuencia definida, o puede ser solamente un fragmento de la porción de proteína madura, siempre que todavía tenga actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa o xilanasa.
Las enzimas celulolíticas son preferiblemente enzimas recombinantes, que pueden ser producidas de una manera conocida generalmente. Se aísla un fragmento de polinucleótido que comprende el gen de la enzima, el gen se inserta bajo un promotor fuerte en un vector de expresión, el vector se transfiere a células anfitrionas adecuadas y las células anfitrionas se cultivan en condiciones que provocan la producción de la enzima. Los métodos para la producción de proteínas por medio de tecnología recombinante en diferentes sistemas anfitriones son bien conocidos en la técnica (Sambrook et al., 1989; Co-en, 2001; Gellissen, 2005). Preferiblemente, las enzimas son producidas como enzimas extracelulares que son secretadas al medio de cultivo, del que se pueden recuperar y aislar fácilmente. El medio de cultivo gastado del anfitrión de producción se puede utilizar tal cual, o las células anfitrionas se pueden retirar del mismo, y/o se puede concentrar, filtrar o fraccionar. También se puede secar.
El polipéptido aislado en el presente contexto puede significar simplemente que las células y los restos celulares se han eliminado del medio de cultivo que contiene el polipéptido. Convenientemente, los polipéptidos se aíslan, por ejemplo, mediante la adición de polímeros aniónicos y/o catiónicos al medio de cultivo gastado para mejorar la precipitación de las células, los restos celulares y algunas enzimas que tienen actividades secundarias no deseadas. El medio se filtra a continuación, utilizando un agente de filtrado inorgánico y un filtro para eliminar los precipitantes formados. Después de esto el producto filtrado se procesa adicionalmente utilizando una membrana semi-permeable para eliminar el exceso de sales, azúcares y productos metabólicos.
El polinucleótido heterólogo descrito en la presente memoria comprende un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 16723, DSM 16728, DSM 16729, DSM 16727, DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724 , DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.
El anfitrión de producción puede ser cualquier organismo capaz de expresar la enzima celulolítica. Preferiblemente, el anfitrión es una célula microbiana, más preferiblemente un hongo. Lo más preferiblemente, el anfitrión es un hongo filamentoso. Preferiblemente, el anfitrión recombinante se modifica para expresar y secretar enzimas celulolíticas como actividad principal o una de sus actividades principales. Esto se puede realizar suprimiendo los principales genes homólogos secretados, p. ej., las cuatro principales celulasas de Trichoderma y dirigiendo genes heterólogos a un locus que se ha modificado para asegurar altos niveles de expresión y producción. Los anfitriónes preferidos para la producción de las enzimas celulolíticas son en particular cepas del género Trichoderma o Aspergillus.
Las enzimas necesarias para la hidrólisis del material celulósico se pueden añadir en una cantidad enzimáticamente eficaz ya sea simultáneamente, p. ej., en forma de una mezcla de enzimas, o sucesivamente, o como una parte de la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). Se puede utilizar cualquier combinación de celobiohidrolasas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6, o su fragmento activo, y celobiohidrolasas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 2, 4, u 8 o un fragmento enzimáticamente activo de los mismos junto con cualquier combinación de endoglucanasas y beta-glucosidasas. Si el material celulósico comprende hemicelulosa, se utilizan adicionalmente hemicelulasas, preferiblemente xilanasas para la degradación. Las endoglucanasas, beta-glucosidasas y xilanasas se pueden seleccionar entre las descritas en la presente memoria, pero no se limitan a las mismas. También pueden ser por ejemplo preparaciones enzimáticas asequibles comercialmente. Además de las celulasas y las hemicelulasas opcionales se pueden utilizar una o más enzimas, por ejemplo proteasas, amilasas, lacasas, lipasas, pectinasas, esterasas y/o peroxidasas. Se puede llevar a cabo otro tratamiento enzimático antes, durante o después del tratamiento con celulasa.
El término "preparación enzimática" denota una composición que comprende al menos una de las enzimas deseadas. La preparación puede contener las enzimas en forma al menos parcialmente purificada y aislada. Puede consistir incluso esencialmente en la enzima o enzimas deseadas. Alternativamente, la preparación puede ser un medio de cultivo gastado o producto filtrado que contiene una o más enzimas celulolíticas. Además de la actividad celulolítica, la preparación puede contener aditivos, tales como mediadores, estabilizantes, tampones, conservantes, tensioactivos y/o componentes del medio de cultivo. Los aditivos preferidos son tales que se utilizan comúnmente en preparaciones de enzimas destinadas a una aplicación concreta. La preparación enzimática puede estar en forma de líquido, polvo o granulado. Preferiblemente, la preparación enzimática es medio de cultivo gastado. "Medio de cultivo gastado" se refiere al medio de cultivo del anfitrión que comprende las enzimas producidas. Preferiblemente, las células anfitrionas se separan de dicho medio después de la producción.
De acuerdo con una realización de la invención, la preparación enzimática comprende una mezcla de CBH, EG y BG, opcionalmente junto con xilanasa y/u otras enzimas. La CBH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6 o un fragmento enzimáticamente activo del mismo. Otras CBH descritas tienen una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 2, 4, u 8 o un fragmento enzimáticamente activo de los mismos, y puede obtenerse a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, mientras que EG, BG y la xilanasa pueden tener cualquier origen, incluyendo a partir de dichos organismos. Otras enzimas que pueden estar presentes en la preparación son, por ejemplo proteasas, amilasas, lacasas, lipasas, pectinasas, esterasas y/o peroxidasas.
Se pueden utilizar diferentes mezclas de enzimas y combinaciones para adaptarse a diferentes condiciones del proceso. Por ejemplo, si el proceso de degradación se va a llevar a cabo a una temperatura alta, se eligen enzimas
termoestables. Una combinación de una CBH de la familia 7 con una endoglucanasa de la familia 45, opcionalmente combinadas con una BG de la familia 3 y/o una xilanasa de la familia 10 tuvo un excelente funcionamiento de hidrólisis tanto a 45°C, como a temperaturas elevadas.
Las enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei se utilizan convencionalmente a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 40-50°C en la hidrólisis, y de 30-40°C en SSF. Las CBH, EG, BG y Xyn obtenibles a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum son eficientes a estas temperaturas también, pero además la mayoría de las mismas también funcionan extremadamente bien a temperaturas entre 50°C y 75°C, o incluso hasta 80°C y 85°C, tal como entre 55°C y 70°C, por ejemplo, entre 60°C y 65°C. Para tiempos de incubación cortos las mezclas de enzimas son funcionales hasta incluso 85°C, para la hidrólisis completa se utilizan normalmente temperaturas más bajas.
El método para el tratamiento de material celulósico con CBH, EG, BG y Xyn es especialmente adecuado para la producción de azúcares fermentables a partir de material lignocelulósico. Los azúcares fermentables pueden ser fermentados a continuación por la levadura a etanol, y utilizados como combustible. También se pueden utilizar como productos intermedios o materias primas para la producción de diversos productos químicos o elementos esenciales para los procedimientos de la industria química, por ejemplo en la denominada biorrefinería. El material lignocelulósico puede ser pretratado antes de la hidrólisis enzimática para interrumpir la estructura de fibra de los sustratos celulósicos y hacer la fracción de celulosa más accesible a las enzimas celulolíticas. Los pretratamientos actuales incluyen procedimientos mecánicos, químicos o térmicos y combinaciones de los mismos. El material puede ser pretratado por ejemplo mediante explosión de vapor de agua o hidrólisis ácida.
Se encontraron varios nuevos polipéptidos celulolíticos en Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, y Chaetomium thermophilum. Los nuevos polipéptidos pueden comprender un fragmento que tiene actividad celulolítica y ser seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 66%, preferiblemente 70% o 75%, de identidad con SEQ ID NO: 4, 90% de identidad con SEQ ID NO: 6, 78% de identidad con SEQ ID NO: 12, 68%, preferiblemente 70% o 75%, de identidad con SEQ ID NO: 14, 72%, preferiblemente 75%, de identidad con SEQ ID NO: 16, 68%, preferiblemente 70% o 75%, de identidad con SEQ ID NO: 20, 74% de identidad con SEQ ID NO: 22 o 24, o 78% de identidad con SEQ ID NO:
26.
También se describen las variantes de los nuevos polipéptidos. Una "variante" puede ser un polipéptido que se produce naturalmente, p. ej., en forma de una variante alélica dentro de la misma cepa, especie o género, o que puede haber sido generado por mutagénesis. Puede comprender sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, pero todavía funcionar de una manera sustancialmente similar a las enzimas anteriormente definidas es decir, comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica.
Los polipéptidos celulolíticos se producen normalmente en la célula en forma de polipéptidos inmaduros que comprenden una secuencia señal que se escinde durante la secreción de la proteína. También se pueden procesar adicionalmente durante la secreción en el extremo N-terminal y/o C-terminal para proporcionar una proteína madura, enzimáticamente activa. Un polipéptido "que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica" significa por tanto que el polipéptido puede estar en forma inmadura o madura, preferiblemente está en forma madura, es decir, el procesamiento ha tenido lugar.
Los nuevos polipéptidos descritos pueden ser adicionalmente un "fragmento de los polipéptidos o variantes" mencionados anteriormente. El fragmento puede ser la forma madura de las proteínas mencionadas anteriormente,
o puede ser solo una parte activa enzimáticamente de la proteína madura. De acuerdo con una realización de la invención, el polipéptido tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6. Los otros polipéptidos pueden tener una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80, 85, 90, 95, o 99% con SEQ ID NO: 4, 12, 14, 16, 20, 22, 24 o 26, o un fragmento celulolíticamente activo de los mismos. También puede ser una variante del mismo, o un fragmento del mismo que tiene actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, xilanasa, o betaglucosidasa. El polipéptido puede consistir esencialmente en un fragmento celulolíticamente activo de una secuencia de SEQ ID NO: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 o 26.
Los nuevos polinucleótidos pueden comprender una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 o 25, o una secuencia que codifica un nuevo polipéptido como se ha definido anteriormente, incluyendo sus cadenas complementarias. El polinucleótido según se utiliza en la presente memoria se refiere tanto a ARN como a ADN, y puede ser monocatenario o bicatenario. El polinucleótido también puede ser un fragmento de dichos polinucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos, p. ej. al menos 25, 30 o 40 nucleótidos. Puede tener al menos 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. Adicionalmente, el polinucleótido puede ser degenerado como resultado del código genético para una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente. Esto significa que diferentes codones pueden codificar el mismo aminoácido.
El polinucleótido puede estar "comprendido en" SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 o 25, lo que significa que la secuencia tiene al menos parte de la secuencia mencionada. El polinucleótido puede comprender un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.
Las nuevas proteínas/polipéptidos se pueden preparar como se ha descrito anteriormente. Los nuevos polinucleótidos pueden insertarse en un vector, que es capaz de expresar el polipéptido codificado por la secuencia heteróloga, y el vector se pueden insertar en una célula anfitriona capaz de expresar dicho polipéptido. La célula anfitriona es preferiblemente del género Trichoderma o Aspergillus.
Un gen heterólogo que codifica los nuevos polipéptidos se ha introducido en un plásmido en una cepa de Escherichia coli que tiene el número acceso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.
Las nuevas enzimas pueden ser componentes de una preparación enzimática. La preparación enzimática puede comprender uno o más de los nuevos polipéptidos, y puede estar, p. ej., en forma de medio de cultivo gastado, polvo, gránulos o líquido. De acuerdo con una realización de la invención ésta comprende actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, y opcionalmente xilanasa y/u otras actividades enzimáticas. Puede comprender adicionalmente cualquier aditivo convencional.
Las nuevas enzimas se pueden aplicar en cualquier procedimiento que implique enzimas celulolíticas, tal como en la industria de los combustibles, tejidos, detergentes, pasta de papel y papel, alimentos, piensos o bebidas, y especialmente en la hidrólisis de material celulósico para la producción de biocombustible que comprende etanol. En la industria de la pasta de papel y el papel se pueden utilizar para modificar fibra celulósica, por ejemplo, en el tratamiento de pasta kraft, pasta mecánica, o papel reciclado.
La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. Escrutinio de cepas que expresan actividad celulolítica y su cultivo para la purificación
Se sometieron a ensayo aproximadamente 25 cepas de hongos de la colección de cultivos Roal Oy para determinar la actividad celulolítica incluyendo beta-glucosidasas. Después del escrutinio preliminar se seleccionaron seis cepas para estudios adicionales. Estas fueron Thermoascus aurantiacus ALK04239 y ALK04242, Acremonium thermophilum ALKO4245, Talaromyces thermophilus ALKO4246 y Chaetomium thermophilum ALKO4261 y ALKO4265.
Las cepas ALKO4239, ALKO4242 y ALKO4246 se cultivaron en matraces oscilantes a 42°C durante 7 días en el medio 3 x B, que contiene en g/litro: celulosa Solka Floc 18, bagazo de destilería 18, xilano de granza de avena 9, CaCO3 2 , harina de soja 4,5, (NH4)HPO4 4,5, salvado de trigo 3,0, KH2PO4 1,5, MgSO4 · H2O 1,5, NaCl 0,5, KNO3 0,9, goma garrofin 9,0, disolución de elementos traza Núm. 1 0,5, disolución de oligoelementos Núm. 2 0,5 y Struktol (Stow, OH, USA) antiespumante 0,5 ml; el pH se ajustó a 6,5. La disolución de elementos traza Núm. 1 tiene en g/litro: MnSO4 1,6, ZnSO4 · 7 H2O 3,45 y CoCl2 · 6H2O 2,0; La disolución de oligoelementos Núm. 2 tiene en g/litro: FeSO4 · 7 H2O 5,0 con dos gotas de H2SO4 concentrado.
La cepa ALKO4261 se cultivó en matraces oscilantes en el medio 1XB, que tiene un tercio de cada uno de los constituyentes del medio 3 x B (anterior), excepto que tiene mismas concentraciones de CaCO3, NaCl y los elementos traza. La cepa se cultivó a 45°C durante 7 días.
La cepa ALKO4265 se cultivó en matraces oscilantes en el siguiente medio, g/l: celulosa Solka Floc 40, Pharmamedia™ (Traders Protein, Memphis, TN, USA) 10, macerado de maíz en polvo 5, (NH4)2SO4 5 y KH2PO4 15; el pH se ajustó a 6,5. La cepa se cultivó a 45°C durante 7 días.
Después del cultivo, las células y otros sólidos se recogieron por centrifugación y el sobrenadante se recuperó. Para los cultivos en matraz oscilante, se añadieron inhibidores de proteasa PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y pepstatina A a 1 mM y 10 g/ml, respectivamente. Si no se utilizaron inmediatamente, las preparaciones se almacenaron en alícuotas a -20°C.
Para la estimación de la termoactividad de las enzimas, se realizaron análisis de las preparaciones de cultivo de los matraces oscilantes a 50°C, 60°C, 65°C, 70°C y 75°C durante 1 h, en presencia de 100 µg de albúmina de suero bovino (BSA)/ml como estabilizador. Se realizaron ensayos preliminares a 50°C y 65°C a dos valores de pH diferentes (4,8/5,0 o 6,0) con el fin de aclarar que pH era más apropiado para el análisis de termoactividad.
Todos los sobrenadantes del matraz oscilante se analizaron para determinar las siguientes actividades:
Actividad de tipo celobiohidrolasa I ('CBHI') y actividad de tipo endoglucanasa I ("EGI"):
Estas se midieron en tampón de acetato de Na 50 mM con MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido) 0,5 mM como sustrato. Se añadió glucosa (100 mM) para inhibir cualquier actividad beta-glucosidasa de interferencia. El 4metilumbeliferilo liberado se midió a 370 nm. Las actividades 'CBHI' y 'EGI'' se distinguieron midiendo la actividad en presencia y ausencia de celobiosa (5 mM). La actividad que no es inhibida por la celobiosa representa la actividad 'EGI' y la actividad MUL restante representa la actividad 'CBHI' (van Tilbeurgh et al, 1988). El análisis se realizó a pH 5,0 o 6,0 (véase más adelante).
Actividad endoglucanasa (CMCasa):
Ésta se analizó con carboximetilcelulosa (CMC) al 2% (p/v) como sustrato en tampón de citrato 50 mM esencialmente como describen Bailey y Nevalainen 1981; Haakana et al. 2004. Los azúcares reductores se midieron con el reactivo DNS. El análisis se realizó a pH 4,8 o 6,0 (véase más adelante).
Actividad beta-glucosidasa (BGU):
Ésta se analizó con 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (1 mM) en tampón de citrato 50 mM como describen Bailey y Nevalainen 1981. El 4-nitrofenol liberado se midió a 400 nm. El análisis se realizó a pH 4,8 o 6,0 (véase más adelante).
Las actividades relativas de las enzimas se presentan en Figura 1. Las actividades relativas se presentaron estableciendo la actividad a 60°C como 100% (Figura 1). Todas las cepas produjeron enzimas, que tenían alta actividad a altas temperaturas (65°C-75°C).
Para las purificaciones de proteínas. ALKO4242 también se cultivó en un biorreactor de 2 litros (Braun Biostat® B, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 40, harina de soja 10, NH4NO3 5, KH2PO4 5, MgSO4 · 7 H2O 0,5, CaCl2 · 2 H2O 0,05, disolución de elementos traza Núm. 1 0,5, disolución de elementos traza Núm. 2 0,5. La aireación fue de 1 vvm, control antiespumante con Struktol, la agitación de 200-800 rpm y la temperatura de 47°C. Se ejecutaron dos lotes, uno a pH 4,7 ± 0,2 (NH3/H2SO4) y el otro con pH inicial de pH 4,5. El tiempo de cultivo fue de 7 d. Después del cultivo las células y otros sólidos se eliminaron mediante centrifugación.
La cepa ALKO4245 se cultivó en un biorreactor de 2 litros (Braun Biostat® B, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 40, macerado de maíz en polvo 15, bagazo de destilería 5, xilano de granza de avena 3, goma garrofín 3, (NH4)2SO4 5 y KH2PO4 5. El intervalo de pH fue de 5,2 ± 0,2 (NH3/H2SO4), la aireación de 1 vvm, la agitación de 300-600 rpm, el control antiespumante con Struktol y la temperatura de 42°C. El tiempo de cultivo fue 4 d. Después del cultivo las células y otros sólidos se eliminaron mediante centrifugación.
Para la purificación de la enzima, ALKO4261 se cultivó en un biorreactor de 10 litros (Braun Biostat® ED, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 30, bagazo de destilería 10, xilano de granza de avena 5, CaCO3 2, harina de soja 10, salvado de trigo 3,0, (NH4)2SO4 5, KH2PO4 5, MgSO4 · 7 H2O 0,5, NaCl 0,5, KNO3 0,3, disolución de elementos traza Núm. 1 0,5 y disolución de elementros traza Núm. 2 0,5. El intervalo de pH fue de 5,2 ± 0,2 (NH3/H2SO4), la aireación de 1 vvm, la agitación de 200-600 rpm, el control antiespumante con Struktol y la temperatura de 42°C. El tiempo de cultivo fue de 5 d. Un segundo lote se cultivó en condiciones similares, excepto que se añadió Solka Floc a 40 g/l y bagazo gastado a 15 g/l. Los sobrenadantes se recuperaron por centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania). El último sobrenadante se concentró aproximadamente diez veces utilizando el sistema de ultrafiltración Pellicon Mini (NMWL del filtro de 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).
Para la purificación de la enzima, ALKO4265 también se cultivó en un biorreactor de 10 litros (Braun Biostat® ED, Braun, Melsungen, Alemania) en el mismo medio que antes, excepto que se añadió KH2PO4 a 2,5 g/l. El intervalo de pH fue de 5,3 ± 0,3 (NH3/H3PO4), la aireación de 0,6 vvm, la agitación de 500 rpm, el control antiespumante con Struktol y la temperatura de 43°C. El tiempo de cultivo fue de 7 d. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania). El último sobrenadante se concentró aproximadamente 20 veces utilizando el sistema de ultrafiltración Pellicon Mini (NMWL del filtro de 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).
Ejemplo 2. Purificación y caracterización de celobiohidrolasas de Acremonium thermophilum ALKO4245 y Chaetomium thermophilum ALKO4265
Se cultivaron Acremonium thermophilum ALKO4245 y Chaetomium thermophilum ALKO4265 como se describe en el Ejemplo 1. Las principales celobiohidrolasas se purificaron utilizando una columna de afinidad basada en paminobencil-1-tio-β-celobiósido, preparada como describen Tomme et al., 1988.
Los sobrenadantes del cultivo se tamponaron primero en tampón de acetato de sodio 50 mM de pH 5,0, que contenía δ-gluconolactona 1 mM y glucosa 0,1 M con el fin de retardar la hidrólisis del ligando en presencia de βglucosidasas. Las celobiohidrolasas se eluyeron con lactosa 0,1 M y finalmente se purificaron mediante cromatografía de filtración en gel utilizando columnas Superdex 200 HR 10/30 en el sistema ÄKTA (Amersham Pharmacia Biotech). El tampón utilizado en la filtración en gel fue fosfato de sodio 50 mM de pH 7,0, que contenía cloruro de sodio 0,15 M.
Las celobiohidrolasas purificadas se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se determinó que la masa molecular de ambas proteínas era aproximadamente 70 kDa evaluada sobre la base de los patrones de masa molecular (Kit de calibración de bajo peso molecular, Amersham Biosciences). Las celobiohidrolasas de Acremonium y Chaetomium purificadas fueron denominadas At Cel7A y Ct Cel7A, respectivamente, siguiendo el esquema en Henrissat et al. (1998) (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993).
La actividad específica de las preparaciones se determinó utilizando 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL), 4metilumbeliferil-β-D-celobiósido (Mug2) o 4-metilumbeliferil-β-D-celotriósido (mug3) como sustrato (van Tilbeurghet al., a 50°C durante 10 min 1988) en tampón de citrato de sodio 0,05 M de pH 5. Las actividades endoglucanasa y xilanasa se determinaron mediante procedimientos convencionales (de acuerdo con la IUPAC, 1987) utilizando carboximetil celulosa (CMC) y glucuronoxilano de abedul (Bailey et al., 1992) como sustratos. La actividad específica frente a Avicel se calculó sobre la base de los azúcares reductores formados en una reacción de 24 h a 50°C, pH 5,0, con sustrato al 1% y dosificación de enzima 0,25 µM. El contenido de proteína de las preparaciones enzimáticas purificadas se midió de acuerdo con Lowry et al., 1951. Para caracterizar los productos finales de la hidrólisis, los azúcares solubles liberados en un experimento de hidrólisis de 24 h, como se ha descrito anteriormente, se analizaron mediante HPLC (Dionex). La celobiohidrolasa I (CBHI/Cel7A) purificada de Trichoderma reesei se utilizó como referencia.
Las actividades específicas de las enzimas purificadas y la de CBHI/Cel7A de T. reesei se presentan en la Tabla 1. Las celobiohidrolasas At Cel7A y Ct Cel7A purificadas poseen actividades específicas mayores contra sustratos sintéticos pequeños en comparación con CBHI/Cel7A de T . reesei. La actividad específica contra Avicel fue claramente superior con las enzimas descritas en la presente memoria. Las bajas actividades de las preparaciones enzimáticas purificadas frente a xilano y CMC pueden ser debidas o bien a las propias propiedades de las proteínas,
o al menos parcialmente a las pequeñas cantidades restantes de enzimas contaminantes. El principal producto final de la hidrólisis de la celulosa de todas las enzimas purificadas fue la celobiosa que es típica de las celobiohidrolasas.
Tabla 1. Actividades específicas (nkat/mg) de las celobiohidrolasas purificadas y la enzima de referencia de T. reesei (50°C, pH 5,0, 24 h).
Sustrato
Cel7A de A. thermophilum ALK04245 Cel7A de C. thermophilum ALK04265 Cel7A de T. reesei
Xilano
11,3 6,7 1,3
CMC
26,2 5,5 1,0
MUG2
9,2 18,9 4,3
MUG3
1,3 1,5 0,9
MUL
21,5 54,0 21,9
Avicel
1,8 1,4 0,6
La estabilidad térmica de las celobiohidrolasas purificadas se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de BSA al 0,1% a pH 5,0 durante 60 minutos utilizando 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido como sustrato. CBH/Cel7A de C. thermophilum ALKO4265 y CBH/Cel7A de A. thermophilum ALKO4245 fueron estables hasta 65°y 60°C, respectivamente. La enzima de referencia de T. reesei (CBHI/Cel7A) conservó 100% de la actividad hasta 55°C.
Ejemplo 3. Purificación y caracterización de una endoglucanasa de Acremonium thermophilum ALKO4245
Se cultivó Acremonium thermophilum ALKO4245 como se describe en el Ejemplo 1. El sobrenadante del cultivo se incubó a 70°C durante 24 horas después de lo cual se concentró mediante ultrafiltración. La endoglucanasa pura se obtuvo mediante purificación sucesiva con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio catiónico seguida de filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato (Procedimiento de la IUPAC 1987). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo concentrado se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl FF equilibrada con tampón de fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. Las proteínas unidas se eluyeron con el gradiente lineal del tampón anterior a fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0. Las fracciones se recogieron y la actividad endoglucanasa se determinó como se ha descrito anteriormente. La actividad endoglucanasa se eluyó en una amplia área de conductividad de 120 a 15 mS/cm.
Las fracciones combinadas se aplicaron a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 8 mM, pH 4,5. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,25 M en el tampón de equilibrado. La proteína que contenía actividad endoglucanasa se eluyó en la zona de conductividad de 3-7 mS/cm. Se repitió la cromatografía de intercambio catiónico y el eluato de proteína se concentró mediante
liofilización.
La muestra disuelta se cargó en una columna de filtración en gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La fracción principal de la proteína eluyó de la columna con el volumen de retención de 13,3 ml. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 40 kDa. Se determinó que la actividad específica de la proteína purificada, denominada At EG_40, a 50°C era de 450 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando CMC como sustrato).
La estabilidad térmica de la endoglucanasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de BSA de 0,1 mg/ml a pH 5,0 durante 60 minutos utilizando carboximetilcelulosa como sustrato. EG_40/Cel45A de A. thermophilum fue estable hasta 80°C. Las enzimas de referencia EGI (Cel7B) y EGII (Cel5A)de
T. reesei conservaron 100% de la actividad hasta 60°C y 65°C, respectivamente.
Ejemplo 4. Purificación de una endoglucanasa de Chaetomium thermophilum ALKO4261
Se cultivó Chaetomium thermophilum ALKO4261 como se describe en el Ejemplo 1. La endoglucanasa pura se obtuvo mediante purificación sucesiva con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio catiónico seguida por filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando carboximetil celulosa (CMC) como sustrato (Procedimiento de IUPAC 1987).
Se añadió sulfato amónico al sobrenadante de cultivo para alcanzar a la misma conductividad que fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. La muestra se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. La elución se llevó a cabo con un gradiente lineal de fosfato de potasio de 20 a 0 mM, pH 6,0, seguido de fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0 y agua. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de Urea de 0 a 6 M. Las fracciones se recogieron y la actividad endoglucanasa se analizó como se ha descrito anteriormente. La proteína que contenía actividad endoglucanasa se eluyó al principio del gradiente de urea.
Las fracciones se combinaron, se equilibraron con Tris-HCl 16 mM, pH 7,5 (I = 1,4 mS/cm) mediante una columna 10DG (Bio-Rad) y se aplicaron a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M en el tampón de equilibrado. Las fracciones se recogieron y analizaron para determinar la actividad endoglucanasa como se ha descrito anteriormente. La proteína se eluyó en el intervalo de 10-20 mS/cm.
La muestra se equilibró con acetato de sodio 15 mM, pH 4,5 mediante una columna 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 20 mM de pH 4,5. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de acetato de sodio de 0 a 0,4 M, pH 4,5. La actividad endoglucanasa se eluyó en el intervalo de 1-10 mS/cm. La muestra recogida se liofilizó.
La muestra se disolvió en agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 6,0, que contenía NaCl 0,15 M. Las fracciones se recogieron y las que contenían actividad endoglucanasa se combinaron. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que la masa molecular sobre la base de patrones de masa molecular (patrones de SDS-PAGE preteñidos, Intervalo Amplio, Bio-Rad) era de 54 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada Ct EG_54 con PhastSystem (Pharmacia) era de aprox. 5,5.
Ejemplo 5. Purificación de una endoglucanasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALKO4242 como se describe en el Ejemplo 1. La endoglucanasa pura se obtuvo mediante purificación sucesiva con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio aniónico seguida de filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando carboximetil celulosa (CMC) como sustrato (Procedimiento de la IUPAC 1987). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se eluyeron con (NH4)2SO4 0,2 M (I = 39 mS/cm). Las fracciones que contenían actividad endoglucanasa se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
La muestra se desaló en las columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM, pH 7,0. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,4 M en el tampón de equilibrado. La proteína que contenía actividad endoglucanasa se eluyó en la zona de conductividad de 15-21 mS/cm. Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron como antes.
La muestra se aplicó a una columna de filtración en gel Sephacryl S-100 HR 26/60 equilibrada con tampón acetato de sodio 50 mM de pH 5,0, que contenía NaCl 0,05 M. La fracción de proteína que contenía actividad endoglucanasa se eluyó de la columna con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 16
kDa. Las fracciones recogidas se combinaron, se concentraron y se repitió la filtración en gel. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 28 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada Ta EG_28, en un gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) era de aproximadamente 3,5. Se determinó que la actividad específica de Ta EG_28 a 50°C era 4290 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando CMC como sustrato).
Ejemplo 6. Purificación y caracterización de una β-glucosidasa de Acremonium thermophilum ALKO4245
Se cultivó Acremonium thermophilum ALKO4245 como se describe en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación sucesiva con cromatografía de interacción hidrófoba e intercambio aniónico seguida de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal del tampón de equilibrado a fosfato potásico 5 mM en la zona de conductividad de 137-16 mS/cm. Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con fosfato de potasio 10 mM de pH 7,0. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal del tampón de equilibrado al mismo tampón que contenía NaCl 0,25 M en la zona de conductividad de 1,5-12 mS/cm. La cromatografía de intercambio aniónico se repitió como antes, excepto que se utilizó el tampón fosfato de potasio 4 mM de pH 7,2. Las proteínas se eluyeron en la zona de conductividad de 6-9 mS/cm. Las fracciones que contenían la actividad β-glucosidasa se recogieron, se combinaron y se concentraron.
El material activo de la cromatografía de intercambio aniónico se aplicó a una columna Sephacryl S-300 HR 26/60 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 6,5, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína con actividad βglucosidasa se eluyó con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 243 kDa. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 101 kDa. De determinó que el pl de la proteína purificada, denominada At βG_101, en un gel de IEF (PhastSystem, Pharmacia) estaba en la zona de 5,6 a 4,9. Se determinó que la actividad específica de At βG_101 a 50°C era de 1100 nkat/mg (utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato, Bailey y Linko, 1990).
La estabilidad térmica de la β-glucosidasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de BSA de 0,1 mg/ml a pH 5,0 durante 60 minutos utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato. A. thermophilum βG_101 era estable hasta 70°C. La enzima de referencia de Aspergillus (Novozym 188) conserva 100% de la actividad hasta 60°.
Ejemplo 7. Purificación de una β-glucosidasa de Chaetomium thermophilum ALKO4261
Se cultivó Chaetomium thermophilum ALKO4261 como se describe en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación sucesiva con cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio aniónico y catiónico seguido de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990).
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,8 M. La elución se llevó a cabo con un gradiente lineal del tampón de equilibrado de fosfato potásico 3 mM, pH 6,0, seguido de elución con agua y urea 6 M. Las primeras fracciones con actividad β-glucosidasa se eluyeron en el área de conductividad de 80-30 mS/cm. La segunda actividad β-glucosidasa se eluyó con urea 6 M. Las fracciones activas eluidas mediante urea se reunieron y se desalaron en columnas 10DG (BioRad) equilibradas con Tris-HCl 10 mM de pH 7,0.
Después de la desalación, la muestra se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM de pH 7,0. La proteína no se unió a la columna, pero se eluyó durante la alimentación de la muestra. Esta fracción de flujo continuo se desaló en las columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con acetato de Na 7 mM, pH 4,5.
La muestra de la cromatografía de intercambio aniónico se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP FF equilibrada con acetato de sodio 10 mM de pH 4,5. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de acetato de sodio de 10 mM a 400 mM, pH 4,5. Se recogieron las fracciones con actividad β-glucosidasa eluyendo en la zona de conductividad de 6,5 a 12 mS/cm, se desalaron en columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con acetato de sodio 7 mM, pH 4,5 y se liofilizaron.
La muestra liofilizada se diluyó hasta 100 µl de agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HF10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 4,5, que contenía NaCl 0,15 M. La actividad β-glucosidasa se eluyó a un volumen de retención de 13,64 ml. Las fracciones recogidas se combinaron, se liofilizaron y se disolvieron en agua. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se
evaluó que el peso molecular era de 76 kDa. La proteína se denominó Ct βG_76.
Ejemplo 8. Purificación y caracterización de una β-glucosidasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALK04242 como se describe en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación sucesiva con cromatografía de interacción hidrófoba, e intercambio aniónico y catiónico seguido de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de (NH4)2SO4 0,2 M a fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0. La actividad β-glucosidasa se eluyó durante el gradiente en la zona de conductividad de 28,0 a 1,1 mS/cm. Las fracciones se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 20 mM de pH 7,0. La enzima se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,2 M en el tampón de equilibrado y con elución retardada mediante Tris-HCl 20 mM, que contenía NaCl 0,4 M. La muestra que eluyó en la zona de conductividad de aprox. 10-30 mS/cm se concentró mediante ultrafiltración y se desaló mediante la columna 10DG (Bio-Rad).
La muestra se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 9 mM de pH 4,5. La enzima se eluyó con un gradiente lineal de NaAc de 10 mM a 400 mM y mediante elución retardada utilizando NaAc 400 mM de pH 4,5. Las proteínas con actividad β-glucosidasa se eluyeron ampliamente durante el gradiente lineal en la zona de conductividad de 5,0 a 11,3 mS/cm.
El material activo de la cromatografía de intercambio catiónico se aplicó a una columna Sephacryl S-300 HR 26/60 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína con actividad βglucosidasa se eluyó con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 294 kDa. Las fracciones recogidas se combinaron, se liofilizaron y se disolvieron en agua. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 81 kDa, lo que representa más probablemente la forma monomérica de la proteína. El isoelectroenfoque (IEF) se llevó a cabo utilizando un gel de pl 3-9. Después de la tinción con plata, se tiñó una amplia zona por encima de pl 5,85 además de una banda estrecha que correspondía a pl 4,55. Se determinó que la actividad específica de la proteína purificada, denominada Ta βG_81, a 50°C era de 600 nkat/mg utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990).
La estabilidad térmica de la β-glucosidasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de BSA de 0,1 mg/ml a pH 5,0 durante 60 minutos utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato. βG_81 de T. aurantiacus era estable hasta 75°C. La enzima de referencia de Aspergillus (Novozym 188) conserva 100% de la actividad hasta 60°C.
Ejemplo 9. Purificación de una xilanasa a partir de Acremonium thermophilum ALKO4245
Se cultivó Acremonium thermophilum ALKO4245 como se describe en el Ejemplo 1. El sobrenadante del cultivo se incubó a 70°C durante 24 horas después de lo cual, se concentró mediante ultrafiltración. La xilanasa pura se obtuvo mediante purificación sucesiva con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio catiónico seguida de filtración en gel. La actividad xilanasa se determinó utilizando xilano de abedul como sustrato (Procedimiento de la IUPAC 1987). La proteína se analizó mediante BioRad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo concentrado se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl FF equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. Las proteínas unidas se eluyeron con el gradiente lineal del tampón anterior a fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0. La fracción de proteína se eluyó en una amplia zona de conductividad de 120 a 15 mS/cm.
La muestra de la columna de interacción hidrófoba se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 8 mM, pH 4,5. La proteína no se unió a esta columna pero se eluyó en el flujo continuo durante la alimentación de la muestra. Este eluato se concentró mediante ultrafiltración. La cromatografía hidrófoba se repitió como se ha descrito anteriormente. Las proteínas no unidas se recogieron y se liofilizaron.
La muestra disuelta se cargó en la columna de filtración en gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. Se estimó que la proteína eluida de la columna con el volumen de retención de 11,2 ml era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. La masa molecular de la proteína purificada evaluada sobre la base de patrones de masa molecular (patrones de SDS-PAGE preteñidos, Amplio Intervalo, Bio-Rad) era de 60 kDa. Se determinó que la actividad específica de la proteína, denominada At XYN_60, a 50°C era de 1800 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato xilano de abedul). La actividad relativa aumentó aproximadamente 1,2 veces a 60°C y 1,65 veces a 70°C (10 min,
pH 5,0) en comparación con 50°C. Las actividades específicas contra MUG2 (4-metilumbeliferil-β-D-celobiósido), MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido) y MUG3 (4-metilumbeliferil-β-D-celotriósido) fueron 54, 33 y 78 nkat/mg (50°C pH 5,0 10 min), respectivamente. Esto está de acuerdo con el hecho de que las xilanasas de la familia 10 también muestran actividad contra los arilglucopiranósidos (Biely et al. 1997).
Ejemplo 10. Purificación de una xilanasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALK04242 como se describe en el Ejemplo 1. La xilanasa pura se obtuvo mediante purificación sucesiva con cromatografía de interacción hidrófoba, e intercambio aniónico y catiónico seguido de filtración en gel. La actividad xilanasa se determinó utilizando xilano de abedul como sustrato (Procedimiento de IUPAC 1987). La proteína se analizó mediante BioRad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se eluyeron con un protocolo de elución de dos etapas. La elución se llevó a cabo dejando caer la concentración de sal primero a (NH4)2SO4 0,2 M y después de eso se aplicó un gradiente lineal de fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,2 M a fosfato de potasio 5 mM de pH 6,0. La proteína se eluyó con (NH4)2SO4 0,2 M (I = 39 mS/cm).
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM, pH 7,0. La proteína no se unió a la columna de intercambio aniónico pero se eluyó en el flujo continuo. La conductividad de la muestra se ajustó para que correspondiera a la de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 mediante la adición de agua y el pH se ajustó a 4,5 durante la concentración mediante ultrafiltración.
La muestra se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 20 mM, pH 4,5. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal del tampón de equilibrado al mismo tampón que contenía NaCl 1 M. La enzima se eluyó en la zona de conductividad de 1-7 mS/cm. La muestra se liofilizó y después de eso se disolvió en agua.
La muestra liofilizada se disolvió en agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína se eluyó de la columna con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 26 kDa. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. La masa molecular de la proteína pura fue de 30 kDa según se evaluó sobre la base de patrones de masa molecular (patrones de SDS-PAGE preteñidos, Intervalo Amplio, Bio-Rad). Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada Ta XYN_30 con PhastSystem (Pharmacia) era de aprox. 6.8. Se determinó que la actividad específica de Ta XYN_30 a 50°C era de 4800 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato de xilano de abedul).
Ejemplo 11. Secuenciación de aminoácidos internos
Los péptidos internos se secuenciaron mediante ionización de electropulverización combinada con espectrometría de masas en tándem (ESI-MS/MS) utilizando el aparato Q-TOF1 (Micromass). La proteína se alquiló primero y se digirió a péptidos trípticos. Los péptidos generados se desalaron y se separaron parcialmente mediante nanocromatografía líquida (de fase inversa) antes de aplicar el aparato Q-TOF1. Las secuencias de péptidos internos para las celobiohidrolasas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se muestran en la Tabla 2. Los péptidos de CBH de Chaetomium se obtuvieron después de haber clonado el correspondiente gen cbh. Los péptidos determinados a partir de CBH de Acremonium no se utilizaron en la clonación del gen correspondiente.
Tabla 2. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de CBH (1_C - 4_C) de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y CBH (1_A - 4_A) de Acremonium thermophilum ALKO4245.
Péptido
Secuencia
Péptido 1_C
T P S T N D A N A G F G R
Péptido 2_C
V A F S N T D D F N R
Péptido 3_C
F S N T D D F N R K
Péptido 4_C
P G N S L/ I T Q E Y C D A Q/K K
Péptido 1_A
V T Q F I/L T G
Péptido
Secuencia
Péptido 2_A
M G D T S F Y G P G
Péptido 3_A
C D P D G C D F N
Péptido 4_A
S G N S L/I T T D F
I/L = la leucina y la isoleucina tienen la misma masa molecular y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS Q/K = la masa molecular de la glutamina y lisina difiere solo en 0,036 Da y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS
Las secuencias de péptidos internos de las endoglucanasas, β-glucosidasas y xilanasas purificadas de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242 se enumeran en la Tabla 3, la Tabla 4 y la Tabla 5.
5 Tabla 3. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de endoglucanasas EG_40 de Acremonium Thermophilum ALKO4245, EG_54 de Chaetomium thermophilum ALKO4261 y EG_28 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Proteína
Péptido Secuencia(a
At EG_40
Péptido 1 Q S C S S F P A P L K P G C Q W R
Péptido 2 Y A L T F N S G P V A G K
Péptido 3 V Q C P S E L T S R
Péptido 4 N Q P V F S C S A D W Q R
Péptido 5 Y W D C C K P S C G W P G K
Péptido 6 P T F T
Ct EG_54
Péptido 1 E P E P E V T Y Y V
Péptido 2 Y Y L L D Q T E Q Y
Péptido 3 R Y C A C M D L W E A N S R
Péptido 4 P G N T P E V H P Q/K
Péptido 5 S I/L A P H P C N Q/K
Péptido 6 Q Q Y E M F R
Péptido 7 A L N D D F C R
Péptido 8 W G N P P P R
Ta EG_28
Péptido 1 I/L T S A T Q W L R
Péptido 2 G C A I/L S A T C V S S T I/L G Q E R
Tabla 5. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de xilanasas XYN_60 de Acremonium thermophilum ALKO4245 y XYN_30 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Proteína
Péptido Secuencia
At XYN_60
Péptido 1 Y N D Y N L E Y N Q K
Péptido 2 F G Q V T P E N
Péptido 3 V D G D A T Y M S Y V N N K
Péptido 4 K P A W T S V S S V L A A K
Péptido 5 S Q G D I V P R A K
Ta XYN_30
Péptido 1 V Y F G V A T D Q N R
Péptido 2 N A A I I Q A D F G Q V T P E N S M K
Péptido 3 G H T L V W H S Q L P S W V S S I T D K
Péptido 4 N H I T T L M T R
Péptido 5 A W D V V N E A F N E D G S L R
Péptido 6 L Y I N D Y N L D S A S Y P K
Péptido 7 A S T T P L L F D G N F N P K P A Y N A I V Q D L Q Q
Péptido 8 Q T V F L N V I G E D Y I P I A F Q T A R
5 Ejemplo 12. Construcción de bibliotecas genómicas para Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum
La biblioteca genómica de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 se elaboraron para el vector Lambda DASH®II (Stratagene, USA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los ADN cromosómicos, aislados por el método de Raeder y Broda (1985), se digirieron parcialmente con Sau3A. Los 10 ADN digeridos se fraccionaron por tamaños y los fragmentos del tamaño elegido (≈ 5-23 kb) se desfosforilaron y se ligaron a los brazos del vector lambda digerido con BamHI. Las mezclas de ligación se empaquetaron utilizando extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene, USA). Los títulos de las bibliotecas genómicas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum fueron 3,6 x 106 pfu/ml y 3,7 x 105 pfu/ml y los de las bibliotecas amplificadas fueron 6,5 x 1010 pfu/ml y 4,2 x 108 pfu/ml,
15 respectivamente.
Se utilizó Lambda FIX® II/XhoI Partial Fill-In Vector Kit (Stratagene, USA) en la construcción de las bibliotecas genómicas para Thermoascus aurantiacus ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALKO4261 de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los ADN cromosómicos, aislados por el método de Raeder y Broda (1985), se digirieron parcialmente con Sau3A. Los ADN digeridos se fraccionan por tamaños y los fragmentos del tamaño seleccionado (≈
20 6-23 kb) se rellenaron y se ligaron a los brazos del vector Lambda Fix II digeridos con Xho l. Las mezclas de ligación se empaquetaron utilizando extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene, USA). Los títulos de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALKO4261 fueron 0,2 x 106 y 0,3 x 106 pfu/ml y los de las bibliotecas amplificadas fueron 1,8 x 109 y 3,8 x 109 pfu/ml, respectivamente.
25 Ejemplo 13. Clonación de los genes de celobiohidrolasa (cbh/ce/7) de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum
Se utilizaron métodos convencionales de biología molecular en el aislamiento y los tratamientos enzimáticos del ADN (plásmidos, fragmentos de ADN), en transformaciones en E. coli, etc. Los métodos básicos utilizados se describen en los manuales de biología molecular convencionales, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001).
Las sondas para el escrutinio de las bibliotecas genómicas construidas como se describe en el Ejemplo 12 se amplificaron mediante PCR utilizando los ADN genómicos de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 como moldes en las reacciones. Se diseñaron varios cebadores sometidos a ensayo en reacciones de PCR de acuerdo con la secuencia de nucleótidos publicada (documento WO 03/000941, Hong et al., 2003b). Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, 5 µM de cada cebador y 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y ≈ 0,5-1 µg de ADN genómico. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, recocido de 1 min a 62°C (± 8°C gradiente) para moldes de Thermoascus ALKO4242 y Chaetomium ALKO4265 o recocido de 1 min a 58°C (± 6°C gradiente) para el molde de Acremonium ALKO4245, 2 min de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 minutos.
Los productos de ADN de los tamaños esperados (calculados a partir de secuencias de cbh publicadas) se obtuvieron de todos los moldes genómicos utilizados. Los fragmentos de ADN de los tamaños esperados se aislaron de las reacciones de PCR más específicas y se clonaron al vector pCR® Blunt-TOPO® (Invitrogen, USA). Los insertos se caracterizaron por secuenciación y realizando hibridaciones mediante transferencia Southern de los ADN genómicos digeridos con varias enzimas de restricción. Los fragmentos de PCR, que fueron seleccionados para ser utilizados como sondas para la detección de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6. Cebadores utilizados en las reacciones de PCR y las sondas seleccionadas para el escrutinio de los genes cbh/cel7 de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum. Se muestran el molde de ADN genómico y el nombre del plásmido que contiene el fragmento de la sonda.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de todas estas sondas tenían homología con varias secuencias de CBH publicadas (programa BLAST, versión 2.2.9 en el NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990), de las glucósido hidrolasas de la familia 7 (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993).
Los insertos de los plásmidos enumerados en la Tabla 6 fueron marcados con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania), y las bibliotecas genómicas amplificadas (2 x 105 - 3 x 105 placas) se escrutaron con los fragmentos de la sonda marcada. La temperatura de hibridación para los filtros fue de 68°C y los filtros se lavaron 2 x 5 min a RT utilizando 2 x SSC - SDS al 0,1% seguido de 2 x 15 min a 68°C utilizando 0,1 x SSC
-
SDS al 0,1% con las sondas homólogas utilizadas. Se obtuvieron varias placas positivas de cada una de las hibridaciones. En el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Acremonium ALKO4245, algunas de las placas positivas hibridaron fuertemente con la sonda en cuestión, pero, además, hubo una cantidad de placas que hibridaron más débilmente con las sondas. Esto sugirió que podrían estar presentes otro u otros genes de celobiohidrolasa en el genoma, causando reacción cruzada. Se purificaron de cuatro a cinco placas con fuerte hibridación de los escrutinios de las bibliotecas genómicas de Thermoascus ALK04242 y Chaetomium ALKO4265. En el caso de Acremonium thermophilum ALKO4245, cuatro de las seis placas purificadas hibridaron débilmente con la sonda utilizada. Los ADN de los fagos se aislaron y se caracterizaron mediante hibridaciones de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción seleccionados que hibridaban con la sonda se subclonaron en el vector pBluescript II KS+ y se secuenciaron las regiones relevantes de los clones.
En total se clonaron cuatro genes cbh/cel7; uno de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, uno de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y dos de Acremonium thermophilum ALKO4245 (en la fase temprana del trabajo, éstos
tenían los códigos At_cbh_C y At_cbh_A, y a continuación se denominaron At cel7A y At cel7B, respectivamente). La Tabla 7 resume la información sobre las sondas utilizadas para la detección de los genes, los clones de fagos de los que se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contenían los genes completos con sus regiones promotora y terminadora, los nombres de plásmido, y los números de depósito DSM para las cepas de
E. coli que portan estos plásmidos.
Tabla 7. Sondas utilizadas para la clonación de los genes cbh/cel7, clon de fago y subclones seleccionados, número de plásmido y número del depósito de la cepa de E. coli correspondiente.
Gen
Sonda utilizada en el escrutinio Clon de fago Fragmento subclonado pBluescript II en Núm. de Plásmido Núm. de depósito de E. coli
Ta cel7A
pALK1633 F12 XbaI de 3,2 kb pALK1635 DSM 16723
Ct cel7A
pALK1632 F36 PvuI -HindIII de 2,3 kb pALK1642 DSM 16727
At cel7B
pALK1634 F6 EcoRI de 3,1 kb pALK1646 DSM 16728
At cel7A
pALK1634 F2 XhoI de 3,4 kb pALK1861 DSM 16729
La información relevante sobre los genes y las secuencias de proteínas deducidas (SEQ ID NO: 1-8) se resumen en 10 la Tabla 8 y la Tabla 9, respectivamente.
Las secuencias peptídicas de las proteínas CBH purificadas de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALK04245 (Tabla 2) se encontraron partir de las secuencias de aminoácidos deducidas de los clones que contenían los genes Ct cel7A y At cel7A. Por lo tanto, se puede concluir que se clonaron los genes que codifican las proteínas CBH/Cel7 purificadas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum.
15 Tabla 8. Compendio de los genes cbh/cel7 aislados de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245.
Gen Cbh
Longitud con intrones (pb) (a Región codificante (pb) (b Núm. de intrones Longitud de los intrones (pb) SEQ ID NO:
Ta cel7A
1439 1371 1 65 1
Ct cel7A
1663 1596 1 64 7
At cel7B
1722 1377 3 134, 122, 87 3
At cel7A
1853 1569 4 88, 53, 54, 86 5
(a Está incluido el codón de PARADA. (b No está incluido el codón de PARADA.
Tabla 9. Resumen de las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de los genes cbh/cel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK4265 y Acremonium thermophilum 20 ALKO4245. ss, secuencia señal.
Proteína CBH
Núm. de aa Longitud de ss NN/HMM(a CBD Cterminal (b PM pronosticado (Da, ss no incl.)(c pl pronosticado (ss no incl.) Supuestos sitios de N-glicosilación(d SEQ ID NO:
Ta Cel7A
457 17/17 NO 46873 4,44 2 2
Proteína CBH
Núm. de aa Longitud de ss NN/HMM(a CBD Cterminal (b PM pronosticado (Da, ss no incl.)(c pl pronosticado (ss no incl.) Supuestos sitios de N-glicosilación(d SEQ ID NO:
Ct Cel7A
532 18/18 SI, T497 a L532 54564 5,05 3 8
At Cel7B
459 21/21 NO 47073 4,83 2 4
At Cel7A
523 17/17 SI, Q488 a L523 53696 4,67 4 6
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al., 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov. (b Dominio de unión a celulosa (CBD), se indican los aminoácidos de la región CBD C-terminal (M1 (Met Núm. 1) incluida en la numeración) (c No se incluyó la secuencia señal pronosticada. La predicción se realizó utilizando la herramienta Compute pl/MW del servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003). (d Número de secuencias NXS/T.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de Cel7A de Thermoascus aurantiacus y de Cel7A de Acremonium thermophilum (núcleo, sin el CBD) fueron más homólogas entre sí (analizadas mediante alineamiento global de Needleman-Wunsch, EMBOSS 3.0.0 Needle, con Matriz EBLOSUM62, Penalización por Hueco 10,0 y Penalización
5 por extensión 0,5; Needleman y Wunsch, 1970). Además, la Cel7A de Acremonium thermophilum deducida tenía una identidad inferior a Cel7A de Chaetomium thermophilum deducida. Cel7B de Acremonium thermophilum era muy distinta de las secuencias de CBH/Cel7 descritas aquí.
La secuencia de Cel7A de Chaetomium deducida poseía las identidades más altas (analizada mediante alineamiento global de Needleman-Wunsch, EMBOSS Needle, véase más arriba) con polipéptidos de CBHI de Chaetomium 10 thermophilum, Scytalidium thermophilum y Thielavia australiensis descritos en el documento WO 03/000941. Del mismo modo, la secuencia de Cel7A de Thermoascus aurantiacus deducida era altamente idéntica a la de CBHI publicada de Thermoascus aurantiacus (documento WO 03/000941, Hong et al., 2003b). Cel7B de Acremonium thermophilum tenía identidades significativamente inferiores a las secuencias previamente publicadas, estando más estrechamente relacionado con el polipéptido CBHI de Oryza sativa. Los mayores homologías de la secuencia de
15 Cel7A de Acremonium thermophilum deducida fueron los polinucleótidos de CBHI de Exidia gladulosa y Acremonium thermophilum (documento WO 03/000941). El alineamiento indica que las secuencias clonadas de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALK04245 codifican las proteínas CBH que tenían alta homología con los polipéptidos de la familia 7 de glucósido hidrolasa, por lo tanto éstos fueron denominados Cel7A o Cel7B (Henrissat et al. 1998) .
20 La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes cbh/cel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 Thielavia entre sí, y adicionalmente con las secuencias encontradas a partir de las bases de datos, se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Secuencias de homología más alta con las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes cbh/cel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK04265 y Acremonium thermophilum
25 ALK04245. El alineamiento se realizó utilizando alineamiento global de Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, Penalización por hueco 10,0, Penalización por extensión 0,5). *Indica una secuencia de aminoácidos derivada de uno de los genes de celobiohidrolasa clonados en este trabajo. 'Núcleo' indica el alineamiento sin el CBD.
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
* Thermoascus aurantiacus Cel7A
100,0
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
Thermoascus aurantiacus, AY840982
99,6
Thermoascus aurantiacus, AX657575
99,1
Thermoascus aurantiacus, AF421954
97,8
Talaromyces emersonii, AY081766
79,5
Chaetomidium pingtungium, AX657623
76,4
Trichophaea saccata, AX657607
73,4
* Acremonium thermophilum Cel7A (núcleo)
70,6
Emericella nidulans, AF420020 (núcleo)
70,4
* Chaetomium thermophilum Cel7A (núcleo)
66,4
* Chaetomium thermophilum Cel7A
100,0
Chaetomium thermophilum, AY861347
91,9
Chaetomium thermophilum, AX657571
91,7
Scytalidium thermophilum, AX657627
74,7
Thielavia australiensis, AX657577
74,6
Acremonium thermophilum, AX657569
72,3
Exidia glandulosa, AX657613
68,0
* Acremonium thermophilum Cel7A
66,9
* Thermoascus aurantiacus Cel7A (núcleo)
66,4
Exidia glandulosa, AX657615
60,8
Chaetomium pingtungium, AX657623
60,7
* Acremonium thermophilum Cel7B (núcleo)
60,2
* Acremonium thermophilum Cel7B
100,0
Oryza sativa, AK108948
66,1
Exidia glandulosa, AX657615
65,0
Acremonium thermophilum, AX657569 (núcleo)
64,8
Thermoascus aurantiacus, AX657575
64,8
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
* Acremonium thermophilum Cel7A
64,6
* Thermoascus aurantiacus Cel7A
64,4
Trichophaea saccata, AX657607
63,6
* Chaetomium thermophilum Cel7A (núcleo)
60,2
* Acremonium thermophilum Cel7A
100,0
Exidia glandulosa, AX657613
77,9
Exidia glandulosa, AX657615
77,9
Acremonium thermophilum, AX657569
77,5
Thielavia australiensis, AX657577
71,0
* Thermoascus aurantiacus Cel7A (núcleo)
70,6
Scytalidium Thermophilum, AX657627
67,5
Chaetomium thermophilum, AX657571
67,5
Chaetomium pingtungium, AX657623
67,3
* Chaetomium thermophilum Cel7A
66,9
* Acremonium thermophilum Cel7B (núcleo)
64,6
Ejemplo 14. Producción de proteínas CBH/Cel7 recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus (Ta Cel7A), Chaetomium thermophilum (Ct Cel7A) y Acremonium thermophilum (At Cel7A, 5 At Cel7B; en la fase inicial del trabajo estas proteínas tenían los códigos temporales At CBH_C y CBH_A, respectivamente). Los plásmidos de expresión construidos se enumeran en la Tabla 11. Los genes cbh/cel7 recombinantes, incluyendo sus propias secuencias señal, se fusionaron exactamente al promotor cbh1 (cel7A) de T. reesei mediante PCR. La terminación de la transcripción fue asegurada por el terminador cel7A de T. reesei y se utilizó el gen marcador amdS de A. nidulans para la selección de los transformantes como describen Paloheimo et 10 al. (2003). Los casetes de expresión lineal (Fig. 2), se aislaron de las cadenas principales del vector después de la digestión con EcoRI y se transformaron en protoplastos de T. reesei A96 y A98 (ambas cepas tienen los genes que codifican las cuatro principales celulasas CBHl/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A suprimidos). Las transformaciones se realizaron como en Penttilä et al. (1987) con las modificaciones descritas por Karhunen et al. (1993), seleccionando con acetamida como única fuente de nitrógeno. Los transformantes se purificaron en placas
15 de selección a través de conidios individuales antes de esporularlos en PD.

