ES2501944T9 - Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo - Google Patents

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Description

Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la producción de productos hidrolizados de azúcares a partir de material celulósico. Más precisamente, la invención se refiere a la producción de azúcares fermentables a partir de material lignocelulósico mediante conversión enzimática. Los azúcares fermentables son útiles p. ej. en la producción de bioetanol, o para otros fines. En particular, la invención se refiere a un método para el tratamiento de material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, y opcionalmente xilanasa, y a preparaciones de enzimas y usos de las mismas. Se describen nuevos polipéptidos celulolíticos, los polinucleótidos que los codifican, y vectores y células anfitrionas que contienen los polinucleótidos. Adicionalmente, se describen otros usos de los polipéptidos y un método para prepararlos.
Antecedentes de la invención
Los productos hidrolizados de azúcares se pueden utilizar para la producción microbiana de una variedad de productos químicos finos o biopolímeros, tales como ácidos orgánicos, p. ej. ácido láctico, o etanol u otros alcoholes,
p. ej. n-butanol, 1,3-propanodiol, o polihidroxialcanoatos (PHA). Los productos hidrolizados de azúcar también pueden servir como materia prima para otros procesos no microbianos, p. ej., para el enriquecimiento, aislamiento y purificación de azúcares de alto valor o varios procesos de polimerización. Uno de los principales usos de los productos hidrolizados de azúcares es en la producción de biocarburantes. La producción de bioetanol y/u otros productos químicos puede tener lugar en un proceso integrado en una biorrefinería (Wyman 2001).
Los recursos limitados de carburantes fósiles, y cantidades crecientes de CO2 liberado a partir de los mismos y causantes el fenómeno del efecto invernadero han planteado la necesidad de la utilización de la biomasa como fuente de energía renovable y limpia. Una tecnología prometedora alternativa es la producción de biocarburantes, es decir, etanol a partir de materiales celulósicos. En el sector del transporte los biocarburantes son, por el momento la única opción, que podría reducir las emisiones de CO2 en un orden de magnitud. Se puede utilizar el etanol en vehículos y sistemas de distribución existentes y por lo tanto no se requiere inversiones costosas en infraestructuras. Los azúcares derivados de materias primas renovables lignocelulósicas también se pueden utilizar como materias primas para una variedad de productos químicos que pueden reemplazar los productos químicos con una base oleosa.
La mayoría de los carbohidratos en las plantas están en la forma de lignocelulosa, que consiste esencialmente en celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina. En un procedimiento de lignocelulosa a etanol el material lignocelulósico se pretrata en primer lugar químicamente o físicamente para hacer más accesible a la hidrólisis la fracción de celulosa. La fracción de celulosa se hidroliza a continuación para obtener azúcares que pueden ser fermentados por levadura a etanol. La lignina se obtiene como un co-producto principal que se puede utilizar como carburante sólido.
Los costes de producción de bioetanol son altos y la producción de energía es baja, y existe una continua búsqueda para hacer el proceso más económico. La hidrólisis enzimática se considera la tecnología más prometedora para la conversión de biomasa celulósica en azúcares fermentables. Sin embargo, la hidrólisis enzimática se utiliza solamente a una cantidad limitada a escala industrial, y especialmente cuando se utiliza material fuertemente lignificado tal como madera o residuos agrícolas, la tecnología no es satisfactoria. El coste de la etapa enzimática es uno de los principales factores económicos del procedimiento. Se han realizado esfuerzos para mejorar la eficacia de la hidrólisis enzimática del material celulósico (Badger 2002).
El documento US 2002/0192774 A1 describe un procedimiento continuo para la conversión de biomasa lignocelulósica sólida en productos carburantes combustibles. Después del pretratamiento mediante oxidación húmeda o explosión de vapor la biomasa se separa parcialmente en celulosa, hemicelulosa y lignina, y a continuación se somete a hidrólisis parcial utilizando una o más enzimas carbohidrasas (CE 3.2). Se proporciona como ejemplo Celluclast™, un producto comercial de Novo Nordisk A/S que contiene actividades celulasa y xilanasa.
El documento US 2004/0005674 A1 describe nuevas mezclas de enzimas que se pueden utilizar directamente sobre un sustrato de lignocelulosa, por medio de las cuales se pueden evitar los productos de desecho tóxicos formados durante los procedimientos de pretratamiento, y se puede ahorrar energía. La mezcla de enzimas sinérgicas contiene una celulasa y una enzima auxiliar tal como celulasa, xilanasa, ligninasa, amilasa, proteasa, lipidasa o glucuronidasa, o cualquier combinación de las mismas. Se considera que la celulasa incluye endoglucanasa (EG), beta-glucosidasa (BG) y celobiohidrolasa (CBH). Los ejemplos ilustran el uso de una mezcla de preparaciones de xilanasa y celulasa de Trichoderma.
Kurabi et al. (2005) han investigado la hidrólisis enzimática de abeto de Douglas por explosión de vapor y pretratadomediante organosolv con etanol por medio de celulasas fúngicas novedosas y comerciales. Éstos sometieron a
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ensayo dos preparaciones de celulasa comerciales de Trichoderna reesei, y dos preparaciones novedosas producidas por cepas mutantes de Trichoderma sp. y Penicillium sp. La preparación de Trichoderma sp. mostró un rendimiento significativamente mejor que las otras preparaciones. Se creyó que el mejor rendimiento se debía al menos en parte a una actividad beta-glucosidasa significativamente mayor, que alivia la inhibición por producto de celobiohidrolasa y endoglucanasa.
El documento US 2004/0053373 A1 se refiere un método de conversión de celulosa en glucosa mediante tratamiento de un sustrato lignocelulósico pretratado con una mezcla de enzimas que comprende celulasa y una celobiohidrolasa I (CBHI) modificada. La CBHI ha sido modificada inactivando su dominio de unión a celulosa (CBD). Las ventajas de la modificación de CBHI son, p. ej. una mejor recuperación y una mayor tasa de hidrólisis con alta concentración de sustrato. La celulasa se selecciona del grupo que consiste en EG, CBH y BG. La CBHI se obtiene preferiblemente a partir de Trichoderma.
El documento US 2005/0164355 A1 describe un método para degradar material lignocelulósico con una o más enzimas celulolíticas en presencia de al menos un tensioactivo. También se pueden usar enzimas adicionales tales como hemicelulasas, esterasa, peroxidasa, proteasa, lacasa o una mezcla de las mismas. La presencia de agente tensioactivo aumenta la degradación de material lignocelulósico en comparación con la ausencia de tensioactivo. Las enzimas celulolíticas pueden ser cualquier enzima implicada en la degradación de lignocelulosa incluyendo CBH, EG y BG.
Existe un gran número de publicaciones que describen diversas celulasas y hemicelulasas.
Se describen celobiohidrolasas (CBHS) p. ej., en el documento WO 03/000941, que se refiere a enzimas CBHI obtenidas a partir de diversos hongos. No se proporcionan las propiedades fisiológicas de las enzimas, ni ningún ejemplo de sus usos. Hong et al. (2003b) caracteriza CBHI de Thermoascus aurantiacus producida en levadura. No se describen las aplicaciones de la enzima. Tuohy et al. (2002) describen tres formas de celobiohidrolasas de Talaromyces emersonii.
Se describen las endoglucanasas de la familia cel5 (EG fam 5) p. ej., en el documento WO 03/062409, que se refiere a composiciones que comprenden al menos dos enzimas termoestables para su uso en aplicaciones para forraje. Hong et al. (2003a) describen la producción de endo-β-1,4-glucanasa termoestable a partir de T. aurantiacus en levadura. No se explican las aplicaciones. El documento WO 01/70998 se refiere a β-glucanasas de Talaromyces. También describe β-glucanasas de Talaromyces emersonii. Se comentan las aplicaciones para alimentos, forrajes, bebidas, elaboración de la cerveza, y detergentes. No se menciona la hidrólisis de lignocelulosa. El documento WO 98/06858 describe beta-1,4-endoglucanasa de Aspergillus niger y comenta las aplicaciones para forraje y alimento de la enzima. El documento WO 97/13853 describe métodos para el escrutinio de fragmentos de ADN que codifican enzimas en genotecas de ADNc. La genoteca de ADNc es de origen de levadura o fúngico, preferiblemente de Aspergillus. La enzima es preferiblemente una celulasa. Van Petegem et al. (2002) describen la estructura 3D de una endoglucanasa de la familia cel5 de Thermoascus aurantiacus. Parry et al. (2002) describen el modo de acción de una endoglucanasa de la familia cel5 de Thermoascus aurantiacus.
Se describen endoglucanasas de la familia cel7 (EG fam 7) p. ej., en el documento US 5. 912. 157, que pertenece a la endoglucanasa de Myceliphthora y sus homólogos y las aplicaciones de la misma en detergentes, productos textiles, y pasta de celulosa. El documento US 6. 071. 735 describe celulasas que muestran una alta actividad endoglucanasa en condiciones alcalinas. Se comentan los usos como detergente, en aplicaciones de pasta de celulosa y papel, y textiles. No se menciona el bioetanol. El documento US 5. 763. 254 describe enzimas que degradan celulosa/hemicelulosa y que tienen residuos de aminoácidos conservados en CBD.
Se describen endoglucanasas de la familia cel45 (EG fam 45) p. ej., en el documento US 6. 001. 639, que se refiere a las enzimas que tienen actividad endoglucanasa y que tienen dos secuencias de aminoácidos conservadas. Se comentan en general los usos en aplicaciones textiles, detergentes, y de pasta de celulosa y papel y se menciona el tratamiento de material lignocelulósico pero no se proporcionan ejemplos. El documento WO 2004/053039 se refiere a las aplicaciones detergentes de las endoglucanasas. El documento US 5. 958. 082 describe el uso de endoglucanasa, especialmente de Thielavia terrestris en aplicaciones textiles. El documento EP 0495258 se refiere a composiciones detergentes que contienen celulasa de Humicola. El documento US 5. 948. 672 describe una preparación de celulasa que contiene endoglucanasa, especialmente de Humicola y su uso en aplicaciones textiles y de pasta de celulosa. No se menciona la hidrólisis de lignocelulosa.
Una pequeña cantidad de beta-glucosidasa (BG) mejora la hidrólisis de la biomasa a glucosa hidrolizando la celobiosa producida por celobiohidrolasas. La conversión de celobiosa en glucosa es normalmente la principal etapa limitante de la velocidad. Se describen beta-glucosidasas, p. ej. en el documento US 2005/0214920, que se refiere a BG de Aspergillus fumigatus. La enzima ha sido producida en Aspergillus oryzae y Trichoderma reesei. Se comenta en general el uso de la enzima en la degradación de biomasa o en aplicaciones detergentes, pero no se ilustra. El documento WO 02/095014 describe una enzima de Aspergillus oryzae que tiene actividad celobiasa. Se comenta en general el uso en la producción de etanol a partir de biomasa, pero no se ilustra. El documento WO 2005/074656 describe polipéptidos que tienen actividad potenciadora celulolítica derivada, p. ej., de T. aurantiacus; A. fumigatus;
T. terrestris y T. aurantiacus. El documento WO 02/26979 describe el procesamiento enzimático de material vegetal.
El documento US 6022725 describe la clonación y la amplificación del gen de la beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, y el documento US 6103464 describe un método para detectar el ADN que codifica una beta-glucosidasa de un hongo filamentoso. No se proporcionan ejemplos de aplicación.
Se describen xilanasas p. ej., en el documento FR 2786784, que se refiere a una xilanasa termoestable útil, p. ej., en el tratamiento de forraje animal y en la fabricación de pan. La enzima deriva de un hongo termófilo, concretamente del género Thermoascus.
El documento US 6197564 describe enzimas que tienen actividad de xilanasa, y obtenidas a partir de Aspergillus aculeatus. Se ilustra su aplicación en panadería. El documento WO 02/24926 se refiere a xilanasas de Talaromyces. Se proporcionan ejemplos para forraje y panadería. El documento WO 01/42433 describe xilanasa termoestable de Talaromyces emersonii para uso en aplicaciones de alimentación y forraje.
Las enzimas celulolíticas mejor investigadas y más ampliamente aplicadas de origen fúngico derivan de Trichoderma reesei (el anamorfo de Hypocrea jecorina). Por consiguiente casi la mayor parte de las celulasas fúngicas disponibles en el mercado derivan de Trichoderma reesei. Sin embargo, la mayor parte de las celulasas de hongos menos conocidos no han sido aplicadas en los procedimientos de importancia práctica tales como la degradación de material celulósico, incluyendo lignocelulosa.
Existe una necesidad continua de nuevos métodos de degradación de sustratos celulósicos, en particular sustratos lignocelulósicos, y de nuevas enzimas y mezclas de enzimas, que mejoren la eficiencia de la degradación. También hay una necesidad de procesos y enzimas, que funcionen a altas temperaturas, permitiendo de ese modo el uso de una elevada consistencia de biomasa y conduciendo a elevadas concentraciones de azúcar y etanol. Este enfoque puede conducir a ahorros significativos en los costes de energía e inversiones. La elevada temperatura también disminuye el riesgo de contaminación durante la hidrólisis. La presente invención tiene como objetivo satisfacer al menos parte de estas necesidades.
Breve descripción de la invención
Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que las enzimas celulolíticas, y especialmente las celobiohidrolasas obtenibles a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum son particularmente útiles en la hidrólisis de material celulósico. Además de las celobiohidrolasas estos hongos también tienen endoglucanasas, beta-glucosidasas y xilanasas que son muy adecuadas para degradar material celulósico. Las enzimas son cinéticamente muy eficaces en un amplio intervalo de temperaturas, y aunque tienen una alta actividad a altas temperaturas, también son muy eficaces a las temperaturas de hidrólisis convencionales. Esto las convierte en extremadamente bien adaptadas para variar procesos de hidrólisis de sustratos celulósicos llevados a cabo tanto a temperaturas convencionales y a temperaturas elevadas.
La presente invención proporciona un método para el tratamiento de material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa y beta-glucosidasa, en donde dicha celobiohidrolasa es una proteína de fusión como se define en la reivindicación 1.
La invención proporciona adicionalmente una preparación enzimática que comprende celobiohidrolasa, endoglucanasa y beta-glucosidasa, en donde dicha celobiohidrolasa es una proteína de fusión como se define en la reivindicación 13.
Asimismo se proporciona el uso de dicha preparación de enzima para degradar material celulósico, así como el uso de dicho método en un procedimiento para preparar etanol a partir de material celulósico.
Se describen polipéptidos que comprenden un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se seleccionan del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 66% con el SEQ ID NO: 4, una identidad de 79% con el SEQ ID NO: 6, una identidad de 78% con el SEQ ID NO: 12, una identidad de 68% con el SEQ ID NO: 14, una identidad de 72% con el SEQ ID NO: 16, una identidad de 68% con el SEQ ID NO: 20, una identidad de 74% con el SEQ ID NO: 22 o 24, o una identidad de 78% con el SEQ ID NO: 26;
b) una variante de a) que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica;
y
c) un fragmento de a) o b) que tiene actividad celulolítica.
También se describen polinucleótidos aislados seleccionados del grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 o 25, o una secuencia que codifica dichos polipéptidos;
b) una hebra complementaria de a)
c) un fragmento de a) o b) que comprende al menos 20 nucleótidos; y
d) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético con respecto a una cualquiera de las secuencias definidas en a), b) o c).
Se describen un vector, que comprende dicho polinucleótido como secuencia heteróloga, y una célula anfitriona que comprende dicho vector. Asimismo se describen cepas de Escherichia coli que tienen el número de acceso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667 también se incluyen en la invención.
Se describen preparaciones de enzimas que comprenden al menos uno de los nuevos polipéptidos, y el uso de dicho polipéptido o preparación de enzima en la industria del combustible, textil, detergente, pasta de celulosa y papel, alimentos, forraje o bebidas.
Adicionalmente se describe un método para preparar un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 66% con el SEQ ID NO: 4, una identidad de 79% con el SEQ ID NO: 6, una identidad de 78% con el SEQ ID NO: 12, una identidad de 68% con el SEQ ID NO: 14, una identidad de 72% con el SEQ ID NO: 16, una identidad de 68% con el SEQ ID NO: 20, una identidad de 74% con el SEQ ID NO: 22 o 24, o una identidad de 78% con el SEQ ID NO: 26;
b) una variante de a) que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica;
y
c) un fragmento de a) o b) que tiene actividad celulolítica,
comprendiendo dicho método transformar una célula anfitriona con un vector que codifica dicho polipéptido, y cultivar dicha célula anfitriona en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido, y opcionalmente recuperar y purificar el polipéptido producido.
También se describe adicionalmente un método de tratamiento de material celulósico con un medio de cultivo gastado de al menos un microorganismo capaz de producir un polipéptido como se ha definido anteriormente, en donde el método comprende hacer reaccionar el material celulósico con el medio de cultivo gastado para obtener material celulósico hidrolizado.
Las realizaciones específicas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Dependencias de la temperatura de las actividades celulasa y beta-glucosidasa en los sobrenadantes de las seis cepas fúngicas sometidas a ensayo. El tiempo de incubación en el análisis fue de 60 min a la temperatura dada, el pH del análisis fue de 5,0 (actividad MUL) o 4,8 (CMCasa o BGU). La actividad obtenida a 60°C se establece como la actividad relativa del 100%. A) Thermoascus aurantiacus ALKO4239, B) Thermoascus aurantiacus ALKO4242, C) Acremonium thermophilum ALKO4245, D) Talaromyces thermophilus ALKO4246, E) Chaetomium thermophilum ALKO4261, F) Chaetomium thermophilum ALKO4265.
Figura 2. Imagen esquemática de los casetes de expresión utilizados en la transformación de protoplastos de Trichoderma reesei para producir las proteínas fúngicas recombinantes. Los genes recombinantes estuvieron bajo el control del promotor de cbh1 (prom cbh1) de T. reesei (cel7A) y la terminación de la transcripción se garantizó utilizando la secuencia terminadora de CBH1 (term CBH1) de T. reesei. Se incluyó el gen amdS como marcador de la transformación.
Figura 3. A) pH óptimos de las preparaciones de proteínas recombinantes CBH/Cel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 determinados sobre 4metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) a 50°C, 10 min. Los resultados se proporcionan como la media (± DT) de tres mediciones separadas. B) estabilidad térmica de las preparaciones de proteínas recombinantes CBH/Cel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 determinada sobre 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) al pH óptimo durante 60 min. Los resultados se proporcionan como la media (± DT) de tres mediciones separadas. Ambas reacciones contenían BSA (100 µg/ml) como estabilizador.
Figura 4. Hidrólisis de celulosa cristalina (Avicel) por las celobiohidrolasas recombinantes purificadas a 45°C. Concentración de sustrato 1% (p/v), pH 5,0, concentración de enzima 1,4 µM. A) celobiohidrolasas que albergan un CBD, B) celobiohidrolasas (núcleo) sin un CBD.
Figura 5. Hidrólisis de celulosa cristalina (Avicel) por las celobiohidrolasas recombinantes purificadas a 70°C. Concentración de sustrato 1% (p/v), pH 5,0, concentración de enzima 1,4 M. A) celobiohidrolasas que albergan un CBD, B) celobiohidrolasas (núcleo) sin un CBD.
Figura 6. A) Se determinó la dependencia del pH de la actividad EG_40/Cel45A, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium, y EG_28/Cel5A de Thermoascus producida de manera heteróloga con sustrato de CMC en un reacción de 10 min a 50°C. B) Se determinó el óptimo de temperatura de EG_40/Cel45A, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium y EG_28/Cel5A de Thermoascus a pH 5,5, 4,8, y 6,0, respectivamente. La reacción que contenía CMC como sustrato se llevó a cabo durante 60 minutos, excepto para EG_28/Cel5A durante 10 min. Se añadió BSA (100 µg/ml) como estabilizador.
Figura 7. A) Se determinó la dependencia del pH de la actividad de BG_101/Cel3A de Acremonium, BG_76/Cel3A de Chaetomium, y BG_81/Cel3A de Thermoascus producida de manera heteróloga con un sustrato de 4-nitrofenil-βD-glucopiranósido en una reacción de 10 min a 50°C. B) Se determinó el óptimo de temperatura de β3G_101/Cel3A de Acremonium, βG_76/Cel3A de Chaetomium, y βG_81/Cel3A de Thermoascus a pH 4,5, 5,5, y 4,5, respectivamente. La reacción que contenía 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato se llevó a cabo durante 60 minutos, se añadió BSA (100 µg/ml) como estabilizador.
Figura 8. A) Se determinó la dependencia del pH de la actividad xilanasa XYN_30/Xyn10A Thermoascus producida de manera heteróloga con sustrato de xilano de abedul en una reacción de 10 min a 50°C. B) Se determinó el óptimo de temperatura de XYN_30/Xyn10A a pH 5,3 en una reacción de 60 min, se añadió BSA (100 µg/ml) como estabilizador.
Figura 9. Hidrólisis de fibra de pícea sometida a explosión de vapor de agua lavada (10 mg/ml) con una mezcla de enzimas termófilas (MEZCLA 1) y enzimas de T. reesei a 55 y 60°C. La dosificación de enzima se administrar mediante FPU/g de materia seca de sustrato, FPU analizado a 50°C, pH 5. La hidrólisis se llevó a cabo durante 72 horas a pH 5, mezclando. Los resultados se proporcionan como la media (± DT) de tres mediciones separadas.
Figura 10. Hidrólisis rastrojo de maíz sometido a explosión de vapor de agua (10 mg/ml) con una mezcla de enzimas termófilas (MEZCLA 2) y enzimas de T. reesei a 45, 55 y 57,5°C. La dosificación de enzima para la "MEZCLA 2" fue de 5 FPU/g de materia seca de sustrato y para las enzimas de T. reesei de 5 FPU/g de materia seca de Celluclast con un suplemento de 100 nkat/g de materia seca de Novozym 188 (la actividad en papel de filtro se analizó a 50°C, pH 5). La hidrólisis se llevó a cabo durante 72 horas a pH 5, mezclando. Los resultados se dan como la media (± DT) de tres mediciones separadas. El sustrato contenía azúcares reductores solubles (aprox. 0,7 mg/ml). Este contenido de azúcar de fondo se restó de los azúcares reductores formados durante la hidrólisis.
Figura 11. Hidrólisis rastrojo de maíz sometido a explosión de vapor de agua (10 mg/ml) con una mezcla de enzimas termófilas que contiene una nueva xilanasa termófila de Thermoascus aurantiacus (MEZCLA 3) y enzimas de T. reesei a 45, 55 y 60°C. La dosificación para la enzima fue para la "MEZCLA 3" de 5 FPU/g de materia seca de sustrato y para las enzimas de T. reesei de 5 FPU/g de materia seca de Celluclast con un suplemento de 100 nkat/g de materia seca de Novozym 188 (la actividad en papel de filtro se analizó a 50°C, pH 5). La hidrólisis se llevó a cabo durante 72 horas a pH 5, mezclando. Los resultados se proporcionan como la media (± DT) de tres mediciones separadas. El sustrato contenía azúcares reductores solubles (aprox. 0,7 mg/ml). Este contenido de azúcar de fondo se restó de los azúcares reductores formados durante la hidrólisis.
Figura 12. Hidrólisis fibra de pícea sometida a explosión de vapor de agua (10 mg/ml) con una mezcla de enzimas termófilas que contiene una nueva xilanasa termófila XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus (MEZCLA 3) y enzimas de T. reesei a 45, 55 y 60°C. La dosificación de enzima para la "MEZCLA 3" fue de 5 FPU/g de materia seca de sustrato y para las enzimas de T. reesei de 5 FPU/g de materia seca de Celluclast con un suplemento de 100 nkat/g de materia seca de Novozym 188 (la actividad en papel de filtro se analizó a 50°C, pH 5). La hidrólisis se llevó a cabo durante 72 horas a pH 5, mezclando. Los resultados se proporcionan como la media (± DT) de tres mediciones separadas.
Figura 13. Efecto de la glucosa sobre la actividad de diferentes preparaciones de β-glucosidasa. El análisis convencional utilizando p -nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato se llevó a cabo en presencia de glucosa en la mezcla de análisis. La actividad se presenta como el porcentaje de la actividad obtenida sin glucosa.
Figura 14. Actividades FPU de las mezclas de enzimas a temperaturas de 50°C a 70°C, presentadas como un porcentaje de la actividad en condiciones convencionales (50°C, 1 h).
Figura 15. Actividad celulasa relativa de dos cepas de T. reesei diferentes cultivadas en medios que contienen Nutriosa sin tratar (N0) o Nutriosa pretratada con BG_81/Cel3A (NBG81) como fuente de carbono.
Descripción detallada de la invención
La celulosa es el principal componente estructural de las plantas superiores. Proporciona a las células vegetales una alta resistencia a la tracción ayudándolas a resistir la tensión mecánica y la presión osmótica. La celulosa es un β1,4-glucano compuesto por cadenas lineales de residuos de glucosa unidos por enlaces glicosídicos β-1,4. La
celobiosa es la unidad repetitiva más pequeña de la celulosa. En las paredes celulares la celulosa está empaquetada en láminas orientadas de manera diversa, que están incluidas en una matriz de hemicelulosa y lignina. La hemicelulosa es un grupo heterogéneo de polímeros carbohidratados que contiene principalmente diferentes glucanos, xilanos y mananos. La hemicelulosa consiste en una cadena principal lineal con residuos unidos por β-1,4 sustituidos con cadenas laterales cortas que contienen normalmente acetilo, glucuronilo, arabinosilo y galactosilo. La hemicelulosa puede estar entrecruzada químicamente con lignina. La lignina es un polímero entrecruzado complejo de unidades de p-hidroxifenilpropano diversamente sustituido que proporciona resistencia a la pared celular para soportar la tensión mecánica, y también protege la celulosa de la hidrólisis enzimática.
La lignocelulosa es una combinación de celulosa y hemicelulosa y polímeros de unidades de fenol propanol y lignina. Es físicamente dura, densa y e inaccesible y el material bioquímico más abundante en la biosfera. Los materiales que contienen lignocelulosa son, por ejemplo: virutas de madera dura y de madera blanda, pasta de madera, serrín y residuos industriales de forestales y de madera; biomasa agrícola tal como paja de cereales, pasta de remolacha azucarera, rastrojo y mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, tallos, hojas, cáscaras, cascarillas, y similares; productos de desecho tales como residuos sólidos urbanos, papel de periódico y de oficina de desecho, residuos de la molienda de, p. ej. cereales; cultivos destinados a la producción de energía (p. ej., sauce, chopo, pasto varilla o alpiste arundináceo, y similares). Los ejemplos preferidos son el rastrojo de maíz, el pasto varilla, la paja de cereales, el bagazo de caña de azúcar y los materiales derivados de la madera.
"Material celulósico" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier material que comprende celulosa, hemicelulosa y/o lignocelulosa como componente significativo. "Material lignocelulósico" significa cualquier material que comprende lignocelulosa. Tales materiales son, p. ej. materiales vegetales tales como madera incluyendo madera blanda y dura, cultivos herbáceos, residuos agrícolas, residuos de pasta de celulosa y de papel, papel usado, residuos de la industria alimenticia y de forraje, etc. Las fibras textiles, como el algodón, las fibras derivadas de algodón, lino, cáñamo, yute y fibras celulósicas elaboradas por el hombre como modal, viscosa, liocel son ejemplos específicos de materiales celulósicos.
El material celulósico es degradado en la naturaleza por diversos organismos diferentes, incluyendo bacterias y hongos. La celulosa es degradada típicamente por diferentes celulasas que actúan sucesivamente o simultáneamente. La conversión biológica de celulosa en glucosa requiere generalmente tres tipos de enzimas hidrolíticas: (1) Endoglucanasas que cortan los enlaces glicosídicos beta-1,4 internos; (2) Exocelobiohidrolasas que cortan el disacárido celobiosa del extremo de la cadena polimérica de celulosa; (3) Beta-1,4-glucosidasas que hidrolizan la celobiosa y otros celo-oligosacáridos cortos a glucosa. En otras palabras, los tres principales grupos de celulasas son celobiohidrolasas (CBH), endoglucanasas (EG) y beta-glucosidasas (BG).
La degradación de los sustratos que contienen celulosa más complejos requiere una amplia gama de enzimas diferentes. Por ejemplo la lignocelulosa es degradada por las hemicelulasas, como xilanasas y mananasas. La hemicelulasa es un enzima que hidroliza la hemicelulosa.
Las "enzimas celulolíticas" son enzimas que tienen "actividad celulolítica", lo que significa que son capaces de hidrolizar sustratos celulósicos o derivados de los mismos a sacáridos más pequeños. Por lo tanto, las enzimas celulolíticas incluyen tanto celulasas como hemicelulasas. Celulasas según se utiliza en la presente memoria incluyen celobiohidrolasas, endoglucanasas y beta-glucosidasas.
T. reesei tiene un sistema de celulasa bien conocido y eficaz, que contiene dos CBH, dos EG y BG principales y varias minoritarias. La CBHI de T. reesei (Cel7A) corta el azúcar desde el extremo reductor de la cadena de celulosa, tiene un dominio de unión a celulosa C-terminal (CBD) y puede constituir hasta 60% de la proteína secretada total. La CBHII de T. reesei (Cel6A) corta el azúcar desde el extremo no reductor de la cadena de celulosa, tiene un dominio de unión a celulosa N-terminal y pueden constituir hasta 20% de la proteína secretada total. Las endoglucanasas EGI (Cel7B), y EGV (Cel45A) tienen un CBD en su extremo C-terminal, EGII (Cel5A) tiene un CBD N-terminal y EGIII (Cel12A) no tiene ningún dominio de unión a celulosa. La CBHI, CBHII, EGI y EGII también se denominan "celulasas principales de Trichoderma" que comprenden juntas 80-90% de las proteínas secretadas totales. Los expertos en la técnica saben que una enzima puede ser activa sobre diversos sustratos y las actividades enzimáticas se pueden medir utilizando diferentes sustratos, métodos y condiciones. La identificación de las diferentes actividades celulolíticas son comentadas, p. ej., por Van Tilbeurgh et al. 1988.
Además de un dominio/núcleo catalítico que expresa la actividad celulolítica, las enzimas celulolíticas pueden comprender uno o más dominios de unión a celulosa (CBD), también denominados dominios/módulos de unión a carbohidratos (CBD/CBM), que pueden estar localizados en el extremo N o C del dominio catalítico. Los CBD tienen actividad de unión a carbohidratos y median la unión de la celulasa a la celulosa cristalina, pero tienen poco o ningún efecto sobre la actividad hidrolítica de celulasa de la enzima sobre sustratos solubles. Estos dos dominios están conectados típicamente a través de una región conectora flexible y altamente glicosilada.
"Celobiohidrolasa" o "CBH" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a enzimas que escinden la celulosa desde el extremo de la cadena de glucosa y producen principalmente celobiosa. También se denominan 1,4-beta-Dglucanocelobiohidrolasas o celulosa 1,4-beta-celobiosidasas. Hidrolizan los enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos desde los extremos reductores o no reductores de un polímero que contiene dichos enlaces, tales como celulosa, por
medio de lo cual se libera celobiosa. Se han aislado dos CBH diferentes de Trichoderma reesei, CBHI y CBHII. Estas tienen una estructura modular que consiste en un dominio catalítico conectado a un dominio de unión a celulosa (CBD). También existen celobiohidrolasas en la naturaleza que carecen de CBD.
"Endoglucanasa" o "EG" se refiere a enzimas que cortan los enlaces glicosídicos internos de la cadena de celulosa. Se clasifican como EC 3.2.1.4. Son 1,4-beta-D-glucano-4-glucanohidrolasas y catalizan la endohidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en polímeros de glucosa tales como la celulosa y sus derivados. Algunas endoglucanasas de origen natural tienen un dominio de unión a celulosa, mientras otras no. Algunas endoglucanasas también tienen actividad xilanasa (Bailey et al., 1993).
"Beta-glucosidasa" o "BG" o "βG" se refiere a enzimas que degradan oligosacáridos solubles pequeños incluyendo celobiosa a glucosa. Se clasifican como EC 3.2.1.21. Son beta-D-glucósido glucohidrolasas, que típicamente catalizan la hidrólisis de residuos de beta-D-glucosa no reductores terminales. Estas enzimas reconocen oligosacáridos de glucosa. Los sustratos típicos son celobiosa y celotriosa. La celobiosa es un inhibidor de las celobiohidrolasas, por tanto la degradación de la celobiosa es importante para superar la inhibición por producto final de celobiohidrolasas.
Las xilanasas son enzimas que son capaces de reconocer e hidrolizar la hemicelulosa. Incluyen enzimas tanto exohidrolíticas como endohidrolíticas. Típicamente tienen actividad endo-1,4-beta-xilanasa (EC 3.2.1.8) o beta-Dxilosidasa (EC 3.2.1.37) que rompe la hemicelulosa a xilosa. "Xilanasa" o "Xyn" en relación con la presente invención se refiere especialmente a una enzima clasificada como EC 3.2.1.8 que hidroliza polímeros de xilosa de sustratos lignocelulósicos o xilano purificado.
Además de esto, las celulasas se pueden clasificar en varias familias de glicosil hidrolasas de acuerdo con su secuencia primaria, apoyada por el análisis de la estructura tridimensional de algunos miembros de la familia (Henrissat 1991, Henrissat y Bairoch 1993, 1996). Algunas glicosilhidrolasas son enzimas multifuncionales que contienen dominios catalíticos que pertenecen a diferentes familias de glicosilhidrolasas. La familia 3 consiste en beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21) tales como BG_81 de Ta, BG_101 de At y BG_76 de Ct descritas en la presente memoria. La familia 5 (antes conocida como celA) consiste principalmente en endoglucanasas (EC 3.2.1.4) como EG_28 de Ta descrita en la presente memoria. La familia 7 (antes familia de celulasa CELC) contiene endoglucanasas (EC 3.2.1.4) y celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) tales como EG_54 de Ct, CBH de Ta, CBH_A de At, CBH_C de At y CBH de Ct descritas en la presente memoria. La familia 10 (antes CELF) consiste principalmente en xilanasas (EC 3.2.1.8) tales como XYN_30 de Ta y XYN_60 de At descritas en la presente memoria. La familia 45 (antes CELK) contiene endoglucanasas (EC 3.2.1.4), tales como la EG_40 de At y de tipo EG_40 de At descritas en la presente memoria.
Las enzimas celulolíticas útiles para hidrolizar material celulósico son obtenibles de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum. "Obtenible de" significa que se pueden obtener de dichas especies, pero no excluye la posibilidad de obtenerlas de otras fuentes. En otras palabras, se pueden originar a partir de cualquier organismo, incluidas plantas. Preferiblemente se originan a partir de microorganismos, por ejemplo bacterias u hongos. Las bacterias pueden ser, p. ej., de un género seleccionado entre Bacillus, Azospirillum y Streptomyces. Más preferiblemente, la enzima se origina a partir de hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras), por ejemplo de un género seleccionado del grupo que consiste en Thermoascus, Acremonium, Chaetomium, Achaetomium, Thielavia, Aspergillus, Botrytis, Chrysosporium, Collybia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melanocarpus, Myceliophthora, Myriococcum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes y Trichoderma.
Las enzimas son obtenibles de Thermoascus aurantiacus cepa ALKO4242 depositada como CBS 116239, cepa ALKO4245 depositada como CBS 116240 actualmente clasificada como Acremonium thermophilium, o Chaetomium thermophilum cepa ALKO4265 depositada como CBS 730.95.
La celobiohidrolasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con el SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.
Estas CBH tienen una inhibición de celobiosa constante ventajosa en comparación con la de la CBH de Trichoderma reesei, y muestran mejores resultados de hidrólisis cuando se someten a ensayo diversos sustratos celulósicos. Los SEQ ID NO: 2 y 4 no lo comprenden un CBD. Se pueden obtener resultados de hidrólisis particularmente mejorados 5 cuando un dominio de unión a celulosa (CBD) se ancla una CBH que no tiene un CBD propio. El CBD se puede obtener p. ej. a partir de una especie de Trichoderma o Chaetomium, y se ancla a la CBH preferiblemente a través de un conector. La proteína de fusión resultante que contiene una región núcleo de CBH anclada a un CBD a través de un conector puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 28 o 30. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia del SEQ ID NO: 27 o 29 codifican tales
10 proteínas de fusión.
La endoglucanasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo. Estas endoglucanasas tienen buena termoestabilidad.
15 La beta-glucosidasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo. Estas beta-glucosidasas tienen buena resistencia a la inhibición por glucosa, que es ventajosa para evitar la inhibición por el producto final durante la hidrólisis enzimática del material celulósico. Las beta-glucosidasas también se pueden utilizar en la preparación de soforosa, un inductor de celulasa utilizado en el cultivo de T. reesei.
La xilanasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 18 o 20, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.
Mediante el término "identidad" se quiere significar aquí la identidad global entre dos secuencias de aminoácidos comparadas entre sí desde el primer aminoácido codificado por el gen correspondiente hasta el último aminoácido. La identidad de las secuencias completas se mide utilizando el programa de alineamiento global de Needleman-Wunsch en el paquete de programas EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice et al., 2000), versión 3.0.0, con los siguientes parámetros: EMBLOSUM62, Penalización por hueco 10,0, Penalización por extensión 0,5. El algoritmo es descrito por Needleman y Wunsch (1970). El experto en la técnica es consciente del hecho de que los resultados en los que se utiliza el algoritmo de Needleman-Wunsch son comparables solamente cuando se alinean los dominios correspondientes de la secuencia. Por consiguiente, la comparación p. ej. de secuencias de celulasa que incluyen CBD o secuencias señal con secuencias que carecen de esos elementos no se puede realizar.
Se puede utilizar un polipéptido celulolítico que tiene una identidad al menos 80, 85, 90, 95 o 99% con el SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 , 20, 22, 24 o 26 o al menos con su fragmento enzimáticamente activo.
Mediante el término "fragmento enzimáticamente activo" se quiere significar cualquier fragmento de una secuencia definida que tiene actividad celulolítica. En otras palabras un fragmento enzimáticamente activo puede ser la parte de la proteína madura de la secuencia definida, o puede ser solamente un fragmento de la parte de la proteína madura, siempre que tenga todavía actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa o xilanasa.
Las enzimas celulolíticas son preferiblemente enzimas recombinantes, que pueden ser producidas de una manera generalmente conocida. Se aísla un fragmento de polinucleótido que comprende el gen de la enzima, el gen se inserta bajo un promotor fuerte en un vector de expresión, el vector se transfiere en células anfitrionas adecuadas y las células anfitrionas se cultivan en condiciones que provocan la producción de la enzima. Los métodos para la producción de proteínas mediante tecnología recombinante en diferentes sistemas anfitriones son bien conocidos en la técnica (Sambrook et al., 1989; Coen, 2001; Gellissen, 2005). Preferiblemente, las enzimas se producen como enzimas extracelulares que son secretadas al medio de cultivo, a partir del cual se puede recuperar y aislarse fácilmente. Se puede utilizar el medio de cultivo gastado del anfitrión de producción tal cual, o se pueden retirar de allí las células anfitrionas, y/o se puede concentrar, filtrar o fraccionar. También se puede secar.
El polipéptido aislado en el presente contexto puede significar simplemente que las células y los residuos celulares se han retirado del medio de cultivo que contiene el polipéptido. Convenientemente, los polipéptidos se aíslan, p. ej., añadiendo polímeros aniónicos y/o catiónicos al medio de cultivo gastado para mejorar la precipitación de las células, los restos celulares y algunas enzimas que tienen actividades secundarias no deseadas. A continuación el medio se filtra, utilizando un agente de filtración inorgánico y un filtro para retirar los precipitantes formados. Después de esto el producto filtrado se procesa adicionalmente utilizando una membrana semi-permeable para retirar el exceso de sales, azúcares y productos metabólicos.
El polinucleótido heterólogo puede comprender un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 16723, DSM 16728, DSM 16729, DSM 16727, DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.
El anfitrión de producción puede ser cualquier organismo capaz de expresar la enzima celulolítica. Preferiblemente, el anfitrión es una célula microbiana, más preferiblemente un hongo. Lo más preferiblemente, el anfitrión es un hongo filamentoso. Preferiblemente, el anfitrión recombinante se modifica para expresar y secretar enzimas celulolíticas como su actividad principal o una de sus actividades principales. Esto se puede realizar mediante la supresión de los principales genes homólogos secretados, p. ej., las cuatro principales celulasas de Trichoderma y dirigiendo genes heterólogos a un locus que se ha modificado para asegurar altos niveles de expresión y producción. Los anfitriones preferidos para la producción de las enzimas celulolíticas son en particular cepas del género Trichoderma o Aspergillus.
