ES2526490T3 - Método para producir un dipéptido - Google Patents
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Abstract
Un microorganismo procariótico que sobreexpresa cualquiera de entre ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa e hidrolasa de amida de aminoácido L, donde dichas ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa e hidrolasa de amida de aminoácido L tienen actividad de síntesis de dipéptidos y en las que la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de una célula microbiana hacia el exterior de dicha célula microbiana (referida a partir de este punto como actividad de transporte de dipéptidos) es superior a la de la cepa original, mediante la transformación de la cepa original con un ADN que codifica una proteína con actividad de transporte de dipéptidos, donde dicha proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos se describe en cualquiera de los siguientes apartados [1] a [3]:7 [1] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, [2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido entre 1 y 20 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos, [3] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con un 80% o más de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos.
Description
Método para producir un dipéptido
Campo Técnico
La presente invención se refiere a un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que presenta actividad de síntesis de un dipéptido, y en el cual la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de la célula microbiana al exterior de la célula microbiana es mayor que la de la cepa original, y un proceso para producir un dipéptido usando el microorganismo.
Antecedentes de la invención
Como proceso para producir un dipéptido donde dos aminoácidos L están unidos mediante un enlace α, se conoce un proceso que utiliza el producto génico ywfE que es una de las sintasas de la bacilisina, un dipéptido antibiótico derivado de un microorganismo que pertenece al género Bacillus (documentos de patentes 1 – 8).
Como método para mejorar la capacidad productora de una cepa en fermentación de aminoácidos L, se conoce un método que incluye alterar un sistema de eflujo para aminoácidos L en una célula microbiana (documentos de patentes 9 – 14). Adicionalmente, también se conoce la presencia de un sistema de eflujo para Microcina J25, un antibiótico peptídico (documento no patente 1).
También en la producción de un dipéptido, se considera que la productividad de dipéptido mejora al potenciar la actividad de un sistema de exportación de dipéptidos, a saber, una proteína que presente actividad para transportar un dipéptido de la célula microbiana hacia el exterior de las células microbianas (desde este punto será referida como actividad de transporte de dipéptidos). Sin embargo, hasta el momento no se ha descubierto ninguna proteína que tenga actividad de transporte de dipéptidos.
Es sabido que el gen bcr de Escherichia coli es un gen que codifica proteína de membrana que está relacionado con la resistencia a biciclomicina (documento no patente 2), y el gen norE es un gen que codifica una bomba de eflujo que está relacionada con la resistencia a quinolona (documento no patente 3). Se ha publicado que el gen emrD es un gen que codifica una proteína transportadora de SDS (documento no patente 4). Se predice que el gen ydeE es un gen que codifica una proteína transportadora de fármaco, pero su actividad no ha sido confirmada (documento no patente 4). La función del gen yeeO permanece completamente desconocida.
Además, previamente se han descrito métodos para producir L-cisteína en microorganismos en los que el gen bcr podría regularse al alza (Patente de EE.UU. 2005/221453). Adicionalmente, se ha descrito la sobreexpresión de proteínas transportadoras de fármaco (que incluyen el bcr) en E. coli (Applied and Environmental Microbiology, 72(7), 4735-4742 (2006)). Finalmente, se han descrito métodos para producir dipéptidos en microorganismos, en particular E. coli, donde la E. coli ha sido transformada con el gen ywfE de Bacillus subtilis (EP 1 616 963).
Documento de Patente 1: WO 2004/058960 Documento de Patente 2: WO 2005/045006 Documento de Patente 3: WO 2005/052153 Documento de Patente 4: WO 2005/052177 Documento de Patente 5: WO 2005/103260 Documento de Patente 6: WO 2006/001379 Documento de Patente 7: WO 2006/001381 Documento de Patente 8: WO 2006/001382 Documento de Patente 9: WO 97/23597 A2 Documento de Patente 10: US 2003/0113899 A1 Documento de Patente 11: JP-A-2000-116390 Documento de Patente 12: JP-A-2000-189177 Documento de Patente 13: JP-A-2005-287333 Documento de Patente 14: JP-A-2005-237379 Documento no patente 1: J. Bacteriol., 187, 3465-3470 (2005)
Documento no patente 2: Gene, 127, 117-120 (1993)
Documento no patente 3: J. Antimicrob. Chemother., 51, 545-56 (2003)
Documento no patente 4: J. Bacteriol., 183, 5803-5812 (2001)
Descripción de la invención
Problemas a resolver con la invención
La presente invención tiene el objetivo de proporcionar un microorganismo que produzca de manera eficiente un dipéptido, y un proceso para producir un dipéptido usando el microorganismo.
Medios para resolver los problemas
La presente invención se refiere a los siguientes puntos (1) – (6).
(1) Un microorganismo procariótico que sobreexpresa cualquiera entre ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa y amida hidrolasa de aminoácido L, donde dicha ligasa de aminoácido L, dicha prolina imino peptidasa y dicha amida hidrolasa de aminoácido L presentan actividad de síntesis de dipéptidos y
en el que la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de una célula microbiana al exterior de la célula microbiana (denominada a partir de este punto actividad de transporte de dipéptidos) es mayor que la de la cepa original, mediante la transformación de la cepa original con un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos,
donde dicha proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos se describe en cualquiera de los siguientes puntos [1] a [3]:
[1] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como la mostrada por cualquiera de las SEQ ID Nos: 6 a 10,
[2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido de 1 a 20 aminoácidos a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID Nos: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos,
[3] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID Nos: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de aminoácidos.
- (2)
- El microorganismo de (1), que se obtiene transformando la cepa original con un ADN descrito en cualquiera de los siguientes puntos [1] a [3]:
[1] un ADN que codifica una proteína de cualquiera de los puntos [1] a [3] de la reivindicación 1,
[2] un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la región codificadora tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 5,
[3] un ADN que se hibrida con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una región codificadora de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 5 en condiciones severas, y que codifica la proteína que tiene actividad de transporte.
- (3)
- El microorganismo de (1) ó (2), que pertenece al género Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.
- (4)
- Un proceso para producir un dipéptido que comprende:
permitir que un cultivo o un cultivo tratado del microorganismo de uno cualquiera de los puntos (1) a (3) y un aminoácido, éster de aminoácido o amida de aminoácido, esté presente en un medio acuoso, permitiendo que el dipéptido se forme y se acumule en el medio acuoso, y recuperar el dipéptido del medio acuoso.
- (5)
- Un proceso para producir un dipéptido que comprende:
cultivar el microorganismo de (1) ó (2) y que tiene la capacidad de producir al menos un tipo de aminoácido diferente a los aminoácidos que constituyen el dipéptido en un medio, permitir que se forme el dipéptido y que se acumule en el medio, y recuperar el dipéptido del cultivo.
(6) El proceso de (4) ó (5), donde el microorganismo pertenece al género Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.
Efecto de la Invención
Según la presente invención, potenciando la actividad de una proteína que tiene una actividad de transporte de dipéptidos en una célula microbiana de un microorganismo hacia el exterior de la célula microbiana, el dipéptido puede producirse de forma eficiente usando dicho microorganismo.
Mejor método para llevar a cabo la invención
1. Microorganismo de la presente invención
(1) Microorganismo procariótico en el que la actividad de transporte de dipéptidos es superior a la de la cepa original.
Los ejemplos del microorganismo en el que la actividad de una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos es superior a la de la cepa original incluyen (a) en el contexto de la presente invención se describe i) un microorganismo en el que la actividad específica de la proteína se ve mejorada en comparación con la cepa original, e ii) un microorganismo que muestra un mayor producción de la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos en comparación con la cepa original, que se obtiene modificando un gen del ADN cromosomal de la cepa original, y que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos, e incluye (b) un microorganismo obtenido transformando la cepa original con un ADN que codifica una proteína que tienen actividad de transporte de dipéptidos. La cepa original de la presente especificación es la cepa original que es una diana para modificación o transformación, y puede ser una cepa natural o un mutante. Los ejemplos de cepa original incluyen, cuando el microorganismo es Escherichia coli, una cepa natural tal como la cepa E. coli K-12, la cepa B y la cepa B/r, o un mutante de las mismas. Los ejemplos de mutantes incluyen E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli ATCC 12435, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli Nº 49, E. coli W3110, E. coli NY49, E. coli MP347, E. coli NM522, E. coli BL21, E. coli ME8415 y otros similares.
Los ejemplos de proteína que tiene actividad transportadora de dipéptidos incluyen una proteína de cualquiera de los siguientes [1] – [3],
[1] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10,
[2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido entre uno y 20 aminoácidos a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos, y
[3] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10 y que tiene actividad de transporte de dipéptidos.
La proteína anterior que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido entre uno y 20 aminoácidos y que tiene actividad de transporte de dipéptidos, se puede obtener, por ejemplo, introduciendo una mutación sito-dirigida en el ADN que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10 mediante mutagénesis sito-dirigida como se describe en “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (referido a partir de este punto como “Molecular Cloning”, tercera edición); en “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons (1987-1997) (referido a partir de este punto como “Current Protocols in Molecular Biology”); en Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985), etc.
El número de residuos de aminoácido que se eliminan, sustituyen o añaden se encuentra dentro del rango en el que la eliminación, sustitución o adición es posible empleando métodos conocidos tales como la mencionada mutagénesis sito-dirigida. El número preferiblemente está entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 10, aún más preferiblemente entre 1 y 5.
La expresión “uno o más residuos de aminoácido son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 6 a 10” significa que la secuencia de aminoácidos puede contener la eliminación, sustitución o adición de un único residuo de aminoácido o de varios residuos de aminoácido en una posición arbitraria de las mismas.