Tabla 11. Casetes de expresión construidos para producir las proteínas CBH/Cel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 (Ta Cel7A), Chaetomium thermophilum ALK04265 (Ct Cel7A), y Acremonium thermophilum ALKO4245 (At Cel7A, At Cel7B) en Trichoderma reesei. La estructura general de las casetes de expresión fue la descrita en la Fig. 2. Los genes cbh/cel7 clonados se fusionaron exactamente al promotor cbh1/cel7A de T. reesei.
CBH/Cel7
Plásmido de expresión Tamaño de casete de expresión(a Terminador cel7A (b
Ta Cel7A
pALK1851 9,0 kb 245 bp (XbaI)
Ct Cel7A
pALK1857 9,2 kb 240 bp (HindIII)
At Cel7B
pALK1860 9,4 kb 361 bp (EcoRI)
At Cel7A
pALK1865 9,5 kb 427 bp (EcoRV)
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló de la cadena principal del vector utilizando la digestión con EcoRI. (b Número de los nucleótidos de la región del terminador cbh1/cel7A genómico después del codón de PARADA. El sitio de restricción en el extremo 3', utilizado en la escisión del fragmento de gen genómico, se incluye en el paréntesis.
La producción de CBH/Cel7 de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 días a 28°C en un medio inductor de celulasa basado en complejo de lactosa (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2PO4 al 5%. La actividad celobiohidrolasa se analizó utilizando sustrato de 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) de acuerdo con van Tilbeurgh et al., 1988. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron mediante el uso de transferencias Southern en las que se incluyeron varios productos digeridos genómicos y el casete de expresión respectivo se utilizó como sonda. La expresión heteróloga de las proteínas Ta Cel7A, Ct Cel7A, At Cel7A y At Cel7B se analizó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie subsiguiente. Los hallazgos de que no se pudieron detectar actividad celobiohidrolasa o producción de proteínas heterólogas en la SDS-PAGE para los transformantes At Cel7B que contenían el casete de expresión integrado, sugieren que At Cel7B se produce por debajo de los niveles de detección en Trichoderma utilizando el diseño experimental descrito.
Las preparaciones de enzimas CBH/Cel7 recombinantes se caracterizaron en términos de óptimo de pH y estabilidad térmica. El óptimo de pH de las proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum, y Acremonium thermophilum se determinó en el tampón de Mcllvaine universal dentro de un intervalo de pH de 3,0-8,0 utilizando 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) como sustrato (Fig 3 A). El óptimo de pH para las enzimas Ct Cel7A y At Cel7A está en 5,5, por encima del cual la actividad empieza a disminuir gradualmente. El pH óptimo de la Ta Cel7A bruta recombinante está en 5,0 (Fig 3 A). La estabilidad térmica de las enzimas Cel7 recombinantes se determinó midiendo la actividad MUL en tampón universal de Mcllvaine al pH óptimo con el tiempo de reacción de 1 h. Como se muestra a partir de los resultados Ta Cel7A y Ct Cel7A conservaron más de 60% de sus actividades a 70°C, mientras que Cel7A demostró ser claramente menos estable a las temperaturas más altas (≥65°C) (Figura 3 B).
Los transformantes CBH/Cel7 seleccionados se cultivaron en biorreactores de laboratorio a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con el control de pH 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtener material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania).
Ejemplo 15. Producción de las proteínas de fusión Cel7A+CBD de Thermoascus aurantiacus recombinantes en T. reesei
Cel7A de Thermoascus aurantiacus (AF478686, Hong et al., 2003b; SEQ ID. NO: 1) se fusionó al conector y al CBD de CBHI/Cel7A de Trichoderma reesei (AR088330, Srisodsuk et al. 1993) (= Tr CBD), seguido de la producción de la proteína de fusión (SEQ ID NO: 28 que correspondía a SEQ ID NO: 27 de ácido nucleico) en T. reesei como se describe en FI20055205/US 11/119.526; presentada el 29 de Abril de 2005. Además, Cel7A de Thermoascus aurantiacus se fusionó al conector y al CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum (SEQ ID NO.: 7) (Ct CBD). Para ello, la secuencia codificante del conector y el CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum se sintetizaron mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:
5'-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTCGACCGTCCCTGGCCTTGAC-3' (secuencia directa)
y
5'-TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTCCAGCAAATCAGGGAACTG-3' (secuencia inversa)
La mezcla de reacción de PCR contenía tampón de reacción EXT 1x DyNAzyme™ (Finnzymes, Finlandia), Mg2+ 15 mM, dNTP 0,2 mM, 2 mM de cada cebador, 0,6 unidades de DyNAzyme™ ADN polimerasa EXT (Finnzymes, Finlandia), y aproximadamente el 75 ng/30 µl de ADN molde, que contenía el gen cel7A completo de Chaetomium thermophilum. Las condiciones para la reacción de PCR fueron las siguientes: 2 min de desnaturalización a 98°C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 98°C, 30 s de recocido a 68°C (gradiente de ±4°C), extensión de 30 segundos a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 minutos. El fragmento de ADN específico en la reacción de PCR se obtuvo en el intervalo de temperatura de hibridación de 64°C a 68,5°C. El fragmento CBD sintetizado Chaetomium thermophilum se ligó después del gen cel7A de Thermoascus aurantiacus dando como resultado un punto de unión de GPIGST entre los dominios. El fragmento amplificado por PCR en el plásmido se confirmó mediante secuenciación (SEQ ID NO: 29). La gen cel7A de fusión construido se fusionó exactamente al promotor cbh1 (cel7A) de T. reesei. La terminación de la transcripción fue asegurada por el terminador cel7A de T. reesei y el gen marcador amdS de A. nidulans se utilizó para la selección de los transformantes como describen Paloheimo et al. (2003).
El casete de expresión lineal se aisló de la cadena principal del vector después de la digestión con NotI y se transformó en protoplastos de T. reesei A96. Las transformaciones se realizaron como en Penttilä et al. (1987) con las modificaciones descritas por Karhunen et al. (1993), seleccionando con acetamida como única fuente de nitrógeno. Los transformantes se purificaron en placas de selección a través de conidios individuales antes de esporularlos en PD.
La producción de los transformantes de Cel7A + CBD de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO: 28 y 30) se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 días en un medio inductor de celulasa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con 5% de KH2PO4 a pH 5,5. La actividad celobiohidrolasa se analizó utilizando sustrato de 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) de acuerdo con van Tilbeurgh et al., 1988. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron mediante el uso de transferencias de Southern en las que se incluyeron diversos productos digeridos genómicos y el casete de expresión se utilizó como sonda. Los análisis de SDS-PAGE mostraron que las enzimas Cel7A+CBD de Thermoascus aurantiacus recombinantes se produjeron en forma de proteínas de fusión estables en T. reesei.
El transformante seleccionado que producía la proteína de fusión Ta Cel7A+Tr CBD (SEQ ID NO: 28) también se cultivó en un biorreactor de 2 litros a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con control de pH de 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtener material para los ensayos de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania).
Ejemplo 16. Comparación de las constantes de Michaelis-Menten y de inhibición de celobiosa de celobiohidrolasas recombinantes purificadas
Las constantes de Michaelis-Menten y de inhibición de celobiosa se determinaron a partir de las celobiohidrolasas producidas de forma heteróloga en T. reesei (Ejemplos 14 y 15). Las enzimas se purificaron como se describe en el Ejemplo 2. Se midieron las concentraciones de proteína de las enzimas purificadas por su absorción a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción molar teórico, que se calcularon a partir de las secuencias de aminoácidos (Gill y von Hippel, 1989).
Las constantes cinéticas (valores Km y Kcat) y la constante de inhibición de celobiosa (Ki) para Tr CBHI/Cel7A, Ta CBH/Cel7A, At CBH/Cel7A y Ct CBH/Cel7A, se midieron utilizando CNPLac (2-Cloro-4-nitrofenil-β-D-lactósido) como sustrato a temperatura ambiente (22°C) en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 5,7. Para la determinación de la constante de inhibición (Ki), se utilizaron ocho concentraciones de sustrato diferentes (31 a 4.000 µM) en presencia de un intervalo de cinco concentraciones de inhibidor (0-100 µM o 0-400 µM), que enmarcan el valor de Ki. Todos los experimentos se realizaron en placas de microtitulación y el volumen de reacción total fue de 200 µl. Las tasas iniciales se midieron en cada caso controlando continuamente la liberación del anión cloro-nitrofenolato (CNP, 2cloro-4-nitrofenolato) a través de mediciones a 405 nm utilizando un lector de placas de microtitulación Varioscan (ThermoLabsystems). Los resultados se calcularon a partir curva patrón de CNP (de 0 a 100 µM). Las concentraciones de enzimas utilizadas fueron: Tr CBHI/Cel7A 2,46 µM, Ta CBH/Cel7A 1,58 µM, Ct CBH/Cel7A 0,79 µM y At CBH/Cel7A 3 µM. Las constantes Km y kcat se calcularon a partir del ajuste de la ecuación de Michaelis-Menten utilizando el programa de Origin. Se utilizaron diagramas de Lineweaver-Burk, diagramas secundarios (pendiente LWB frente a [Glc2; celobiosa]) y diagramas de Hanes para distinguir entre la inhibición de tipo competitivo y de tipo mixto y para determinar las constantes de inhibición (Ki).
Los resultados de las mediciones cinéticas se muestran en la Tabla 12 y la Tabla 13. Como se puede observar, Ct CBH/Cel7A tiene claramente el número de recambio más alto (kcat) en CNPLac y también la constante de especificidad (kcat/Km) es mayor en comparación con CBHI/Cel7A de T . reesei. La celobiosa (Glc2) es un inhibidor competitivo para todas las celulasas medidas, y Tr CBHI/Cel7A (utilizada como control) tiene la inhibición más fuerte
(es decir, el valor más bajo de Ki) por celobiosa. At CBH/Cel7A tenía una constante de inhibición más de 7 veces mayor en comparación con la de Tr CBHI/Cel7A. Estos resultados indican que las tres nuevas celobiohidrolasas podría funcionar mejor en la hidrólisis de celulosa debido a la disminución de la inhibición por celobiosa en comparación con la celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei.