Las enzimas necesarias para la hidrólisis del material celulósico se pueden añadir en una cantidad enzimáticamente eficaz o bien simultáneamente, p. ej., en forma de una mezcla de enzimas, o bien sucesivamente, o bien como una parte de la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). Se puede utilizar cualquier combinación de las celobiohidrolasas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o con un fragmento enzimáticamente activo del mismo junto con cualquier combinación de endoglucanasas y beta-glucosidasas. Si el material celulósico comprende hemicelulosa, se utilizan adicionalmente para la degradación hemicelulasas, preferiblemente xilanasas. Las endoglucanasas, beta-glucosidasas y xilanasas se pueden seleccionar entre las descritas en la presente memoria, pero no se limitan a las mismas. Estas pueden ser también por ejemplo preparaciones de enzimas asequibles comercialmente. Además de celulasas y hemicelulasas opcionales se pueden utilizar una o más enzimas, por ejemplo, proteasas, amilasas, lacasas, lipasas, pectinasas, esterasas y/o peroxidasas. Se puede llevar a cabo otro tratamiento enzimático antes, durante o después del tratamiento con celulasa.
El término "preparación de enzima" se refiere a una composición que comprende al menos una de las enzimas deseadas. La preparación puede contener las enzimas en forma al menos parcialmente purificada y aislada. Ésta puede consistir incluso esencialmente en la enzima o enzimas deseadas. Alternativamente, la preparación puede ser un medio de cultivo gastado o producto filtrado que contiene una o más enzimas celulolíticas. Además de la
actividad celulolítica, la preparación puede contener aditivos, tales como mediadores, estabilizantes, tampones, conservantes, tensioactivos y/o componentes del medios de cultivo. Los aditivos preferidos son tales que se utilizan comúnmente en preparaciones de enzimas destinadas a una aplicación concreta. La preparación de enzima puede estar en forma de líquido, polvo o granulado. Preferiblemente, la preparación de enzima es medio de cultivo gastado. El "medio de cultivo gastado" se refiere al medio de cultivo del anfitrión que comprende las enzimas producidas. Preferiblemente, las células anfitrionas se separan de dicho medio después de la producción.
La preparación de enzima puede comprender una mezcla de CBH, EG y BG, opcionalmente junto con xilanasa y/u otras enzimas. La CBH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o con un fragmento enzimáticamente activo del mismo, y se puede obtener a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, mientras que EG, BG y xilanasa pueden ser de cualquier origen, incluyendo a partir de dichos organismos. Otras enzimas que podrían estar presentes en la preparación son, p. ej. proteasas, amilasas, lacasas, lipasas, pectinasas, esterasas y/o peroxidasas.
Se pueden utilizar mezclas y combinaciones de enzimas para adaptarse a diferentes condiciones del proceso. Por ejemplo, si el proceso de degradación se lleva a cabo a una temperatura alta, se eligen enzimas termoestables. Una combinación de una CBH de la familia 7 con una endoglucanasa de la familia 45, opcionalmente combinadas con una BG de la familia 3 y/o una xilanasa de la familia 10 tuvo un excelente rendimiento de hidrólisis tanto a 45°C, como a temperaturas elevadas.
Las enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei se utilizan convencionalmente a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 40-50°C en la hidrólisis, y a 30-40°C en SSF. La CBH, EG, BG y Xyn obtenibles de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum también son eficientes a estas temperaturas, pero además la mayoría de ellas también funciona extremadamente bien a temperaturas entre 50°C y 75°C, o incluso hasta 80°C y 85°C, tal como entre 55°C y 70°C, p. ej., entre 60°C y 65°C. Para tiempos de incubación cortos las mezclas de enzimas son funcionales incluso hasta 85°C, para la hidrólisis completa se utilizan normalmente temperaturas más bajas.
El método para el tratamiento de material celulósico con CBH, EG y BG y Xyn es especialmente adecuado para la producción de azúcares fermentables a partir de material lignocelulósico. Los azúcares fermentables se pueden fermentar a continuación por medio de levadura en etanol, y utilizar como combustible. También se pueden utilizar como intermedios o materias primas para la producción de diversos productos químicos o elementos esenciales para los procesos de la industria química, p. ej. en la denominada biorrefinería. El material lignocelulósico se puede pretratar antes de la hidrólisis enzimática para desorganizar la estructura de fibra de los sustratos celulósicos y hacer la fracción de celulosa más accesible a las enzimas celulolíticas. Los pretratamientos actuales incluyen procesos mecánicos, químicos o térmicos y sus combinaciones. El material puede ser pretratado por ejemplo mediante explosión de vapor o hidrólisis ácida.
Se encontraron diversos nuevos polipéptidos celulolíticos en Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, y Chaetomium thermophilum. Los nuevos polipéptidos pueden comprender un fragmento que tiene actividad celulolítica y se pueden seleccionar del grupo que consiste en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 66%, preferiblemente 70% o 75%, con el SEQ ID NO: 4, una identidad de 79% con el SEQ ID NO: 6, una identidad de 78% con el SEQ ID NO: 12, una identidad de 68%, preferiblemente 70% o 75%, identidad con el SEQ ID NO: 14, una identidad de 72%, preferiblemente 75%, con el SEQ ID NO: 16, una identidad de 68%, preferiblemente 70% o 75%, con el SEQ ID NO: 20, una identidad de 74% con el SEQ ID NO: 22 o 24, o una identidad de 78% con el SEQ ID NO: 26.
Los nuevos polipéptidos también pueden ser variantes de dichos polipéptidos. Una "variante" puede ser un polipéptido que se produce naturalmente, p. ej., en forma de una variante alélica dentro de la misma cepa, especie o género, o puede haber sido generado mediante mutagénesis. Puede comprender sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, pero todavía funciona de una manera sustancialmente similar a las enzimas definidas anteriormente, es decir, comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica.
Los polipéptidos celulolíticos se producen normalmente en las células en forma de polipéptidos inmaduros que comprenden una secuencia señal que es escindida durante la secreción de la proteína. También pueden ser procesados adicionalmente durante la secreción, en el extremo N-terminal y/o extremo C-terminal para dar una proteína enzimáticamente activa, madura. Un polipéptido "que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica" significa por lo tanto que el polipéptido puede estar en forma inmadura o madura, preferiblemente está en forma madura, es decir, ha tenido lugar el procesamiento.
Los nuevos polipéptidos pueden ser, adicionalmente, un "fragmento de los polipéptidos o variantes" mencionados anteriormente. El fragmento puede ser la forma madura de las proteínas mencionadas anteriormente, o puede ser solamente una parte enzimáticamente activa de la proteína madura. De acuerdo con una realización de la invención, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80, 85, 90, 95, o 99% con el SEQ ID NO: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 o 26, o con un fragmento celulolíticamente activo del mismo. También puede ser una variante del mismo, o un fragmento del mismo que tiene actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa,
xilanasa, o beta-glucosidasa. De acuerdo con otra realización de la invención, el polipéptido consiste esencialmente en un fragmento celulolíticamente activo de una secuencia del SEQ ID NO: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 o 26.
Los nuevos polinucleótidos pueden comprender una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 o 25, o una secuencia que codifica un nuevo polipéptido como se ha definido anteriormente, incluyendo hebras complementarias del mismos. Polinucleótido según se utiliza en la presente memoria se refiere tanto a ARN y ADN, y puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. El polinucleótido también puede ser un fragmento de dichos polinucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos, p. ej. al menos 25, 30 o 40 nucleótidos. De acuerdo con una realización de la invención tiene al menos 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. Adicionalmente, el polinucleótido puede ser degenerado como resultado del código genético con respecto a una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente. Esto significa que diferentes codones pueden codificar para el mismo aminoácido.
El polinucleótido puede estar "comprendido en" el SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 o 25, lo que significa que la secuencia tiene al menos parte de la secuencia mencionada. Alternativamente, el polinucleótido comprende un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.
Las nuevas proteínas/polipéptidos se pueden preparar como se ha descrito anteriormente. Los nuevos polinucleótidos se pueden insertar en un vector, que es capaz de expresar el polipéptido codificado por la secuencia heteróloga, y el vector se puede insertar en una célula anfitriona capaz de expresar dicho polipéptido. La célula anfitriona es preferiblemente del género Trichoderma o Aspergillus.
Se ha introducido un gen heterólogo que codifica los nuevos polipéptidos en un plásmido en una cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.
Las nuevas enzimas pueden ser componentes de una preparación de enzima. La preparación de enzima puede comprender uno o más de los nuevos polipéptidos, y puede estar, p. ej. en forma de medio de cultivo gastado, polvo, gránulos o líquido. Puede comprender actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, y opcionalmente xilanasa y/o otras actividades enzimáticas. Puede comprender adicionalmente cualquier aditivo convencional.
Las nuevas enzimas se pueden aplicar en cualquier proceso que implique enzimas celulolíticas, tal como en la industria de combustibles, textil, detergentes, pasta de celulosa y papel, alimentos, forrajes o bebidas, y especialmente en la hidrólisis de material celulósico para la producción de biocombustible que comprende etanol. En la industria de la pasta de celulosa y el papel se pueden utilizar para modificar la fibra celulósica, por ejemplo, en el tratamiento de pasta kraft, pasta mecánica, o papel reciclado.
Ejemplos
Ejemplo 1. Escrutinio para determinar las cepas que expresan la actividad celulolítica y su cultivo para la purificación
Se sometieron a ensayo aproximadamente 25 cepas de hongos de la colección de cultivos Roal Oy para determinar la actividad celulolítica incluyendo beta-glucosidasas. Después del escrutinio preliminar se eligieron seis cepas para estudios posteriores. Estas fueron ALKO4239 y ALKO4242 de Thermoascus aurantiacus, ALKO4245 de Acremonium thermophilum, ALKO4246 de Talaromyces thermophilus y ALKO4261 y ALKO4265 de Chaetomium thermophilum.
Las cepas ALKO4239, ALKO4242 y ALKO4246 se cultivaron en matraces oscilantes a 42°C durante 7 días en el medio 3 x B, que contiene g/litro: celulosa Solka Floc 18, bagazo de destilería 18, xilano de espelta de avena 9, CaCO3 2, harina de soja 4,5, (NH4)HPO4 4,5, salvado de trigo 3,0, KH2PO4 1,5, MgSO4·H2O 1,5, NaCl 0,5, KNO3 0,9, goma garrofín 9,0, disolución de elementos traza Núm. 1 0,5, disolución de elementos traza Núm. 2 0,5 y Struktol (Stow, OH, USA ) antiespumante 0,5 ml; el pH se ajustó a 6,5. La disolución de elementos traza Núm. 1 tiene g/litro: MnSO4 1,6, ZnSO4·7H2O 3,45 y CoCl2·6H2O 2,0; la disolución de elementos traza Núm. 2 tiene g/litro: FeSO4·7H2O 5,0 con dos gotas de H2SO4 concentrado.
La cepa ALKO4261 se cultivó en matraces oscilantes en el medio 1XB, que tiene un tercio de cada uno de los componentes del medio 3 x B (anterior), excepto que tiene mismas concentraciones de CaCO3, NaCl y elementos traza. La cepa se cultivó a 45°C durante 7 d.
La cepa ALKO 4265 se cultivó en matraces oscilantes en el siguiente medio, g/I: celulosa Solka Floc 40, Pharmamedia™ (Traders Protein, Memphis, TN, USA) 10, polvo de aguas de infusión de maíz 5, (NH4)2SO4 5 y KH2PO4 15; el pH se ajustó a 6,5. La cepa se cultivó a 45°C durante 7 d.
Después del cultivo las células y otros sólidos se recogieron por centrifugación y se recuperó el sobrenadante. Para los cultivos en matraz oscilante, se añadieron los inhibidores de proteasa PMSF (fluoruro de fenilmetil-sulfonilo) y pepstatina A a 1 mM y 10 µg/ml, respectivamente. Si no se utilizan inmediatamente, las preparaciones se almacenan en alícuotas a -20°C.
Para la estimación de la termoactividad de las enzimas, se realizaron análisis de las preparaciones de cultivo en matraz oscilante a 50°C, 60°C, 65°C, 70°C y 75°C durante 1 h, en presencia de 100 µg de albúmina de suero bovino (BSA)/ml como estabilizador. Se realizaron análisis preliminares a 50°C y 65°C a dos valores de pH diferentes (4,8/5,0 o 6,0) con el fin de aclarar qué pH era el más apropiado para el análisis de termoactividad.
Se analizaron todos los sobrenadantes de los matraces oscilantes para determinar las siguientes actividades:
Actividad de tipo celobiohidrolasa I ('CBHI') y actividad de tipo endoglucanasa I ('EGI'):
Éstas se midieron en tampón de acetato de Na 50 mM con MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido) 0,5 mM como sustrato. Se añadió glucosa (100 mM) para inhibir cualquier actividad de beta-glucosidasa interferente. El 4metilumbeliferilo liberado se midió a 370 nm. Las actividades de 'CBHI' y 'EGI' se distinguieron midiendo actividad en presencia y ausencia de celobiosa (5 mM). La actividad que no es inhibida por celobiosa representa la actividad 'EGI' y la actividad MUL restante representa la actividad 'CBHI' (van Tilbeurgh et al, 1988). El análisis se realizó a pH 5,0 o 6,0 (véase más abajo).
Actividad endoglucanasa (CMCasa):
Ésta se analizó carboximetilcelulosa (CMC) al 2% (p/v) como sustrato en tampón de citrato 50 mM esencialmente como describen Bailey y Nevalainen 1981; Haakana et al. 2004. Los azúcares reductores se midieron con el reactivo DNS. El análisis se realizó a pH 4,8 o 6,0 (véase más abajo).
Actividad beta-glucosidasa (BGU):
Ésta se analizó con 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (1 mM) en tampón de citrato 50 mM como describen Bailey y Nevalainen 1981. El 4-nitrofenol liberado se midió a 400 nm. El análisis se realizó a pH 4,8 o 6,0 (véase más abajo).
Las actividades relativas de las enzimas se presentan en la Figura 1. Las actividades relativas se presentaron ajustando la actividad a 60°C como 100% (Figura 1). Todas las cepas produjeron enzimas, que tenían una actividad elevada a altas temperaturas (65°C-75°C).
Para las purificaciones de las proteínas, también se cultivó ALKO4242 en un biorreactor de 2 litros (Braun Biostat® B, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 40, harina de soja 10, NH4NO3 5, KH2PO4 5, MgSO4·7H2O 0,5, CaCl2·2H2O 0,05, disolución de elementos traza Núm. 1 0,5, disolución de elementos traza Núm. 2 0,5. La aireación a fue de 1 vvm, control antiespumante con Struktol, agitación a 200-800 rpm y temperatura a 47°C. Se hicieron circular dos lotes, uno a pH 4,7 ± 0,2 (NH3/H2SO4) y el otro con un pH inicial de pH 4,5. El tiempo de cultivo fue de 7 d. Después del cultivo las células y otros sólidos se eliminaron mediante centrifugación.
La cepa ALKO4245 se cultivó en un bioreactor de 2 litros (Braun Biostat® B, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 40, polvo de aguas de infusión de maíz 15, bagazo de destilería 5, xilano de espelta de avena 3, goma garrofín 3, (NH4)2SO4 5 y KH2PO4 5. El intervalo de pH fue de 5,2 ± 0,2 (NH3/H2SO4), aireación a 1 vvm, agitación a 300-600 rpm, control antiespumante con Struktol y temperatura de 42°C. El tiempo de cultivo fue de 4 d. Después del cultivo las células y otros sólidos se eliminaron mediante centrifugación.
Para la purificación de la enzima, se cultivó ALKO4261 en un biorreactor de 10 litros (Braun Biostat® ED, Braun, Melsungen, Alemania) en el siguiente medio, g/litro: celulosa Solka Floc 30, bagazo de destilería 10, xilano de espelta de avena 5, CaCO3 2, harina de soja 10, salvado de trigo 3,0, (NH4)2SO4 5, KH2PO4 5, MgSO4·7H2O 0,5, NaCl 0,5, KNO3 0,3, solución de elementos traza Núm. 1 0,5 y disolución de elementos traza Núm. 2 0,5. El intervalo de pH fue de 5,2 ± 0,2 (NH3/H2SO4), aireación a 1 vvm, agitación a 200-600 rpm, control antiespumante con Struktol y temperatura de 42°C. El tiempo de cultivo fue de 5 d. Se cultivó un segundo lote en condiciones similares excepto que se añadió Solka Floc a 40 g/I y bagazo a 15 g/l. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania). El último sobrenadante se concentró aproximadamente diez veces utilizando el sistema ultrafiltración Pellicon Mini (filtro NMWL de 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).
Para la purificación de la enzima, ALKO4265 también se cultivó en un biorreactor de 10 litros (Braun Biostat® ED, Braun, Melsungen, Alemania) en el mismo medio que antes, excepto que se añadió KH2PO4 a 2,5 g/I. El intervalo de pH fue de 5,3 ± 0,3 (NH3/H3PO4), aireación a 0,6 vvm, agitación a 500 rpm, control antiespumante con Struktol y temperatura de 43°C. El tiempo de cultivo fue de 7 d. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania). El último sobrenadante se concentró aproximadamente 20 veces utilizando el sistema de ultrafiltración Pellicon Mini (filtro NMWL de 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).
Ejemplo 2. Purificación y caracterización de celobiohidrolasas de Acremonium thermophilum ALKO4245 y Chaetomium thermophilum ALKO4265
Se cultivaron Acremonium thermophilum ALKO4245 y Chaetomium thermophilum ALKO4265 como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las principales celobiohidrolasas se purificaron utilizando una columna de afinidad basada en paminobencil-1-tio-β-celobiósido, preparada como describen Tomme et al.,1988.
Los sobrenadantes del cultivo se tamponaron en primer lugar en tampón de acetato de sodio 50 mM de pH 5,0, que contenía δ-gluconolactona 1 mM y glucosa 0,1 M con el fin de retardar la hidrólisis del ligando en presencia de βglucosidasas. Las celobiohidrolasas se hicieron eluir con lactosa 0,1 M y finalmente se purificaron mediante cromatografía de filtración en gel utilizando columnas Superdex 200 HR 10/30 en el sistema ÄKTA (Amersham Pharmacia Biotech). El tampón utilizado en la filtración de gel fue fosfato de sodio 50 mM de pH 7,0, que contenía cloruro de sodio 0,15 M.
Las celobiohidrolasas purificadas se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se determinó que la masa molecular de ambas proteínas era de aproximadamente 70 kDa evaluada sobre la base de los patrones de masa molecular (Kit de calibración de bajo peso molecular, Amersham Biosciences). Las celobiohidrolasas de Acremonium y Chaetomium purificadas se denominaron Cel7A de At y Cel7A de Ct, respectivamente, siguiendo el esquema en Henrissat et al. (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993).
La actividad específica de las preparaciones se determinó utilizando 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL), 4metilumbeliferil-β-D-celobiósido (MUG2) o 4-metilumbeliferil-β-D-celotriósido (MUG3) como sustrato (van Tilbeurgh et al., 1988) en tampón de citrato sódico 0,05 M de pH 5 a 50°C durante 10 min. Las actividades endoglucanasa y xilanasa se determinaron mediante procedimientos normalizados (de acuerdo con la IUPAC, 1987) utilizando carboximetilcelulosa (CMC) y glucuronoxilano de abedul (Bailey et al., 1992) como sustratos. La actividad específica frente a Avicel se calculó sobre la base de los azúcares reductores formados en una reacción de 24 horas a 50°C, pH 5,0, con sustrato al 1% y dosificación de enzima 0,25 µM. El contenido de proteína de las preparaciones de enzima purificada se midió de acuerdo con Lowry et al., 1951. Para caracterizar los productos finales de la hidrólisis, los azúcares solubles liberados en 24 h en el experimento de hidrólisis, como se ha descrito anteriormente, se analizaron mediante HPLC (Dionex). La celobiohidrolasa purificada I (CBHI/Cel7A) de Trichoderma reesei se utilizó como referencia.
Las actividades específicas de las enzimas purificadas y la de CBHI/Cel7A de T. reesei se presentan en la Tabla 1. Las celobiohidrolasas Cel7A de At y Cel7A de Ct purificadas poseen actividades específicas superiores frente a sustratos sintéticos pequeños en comparación con CBHI/Cel7A de T. reesei. La actividad específica frente a Avicel fue claramente superior con las enzimas descritas en la presente memoria. Las actividades bajas de las preparaciones de enzima purificada frente a xilano y CMC pueden ser o debidas a las propiedades de las proteínas por sí mismas, o al menos parcialmente a las pequeñas cantidades restantes de enzimas contaminantes. El principal producto final de hidrólisis de la celulosa por todas las enzimas purificadas fue la celobiosa lo que es típico de las celobiohidrolasas.
Tabla 1. Actividades específicas (nkat/mg) de las celobiohidrolasas purificadas y la enzima de referencia de T. reesei (50°C, pH 5,0, 24 h).
Sustrato
ALKO4245 Cel7A de A. thermophilum ALKO4265 Cel7A de C. thermophilum Cel7A de T. reesei
Xilano
11,3 6,7 1,3
CMC
26,2 5,5 1,0
Mug2
9,2 18,9 4,3
Mug3
1,3 1,5 0,9
MUL
21,5 54,0 21,9
Avicel
1,8 1,4 0,6
La estabilidad térmica de las celobiohidrolasas purificadas se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de BSA al 0,1% a pH 5,0 durante 60 min utilizando 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido como sustrato. ALKO4265 CBH/Cel7A de C. thermophilum y ALKO4245 CBH/Cel7A de A. thermophilum fueron estables hasta 65° y 60°C, respectivamente. La enzima de referencia de T. reesei (CBHI/Cel7A) conservó 100% de la actividad hasta 55°C.
Ejemplo 3. Purificación y caracterización de una endoglucanasa de Acremonium thermophilum ALKO4245
Se cultivó Acremonium thermophilum ALKO4245 como se ha descrito en el Ejemplo 1. El sobrenadante de cultivo se incubó a 70°C durante 24 horas después de lo cual se concentró mediante ultrafiltración. La endoglucanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio catiónico seguida de filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato (Procedimiento de la IUPAC 1987). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo concentrado se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl FF equilibrada con tampón de fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con el gradiente lineal desde el tampón anterior a fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0. Las fracciones se recogieron y la actividad de endoglucanasa se determinó como se ha descrito anteriormente. La actividad endoglucanasa eluyó en una amplia zona de conductividad de 120 a 15 mS/cm.
Las fracciones combinadas se aplicaron a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 8 mM, pH 4,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,25 M en el tampón de equilibrado. La actividad endoglucanasa que contenía proteína se hizo eluir en la zona de conductividad de 3-7 mS/cm. Se repitió la cromatografía de intercambio catiónico y el eluato de la proteína se concentró mediante liofilización.
La muestra disuelta se cargó en una columna de filtración en gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La fracción principal de la proteína se hizo eluir de la columna con el volumen de retención de 13,3 ml. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 40 kDa. Se determinó que la actividad específica de la proteína purificada, designada como EG_40 de At, a 50°C era 450 de nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato CMC).
La estabilidad térmica de la endoglucanasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de 0,1 mg/ml de BSA a pH 5,0 durante 60 min utilizando carboximetilcelulosa como sustrato. A. thermophilum EG_40/Cel45A fue estable hasta 80°C. Las enzimas de referencia de T. reesei EGI (Cel7B) y EGII (Cel5A) conservaron 100% de la actividad hasta 60°C y 65°C, respectivamente.
Ejemplo 4. Purificación de una endoglucanasa de Chaetomium thermophilum ALKO4261
Se cultivó Chaetomium thermophilum ALKO4261 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La endoglucanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio catiónico seguida de filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato (procedimiento de la IUPAC 1987).
Se añadió sulfato amónico al sobrenadante de cultivo para alcanzar la misma conductividad que fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. La muestra se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. La elución se llevó a cabo con un gradiente lineal de fosfato de potasio de 20 a 0 mM, pH 6,0, seguido de fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0 y agua. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de urea de 0 a 6 M. Las fracciones se recogieron y la actividad endoglucanasa se analizó como se ha descrito anteriormente. La proteína que contiene actividad endoglucanasa se hizo eluir al principio del gradiente de urea.
Las fracciones se combinaron, se equilibraron a Tris-HCl 16 mM, pH 7,5 (I = 1,4 mS/cm) mediante una columna 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M en el tampón de equilibrado. Las fracciones se recogieron y analizaron para determinar la actividad endoglucanasa como se ha descrito anteriormente. La proteína se hizo eluir en el intervalo de 10-20 mS/cm.
La muestra se equilibró a acetato de sodio 15 mM, pH 4,5 mediante una columna 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 20 mM de pH 4,5. Las proteínas se hicieron eluir con un gradiente lineal de acetato de sodio de 0 a 0,4 M, pH 4,5. La actividad endoglucanasa eluyó en el intervalo de 1-10 mS/cm. La muestra recogida se liofilizó.
La muestra se disolvió en agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 6,0, que contenía NaCl 0,15 M. Las fracciones se recogieron y las que contenían actividad endoglucanasa se combinaron. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que la masa molecular sobre la base de patrones de masa molecular (patrones de SDS-PAGE preteñidos, Broad Range, Bio-Rad) era de 54 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada EG_54 de Ct con PhastSystem (Pharmacia) era aprox. 5,5.
Ejemplo 5. Purificación de una endoglucanasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALKO4242 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La endoglucanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio aniónico seguida de filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato (Procedimiento de la IUPAC 1987). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con (NH4)2SO4 0,2 M (I = 39 mS/cm). Las fracciones que contenían actividad endoglucanasa se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM, pH 7,0. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,4 M en el tampón de equilibrado. La proteína que contiene actividad endoglucanasa se hizo eluir en la zona de conductividad de 15-21 mS/cm. Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron como antes.
La muestra se aplicó a una columna de filtración en gel Sephacryl S-100 HR 26/60 equilibrada con tampón acetato de sodio 50 mM de pH 5,0, que contenía NaCl 0,05 M. La fracción de proteína que contenía actividad endoglucanasa se hizo eluir de la columna con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 16 kDa. Las fracciones recogidas se combinaron, se concentraron y se repitió la filtración en gel. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se consideró que el peso molecular era de 28 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada EG_28 de Ta, en un gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) era de aproximadamente 3,5. Se determinó que la actividad específica de EG_28 de Ta a 50°C era de 4290 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato CMC).
Ejemplo 6. Purificación y caracterización de una β-glucosidasa de Acremonium thermophilum ALKO4245
Se cultivó Acremonium thermophilum ALKO4245 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio aniónico seguida de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de Phenyl Sepharose FF de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado a fosfato de potasio 5 mM en la zona de conductividad de 137-16 mS/cm. Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con fosfato de potasio 10 mM de pH 7,0. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado al mismo tampón que contenía NaCl 0,25 M en la zona de conductividad de 1,5-12 mS/cm. La cromatografía de intercambio aniónico se repitió como antes, excepto que se utilizó tampón de fosfato de potasio 4 mM de pH 7,2 mM. Las proteínas se hicieron eluir a la zona conductividad de 6-9 mS/cm. Las fracciones que contenían actividad de β-glucosidasa se recogieron, se combinaron y se concentraron.
El material activo de la cromatografía de intercambio aniónico se aplicó a una columna HR 26/60 Sephacryl S-300 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 6,5, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína con actividad βglucosidasa se hizo eluir con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 243 kDa. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 101 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada A βG_101, en un gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) estaba en la zona de 5,6-4,9. Se determinó que la actividad específica de βG_101 de At a 50°C era de 1100 nkat/mg (utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato, Bailey y Linko, 1990).
La estabilidad térmica de la β-glucosidasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de 0,1 mg/ml de BSA a pH 5,0 durante 60 min utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato. La βG_101 de A. thermophilum fue estable hasta 70°C. La enzima de referencia de Aspergillus (Novozym 188) conservó 100% de la actividad hasta 60°C.
Ejemplo 7. Purificación de una β-glucosidasa de Chaetomium thermophilum ALKO4261
Se cultivó Chaetomium thermophilum ALKO4261 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio aniónico y catiónico seguida de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990).
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,8 M. La elución se llevó a cabo con
un gradiente lineal desde tampón de equilibrado a fosfato de potasio 3 mM, pH 6,0, seguido de elución con agua y urea 6 M. Las primeras fracciones con actividad β-glucosidasa se hicieron eluir en la zona de conductividad de 80-30 mS/cm. La segunda actividad β-glucosidasa se hizo eluir con urea 6 M. Las fracciones activas eluidas mediante urea se reunieron y se desalaron en columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con Tris-HCl 10 pH 7,0.
Después de la eliminación de las sales, la muestra se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM de pH 7,0. La proteína no se unió a la columna, sino que eluyó durante la introducción de la muestra. Esta fracción de flujo directo se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con acetato de Na 7 mM, pH 4,5.
La muestra de la cromatografía de intercambio aniónico se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP FF equilibrada con acetato de sodio 10 mM de pH 4,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de acetato de sodio de 10 mM a 400 mM, pH 4,5. Se recogieron las fracciones con actividad β-glucosidasa que eluyeron en la zona de conductividad de 6,5 a 12 mS/cm, se desalaron en columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con acetato de sodio 7 mM, pH 4,5 y se liofilizaron.
La muestra liofilizada se diluyó hasta 100 µl de agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HF10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 4,5, que contenía NaCl 0,15 M. La actividad β-glucosidasa se hizo eluir a un volumen de retención de 13,64 ml. Las fracciones recogidas se combinaron, se liofilizaron y se disolvieron en agua. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se consideró que el peso molecular era de 76 kDa. La proteína se denominó βG_76 de Ct.
Ejemplo 8. Purificación y caracterización de una β-glucosidasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALKO4242 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio aniónico y catiónico seguida de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990). El contenido de proteína se midió por BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de (NH4)2SO4 0,2 M a fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0. La actividad β-glucosidasa se hizo eluir durante el gradiente en la zona conductividad de 28,0 a 1,1 mS/cm. Las fracciones se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 20 mM de pH 7,0. La enzima se hizo eluir con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,2 M en el tampón de equilibrado y con elución retardada mediante Tris-HCl 20 mM, que contenía NaCl 0,4 M. La muestra que eluyó en la zona de conductividad de aprox. 10-30 mS/cm se concentró mediante ultrafiltración y se desaló mediante una columna 10DG (Bio-Rad).
La muestra se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 9 mM de pH 4,5. La enzima se hizo eluir con un gradiente lineal de NaAc 10 mM a 400 mM y mediante elución retardada utilizando NaAc 400 mM de pH 4,5. Las proteínas con actividad β-glucosidasa se hicieron eluir ampliamente durante el gradiente lineal en la zona de conductividad de 5,0 a 11,3 mS/cm.
El material activo de la cromatografía de intercambio catiónico se aplicó a una columna Sephacryl S-300 HR 26/60 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína con actividad βglucosidasa se hizo eluir con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 294 kDa. Las fracciones recogidas se combinaron, se liofilizaron y se disolvieron en agua. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se consideró que el peso molecular era de 81 kDa, que representaba muy probablemente la forma monomérica de la proteína. El enfoque isoeléctrico (IEF) se llevó a cabo utilizando un gel de pl 3-9. Después de la tinción con plata, se tiñó una amplia zona por encima de pl 5,85, además de una banda estrecha que correspondía a pl de 4,55. Se determinó que la actividad específica de la proteína purificada, denominada βG_81 de Ta, a 50°C era de 600 nkat/mg utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990).
La estabilidad térmica de la β-glucosidasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de 0,1 mg/ml de BSA a pH 5,0 durante 60 min. utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato. La βG_81 de T. aurantiacus fue estable hasta 75°C. El enzima de referencia de Aspergillus (Novozym 188) conservó 100% de la actividad hasta 60°C.
Ejemplo 9. Purificación de una xilanasa de Acremonium thermophilum ALKO4245
Se cultivó Acremonium thermophilum ALKO4245 como se ha descrito en el Ejemplo 1. El sobrenadante del cultivo se incubó a 70°C durante 24 horas después de lo cual, se concentró mediante ultrafiltración. La xilanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio catiónico
seguida de filtración en gel. La actividad xilanasa se determinó utilizando como sustrato xilano de abedul (Procedimiento de la IUPAC 1987). La proteína se analizó mediante BioRad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo concentrado se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl FF equilibrada con tampón de fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con el gradiente lineal desde el tampón anterior a fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0. La fracción de proteína se hizo eluir en una amplia zona de conductividad de 120 a 15 mS/cm.
La muestra de la columna de interacción hidrófoba se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 8 mM, pH 4,5. La proteína no se unió a esta columna, sino que eluyó en el flujo directo durante la introducción de la muestra. Este eluato se concentró mediante ultrafiltración. La cromatografía hidrófoba se repitió como se ha descrito anteriormente. Las proteínas no unidas se recogieron y se liofilizaron.
La muestra disuelta se cargó en la columna de filtración en gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. Se estimó que la proteína eluida de la columna con el volumen de retención de 11,2 ml era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se consideró que la masa molecular de la proteína purificada sobre la base de los patrones de masa molecular (patrones SDS-PAGE teñidos previamente, Intervalo Amplio, Bio-Rad) era de 60 kDa. Se determino que la actividad específica de la proteína, denominada XYN_60 de At, a 50°C era de 1800 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato xilano de abedul). La actividad relativa aumentó aproximadamente 1,2 veces a 60°C y 1,65 veces a 70°C (10 min, pH 5,0) en comparación con 50°C. Las actividades específicas contra MUG2 (4-metilumbeliferil-β-Dcelobiósido), MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido) y MUG3 (4-metilumbeliferil-β-D-celotriósido) fueron de 54, 33 y 78 nkat/mg (50°C, pH 5,0, 10 min), respectivamente. Esto está de acuerdo con el hecho de que las xilanasas de la familia 10 también muestran actividad contra los arilglucopiranósidos (Biely et al. 1997).
Ejemplo 10. Purificación de una xilanasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALKO4242 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La xilanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio aniónico y catiónico seguida de filtración en gel. La actividad xilanasa se determinó utilizando como sustrato xilano de abedul (Procedimiento de la IUPAC 1987). La proteína se analizó mediante BioRad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un protocolo de elución de dos etapas. La elución se llevó a cabo dejando caer primero la concentración de sal a (NH4)2SO4 0,2 M y después de eso se aplicó un gradiente lineal de fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,2 M a fosfato de potasio 5 mM de pH 6,0. La proteína se hizo eluir con (NH4)2SO4 0,2 M (I = 39 mS/cm).
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM, pH 7,0. La proteína no se unió a la columna de intercambio aniónico sino que eluyó en el flujo directo. La conductividad de la muestra se ajustó para que correspondiera a la de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 mediante adición de agua y el pH se ajustó a 4,5 durante la concentración mediante ultrafiltración.
La muestra se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 20 mM, pH 4,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado al mismo tampón que contenía NaCl 1 M. La enzima se hizo eluir en la zona de conductividad de 1-7 mS/cm. La muestra se liofilizó y después de eso se disolvió en agua.
La muestra liofilizada se disolvió en agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína se hizo eluir de la columna con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 26 kDa. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. La masa molecular de la proteína pura fue de 30 kDa según se evaluó sobre la base de patrones de masa molecular (patrones de SDS-PAGE teñidos previamente, Intervalo Amplio, Bio-Rad). Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada XYN_30 de Ta con PhastSystem (Pharmacia) era de aprox. 6,8. Se determinó que la actividad específica de XYN_30 de Ta a 50°C era de 4800 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato xilano de abedul).
Ejemplo 11. Secuenciación de aminoácidos internos
Los péptidos internos se secuenciaron mediante ionización por electropulverización combinada con espectrometría de masas en tándem (ESI-MS/MS) utilizando un aparato Q-TOF1 (Micromass). La proteína se alquiló primero y se digirió en péptidos trípticos. Los péptidos generados se desalaron y se separaron parcialmente mediante nanocromatografía líquida (de fase inversa) antes de aplicarlos al aparato Q-TOF1. Las secuencias de los péptidos internos para las celobiohidrolasas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se muestran en la
Tabla 2. Los péptidos de CBH de Chaetomium se obtuvieron después de haber clonado el correspondiente gen CBH. Los péptidos determinados de CBH de Acremonium no se utilizaron en la clonación del gen correspondiente.
Tabla 2. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de CBH (1_C - 4_C) de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y de CBH (1_A - 4_A) de Acremonium thermophilum ALKO4245.
5 I/L = la leucina y la isoleucina tienen la misma masa molecular y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS, Q/K = la masa molecular de la glutamina y la lisina difiere solo en 0,036 Da y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS.
Las secuencias de péptidos internos de las endoglucanasas, β-glucosidasas y xilanasas purificadas de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242 se
10 enumeran en la Tabla 3, la Tabla 4 y la Tabla 5.
Tabla 3. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de las endoglucanasas EG_40 de Acremonium thermophilum ALK04245, EG_54 de Chaetomium thermophilum ALKO4261 y EG_28 de Thermoascus aurantiacus ALK04242.
(a I/L = la leucina y la isoleucina tienen la misma masa molecular y no se pueden distinguir en el análisis ESI15 MS/MS, Q/K = la masa molecular de la glutamina y la lisina difiere solo en 0,036 Da y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS. 19
Tabla 4. Secuencias de péptidos internos determinados a partir de las beta-glucosidasas βG_101 de Acremonium thermophilum ALK04245, βG_76 de Chaetomium thermophilum ALKO4261 y βG_81 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Proteína
Péptido Secuencia(a
βG_101 de At
Péptido 1 S P F T W G P T R
Péptido 2 V V V G D D A G N P C
Péptido 3 A F V S Q L T L L E K
Péptido 4 G T D V L/I Y T P N N K
Péptido 5 Q P N P A G P N A C V L/I R
βG_76 de Ct
Péptido 1 E G L F I D Y R
Péptido 2 P G Q S G T A T F R
Péptido 3 E T M S S N V D D R
Péptido 4 I A L V G S A A V V
Péptido 5 M W L C E N D R
Péptido 6 Y P Q L C L Q D G P L G I R
Péptido 7 E L N G Q N S G Y P S I
βG_81 de Ta
Péptido 1 T P F T W G K
Péptido 2 L C L Q D S L P G V R
Péptido 3 G V D V Q L G P V A G V A P R
Péptido 4 V N L T L E
Péptido 5 F T G V F G E D V V G
Péptido 6 N D L P L T G Y E K
(a I/L = la leucina y la isoleucina tienen la misma masa molecular y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS
5 Tabla 5. Secuencias de péptidos internos determinados a partir de las xilanasas XYN_60 de Acremonium thermophilum ALK04245 y XYN_30 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Proteína
Péptido Secuencia
XYN_60 de At
Péptido 1 Y N D Y N L E Y N Q K
Péptido 2 F G Q V T P E N
Péptido 3 V D G D A T Y M S Y V N N K
Péptido 4 K P A W T S V S S V L A A K
Péptido 5 S Q G D I V P R A K
XYN_30 de Ta
Péptido 1 V Y F G V A T D Q N R
Péptido 2 N A A I I Q A D F G Q V T P E N S M K
Péptido 3 G H T L V W H S Q L P S W V S S I T D K
Péptido 4 N H I T T L M T R
Péptido 5 A W D V V N E A F N E D G S L R
Péptido 6 L Y I N D Y N L D S A S Y P K
Péptido 7 A S T T P L L F D G N F N P K P A Y N A I V Q D L Q Q
Péptido 8 Q T V F L N V I G E D Y I P I A F Q T A R