La eliminación o adición de residuos de aminoácido puede darse, por ejemplo, a entre uno y 10 residuos de aminoácido del extremo N o el extremo C de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10.
La eliminación, sustitución y adición pueden estar contenidas simultáneamente en una secuencia, y los aminoácidos que van a sustituirse o añadirse pueden ser naturales o no. Los ejemplos de aminoácidos naturales son L-alanina, L
asparagina, ácido L-aspártico, L-arginina, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina y L-cisteína.
A continuación se presentan ejemplos de los aminoácidos capaces de sustitución mutua. Los aminoácidos del mismo grupo pueden sustituirse mutuamente.
Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, Ometilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclohexialanina.
Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2aminosubérico.
Grupo C: asparagina, glutamina.
Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropiónico.
Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina.
Grupo F: serina, treonina, homoserina.
Grupo G: fenilalanina, tirosina.
Adicionalmente, los ejemplos de proteínas que tienen actividad de transporte de dipéptidos incluyen una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más, aún más preferiblemente un 97% o más, de forma particularmente preferible un 98%
o más, lo más preferiblemente un 99% o más de homología con respecto a una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos.
La homología entre secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] y FASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]. En base al algoritmo BLAST, se han desarrollado programas tales como BLASTN y BLASTX [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]. Cuando se analiza una secuencia de nucleótidos mediante BLASTN en base a BLAST, los parámetros, por ejemplo, son los siguientes: puntuación = 100 y longitud de palabra = 12. Cuando se analiza una secuencia de aminoácidos mediante BLASTX en base a BLAST, los parámetros, por ejemplo, son los siguientes: puntuación = 50 y longitud de palabra = 3. Cuando se usan programas BLAST y BLAST con huecos (“gapped”), se emplean los parámetros por defecto de cada programa. Las técnicas específicas para estos análisis son bien conocidas.
El hecho de que la proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos, donde se eliminan, sustituyen o añaden entre uno y 20 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada por las SEQ ID NO: 6 a 10, tenga actividad de transporte de dipéptidos se puede confirmar, por ejemplo, preparando un transformante que tenga una actividad de proteína superior a la cepa original mediante la transformación de la cepa original con un ADN que codifica la proteína cuya actividad se quiere confirmar, añadiendo el cultivo de la cepa original o de la cepa transformada y los aminoácidos que constituyen el dipéptido objetivo a una disolución tampón, y comparando las cantidades de dipéptido formado y acumulado en el medio acuoso.
Los ejemplos de microorganismos de los mencionados anteriormente en (a) i), que tienen una actividad específica mejorada de la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos en comparación con la cepa original, incluyen un microorganismo que contenga una proteína mutante con actividad mejorada con respecto a la proteína con actividad de transporte de dipéptidos de la cepa original, ya que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos igual en la que entre uno y 20 aminoácidos, preferiblemente 1 – 10 aminoácidos, más preferiblemente 1 – 5 aminoácidos, aún más preferiblemente 1 – 3 aminoácidos, han sido sustituidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cepa original.
Se describen ejemplos de microorganismos con una producción mejorada de la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos, con respecto a la cepa original, de los mencionados anteriormente en (a) ii), que incluyen un microorganismo que muestra una mejora en la cantidad producida de la proteína con respecto a la proteína que tiene actividad transportadora de dipéptidos de la cepa original, ya que tiene una región promotora en la que se ha sustituido no menos de una base, preferiblemente entre 1 y 10 bases, más preferiblemente entre 1 y 5 bases, aún más preferiblemente entre 1 y 3 bases, de la secuencia de nucleótidos de la región reguladora de la transcripción o de la región promotora del gen que codifica la proteína, que está presente en el ADN cromosomal de la cepa original.
Los ejemplos de microorganismos obtenidos al transformar la cepa original de los mencionados anteriormente en (b) con un ADN que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos incluyen un microorganismo obtenido mediante la transformación de la cepa original con
[4] un ADN que codifica una proteína de cualquiera de los mencionados anteriormente en [1] a [3],
[5] un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de la región codificadora en la secuencia de nucleótidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5, o
[6] un ADN que se hibrida con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de una región codificadora de la secuencia de nucleótidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5 en condiciones severas, y que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos.
Los ejemplos de microorganismos incluyen i) un microorganismo que tiene un ADN exógeno que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos en el ADN cromosomal y ii) un microorganismo que tiene un ADN exógeno que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos fuera del cromosoma. En otras palabras, el microorganismo de i) significa que la cepa original no tiene un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos y uno o más ADNs recién introducidos están presentes en el ADN cromosomal, o la cepa original tiene intrínsecamente un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos, lo que incluye el ADN recién introducido, están presentes en el ADN cromosomal. El microorganismo de ii) es un microorganismo que tiene un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos el ADN plásmido.
“Hibridar” como se ha mencionado anteriormente se refiere a una etapa de hibridación de ADN con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos específica o una parte del ADN puede usarse como sonda para análisis Northern o Southern blot como un cebador de oligonucleótido para análisis de PCR. Los ADNs usados como sonda incluyen ADNs que comprenden al menos 100 o más bases, preferiblemente 200 o más bases, más preferiblemente 500 o más bases, y los ADNs usados como cebador incluyen ADNs que comprenden al menos 10 o más bases, preferiblemente 15 o más bases.
Los métodos de los experimentos de hibridación de ADN son bien conocidos y, por ejemplo, los especialistas en la técnica pueden determinar las condiciones de hibridación según la descripción de la especificación de la presente solicitud. Se pueden emplear condiciones de hibridación acordes a muchos libros de texto, que incluyen la descripción de “Molecular Cloning”, Segunda Edición, Tercera Edición (2001), “Methods for General and Molecular Bacteriology”, ASM Press (1994) e “Immunology Methods Manual”, Academic Press (Molecular).
Por ejemplo, la hibridación en condiciones severas mencionada anteriormente se lleva a cabo como se indica a continuación. Se incuban un filtro y un ADN sonda en una disolución que comprende un 50% de formamida, 5xSSC (750 mmol/l de cloruro sódico y 75 mmol/l de citrato sódico), 50 mmol/l de fosfato sódico (pH 7,6), 5xdisolución de Denhardt, un 10% de sulfato de dextrano y 20 µg/L de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC durante una noche, y tras la incubación, por ejemplo, el filtro se lava preferiblemente en disolución 0,2xSSC a aproximadamente 65ºC. También se pueden emplear condiciones menos severas. La modificación de las condiciones severas se puede realizar ajustando la concentración de formamida (las condiciones se hacen menos severas al reducir la concentración de formamida) y cambiando las condiciones de concentración salina y temperatura. La hibridación en condiciones menos severas se lleva a cabo, por ejemplo, incubando un filtro con ADN inmovilizado sobre él y una sonda de ADN en una disolución que comprende 6xSSCE (20xSSCE: 3 mol/L de cloruro sódico, 0,2 mol/L de dihidrogenofosfato sódico y 0,02 mol/L de EDTA, pH 7,4), 0,5% de SDS, 30% de formamida y 100 µg/L de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 37ºC durante una noche, y lavando el filtro con disolución 1xSSC que contiene 0,1% de SDS a 50ºC. La hibridación en condiciones aún menos severas se lleva a cabo mediante hibridación en las condiciones menos severas anteriores usando una disolución que tenga una elevada concentración salina (por ejemplo, 5xSSC), y lavando el filtro.
También se pueden establecer varias condiciones descritas anteriormente añadiendo un reactivo de bloqueo usado para reducir el ruido de fondo de la hibridación o para cambiar el reactivo. La adición de dicho reactivo bloqueante puede venir acompañada de cambios en las condiciones para la hibridación para hacer que las condiciones sean más adecuadas para el propósito.
El anterior ADN capaz de hibridación en condiciones severas incluye ADN que tiene al menos un 90% o más, preferiblemente un 95% o más, más preferiblemente un 97% o más, aún más preferiblemente un 98% o más, de forma particularmente preferida un 99% o más, de homología con respecto al ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la región codificadora de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5, calculada mediante el uso de programas tales como BLAST y FASTA descritos antes en base a los parámetros anteriores.
- (2)
- Microorganismos que tienen la capacidad de producir una proteína que tenga actividad de síntesis de dipéptidos
El microorganismo que tiene capacidad para producir una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos no está limitado particularmente, siempre que presente dicha capacidad. Los ejemplos del mismo incluyen un microorganismo que produce una proteína que tiene actividad para sintetizar dipéptidos condensando y ligando uno
- o más tipos de aminoácidos [referidos a partir de este punto como ligasa de aminoácido L (EC 6.3.2.28)], un microorganismo que produce una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos a partir de un éster de aminoácido L y un aminoácido L, un microorganismo que produce una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos a partir de amida de aminoácido L y aminoácido L, y similares.
Los ejemplos del microorganismo que produce una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos condensando y ligando uno o más tipos de aminoácidos incluyen un microorganismo que produce una proteína seleccionada del grupo que consiste en NRPS, D-Ala-D-Ala ligasa y ligasa de aminoácido L.
Los ejemplos del microorganismo que produce NRPS incluyen procariontes que incluyen Bacillus, eucariontes que incluyen Penicillium, microorganismos que producen TycA, TycB y TycC (GenBank AF004835), un microorganismo que produce PcbAB (GenBank M57425), y un microorganismo que produce una proteína que tiene un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más, de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína seleccionada entre BacA, BacB, BacC, TycA, TycB, TycC y PcbAB y que tienen actividad de NRPS, y otros similares.