Tabla 12. Comparación de las constantes de inhibición por celobiosa de cuatro celobiohidrolasas GH de la familia 7, medidas en CNPLac en tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 5,7, a 22°C.
Ct Cel7A
39 competitiva
Ta Cel7A
107 competitiva
At Cel7A
141 competitiva
Tr Cel7A
19 competitiva
Tabla 13. Comparación de las constantes cinéticas de Michaelis-Menten de celobiohidrolasa Cel7A de Chaetomium thermophilum con CBHI/Cel7A de T. reesei, medidas en CNPLac en tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 5,7, a 22°C.
Enzima
kcat (min-1) Km (µM) kcat /Km (min-1 M-1)
Ct Cel7A
18,8 1960 9,5 103
Tr Cel7A
2,6 520 5,0 103
Ejemplo 17. Hidrólisis de celulosa cristalina (Avicel) por las celobiohidrolasas recombinantes
Los celobiohidrolasas recombinantes purificadas Ct Cel7A, Ta Cel7A, Ta Cel7A + Tr CBD, Ta Cel7A + Ct CBD, At Cel7A así como la versión núcleo de Ct Cel7A (véase más adelante) se sometieron a ensayo en cantidades equimolares en la hidrólisis de celulosa cristalina a dos temperaturas, 45°C y 70°C; Tr Cel7A de T. reesei purificada y su versión núcleo (véase más adelante) se utilizaron como comparación. Los análisis de hidrólisis de celulosa cristalina (Ph 101, Avicel; Fluka, Bucsh, Suiza) se realizaron en acetato de sodio 50 mM con escala de tubo de 1,5 ml, pH 5,0. Se sacudió Avicel a 45°C o a 70°C, con la disolución de enzima (1,4 µM), y el volumen final de la mezcla de reacción fue de 325 µl. La hidrólisis prosiguió hasta 24 horas tomando muestras en seis momentos diferentes y deteniendo la reacción mediante la adición de 163 µl de reactivo de parada que contenía 9 vol de etanol del 94% y 1 vol de glicina 1 M (pH 11). La disolución se filtró a través de una unidad de filtración de 0,22 µM Millex GV13 (Millipore, Billerica, MA, USA). La formación de azúcares reductores solubles en el sobrenadante se determinó por el método de la hidrazida de ácido para-hidroxibenzoico (PAHBAH) (Lever, 1972) utilizando una curva patrón de celobiosa (celobiosa 50 a 1600 µM). Se añadió una disolución de PAHBAH 0,1 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en NaOH 0,5 M (100 µl) recién elaborada a 150 µl de la muestra filtrada y se hirvió durante 10 minutos después de lo cual la disolución se enfrió en hielo. Se midió la absorbancia de las muestras a 405 nm.
Las versiones núcleo de las celobiohidrolasas que albergan un CBD en su forma nativa se obtuvieron como sigue: Ct Cel7A y Tr Cel7A se expusieron a digestión proteolítica para eliminar el dominio de unión a celulosa. La digestión con papaína (Papaya Latex, 14 U/mg, Sigma) de las celobiohidrolasas nativas se realizó a 37°C durante 24 h en una mezcla de reacción compuesta de L-cisteína 10 mM y EDTA 2 mM en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5,0) con la adición de papaína (se sometieron a ensayo dos concentraciones de papaína: una quinta o una décima parte la cantidad de papaína de la cantidad total de la Cel7A en la mezcla de reacción). La proteína núcleo resultante se purificó con columna de intercambio aniónico DEAE Sepharose FF (Pharmacia, Uppsala, Suecia) como se describió anteriormente. El producto se analizó en SDS-PAGE.
Los resultados de la hidrólisis a 45°C y 70°C se muestran en la Figura 4 y la Figura 5, respectivamente. Los resultados muestran claramente que todas las celobiohidrolasas muestran una hidrólisis más rápida y más completa a ambas temperaturas en comparación con la celobiohidrolasa Cel7A de T. reesei del estado de la técnica. A 70°C, las celobiohidrolasas termoestables de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALK04265 son superiores en comparación con Cel7A de T. reesei, también en el caso en el que el núcleo Cel7A de Thermoascus está conectado al CBD de Cel7A de T. reesei (Ta Cel7A + Tr CBD). Fue sorprendente que las
celobiohidrolasas aisladas y clonadas en este trabajo sean superiores, cuando albergan un CBD, en velocidad y formación de producto en la hidrólisis de celulosa cristalina también a la temperatura de hidrólisis convencional de 45°C en comparación con la celobiohidrolasa Cel7A (CBHI) de T. reesei del estado de la técnica a la misma concentración de enzima. Los resultados también están de acuerdo con las preparaciones enzimáticas (At Cel7A y Ct Cel7A), que fueron purificadas a partir de los anfitriones originales y sometidas a ensayo en la hidrólisis de Avicel (50°C, 24 h) (Ejemplo 2, Tabla 1).
Ejemplo 18. Clonación de genes de endoglucanasa de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALK04261, y Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se utilizaron métodos de biología molecular convencionales como se describe en el Ejemplo 13. La construcción de las bibliotecas genómicas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus se ha descrito en el Ejemplo 12.
Los péptidos derivados de endoglucanasas de Acremonium y Chaetomium purificadas comparten homología con varias endoglucanasas de la familia 45 de glicosil hidrolasa tales como la endoglucanasa de Melanocarpus albomyces Cel45A (AJ515703) y la endoglucanasa de Humicola insolens (A35275), respectivamente. Los péptidos derivados de la endoglucanasa de Thermoascus comparten casi 100% de identidad con la secuencia de endoglucanasa de Thermoascus aurantiacus EG1 (AF487830) publicada. Para amplificar una sonda para el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Acremonium y Chaetomium, se diseñaron cebadores degenerados basándose en las secuencias de péptidos. El orden de los péptidos en la secuencia de la proteína y la naturaleza efectora o anti-sentido correspondiente de los cebadores se dedujo de la comparación con las endoglucanasas homólogas publicadas. Las secuencias de los cebadores y los péptidos correspondientes se enumeran en la Tabla
14. Debido a casi 100% de identidad de los péptidos de Thermoascus con la secuencia publicada, el gen de endoglucanasa se amplificó mediante PCR directamente a partir del ADN genómico.