Ejemplo 12. Construcción de bibliotecas genómicas para Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum
Se prepararon las bibliotecas genómicas de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 para el vector Lambda DASH®II (Stratagene, USA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los ADN cromosómicos, aislados por el método de Raeder y Broda (1985), se digirieron parcialmente con Sau 3A. Los ADN digeridos también se fraccionaron por tamaños y los fragmentos del tamaño seleccionado (≈ 5-23 kb) se desfosforilaron y se ligaron a los brazos del vector lambda digerido con BamHI. Las mezclas de ligación se empaquetaron utilizando extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene, USA). Los títulos de las bibliotecas genómicas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum fueron de 3,6 x 106 pfu/ml y 3,7 x 105 pfu/ml y los de las bibliotecas amplificadas fueron de 6,5 x 1010 pfu/ml y de 4,2 x 108 pfu/ml, respectivamente.
Se utilizó Lambda FIX® II/Xho I Partial Fill-In Vector Kit (Stratagene, USA) en la construcción de las bibliotecas genómicas para Thermoascus aurantiacus ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALKO4261 de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los ADN cromosómicos, aislados mediante el método de Raeder y Broda (1985), se digirieron parcialmente con Sau3A. Los ADN digeridos se fraccionaron por tamaños y los fragmentos del tamaño seleccionado (≈ 6-23 kb) se rellenaron y se ligaron a los brazos del vector Lambda FIX II digerido con XhoI. Las mezclas de ligación se empaquetaron utilizando extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene, USA). Los títulos de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALKO4261 fueron de 0,2 x 106 y 0,3 x 106 pfu/ml y los de las bibliotecas amplificadas fueron de 1,8 x 109 y 3,8 x 109 pfu/ml, respectivamente.
Ejemplo 13. Clonación de los genes de celobiohidrolasa (CBH/cel7) de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum
Se utilizaron los métodos de biología molecular convencionales en el aislamiento y los tratamientos con enzima del ADN (plásmidos, fragmentos de ADN), en las transformaciones de E. coli, etc. Los métodos básicos utilizados se describen en los manuales de biología molecular convencionales, p. ej., Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001).
Las sondas para el escrutinio de las bibliotecas genómicas que se habían construido como se ha descrito en el Ejemplo 12 se amplificaron mediante PCR utilizando los ADN genómicos de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 como moldes en las reacciones. Varios cebadores sometidos a ensayo en reacciones de PCR se diseñaron de acuerdo con la secuencia de nucleótidos publicada (documento WO 03/000941, Hong et al., 2003b). Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, cada cebador 5 mM y 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y ≈0,5-1 µg del ADN genómico. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, o bien 1 min de recocido a 62°C (gradiente de ± 8°C) para los moldes de Thermoascus ALKO4242 y Chaetomium ALKO4265 o 1 min de recocido a 58°C (gradiente de ± 6°C) para el molde de Acremonium ALKO4245, 2 min de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 min.
Los productos de ADN de los tamaños esperados (calculados a partir de las secuencias de CBH publicadas) se obtuvieron de todos los moldes genómicos utilizados. Los fragmentos de ADN de los tamaños esperados se aislaron de las reacciones de PCR más específicas y se clonaron en el vector pCR® Blunt-TOPO® (Invitrogen, USA). Los insertos se caracterizaron mediante secuenciación y llevando a cabo hibridaciones de transferencia Southern para los ADN genómicos digeridos con varias enzimas de restricción. Los fragmentos de PCR, que se eligieron para ser utilizados como sondas para el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6. Cebadores utilizados en las reacciones de PCR y sondas seleccionadas para el escrutinio de los genes CBH/cel7 de las bibliotecas genómicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum. Se muestran el ADN molde genómico y el nombre del plásmido que contiene el fragmento sonda.
Gen
Cebador directo Cebador inverso DNA molde Fragmento (kb) Plásmido
cbh de Ta
TCEL11 atgcgaactggcgttgggtcc TCEL12 gaatttggagctagtgtcgacg Thermoascus ALKO4242 0,8 kb pALK1633
cbh de Ct
TCEL7 cgatgccaactggcgctggac TCEL8 ttcttggtggtgtcgacggtc Chaetomium ALKO4265 0,8 kb pALK1632
cbh de At
TCEL13 agctcgaccaactgctacacg TCEL4 accgtgaacttcttgctggtg Acremonium ALKO4245 0,7 kb pALK1634
Las secuencias de aminoácidos deducidas de todas estas sondas tenían homología con varias secuencias publicadas de CBH (programa BLAST, versión 2.2.9 del NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul. et al, 1990), de la familia 7 de glicósido hidrolasas (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993).
Los insertos de los plásmidos enumerados en la Tabla 6 se marcaron con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania), y las bibliotecas genómicas amplificadas (2 x 105 - 3 x 105 placas) se escrutaron con los fragmentos sonda marcados. La temperatura de hibridación para los filtros fue de 68°C y los filtros se lavaron 2 x 5 min a RT utilizando 2 x SSC - SDS al 0,1% seguido de 2 x 15 min a 68°C utilizando 0,1 x SSC
-
SDS al 0,1% con las sondas homólogas utilizadas. Se obtuvieron varias placas positivas a partir de cada una de las hibridaciones. En el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Acremonium ALKO4245, algunas de las placas positivas hibridaron fuertemente con la sonda en cuestión, pero, además, hubo una cantidad de placas que hibridaron más débilmente con las sondas. Esto sugirió que otro u otros genes de celobiohidrolasa podrían estar presentes en el genoma, causando una reacción cruzada. Se purificaron de cuatro a cinco placas que hibridaron fuertemente a partir de los escrutinios de las bibliotecas genómicas de Thermoascus ALKO4242 y Chaetomium ALKO4265. En el caso de Acremonium thermophilum ALKO4245, cuatro de las seis placas purificadas hibridaron débilmente con la sonda utilizada. Los ADN de fagos se aislaron y se caracterizaron mediante hibridaciones de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción seleccionados que hibridaron con la sonda se subclonaron con el vector pBluescript II KS+ y se secuenciaron las regiones relevantes de los clones.
En total, se clonaron cuatro genes cbh/cel7; uno de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, uno de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y dos de Acremonium thermophilum ALKO4245 (en la fase temprana del trabajo, estos tenían los códigos At_cbh_C At_cbh_A y, a continuación, se denominaron At cel7 A y cel7B de At, respectivamente). La Tabla 7 resume la información sobre las sondas utilizadas para los escrutinios de los genes, los clones de fagos a partir de los cuales se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contenían los genes completos con sus regiones promotoras y terminadoras, los nombres de los plásmidos, y los números de depósito DSM para las cepas de E. coli que portaban estos plásmidos.
Tabla 7. Sondas utilizadas para la clonación de los genes cbhlcel7, el clon de fago y los subclones seleccionados, el número de plásmido y el número de depósito de la correspondiente cepa de E. coli.
Gen
Sonda utilizada en el escrutinio Clon de fago Fragmento subclonado en pBluescript II Número de plásmido Núm. de depósito de E. coli
Cel7A de Ta
pALK1633 F12 XbaI de 3,2 kb pALK1635 DSM 16723
Cel7A de Ct
pALK1632 F36 PvuI - HindIII de 2,3 kb pALK1642 DSM 16727
cel7B de At
pALK1634 F6 EcoRI de 3,1 kb pALK1646 DSM 16728
Cel7A de At
pALK1634 F2 XhoI de 3,4 kb pALK1861 DSM 16729
La información relevante sobre los genes y las secuencias de proteínas deducidas (SEQ ID NO: 1-8) se resumen en la Tabla 8 y la Tabla 9, respectivamente.
Las secuencias de péptidos de las proteínas CBH purificadas de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 (Tabla 2) se encontraron partir de las secuencias de aminoácidos deducidas de los clones que contenían los genes Cel7A de Ct y Cel7A de At. Por lo tanto, se pudo concluir que los genes que codificaban las proteínas CBH/Cel7 purificadas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se habían clonado.
Tabla 8. Resumen de los genes cbh/cel7 aislados de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245.
Gen Cbh
Longitud con intrones (pb)(a Región codificante (pb)(b Núm. de intrones Longitudes de los intrones (pb) SEQ ID NO:
Cel7A de Ta
1439 1371 1 65 1
Cel7A de Ct
1663 1596 1 64 7
cel7B de At
1722 1377 3 134, 122, 87 3
Gen Cbh
Longitud con intrones (pb)(a Región codificante (pb)(b Núm. de intrones Longitudes de los intrones (pb) SEQ ID NO:
Cel7A de At
1853 1569 4 88, 53, 54, 86 5
(a Está incluido el codón de PARADA. (b No está incluido el codón de PARADA.
Tabla 9. Resumen de las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de los genes cbhlcel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK4265 y Acremonium thermophilum ALK04245. ss, secuencia señal.
Proteína CBH
Núm. de aa Longitud de ss NN/HMM(a CBD Cterminal (b PM pronosticado (Da, no incluida ss)(c pl pronosticado (no incluida ss) Supuestos sitios de N-glicosilación (d SEQ ID NO:
Cel7A de Ta
457 17/17 NO 46873 4,44 2 2
Cel7A de Ct
532 18/18 SI, T497 a L532 54564 5,05 3 8
Cel7B de At
459 21/21 NO 47073 4,83 2 4
Cel7A de At
523 17/17 SI, Q488 a L523 53696 4,67 4 6
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen. et al, 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y el valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov.
(b Se indican el dominio de unión a celulosa (CBD), los aminoácidos de la región CBD C-terminal (M1 (se incluye en la numeración la Met Núm. 1))
(c No se incluyó la secuencia señal pronosticada. La predicción fue hecha utilizando la herramienta Compute pl/MW del servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003).
(d Número de secuencias NXS/T.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de Cel7A de Thermoascus aurantiacus y Cel7A de Acremonium thermophilum (núcleo, sin el CBD) eran muy homólogas entre sí (analizadas mediante el alineamiento global de Needleman-Wunsch, EMBOSS 3.0.0 Needle, con Matrix EBLOSUM62, Penalización por Hueco 10,0 y Penalización por extensión 0,5; Needleman y Wunsch, 1970). Además, la Cel7A de Acremonium thermophilum deducida tenía una identidad menor con la Cel7A de Chaetomium thermophilum deducida. La Cel7B de Acremonium thermophilum fue muy distinta de las secuencias de CBH/Cel7 descritas aquí.
La secuencia de Cel7A de Chaetomium deducida poseía las identidades más altas (analizadas mediante alineamiento global de Needleman-Wunsch, EMBOSS Needle, véase más arriba) con los polipéptidos de CBHI de Chaetomium thermophilum, Scytalidium thermophilum y Thielavia australiensis describos en el documento WO 03/000941. Del mismo modo, la secuencia de Cel7A de Thermoascus aurantiacus deducida era altamente idéntica a la de CBHI publicada de Thermoascus aurantiacus (documento WO 03/000941, Hong et al., 2003b). Cel7B de Acremonium thermophilum tenía identidades significativamente inferiores a las secuencias previamente publicadas, estando más estrechamente relacionada con el polipéptido de CBHI de Oryza sativa. Los mayores homologías de la secuencia de Cel7A de Acremonium thermophilum deducida fueron con los polinucleótidos de CBHI de Exidia gladulosa y Acremonium thermophilum (documento WO 03/000941). El alineamiento indica que las secuencias clonadas de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 codifican las proteínas CBH que tienen alta homología con los polipéptidos de la familia 7 de glicósido hidrolasas, por lo tanto, éstas se denominaron Cel7A o Cel7B (Henrissat et al. 1998).
La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes CBH/cel 7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 y Thielavia entre sí, y adicionalmente con las secuencias encontradas en las bases de datos, se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Secuencias con una homología más alta con las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes CBH/cel 7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK04265 y Acremonium thermophilum ALK04245. El alineamiento se realizó utilizando el alineamiento global Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, Penalización por huevo 10,0, Penalización por extensión 0,5). * indica una secuencia de
aminoácidos derivada de uno de los genes celobiohidrolasa clonados en este trabajo. 'Central' indica el alineamiento sin el CBD.
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
*Thermoascus aurantiacus Cel7A
100,0
Thermoascus aurantiacus, AY840982
99,6
Thermoascus aurantiacus, AX657575
99,1
Thermoascus aurantiacus, AF421954
97,8
Talaromyces emersonii, AY081766
79,5
Chaetomidium pingtungium, AX657623
76,4
Trichophaea saccata, AX657607
73,4
*Acremonium thermophilum Cel7A (núcleo)
70,6
Emericella nidulans, AF420020 (núcleo)
70,4
*Chaetomium thermophilum Cel7A (núcleo)
66,4
*Chaetomium thermophilum Cel7A
100,0
Chaetomium thermophilum, AY861347
91,9
Chaetomium thermophilum, AX657571
91,7
Scytalidium thermophilum, AX657627
74,7
Thielavia australiensis, AX657577
74,6
Acremonium thermophilum, AX657569
72,3
Exidia glandulosa, AX657613
68,0
*Acremonium thermophilum Cel7A
66,9
*Thermoascus aurantiacus Cel7A (núcleo)
66,4
Exidia glandulosa, AX657615
60,8
Chaetomium pingtungium, AX657623
60,7
*Acremonium thermophilum Cel7B (núcleo)
60,2
*Acremonium thermophilum Cel7B
100,0
Oryza sativa, AK108948
66,1
Exidia glandulosa, AX657615
65,0
Acremonium thermophilum, AX657569 (núcleo)
64,8
Thermoascus aurantiacus, AX657575
64,8
*Acremonium thermophilum Cel7A
64,6
*Thermoascus aurantiacus Cel7A
64,4
Trichophaea saccata, AX657607
63,6
*Chaetomium thermophilum Cel7A (núcleo)
60,2
*Acremonium thermophilum Cel7A
100,0
Exidia glandulosa, AX657613
77,9
Exidia glandulosa, AX657615
77,9
Acremonium thermophilum, AX657569
77,5
Thielavia australiensis, AX657577
71,0
*Thermoascus aurantiacus Cel7A (núcleo)
70,6
Scytalidium thermophilum, AX657627
67,5
Chaetomium thermophilum, AX657571
67,5
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
Chaetomium pingtungium, AX657623
67,3
*Chaetomium thermophilum Cel7A
66,9
*Acremonium thermophilum Cel7B (núcleo)
64,6
Ejemplo 14. Producción de proteínas CBH/Cel7 recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus (Cel7A de Ta), Chaetomium thermophilum (Cel7A de Ct) y Acremonium thermophilum (Cel7A de At, Cel7B de At; en la fase inicial del trabajo estas proteínas tenían los códigos temporales CBH_C de At y CBH_A de At, respectivamente). Los plásmidos de expresión construidos se enumeran en la Tabla 11. Los genes cbhlcel7 recombinantes, incluyendo sus propias secuencias señal, se fusionaron exactamente con el promotor de cbh1 (cel7A) de T. reesei mediante PCR. La terminación de la transcripción se garantizó por medio del terminador de cel7A de T. reesei y el gen marcador amdS de A. nidulans se utilizó para la selección de los transformantes como describen Paloheimo et al. (2003). Los casetes de expresión lineal (Fig. 2), se aislaron de las cadenas principales del vector después de la digestión con EcoRI y se transformaron en protoplastos A96 y A98 de T. reesei (ambas cepas tienen suprimidos los genes que codifican las cuatro celulasas principales CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A). Las transformaciones se realizaron como en Penttilä et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993), seleccionando con acetamida como única fuente de nitrógeno. Los transformantes se purificaron sobre placas de selección a través de conidios individuales antes de su esporulación sobre PD.