Los ejemplos de microorganismo que produce D-Ala-D-Ala ligasa incluyen un procarionte que forma un peptidoglicano, un microorganismo que produce DdlA (nº de acceso de GenBank M58467), un microorganismo que produce DdlC (nº de acceso de GenBank D88151), y un microorganismo que produce una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos donde uno o más aminoácidos han sido eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera seleccionado entre DdlA, DdlB y DdlC, y que tiene actividad de D-AlaD-Ala ligasa, y otros similares.
La homología de la secuencia de aminoácidos se puede determinar usando un programa tal como los anteriormente mencionados BLAST, FASTA y similares.
Los ejemplos de microorganismos que producen ligasa de aminoácido L incluyen microorganismos que pertenecen al género Bacillus, preferiblemente Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, y el microorganismo que produce la proteína descrita en el documento WO 2004/058960.
Los ejemplos de ligasa de aminoácido L incluyen microorganismos capaces de producir una proteína seleccionada de entre los siguientes puntos [7] a [10]:
[7] Una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID N: 11 a 18,
[8] Una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos, donde se han eliminado, sustituido o añadido uno o más aminoácidos a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 11 a 18, y que tiene actividad de ligasa de aminoácido L,
[9] Una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80% o más, preferiblemente del 90% o más, más preferiblemente del 95% o más, aún más preferiblemente del 97% o más, de forma particularmente preferida del 98% o más, lo más preferiblemente del 99% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 11 a 18, y que tiene actividad de ligasa de aminoácido L, y
[10] Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80% o más, preferiblemente del 90% o más, más preferiblemente del 95% o más, aún más preferiblemente del 97% o más, de forma particularmente preferida del 98% o más, lo más preferiblemente del 99% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 19, y que tiene actividad de ligasa de aminoácido L.
Los ejemplos de microorganismos que producen una proteína que tiene una actividad de síntesis de dipéptidos a partir de un éster de aminoácido L y aminoácido L incluyen un microorganismo que produce prolina imino peptidasa; específicamente, microorganismos que pertenecen al género Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, y similares. Específicamente, los ejemplos de microorganismo incluyen Bacillus subtilis ATCC6633, Bacillus coagulans EK01 [J. Bacteriol., 174, 7919 (1992)], Corynebacterium glutamicum ATCC13286, Pseudomonas putida AJ-2402 (FERM BP8101), Pseudomonas putida ATCC12633, Pseudomonas putida AJ2048 (FERM BP-8123) (los microorganismos anteriores se describen en el documento WO 03/010307) y otros similares. Los ejemplos de microorganismos productores de prolina imino peptidasa incluyen Arthrobacter nicotianae [FEMS Microbiol. Lett., 78, 191 (1999)], Escherichia coli (JP-A-2-113887), Flavobacterium meningosepticum [Arch. Biochem. Biophys., 336, 35 (1996)], Hafnia alvei [J. Biochem., 119, 468 (1996)], Lactobacillus delbrueckii [Microbiology, 140, 527 (1994)], Bacillus coagulans [J. Bacteriol., 174, 7919 (1994)], Aeromonas sobria [J. Biochem., 116, 818 (1994)], Xanthomonas campestris (JP-A-9-121860), Neisseria gonorrhoeae [Mol. Microbiol., 9, 1203 (1993)], Propionibacterium freudenreichii [Appl. Environ. Microbiol., 64, 4736 (1998)], Serratia marcescens [J. Biochem., 122, 601 (1997)], Corynebacterium variabilis [J. Appl. Microbiol., 90, 449 (2001)], Thermoplasma acidophilum [FEBS Lett., 398, 101 (1996)], Pseudomonas aeruginosa [Nature, 406, 959 (2000)] y otros similares.
Además, los ejemplos de microorganismos que producen prolina imino peptidasa incluyen un microorganismo que tenga la capacidad de producir una proteína seleccionada de entre los siguientes puntos [11] – [13]:
[11] prolina imino peptidasa descrita en cualquiera de los siguientes documentos, WO 03/010307, FEMS Microbiol. Lett., 78, 191 (1999), JP-A-2-113887, Arch. Biochem. Biophys., 336, 35 (1996), J. Biochem., 119, 468 (1996), Microbiology, 140, 527 (1994), J. Bacteriol., 174, 7919 (1994), J. Biochem., 116, 818 (1994), JP-A-9-121860, Mol. 7 5
Microbiol., 9, 1203 (1993), Appl. Environ. Microbiol., 64, 4736 (1998), J. Biochem., 122, 601 (1997), FEBS Lett., 398, 101 (1996), y Nature, 406, 959 (2000),
[12] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos, donde se han eliminado, sustituido o añadido uno
o más aminoácidos de secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente de prolina imino péptidos de [11], y que tiene actividad de prolina imino peptidasa, y
[13] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80% o más, preferiblemente del 90% o más, más preferiblemente del 95% o más, aún más preferiblemente del 97% o más, de forma particularmente preferida del 98% o más, lo más preferiblemente del 99% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las prolina imino peptidasas mencionadas anteriormente en [11], y que tiene actividad de prolina imino peptidasa.
Los ejemplos de microorganismos que producen una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos a partir de amida de aminoácido L y de aminoácido L incluyen un microorganismo que produce hidrolasa de amida de aminoácido L; específicamente, microorganismos que pertenecen al género Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Rhodococcus, Chryseobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Cryptcoccus, Trichosporon, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Tremella, Torulaspora, Sterigmatomyces y Rhodotorula, preferiblemente un microorganismo que pertenece al género Bacillus, Corynebacterium y Pseudomonas, más preferiblemente Bacillus megaterium AJ3284 (FERM BP-8090), Corynebacterium glutamicum ATCC13286, Micrococcus luteus ATCC9341, Pseudomonas saccharophila ATCC15946 (los microorganismos anteriores se describen en el documento WO 03/010187) y similares.
Adicionalmente, los ejemplos de microorganismos que producen una proteína que tiene actividad de hidrolasa de amida de aminoácido L incluyen un microorganismo que tienen la capacidad de producir una proteína seleccionada de los siguientes puntos [14] – [16]:
[14] la hidrolasa de amida de aminoácido L descrita en WO 03/010187,
[15] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácido donde se han eliminado, sustituido o añadido uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la hidrolasa de amida de aminoácido L descrita en el documento WO 03/010187, y que tiene actividad de hidrolasa de amida de aminoácido L, y
[16] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 80% o más, preferiblemente del 90% o más, más preferiblemente del 95% o más, aún más preferiblemente del 97% o más, de forma particularmente preferida del 98% o más, lo más preferiblemente del 99% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la hidrolasa de amida de aminoácido L descrita en el documento WO 03/010187, y que tiene actividad de hidrolasa de amida de aminoácido L.
En lo anterior, la proteína que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido uno o más aminoácidos, y que tiene actividad de síntesis de dipéptidos, puede adquirirse siguiendo un método similar al mencionado anteriormente en (1). El número, tipo y similar de aminoácidos a eliminar, sustituir o añadir es igual a lo mencionado anteriormente en (1).
La homología de secuencias de aminoácido se puede determinar usando un programa tal como los mencionados BLAST, FASTA y similares.
Adicionalmente, un microorganismo que tiene un ADN recombinante obtenido ligando un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos condensando y ligando uno o más tipos de aminoácidos, un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos a partir de éster de aminoácido L y de aminoácido L, o un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos a partir de amida de aminoácido L y aminoácido L y un ADN vector también es un microorganismo que tiene capacidad para producir una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos.
Los ejemplos de microorganismos incluyen microorganismos que pertenecen al género Escherichia, Bacillus, Corynebacterium o Saccharomyces.
Los ejemplos de ADN que codifica una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos condensando y ligando uno o más tipos de aminoácidos incluyen ADNs que codifican NRPS, D-Ala-D-Ala ligasa, ligasa de aminoácido L, y otros similares.
Los ejemplos de ADN que codifica NRPS incluyen ADN que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en BacA, BacB, BacC, TycA, TycB, TycC y PcbAB.
Los ejemplos de ADN que codifica D-Ala-D-Ala ligasa incluyen un ADN que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en DdlA, DdlB y DdlC.
Los ejemplos de ADN que codifican ligasa de aminoácido L incluyen ADN seleccionado de los siguientes puntos [17]
– [20]:
[17] un ADN que codifica la ligasa de aminoácido L descrita en cualquiera de los puntos mencionados anteriormente
[7] a [10],
[18] un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 20 a 28,
[19] un ADN que se hibrida con un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 20 a 28 en condiciones severas, y que codifica una proteína que tiene actividad de ligasa de aminoácido L, y
[20] un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una homología del 80% o más, preferiblemente del 90% o más, más preferiblemente del 95% o más, aún más preferiblemente del 97% o más, de forma particularmente preferida del 98% o más, lo más preferiblemente del 99% o más, con respecto a la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 29, y que codifica una proteína que tiene actividad de ligasa de aminoácido L.