Tabla 14. Oligonucleótidos sintetizados y utilizados como cebadores de PCR para amplificar una sonda para el escrutinio de los genes cel45A (EG_40) de Acremonium thermophilum y cel7B (EG_54) de Chaetomium thermophilum de las bibliotecas genómicas correspondientes.
Proteína
Péptido Localización del cebador (a Secuencia del cebador (b
At EG_40
Péptido 5 1-6 TAYTGGGAYTGYTGYAARCC
WFQNADN(c RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA
Ct EG_54
Péptido 7 3-7 GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT (d
Péptido 2 5-9 GGAATTCGAYCARACNGARCARTA (e
(a Aminoácidos del péptido utilizado para el diseño de la secuencia del cebador (b N = A, C, G o T; R = A o G; Y = C o T (c El péptido no deriva de la proteína de Acremonium EG_40 purificada, pero se origina a partir de la secuencia de Cel45A de M. albomyces (AJ515703) homóloga a EG_40. (d Se añadió un sitio de restricción HindIII al extremo 5' del oligonucleótido (e Se añadió un sitio de restricción EcoRI al extremo 5' del oligonucleótido
Se amplificó la sonda específica del gen de Acremonium thermophilum cel45A para explorar la biblioteca genómica con los cebadores directo (TAYTGGGAYTGYTGYAARCC) e inverso (RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA) utilizando ADN genómico como molde. Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,1 mM, 0,5 µg de cada cebador, 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,5 µg de ADN genómico de Acremonium. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, recocido de 1 min a 50-60°C, extensión de 2 min a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 min. Para la amplificación de la sonda específica del gen cel7B de Chaetomium thermophilum (que codificaba Ct EG_54), se utilizaron un cebador directo (GGAATTCGAYCARACNGARCARTA) y un cebador inverso (GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT). Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, KCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, 250 pmol de cada cebador, 2 unidad de ADN polimerasa Dynazyme II (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 2 µg de ADN genómico de Chaetomium. Las
condiciones para la reacción de PCR fueron las descritas anteriormente, excepto que el recocido se realizó a 4550°C.
Se obtuvieron dos productos de PCR a partir de la reacción de PCR de Acremonium. Se aislaron fragmentos de ADN de aproximadamente 0,6 kb y 0,8 kb a partir de gel de agarosa y se clonaron en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA), dando como resultado los plásmidos pALK1710 y pALK1711, respectivamente. Los productos de ADN se caracterizaron mediante secuenciación y realizando hibridaciones de transferencia Southern con el ADN genómico de Acremonium digerido con varias enzimas de restricción. Los patrones de hibridación obtenidos con los dos fragmentos en condiciones de lavado rigurosas sugieren que se podrían escrutar dos supuestos genes de endoglucanasa a parir de la biblioteca genómica de Acremonium. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los dos productos de PCR tienen homología con varias secuencias de endoglucanasa de la familia 45 de glicosil hidrolasa publicadas (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).
Se obtuvo un producto de PCR del tamaño esperado (estimado a partir de la secuencia de endoglucanasa de Humicola insolens, A35275 homóloga) a partir de la reacción de PCR de Chaetomium. Este fragmento de ADN de aproximadamente 0,7 kb se clonó en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA), dando como resultado el plásmido pALK2005 y se analizó como se ha descrito anteriormente. La secuencia de aminoácidos deducida del producto de la PCR tiene homología con varias secuencias de celulasa publicadas de la familia de glicosil hidrolasa 7 (programa BLAST, versión 2.2.9 en NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).
El inserto de los plásmidos pALK1710, pALK1711 y pALK2005 se aisló por digestión con enzimas de restricción y se marcó con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania). Se escrutaron aproximadamente 1-2 x 105 placas de la biblioteca genómica de Acremonium o Chaetomium amplificada. La temperatura de hibridación fue 68°C y los filtros se lavaron 2 x 5 min a RT utilizando 2 x SSC - SDS al 0,1% seguido de 2 x 15 min a 68°C utilizando 0,1 x SSC - SDS al 0,1%. Se obtuvieron varias placas positivas, de las cuales de cinco a seis placas de fuerte hibridación se purificaron a partir de cada escrutinio. Los ADN de los fagos se aislaron y se analizaron mediante hibridación de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción que hibridaron con la sonda se subclonaron en el vector pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) y las porciones relevantes se secuenciaron. En todos los casos, el fragmento de fago subclonado contenía el gen completo de interés. La Tabla 15 resume la información de las sondas utilizadas para el escrutinio de los genes de endoglucanasa, los clones de fagos de los que se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contenían los genes completos con sus regiones promotora y terminadora, los nombres de los plásmidos que contenían el fragmento de fago subclonado, y los números de depósito en la colección de cultivos de Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH (DSM) para las cepas de E . coli portadoras de estos plásmidos.