Tabla 11. Casetes de expresión construidos para producir las proteínas CBH/Cel7 de Thermoascus aurantiacus ALK04242 (Cel7A de Ta), Chaetomium thermophilum ALKO4265 (Cel7A de Ct), y Acremonium thermophilum ALKO4245 (Cel7A de At, Cel7B de At) en Trichoderma reesei. La estructura general de los casetes de expresión fue la descrita en la Fig. 2. Los genes cbhlcel7 clonados se fusionaron exactamente con el promotor cbh1/cel7A de T. reesei.
CBH/Cel7
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a terminador de cel7A(b
Cel7A de Ta
pALK1851 9,0 kb 245 pb (XbaI)
Cel7A de Ct
pALK1857 9,2 kb 240 pb (HindIII)
Cel7B de At
pALK1860 9,4 kb 361 pb (EcoRI)
Cel7A de At
pALK1865 9,5 kb 427 pb (EcoRV)
(a El casete de expresión para la transformación de T. reesei se aisló de la cadena principal del vector utilizando la digestión con EcoRI.
(b Número de nucleótidos de la región terminadora de cbh1/cel7A genómico después del codón de parada. El sitio de restricción en el extremo 3' , utilizado en la escisión del fragmento de gen genómico, se incluye en el paréntesis.
La producción de CBH/Cel7 de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 días a 28°C en un medio inductor de celulasa a base de complejo de lactosa (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2PO4 al 5%. La actividad celobiohidrolasa se analizó utilizando sustrato de 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) de acuerdo con van Tilbeurghet al., 1988. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron utilizando transferencias Southern en las que se incluyeron varios productos digeridos genómicos y el casete de expresión respectivo se utilizó como sonda. Se analizó la expresión heteróloga de las proteínas Cel7A de Ta, Cel7A de Ct, Cel7A de At y Cel7B de At mediante SDS-PAGE con la posterior tinción de Coomassive. Las conclusiones de que no se pudiera detectar ninguna actividad celobiohidrolasa o la producción de proteína heteróloga en SDS-PAGE para los transformantes de Cel7B de At que contenía el casete de expresión integrado, sugieren que Cel7B de At es producida por debajo de los niveles de detección en Trichoderma utilizando el diseño experimental descrito.
Las preparaciones de enzima CBH/Cel7 recombinante se caracterizaron en términos de pH óptimo y de estabilidad térmica. El pH óptimo de las proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum, y Acremonium thermophilum se determinó en el tampón universal de McIIvaine dentro de un intervalo de pH de 3,0-8,0 utilizando 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) como sustrato (Fig. 3A). El pH óptimo para las enzimas Cel7A de Ct y Cel7A de At se encuentra en 5,5, por encima del cual la actividad comienza a disminuir gradualmente. El pH óptimo de Cel7A de Ta bruta recombinante se encuentra en 5,0 (Fig. 3A). La estabilidad térmica de las enzimas Cel7 recombinantes se determinó midiendo la actividad MUL en tampón universal de McIIvaine, al pH óptimo con un tiempo de reacción de 1 h. Como se muestra a partir de los resultados Cel7A de Ta y Cel7A de Ct conservaron más de 60% de sus actividades a 70°C, mientras que Cel7A de At demostró claramente ser menos estable a las temperaturas más altas (≥65°C) (Fig. 3B).
Los transformantes de CBH/Cel7 seleccionados se cultivaron biorreactores de laboratorio a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con un pH de control de 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtener material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania).
Ejemplo 15. Producción de las proteínas de fusión Cel7A + CBD de Thermoascus aurantiacus recombinante en T. reesei
Se fusionó Cel7A de Thermoascus aurantiacus (AF478686, Hong et al., 2003b; SEQ ID NO: 1) con el conector y CBD de CBHI/Cel7A de Trichoderma reesei (AR088330, Srisodsuk et al. 1993) (= CBD de Tr), seguido de la producción de la proteína de fusión (SEQ ID NO: 28 que corresponde al ácido nucleico del SEQ ID NO: 27) en T. reesei como se describe en FI20055205/US 11/119526; presentado el 29 de Abril 2005. Además, Cel7A de Thermoascus aurantiacus se fusionó con el conector y el CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum (SEQ ID NO: 7) (CBD de Ct). Para ello, se sintetizaron la secuencia codificante del conector y el CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:
5'-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTC-GACCGTCCCTGGCCTTGAC-3' (secuencia directa)
y
5'-TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTCCAGCAAATCAGGG-AACTG-3' (secuencia inversa).
La mezcla de reacción de PCR contenía 1 x tampón de reacción de DyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), Mg2+ 15 mM, dNTP 0,2 mM, 2 µM de cada cebador, 0,6 unidades de ADN polimerasa DyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), y aproximadamente 75 ng/30 µl de ADN molde, que contenía el gen cel7A completo de Chaetomium thermophilum. Las condiciones para la reacción de PCR fueron las siguientes: 2 min. de desnaturalización inicial a 98°C, seguido de 30 ciclos de 30 seg. a 98°C, 30 seg. de recocido a 68°C (gradiente de ± 4°C), 30 segundos de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 min. El fragmento de ADN específico en la reacción de PCR se obtuvo a un intervalo de temperatura de recocido entre 64°C a 68,5°C. El fragmento CBD sintetizado de Chaetomium thermophilum se ligó después del gen cel7A de Thermoascus aurantiacus dando como resultado un punto de unión de GPIGST entre los dominios. El fragmento amplificado por PCR del plásmido se confirmó mediante secuenciación (SEQ ID NO: 29). El gen fusión cel7A construido se fusionó exactamente al promotor de cbh1 (cel7A) de T. reesei. La terminación de la transcripción se aseguró por medio del terminador de cel7A de T. reesei y se utilizó el gen marcador amdS de A. nidulans para la selección de los transformantes como se describe en Paloheimo et al. (2003).
El casete de expresión lineal se aisló de la cadena principal del vector después de la digestión con NotI y se transformó en protoplastos A96 de T. reesei. Las transformaciones se realizaron como en Penttilä et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993), con la selección de acetamida como única fuente de nitrógeno. Los transformantes se purificaron en placas de selección a través de conidios individuales antes de la su esporulación sobre PD.
Se analizó la producción Cel7A + CBD (SEQ ID NO. : 28 y 30) de Thermoascus aurantiacus de los transformantes a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 días en un medio inductor de celulasa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con 5% de KH2PO4 a pH 5,5. La actividad de celobiohidrolasa se analizó utilizando sustrato de 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) de acuerdo con van Tilbeurgh et al., 1988. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron utilizando transferencias Southern en las que se habían incluido diversos productos digeridos genómicos y el casete de expresión se utilizó como sonda. Los análisis de SDS-PAGE mostraron que las enzimas Cel7A + CBD de Thermoascus aurantiacus recombinante se habían producido en forma de proteínas de fusión estables en T. reesei.
El transformante seleccionado que producía la proteína de fusión Cel7A de Ta + CBD de Tr (SEQ ID NO: 28) también se cultivó en un biorreactor 2 litros a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con control de pH a 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtener material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania).
Ejemplo 16. Comparación de las constantes de Michaelis-Menten y de inhibición de celobiosa de celobiohidrolasas recombinantes purificadas
Las constantes de Michaelis-Menten y de inhibición de la celobiosa se determinaron a partir de las celobiohidrolasas producidas de manera heteróloga en T. reesei (Ejemplos 14 y 15). Las enzimas se purificaron como se describe en el Ejemplo 2. Las concentraciones de proteína de las enzimas purificadas se midieron mediante su absorción a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción molar teórico, que se evaluó a partir de las secuencias de aminoácidos (Gill y von Hippel, 1989).
Las constantes cinéticas (valores Km y kcat) y la constante de inhibición de celobiosa (Ki) para CBHI/Cel7A de Tr, CBH/Cel7A de Ta, CBH/Cel7A de At y CBH/Cel7A de Ct, se midieron utilizando CNPLac (2-Cloro-4-nitrofenil-β-Dlactósido) como sustrato a la temperatura ambiente (22°C) en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 5,7. Para la determinación de la constante de inhibición (Ki), se utilizaron ocho concentraciones de sustrato diferentes (31 a 4000 µM) en presencia de un intervalo de cinco concentraciones de inhibidor (0-100 µM o 0-400 µM), que agrupen el valor de Ki. Todos los experimentos se realizaron en placas de microtitulación y el volumen de reacción total fue de 200 µl. Las tasas iniciales se midieron en cada caso mediante control continuo de la liberación del anión de cloronitrofenolato (CNP, 2-cloro-4-nitrofenolato) a través de mediciones a 405 nm utilizando un lector de placas de microtitulación Varioscan (ThermoLabsystems). Los resultados se calcularon a partir de la curva patrón de CNP (de 0 a 100 µM). Las concentraciones de enzima utilizadas fueron: CBHI/Cel7A de Tr 2,46 µM, CBH/Cel7A de Ta 1,58 µM, CBH/Cel7A de Ct 0,79 µM y CBH/Cel7A de At 3 µM. Las constantes Km y kcat se calcularon a partir del ajuste de la ecuación de Michaelis-Menten utilizando el programa de Origen. Se utilizaron diagramas de Lineweaver-Burk, regráficos "replots" (pendiente de LWB frente a [glc2; celobiosa]) y diagramas de Hanes para distinguir entre la inhibición de tipo competitivo y mixta y para determinar las constantes de inhibición (Ki).
Los resultados de las mediciones cinéticas se muestran en la Tabla 12 y la Tabla 13. Como se puede observar, CBH/Cel7A de Ct tiene claramente el número de recambio más alto (kcat) sobre CNPLac y también la constante de especificidad (kcat/Km) es mayor en comparación con CBHI/Cel7A de T. reesei. La celobiosa (glc2) es un inhibidor competitivo para todas las celulasas medidas, y la CBHI/Cel7A de Tr (utilizada como control) tiene la inhibición más fuerte (es decir, el valor de Ki más bajo) por celobiosa. La CBH/Cel7A de At tuvo una constante de inhibición 7 veces mayor en comparación con el de CBHI/Cel7A de Tr. Estos resultados indican que las tres nuevas celobiohidrolasas podrían funcionar mejor en la hidrólisis de celulosa debido a la disminución de la inhibición por celobiosa en comparación con la celobiohidrolasa I de Cel7A de Trichoderma reesei.