Los ejemplos de ADN que codifican una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos a partir de éster de aminoácido L y aminoácido L incluyen un ADN seleccionado de los siguientes apartados [21] – [23]:
[21] un ADN que codifica la prolina imino peptidasa descrita en cualquiera de los puntos mencionados anteriormente
[11] a [13],
[22] un ADN que codifica prolina imino peptidasa que tiene la secuencia de nucleótidos descrita en cualquiera de WO 03/010307, FEMS Microbiol. Lett., 78, 191 (1999), JP-A-2-113887, Arch. Biochem. Biophys., 336, 35 (1996), J. Biochem., 119, 468 (1996), Microbiology, 140, 527 (1994), J. Bacteriol., 174, 7919 (1994), J. Biochem., 116, 818 (1994), JP-A-9-121860, Mol. Microbiol., 9, 1203 (1993), Appl. Environ. Microbiol., 64, 4736 (1998), J. Biochem., 122, 601 (1997), FEBS Lett., 398, 101 (1996), y Nature, 406, 959 (2000), y
[23] un ADN que se hibrida con un ADN de cadena complementaria del ADN que codifica prolina imino peptidasa de cualquiera de las mencionadas anteriormente en [21] en condiciones severas, y que codifica una proteína que tiene actividad de prolina imino peptidasa.
Los ejemplos de ADN que codifican una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos a partir de amida de aminoácido L y de aminoácido L incluyen ADN seleccionado de los siguientes apartados [24] – [26]:
[24] un ADN que codifica la hidrolasa de amida de aminoácido L de cualquiera de los apartados mencionados anteriormente [14] – [16],
[25] un ADN que codifica una hidrolasa de amida de aminoácido L que tiene la secuencia de nucleótidos descrita en el documento WO 03/010187, y
[26] un ADN que se hibrida con una cadena complementaria de un ADN que codifica una hidrolasa de amida de aminoácido L que tiene la secuencia de nucleótidos descrita en el documento WO 03/010187 en condiciones severas, y que codifica una proteína que tiene actividad de hidrolasa de amida de aminoácido L.
El ADN que puede hibridarse en condiciones severas es el mismo de la definición del anteriormente mencionado (1). El hecho de que el ADN que se hibrida con el ADN mencionado anteriormente en condiciones severas sea un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos se puede confirmar empleando un método que incluye la preparación de un ADN recombinante que expresa el ADN, usando un microorganismo obtenido introduciendo el ADN recombinante en una célula hospedante como fuente enzimática, 1) añadiendo la fuente de enzima y uno o más tipos de aminoácidos a un medio acuoso, y analizando si se forma y acumula un dipéptido o no en el medio acuoso mediante HPLC o similar, 2) añadiendo la fuente de enzimas, éster de aminoácido L y aminoácido L en un medio acuoso, y analizando si se forma y se acumula un dipéptido o no en el medio acuoso mediante HPLC o similar, o 3) añadiendo la fuente de enzimas, amida de aminoácido L y aminoácido L en un medio acuoso, y analizando si se forma y se acumula un dipéptido en el medio acuoso mediante HPLC o similar.
La homología de la secuencia de nucleótidos se puede determinar usando un programa como los mencionados anteriormente BLAST, FASTA y similares.
2. Preparación de un microorganismo procariótico usado en la presente invención
(1) Preparación de un microorganismo en el que una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos presenta una actividad mayor que la de la cepa original
De los microorganismos en los que una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos presenta mayor actividad que la de la cepa original, en la presente memoria se describe un microorganismo en el que la actividad específica es mayor que la de la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos de la cepa original, que puede obtenerse sometiendo un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos a un 9 5
tratamiento de mutación in vitro con un mutágeno, o a PCR con tendencia a error y otros similares para introducir una mutación en el ADN, sustituyendo un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos antes de la introducción de la mutación, que está presente en el ADN cromosomal de la cepa original, con el ADN mutante por un método conocido [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 6640 (2000)] para proporcionar una cepa modificada que exprese el ADN mutante, y comparar la actividad de transporte de dipéptidos de la cepa original y de la cepa modificada de acuerdo a los métodos mencionados anteriormente.
Adicionalmente, de los microorganismos en los que la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos muestra una actividad superior a la de la cepa original, en la presente memoria se describe un microorganismo en el que la cantidad de proteína producida es superior a la de la cepa original, lo que puede confirmarse mediante un método que incluye someter un ADN que tiene una región reguladora de la transcripción y una región promotora del gen que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos de la cepa original, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de 200 pb, preferiblemente 100 pb, por encima del codón de inicio de la proteína, a un tratamiento de mutación in vitro, o a PCR con tendencia a erro o similar, para introducir una mutación en el ADN, sustituyendo la región reguladora de la transcripción y la región promotora del gen que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos antes de la introducción de la mutación, que está presente en el ADN cromosomal de la cepa original, con el ADN mutante mediante un método conocido [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 6640 (2000)] para proporcionar una cepa modificada que tenga una región reguladora de la transcripción mutante o una región promotora mutante, y comparar las cantidades de tránscrito de los genes que codifican la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos de la cepa original y de la cepa modificada mediante RT-PCR, hibridación Northern y similares, o comparando las cantidades producidas de proteína con actividad de transporte de dipéptidos de la cepa original y de la cepa modificada mediante SDS-PAGE y similares.
Adicionalmente, en la presente memoria se describe que un microorganismo en el que se ha promocionado el nivel de producción de la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos en comparación con la cepa original también se puede obtener sustituyendo la región promotora de un gen que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos de la cepa original con una secuencia promotora fuerte conocida.
Los ejemplos de dicho promotor incluyen promotores derivados de Escherichia coli, fagos y similares, que son funcionales en E. coli, tal como el promotor trp (Ptrp), el promotor lac (Plac), el promotor PL, el promotor PR, el promotor PSE y otros similares, el promotor SPO1, el promotor SPO2, el promotor penP y otros similares. Adicionalmente, también se pueden mencionar promotores construidos artificialmente tales como un promotor que tenga dos Ptrp conectados en tándem, el promotor tac, el promotor lacT7, el promotor let I y otros similares.
A continuación se explica en detalle el método de preparación de un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos, y un método de preparación de un microorganismo obtenido mediante la transformación de la cepa original con el ADN.
(a) Preparación de un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos
Un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos se puede obtener, por ejemplo, mediante hibridación Southern de una biblioteca de ADN cromosomal de un microorganismo tal como E. coli y similar, usando un ADN sonda que puede diseñarse en base a la secuencia de nucleótidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, o mediante PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] usando un ADN cebador que puede diseñarse en base a la secuencia de nucleótidos y el ADN cromosomal de un microorganismo, preferiblemente E. coli, como plantilla.
Adicionalmente, es posible buscar en varias bases de datos de secuencias génicas una secuencia que tenga una homología del 80% o más, preferiblemente del 90% o más, más preferiblemente del 95% o más, aún más preferiblemente del 97% o más, lo más preferiblemente del 99% o más, con respecto a la secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y, en base a la secuencia de nucleótidos obtenida mediante dicha búsqueda, obtener un ADN que codifique una proteína que tenga actividad de transporte de dipéptidos de acuerdo a los métodos mencionados anteriormente a partir de ADN cromosomal, una biblioteca de ADNc, y otros similares, del microorganismo que tiene la secuencia de nucleótidos.
La secuencia de nucleótidos del ADN puede determinarse incorporando el ADN obtenido directamente o tras realizar la ruptura con una enzima de restricción adecuada, y similar, en un vector de acuerdo a un método convencional, e introduciendo el ADN recombinante obtenido en una célula hospedante, y analizando la secuencia mediante un método de análisis de secuencia de nucleótidos usado de manera general, por ejemplo, el método didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)], o usando un aparato de análisis de secuencia de nucleótidos tal como el analizador 3700 DNA (fabricado por Applied Biosystems) y otros similares.
Como vector se puede mencionar pBluescriptII KS (+) fabricado por Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (fabricado por Stratagene), pT7Blue (fabricado por Novagen), pCR II (fabricado por Invitrogen) y pCR-TRAP (fabricado por GenHunter Corporation) y similares.
Como célula hospedante, se pueden mencionar los microorganismos que pertenecen al género Escherichia y similar. Los ejemplos de microorganismos que pertenecen al género Escherichia incluyen E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli ATCC 12435, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No.49, E. coli W3110, E. coli NY49, E. coli MP347, E. coli NM522, E. coli BL21, E. coli ME8415 y similares.
Para la introducción de ADN recombinante, se puede usar cualquier método siempre que el ADN sea introducido en la célula hospedante mencionada anteriormente. Por ejemplo, se puede mencionar un método que usa ion calcio [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], el método de protoplasto (JP-A-63-248394), el método de electroporación [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] y similares.
Como resultado de la determinación de la secuencia de nucleótidos, cuando es ADN obtenido es un ADN parcial, se puede obtener el ADN de longitud completa sometiendo a una biblioteca de ADN cromosomal a un método de hibridación Southern usando el ADN parcial como sonda, y similares.
Además, el ADN objeto se puede preparar en base a la secuencia de nucleótidos de ADN determinada mediante síntesis química usando un sintetizador de ADN de tipo 8905 fabricado por Perceptive Biosystems y similar.
Los ejemplos de ADN obtenido como se ha mencionado anteriormente incluyen un ADN que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10 y un ADN que tiene una región codificadora en la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5.
(b) Preparación del microorganismo transformado con vector de plásmido que expresa la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos
En base al ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos, que se obtiene mediante el método del aparato (a) anterior, se prepara si es necesario un fragmento de ADN con una longitud adecuada y que contiene una parte que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos. Adicionalmente, se puede obtener un transformante que muestra un aumento de la cantidad de proteína sustituyendo la base de la secuencia de nucleótidos de la parte que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos, de tal modo que se pueda obtener un codón óptimo para la expresión en la célula hospedante.
El ADN recombinante se prepara insertando el fragmento de ADN por debajo de un promotor de un vector de expresión adecuado.