Tabla 15. Sondas utilizadas para la clonación del gen de endoglucanasa, clon de fago y subclón seleccionado, nombre del plásmido y el número de depósito correspondiente de la cepa de E. coli.
Gen
Biblioteca genómica Sonda utilizada en el escrutinio Clon de fago Fragmento subclonado Plásmido Núm. de depósito de E. coli
At ce/45A
A. thermophilum ALK04245 pALK1710 P24 Smal de 5,5 kb pALK1908 DSM 17324
At cel45B
A. thermophilum ALK04245 pALK1711 P41 Xhol de 6,0 kb pALK1904 DSM 17323
Ct cel7B
C. thermophilum ALK04261 pALK2005 P55 BamHI de 5,1 kb pALK2010 DSM 17729
El gen cel5A de Thermoascus aurantiacus (que codificaba EG_28) (SEQ ID NO: 9) se amplificó directamente a partir del ADN genómico aislado por medio de reacción PCR. Los cebadores directo (ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTCGGCTCTCTCGTGCTC) e inverso (AACTGAGGCATAGAAACTGACGTCATATT) que se utilizaron para la amplificación fueron diseñados basándose en el gen eg.1 de T. aurantiacus (AF487830) publicado. Las mezclas de reacción de PCR contenían 1 x tampón Phusion HF, dNTP 0,3 mM, 0,5 µM de cada cebador, 2 unidades de ADN polimerasa Phusion TM (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,25 µg de ADN genómico de Thermoascus. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 25 ciclos de 30 s a 95°C, recocido de 30 s a 57-67°C, extensión de 2,5 min a 72°C y una extensión final a 72°C durante 5 min. El producto de 1,3 kb amplificado que contenía el gen exacto (de codón de INICIO a PARADA) se clonó como un fragmento SacII-PstI en el vector pBluescript II KS+. Se secuenciaron dos clones independientes y un clon se seleccionó y se denominó pALK1926. El número de depósito de la cepa de E. coli que contenía pALK1926 en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH es DSM 17326.
La información relevante de los genes y las secuencias de proteínas deducidas (SEQ ID NO: 9-16) se resumen en la
Tabla 16 y la Tabla 17, respectivamente. Las secuencias de péptido de las endoglucanasas EG_40 (gen Acel 45A) de Acremonium, EG_54 (gen Ct cel7B) de Chaetomium, y EG_28 (gen Ta Cel5A) de Thermoascus purificadas se encontraron en las correspondientes secuencias de aminoácidos deducidas de los genes clonados confirmando que se clonaron los genes apropiados.
Tabla 17. Resumen de las secuencias de endoglucanasa deducidas de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum, y Thermoascus aurantiacus. ss, secuencia señal.
Las secuencias de proteínas deducidas de las endoglucanasas EG_40 (At Cel45A) y de tipo_EG_40 (At Cel45B)de Acremonium, Chaetomium EG_54 (Ct Cel7B), y EG_28 de Thermoascus (Ta Cel5A) comparten homología con celulasas de la familia 45 de glicosil hidrolasas (Acremonium), familia 7 (Chaetomium), y familia 5 (Thermoascus), identificando así los genes aislados como miembros de estas familias de genes. Las homologías más cercanas de
las endoglucanasas EG_40/Cel45A y de tipo_EG_40/Cel45B de Acremonium son las endoglucanasas de Thielavia terrestris (CQ827970, 77,3% de identidad) y Myceliophthora thermophila (AR094305, 66,9% de identidad), respectivamente (Tabla 18). Las dos endoglucanasas aisladas de la familia 45 de Acremonium comparten solo una identidad de 53,7% entre sí. De estas enzimas solo EG_40/Cel45A contiene un dominio de unión a celulosa (CBD).
5 La homología más cercana para la secuencia de proteína pronosticada de la endoglucanasa EG_54/Cel7B de Chaetomium se encuentra en la secuencia de celulasa Cel7A (AJ515704) de Melanocarpus albomyces. La identidad entre estas dos secuencias de proteínas es de 70,6%.
La secuencia de proteína de la endoglucanasa de Thermoascus aurantiacus aislada es completamente idéntica a la de EGI de T. aurantiacus (AF487830, Tabla 18) publicada. La homología más cercana se encuentra en una
10 secuencia de β-glucanasa de Talaromyces emersonii (AX254752, identidad de 71,1%).

Tabla 18. Comparación de las endoglucanasas EG_40, de tipo_EG_40/Cel45B de Acremonium thermophilum, EG_54/Cel7B de Chaetomium thermophilum y EG_28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. El alineamiento se realizó utilizando el programa Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una endoglucanasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
Acremonium thermophilum EG_40
100,0
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
77,3
Melanocarpus albomyces Cel45A, AJ515703
75,3
Neurospora crassa, hipotética XM_324477
68,9
Humicola grisea var thermoidea, EGL3, AB003107
67,5
Humicola insolens EG5, A23635
67,3
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305
57,9
* Acremonium thermophilum de tipo_EG_40
53,7
Acremonium thermophilum de tipo_EG_40
100,0
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305
66,9
Magnaporthe grisea 70-15 hipotética, XM_363402
61,9
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
* Acremonium thermophilum EG_40
56,8
Melanocarpus albomyces Cel45A, AJ515703
53,7
52,8
Chaetomium thermophilum EG_54
100,0
Melanocarpus albomyces Cel7A, AJ515704
70,6
Humicola grisea var thermoidea EGI, D63516
68,8
Humicola insolens EGI, AR012244
67,7
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
Myceliophthora thermophila EGI, AR071934
61,7
Fusarium oxysporum var lycopercisi EGI, AF29210
53,5
Fusarium oxysporum EGI, AR012243
52,6
Thermoascus aurantiacus EG_28
100,0
Thermoascus aurantiacus EG, AX812161
100,0
Thermoascus aurantiacus EGI, AY055121
99,4
Talaromyces emersonii β-glucanasa, AX254752
71,1
Talaromyces emersonii EG, AF440003
70,4
Aspergillus niger EG, A69663
70,1
Aspergillus niger EG, A62441
69,9
Aspergillus niger EG, AF331518
69,6
Aspergillus aculeatus EGV, AF054512
68,5
Ejemplo 19. Producción de endoglucanasas recombinantes en Trichoderma reesei
Los plásmidos de expresión se construyeron para la producción de las proteínas EG_40/Cel45A, de tipo_EG_40/Cel45B de Acremonium, y EG_28/Cel5A de Thermoascus recombinantes como se describe en el
5 Ejemplo 14. Los casetes de expresión lineales (Tabla 19) se aislaron a partir de la cadena principal del vector mediante digestión con enzimas de restricción, se transformaron en T. reesei A96 y los transformantes se purificaron como se describe en el Ejemplo 14.
10 reesei. La estructura esquemática de los casetes de expresión se describe en la Figura 2.

Tabla 19. Casetes de expresión construidos para la producción de las endoglucanasas EG_40/Cel45A, de tipo_EG_40/Cel45B de Acremonium thermophilum, y EG_28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus en Trichoderma
Endoglucanasa
Plásmido de expresión Tamaño de casete de expresión(a Terminador heterólogo (b
At EG_40
pALK1920 NotI de 10,9 kb 156 pb (HindIII)
de tipo_At EG_40
pALK1921 EcoRI de 8,6 kb 282 pb (SspI)
Ta EG_28
pALK1930 NotI de 8,6 kb ninguno
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló a partir de la cadena principal del vector mediante digestión con EcoRI o Notl. (b Se indica el número de nucleótidos después del codón de PARADA del gen clonado que se incluyen en el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se utilizó en la construcción del casete de expresión se indica entre paréntesis.
La producción de endoglucanasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron como en el Ejemplo 14 y la actividad enzimática de la proteína recombinante se midió a partir del sobrenadante de cultivo como la liberación de azúcares
reductores de la carboximetilcelulosa (2% (p/v) CMC) a 50°C en tampón de citrato 50 mM pH 4,8 esencialmente como describen Bailey y Nevalainen 1981; Haakana et al. 2004. La producción de las proteínas recombinantes también se detectó a partir de sobrenadantes de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se produjeron anticuerpos policlonales específicos de EG_40 de Acremonium en conejos (Universidad de Helsinki, Finlandia). La expresión de EG_40 se verificó mediante análisis de transferencia Western con anticuerpos anti_EG_40 utilizando el sistema ProtoBlot Western blot AP (Promega). Los genotipos de los transformantes seleccionados se analizaron mediante transferencia Southern utilizando el casete de expresión como una sonda.
El pH óptimo de las endoglucanasas producidas de forma heteróloga se determinó en el tampón de Mcllvaine universal dentro de un intervalo de pH de 4,0-8,0 utilizando carboximetilcelulosa como sustrato. Como se muestra en la Figura 6A el intervalo de pH más amplio (4,5-6,0) es el de la proteína EG_40/Cel45A de Acremonium, siendo el óptimo a pH 5,5. Los óptimos de pH para las otras endoglucanasas producidas de forma heteróloga son pH 5,0-5,5 y 6,0 para la de tipo_EG_40/Cel45B de Acremonium y EG_28/Cel5A de Thermoascus, respectivamente. La temperatura óptima para la actividad enzimática de estas endoglucanasas se determinó en el intervalo de temperatura de 50-85°C como se describió anteriormente. Se determinó que la mayor actividad de las enzimas era a 75°C, 60°C y 75°C para EG_40/Cel45A, de tipo_EG_40/Cel45B de Acremonium, y EG_28/Cel5A de Thermoascus, respectivamente (Figura 6B).
Los transformantes seleccionados se cultivaron, como se describe en el Ejemplo 14, en un biorreactor de 2 litros durante cuatro días (28°C, pH 4,2) para obtener material para los ensayos de aplicación.
Ejemplo 20. Clonación de genes de beta-glucosidasas de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se utilizaron métodos convencionales de biología molecular como se describe en el Ejemplo 13. La construcción de las bibliotecas genómicas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus se ha descrito en el Ejemplo 12.
Los péptidos derivados de las β-glucosidasas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus purificadas compartían homología con varias β-glucosidasas de la familia 3 de glicosil hidrolasas tales como las β-glucosidasas de Acremonium cellulolyticus (BD168028), Trichoderma viride (AY368687), y Talaromyces emersonii (AY072918), respectivamente. Para amplificar una sonda para el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Acremonium, Chaetomium, o Thermoascus, se diseñaron cebadores degenerados basándose en las secuencias de péptidos. El orden de los péptidos en la secuencia de la proteína y la naturaleza efectora o anti-sentido correspondiente de los cebadores se dedujo a partir de la comparación con los β-glucosidasas homólogas publicadas. Las secuencias de los cebadores y los péptidos correspondientes se enumeran en la Tabla 20.

Tabla 20. Oligonucleótidos sintetizados y utilizados como cebadores de PCR para amplificar una sonda para el escrutinio de los genes cel3A (βG_101) de Acremonium thermophilum, cel3A (βG_76) de Chaetomium thermophilum, y cel3A (βG_81) de Thermoascus aurantiacus a partir de las bibliotecas genómicas correspondientes.
Proteína
Péptido Localización del cebador(a Secuencia del cebador(b
At βG_101
EKVNLT(c GARAARGTNAAYCTNAC
Péptido 4 6-11 YTTRCCRTTRTTSGGRGTRTA
Ct βG_76
Péptido 6 4-9 TNTGYCTNCARGAYGG
Péptido 1 3-8 TCRAARTGSCGRTARTCRATRAASAG
Ta βG_81
Péptido 3 1-5 AARGGYGTSGAYGTSCAR
Péptido 1 2-7 YTTRCCCCASGTRAASGG
(a Aminoácidos del péptido utilizado para el diseño de la secuencia del cebador (b Para reducir la degeneración, algunos codones se seleccionaron de acuerdo con la preferencia fúngica N = A, C, G, o T;. R = A o G; S = C o G; Y = C o T (c El péptido no deriva de la proteína βG_101 de Acremonium purificada, pero se origina a partir de la secuencia de β-glucosidasa de A. cellulolyticus (BD168028) homóloga a βG_101.
Las sondas para el escrutinio de las bibliotecas genómicas construidas fueron amplificadas con las combinaciones de cebadores enumeradas (Tabla 20) utilizando ADN genómico de Acremonium, Chaetomium, o Thermoascus como molde. Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,1-0,2 mM, 0,25 µg de cada cebador, 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,5 µg de ADN genómico. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, recocido de 1 min a 40°C (ADN de Acremonium como molde), a 50°C (ADN de Chaetomium como molde), o a 63°C (ADN de Thermoascus como molde), extensión de 2-3 min a 72°C y una extensión final a 72°C durante 5-10 min.
Los productos de PCR específicos de tamaño esperado (estimado a partir de las secuencias de β-glucosidasa homólogas BD168028, AY072918, y AY368687) se aislaron del gel de agarosa. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 1,8 kb (Acremonium), 1,5 kb (Chaetomium), y 1,52 kb (Thermoascus) se clonaron en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA), dando como resultado los plásmidos pALK1924, pALK1935 y pALK1713, respectivamente. Los productos de ADN se caracterizaron por secuenciación y realizando hibridaciones de transferencia Southern con el ADN genómico digerido con varias enzimas de restricción. Los patrones de hibridación en condiciones de lavado rigurosas sugieren que se podría aislar un supuesto gen de β-glucosidasa de la biblioteca genómica de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los tres productos de PCR tienen homología con varias secuencias de β-glucosidasa publicadas de la familia 3 de glicosil hidrolasa (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).
El inserto de los plásmidos pALK1713, pALK1924 y pALK1935 se aisló mediante digestión con enzimas de restricción y se marcó con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania). Se escrutaron aproximadamente 1-2 x 105 placas de la biblioteca genómica de Acremonium, Chaetomium, o Thermoascus amplificada como se describe en el Ejemplo 18. Se obtuvieron varias placas positivas, de las cuales se purificaron de cinco a seis placas de fuerte hibridación a partir de cada escrutinio. Los ADN de los fagos se aislaron y se analizaron mediante hibridación de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción que hibridaban con la sonda se subclonaron en el vector pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) y las porciones relevantes se secuenciaron. En todos los casos, el fragmento de fago subclonado contiene el gen completo de interés. La Tabla 21 resume la información de las sondas utilizadas para el escrutinio de los genes de β-glucosidasa, los clones de fagos a partir de los que se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contienen los genes completos con sus regiones promotora y terminadora, los nombres de los plásmidos que contienen el fragmento de fago subclonado, y los números de depósito en la Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH colección de cultivos (DSM) para las cepas de E. coli que portan estos plásmidos.

Tabla 21. Sondas utilizadas para la clonación del gen de la β-glucosidasa, clon de fago y subclón elegido, nombre del plásmido y número de depósito correspondiente de la cepa de E. coli.
Gen
Biblioteca genómica Sonda utilizada en el escrutinio Clon de fago Fragmento subclonado Plásmido Núm. de depósito de E. coli
At cel3A
A. thermophilumALKO4245 pALK1924 P44 HindIII de 6,0 kb pALK1925 DSM 17325
Ct cel3A
C. thermophilumALKO4261 pALK1935 P51 Xbal de 7,0 kb pALK2001 DSM 17667
Ta cel3A
T. aurantiacusALKO4242 pALK1713 P21 BamHI de 5,3 kb pALK1723 DSM 16725
La información relevante de los genes y las secuencias de proteína deducidas (SEQ ID NO: 21-26) se resumen en la Tabla 22 y la Tabla 23, respectivamente. Las secuencias peptídicas de las proteínas βG_101 (At Cel3A) de Acremonium, βG_76 (Ct Cel3A) de Chaetomium, y βG_81 (Ta Cel3A) de Thermoascus purificadas se encontraron en las secuencias de aminoácidos deducidas correspondientes de los genes clonados confirmando que se clonaron los genes correspondientes.