Tabla 12. Comparación de las constantes de inhibición de celobiosa de cuatro celobiohidrolasas de la familia 7 de GH, medidas sobre CNPLac en tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 5,7, a 22°C.
Enzima
Ki (µM) Tipo de inhibición
Cel7A de Ct
39 competitiva
Cel7A de Ta
107 competitiva
Cel7A de At
141 competitiva
Cel7A de Tr
19 competitiva
Tabla 13. Comparación de las constantes cinéticas de Michaelis-Menten de celobiohidrolasa Cel7A de Chaetomium thermophilum con CBHI/Cel7A de T. reesei, medidas sobre CNPLac en tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 5,7, a 22°C.
Enzima
kcat (min-1) Km (µM) kcat /Km (min-1 M-1)
Cel7A de Ct
18,8 1960 9,5 103
Cel7A de Tr
2,6 520 5,0 103
Ejemplo 17. Hidrólisis de celulosa cristalina (Avicel) por las celobiohidrolasas recombinantes
Las celobiohidrolasas recombinantes purificadas Cel7A de Ct, Cel7A de Ta, Cel7A de Ta+CBD de Tr, Cel7A de Ta+CBD de Ct, Cel7A de At así como la versión núcleo de Cel7A de Ct (véase más adelante) se sometieron a ensayo en cantidades equimolares en la hidrólisis de celulosa cristalina a dos temperaturas, 45°C y 70°C; la Cel7A de Tr de T. reesei purificada y su versión núcleo (véase más adelante) se utilizaron como comparación. Los análisis de hidrólisis de la celulosa cristalina (Ph 101, Avicel; Fluka, Bucsh, Suiza) se llevaron a cabo en acetato de sodio 50 mM en un tubo con escala de 1,5 ml, pH 5,0. Se aplicó movimiento oscilante a Avicel a 45°C o a 70°C, con la disolución de enzima (1,4 µM), y el volumen final de la mezcla de reacción fue de 325 µl. La hidrólisis siguió hasta 24 horas tomando muestras en seis momentos diferentes y deteniendo la reacción mediante la adición de 163 µl de reactivo de parada que contenía 9 vol de etanol del 94% y 1 vol de glicina 1 M (pH 11). La disolución se filtró a través de una unidad de filtración Millex GV13 de 0,22 µm (Millipore, Billerica, MA, USA). La formación de azúcares reductores solubles en el sobrenadante se determinó mediante el método de la hidrazida de ácido parahidroxibenzoico (PAHBAH) (Lever, 1972) utilizando una curva patrón de celobiosa (celobiosa de 50 a 1600 µM). Se añadió una disolución de PAHBAH 0,1 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) de nueva aportación en NaOH 0,5 M (100 µl) a 150 µl de la muestra filtrada y se hirvió durante 10 minutos después de lo cual la disolución se enfrió sobre hielo. Se midió la absorbancia de las muestras a 405 nm.
Las versiones núcleo de las celobiohidrolasas que albergan un CBD en su forma nativa se obtuvieron como sigue: Cel7A de Ct y Cel7A de Tr fueron expuestas a digestión proteolítica para eliminar el dominio de unión a celulosa. La digestión con papaína (Papaya Latex, 14 U/mg, Sigma) de las celobiohidrolasas nativas se realizó a 37°C durante 24 h en una mezcla de reacción compuesta de L-cisteína 10 mM y EDTA 2 mM en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5,0 ) con la adición de papaína (se sometieron a ensayo dos concentraciones de papaína: una cantidad de una quinta parte o una décima parte de papaína con respecto a la cantidad total de la Cel7A en la mezcla de reacción). La proteína núcleo resultante se purificó con una columna de intercambio aniónico DEAE Sepharose FF (Pharmacia, Uppsala, Suecia) como se ha descrito anteriormente. El producto se analizó en SDS-PAGE.
Los resultados de hidrólisis a 45°C y 70°C se muestran en la Figura 4 y la Figura 5, respectivamente. Los resultados muestran claramente que todas las celobiohidrolasas muestran una hidrólisis más rápida y más completa a ambas temperaturas en comparación con la celobiohidrolasa Cel7A de T. reesei del estado de la técnica. A 70°C, las celobiohidrolasas termoestable de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALKO4265 son superiores en comparación con Cel7A de T. reesei, también en el caso en el que el núcleo de Cel7A de Thermoascus está conectado al CBD de Cel7A de T. reesei (Cel7A de Ta + CBD de Tr). Resultó sorprendente que las celobiohidrolasas aisladas y clonadas en este trabajo sean superiores, cuando albergan un CBD, en la velocidad y la formación del producto en la hidrólisis de celulosa cristalina también a la temperatura de hidrólisis convencional de 45°C cuando se comparó con la celobiohidrolasa del estado de la técnica de Cel7A (CBHI) de T. reesei a la misma concentración de la enzima. Los resultados también están de acuerdo con las preparaciones de enzima (Cel7A de At y Cel7A de Ct), que se purificaron a partir de los anfitriones originales y se sometieron a ensayo en la hidrólisis de Avicel (50°C, 24 h) (Ejemplo 2, Tabla 1).
Ejemplo 18. Clonación de genes de endoglucanasa de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261, y Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se utilizaron métodos convencionales de biología molecular como se ha descrito en el Ejemplo 13. La construcción de las bibliotecas genómicas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus se ha descrito en el Ejemplo 12.
Los péptidos derivados de endoglucanasas purificadas de Acremonium y Chaetomium comparten homología con varias endoglucanasas de la familia 45 de glicosilhidrolasas tales como la endoglucanasa Cel45A de Melanocarpus albomyces (AJ515703) y la endoglucanasa de Humicola insolens (A35275), respectivamente. Los péptidos derivados de la endoglucanasa de Thermoascus comparten casi 100% de identidad con la secuencia de la endoglucanasa EG1 de Thermoascus aurantiacus (AF487830) publicada. Para amplificar una sonda para el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Acremonium y Chaetomium, se diseñaron cebadores degenerados basándose en las secuencias de los péptidos. El orden de los péptidos en la secuencia de la proteína y la naturaleza efectora o antisentido correspondiente de los cebadores se dedujeron a partir de la comparación con las endoglucanasas publicadas homólogas. Las secuencias de los cebadores y los péptidos correspondientes se enumeran en la Tabla 14. Debido a una identidad de casi 100% de los péptidos de Thermoascus con la secuencia publicada, el gen de la endoglucanasa se amplificó mediante PCR directamente a partir del ADN genómico.

Tabla 14. Oligonucleótidos sintetizados y utilizados como cebadores de PCR para amplificar una sonda para el escrutinio de los genes cel45A (EG_40) de Acremonium thermophilum y cel7B (EG_54) de Chaetomium thermophilum a partir de las bibliotecas genómicas correspondientes.
Proteína
Péptido Localización del cebador(a Secuencia del cebador(b
EG_40 de At
Péptido 5 1―6 TAYTGGGAYTGYTGYAARCC
WFQNADN(c RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA
EG_54 de Ct
Péptido 7 3―7 GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT (d
Péptido 2 5―9 GGAATTCGAYCARACNGARCARTA (e
(a aminoácidos del péptido utilizado para el diseño de la secuencia del cebador (b N = A, C, G, o T; R = A o G, Y = C o T (c El péptido no deriva de la proteína EG_40 purificada de Acremonium, pero se origina a partir de la secuencia
Cel45A de M. albomyces (AJ515703) homóloga a EG_40. (d Se añadió un sitio de restricción HindIII al extremo 5' del oligonucleótido (e Se añadió un sitio de restricción EcoRI al extremo 5' del oligonucleótido Se amplificó la sonda específica del gen cel45A de Acremonium thermophilum para escrutar la biblioteca genómica
con los cebadores directo (TAYTGGGAYTGYTGYAARCC) e inverso (RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA) utilizando
ADN genómico como molde. Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,1 mM, 0,5 µg de cada cebador, 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,5 µg de ADN genómico de Acremonium. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de recocido a 50-60°C, 2 min de extensión a 72°C y una final extensión a 72°C durante 10 min. Para la amplificación de la sonda específica de gen cel7B de Chaetomium thermophilum (que codifica EG_54 de Ct), se utilizaron un cebador directo (GGAATTCGAYCARACNGARCARTA) y un cebador inverso (GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT). Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, KCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, 250 pmol de cada cebador, 2 unidades de ADN polimerasa Dynazyme II (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 2 µg de ADN genómico de Chaetomium. Las condiciones para la reacción de PCR fueron las descritas anteriormente, excepto que el recocido se realizó a 4550°C.
Se obtuvieron dos productos de PCR a partir de la reacción de PCR de Acremonium. Se aislaron fragmentos de ADN de aproximadamente 0,6 kb y 0,8 kb de gel de agarosa y se clonaron en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA), dando como resultado los plásmidos pALK1710 y pALK1711, respectivamente. Los productos de ADN se caracterizaron por secuenciación y realizando hibridaciones mediante transferencia Southern con el ADN genómico de Acremonium digerido con varias enzimas de restricción. Los patrones de hibridación obtenidos con los dos fragmentos en condiciones de lavado rigurosas sugieren que los dos supuestos genes de endoglucanasa podrían ser escrutados a partir de la biblioteca genómica de Acremonium. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los dos productos de PCR tienen homología con varias secuencias publicadas de endoglucanasa de la familia 45 de glicosilhidrolasa (programa BLAST del Nacional Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).
Se obtuvo un producto de PCR del tamaño esperado (estimado a partir de la secuencia de endoglucanasa homóloga de Humicola insolens, A35275) a partir de la reacción de PCR de Chaetomium. Este fragmento de ADN de aproximadamente 0,7 kb se clonó en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA) dando como resultado el plásmido pALK2005 y se analizó como se ha descrito anteriormente. La secuencia de aminoácidos deducida del producto de la PCR tiene homología con varias secuencias de celulasa publicadas de la familia de 7 glicosilhidrolasa (programa BLAST, versión 2.2.9 en el NCBI, Nacional Center for Biotechnology Information; Altschul et al,. 1990).
El inserto de los plásmidos pALK1710, pALK1711, pALK2005 y se aisló mediante digestión con enzimas de restricción y se marcó con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania). Se escrutaron aproximadamente 1-2 x 105 placas de la biblioteca genómica amplificada de Acremonium o Chaetomium. La temperatura de hibridación fue de 68°C y los filtros se lavaron 2 x 5 min a RT utilizando 2 x SSC - SDS al 0,1% seguido de 2 x 15 min a 68°C utilizando 0,1 x SSC - SDS al 0,1%. Se obtuvieron varias placas positivas, de las cuales de cinco a seis placas que hibridación fuertemente se purificaron a partir de cada escrutinio. Los ADN de los fagos se aislaron y se analizaron mediante hibridación por transferencia Southern. Los fragmentos de restricción que hibridaban con la sonda se subclonaron en el vector pBluescript II KS + (Stratagene, USA) y se secuenciaron las porciones relevantes. En todos los casos el fragmento de fago subclonado contiene el gen completo de interés. La Tabla 15 resume la información de las sondas utilizadas para el escrutinio de los genes de endoglucanasa, los clones de fagos a partir de los cuales se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contenían los genes completos con sus regiones promotora y terminadora, los nombres de los plásmidos que contenían el fragmento del fago subclonado, y los números de depósito de la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH (DSM) de cepas de E. coli que portaban estos plásmidos.
El gen cel5A de Thermoascus aurantiacus (que codificaba EG_28) (SEQ ID NO: 9) se amplificó directamente a partir del ADN genómico aislado mediante reacción de PCR. los cebadores directo (ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTCGGCTCTCTCGTGCTC) e inverso (AACTGAGGCATAGAAACTGACGTCATATT) que se utilizaron para la amplificación se diseñaron basándose en el gen eg1 de T. aurantiacus publicado (AF487830). Las mezclas de reacción PCR contenían 1 x tampón Phusion HF,
dNTP 0,3 mM, 0,5 M de cada cebador, 2 unidades de ADN polimerasa Phusion TM (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,25 µg de ADN genómico de Thermoascus. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 25 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s de recocido a 5767°C, 2,5 minutos de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 5 min. El producto de 1,3 kb amplificado que contenía el gen exacto (del codón de INICIO al de PARADA) se clonó como un fragmento SacII-PstI en el vector pBluescript II KS +. Se secuenciaron dos clones independientes y un clon se seleccionó y se denominó pALK1926. El número de depósito de la cepa de E. coli que contenía pALK1926 en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH es DSM 17326.
La información relevante de los genes y las secuencias de proteínas deducidas (SEQ ID NO: 9-16) se resumen en la Tabla 16 y la Tabla 17, respectivamente. Las secuencias peptídicas de las endoglucanasas EG_40 de Acremonium (gen cel45A de At), EG_54 de Chaetomium (gen cel7B de Ct), y EG_28 de Thermoascus (gen cel5A de Ta) se encontraron en las correspondientes secuencias de aminoácidos deducidas de los genes clonados confirmando que se clonaron los genes apropiados.
(a El codón de PARADA está incluido. (b El codón de PARADA no está incluido. Tabla 17. Resumen de las secuencias deducidas de las endoglucanasas de Acremonium thermophilum,
Chaetomium thermophilum, y Thermoascus aurantiacus. ss, secuencia señal.
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al,. 1997; Bendtsen. et al, 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y el valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov.
(b Se indican la presencia de un dominio de unión a celulosa en la proteína, los aminoácidos del CBD C-terminal (numeración de acuerdo con el polipéptido completo)
(c La secuencia señal pronosticada no está incluida. La predicción se realizó utilizando la herramienta Compute pl/MW en el servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003).
(d Los supuestos sitios de N-glicosilación N-X-S/T se pronosticaron utilizando el programa NetNGlyc 1.0 (Gupta et al., 2004).
(e De acuerdo con Hong et al. 2003a.
Las secuencias de proteínas deducidas de las endoglucanasas EG_40 (Cel45A de At) y de tipo EG_40 (Cel45B de At) de Acremonium, EG_54 (Cel7B de Ct) de Chaetomium, y EG_28 (Cel5A de Ta) de Thermoascus comparten homología con celulasas de la familia 45 (Acremonium), la familia 7 (Chaetomium), y la familia 5 (Thermoascus) de glicosilhidrolasa, identificando de este modo los genes aislados como miembros de estas familias de genes. Las homologías más cercanas de las endoglucanasas EG_40/Cel45A y de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium son endoglucanasas de Thielavia terrestris (CQ827970, identidad del 77,3%) y Myceliophthora thermophila (AR094305, identidad de 66,9%), respectivamente (Tabla 18). Las dos endoglucanasas aisladas de la familia 45 de Acremonium
comparten una identidad de solo 53,7% entre sí. De estas enzimas sólo EG_40/Cel45A contiene un dominio de unión a celulosa (CBD).
La homología más próxima para la secuencia de proteína pronosticada de la endoglucanasa EG_54/Cel7B de Chaetomium se encuentra en la secuencia de celulasa Cel7A Melanocarpus albomyces (AJ515704). La identidad 5 entre estas dos secuencias de proteínas es 70,6%.
La secuencia de la proteína de la endoglucanasa aislada Thermoascus aurantiacus es completamente idéntica a la de la EGI publicada de T. aurantiacus (AF487830, Tabla 18). La homología más próxima se encontró en una secuencia de β-glucanasa de Talaromyces emersonii (AX254752, identidad de 71,1%).
10 EG_54/Cel7B de Chaetomium thermophilum y EG_28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus con sus contrapartes homólogas. Este alineamiento se realizó utilizando el programa de Needle del paquete de programas EMBOSS. *Indica una endoglucanasa codificada por un gen clonado en este trabajo.