Al introducir el ADN recombinante en una célula hospedante adecuada para el vector de expresión, se puede obtener un transformante en el que la actividad de una proteína que tenga actividad de transporte de dipéptidos mejora con respecto a la de la célula hospedante, a saber, la cepa original.
Como célula hospedante, se pueden usar microorganismos procarióticos, más preferiblemente bacterias, más preferiblemente microorganismos que pertenezcan al género Escherichia, lo más preferiblemente E. coli.
Los vectores de expresión que pueden emplearse son aquellos capaces de replicación o integración autónomas en el cromosoma de las células hospedantes anteriores y que contienen un promotor en una posición apropiada para la transcripción del ADN que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos.
Cuando se usa un procarionte como célula hospedante, se prefiere que el ADN recombinante que comprende el ADN que sea capaz de replicación autónoma en el procarionte y que comprenda un promotor, una secuencia de unión a ribosoma, el ADN que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos y una secuencia de terminación de la transcripción. El ADN recombinante puede comprender además un gen que regule el promotor.
Los ejemplos de vectores de expresión son pColdI (fabricado por Takara Bio Inc.), pCDF-1b, pRSF-1b (ambos fabricados por Novagen, Inc.), pMAL-c2x (fabricado por New England Biolabs), pGEX-4T-1 (fabricado por GE Healthcare Bioscience), pTrcHis (fabricado por Invitrogen), pSE280 (fabricado por Invitrogen), pGEMEX-1 (fabricado por Promega Corp.), pQE-30 (fabricado por Qiagen, Inc.), pET-3 (fabricado por Novagen, Inc.), pKYP10 (JP-A-58110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pBluescriptII SK(+), pBluescript II KS(-) (fabricado por Stratagene), pTrS30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)], pTrS32 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pPAC31 (WO 98/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (fabricado por Takara Bio Inc.), pUC118 (fabricado por Takara Bio Inc.), pPA1 (JP-A-63-233798) y otros similares.
Como promotor, se puede usar cualquier promotor capaz de funcionar en células hospedantes tales como E. coli. Por ejemplo, también se pueden usar promotores derivados de E. coli, fagos y otros similares, tales como el promotor trp (Ptrp), el promotor lac (Plac), el promotor PL, el promotor PR, el promotor PSE, el promotor SPO1, el promotor SPO2, el promotor penP. También se pueden usar promotores modificados y diseñados artificialmente tales como un promotor que tenga dos Ptrp combinados en tándem, el promotor tac, el promotor lacT7 y el promotor let I, etc.
También se pueden usar promotores tales como el promotor xylA para la expresión en microorganismos que pertenezcan al género Bacillus [Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)] y el promotor P54-6 para la expresión en microorganismos que pertenezcan al género Corynebacterium [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674679 (2000)].
Se prefiere usar un plásmido en el que la distancia entre la secuencia de Shine-Dalgarno (secuencia de unión de ribosomas) y el codón de inicio se ajuste a una longitud apropiada (p.ej., de 6 a 18 bases).
En un ADN recombinante en el que un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos se une a un vector de expresión, no siempre es necesaria una secuencia terminadora de la transcripción. Sin embargo, es preferible disponer la secuencia terminadora de la transcripción inmediatamente por debajo del gen estructural.
Los ejemplos de dicho ADN recombinante incluyen pSbcr, pSnorE, pSydeE, pSemrD y pSyeeO, mostrados más adelante.
Como hospedante de ADN recombinante, se pueden mencionar los procariontes, más preferiblemente bacterias.
Los ejemplos de procariontes incluyen microorganismos que pertenecen a los géneros Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Scenedesmus, Streptomyces, Synechoccus, Zymomonas y otros similares. Por ejemplo, se pueden mencionar los siguientes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Anabaena cylindrica, Anabaena doliolum, Anabaena flos-aquae, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globformis, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter mysorens, Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter protophormiae, Arthrobacter roseoparaffinus, Arthrobacter sulfureus, Arthrobacter ureafaciens, Chromatium buderi, Chromatium tepidum, Chromatium vinosum, Chromatium warmingii, Chromatium fluviatile, Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwinia ananas, Erwinia herbicola, Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methylobacterium rhodesianum, Methylobacterium extorquens, Phormidium sp. ATCC29409, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marina, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexigens, Rhodospirillum salinarum, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus, Zymomonas mobilis y otros similares.
Los ejemplos de procariontes preferidos incluyen bacterias pertenecientes a los géneros Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, Streptomyces y otros similares. Por ejemplo, se pueden mencionar las especies anteriores que pertenecen al género Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, Streptomyces y otros similares. Los ejemplos de bacterias más preferidas incluyen Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium lactofermentum, Corynebacterium flavum, Corynebacterium efficiens, Bacillus sabtilis, Bacillus megaterium, Serratia marcescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces coelicolor y Streptomyces lividans. De forma particularmente preferida, se puede mencionar la Escherichia coli.
(c) Preparación de un microorganismo en el que se incorpora un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos al ADN cromosomal
Mediante la incorporación de un ADN que codifica una proteína que tenga actividad de transporte de dipéptidos obtenida por el método mencionado anteriormente en (a) en una posición del ADN cromosomal, también se puede obtener un microorganismo en el que la actividad de la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos sea superior a la de la cepa original.
Como método para la incorporación de un ADN que codifique una proteína que tenga actividad de transporte de dipéptidos en cualquier posición del ADN cromosomal de un microorganismo, se puede mencionar un método que utiliza recombinación homóloga. Si se usa E. coli como hospedante, es decir, una cepa original, se puede mencionar el método descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 6640 (2000).
(2) Preparación de un microorganismo en el que la actividad de la proteína con actividad de síntesis de dipéptidos es superior a la de la cepa original
De los microorganismos en los que la actividad de una proteína con actividad de síntesis de dipéptidos es superior a la de la cepa original, se puede obtener un microorganismo que muestre una actividad específica superior a la de la
proteína de la cepa original, y un microorganismo en el que la cantidad producida de la proteína se incremente con respecto a la de la cepa original, como se han indicado en el anterior apartado (1) sustituyendo el gen de la cepa original por un gen de enzima mutante obtenido al someter a un ADN que codifica una proteína con actividad de síntesis de dipéptidos a un tratamiento de mutación in vitro, PCR con tendencia a error y otros métodos similares.
Cultivando respectivamente el microorganismo obtenido que tiene un gen de enzima mutante y la cepa original en un medio de cultivo líquido, y midiendo y comparando la cantidad de dipéptido contenida en el cultivo mediante un método conocido, se puede confirmar la mayor actividad de la proteína con actividad de síntesis de dipéptidos con respecto a la de la cepa original.
A continuación se explica un método para preparar ADN que codifica la proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos y un método para preparar el microorganismo obtenido mediante la transformación de la cepa original con el ADN.
(a) Preparación de un ADN que codifica una proteína con actividad de síntesis de dipéptidos
Se puede obtener un ADN que codifica una proteína con actividad de síntesis de dipéptidos según la secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos del apartado anterior 1(2) del mismo modo que el apartado anterior 2(1) (a).
Los ejemplos de ADN que puede obtenerse mediante el método mencionado anteriormente incluyen un ADN que tiene una región codificadora en la secuencia de nucleótidos mostrada como cualquiera de las SEQ ID NO: 20 a 28, que codifica ligasa de aminoácido L que tiene las secuencias de aminoácido mostradas por las SEQ ID NO: 11 – 18.
(b) Preparación de un microorganismo transformado con un vector plásmido que expresa una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos
Se puede obtener un vector plásmido que exprese una proteína con actividad de síntesis de dipéptidos usando el ADN que codifica una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos, que se obtiene en el apartado anterior 2(2) (a), y del mismo modo que en el apartado anterior 2(1) (b).
Los ejemplos de vector plásmido que expresan una proteína con actividad de síntesis de dipéptidos, que puede obtenerse mediante el método mencionado anteriormente, incluyen el pPE86usp, que se menciona más adelante.
(c) Preparación de un microorganismo en el que se incorpora al ADN cromosomal un ADN que codifica la proteína con actividad de síntesis de dipéptidos
Un microorganismo en el que la actividad de una proteína con actividad de síntesis de dipéptidos sea superior a la de la cepa original también puede obtenerse incorporando el ADN que codifica la proteína con actividad de síntesis de dipéptidos, que se obtiene mediante el método del apartado anterior 2(2) (a), en cualquier posición de un ADN cromosomal.
El ADN se puede incorporar en cualquier posición de un ADN cromosomal de un microorganismo del mismo modo que en el apartado anterior 2(1) (c).
(3) Preparación de un microorganismo que tenga la capacidad de producir al menos un tipo de aminoácido de entre los aminoácidos que constituyen el dipéptido
El microorganismo que tiene la capacidad de producir al menos un tipo de aminoácidos de entre los aminoácidos que constituyen el dipéptido, que se usa en el proceso de producción de un dipéptido de la presente invención, puede ser cualquiera siempre que tenga dicha capacidad. Cuando una cepa aislada del mundo natural presenta dicha capacidad por sí misma, se puede usar la cepa per se. Alternativamente, se puede usar un microorganismo al que se le ha conferido la capacidad de producir al menos un tipo de aminoácido de entre los aminoácidos que constituyen el dipéptido mediante un método conocido, y similar.