Tabla 22. Resumen de los genes β-glucosidasa aislados a partir de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum, y Thermoascus aurantiacus.
Gen de βglucosidasa
Longitud con intrones (pb) (a Región codificante pb)(b Núm. de intrones Longitud de los intrones (pb) SEQ ID NO:
At cel3A
2821 2583 3 92, 74, 69 23
Gen de βglucosidasa
Longitud con intrones (pb) (a Región codificante pb)(b Núm. de intrones Longitud de los intrones (pb) SEQ ID NO:
Ct cel3A
2257 2202 1 52 25
Ta cel3A
3084 2529 7 134, 67, 56, 64, 59, 110, 62 21
(a Está incluido el codón de PARADA. (b No está incluido el codón de PARADA.

Tabla 23. Resumen de las secuencias β-glucosidasa deducidas de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum, y Thermoascus aurantiacus. ss, secuencia señal.
Proteína βglucosidasa
Núm. de aa Longitud de ss NN/HMM(a CBD(b PM pronosticado (Da, sin incluir ss)(c pl pronosticado sin incluir ss) Supuestos sitios de N-glicosilación (d SEQ ID NO:
At βG_101
861 19/18 No 91434 5,46 8 24
Ct βG_76
734 20/20 No 76457 6,3 2 26
Ta βG_81
843 19/19 No 89924 4,95 8 22
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al., 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y el valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov. (b Presencia de un dominio de unión a celulosa en la proteína (c La secuencia señal pronosticada no está incluida. La predicción se realizó utilizando la herramienta Compute pl/MW del servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003). (d Los supuestos sitios de N-glicosilación NXS/T se pronosticaron utilizando el programa NetNGlyc 1.0 (Gupta et al., 2004).
5 Las secuencias de proteínas deducidas de las β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium, βG_76/Cel3A de Chaetomium, y βG_B1/Cel3A de Thermoascus comparten homología con las enzimas de la familia 3 de glicosil hidrolasas, identificando así que los genes aislados pertenecen a esta familia de genes. Las contrapartes más cercanas de las β-glucosidasas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus son las de Magnaporthe grisea (βglucosidasa, AY849670), Neurospora crassa (hipotética, XM_324308), y Talaromyces emersonii (β-glucosidasa,
10 AY072918), respectivamente (Tabla 24). Se encontró que la identidad de secuencia más alta (73,2%) fue la de βG_76/Cel3A de C. thermophilum con la proteína hipotética de N. crassa lo que indica que se clonaron nuevos genes de enzimas.

Tabla 24. Comparación de las β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG_76/Cel3A de Chaetomium thermophilum y βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. El alineamiento se realizó utilizando el programa Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una β-glucosidasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
* Acremonium thermophilum βG_101
100,0
Magnaporthe grisea β-glucosidasa, AY849670
73,1
Neurospora crassa hipotética, XM_330871
71,1
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
65,2
*Thermoascus aurantiacus βG_81
62,2
Aspergillus aculeatus β-glucosidasa, D64088
59,5
Talaromyces emersonii β-glucosidasa, AY072918
58,9
Aspergillus oryzae, AX616738
58,2
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
57,2
* Chaetomium thermophilum βG_76
40,9
Chaetomium thermophilum βG_76
100,0
Neurospora crassa, hipotética XM_324308
76,9
Magnaporthe grisea, hipotética XM_364573
70,2
Trichoderma viridae BGI, AY368687
65,8
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
41,2
* Acremonium thermophilum βG_101
40,9
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
40,0
* Thermoascus aurantiacus βG_81
39,9
* Thermoascus aurantiacus βG_81
100,0
Talaromyces emersonii β-glucosidasa, AY072918
73,2
Aspergillus oryzae, AX616738
69,5
Aspergillus aculeatus β-glucosidasa, D64088
68,0
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
65,7
* Acremonium thermophilum βG_101
62,2
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
57,9
* Chaetomium thermophilum βG_76
39,9
Ejemplo 21. Producción de beta-glucosidasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción recombinante de las proteínas βG_101/Cel3A de Acremonium, βG_76/Cel3A de Chaetomium, y βG_81/Cel3A de Thermoascus como se describe en el Ejemplo 14. Los casetes de expresión lineales (Tabla 25) se aislaron a partir de la cadena principal de vector mediante digestión con enzimas de restricción, se transformaron en A96 o A33 de T. reesei (ambas cepas tienen suprimidos los genes que codifican las cuatro principales celulasas CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A) y se purificaron los transformantes purificados como se describe en el Ejemplo 14.

Tabla 25. Casetes de expresión construidos para la producción de β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG_76/Cel3A de Chaetomium thermophilum y βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus en Trichoderma reesei. La estructura esquemática de los casetes de expresión se describe en la Figura 2.
β-glucosidasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
At βG_101
pALK1933 NotI de 10,5 kb 300 pb (HindIII)
Ct βG_76
pALK2004 EcoRI de 10,1 kb 528 pb (XbaI)
Ta βG_81
pALK1914 EcoRI de 10,9 kB 452 pb (ApoI)
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló a partir de la cadena principal del vector mediante digestión con EcoRI o NotI. (b Se indica el número de nucleótidos después del codón de PARADA del gen clonado que se incluye en el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se utilizó en la construcción del casete de expresión se indica entre paréntesis.
La producción de beta-glucosidasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron como en el Ejemplo 14 y se midió la actividad enzimática de la proteína recombinante a partir del sobrenadante de cultivo utilizando sustrato de 4-nitrofenil-β-Dglucopiranósido como describen Bailey y Nevalainen 1981. La producción de las proteínas recombinantes también se detectó a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Además, la expresión de βG_81 de Thermoascus se verificó mediante análisis de transferencia Western con anticuerpos antiβG_81 como se describe en el Ejemplo 19. Los genotipos de los transformantes seleccionados se analizaron mediante transferencia Southern utilizando el casete de expresión como sonda.
El óptimo de pH de las β-glucosidasas producidas de manera heteróloga se determinó en el tampón de Mcllvaine universal dentro de un intervalo de pH de 3,0-8,0 utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato. Los óptimos de pH para βG_101 de Acremonium, βG_76 de Chaetomium y βG_81 de Thermoascus son un pH de 4,5, 5,5 y 4,5, respectivamente (Figura 7A). La temperatura óptima para la actividad enzimática de estas β-glucosidasas se determinó en el intervalo de temperatura de 50-85°C como se describió anteriormente. Se determinó que la mayor actividad de las enzimas era a 70°C, 65°C y 75°C para βG_101/Cel3A de Acremonium, βG_76/Cel3A de Chaetomium y βG_81/Cel3A de Thermoascus, respectivamente (Figura 7B).
Los transformantes seleccionados se cultivaron, tal como se describe en el Ejemplo 14, en un biorreactor de 2 litros durante cuatro días (28°C, pH 4,2) para obtener material para los ensayos de aplicación.
Ejemplo 22. Clonación de los genes de xilanasa de Acremonium thermophilum ALK04245 y Thermoascus aurantiacus ALK04242
Se utilizaron métodos de biología molecular convencionales como se describe en el Ejemplo 13. La construcción de la biblioteca genómica de Acremonium se ha descrito en el Ejemplo 12.
Los péptidos derivados de la xilanasa de Acremonium purificada comparten homología con las xilanasas de la familia 10 de glicosil hidrolasas tales como XYNI (AB001030) de Humicola grisea. Todos los péptidos derivados de la xilanasa de Thermoascus fueron completamente idénticos a la secuencia de XynA (AJ132635) de Thermoascus aurantiacus publicada identificando así la proteína purificada como la misma enzima. Debido a esto el gen de xilanasa de Thermoascus se amplificó mediante PCR a partir del ADN genómico.
Para amplificar una sonda para el escrutinio del gen de xilanasa de Acremonium a partir de la biblioteca genómica, se diseñaron cebadores degenerados sobre la base de las secuencias de péptidos (Ejemplo 11, Tabla 5). El orden de los péptidos en la secuencia de la proteína y la naturaleza efectora o antisentido correspondiente de los cebadores se dedujo de la comparación con la secuencia XYNI (AB001030) de Humicola insolens homóloga. La secuencia del cebador efector (GAYGGYGAYGCSACYTAYATG) se basa en el péptido 3 (aminoácidos 2-8) y el cebador anti-sentido (YTTYTGRTCRTAYTCSAGRTTRTA) en el péptido 1 (aminoácidos 4-11).
Se obtuvo de la reacción un producto de PCR del tamaño esperado (estimado a partir de la secuencia XYNI AB001030 de Humicola insolens homóloga). Este fragmento de ADN de aproximadamente 0,7 kb se clonó en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA), dando como resultado el plásmido pALK1714, y se caracterizó mediante secuenciación. La secuencia de aminoácidos deducida del producto de la PCR tiene homología con varias secuencias de xilanasas publicadas de la familia 10 de glicosil hidrolasas (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).
El inserto del plásmido pALK1714 se aisló mediante digestión con enzimas de restricción y se marcó con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania). Se seleccionaron aproximadamente 1-2 x 105 placas de la biblioteca genómica de Acremonium amplificada como se describe en el Ejemplo 18. Se obtuvieron varias placas positivas, de las cuales se purificaron cinco placas de fuerte hibridación. Los ADN de los fagos se aislaron y se analizaron mediante hibridación de transferencia Southern. Un fragmento de restricción de XbaI de 3,0 kb que hibridaba con la sonda se subclonó en el vector pBluescript II KS+ (Stratagene, USA), dando como resultado el plásmido pALK1725. Las porciones relevantes de pALK1725 se secuenciaron y se encontró que contenían el gen xyn 10A completo de Acremonium thermophilum (SEQ ID NO: 19). El número de depósito de la cepa de E. coli que contiene pALK1725 en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH es DSM 16726.
El gen xyn 10A de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO: 17) se amplificó directamente a partir del ADN genómico aislado por reacción mediante PCR. Los cebadores directo (TTATACCGCGGGAAGCCATGGTTCGACCAACGATCCTAC) e inverso (TTATAGGATCCACCGGTCTATACTCACTGCTGCAGGTCCTG) que se utilizaron en la amplificación del gen se diseñaron sobre la base del gen XynA (AJ132635) de T. aurantiacus publicado. Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,3 mM, 1 µM de cada cebador, 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,5 µg de ADN genómico de Thermoascus. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, recocido de 1 min a 60-66°C, extensión de 3 min a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 min. El producto de 1,9 kb amplificado que contenía el gen exacto (del codón de INICIO al de PARADA) se clonó como un fragmento SacII-BamHI en el vector pBluescript II KS+. Se secuenciaron tres clones independientes y se seleccionó un clon y se denominó pALK1715. El número de depósito de la cepa de E. coli que contiene pALK1715 en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH es DSM 16724.
La información relevante de los genes y las secuencias de proteína deducidas (SEQ ID NO: 17-20) se resumen en la Tabla 26 y la Tabla 27, respectivamente. Las secuencias peptídicas de las proteínas XYN_60 de Acremonium y XYN_30 de Thermoascus purificadas se encontraron en las secuencias de aminoácidos deducidas correspondientes de los genes clonados (At xyn10A y Ta xyn10A , respectivamente) confirmando que se clonaron los genes correspondientes.

Tabla 26. Resumen de los genes de xilanasa aislados de Acremonium thermophilum y Thermoascus aurantiacus.
Gen de xilanasa
Longitud con intrones (pb) (a Región codificante (pb) (b Núm. de intrones Longitud de los intrones (pb) SEQ ID NO:
At xyn10A
1471 1248 2 135, 85 19
Ta xyn10A
1913 987 10 73, 74, 68, 103, 69, 65, 93, 66, 100, 212 17
(a Está incluido el codón de PARADA. (b No está incluido el codón de PARADA.

Tabla 27. Resumen de las secuencias deducidas de xilanasa de Acremonium thermophilum y Thermoascus aurantiacus. ss, secuencia señal.
Proteína xilanasa
Núm. de aa Longitud de ss NN/HMM(a CBD(b PM pronosticado (Da, sin incluir la)(c pl pronosticado (sin incluir la ss) Supuestos sitios de Nglicosilación (d SEQ ID NO:
At XYN_60
416 19/19 Si, W385 a L416 42533 6,32 1-2 20
Ta XYN_30
329 26(e No 32901 5,81 0 18
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al, 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov. (b Presencia de un dominio de unión a carbohidrato CBD, se indican los aminoácidos del CBD C-terminal (numeración de acuerdo con el polipéptido completo) (c No está incluida la secuencia señal pronosticada. La predicción se realizó utilizando la herramienta Compute pl/MW del servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003). (d Los supuestos sitios de N-glicosilación NXS/T se pronosticaron utilizando el programa NetNGlyc 1,0 (Gupta et al., 2004). (e Según Lo Leggio et al., 1999.
Las secuencias de proteínas deducidas de las xilanasas de Acremonium y Thermoascus comparten homología con
5 varias enzimas de la familia 10 de glicosil hidrolasas, identificando los genes correspondientes como miembros de la familia 10 de xilanasas. La contraparte más cercana para XYN_60/Xyn10A de Acremonium encontrado es XYLI (AB001030) de Humicola grisea que muestra 67,1% de identidad con XYN_60 (Tabla 28). La secuencia de proteína pronosticada xilanasa XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus aislada es completamente idéntica a la de XynA de T. aurantiacus (P23360, Tabla 28) publicada. La homología más cercana se encontró en una secuencia de
10 xilanasa de Aspergillus niger (A62445, identidad de 69,7%).

Tabla 28. Comparación de las xilanasas XYN_60/Xyn10A de Acremonium thermophilum y XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. El alineamiento se realizó utilizando el programa Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una xilanasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
identidad (%)
* Thermoascus aurantiacus XYN_30
100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, P23360
100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, AF127529
99,4
Aspergillus niger xilanasa, A62445
69,7
Aspergillus aculeatus xilanasa, AR137844
69,9
Aspergillus terreus fam 10 xyn, DQ087436
65,0
Aspergillus sojae, XynXI AB040414
63,8
Penicillium chrysogenum xilanasa, AY583585
62,5
* Acremonium thermophilum XYN_60
100,0
Organismo, enzima, y número de acceso
identidad (%)
Humicola grisea XYL I, AB001030
67,1
Magnaporthe grisea 70-15, hipotética XM_364947
63,8
Aspergillus aculeatus xilanasa, AR149839
53,7
Talaromyces emersonii xilanasa, AX403831
51,8
Gibberella zeae xilanasa, AY575962
51,4
Magnaporthe grisea XYL5, AY144348
48,5
Talaromyces emersonii, AX172287
46,9
Ejemplo 23. Producción de xilanasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas XYN_60/Xyn10A de Acremonium y XYN_30/Xyn10A de Thermoascus recombinantes como se describe en el Ejemplo 14. Los casetes de expresión 5 lineales (Tabla 29) se aislaron a partir de la cadena principal del vector mediante digestión con enzimas de restricción, se transformaron en T. reesei A96, y los transformantes se purificaron como se describe en el Ejemplo
14.
Tabla 29. Casetes de expresión construidos para la producción de las xilanasas XYN_60/Xyn10A de Acremonium thermophilum y XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus en Trichoderma reesei. La estructura esquemática de 10 los casetes de expresión se describe en la Figura 2.
Xilanasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión (a Terminador heterólogo (b
At XYN_60
pALK1912 9,0 kb 150 pb (BamHI)
Ta XYN_30
pALK1913 9,3 kb ninguno
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló a partir de la cadena principal del vector mediante digestión con EcoRI. (b Se indica el número de nucleótidos después del codón de parada del gen clonado que se incluyen en el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se utilizó en la construcción del casete de expresión se indica entre paréntesis.
La producción de xilanasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron como en el Ejemplo 14 y la actividad enzimática de la proteína recombinante se midió a partir del sobrenadante de cultivo como la liberación de azúcares reductores a 15 partir de xilano de abedul (1% p/v) a 50°C en tampón de citrato 50 mM de pH 5,3 tal como describen Bailey y Poutanen 1989. También se analizó la producción de la proteína recombinante del sobrenadante de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Además, la expresión de ambas xilanasas se determinó mediante análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-XYN_30 o anti-XYN_60 como se describe en el Ejemplo 19. Los genotipos de los transformantes seleccionados se analizaron mediante transferencia Southern utilizando el
20 casete de expresión como sonda.
Se produjo XYN_30/Xyn10A de Thermoascus en T. reesei y el pH óptimo de la proteína heteróloga producida se determinó en tampón de Mcllvaine universal dentro de un intervalo de pH de 3,0-8,0 utilizando xilano de abedul como sustrato (Figura 8A). Se determinó que el pH óptimo era 4,5. Se determinó que la temperatura óptima para la actividad enzimática de XYN_30 era 75°C (Figura 8B).
25 Los transformantes seleccionados se cultivaron, tal como se describe en el Ejemplo 14, en un biorreactor de 2 litros durante cuatro días (28°C, pH 4,2) para obtener material para los ensayos de aplicación.
Ejemplo 24. Funcionamiento de las celobiohidrolasas recombinantes en la hidrólisis
El funcionamiento de las celobiohidrolasas recombinantes purificadas se evaluó en los estudios de hidrólisis con enzimas de T. reesei purificadas. La hidrólisis se llevó a cabo con mezclas controladas de enzimas purificadas sobre varios sustratos pretratados. Los productos filtrados de los cultivos de T. reesei, que contenían diferentes enzimas CBH/Cel7 clonadas se obtuvieron como se describe en los Ejemplos 14 y 15, y las enzimas CBH se purificaron mediante cromatografía de afinidad como se describe en el Ejemplo 2. Además, se utilizaron celulasas de T. reesei puras (purificadas como describen Suurnäkki et al., 2000) en las mezclas de enzimas. Las celobiohidrolasas utilizadas en el experimento fueron:
Thermoascus aurantiacus ALK04242 CBH (Ta Cel7A)
Thermoascus aurantiacus ALKO4242 CBH (Ta Cel7A) con CBD anclado genéticamente de Trichoderma reesei (Ta Cel7A + Tr CBD)
Thermoascus aurantiacus ALKO4242 CBH (Ta Cel7A) con CBD anclado genéticamente de Chaetomium thermophilum (Ta Cel7A + Ct CBD)
Acremonium thermophilum ALKO4245 CBH (At Cel7A)
Chaetomium thermophilum ALK04265 CBH (Ct Cel7A).
Cada CBH/Cel7 que se iba a someter a ensayo (dosis 14,5 mg/g de materia seca de sustrato) se utilizó junto con EGII/Cel5A de T. reesei (3,6 mg/g) o con una mezcla que contenía EGI/Cel7B de T. reesei (1,8 mg/g), EGII/Cel5A (1,8 mg/g), xilanasa pl 9 (Tenkanen et al. 1992) (5000 nkat/g) y acetil xilano esterasa (AXE) (Sundberg y Poutanen, 1991) (250 nkat/g). A todas las mezclas se les añadió un suplemento de β-glucosidasa adicional de una preparación enzimática comercial Novozym 188 (176 nkat/g p.s.). Los tubos por triplicado que contenían la mezcla de enzima y 10 mg (materia seca)/ml del sustrato suspendido en acetato de sodio 0,05 M, se incubaron en la mezcla por agitación magnética a 45°C durante 48 h. También se prepararon muestras de referencia con enzimas inactivadas y sustratos correspondientes. La liberación de productos de la hidrólisis se midió en forma de azúcares reductores con el método DNS utilizando glucosa como patrón (Tabla 30).
Los siguientes sustratos se utilizaron en el experimento:
Celulosa cristalina (Avicel)
Fibra de abeto pretratada con vapor de agua lavada (impregnación con SO2 al 3% p/p durante 20 minutos, seguido de pretratamiento con vapor de agua a 215°C durante 5 min), 25,9% de materia seca (ABETO).
Fibra rastrojo de maíz oxidada mojada lavada ("WOCS en sus siglas inglesas").
Fibra de sauce pretratada con vapor de agua lavada (pre-tratamiento durante 14 min a 210°C), 23,0% de materia seca (SAUCE).