Tabla 18. Comparación de las endoglucanasas EG_40, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium thermophilum,
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
Acremonium thermophilum EG_40
100,0
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
77,3
Melanocarpus albomyces Cel45A, AJ515703
75,3
Neurospora crassa, hipotético XM_324477
68,9
Humicola grisea var thermoidea, EGL3, AB003107
67,5
Humicola insolens EG5, A23635
67,3
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305
57,9
*Acremonium thermophilum de tipo EG_40
53,7
Acremonium thermophilum de tipo EG_40
100,0
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305
66,9
Magnaporthe grisea 70-15 hipotético, XM_363402
61,9
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
*Acremonium thermophilum EG_40
56,8
Melanocarpus albomyces Cel45A, AJ515703
53,7
52,8
Chaetomium thermophilum EG_54
100,0
Melanocarpus albomyces Cel7A, AJ515704
70,6
Humicola grisea var thermoidea EGI, D63516
68,8
Humicola insolens EGI, AR012244
67,7
Myceliophthora thermophila EGI, AR071934
61,7
Fusarium oxysporum var lycopercisi EGI, AF29210
53,5
Fusarium oxysporum EGI, AR012243
52,6
Thermoascus aurantiacus EG_28
100,0
Thermoascus aurantiacus EG, AX812161
100,0
Thermoascus aurantiacus EGI, AY055121
99,4
Talaromyces emersonii β-glucanasa, AX254752
71,1
Talaromyces emersonii EG, AF440003
70,4
Aspergillus niger EG, A69663
70,1
Aspergillus niger EG, A62441
69,9
Aspergillus niger EG, AF331518
69,6
Aspergillus aculeatus EGV, AF054512
68,5
Ejemplo 19. Producción de endoglucanasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes EG_40/Cel45A, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium, y EG_28/Cel5A de Thermoascus como se ha descrito en el Ejemplo 14. Los casetes de expresión lineales (Tabla 19) se aislaron de la cadena principal del vector mediante digestión con enzimas de restricción, se transformaron en T. reesei A96 y los transformantes se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo
14.

Tabla 19 Casetes de expresión construidos para la producción de las endoglucanasas EG_40/Cel45A, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium thermophilum y EG_28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus en Trichoderma reesei. La estructura esquemática de los casetes de expresión se describe en la Figura 2.
Endoglucanasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
EG_40 de At
pALK1920 NotI 10,9 kb 156 pb (HindIII)
De tipo EG_40 de At
pALK1921 EcoRI 8,6 kb 282 pb (SspI)
EG_28 de Ta
pALK1930 NotI 8,6 kb ninguno
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló a partir de la cadena principal del vector mediante digestión con EcoRI o NotI.
(b Se indica el número de nucleótidos después del codón de PARADA del gen clonado que se incluyen en el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se utilizó en la construcción del casete de expresión se indica entre paréntesis.
La producción de endoglucanasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron como en el Ejemplo 14 y la actividad enzimática de la proteína recombinante se midió a partir del sobrenadante de cultivo como la liberación de azúcares reductores a partir de carboximetilcelulosa (2% (p/v) de CMC) a 50°C en tampón de citrato 50 mM de pH 4,8 esencialmente como describen Bailey y Nevalainen 1981; Haakana et al. 2004. La producción de las proteínas recombinantes también se detectó a partir de sobrenadantes de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Los anticuerpos policlonales específicos de EG_40 de Acremonium se produjeron en conejos (Universidad de Helsinki, Finlandia). La expresión de EG_40 se verificó mediante análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-EG_40 utilizando el sistema AP para transferencia Western ProtoBlot (Promega). Los genotipos de los transformantes seleccionados se analizaron mediante transferencia Southern utilizando el casete de expresión como sonda.
El pH óptimo de las endoglucanasas producidas de manera heteróloga se determinó en tampón universal de Mcllvaine dentro de un intervalo de pH de 4,0-8,0 utilizando carboximetilcelulosa como sustrato. Como se muestra en la Figura 6A el intervalo de pH más amplio (4,5-6,0) es el de la proteína EG_40/Cel45A de Acremonium, siendo el óptimo a pH 5,5. El pH óptimo para las otras endoglucanasas producidas de manera heteróloga son pH 5,0-5,5 y 6,0 para el tipo EG_40/Cel45B de Acremonium y EG_28/Cel5A de Thermoascus, respectivamente. La temperatura óptima para la actividad enzimática de estas endoglucanasas se determinó en el intervalo de temperatura de 5085°C como se ha descrito anteriormente. Se determinó que la mayor actividad de la enzima era a 75°C, 60°C y 75°C para EG_40/Cel45A, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium y EG_28/Cel5A de Thermoascus, respectivamente (Figura 6B).
Los transformantes seleccionados se cultivaron, como se ha descrito en el Ejemplo 14, en un biorreactor de 2 litros durante cuatro días (28°C, pH 4,2) para obtener material para las pruebas de aplicación.
Ejemplo 20. Clonación de los genes de beta-glucosidasa de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261, y Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Se utilizaron métodos convencionales de biología molecular como se ha descrito en el Ejemplo 13. La construcción de las bibliotecas genómicas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus se ha descrito en el Ejemplo 12.
Los péptidos derivados de las β-glucosidasas purificadas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus comparten homología con varias β-glucosidasas de la familia 3 de glicosil hidrolasa tales como las β-glucosidasas de Acremonium cellulolyticus (BD168028), Trichoderma viride (AY368687), y Talaromyces emersonii (AY072918), respectivamente. Para amplificar una sonda para el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Acremonium, Chaetomium, o Thermoascus, se diseñaron cebadores degenerados basándose en las secuencias de los péptidos. El orden de los péptidos en la secuencia de la proteína y la naturaleza efectora o anti-sentido correspondiente de los cebadores se dedujo de la comparación con las β-glucosidasas homólogas publicadas. Las secuencias de los cebadores y los péptidos correspondientes se enumeran en la Tabla 20.

Tabla 20. Oligonucleótidos sintetizados y utilizados como cebadores de PCR para amplificar una sonda para el escrutinio de los genes cel3A (βG_101) de Acremonium thermophilum, cel3A (βG_76) de Chaetomium thermophilum, y cel3A (βG_81) de Thermoascus aurantiacus de las bibliotecas genómicas correspondientes.
Proteína
Péptido Localización del cebador(a Secuencia del cebador (b
At
EKVNLT(c GARAARGTNAAYCTNAC
βG_101
Péptido 4 6―11 YTTRCCRTTRTTSGGRGTRTA
Ct
Péptido 6 4―9 TNTGYCTNCARGAYGG
βG_76
Péptido 1 3―8 TCRAARTGSCGRTARTCRATRAASAG
Ta
Péptido 3 1―5 AARGGYGTSGAYGTSCAR
βG_81
Péptido 1 2―7 YTTRCCCCASGTRAASGG
(a Aminoácidos del péptido utilizado para el diseño de la secuencia del cebador
(b Para reducir la degeneración, algunos codones se seleccionaron de acuerdo con la preferencia fúngica N = A, C, G, o T;. R = A o G, S = C o G; Y = C o T
(c El péptido no deriva de la proteína βG_101 de Acremonium purificada, sino que se origina a partir de la secuencia de β-glucosidasa (BD168028) de A. cellulolyticus homóloga a βG_101.
Las sondas para el escrutinio de las bibliotecas genómicas construidas se amplificaron con las combinaciones de cebadores enumeradas (Tabla 20) utilizando ADN genómico de Acremonium, Chaetomium, o Thermoascus como molde. Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,1-0,2 mM, 0,25 µg de cada cebador, 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,5 µg de ADN genómico. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de hibridación a 40°C (ADN de Acremonium como molde), a 50°C (ADN de Chaetomium como molde), o a 63°C (ADN de Thermoascus como molde), 2-3 min de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 5-10 min.
Se aislaron productos de PCR específicos del tamaño esperado (estimado a partir de las secuencias de βglucosidasa homólogas BD168028, AY072918, y AY368687) del gel de agarosa. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 1,8 kb (Acremonium), 1,5 kb (Chaetomium), y 1,52 kb (Thermoascus) se clonaron en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA) dando como resultado los plásmidos pALK1924, pALK1935, y pALK1713, respectivamente. Los productos de ADN se caracterizaron mediante secuenciación y realizando hibridaciones de transferencia Southern del ADN genómico digerido con varias enzimas de restricción. Los patrones de hibridación en condiciones de lavado rigurosas sugieren que se podría aislar un supuesto gen de β-glucosidasa de la biblioteca genómica de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los tres productos de PCR tienen homología con varias secuencias de β-glucosidasa publicadas de la familia 3 de glicosil hidrolasa (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).
El inserto de los plásmidos pALK1713, pALK1924, y pALK1935 se aisló mediante digestión con enzimas de restricción y se marcó con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania). Se escrutaron aproximadamente 1-2 x 105 placas de la biblioteca genómica de Acremonium, Chaetomium, o Thermoascus amplificadas como se ha descrito en el Ejemplo 18. Se obtuvieron varias placas positivas, de las cuales de cinco a seis placas que hibridaron fuertemente se purificaron a partir de cada escrutinio. Los ADN de los fagos aislaron y se analizaron mediante hibridación de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción que hibridaban con la sonda se subclonaron en el vector pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) y las porciones relevantes se secuenciaron. En todos los casos el fragmento de fago subclonado contiene el gen completo de interés. La Tabla 21 resume la información de las sondas utilizadas para el escrutinio de los genes de β-glucosidasa, los clones de fagos de los que se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contienen los genes completos con sus regiones promotora y terminadora, los nombres de los plásmidos que contienen el fragmento de fago subclonado, y los números de depósito en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH (DSM) de cepas de E. coli que portan estos plásmidos.
Tabla 21. Sondas utilizadas para la clonación del gen de la β-glucosidasa, clon del fago y subclón seleccionados, nombre de plásmido y número de depósito correspondiente de la cepa de E. coli.
Gen
Biblioteca genómica Sonda utilizada en el escrutinio Clon del fago Fragmento subclonado Plásmido Núm. de depósito de E. coli
cel3A de At
A. thermophilum pALK1924 P44 6,0 kb pALK1925 DSM
ALKO4245
HindIII 17325
cel3A de Ct
C. thermophilum pALK1935 P51 7,0 kb pALK2001 DSM
ALKO4261
XbaI 17667
cel3A de Ta
T. aurantiacus pALK1713 P21 5,3 kb pALK1723 DSM
ALKO4242
BamHI 16725
La información relevante de los genes y las secuencias de proteína deducidas (SEQ ID NO: 21-26) se resumen en la Tabla 22 y la Tabla 23, respectivamente. Las secuencias de péptidos de las proteínas βG_101 (At Cel3A) Acremonium, βG_76 (Ct Cel3A) de Chaetomium, y βG_81 (Ta Cel3A) de Thermoascus purificadas se encontraron en las correspondientes secuencias de aminoácidos deducidas de los genes clonados confirmando que se habían clonado los genes apropiados.

Tabla 22. Resumen de los genes de β-glucosidasa aislados de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum, y Thermoascus aurantiacus.
Gen de βglucosidasa
Longitud con intrones (pb)(a Región codificante pb)(b Núm. de intrones Longitud de los intrones (pb) SEQ ID NO:
cel3A de At
2821 2583 3 92, 74, 69 23
cel3A de Ct
2257 2202 1 52 25
cel3A de Ta
3084 2529 7 134, 67, 56, 64, 59, 110, 62 21
(a Está incluido el codón de PARADA. 10 (b No está incluido el codón de PARADA. Tabla 23. Resumen de las secuencias de β-glucosidasa deducidas de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum, y Thermoascus aurantiacus. ss, secuencia señal.
Proteína βglucosidasa
Núm. de aa Longitud de la ss NN/HMM(a CBD(b PM pronosticado (Da, no incluida ss)(c pl pronosticado no incluida ss) Supuestos sitios de N-glicosilación(d SEQ ID NO:
βG_101 de At
861 19/18 No 91434 5,46 8 24
βG_76 de Ct
734 20/20 No 76457 6,3 2 26
βG_81 de Ta
843 19/19 No 89924 4,95 8 22
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al,. 1997; Bendtsen et al, 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov.
15 (b Presencia de un dominio de unión a celulosa en la proteína.
(c La secuencia señal pronosticada no está incluida. La predicción se realizó utilizando la herramienta el Compute pl/MW en el servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003).
(d Los supuestos sitios de N-glicosilación NXS/T se pronosticaron utilizando el programa NetNGlyc 1,0 (Gupta et al., 2004).
20 Las secuencias de proteínas deducidas de las β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium, βG_76/Cel3A de Chaetomium, y βG_81/Cel3A de Thermoascus comparten homología con las enzimas de la familia 3 de glicosil hidrolasa, identificando de este modo que los genes aislados pertenecen a esta familia de genes. Las contrapartes más cercanas de las β-glucosidasas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus son las de Magnaporthe grisea (β-glucosidasa, AY849670), Neurospora crassa (hipotética, XM_324308), y Talaromyces emersonii (β-glucosidasa,
25 AY072918), respectivamente (Tabla 24). Se encontró que la identidad de secuencia más alta (73,2%) era la de βG_76/Cel3A de C. thermophilum para la proteína hipotética de N. crassa indicando que se habían clonado genes de nuevas enzimas.

Tabla 24 Comparación de las β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG_76/Cel3A de Chaetomium thermophilum y βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. La alineación se ha realizado mediante el programa Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una β-glucosidasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
*Acremonium thermophilum βG_101
100,0
Magnaporthe grisea β-glucosidasa, AY849670
73,1
Neurospora crassa hipotética, XM_330871
71,1
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
65,2
*Thermoascus aurantiacus βG_81
62,2
Aspergillus aculeatus β-glucosidasa, D64088
59,5
Talaromyces emersonii β-glucosidasa, AY072918
58,9
Aspergillus oryzae, AX616738
58,2
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
57,2
*Chaetomium thermophilum βG_76
40,9
Chaetomium thermophilum βG_76
100,0
Neurospora crassa, hipotética XM_324308
76,9
Magnaporthe grisea, hipotética XM_364573
70,2
Trichoderma viridae BGI, AY368687
65,8
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
41,2
*Acremonium thermophilum βG_101
40,9
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
40,0
*Thermoascus aurantiacus βG_81
39,9
*Thermoascus aurantiacus βG_81
100,0
Talaromyces emersonii β-glucosidasa, AY072918
73,2
Aspergillus oryzae, AX616738
69,5
Aspergillus aculeatus β-glucosidasa, D64088
68,0
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
65,7
*Acremonium thermophilum βG_101
62,2
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
57,9
*Chaetomium thermophilum βG_76
39,9
Ejemplo 21. Producción de beta-glucosidasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes βG_101/Cel3A de Acremonium, de βG_76/Cel3A de Chaetomium, y βG_81/Cel3A de Thermoascus como se describe en el Ejemplo
14. Se aislaron casetes de expresión lineales (Tabla 25) de la cadena principal del vector mediante digestión con 10 enzimas de restricción, se transformaron en T. reesei A96 o A33 (ambas cepas tienen suprimidos los genes que codifican las cuatro celulasas principales CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A) y los transformantes se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 14.
Tabla 25. Casetes de expresión construidos para la producción de β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG_76/Cel3A de Chaetomium thermophilum, y βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus en 15 Trichoderma reesei. La estructura esquemática de los casetes de expresión se describe en la Figura 2.
β-glucosidasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
βG_101 de At
pALK1933 NotI de 10,5 kb 300 pb (HindIII)
β-glucosidasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
βG_76 de Ct
pALK2004 EcoRI de 10,1 kb 528 pb (XbaI)
βG_81 de Ta
pALK1914 EcoRI de 10,9 kB 452 pb (ApoI)
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló de la cadena principal del vector mediante digestión con Eco RI o NotI.
(b Se indica el número de nucleótidos después del codón de PARADA del gen clonado que está incluido el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se utilizó en la construcción del casete de expresión se indica entre paréntesis.
Se analizó La producción de beta-glucosidasa de los transformantes a partir de los sobrenadantes de cultivo de cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron como en el Ejemplo 14 y se midió la actividad enzimática de la proteína recombinante a partir del sobrenadante de cultivo utilizando sustrato de 4-nitrofenil-β-Dglucopiranósido como describen Bailey y Nevalainen 1981. También se detectó la producción de proteínas recombinantes a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Además, se verificó la expresión de βG_81 de Thermoascus mediante análisis de transferencia de Western con anticuerpos anti-βG_81 como se ha descrito en el Ejemplo 19. Los genotipos de los transformantes seleccionados se analizaron mediante transferencia Southern utilizando el casete de expresión como sonda.
El pH óptimo de las β-glucosidasas producidas de manera heteróloga se determinó en tampón universal la McIlvaine en un intervalo de pH de 3,0-8,0 utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato. Los pH óptimos para βG_101 de Acremonium, βG_76 de Chaetomium, y βG_81 de Thermoascus son pH 4,5, 5,5, y 4,5, respectivamente (Figura 7A). La temperatura óptima para la actividad enzimática de estas β-glucosidasas se determinó en el intervalo de temperatura de 50-85°C como se ha descrito anteriormente. Se determinó que la mayor actividad de las enzimas era a 70°C, 65°C y 75°C para βG_101/Cel3A Acremonium, βG_76/Cel3A de Chaetomium y βG_81/Cel3A de Thermoascus, respectivamente (Figura 7B).
Los transformantes seleccionados se cultivaron, como se ha descrito en el Ejemplo 14, en un biorreactor de 2 litros durante cuatro días (28°C, pH 4,2) para obtener material para las pruebas de aplicación.
Ejemplo 22. Clonación de los genes de xilanasa de Acremonium thermophilum ALKO4245 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se utilizaron métodos convencionales de la biología molecular como se ha descrito en el Ejemplo 13. La construcción de la biblioteca genómica de Acremonium se ha descrito en el Ejemplo 12.
Los péptidos derivados de la xilanasa Acremonium purificada comparten homología con las xilanasas de la familia 10 de glicosil hidrolasa tales como Humicola grisea XYNI (AB001030). Todos los péptidos derivados de xilanasa de Thermoascus fueron completamente idénticos a la secuencia XynA publicada de Thermoascus aurantiacus (AJ132635) identificando de este modo la proteína purificada como la misma enzima. Debido a esto el gen de xilanasa de Thermoascus se amplificó mediante PCR a partir del ADN genómico.
Para amplificar una sonda para el escrutinio del gen de xilanasa de Acremonium a partir de la biblioteca genómica, se diseñaron cebadores degenerados basándose en las secuencias de péptidos (Ejemplo 11, Tabla 5). El orden de los péptidos en la secuencia de la proteína y la naturaleza efectora o antisentido correspondiente de los cebadores se dedujeron a partir de la comparación con secuencia XYNI de Humicola insolens homóloga (AB001030). La secuencia del cebador efector (GAYGGYGAYGCSACYTAYATG) se basa en el Péptido 3 (aminoácidos 2-8) y el cebador anti-sentido (YTTYTGRTCRTAYTCSAGRTTRTA) en el Péptido 1 (aminoácidos 4-11).
Se obtuvo un producto de PCR del tamaño esperado (estimado a partir del secuencia XYNI de Humicola insolens homóloga AB001030) de la reacción. Este fragmento de ADN de aproximadamente 0,7 kb se clonó en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA) dando como resultado el plásmido pALK1714, y se caracterizó mediante secuenciación. La secuencia de aminoácidos deducida del producto de la PCR tiene homología con varias secuencias de xilanasa publicadas de la familia 10 de glicosil hidrolasa (programa BLAST del National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).
El inserto del plásmido pALK1714 se aisló mediante digestión con enzimas de restricción y se marcó con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania). Se escrutaron aproximadamente 12 x 105 placas de la biblioteca genómica de Acremonium amplificada como se ha descrito en el Ejemplo 18. Se obtuvieron varias placas positivas, de las cuales se purificaron cinco placas que hibridaban fuertemente. Los ADN de fagos se aislaron y se analizaron mediante hibridación de transferencia Southern. Un fragmento de restricción XbaI de 3,0 kb que hibridaba con la sonda se subclonó en el vector pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) dando como resultado el plásmido pALK1725. Las porciones relevantes de pALK1725 se secuenciaron y se encontró que contenían el gen xyn10A de Acremonium thermophilum completo (SEQ ID NO: 19). El número de depósito de la cepa de E. coli que contiene pALK1725 en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH es DSM 16726.
El gen xyn10A de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO: 17) se amplificó directamente a partir del ADN genómico aislado mediante reacción de PCR. Los cebadores directo (TTATACCGCGGGAAGCCATGGTTCGACCAACGATCCTAC) e inverso (TTATAGGATCCACCGGTCTATACTCACTGCTGCAGGTCCTG) que se utilizaron en la amplificación del gen se diseñaron basándose en el gen XynA de T. aurantiacus publicado (AJ132635). Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,3 mM, cada cebador 1 µM, 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,5 µg de ADN genómico de Thermoascus. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de recocido a 60-66°C, 3 min de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 min. El producto de 1,9 kb amplificado que contenía el gen exacto (desde el codón inicio al de parada) se clonó como un fragmento SacII-BamHI en el vector pBluescript II KS+. Se secuenciaron tres clones independientes y se seleccionó un clon y se denominó pALK1715. El número de depósito de la cepa de E. coli que contenía pALK1715 en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH es DSM 16724.
La información relevante de los genes y las secuencias de proteínas deducidas (SEQ ID NO: 17-20) se resumen en la Tabla 26 y la Tabla 27, respectivamente. Las secuencias peptídicas de las proteínas purificados XYN_60 de Acremonium y XYN_30 de Thermoascus se encontraron en las correspondientes secuencias de aminoácidos deducidas de los genes clonados (At xyn10A y Ta xyn10A, respectivamente) confirmando que los se habían clonado los genes apropiados.