Los ejemplos del método conocido incluyen:
- (a)
- un método para moderar o liberar al menos uno de los mecanismos que regulan la biosíntesis de un aminoácido,
- (b)
- un método para potenciar la expresión de al menos una enzima implicada en la biosíntesis de un aminoácido,
- (c)
- un método para aumentar el número de copias de al menos uno de los genes de enzima implicados en la biosíntesis de un aminoácido,
- (d)
- un método para debilitar o bloquear al menos una ruta metabólica paralela a la ruta de biosíntesis de un aminoácido que genere otro metabolito diferente al aminoácido, y
- (e)
- un método para seleccionar la línea celular que tenga una elevada resistencia a un análogo de aminoácido en comparación con la cepa natural,
y otros similares. Los métodos conocidos mencionados pueden usarse solos o en combinación.
El método (a) descrito antes se describe, por ejemplo, en Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979), J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972) y en Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993) y otros similares; el método (b) descrito anteriormente se describe, por ejemplo, en Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979) y en J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972) y otros similares; el método (c) descrito anteriormente se describe, por ejemplo, en Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993) y en Agric. Biol. Chem., 39, 371-377 (1987) y otros similares; el método (d) descrito anteriormente se describe, por ejemplo, en Appl. Environ. Microbiol., 38, 181-190 (1979) y en Agric. Biol. Chem., 42, 1773-1778 (1978) y otros similares; y el método (e) descrito anteriormente se describe, por ejemplo, en Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684 (1972), Agric. Biol. Chem., 41, 109-116 (1977), Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023 (1973) y en Agric. Biol. Chem., 51, 2089-2094 (1987) y otros similares. En referencia a las publicaciones mencionadas, y otras similares, se puede preparar un microorganismo que tenga la capacidad de producir diversos aminoácidos.
Adicionalmente, muchos ejemplos de métodos de preparación de un microorganismo que tenga la capacidad de producir un aminoácido a partir de cualquiera de las vías (a) – (e) mencionadas anteriormente, o de una combinación de las mismas, se describe en Biotechnology 2nd ed., Vol. 6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996), sección 14a, 14b, y en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 79, 1-35 (2003), y en Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press, Hiroshi Aida et al. (1986). Además de las anteriores, se presentan muchos informes relativos a un método de preparación de un microorganismo con capacidad para producir un aminoácido específico en los siguientes documentos, JP-A2003-164297, Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975), Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153 (1975), JP-A-58-13599, J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283 (1958), JP-A-63-94985, Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023 (1973), WO 97/15673, JP-A-56-18596, JP-A-56-144092, Publicación Nacional de Solicitud de Patente Internacional Nº 2003-511086 y otros similares. Un microrganismo con capacidad para producir uno o más tipos de aminoácidos se puede preparar usando como referencia las publicaciones mencionadas, y otras similares.
Los ejemplos de microorganismos que tienen capacidad de producir un aminoácido, que pueden ser preparados a través de los métodos anteriores, incluyen un microorganismo como la bacteria productora de L-glutamina, que tiene defecto de gen glnE y/o gen glnB, un microorganismo como la bacteria productora de L-alanina, que muestra un aumento en la expresión del gen de alanina deshidrogenasa (gen ald), un microorganismo como el microorganismo productor de L-prolina, que expresa el gen pheA insensible a fenilalanina y/o el gen aroF insensible a tirosina, y otros similares.
El microorganismo mencionado anteriormente que forma y acumula un aminoácido puede ser cualquiera siempre que se le puedan aplicar los métodos de los apartados (a) – (e) anteriores o que tenga las propiedades genéticas mencionadas anteriormente. Se prefieren los procariontes y son más preferidas las bacterias. Los procariontes y las bacterias son los mismos indicados en el apartado anterior 2(1).
Los ejemplos de microorganismo productor de un aminoácido incluyen la Escherichia coli JGL1, la Escherichia coli JGLBE1 y otros similares, como la cepa productora de L-glutamina, la Escherichia coli JM101 que porta el plásmido de expresión de gen ald y otros similares, como cepa productora de L-alanina, la Escherichia coli JM101 que porta el plásmido de expresión del gen pPHEA2 y/o aroF y otros similares, como cepa productora de L-fenilalanina, la Escherichia coli JGLE1 y la Escherichia coli JGLBE1 que porta el plásmido de expresión de gen ald y otros similares, como cepa productora de L-glutamina y L-alanina, la Escherichia coli JM101 que porta el plásmido de expresión de gen ald y el plásmido de expresión de gen pPHEA2 y/o aroF y otros similares, como cepa productora de L-alanina y L-fenilalanina, la cepa ATCC21277 que porta el plásmido de expresión de gen pPHEA2 y/o aroF y otros similares, como cepa productora de L-treonina y L-fenilalanina, se describen en el documento WO 2006/001379.
Específicamente, los ejemplos de microorganismos que tienen la capacidad de producir un aminoácido incluyen el FERM BP-5807, el ATCC13032 y otros similares, como cepa productora de ácido L-glutámico, el FERM P-4806, el ATCC14751 y otros similares como cepa productora de L-glutamina, ATCC21148, ATCC21277, ATCC21650 y otros similares como cepa productora de L-treonina, FERM P-5084, ATCC13286 y otros similares como cepa productora de L-lisina, FERM P-5479, VKPM B-2175, ATCC21608 y otros similares como cepa productora de L-metionina, FERM BP-3757, ATCC14310 y otros similares como cepa productora de L-isoleucina, ATCC13005, ATCC19561 y otras similares como cepa productora de L-valina, FERM BP-4704, ATCC21302 y otros similares como cepa productora de L-leucina, FERM BP-4121, ATCC15108 y otros similares como cepa productora de L-alanina, ATCC21523, FERM BP-6576 y otros similares como cepa productora de L-serina, FERM BP-2807, ATCC19224 y otros similares como cepa productora de L-prolina, FERM P-5616, ATCC21831 y otros similares como cepa productora de L-arginina, ATCC13232 y otros similares como cepa productora de L-ornitina, FERM BP-6674, ATCC21607 y otros similares como cepa productora de L-histidina, DSM10118, DSM10121, DSM10123, FERM BP1777 y otros similares como la cepa productora de L-triptófano, ATCC13281, ATCC21669 y otros similares como cepa productora de L-fenilalanina, ATCC21652 y otros similares como cepa productora de L-tirosina, W3110/pHC34 (descrito en la Publicación Nacional de Solicitud de Patente Internacional Nº 2003-511086) y otros similares como cepa productora de L-cisteína, Escherichia coli SOLR/pHR71 (descrita en el documento WO 96/27669) y otros similares como cepa productora de L-4-hidroxiprolina, FERM BP-5026, FERM BP-5409 y otros similares como cepa productora de L-3-hidroxiprolina, FERM P-5643, FERM P-1645 y otros similares como cepa productora de Lcitrulina.
Las cepas mostradas con la identificación FERM mencionada anteriormente se encuentran disponibles en el “International Patent Organism Depositary”, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Japón), las cepas mostradas con la identificación ATCC pueden obtenerse en el “American Type Culture Collection” (EE.UU.), las cepas identificadas como VKPM pueden obtenerse en el “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (Rusia), y las cepas identificadas como DSM pueden obtenerse en el “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen” (Alemania).
(4) Preparación de microorganismos en los que la actividad de una proteína que tiene actividad de peptidasa o de captación de péptidos es inferior a la de la cepa original o se ha perdido.
El microorganismo de la presente invención y un microorganismo que va a ser usado en el método de producción de dipéptidos de la presente invención tienen la capacidad de producir una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos, donde la actividad de la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos es superior a la de la cepa original, y la actividad de la proteína que tiene actividad de peptidasa o de captación de péptidos puede ser inferior a la de la cepa original o haberse perdido.
El microorganismo en el que la actividad de una proteína que tiene actividad de peptidasa o de captación de péptidos puede ser inferior a la de la cepa original, o se ha perdido, se puede preparar según el método descrito en el documento WO 2005/045006.
3. Proceso para la producción del dipéptido de la presente invención.
(1) Proceso para producir el dipéptido usando un cultivo de microorganismos o un cultivo tratado del mismo como fuente de enzimas
Se puede obtener un cultivo de los microorganismos de la presente invención cultivando los microorganismos en un medio natural o en un medio sintético que contenga fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y otros similares, utilizables por los microorganismos, y que permita un cultivo eficiente de un transformante.
Como fuentes de carbono, se puede usar cualquier fuente de carbono que sea asimilada por el microorganismo. Los ejemplos de fuentes de carbono incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas que los contengan, almidón e hidrolisato de almidón; ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido propiónico; y alcoholes tales como etanol y propanol.
Como fuentes de nitrógeno, se puede usar amoniaco, sales de amonio de ácidos inorgánicos u orgánicos tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio, y otros compuestos que contengan nitrógeno, así como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, licor de maíz, hidrolisato de caseína, torta de soja, hidrolisato de torta de soja, y diversas células microbianas fermentadas, y productos digeridos de los mismos.
Los ejemplos de sales inorgánicas incluyen dihidrogenofosfato potásico, hidrogenofosfato dipotásico, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre y carbonato cálcico.
El cultivo se lleva a cabo habitualmente en condiciones aerobias, por ejemplo, agitando el cultivo o con un agitador sumergido con aeración al cultivo. La temperatura de cultivo preferiblemente va de 15 a 40ºC, y el tiempo de cultivo normalmente es de 5 horas a 7 días. El pH se mantiene entre 3,0 y 9,0 durante el cultivo. El ajuste de pH se lleva a cabo usando un ácido inorgánico u orgánico, una disolución alcalina, urea, carbonato cálcico, amoniaco, etc.
Si es necesario, se pueden añadir antibióticos como la ampicilina y la tetraciclina al medio de cultivo durante el cultivo.
Cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende un promotor inducible, se puede añadir un inductor al medio de cultivo, si es necesario. Por ejemplo, en el caso de un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende el promotor lac, se puede añadir isopropilβ-D-tiogalactopiranosido, u otro similar, al medio de cultivo; y en el caso de un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende el promotor trp, se puede añadir ácido indolacrílico, u otro similar.
Los ejemplos de cultivos tratados incluyen cultivos concentrados obtenidos mediante el método mencionado anteriormente, cultivos sometidos a secado, células microbianas centrifugadas y obtenidas a partir del cultivo, células microbianas sometidas a secado, células microbianas secadas por congelación, células microbianas tratadas con tensioactivos, células microbianas sometidas a ultrasonidos, células microbianas molidas mecánicamente, células microbianas tratadas con disolvente, células microbianas tratadas con enzimas y cultivos tratados que contengan células microbianas viables tales como células microbianas inmovilizadas.
Mediante el uso de un cultivo o un cultivo tratado de los microorganismos de la presente invención, que pueden obtenerse a través del método mencionado anteriormente, como fuente de enzimas, se puede producir un dipéptido que se forme y se acumule en un medio acuoso que contenga la fuente de enzimas y uno o más tipos de sustratos
seleccionados entre un aminoácido, un éster de aminoácido y una amida de aminoácido, y recuperando el dipéptido del medio.
El proceso anterior se explica en detalle a continuación, dividido en los apartados (i) a (iii):
- (i)
- un proceso que usa un cultivo o un cultivo tratado del microorganismo como fuente de enzimas, donde el dipéptido se forma y se acumula en un medio acuoso que contiene la fuente de enzimas y uno o más tipos, preferiblemente uno o dos tipos, de aminoácidos, y se recupera del medio,
- (ii)
- un proceso que usa un cultivo o un cultivo tratado del microorganismo como fuente de enzimas, donde se forma y se acumula un dipéptido en un medio acuoso que contiene la fuente de enzimas, uno o más tipos, preferiblemente un tipo, de éster de aminoácido y uno o más tipos, preferiblemente un tipo, de aminoácido, y se recupera del medio, y
(iii) un proceso que usa un cultivo o un cultivo tratado del microorganismo como fuente de enzimas, donde se forma y se acumula un dipéptido en un medio acuoso que contiene la fuente de enzimas, uno o más tipos, preferiblemente un tipo, de amida de aminoácido y uno o más tipos, preferiblemente un tipo, de aminoácido, y se recupera del medio.
En el proceso de producción del apartado anterior (i), uno o más tipos, preferiblemente uno o dos tipos de aminoácidos usados como sustratos pueden ser cualquier aminoácido, preferiblemente aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en aminoácidos L, glicina (Gly) y β-alanina (β-Ala), que pueden usarse en cualquier combinación. Los ejemplos de aminoácido L incluyen L-alanina (L-Ala), L-glutamina (L-Gln), ácido L-glutámico (L-Glu), L-valina (L-Val), L-leucina (L-Leu), L-isoleucina (L-Ile), L-prolina (L-Pro), L-fenilalanina (L-Phe), L-triptófano (L-Trp), L-metionina (L-Met), L-serina (L-Ser), L-treonina (L-Thr), L-cisteína (L-Cys), L-asparagina (L-Asn), L-tirosina (L-Tyr), L-lisina (L-Lys), L-arginina (L-Arg), L-histidina (L-His), ácido L-aspártico (L-Asp), ácido L-α-aminobutírico (L-α-AB), L-azaserina, L-teanina, L-4-hidroxiprolina (L-4-HYP), L-3-hidroxiprolina (L-3-HYP), L-ornitina (L-Orn), L-citrulina (L-Cit) y L-6-diazo-5-oxo norleucina y otros similares.
Los aminoácidos que se usan más preferiblemente en el proceso de producción del apartado anterior (i) son una combinación de un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-α-AB y β-Ala, y un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-azaserina, L-teanina, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn, L-Cit y L-6-diazo-5-oxo-norleucina; una combinación de L-Gln y L-Phe. Otros aminoácidos preferidos son: una combinación de L-Ala y un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Ala, L-Gln, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB, L-Azaserina, L-Cit y L-teanina; una combinación de Gly un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Gln, Gly, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-α-AB y K-Cit; una combinación de L-Met y un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys y L-His; una combinación de L-Ser y un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Gln, L-Phe, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-His y L-α-AB; una combinación de L-Thr y un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Gln, L-Phe, L-Leu, L-Thr y L-α-AB; una combinación de L-Gln y L-Phe; una combinación de β-Ala y un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Phe, L-Met, L-His y L-Cit; una combinación de L-α-AB y L-Gln, L-Arg o L-α-AB.
En el proceso de producción del apartado anterior (i), el aminoácido que va a usarse como sustrato se añade a un medio acuoso hasta una concentración de 0,1 – 500 g/L, preferiblemente de 0,2 – 200 g/L, desde el inicio o durante la reacción.
Los ejemplos de dipéptido producido mediante el proceso de producción del apartado anterior (i) incluyen un dipéptido representado por la siguiente fórmula (I)
R1-R2 (I)
donde R1 y R2 son iguales o diferentes y cada uno es un aminoácido. Los ejemplos preferibles incluyen un dipéptido representado por la fórmula (I) anterior donde R1 y R2 son iguales o diferentes y cada uno es un aminoácido seleccionado de L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-azaserina, L-teanina, L-4-HYP, L3-HYP, L-Orn y L-6-diazo-5-oxonorleucina. Más preferido es un dipéptido en el que R1 es L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-α-AB ó β-Ala, entonces R2 es L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, β-Ala, L-azaserina, L-teanina, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn ó L-6-diazo-5-oxonorleucina, y aún más preferido es un dipéptido en el que cuando R1 es L-Ala, entonces R2 es L-Ala, L-Gln, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB, L-azaserina o Lteanina, cuando R1 es Gly, entonces R2 es L-Gln, Gly, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys, L-Arg o L-α-AB, cuando R1 es L-Met, entonces R2 es L-Phe, L-Met, L-Cys, L-Tyr, L-Lys o L-His, cuando R1 es L-Ser, entonces R2 es L-Gln, Gly, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-His ó L-α-AB, cuando R1 es L-Thr, entonces R2 es L-Gln, L-Gly, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr ó L-α-AB, cuando R1 es L-Gln, entonces R2 es L-Phe ó L-α-AB, cuando R1 es L-Phe, entonces R2 es L-Gln, cuando R1 es L-Trp, entonces R2 es Gly, cuando R1 es L-Cys, entonces R2 es L-Ala, L-Gln,
Gly ó L-Met, cuando R1 es L-Lys, entonces R2 es L-Ala, Gly ó L-Met, cuando R1 es L-Arg, entonces R2 es L-α-AB, cuando R1 es L-His, entonces R2 es L-Met, o cuando R1 es L-α-AB, entonces R2 es L-Ala, L-Gln, Gly, L-Ser, L-Thr, L-Arg ó L-α-AB.
En el proceso de producción mencionado anteriormente, además, se puede añadir un compuesto que pueda ser metabolizado por el microorganismo de la presente invención para producir ATP, por ejemplo, sacáridos tales como glucosa, alcoholes tales como etanol, ácidos orgánicos tales como ácido acético y otros similares, según sea necesario como fuente de suministro de ATP a un medio acuoso.
En el proceso de producción del apartado anterior (ii), uno o más tipos de ésteres de aminoácido y uno o más tipos de aminoácidos que van a ser usados como sustratos y uno o más tipos de aminoácidos que van a ser usados como sustratos pueden ser cualquier combinación de cualquier éster de aminoácido y cualquier aminoácido, siempre que el microorganismo que va a ser usado como fuente de enzimas en el proceso de producción de la presente invención pueda formar un dipéptido usándolos como sustratos. Se prefiere una combinación de un tipo de éster de aminoácido y un tipo de aminoácido, en la que el aminoácido preferiblemente es un aminoácido L o glicina. Los ejemplos de una combinación más preferible de un tipo de éster de aminoácido y un tipo de aminoácido incluyen una combinación de éster de aminoácido, que sea de un tipo seleccionado del grupo que consiste en éster de L-alanina, éster de glicina, éster de L-valina, éster de L-isoleucina, éster de L-metionina, éster de L-fenilalanina, éster de Lserina, éster de L-metionina, éster de L-fenilalanina, éster de L-serina, éster de L-treonina, éster de L-glutamina, éster de L-tirosina, éster de L-arginina, α-éster de ácido L-aspártico, β-éster de ácido L-aspártico, éster de L-leucina, éster de L-asparagina, éster de L-lisina, α,β-dimetiléster de ácido L-aspártico y γ-éster de L-glutamina, y aminoácido, que sea de un tipo seleccionado del grupo que consiste en L-Gln, L-Asn, Gly, L-Ala, L-Leu, L-Met, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His y L-Glu.
En el proceso de producción del apartado anterior (ii), el éster de aminoácido y el aminoácido que van a ser usados como sustratos se añaden a un medio acuoso hasta una concentración de 0,1 – 500 g/L, preferiblemente de 0,2 – 200 g/L, desde el inicio o durante la reacción.
En el proceso de producción del apartado anterior (iii), uno o más tipos de amidas de aminoácido y uno o más tipos de aminoácidos que van a ser usados como sustratos pueden ser cualquier combinación de cualquier amida de aminoácido y cualquier aminoácido, siempre que el microorganismo que va a ser usado como fuente de enzimas en el método de producción de la presente invención pueda formar un dipéptido usándolos como sustratos. Se prefiere una combinación de un tipo de amida de aminoácido y un tipo de aminoácido. Como aminoácido, son preferibles los aminoácidos L y la glicina. Los ejemplos de combinaciones de un tipo de amida de aminoácido y un tipo de aminoácido incluyen una combinación de un tipo de amida de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en amida de L-alanina, amida de glicina y amida de ácido L-aspártico, y un tipo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L-Gln, L-Asn, Gly, L-Ala, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Met, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His y L-Glu.