Tabla 30. Productos de la hidrólisis con enzimas CBH (45°C, pH 5,0). Los productos de reacción después de 48 h de hidrólisis como azúcares reductores (mg/ml), glucosa medida como patrón. Abreviaturas: CBH = celobiohidrolasa; EGI = endoglucanasa I (Cel7B) de T. reesei , EGII = endoglucanasa II (Cel5A) de T. reesei; bG = β-glucosidasa (de Novozym 188); XYL = xilanasa pl 9 (Xyn II) de T. reesei, AXE = acetil xilano esterasa de T. reesei; nd = no realizado.
Enzimas
Sustratos
CBH
Enzimas adicionales Avicel ABETO WOCS SAUCE
Ta Cel7A
EGII, bG 2,0 2,0 2,8 2,0
Ta Cel7A +Tr CBD
EGII, bG 5,8 4,0 4,4 4,0
Ta Cel7A +Ct CBD
EGII, bG 4,9 3,7 4,6 3,7
At Cel7A
EGII, bG 5,3 3,3 4,5 3,3
Ct Cel7A
EGII, bG 6,0 2,6 3,4 2,6
Cel7A de T. reesei
EGII, bG 4,7 2,9 2,9 2,9
Enzimas
Sustratos
CBH
Enzimas adicionales Avicel ABETO WOCS SAUCE
Ta Cel7A
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 4,3 2,8
Ta Cel7A +Tr CBD
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 7,2 5,9
Ta Cel7A +Ct CBD
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 7,2 5,6
At Cel7A
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 6,4 5,4
Ct Cel7A
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 5,6 4,0
Cel7A de T. reesei
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 6,0 4,1
En la Tabla 30 se han comparado las diferentes celobiohidrolasas basándose en la misma dosis de proteína en la hidrólisis. Los resultados muestran que en sustratos celulósicos (Avicel y fibra de abeto) Cel7A de Thermoascus aurantiacus con el CBD anclado genéticamente mostró una hidrólisis claramente superior que CBHI/Cel7A de T. reesei. Sin CBD, Cel7A de T. aurantiacus fue menos eficiente en estos sustratos. El rendimiento de celobiohidrolasas de Acremonium thermophilum y Chaetomium thermophilum también fue mejor que el de CBHI/Cel7A de T. reesei sobre diversos sustratos; en particular, Cel7A de C. thermophilum mostró una alta eficacia sobre celulosa pura (Avicel).
En el caso de los sustratos que contienen cantidades notables de hemicelulosa (sauce y rastrojo de maíz) las enzimas CBH/Cel7 claramente necesitaron adicionalmente hemicelulasas y endoglucanasas para funcionar eficazmente. Si no estaban presentes hemicelulasas adicionales, Cel7A de T. aurantiacus con CBD anclado genéticamente volvió a mostrar una hidrólisis claramente más alta. Con las enzimas que degradan la hemicelulosa más importantes (xilanasa, acetil xilano esterasa y EGI) Cel7A de T. aurantiacus con CBD anclado genéticamente funcionó de nuevo con la más alta eficacia. Cel7A de A. thermophilum fue más eficaz que la enzima de T. reesei y Cel7A de C. thermophilum produjo productos de hidrólisis al mismo nivel que CBHI/Cel7A de T. reesei. El dominio de unión a celulosa de T. reesei parecía proporcionar una eficacia ligeramente mejor que el CBD de C. thermophilum en el funcionamiento hidrolítico de Cel7A de T. aurantiacus, aunque la diferencia fue bastante pequeña.
Se puede concluir que cuando se remplazó CBHI/Cel7A en la mezcla de enzimas de Trichoderma por las celobiohidrolasas producidas en la presente memoria, la eficacia de la hidrólisis a juzgar por estas disposiciones experimentales mejoró claramente en el caso de Cel7A de T. aurantiacus con el CBD anclado genéticamente, y también mejoró en el caso de Cel7A de A. thermophilum y Cel7A de C. thermophilum. Considerando también la mejor estabilidad frente a la temperatura de las celobiohidrolasas producidas de la presente memoria, los resultados indican que el funcionamiento de las mezclas de enzimas celulasas a temperaturas más altas que 45°C puede ser claramente mejorado mediante el uso de las celobiohidrolasas producidas en la presente memoria.
Ejemplo 25. Rendimiento de las endoglucanasas recombinantes en la hidrólisis
Las preparaciones que contenían las endoglucanasas se compararon en estudios de hidrólisis mezcladas con las enzimas CBH/Cel7 y CBH/Cel6 purificadas sobre varios sustratos pretratados. Los productos filtrados de los cultivos de T. reesei, que contenían diferentes enzimas endoglucanasas clonadas se obtuvieron como se describe en el Ejemplo 19. Las enzimas fueron enriquecidas mediante la eliminación de las proteínas termolábiles a partir de las mezclas mediante un tratamiento térmico (60°C, 2 h, pH 5) y el sobrenadante se utilizó para los estudios de hidrólisis. Además, las celulasas de T. reesei puras (purificadas como describen Suurnäkki et al., 2000) se utilizaron en las mezclas de enzimas. Las endoglucanasas utilizadas en el experimento fueron:
Endoglucanasa A EG_40/Cel45A (ALKO4245 EG_40) de Acremonium thermophilum ALKO4245
Endoglucanasa A de tipo_EG_40/Cel45B (ALKO4245 de tipo_EG_40) de Acremonium thermophilum ALKO4245
Endoglucanasa Ta EG_28/Cel5A (ALKO4242 EG_28) de Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Los siguientes sustratos se utilizaron en el experimento:
Fibra de abeto pretratada con vapor de agua lavada (impregnación con SO2 al 3% durante 20 min, seguido de pretratamiento con vapor a 215°C durante 5 min), 25,9% de materia seca (ABETO).
Rastrojo de maíz sometido a explosión de vapor de agua (pretratamiento con vapor a agua a 210°C durante 5 min), materia seca 31,0% (SECS).
Las endoglucanasas a estudiar (dosis 840 nkat/g de materia seca, basada de la actividad endoglucanasa contra HEC de acuerdo con IUPAC, 1987) se utilizaron, con celobiohidrolasas de T. reesei (CBHI/Cel7A, 8,1 mg/g m.s. y 5 CBHII/Cel6A, 2,0 mg/g m.s.) o con Cel7A de Thermoascus aurantiacus con CBD anclado genéticamente de T. reesei (10,1 mg/g m.s.). También se incluyeron EGI (Cel7B) y EGII (Cel5A) de T. reesei purificadas (Suurnäkki et al., 2000) en los experimentos para la comparación. A todas las mezclas se les añadió un suplemento de β-glucosidasa adicional de Novozym 188 (para hacer la dosificación total de β-glucosidasa de 560 nkat/g p.s., se utilizó la dosificación relativamente alta para compensar las diferencias en las actividades de fondo de las diferentes
10 preparaciones de EG). Se incubaron tubos por triplicado en la mezcla a 45°C durante 48 h y se prepararon muestras de referencia con enzimas inactivadas y sustratos correspondientes. La liberación de productos de la hidrólisis se midió en forma de azúcares reductores con el método DNS utilizando glucosa como patrón (Tabla 31).
15 después de 48 h de hidrólisis (45°C, pH 5,0) en forma de azúcares reductores (mg/ml), glucosa medida como patrón. Abreviaturas: CBHI = celobiohidrolasa I (Cel7A) de T. reesei ; CBHII = celobiohidrolasa II (Cel6A) de T. reesei; EGI = endoglucanasa I (Cel7B) de T. reesei, EGII = endoglucanasa II (Cel5A) de T. reesei; BG = β-glucosidasa (de Novozym 188); nd. = no realizado.