Tabla 26. Resumen de los genes de xilanasa aislados de Acremonium thermophilum y Thermoascus aurantiacus.
Gen de xilanasa
Longitud con intrones (pb)(a Región codificante (pb) (b Núm. de intrones Longitud de los intrones (pb) SEQ ID NO:
At xyn10A
1471 1248 2 135, 85 19
Ta xyn10A
1913 987 10 73, 74, 68, 103, 69, 65, 93, 66, 100, 212 17
(a Está incluido el codón de PARADA. (b No está incluido el codón de PARADA.
Tabla 27. Resumen de las secuencias de xilanasa deducidas DE Acremonium thermophilum y Thermoascus aurantiacus. ss, secuencia señal.
Proteína xilanasa
Núm. de aa Longitud de la ss NN/HMM(a CBD(b PM pronosticado (Da, ss no incluida)(c pl pronosticado (ss no incluida) Supuestos sitios de N-glicosilación(d SEQ ID NO:
XYN_60 de At
416 19/19 Si, W385 a L416 42533 6,32 1-2 20
XYN_30 de Ta
329 26(e No 32901 5,81 0 18
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al,. 1997; Bendtsen et al, 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y el valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov.
(b Se indican la presencia de un dominio de unión a carbohidratos CBD, los aminoácidos del CBD C-terminal (numeración de acuerdo con el polipéptido completo)
(c No está incluida la secuencia pronosticada. La predicción se realizó utilizando la herramienta Compute pl/MW en el servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003).
(d Los supuestos sitios de N-glicosilación NXS/T se pronosticaron utilizando el programa NetNGlyc 1.0 (Gupta et al., 2004).
(e De acuerdo con Lo Leggio et al., 1999
Las secuencias de proteínas deducidas de las xilanasas Acremonium y Thermoascus comparten homología con varias enzimas de la familia 10 de glicosil hidrolasa, identificando los correspondientes genes como miembros de la familia 10 de xilanasas. La contraparte más próxima para XYN_60/Xyn10A de Acremonium encontrada es la XYLI de Humicola grisea (AB001030) que muestra una identidad de 67,1% con XYN_60 (Tabla 28). La secuencia de proteína pronosticada de la xilanasa XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus aislada es completamente idéntica a la de XYNA de T. aurantiacus publicada (P23360, Tabla 28). La homología más próxima se encuentra en una secuencia de xilanasa de Aspergillus niger (A62445, identidad de 69,7%).

Tabla 28. Comparación de las xilanasas XYN_60/Xyn10A de Acremonium thermophilum y XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. El alineamiento se realizó utilizando el programa de Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una xilanasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
* Thermoascus aurantiacus XYN_30
100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, P23360
100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, AF127529
99,4
Aspergillus niger xilanasa, A62445
69,7
Aspergillus aculeatus xilanasa, AR137844
69,9
Aspergillus terreus fam 10 xyn, DQ087436
65,0
Aspergillus sojae, XynXl AB040414
63,8
Penicillium chrysogenum xilanasa, AY583585
62,5
*Acremonium thermophilum XYN_60
100,0
Humicola grisea XYL I, AB001030
67,1
Magnaporthe grisea 70-15, hipotética XM_364947
63,8
Aspergillus aculeatus xilanasa, AR149839
53,7
Talaromyces emersonii xilanasa, AX403831
51,8
Gibberella zeae xilanasa, AY575962
51,4
Magnaporthe grisea XYL5, AY144348
48,5
Talaromyces emersonii, AX172287
46,9
Ejemplo 23. Producción de xilanasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes XYN_60/Xyn10A de Acremonium y XYN_30 /Xyn10A de Thermoascus como se ha descrito en el Ejemplo 14. Los casetes de expresión lineales (Tabla 29) se aislaron de la cadena principal del vector mediante digestión con enzimas de restricción, se
10 transformaron en T. reesei A96, y los transformantes se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 14.

Tabla 29. Casetes de expresión construidos para la producción de las xilanasas XYN_60/Xyn10A de Acremonium thermophilum y XYN_30/ Xyn10A de Thermoascus aurantiacus en Trichoderma reesei. Las estructuras esquemáticas de los casetes de expresión se describen en la Figura 2.
Xilanasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
XYN_60 de At
pALK1912 9,0 kb 150 pb (BamHI)
XYN_30 de Ta
pALK1913 9,3 kb ninguno
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló de cadena principal del vector mediante 15 digestión con EcoRI.
(b Se indica el número de nucleótidos después del codón de PARADA del gen clonado que está incluido en el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se utilizó en la construcción del casete de expresión se indica entre paréntesis.
Se analizó la producción de xilanasa de los transformantes a partir de los sobrenadantes de cultivo de cultivos en
20 matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron como en el Ejemplo 14 y la actividad enzimática de la proteína recombinante se midió a partir del sobrenadante de cultivo como la liberación de azúcares reductores de xilano de abedul (1% p/v) a 50°C en tampón citrato 50 mM de pH 5,3 como describen Bailey y Poutanen 1989. También se analizó la producción de la proteína recombinante del sobrenadante de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Además, la expresión de ambas xilanasas se determinó mediante análisis de
25 transferencia Western con anticuerpos anti-XYN_30 o anti-XYN_60 como se ha descrito en el Ejemplo 19. Los genotipos de los transformantes seleccionados se analizaron mediante transferencia Southern utilizando el casete de expresión como sonda.
Se produjo XYN_30/Xyn10A de Thermoascus en T. reesei y se determinó el pH óptimo de la proteína producida de manera heteróloga en tampón de universal McIlvaine en un intervalo de pH de 3,0-8,0 utilizando como sustrato xilano de abedul (Figura 8A). Se determinó que el pH óptimo era de 4,5. Se determinó que la temperatura óptima para la actividad enzimática de XYN_30 era de 75°C (Figura 8B).
Los transformantes seleccionados se cultivaron, como se ha descrito en el Ejemplo 14, en un biorreactor de 2 litros durante cuatro días (28°C, pH 4,2) para obtener material para las pruebas de aplicación.
Ejemplo 24. Rendimiento de las celobiohidrolasas recombinantes en la hidrólisis
El rendimiento de las celobiohidrolasas recombinantes purificadas se evaluó en los estudios de hidrólisis con las enzimas de T. reesei purificadas. La hidrólisis se llevó a cabo con mezclas controladas de enzimas purificadas sobre varios sustratos pretratados. Se obtuvieron productos filtrados de cultivo de T. reesei, que contenían diferentes enzimas CBH/Cel7 clonadas como se ha descrito en los Ejemplos 14 y 15, y las enzimas CBH se purificaron mediante cromatografía de afinidad como se ha descrito en el Ejemplo 2. Además, se utilizaron celulasas de T. reesei puras (purificadas como describen Suurnäkki et al., 2000) en las mezclas de enzimas. Las celobiohidrolasas utilizadas en el experimento fueron:
CBH de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 (Cel7A de Ta)
CBH de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 (Cel7A de Ta) con CBD anclado genéticamente de Trichoderma reesei (Cel7A de Ta + CBD de Tr)
CBH de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 (Cel7A de Ta) con el CBD anclado genéticamente de Chaetomium thermophilum (Cel7A de Ta + CBD de Ct)
CBH de Acremonium thermophilum ALKO4245 (Cel7A de At)
CBH de Chaetomium thermophilum ALKO4265 (Cel7A de Ct).
Cada CBH/Cel7 que se iba a someter a ensayo (dosificación 14,5 mg/g de materia seca de sustrato) se utilizó o bien con EGII/Cel5A de T. reesei (3,6 mg/g) o bien con una mezcla que contenía EGI/Cel7B (1,8 mg/g), EGII/Cel5A (1,8 mg/g) de T. reesei, xilanasa pl 9 (Tenkanen et al. 1992) (5000 nkat/g ) y acetil xilano esterasa (AXE) (Sundberg y Poutanen, 1991) (250 nkat/g). A todas las mezclas se les añadió un suplemento de β-glucosidasa adicional de una preparación enzimática comercial Novozym 188 (176 nkat/g de peso seco). Se incubaron tubos por triplicado que contenían la mezcla de enzima y 10 mg (materia seca)/ml del sustrato suspendido en acetato de sodio 0,05 M en la mezcla mediante agitación magnética a 45°C durante 48 h. También se prepararon las muestras de referencia con las enzimas inactivadas y loa sustratos correspondientes. Se midió la liberación de los productos de hidrólisis como azúcares reductores con el método DNS utilizando glucosa como patrón (Tabla 30).
Se utilizaron los siguientes sustratos en el experimento:
Celulosa cristalina (Avicel)
Fibra de pícea pretratada con vapor de agua lavada (impregnación con SO2 al 3% p/p durante 20 minutos, seguido de pretratamiento con vapor de agua a 215°C durante 5 min), materia seca de 25,9% (PICEA).
Fibra de rastrojo de maíz oxidada en mojado lavada ("WOCS en sus siglas en inglés") .
Fibra de sauce pretratada con vapor de agua lavada (pretratamiento durante 14 min a 210°C), materia seca 23,0% (SAUCE).