Tabla 31. Productos de hidrólisis con diferentes preparaciones de endoglucanasa cuando se utilizan junto con celobiohidrolasas de T. reesei o con Cel7A de T. aurantiacus que alberga CBD de T. reesei. Productos de reacción
Enzimas
Sustrato
Endoglucanasa
CBH/Cel7 ABETO SECS
EG no añadida
CBHI and CBHII de T. reesei 2,4 3,2
EGI
CBHI and CBHII de T. reesei 3,5 4,6
EGII
CBHI and CBHII de T. reesei 3,8 3,5
At EG_40
CBHI and CBHII de T. reesei 4,9 4,3
de tipo _At EG_40
CBHI and CBHII de T. reesei 4,5 4,8
Ta EG_28
CBHI and CBHII de T. reesei 3,0 3,9
Sin añadir EG
Cel7A + Tr CBD de T. aurantiacus 1,8 2,1
EG I
Cel7A + Tr CBD de T. aurantiacus nd, 4,2
EG II
Cel7A + Tr CBD de T. aurantiacus 3,2 nd,
At EG_40
Cel7A + Tr CBD de T. aurantiacus 4,8 4,0
Ta EG_28
Cel7A + Tr CBD de T. aurantiacus 1,5 nd,
20 En la Tabla 31 se han comparado las diferentes endoglucanasas basándose en la misma dosificación de actividad en la hidrólisis. Esto puede favorecer las enzimas con baja actividad específica contra el sustrato (hidroxietilcelulosa) utilizado en el análisis y subestimar la eficacia de las enzimas con alta actividad específica contra hidroxietilcelulosa. En cualquier caso, los resultados muestran que las endoglucanasas de Acremonium thermophilum funcionan muy bien en la hidrólisis cuando ejercen su efecto junto con ambas celobiohidrolasas utilizadas en la mezcla. Las
25 endoglucanasas de A. thermophilum tienen un rendimiento similar a EGI/Cel7B de T. reesei que es una enzima muy eficaz en el sustrato de rastrojo de maíz que contiene hemicelulosa debido a su fuerte actividad secundaria xilanasa. La endoglucanasa Cel5A (ALK04242 EG_28) de T. aurantiacus mostró menor hidrólisis que las enzimas de T. reesei.
Se puede concluir que las endoglucanasas de A. thermophilum funcionan con una eficacia comparable o mejorada 30 en comparación con las enzimas de Trichoderma correspondientes en la hidrólisis como se determina por esta
disposición experimental. Considerando también la estabilidad frente a la temperatura de las endoglucanasas descritas en la presente memoria, los resultados indican que el rendimiento de mezclas de enzimas celulasas a temperaturas más altas que 45°C se puede mejorar mediante el uso de las endoglucanasas descritas en la presente memoria.
Ejemplo 26. Hidrólisis de abeto pretratado con vapor de agua a altas temperaturas
Se suspendió fibra de abeto sometida a explosión de vapor de agua lavada (impregnación con SO2 al 3% p/p durante 20 min, seguido de pretratamiento con vapor de agua a 215°C durante 5 min), con materia seca de 25,9% en 5 ml de tampón de acetato de sodio 0,05 M a la consistencia de 10 mg/ml. Este sustrato se hidrolizó utilizando diferentes mezclas de enzimas en tubos de ensayo con agitación magnética en el baño de agua ajustado a diferentes temperaturas durante 72 h. Para cada punto de muestra, se retiraron tubos de ensayo por triplicado de la hidrólisis, se hirvieron durante 10 min con el fin de terminar la hidrólisis enzimática, se centrifugaron, y el sobrenadante se analizó para determinar los productos de reacción de la hidrólisis. Los blancos que contenían el sustrato solo (solo se añadido tampón en lugar de las enzimas) también se incubaron en las condiciones correspondientes.
Se preparó una mezcla de celulasas termófilas utilizando los siguientes componentes:
Preparación de CBH/Cel7 termófila que contenía Cel7A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 con CBD anclado genéticamente de CBHI/Cel7A de T. reesei. La preparación de proteína se produjo como se describe en el Ejemplo 15 y se purificó de acuerdo con el Ejemplo 2 dando como resultado la preparación de Ta Cel7A + Tr CBD purificada con un contenido de proteína de 5,6 mg/ml.
Preparación de endoglucanasa termófila que contenía endoglucanasa A EG_40/Cel45A de Acremonium thermophilum ALKO4245. La proteína se produjo en T. reesei como se describe en el Ejemplo 19. Con el fin de enriquecer los componentes termófilos, el medio de cultivo gastado se trató con calor (60°C durante 2 horas). La preparación obtenida contenía 4,9 mg/ml de proteína y una actividad endoglucanasa (de acuerdo con la IUPAC, 1987) de 422 nkat/ml.
Preparación de β-glucosidasa termófila preparada como se ha descrito en el Ejemplo 21 que contenía β-glucosidasa Ta βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242. Con el fin de enriquecer los componentes termófilos, el caldo del fermentador se trató con calor (65°C durante 2 horas). La preparación obtenida contenía 4,3 mg/ml de proteína y una actividad β-glucosidasa de 6270 nkat/ml (de acuerdo con Bailey y Linko, 1990).
Estas preparaciones de enzimas se combinaron como sigue (por 10 ml de la mezcla): 4,51 ml de preparación de CBH/Cel7, 5,19 ml de preparación de endoglucanasa y 0,29 ml de preparación de β-glucosidasa. Esta mezcla se usó como "MEZCLA 1" de enzimas termófilas.
A modo de comparación y de referencia, se construyó una mezcla del estado de la técnica de enzimas de Trichoderma reesei comerciales combinando (por 10 ml): 8,05 ml de Celluclast 1,5 L FG (de Novozymes A/S) y 1,95 ml de Novozym 188 (de Novozymes A/S). Esto se denominó "ENZIMAS DE T.REESEI".
Las enzimas se dosificaron sobre la base de la actividad FPU de las mezclas: "MEZCLA 1", utilizando la dosis de 5,5 FPU por 1 gramo de materia seca en el sustrato de abeto, y "ENZIMAS DE T. REESE" utilizando 5,8 FPU por 1 gramo de materia seca en el sustrato de abeto.
Se tomaron muestras de la hidrólisis después de 24, 48 y 72 h y se trataron como se ha descrito anteriormente. Los productos de hidrólisis se cuantificaron utilizando el análisis de azúcares reductores (Bernfeld, 1955), utilizando glucosa como patrón. La cantidad de productos de hidrólisis en forma de azúcares reductores se presenta en la Figura 9.
Los resultados muestran claramente un mejor funcionamiento de las enzimas descritas en la presente memoria en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica a 55°C y 60°C en el sustrato de abeto. Basándose en el análisis de HPLC el máximo rendimiento de los azúcares del sustrato sería 5,67 mg por 10 mg de sustrato de abeto seco. Debido a la relativamente baja dosis de enzima los rendimientos finales de azúcar fueron claramente inferiores. Para enzimas termoestables el rendimiento de azúcar basado en el análisis de azúcares reductores fue de 66% y 57% del teórico a 55°C y 60°C, respectivamente. Para las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica fue solo de 31% y de 11% a 55°C y 60°C, respectivamente.
Ejemplo 27. Hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado con vapor de agua a altas temperaturas
Se suspendió fibra de rastrojo de maíz sometida a explosión de vapor de agua (tratamiento a 195°C durante 5 min), con materia seca de 45,3% en 5 ml de tampón de acetato de sodio 0,05 M a la consistencia de 10 mg/ml. Los tratamientos y las mediciones se realizaron como se describe en el Ejemplo 26.
Se construyó una mezcla de las celulasas termófilas descritas en la presente memoria utilizando los siguientes componentes:
Preparación de CBH termófila que contenía Cel7A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 con CBD anclado genéticamente de CBHI/Cel7A de T. reesei (Ta Cel7A + Tr CBD, Ejemplo 15). El contenido de proteína de la preparación fue de 31 mg/ml.
La preparación de endoglucanasa termófila que contenía la endoglucanasa At EG_40/Cel45A de Acremonium thermophilum ALKO4245 se obtuvo como se describe en el Ejemplo 19. La preparación enzimática concentrada contenía una actividad endoglucanasa (de acuerdo con la IUPAC, 1987) de 2057 nkat/ml.
La preparación de β-glucosidasa termófila que contenía la β-glucosidasa Ta βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus ALKO 4242 se obtuvo como se describe en el Ejemplo 21 conteniendo una actividad β-glucosidasa (de acuerdo con Bailey y Linko, 1990) de 11500 nkat/ml.
Producto de xilanasa termófila que contenía una xilanasa AM24 procedente de Nonomuraea flexuosa DSM43186. El producto se preparó mediante el uso de una cepa de Trichoderma reesei recombinante que había sido transformada con el casete de expresión pALK1502, como se describe en el documento WO2005/100557. El producto sólido se disolvió en agua para elaborar una disolución al 10% y se obtuvo una preparación enzimática con actividad xilanasa (analizada de acuerdo con Bailey et al., 1992) de 208000 nkat/ml.
Estas preparaciones enzimáticas se combinaron como sigue (por 10 ml de mezcla): 7,79 ml de preparación de CBH/Cel7, 0,96 ml de preparación de endoglucanasa, 1,14 ml de preparación de β-glucosidasa y 0,31 ml de preparación de xilanasa. Esta mezcla se usó como "MEZCLA 2" de enzimas termófilas.
A modo de comparación y de referencia, se construyó una mezcla del estado de la técnica de enzimas de Trichoderma reesei comerciales combinando (por 10 ml) 8,05 ml de Celluclast 1,5 L FG (de Novozymes A/S) y 1,95 ml de Novozym 188 (de Novozymes A/S). Esto se denominó "ENZIMAS DE T. REESEI ".
Se tomaron muestras de la hidrólisis después de 24, 48 y 72 h y se trataron como se ha descrito anteriormente. Los productos de hidrólisis se cuantificaron utilizando el análisis de azúcares reductores (Bernfeld, 1955), utilizando glucosa como patrón. Los resultados de los blancos de sustrato se restaron de las muestras con enzimas, y la concentración de productos de hidrólisis en forma de azúcares reductores se presenta en la Figura 10.
Los resultados muestran claramente un mejor funcionamiento de las enzimas descritas en la presente memoria en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica. A 45°C la mezcla de enzimas termófilas mostró una hidrólisis más eficaz en comparación con las enzimas de T. reesei: La hidrólisis fue más rápida y también se obtuvieron rendimientos más altos de azúcar. Sobre la base del análisis HPLC el máximo rendimiento de azúcares (incluyendo azúcares solubles libres en el sustrato sin lavar que se utilizó) del sustrato sería de 5,73 mg por 10 mg de sustrato seco. Por lo tanto, la hidrólisis por la MEZCLA 2 de enzimas fue casi completa en el plazo de 48 horas. A 55°C y 57,5°C las enzimas termófilas descritas en la presente memoria mostraron también claramente un mejor funcionamiento en la hidrólisis en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica.
Ejemplo 28. Hidrólisis del rastrojo de maíz pretratado a altas temperaturas utilizando una mezcla con una xilanasa termoestable
Se repitió el procedimiento explicado en el Ejemplo 27 excepto que el producto de xilanasa XT 02026A3 fue reemplazado por una preparación de xilanasa termófila que contenía la xilanasa Ta XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 producida en T, reesei. El caldo del fermentador, producido como se describe en el Ejemplo 23 contenía una actividad xilanasa de 132000 nkat/ml (analizada de acuerdo con Bailey et al., 1992).
Estas preparaciones enzimáticas se combinaron como sigue (por 10 ml de la mezcla): 7,64 ml de preparación de CBH/Cel7, 0,96 ml de preparación de endoglucanasa, 1,15 ml de preparación de β-glucosidasa y 0,25 ml de preparación de xilanasa. Esta mezcla se utilizó como "MEZCLA 3" de enzimas termófilas.
A modo de comparación y de referencia, se construyó una mezcla del estado de la técnica de enzimas de Trichoderma reesei comerciales combinando (por 10 ml) 8,05 ml de Celluclast 1,5 L FG (de Novozymes A/S) y 1,95 ml de Novozym 188 (de Novozymes A/S). Esto de denominó "ENZIMAS DE T. REESEI ".
Se tomaron muestras de la hidrólisis después de 24, 48 y 72 h y se trataron como se ha descrito anteriormente. Los productos de hidrólisis se cuantificaron utilizando el análisis de azúcares reductores (Bernfeld, 1955), utilizando glucosa como patrón. Los resultados de los blancos de sustrato se restaron de las muestras con enzimas, y la concentración de productos de hidrólisis en forma de azúcares reductores se presenta en la Figura 11.
Los resultados muestran claramente un mejor funcionamiento de la mezcla de las enzimas descritas en la presente memoria en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica. A 45°C la mezcla de enzimas termófilas mostró una hidrólisis más eficaz en comparación con las enzimas T. reesei. A 55°C y 60°C, las enzimas termófilas descritas en la presente memoria muestran claramente un mejor funcionamiento en la hidrólisis en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica. El funcionamiento de la nueva mezcla enzimática a 60°C estaba al mismo nivel que el funcionamiento de las enzimas del estado de la técnica a 45°C.
Ejemplo 29. Hidrólisis de abeto pretratado a altas temperaturas utilizando una mezcla con una xilanasa termoestable
Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 28 con fibra de abeto sometida a explosión de vapor de agua lavada (impregnación con SO2 al 3% p/p durante 20 min, seguido de pretratamiento con vapor a 215°C durante 5 min, con materia seca de 25,9%) como sustrato utilizando temperaturas de hidrólisis 45°C, 55°C y 60°C. Se tomaron muestras de la hidrólisis después de 24, 48 y 72 h y se trataron como se ha descrito anteriormente. Los productos de hidrólisis se cuantificaron utilizando el análisis de azúcares reductores (Bernfeld, 1955), utilizando glucosa como patrón. Los resultados de los blancos de sustrato se restaron de las muestras con enzimas, y la concentración de productos de hidrólisis en forma de azúcares reductores se presenta en Figura 12.
Los resultados muestran claramente un mejor funcionamiento de la mezcla de las enzimas descritas en la presente memoria, en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica a todas las temperaturas estudiadas. A 45°C la mezcla de enzimas termófilas mostró una hidrólisis más eficiente en comparación con las enzimas de T. reesei, evidentemente debido a la mejor estabilidad en la hidrólisis a largo plazo. A 55°C la eficacia de la mezcla de las enzimas descritas en la presente memoria estaba todavía al mismo nivel que a 45°C, mientras que la mezcla del estado de la técnica era ineficaz con el sustrato utilizado a esta temperatura. A 60°C las enzimas termófilas descritas en la presente memoria mostraron una disminución de la hidrólisis aunque la hidrólisis estaba casi al mismo nivel que el rendimiento de las enzimas del estado de la técnica a 45°C.
Ejemplo 30. Evaluación de la inhibición por glucosa de las β-glucosidasas de Acremonium thermophilium ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Los productos filtrados de cultivo producidos por las cepas Acremonium thermophilium ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALK04261 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242 se describen en el Ejemplo 1. Las actividades βglucosidasa (medidas de acuerdo con Bailey y Linko, 1990) de estas preparaciones fueron 21,4 nkat/ml, 5,6 nkat/ml y 18,6 nkat/ml, respectivamente. Para la comparación, también se incluyeron en el experimento las enzimas comerciales β-glucosidasa Celluclast 1,5L de 534 nkat/ml) y (β-glucosidasa Novozym 188 de 5840 nkat/ml).
Con el fin de evaluar la sensibilidad de las diferentes β-glucosidasas con miras a la inhibición por glucosa, el procedimiento de análisis de actividad convencional se realizó en presencia de diferentes concentraciones de glucosa. A las disoluciones de sustrato (p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido) para el análisis de la actividad βglucosidasa se les añadió un suplemento de glucosa de manera que la concentración de glucosa en la mezcla de análisis se ajustara a los valores de 0 a 0,5 M. Excepto esta adición de glucosa el análisis se realizó utilizando el procedimiento convencional (Bailey y Linko, 1990). Las actividades en la presencia de diferentes concentraciones de glucosa como un porcentaje de la actividad sin glucosa se presentan en la Figura 13.
Los resultados muestran que las β-glucosidasas de C. thermophilum y T. aurantiacus resultan menos afectadas por la inhibición por glucosa que las β-glucosidasas presentes en las enzimas comerciales: β-glucosidasa derivada de Aspergillus en Novozym 188 o β-glucosidasa derivada de Trichoderma en Celluclast 1,5L. La enzima de A. thermophilum mostró un comportamiento comparable a la enzima de T. reesei de Celluclast. Especialmente la enzima de C. thermophilum resultó claramente menos afectada por la alta concentración de glucosa. Por lo tanto, estos resultados indican que la inhibición por glucosa teniendo en cuenta el uso de la nueva β-glucosidasa, especialmente a partir de cepas Acremonium thermophilium ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALK04261, proporcionaría claras ventajas en la hidrólisis en condiciones industriales con alta concentración de glucosa.
Ejemplo 31. Actividad sobre papel de filtro de mezclas de enzimas a altas temperaturas
La actividad sobre papel de filtro de las preparaciones enzimáticas se midió de acuerdo con el método de la IUPAC (1987) como se describe en el procedimiento, excepto que la reacción enzimática se realizó a temperaturas de 50°C a 70°C. La actividad FPU calculada se basa en la cantidad de enzima requerida para hidrolizar 4% del sustrato de papel de filtro en 1 h en las condiciones experimentales. Se considera que la actividad FPU representa la actividad de la celulasa global total de una preparación enzimática.
Las mezclas de enzimas fueron la MEZCLA 2 preparada como se ha descrito en el Ejemplo 27, la MEZCLA 3 preparada como se ha descrito en el Ejemplo 28, y la MEZCLA 4. La MEZCLA 4 se preparó combinando las preparaciones enzimáticas descritas en el Ejemplo 27 como sigue (por 10 ml de mezcla): 7,84 ml de preparación de CBH/Cel7, 0,99 ml de preparación de endoglucanasa y 1,17 ml de preparación de β-glucosidasa.
Las mezclas de enzimas utilizadas como referencia, que representan las mezclas del estado de la técnica, fueron:
"ENZIMAS A de T. REESEI" preparadas como preparación de "ENZIMAS de T. REESEI" descrita en el Ejemplo 26.
Las "ENZIMAS B de T. REESEI" se construyeron combinando (por 10 ml) 8,05 ml de Econase CE (una preparación de celulasa de T. reesei comercial de AB Enzymes Oy, Rajamäki, Finlandia) y 1,95 ml de Novozym 188 (de Novozymes A/S).
Las actividades FPU medidas para las preparaciones enzimáticas a diferentes temperaturas se presentan en la Figura 14 en forma de porcentajes de la actividad en condiciones convencionales (IUPAC, 1987) (a 50°C).
Los resultados muestran claramente que las mezclas aquí descritas muestran una mayor actividad celulasa general a elevadas (60-70°) temperaturas en comparación con las mezclas del estado de la técnica basadas en enzimas de Trichoderma y Aspergillus.
Ejemplo 32. Uso de las nuevas beta-glucosidasas en la preparación de soforosa
5 Una alta concentración de la mezcla de producto hidrolizado de almidón (Nutriose 74/968, Roquette) se trató con la preparación enzimática enriquecida en βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus producida como se ha descrito en el Ejemplo 21 para producir una mezcla de azúcar que contenía cantidades apreciables de inductor de celulasa (soforosa) para superar la represión por glucosa .
La preparación enzimática enriquecida en Ta βG_81/Cel3A se añadió a una disolución al 70% (p/p) de Nutriose a
10 una concentración final de 1 g de proteína total/litro. El recipiente de la mezcla se incubó en un baño de agua a 65°C durante 3 días con agitación constante y se utilizó como fuente de carbono en un medio de matraz oscilante para dos diferentes cepas de Trichoderma (A47 y Rut-C30). El efecto del tratamiento enzimático se midió como la actividad endoglucanasa formada durante un cultivo en matraz oscilante de 7 días. Como referencia los cultivos se realizaron en las mismas condiciones con Nutriose sin tratar como fuente de carbono. Se obtuvo un aumento de más
15 del doble en las actividades en los cultivos en matraces oscilantes realizados en medios Nutriose pretratados con Ta βG_81/Cel3A con las cepas sometidas a ensayo. Los resultados se muestran en la Figura 15.
Lista de los organismos depositados
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> Roal
<120> Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo 5
<130> 2051999
<160> 30
10 <170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 3192
<212> ADN 15 <213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> CDS
<222>
(1514)..(2122) 20 <223>
<220>
<221> Intrón
<222>
(2123)..(2187) 25 <223>
<220>
<221> CDS
<222>
(2188)..(2949) 30 <223>
<400> 1
<210> 2
<211> 457
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 2
<210> 3
<211> 3055 5 <212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (972)..(1595)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222> (1596)..(1729)
<223>
<220>
<221>
CDS 20 <222> (1730)..(2290)
<223>
<220>
<221>
Intrón 25 <222> (2291)..(2412)
<223>
<220>
<221>
CDS 30 <222> (2413)..(2540)
<223>
<220>
<221>
Intrón 35 <222> (2541)..(2627)
<223>
<220>
<221>
CDS 40 <222> (2628)..(2691)
<223>
<400> 3
<210> 4
<211> 459
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 4
<210> 5
<211> 3401
<212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> CDS
<222> (891)..(1299)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1300)..(1387)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1388)..(1442)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1443)..(1495)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1496)..(1643)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1644)..(1697)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1698)..(1928)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1929)..(2014)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2015)..(2740)
<223>
<400> 5
<210> 6
<211> 523
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 6
<210> 7
<211> 3649 5 <212> ADN
<213> Chaetomium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (1290)..(2879)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222> (2880)..(2943)
<223>
<220>
<221>
CDS 20 <222> (2944)..(2949)
<223>
<400> 7
<210> 8
<211> 532
<212> PRT
<213> Chaetomium thermophilum
<400> 8
<210> 9
<211> 1339
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> CDS
<222> (17)..(122)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (123)..(177)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (178)..(236)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (237)..(296)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (297)..(449)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (450)..(508)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (509)..(573)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (574)..(647) 5 <223>
<220>
<221> CDS
<222> (648)..(745)
<223> 10 <220>
<221> Intrón
<222> (746)..(806)
<223>
<220> 15 <221> CDS
<222> (807)..(1330)
<223>
<400> 9
<210> 10
<211> 335
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 10
<210> 11
<211> 2334
<212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (13)..(13)
<223> N = no identificado
<220>
<221> CDS
<222> (715)..(797)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (798)..(856)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (857)..(1105)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1106)..(1228)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1229)..(1787)
<223>
<400> 11
<210> 12
<211> 297
<212> PRT 5 <213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (13)..(13) 10 <223> N = no identificado
<400> 12
<210> 13
<211> 2033
<212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> CDS
<222> (259)..(702)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (703)..(857)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (858)..(888)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (889)..(990)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (991)..(1268)
<223>
<400> 13
<210> 14
<211> 251
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 14
<210> 15
<211> 2800
<212> ADN 5 <213> Chaetomium thermophilum
<220>
<221> rasgo_misc
<222>
(2786)..(2786) 10 <223> N = no identificado
<220>
<221> CDS
<222>
(768)..(2042) 15 <223>
<400> 15
<210> 16
<211> 425 5 <212> PRT
<213> Chaetomium thermophilum
<220>
<221> rasgo_misc 10 <222> (2786)..(2786)
<223> N = no identificado
<400> 16
<210> 17
<211> 1943
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> CDS
<222> (13)..(256)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (257)..(329)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (330)..(370)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (371)..(444)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (445)..(493)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (494)..(561)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (562)..(683)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (684)..(786)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (787)..(932)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (933)..(1001)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1002)..(1090)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1091)..(1155)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1156)..(1174)
<223> <220>
<221> Intrón
<222> (1175)..(1267)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1268)..(1295)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1296)..(1361)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1362)..(1451)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1452)..(1551)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1552)..(1617)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1618)..(1829)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1830)..(1922)
<223>
<400> 17
<210> 18
<211> 329
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 18
<210> 19
<211> 2955 5 <212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (1335)..(1671)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222> (1672)..(1806)
<223> <220>
<221> CDS
<222>
(1807)..(2032) 5 <223>
<220>
<221> Intrón
<222>
(2033)..(2117) 10 <223>
<220>
<221> CDS
<222>
(2118)..(2802) 15 <223>
<400> 19
<210> 20
<211> 416
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 20
<210> 21
<211> 5092
<212> ADN 5 <213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> CDS
<222> (669)..(728) 10 <223>
<220>
<221> Intrón
<222> (729)..(872)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (873)..(1015)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1016)..(1082)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1083)..(1127)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1128)..(1183)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1184)..(1236)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1237)..(1300)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1301)..(1717)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1718)..(1776)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1777)..(2489)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (2490)..(2599)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2600)..(3469)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (3470)..(3531)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (3532)..(3759)
<223>
<400> 21
<210> 22
<211> 843
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 22
<210> 23
<211> 3510
<212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> CDS
<222> (391)..(447)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (448)..(539)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (540)..(685)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (686)..(759)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (760)..(1148)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1149)..(1217)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1218)..(3208)
<223>
<400> 23
<210> 24
<211> 861
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 24
<210> 25
<211> 3392 5 <212> ADN
<213> Chaetomium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (608)..(2405)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222> (2406)..(2457)
<223>
<220>
<221>
CDS 20 <222> (2458)..(2861)
<223>
<400> 25
<210> 26
<211> 734
<212> PRT
<213> Chaetomium thermophilum
<400> 26
<210> 27
<211> 1631
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> Intrón
<222> (610)..(674)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (675)..(1628)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(609)
<223>
<400> 27
<210> 28
<211> 521
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 28
<210> 29
<211> 1734
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> Intrón
<222> (610)..(674)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1726)..(1731)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (675)..(1661)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(609)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1662)..(1725)
<223>
<400> 29
<210> 30
<211> 534
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 30

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y se selecciona del grupo que consiste en:
    a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y
    b) un fragmento a) que tiene actividad celulolítica.
  2. 2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del al menos 95% o 99% con SEQ ID NO: 6, o un fragmento del mismo que tiene actividad celulolítica.
  3. 3. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
    a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o una secuencia que codifica un polipéptido de la reivindicación 1; b) una cadena complementaria de a) y c) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético para una cualquiera de
    las secuencias definidas en a) o b).
  4. 4.
    Un vector, que comprende como secuencia heteróloga un polinucleótido de la reivindicación 3.
  5. 5.
    Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 4.
  6. 6.
    Una cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 16729.
  7. 7.
    Una preparación enzimática que comprende un polipéptido de la reivindicación 1.
  8. 8.
    La preparación enzimática de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente endoglucanasa y betaglucosidasa, en donde la endoglucanasa comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o un fragmento de los mismos que tiene actividad celulolítica, y la beta-glucosidasa comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o un fragmento de los mismos que tiene actividad celulolítica.
  9. 9.
    La preparación enzimática de la reivindicación 8, que comprende al menos una enzima adicional, preferiblemente una xilanasa, que comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 18 o 20, o un fragmento de los mismos que tiene actividad celulolítica.
  10. 10.
    El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, o una preparación enzimática según la reivindicación 7 en la industria de combustibles, textil, detergentes, pasta de papel y papel, alimentos, piensos o bebidas, o en el tratamiento de pasta kraft, pasta mecánica, o papel reciclado.
  11. 11.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la preparación enzimática es medio de cultivo gastado.
  12. 12.
    El uso de una preparación enzimática de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 para degradar material celulósico.
  13. 13.
    Un método para preparar un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:
    a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y
    b) un fragmento de a) que tiene actividad celulolítica,
    comprendiendo dicho método transformar una célula anfitriona con un vector que codifica dicho polipéptido, y cultivar dicha célula anfitriona en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido, y opcionalmente recuperar y purificar el polipéptido producido.
  14. 14. Un método de tratamiento de material celulósico con un medio de cultivo gastado de al menos un microorganismo capaz de producir un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:
    a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y
    b) un fragmento de a) que tiene actividad celulolítica, comprendiendo dicho método hacer reaccionar el material celulósico con el medio de cultivo gastado para obtener material celulósico hidrolizado.
  15. 15.
    Un método para el tratamiento de material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa y beta-glucosidasa, por medio del cual dicha celobiohidrolasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 6, o un fragmento del mismo que tiene actividad celulolítica.
  16. 16.
    El uso del método de acuerdo con la reivindicación 15 en un procedimiento para la preparación de etanol a partir de material celulósico.
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