Tabla 30. Productos de hidrólisis con enzimas CBH (45°C, pH 5,0). Productos de reacción después de 48 h de hidrólisis como azúcares reductores (mg/ml), glucosa medida como patrón. Abreviaturas: CBH = celobiohidrolasa; EGI = endoglucanasa I (Cel7B) de T. reesei, EGII = endoglucanasa II (Cel5A) de T. reesei; bG = β-glucosidasa (de Novozym 188); XYL = xilanasa pl 9 (XYN II) de T. reesei , AXE = acetil xilano esterasa de T. reesei; nd = no realizado.
Enzimas
Sustratos
CBH
Enzimas adicionales Avicel PICEA WOCS SAUCE
Cel7A de Ta
EGII, bG 2,0 2,0 2,8 2,0
Cel7A de Ta +CBD de Tr
EGII, bG 5,8 4,0 4,4 4,0
Cel7A de Ta +CBD de Ct
EGII, bG 4,9 3,7 4,6 3,7
Cel7A de At
EGII, bG 5,3 3,3 4,5 3,3
Cel7A de Ct
EGII, bG 6,0 2,6 3,4 2,6
Enzimas
Sustratos
CBH
Enzimas adicionales Avicel PICEA WOCS SAUCE
Cel7A de T. reesei
EGII, bG 4,7 2,9 2,9 2,9
Cel7A de Ta
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 4,3 2,8
Cel7A de Ta +CBD de Tr
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 7,2 5,9
Cel7A de Ta +CBD de Ct
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 7,2 5,6
Cel7A de At
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 6,4 5,4
Cel7A de Ct
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 5,6 4,0
Cel7A de T. reesei
EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 6,0 4,1
En la Tabla 30 se han comparado las diferentes celobiohidrolasas basándose en la misma dosificación de proteína en la hidrólisis. Los resultados demuestran que sobre los sustratos celulósicos (Avicel y fibra de pícea) Cel7A de Thermoascus aurantiacus con el CBD unido genéticamente mostraba una hidrólisis claramente superior hidrólisis que CBHI/Cel7A de T. reesei. Sin CBD, Cel7A de T. aurantiacus fue menos eficaz sobre estos sustratos. El rendimiento de las celobiohidrolasas de Acremonium thermophilum y Chaetomium thermophilum también fue mejor que el de CBHI/Cel7A de T. reesei sobre varios sustratos; en particular, Cel7A de C. thermophilum mostró una alta eficacia sobre la celulosa pura (Avicel).
En el caso de los sustratos que contenían cantidades notables de hemicelulosa (sauce y el rastrojo de maíz), las enzimas CBH/Cel7 necesitaron claramente, tanto hemicelulasas como endoglucanasas adicionales para funcionar eficazmente. Si no se encontraban presentes hemicelulasas adicionales, Cel7A de T. aurantiacus con CBD anclado genéticamente mostró de nuevo una hidrólisis claramente máxima. Con las enzimas degradantes de hemicelulosa más importantes (xilanasa, acetil xilano esterasa y EGI), Cel7A de T. aurantiacus con CBD anclado genéticamente funcionaba de nuevo con la más alta eficacia. Cel7A de A. thermophilum fue más eficaz que la enzima de T. reesei y Cel7A de C. thermophilum produjo productos de hidrólisis al mismo nivel que CBHI/Cel7A de T. reesei. El dominio de unión a celulosa de T. reesei parecía proporcionar una eficacia ligeramente mejor que el CBD de C. thermophilum en el rendimiento hidrolítico de Cel7A de T. aurantiacus, incluso aunque la diferencia fuera bastante pequeña.
Se puede concluir que cuando se remplaza CBHI/Cel7A en la mezcla de enzimas de Trichoderma por las celobiohidrolasas producidas en la presente memoria, la eficacia de la hidrólisis a juzgar por estas trasposiciones experimentales resultó claramente mejorada en el caso de Cel7A de T. aurantiacus con el CBD anclado genéticamente, y también mejoró en el caso de Cel7A de A. thermophilum y Cel7A de C. thermophilum. Considerando también la mejor estabilidad de temperatura de las celobiohidrolasas producidas en la presente memoria, los resultados indican que el rendimiento de las mezclas de enzimas celulasas a temperaturas más altas de 45°C se puede mejorar claramente utilizando las celobiohidrolasas producida en la presente memoria.
Ejemplo 25. Rendimiento de las endoglucanasas recombinantes en la hidrólisis
Se compararon las preparaciones que contenían las endoglucanasas en estudios de hidrólisis mezcladas con las enzimas purificadas CBH/Cel7 y CBH/Cel6 sobre varios sustratos pretratados. Los productos filtrados de cultivo de
T. reesei, que contenían diferentes enzimas endoglucanasa clonadas se obtuvieron como se ha descrito en el Ejemplo 19. Las enzimas se enriquecieron retirando las proteínas termolábiles de las mezclas mediante un tratamiento térmico (60°C, 2 h, pH 5) y el sobrenadante se utilizó para los estudios de hidrólisis. Además, se utilizaron celulasas de T. reesei puras (purificadas como describen Suurnäkki et al., 2000) en las mezclas de enzimas. Las endoglucanasas utilizadas en el experimento fueron:
Endoglucanasa EG_40 de At/Cel45A de Acremonium thermophilum ALKO4245 (EG_40 de ALKO4245)
Endoglucanasa de tipo EG_40 de At/Cel45B de Acremonium thermophilum ALKO4245 (de tipo EG_40 de ALKO4245)
Endoglucanasa EG_28 de Ta/Cel5A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 (EG_28 de ALKO4242).
Se utilizaron los siguientes sustratos en el experimento:
Fibra de pícea pretratada con vapor de agua lavada (impregnación con SO2 al 3% durante 20 minutos, seguido de pretratamiento con vapor de agua a 215°C durante 5 min), materia seca de 25,9% (PICEA).
Fibra de rastrojo de maíz sometida a explosión de vapor de agua (pretratamiento con vapor de agua a 210°C durante 5 min), materia seca 31,0% ("SECS en sus siglas en inglés").
Las endoglucanasas que se iban a estudiar (dosificación de 840 nkat/g de materia seca, basándose en la actividad endoglucanasa contra HEC de acuerdo con la IUPAC, 1987) se utilizaron o bien con celobiohidrolasas de T. reesei (CBHI/Cel7A, 8,1 mg/g de materia seca y CBHII/Cel6A, 2,0 mg/g de materia seca) o bien con Cel7A de Thermoascus aurantiacus con el CBD de T. reesei anclado genéticamente (10,1 mg/g de materia seca). también se incluyeron EGI (Cel7B) y EGII (Cel5A) de T. reesei purificadas (Suurnäkki et al., 2000) en los experimentos para la comparación. A todas las mezclas se les añadió un suplemento de β-glucosidasa adicional de Novozym 188 (para hacer la dosificación total de β-glucosidasa de 560 nkat/g de peso seco, se utilizó la dosificación relativamente alta para compensar las diferencias en las actividades de fondo de las diferentes preparaciones de EG). Se incubaron tubos por triplicado en la mezcla a 45°C durante 48 h y se prepararon muestra de referencia con enzimas inactivadas y los sustratos correspondientes. Se midió la liberación de los productos de la hidrólisis como azúcares reductores con el método DNS utilizando glucosa como patrón (Tabla 31).
Tabla 31. Productos de hidrólisis con diferentes preparaciones de endoglucanasa cuando se utilizan junto con celobiohidrolasas de T. reesei o con Cel7A de T. aurantiacus que alberga CBD de T. reesei. Productos de reacción después de 48 h de hidrólisis (45°C, pH 5,0) como azúcares reductores (mg/ml), glucosa medida como patrón. Abreviaturas: CBHI = celobiohidrolasa I (Cel7A) de T. reesei; CBHII = celobiohidrolasa II (Cel6A) de T. reesei; EGI = endoglucanasa I (Cel7B) de T. reesei, EGII = endoglucanasa II (Cel5A) de T. reesei; bG = β-glucosidasa (de Novozym 188); nd. = No realizado.
Enzimas
Sustrato
Endoglucanasa
CBH/Cel7 PICEA SECS
EG no añadida
CBHI y CBHII de T. reesei 2,4 3,2
EGI
CBHI y CBHII de T. reesei 3,5 4,6
EGII
CBHI y CBHII de T. reesei 3,8 3,5
EG_40 de At
CBHI y CBHII de T. reesei 4,9 4,3
At de tipo EG_40
CBHI y CBHII de T. reesei 4,5 4,8
EG_28 de Ta
CBHI y CBHII de T. reesei 3,0 3,9
sin EG añadida
Cel7A de T. aurantiacus + CBD de Tr 1,8 2,1
EG I
Cel7A de T. aurantiacus + CBD de Tr nd. 4,2
EG II
Cel7A de T. aurantiacus + CBD de Tr 3,2 nd.
EG_40 de At
Cel7A de T. aurantiacus + CBD de Tr 4,8 4.0
EG_28 de Ta
Cel7A de T. aurantiacus + CBD de Tr 1,5 nd.
En la Tabla 31 se han comparado las diferentes endoglucanasas basándose en la misma dosificación de actividad en la hidrólisis. Esto puede favorecer las enzimas con baja actividad específica contra el sustrato (hidroxietilcelulosa) utilizadas en el análisis y subestimar la eficacia de las enzimas con alta actividad específica contra hidroxietilcelulosa. En cualquier caso, los resultados demuestran que las endoglucanasas de Acremonium thermophilum funcionan muy bien en la hidrólisis cuando influyen juntas en ambas celobiohidrolasas utilizadas en la mezcla. Las endoglucanasas de A. thermophilum tienen un rendimiento similar a EGI/Cel7B de T. reesei que es una enzima muy eficaz sobre el sustrato rastrojo de maíz que contiene hemicelulosa debido a su fuerte actividad xilanasa secundaria. La endoglucanasa Cel5A de T. aurantiacus (EG_28 de ALKO4242) mostró una hidrólisis inferior que las enzimas de T. reesei.
Se puede concluir que las endoglucanasas de A. thermophilum funcionan con una eficacia comparable o mayor en comparación con las correspondientes enzimas de Trichoderma en la hidrólisis a juzgar por esta disposición experimental. Considerando también la estabilidad de temperatura de las endoglucanasas descritas en la presente memoria, los resultados indican que el rendimiento de las mezclas de enzimas celulasas a temperaturas más altas que 45°C se puede mejorar mediante el uso de las endoglucanasas descritas en la presente memoria.
Ejemplo 26. La hidrólisis de pícea pre-tratada con vapor de agua a altas temperaturas
Se suspendió fibra de pícea sometida a explosión de vapor de agua lavada (impregnación con SO2 al 3% p/p durante 20 min, seguido de pretratamiento con vapor de agua a 215°C durante 5 min), con 25,9% de materia seca en 5 ml de tampón de acetato de sodio 0,05 M con una consistencia de 10 mg/ml. Este sustrato se hidrolizó utilizando diferentes mezclas de enzimas en tubos de ensayo con agitación magnética en el baño de agua ajustado a diferentes temperaturas durante 72 h. Para cada punto de muestreo, se retiraron de la hidrólisis tubos de ensayo por triplicado, se hirvieron durante 10 min con el fin de terminar la hidrólisis enzimática, se centrifugaron, y el sobrenadante se analizó para determinar los productos de la reacción de hidrólisis. Los blancos que contenían
sustrato solo (solamente tampón añadido en lugar de enzimas) también se incubaron en las condiciones correspondientes.
Se preparó una mezcla de celulasas termófilas utilizando los siguientes componentes:
Preparación de CBH/Cel7 termófila que contiene Cel7A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 con CBD de CBHI/Cel7A de T. reesei anclado genéticamente. La preparación de proteína se produjo como se ha descrito en el Ejemplo 15 y se purificó de acuerdo con el Ejemplo 2, dando como resultado la preparación Cel7A de Ta + CBD de Tr purificada con contenido de proteína de 5,6 mg/ml.
Preparación de endoglucanasa termófila que contiene endoglucanasa At EG_40/Cel45A de Acremonium thermophilum ALKO4245. La proteína se produjo en T. reesei como se ha descrito en el Ejemplo 19. Con el fin de enriquecer los componentes termófilos, el medio de cultivo gastado se trató con calor (60°C durante 2 horas). La preparación obtenida contenía 4,9 mg/ml de proteína y 422 nkat/ml de actividad endoglucanasa (de acuerdo con la IUPAC, 1987).
Preparación de β-glucosidasa termófila preparada como se ha descrito en el Ejemplo 21 que contenía β-glucosidasa βG_81 de Ta/Cel3A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242. Con el fin de enriquecer los componentes termófilos, el caldo del fermentador se trató con calor (65°C durante 2 horas). La preparación obtenida contenía 4,3 mg/ml de proteína y actividad β-glucosidasa de 6270 nkat/ml (de acuerdo con Bailey y Linko, 1990).
Estas preparaciones de enzimas se combinaron como sigue (por 10 ml de mezcla): preparación de CBH/Cel7 4,51 ml, preparación endoglucanasa 5,19 ml y preparación de β-glucosidasa 0,29 ml. Esta mezcla se utilizó como "MEZCLA 1" de las enzimas termófilas.
Como comparación y referencia, se construyó una mezcla del estado de la técnica de enzimas de Trichoderma reesei comerciales combinando (por 10 ml): 8,05 ml de Celluclast 1,5 L FG (de Novozymes A/S) y 1,95 ml Novozym 188 (de Novozymes A/S). Ésta se denominó "ENZIMAS de T. REESEI ".
Las enzimas se dosificaron sobre la base de la actividad UFP de las mezclas: "MEZCLA 1" utilizando la dosis de 5,5 FPU por 1 gramo de materia seca en el sustrato de pícea, y "ENZIMAS de T. REESEI" utilizando 5,8 FPU por 1 gramo de materia seca en el sustrato de pícea.
Se tomaron muestras de la hidrólisis después de 24, 48 y 72 h y se trataron como se ha descrito anteriormente. Los productos de la hidrólisis se cuantificaron utilizando el análisis para azúcares reductores (Bernfeld, 1955), utilizando glucosa como patrón. La cantidad de productos de hidrólisis como azúcares reductores se presenta en la Figura 9.
Los resultados muestran claramente un mejor rendimiento de las enzimas descritas en la presente memoria en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica a 55°C y 60°C sobre el sustrato de abeto. Basándose en el análisis de HPLC el máximo rendimiento de los azúcares del sustrato sería 5,67 mg por 10 mg de sustrato seco de pícea. Debido a la dosificación relativamente baja de enzima, los rendimientos finales de azúcar eran claramente inferiores. Para las enzimas termoestables el rendimiento de azúcar basado en el análisis de azúcares reductores fue de 66% y 57% del teórico a 55°C y 60°C, respectivamente. Para las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica éste fue solo de 31% y 11% a 55°C y 60°C, respectivamente.
Ejemplo 27. Hidrólisis de rastrojo de maíz pre-tratado con vapor de agua a altas temperaturas
Se suspendió fibra de rastrojo de maíz sometida a explosión de vapor de agua (tratamiento a 195°C durante 5 min), con 45,3% de materia seca en 5 ml de tampón de acetato de sodio 0,05 M a una consistencia de 10 mg/ml. Los tratamientos y las mediciones se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 26.
Se construyó una mezcla de las celulasas termófilas descritas en la presente memoria utilizando los siguientes componentes:
Preparación de CBH termófila que contenía Cel7A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 con CBD de CBHI/Cel7A de T. reesei anclado genéticamente (Cel7A de Ta + CBD de Tr, Ejemplo 15). El contenido de proteína de la preparación fue 31 mg/ml.
La preparación de endoglucanasa termófila que contenía endoglucanasa At EG_40/Cel45A de Acremonium thermophilum ALKO4245 se obtuvo como se ha descrito en el Ejemplo 19. La preparación de enzima concentrada contenía actividad endoglucanasa (de acuerdo con la IUPAC, 1987) de 2057 nkat/ml.
La preparación de β-glucosidasa termófila que contenía β-glucosidasa βG_81 de Ta/Cel3A de Thermoascus aurantiacus ALKO 4242 se obtuvo como se ha descrito en el Ejemplo 21 que contenía una actividad β-glucosidasa (de acuerdo con Bailey y Linko, 1990), de 11500 nkat/ml.
Producto xilanasa termófila que contenía una xilanasa AM24 procedente de Nonomuraea flexuosa DSM43186. El producto se preparó mediante el uso de una cepa recombinante de Trichoderma reesei que había sido transformada con el casete de expresión de pALK1502, como se describe en el documento WO2005/100557. El producto sólido se
disolvió en agua para preparar una disolución al 10% y se obtuvo una preparación de enzima con actividad xilanasa (analizada de acuerdo con Bailey et al., 1992) de 208000 nkat/ml.
Estas preparaciones de enzimas se combinaron como sigue (por 10 ml de mezcla): preparación de CBH/Cel7 7,79 ml, preparación de endoglucanasa 0,96 ml, preparación de β-glucosidasa 1,14 ml y preparación de xilanasa 0,31 ml. Esta mezcla se utilizó como "MEZCLA 2" de las enzimas termófilas.
Como comparación y referencia, se construyó una mezcla del estado de la técnica de enzimas de Trichoderma reesei comerciales combinando (por 10 ml) 8,05 ml de Celluclast 1,5 L FG (de Novozymes A/S) y 1,95 ml de Novozym 188 (de Novozymes A/S). Ésta se denominó "ENZIMAS de T. REESEI".
Se tomaron muestras de la hidrólisis después de 24, 48 y 72 h y se trataron como se ha descrito anteriormente. Los productos de la hidrólisis se cuantificaron utilizando el análisis para azúcares reductores (Bernfeld, 1955), utilizando glucosa como patrón. Los resultados de los blancos de sustrato se restaron de las muestras con enzimas, y la concentración de los productos de hidrólisis como azúcares reductores se presentan en la Figura 10.
Los resultados muestran claramente un mejor rendimiento de las enzimas descritas aquí la presente memoria en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica. A 45°C, la mezcla de enzimas termófilas mostró una hidrólisis más eficaz en comparación con las enzimas de T. reesei: La hidrólisis fue más rápida y también se obtuvieron rendimientos más altos de azúcar. Basándose en el análisis de HPLC el máximo rendimiento de azúcares (incluyendo azúcares solubles libres en el sustrato no lavado que se había utilizado) del sustrato sería de 5,73 mg por 10 mg de sustrato seco. De este modo, la hidrólisis por las enzimas de la mezcla 2 fue casi completa en el plazo de 48 horas. A 55°C y 57,5°C las enzimas termófilas descritas la presente memoria también mostraron un rendimiento claramente mejor en la hidrólisis, en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica.
Ejemplo 28. Hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado a altas temperaturas utilizando una mezcla con una xilanasa termoestable
Se repitió el procedimiento explicado en el Ejemplo 27 excepto que el producto de xilanasa XT 02026A3 se remplazó por preparación de xilanasa termófila que contenía xilanasa XYN_30 de Ta/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 producida en T. reesei. El caldo del fermentador, producido como se describe en el Ejemplo 23 contenía una actividad xilanasa de 132000 nkat/ml (analizada de acuerdo con Bailey et al., 1992).
Estas preparaciones de enzimas se combinaron como sigue (por 10 ml de mezcla): preparación de CBH/Cel7 7,64 ml, preparación de endoglucanasa 0,96 ml, preparación de β-glucosidasa 1,15 ml y preparación de xilanasa 0,25 ml. Esta mezcla se utilizó como "MEZCLA 3" de las enzimas termófilas.
Como comparación y referencia, se construyó una mezcla del estado de la técnica de enzimas de Trichoderma reesei comerciales combinando (por 10 ml) 8,05 ml de Celluclast 1,5 L FG (de Novozymes A/S) y 1,95 ml de Novozym 188 (de Novozymes A/S). Ésta se denominó "ENZIMAS de T. REESEI".
Se tomaron muestras de la hidrólisis después de 24, 48 y 72 h y se trataron como se ha descrito anteriormente. Los productos de la hidrólisis se cuantificaron utilizando el análisis para azúcares reductores (Bernfeld, 1955), utilizando glucosa como patrón. Los resultados de los blancos de sustrato se restaron de las muestras con enzimas, y la concentración de los productos de hidrólisis como azúcares reductores se presenta en la Figura 11.
Los resultados muestran claramente un mejor rendimiento de la mezcla de las enzimas descritas en la presente memoria en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica. A 45°C, la mezcla de enzimas termófilas mostró una hidrólisis más eficaz en comparación con las enzimas de T. reesei. A 55°C y 60°C las enzimas termófilas descritas en la presente memoria mostraron un rendimiento claramente mejor en la hidrólisis, en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica. El rendimiento de la nueva mezcla de enzimas a 60°C estuvo al mismo nivel que el rendimiento de las enzimas del estado de la técnica a 45°C.
Ejemplo 29. Hidrólisis de pícea pre-tratada a altas temperaturas utilizando una mezcla con una xilanasa termoestable
Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 28 con fibra de pícea sometida a explosión de vapor de agua lavada (impregnación con SO2 al 3% p/p durante 20 min, seguido de pretratamiento con vapor de agua a 215°C durante 5 min, con 25,9% de materia seca) como sustrato utilizando temperaturas de hidrólisis 45°C, 55°C y 60°C. Se tomaron muestras de la hidrólisis después de 24, 48 y 72 h y se trataron como se ha descrito anteriormente. Los productos de la hidrólisis se cuantificaron utilizando el análisis para azúcares reductores (Bernfeld, 1955), utilizando glucosa como patrón. Los resultados de los blancos de sustrato se restaron de las muestras con enzimas, y la concentración de los productos de hidrólisis como azúcares reductores se presenta en la Figura 12.
Los resultados muestran claramente un mejor rendimiento de la mezcla de las enzimas descritas en la presente memoria, en comparación con las enzimas de Trichoderma del estado de la técnica a todas las temperaturas estudiadas. A 45°C la mezcla de enzimas termófilas mostró una hidrólisis más eficaz en comparación con las
enzimas de T. reesei, evidentemente debido a la mejor estabilidad en la hidrólisis a largo plazo. A 55°C la eficacia de la mezcla de las enzimas descritas en la presente memoria todavía estuvo al mismo nivel que a 45°C, mientras que la mezcla de estado de la técnica fue ineficaz con el sustrato utilizado a esta temperatura. A 60°C las enzimas termófilas descritas en la presente memoria mostraron una disminución de la hidrólisis aunque la hidrólisis estuvo casi al mismo nivel que el rendimiento de las enzimas del estado de la técnica a 45°C.
Ejemplo 30 Evaluación de la inhibición por glucosa de las β-glucosidasas de Acremonium thermophilium ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Los productos filtrados de cultivo producidos por las cepas Acremonium thermophilium ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 y Thermoascus aurantiacus ALKO4242 se describen en el Ejemplo 1. Las actividades βglucosidasa (medidas de acuerdo con Bailey y Linko, 1990) de estas preparaciones fueron 21,4 nkat/ml, 5,6 nkat/ml y 18,6 nkat/ml, respectivamente. Como comparación, también se incluyeron en el experimento las enzimas comerciales Celluclast 1,5 L (β-glucosidasa de 534 nkat/ml) y Novozym 188 (β-glucosidasa de 5840 nkat/ml).
Con el fin de evaluar la sensibilidad de las diferentes β-glucosidasas a la inhibición por glucosa, se realizó un procedimiento de análisis de la actividad patrón en presencia de diferentes concentraciones de glucosa. A las disoluciones de sustrato (p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido) para el análisis de la actividad β-glucosidasa se les añadió un suplemento de la glucosa de manera que la concentración de glucosa en la mezcla de análisis se ajustó a valores entre 0 y 0,5 M. Excepto esta adición de glucosa el análisis se realizó utilizando el procedimiento convencional (Bailey y Linko, 1990). Las actividades en presencia de concentraciones variables de glucosa como porcentaje de la actividad sin glucosa se presentan en la Figura 13.
Los resultados demuestran que las β-glucosidasas de C. thermophilum y T. aurantiacus se vieron menos afectadas por la inhibición por glucosa que las β-glucosidasas presentes en las enzimas comerciales: β-glucosidasa derivada de Aspergillus en Novozym 188 o β-glucosidasa derivada de Trichoderma en Celluclast 1,5 L. La enzima de A. thermophilum mostró un comportamiento comparable a la enzima de T. reesei de Celluclast. Especialmente la enzima de C. thermophilum fue claramente menos afectada por la alta concentración de glucosa. Por lo tanto, estos resultados indican que teniendo en cuenta la inhibición por glucosa el uso de las nuevas β-glucosidasas, especialmente a partir de cepas Acremonium thermophilium ALKO4242 y Chaetomium thermophilum ALK04261, proporcionaría claras ventajas en la hidrólisis en condiciones industriales con alta concentración de glucosa.
Ejemplo 31. Actividad en papel de filtro de mezclas de enzimas a altas temperaturas
La actividad en papel de filtro de las preparaciones de enzimas se midió de acuerdo con el método de la IUPAC (1987) como se ha descrito en el procedimiento, excepto la reacción enzimática se realizó a temperaturas de 50°C a 70°C. La actividad FPU calculada se basa en la cantidad de enzima requerida para hidrolizar 4% de sustrato de papel de filtro en 1 h en condiciones experimentales. Se considera que la actividad FPU representa la actividad celulasa global total de una preparación de enzima.
Las mezclas de enzimas fueron MEZCLA 2 preparada como se ha descrito en el Ejemplo 27, MEZCLA 3 preparada como se ha descrito en el Ejemplo 28, y MEZCLA 4. La MEZCLA 4 se preparó combinando las preparaciones de enzimas descritas en el Ejemplo 27 como sigue (por 10 ml de mezcla): preparación de CBH/Cel7 7,84 ml, preparación de endoglucanasa 0,99 ml y preparación de β-glucosidasa 1,17 ml.
Las mezclas de enzimas utilizadas como referencia, que representaban las mezclas del estado de la técnica, fueron:
"ENZIMAS A de T. REESEI" preparada como se describe la preparación de "ENZIMAS de T. REESEI" descrita en el Ejemplo 26.
"ENZIMAS B de T. REESEI" se construyó combinando (por 10 ml) 8,05 ml de Econase CE (una preparación de celulasa de T. reesei comercial de AB Enzymes Oy, Rajamäki, Finlandia) y 1,95 ml de Novozym 188 (de Novozymes A/S).
Las actividades FPU medidas para las preparaciones de enzimas a diferentes temperaturas se presentan en la Figura 14 como porcentajes de la actividad en condiciones convencionales (IUPAC, 1987) (a 50°C).
Los resultados demuestran claramente que las mezclas descritas aquí muestran una actividad celulasa global superior a temperaturas elevadas (60-70º) en comparación con las mezclas del estado de la técnica basadas en enzimas de Trichoderma y Aspergillus.
Ejemplo 32. Uso de las nuevas beta-glucosidasas en la preparación de soforosa
Una mezcla de producto hidrolizado de almidón de alta concentración (Nutriosa 74/968, Roquette) se trató con preparación enzimática enriquecida pG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus producida como se ha descrito en el Ejemplo 21 para producir una mezcla de azúcar que contenía cantidades apreciables de inductor de celulasa (soforosa) para superar la represión por glucosa.
La preparación enzimática enriquecida en βG_81/Cel3A de Ta se añadió a la disolución de Nutriosa al 70% (p/p) a una concentración final de 1 g de proteína total/litro. El recipiente de la mezcla se incubó en un baño de agua a 65°C durante 3 días con agitación constante y se utilizó como una fuente de carbono en un medio en matraces oscilantes para dos cepas de Trichoderma diferentes (A47 y Rut-C30). El efecto del tratamiento de la enzima se midió como la actividad endoglucanasa formada durante un cultivo en matraz oscilante durante 7 días. Como referencia se realizaron cultivos en las mismas condiciones con Nutriosa no tratada como fuente de carbono. Se obtuvo un incremento de más del doble en las actividades en los cultivos en matraz oscilante realizados en medio de Nutriosa pretratado con βG_81/Cel3A de Ta con las cepas sometidas a ensayo. Los resultados se muestran en la Figura 15.
Lista de depósito de organismos
10 (1) Centralbureau Voor Schimmelcultures en Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Países Bajos
(2) Centralbureau Voor Schimmelcultures en Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Países Bajos
(3)Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania
(4) [Después de la terminación del período de depósito actual, las muestras se almacenarán bajo los acuerdos para 15 dejar la cepa disponible más allá del tiempo aplicable de la patente].
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LISTA DE SECUENCIAS
5
<110> Roal <120> Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo
<130> 2051999
10
<160> 30
<170> PatentIn versión 3.1
15
<210> 1 <211> 3192 <212> ADN <213> Thermoascus aurantiacus
20 25
<220> <221> CDS <222> (1514)..(2122) <223>
30
<220> <221> Intrón <222> (2123)..(2187) <223>
35
<220> <221> CDS <222> (2188)..(2949) <223>
<400> 1
<210> 2 5 <211> 457
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
10 <400> 2
<210> 3 5 <211> 3055
<212> ADN
<213> Acremonium thermophilum.
10 <220>
<221> CDS
<222> (972)..(1595)
<223>
15 <220>
<221> Intrón
<222> (1596)..(1729)
<223>
20 <220>
<221> CDS
<222> (1730)..(2290)
<223>
25 <220>
<221> Intrón
<222> (2291)..(2412)
<223>
30 <220>
<221> CDS
<222> (2413)..(2540)
<223>
<220>
5 <221> Intrón
<222> (2541)..(2627)
<223>
<220>
10 <221> CDS
<222> (2628)..(2691)
<223>
<400> 3
<210> 4
<211> 459
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 4
<210> 5
<211> 3401 5 <212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (891)..(1299)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222> (1300)..(1387)
<223>
<220>
<221>
CDS 20 <222> (1388)..(1442)
<223>
<220>
<221>
Intrón 25 <222> (1443)..(1495)
<223>
<220>
<221> CDS
30 <222> (1496)..(1643) <223>.
<220>
<221>
Intrón 35 <222> (1644)..(1697)
<223>
<220>
<221>
CDS 40 <222> (1698)..(1928)
<223>
<220>
<221>
Intrón 45 <222> (1929).. (2014)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2015)..(2740)
<223>
<400> 5
<210> 6
<211> 523
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 6
<210> 7
<211> 3649
<212> ADN
<213> Chaetomium thermophilum 5
<220>
<221> CDS
<222> (1290)..(2879)
<223>
10
<220>
<221> Intrón
<222> (2880)..(2943)
<223>
15
<220>
<221> CDS
<222> (2944)..(2949)
<223>
20
<400> 7
<210> 8
<211> 532
<212> PRT
<213> Chaetomium thermophilum
<400> 8
<210> 9
<211> 1339
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> CDS
<222> (17)..(122)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (123)..(177)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (178)..(236)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (237)..(296)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (297)..(449)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (450)..(508)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (509)... (73)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (574)..(647)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (648)..(745)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (746)..(806)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (807)..(1330)
<223>
<400> 9
<210> 10
<211> 335
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 10
<210> 11
<211> 2334
<212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> característica miscelánea
<222> (13)..(13)
<223> N = no identificada
<220>
<221> CDS
<222> (715)..(797)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (798)..(856)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (857)..(1105)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1106)..(1228)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1229)..(1787)
<223>
<400> 11
<210> 12
<211> 297 5 <212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221> característica miscelánea 10 <222> (13)..(13)
<223> N = no identificada
<400> 12 <210> 13
<211> 2033 5 <212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (259)..(702)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222> (703)..(857)
<223>
<220>
<221>
CDS 5 <222> (858)..(888)
<223>
<220>
<221>
Intrón 10 <222> (889)..(990)
<223>
<220>
<221>
CDS 15 <222> (991)..(1268)
<223>
<400> 13
<210> 14
<211> 251
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 14
<210> 15
<211> 2800 5 <212> ADN
<213> Chaetomium thermophilum
<220>
<221>
característica miscelánea 10 <222> (2786)..(2786)
<223> N = no identificada
<220>
<221>
CDS 15 <222> (768)..(2042)
<223>
<400> 15
<210> 16
<211> 425 5 <212> PRT
<213> Chaetomium thermophilum
<220>
<221> característica miscelánea 10 <222> (2786)..(2786)
<223> N = no identificada
<400> 16
<210> 17
<211> 1943
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> CDS
<222> (13)..(256)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (257)..(329)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (330)..(370)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (371)..(444)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (445)..(493)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (494)..(561)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (562)..(683)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (684)..(786)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (787)..(932)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (933)...(1001)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1002)..(1090)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1091)..(1155)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1156)..(1174)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1175)..(1267)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1268)..(1295)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1296)..(1361)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1362)..(1451)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1452)..(1551)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1552)..(1617)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1618)..(1829)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1830)..(1922)
<223>
<400> 17
<210> 18
<211> 329
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 18
<210> 19
<211> 2955 5 <212> ADN .
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (1335)..(1671)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222> (1672)..(1806)
<223>
<220>
<221>
CDS 20 <222> (1807)..(2032)
<223>
<220>
<221>
Intrón 25 <222> (2033)..(2117)
<223>
<220>
<221>
CDS 30 <222> (2118)..(2802)
<223>
<400> 19
<210> 20
<211> 416
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 20
<210> 21
<211> 5092
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> CDS
<222> (669)..(728)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (729)..(872)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (873)..(1015)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1016)..(1082)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1083)..(1127)
<223>
<220> <221> Intrón
<222> (1128)..(1183)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1184)..(1236)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1237)..(1300)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1301)..(1717)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1718)..(1776)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1777)..(2489)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (2490)..(2599)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (2600)..(3469)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (3470)..(3531)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (3532)..(3759)
<223>
<400> 21
<210> 22
<211> 843
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 22
<210> 23
<211> 3510 5 <212> ADN
<213> Acremonium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (391)..(447)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222w (448)..(539)
<223> <220>
<221> CDS
<222> (540)..(685)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (686)..(759)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (760)..(1148)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1149)..(1217)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1218)..(3208)
<223>
<400> 23
<210> 24
<211> 861
<212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 24
<210> 25
<211> 3392 5 <212> ADN
<213> Chaetomium thermophilum
<220>
<221>
CDS 10 <222> (608)..(2405)
<223>
<220>
<221>
Intrón 15 <222> (2406)..(2457)
<223>
<220>
<221>
CDS 20 <222> (2458)..(2861)
<223>
<400> 25
<210> 26
<211> 734
<212> PRT
<213> Chaetomium thermophilum
<400> 26
<210> 27
<211> 1631
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> Intrón
<222> (610)..(674)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (675)..(1628)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(609)
<223>
<400> 27
<210> 28
<211> 521
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 28
<210> 29
<211> 1734
<212> ADN
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> Intrón
<222> (610)..(674)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1726)..(1731)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (675)..(1661)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(609)
<223>
<220>
<221> Intrón
<222> (1662)..(1725)
<223>
<400> 29
<210> 30
<211> 534
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 30

Claims (24)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para tratar material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa, y beta-glucosidasa, por medio del cual dicha celobiohidrolasa es una proteína de fusión que comprende una región núcleo de celobiohidrolasa anclada a un dominio de unión a celulosa, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 28 o 30, y en donde dicha región núcleo tiene una identidad de al menos 95% con el SEQ ID NO: 2.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en donde la endoglucanasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o con un fragmento del mismo que tiene actividad endoglucanasa.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 2, en donde la endoglucanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 3, en donde la endoglucanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, o Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
  5. 5.
    El método de la reivindicación 1, en donde la beta-glucosidasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o con un fragmento del mismo que tiene actividad beta-glucosidasa.
  6. 6.
    El método de la reivindicación 5, en donde la beta-glucosidasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, o Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
  7. 7.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material celulósico es material lignocelulósico.
  8. 8.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende tratar material lignocelulósico con al menos una enzima adicional, preferiblemente una xilanasa que comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 18 o 20, o con un fragmento del mismo que tiene actividad xilanasa.
  9. 9.
    El método de la reivindicación 8, en donde la xilanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus o Acremonium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, o Acremonium thermophilum CBS 116240.
  10. 10.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las enzimas se añaden al material celulósico o bien simultáneamente o bien sucesivamente.
  11. 11.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos una de las enzimas está codificada por un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.
  12. 12.
    El método de la reivindicación 1, en donde el material celulósico se selecciona del grupo que consiste en rastrojo de maíz, pasto varilla, paja de cereales, bagazo de caña de azúcar y materiales derivados de madera.
  13. 13.
    Una preparación de enzima que comprende celobiohidrolasa, endoglucanasa, y beta-glucosidasa, en donde dicha celobiohidrolasa es una proteína de fusión que comprende una región núcleo de celobiohidrolasa anclada a un dominio de unión a celulosa, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 28 o 30, y en donde dicha región núcleo tiene una identidad de al menos 95% con el SEQ ID NO:
  14. 2.
  15. 14.
    La preparación de enzima de la reivindicación 13, en donde la endoglucanasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o con un fragmento del mismo que tiene actividad endoglucanasa.
  16. 15.
    La preparación de enzima de la reivindicación 14, en donde la endoglucanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, o Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
  17. 16.
    La preparación de enzima de la reivindicación 13, en donde la beta-glucosidasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o con un fragmento del mismo que tiene actividad beta-glucosidasa.
  18. 17.
    La preparación de enzima de la reivindicación 16, en donde la beta-glucosidasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, o Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
  19. 18. La preparación de enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, que comprende al menos una enzima adicional, preferiblemente una xilanasa que comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 18 o 20, o con un fragmento del mismo que tiene actividad xilanasa.
    5 19. La preparación de enzima de la reivindicación 18, en donde la xilanasa es obtenible de Thermoascus aurantiacus
    o Acremonium thermophilum, preferiblemente de Thermoascus aurantiacus CBS 116239 o Acremonium thermophilum CBS 116240.
  20. 20. La preparación de enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 13-19, en donde al menos una de las
    enzimas está codificada por un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 10 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 o DSM 17667.
  21. 21.
    La preparación de enzima de la reivindicación 13, que está en forma de medio de cultivo gastado, o polvos, gránulos, o líquido.
  22. 22.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o la preparación de enzima de una cualquiera de las
    reivindicaciones 13-21, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el SEQ 15 ID NO: 28 o el SEQ ID NO: 30.
  23. 23.
    El uso de una preparación de enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 13-22 para la degradación de material celulósico.
  24. 24.
    El uso de la reivindicación 23, en donde el material celulósico se selecciona del grupo que consiste en rastrojo de maíz, pasto varilla, paja de cereales, bagazo de caña de azúcar y materiales derivados de madera.
    20 25. El uso del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o 22 en un procedimiento para preparar etanol a partir de material celulósico.
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