En el proceso de producción del apartado anterior (iii), la amida de aminoácido y el aminoácido que van a ser usados como sustratos se añaden a un medio acuoso hasta una concentración de 0,1 – 500 g/L, preferiblemente de 0,2 – 200 g/L, desde el inicio o durante la reacción.
El medio acuoso que va a ser usado en el proceso de producción de la presente invención puede tener cualesquier componentes y cualquier composición, siempre que no inhiba la reacción de producción de un dipéptido. Por ejemplo, se pueden mencionar agua, tampones tales como fosfato, carbonato, acetato, borato, citrato, tris, etc., y otros similares. Adicionalmente, puede contener alcoholes tales como metanol, etanol y otros similares, ésteres tales como acetato de etilo y otros similares, cetonas tales como acetona y otros similares, y amidas tales como acetamida y otros similares.
La reacción de producción de un dipéptido se lleva a cabo en un medio acuoso en las condiciones de pH 5 – 11, preferiblemente pH 6 – 10, a 20 – 60ºC, preferiblemente 25 – 45ºC, durante 2 – 150 h, preferiblemente 6 – 120 h.
Cuando sea necesario, también se puede añadir un tensioactivo o un disolvente orgánico al medio acuoso.
El tensioactivo puede ser cualquiera siempre que promueva la formación de un dipéptido, tal como los tensioactivos no iónicos tales como polioxietilen octadecilamina (p.ej., NYMEEN S-215, fabricado por NOF Corporation), tensioactivos catiónicos tales como bromuro de cetil trimetilamonio y cloruro de alquildimetil bencilamonio (p.ej., cation F2-40E fabricado por NOF Corporation), tensioactivos aniónicos tales como sarcosinato de lauroilo, aminas terciarias tales como alquildimetilamina (p.ej., amina terciaria FB, fabricada por NOF Corporation) y otros similares. Uno tipo o varios tipos de los mismos se pueden usar mezclados. La concentración de tensioactivo generalmente es de 0,1 – 50 g/L. Los ejemplos de disolvente orgánico incluyen xileno, tolueno, alcohol alifático, acetona, acetato de etilo y otros similares, y generalmente se usa en una concentración de 0,1 – 50 mL/L.
Aunque la cantidad de cultivo o de producto tratado de cultivo que va a ser usado como fuente de enzimas varía dependiendo de la actividad específica y el tipo de fuente de enzima, por ejemplo es de 5 – 1000 mg,
preferiblemente de 10 – 400 mg, por cada 1 mg de aminoácido, éster metílico de aminoácido o amida de aminoácido como sustrato.
El dipéptido formado y acumulado en el medio acuoso puede recolectarse empleando un método general que use carbón activado, resina de intercambio iónico y otros similares, o mediante extracción con un disolvente orgánico, cristalización, cromatografía de capa fina, cromatografía líquida de alta resolución, y otros similares.
Además, los procesos de producción de los apartados anteriores (ii) y (iii) se pueden llevar a cabo según la descripción de los documentos de patente WO 03/010189 y WO 03/010187.
(2) Producción mediante un método de fermentación
Se puede producir un dipéptido cultivando el microorganismo de la presente invención que tiene capacidad para producir al menos un tipo de aminoácido de entre los aminoácidos que constituyen el dipéptido en un medio de cultivo para permitir la formación y acumulación del dipéptido en el medio de cultivo, y recuperando el dipéptido del cultivo.
El método para cultivar el microorganismo en un medio de cultivo es similar al método de cultivo en el apartado anterior (1). Cuando se desee, el medio de cultivo puede contener al menos un tipo de aminoácido que constituya el dipéptido deseado.
Los ejemplos de dipéptido producido mediante el proceso mencionado incluyen un dipéptido en el que uno o dos tipos de aminoácido están unidos en configuración α, dándole preferencia al dipéptido en el que el aminoácido es un aminoácido L o glicina. Más preferidos son los dipéptidos representados por la siguiente fórmula (II)
R1-R2 (II)
donde R1 y R2 son iguales o diferentes y cada uno es un aminoácido seleccionado de L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, L-α-AB, L4-HYP, L3-HYP, L-ornitina (L-Orn) y L-citrulina (L-Cit). Más preferido es un dipéptido en el que cuando R1 es L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Cys, L-α-AB ó L-Thr, entonces R2 es L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB, L-4-HYP, L-3-HYP, L-Orn ó L-Cit. Particularmente preferido es un dipéptido en el que cuando R1 es L-Ala, entonces R2 es L-Gln, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-α-AB ó L-Cit, cuando R1 es Gly, entonces R2 es L-Gln, Gly, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-α-AB ó L-Cit, cuando R1 es L-Met, entonces R2 es L-Phe, L-Met, L-Cys, L-Tyr, L-Lys ó L-His, cuando R1 es L-Ser, entonces R2 es L-Gln, Gly, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr, Tyr, L-His ó L-α-AB, cuando R1 es L-Thr, entonces R2 es L-Gln, L-Leu, L-Phe, L-Met, L-Ser, L-Thr ó L-α-AB, cuando R1 es L-Gln, entonces R2 es L-Phe ó L-α-AB, cuando R1 es L-Phe, entonces R2 es L-Gln, cuando R1 es L-Trp, entonces R2 es Gly, cuando R1 es L-Cys, entonces R2 es L-Ala, L-Gln, Gly ó L-Met, cuando R1 es L-Lys, entonces R2 es L-Ala, Gly ó L-Met, cuando R1 es L-Arg, entonces R2 es L-α-AB, cuando R1 es L-His, entonces R2 es L-Met, o cuando R1 es L-α-AB, entonces R2 es L-Ala, L-Gln, Gly, L-Ser, L-Thr, L-Arg ó L-α-AB, y los más preferidos son L-alanil-L-alanina (L-Ala-L-Ala), L-alanil-L-glutamina (L-Ala-L-Gln), L-alanil-L-fenilalanina (L-AlaL-Phe) y L-treonil-L-fenilalanina (L-Thr-L-Phe).
La recuperación del dipéptido formado y acumulado en el medio o cultivo acuoso puede llevarse a cabo empleando métodos ordinarios mediante el uso de carbón activado, resinas de intercambio iónico, etc., o por medio de extracción con un disolvente orgánico, cromatografía de capa fina, cromatografía de líquidos de alta resolución y otros similares.
La presente invención se explica detalladamente a continuación en referencia a los Ejemplos, que no pretenden ser limitativos.
[Ejemplo 1]
Construcción de un plásmido de expresión de gen bcr
Se construye un plásmido de expresión de gen bcr mediante el siguiente método.
Se inoculó la cepa JM101 de Escherichia coli en medio LB [10 g/L de Bacto Tripton (fabricado por Difco), 5 g/L de extracto de levadura (fabricado por Difco), 5 g/L de cloruro sódico] y se cultivó en reposo a 30ºC durante una noche. Tras el cultivo, se aisló el ADN cromosomal del microorganismo y se purificó mediante un método que usa fenol saturado descrito en “Current Protocols in Molecular Biology”.
En base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, se sintetizaron ADNs que consistían en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID N: 30 ó 31 como ADNs cebadores para la amplificación de gen bcr, y se llevó a cabo una PCR usando los ADNs sintéticos como conjunto de cebadores.
Se llevó a cabo una PCR preparando 50 µL de una mezcla de reacción que comprende 0,1 µg de ADN cromosomal como plantilla, 0,5 µmol/L de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pyrobest (10x) (fabricado por Takara Bio Inc.) y 200 µmol/L de dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y repitiendo 30 veces un ciclo que consiste en reacción a 96ºC durante 15 s, reacción a 55ºC durante 30 s y reacción a 72ºC durante 1 minuto.
Tras confirmación de la amplificación de aproximadamente de 1,2 kb de fragmento de ADN, el fragmento de ADN fue purificado mediante un método convencional.
El vector de expresión pTrS30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)] que contenía el fragmento de ADN y promotor de trp fue digerido con HindIII, SacI, respectivamente, los fragmentos de ADN fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos de ADN digeridos con enzima de restricción fueron recuperados usando un kit GENECLEAN II (fabricado por BIO 101).
El fragmento de 1,2 kb que contenía el gen bcr obtenido antes, y el fragmento pTrs30 digerido con enzima de restricción fueron ligados uno al otro usando un Kit de Ligadura (fabricado por Takara Bio Inc.).
La cepa DH5α de Escherichia coli (fabricada por Takara Bio Inc.) fue transformada usando el ADN ligado obtenido, y se seleccionó un transformante con resistencia a ampicilina como índice.
Se extrajo un plásmido de la colonia del transformante seleccionado empleando un método conocido, y se analizó su estructura usando una enzima de restricción, mediante lo cual se confirmó que el vector de expresión pTbcr en el que se había ligado el gen bcr al promotor de trp se había adquirido.
A continuación, se digirieron el pTbcr y el pSTV28 con EcoRI y SacI, respectivamente, y el fragmento de 1,6 kb en el que se había ligado el gen bcr al promotor trp y el fragmento de pSTV28 digerido con enzima de restricción fueron recuperados del mismo modo que antes.
Fueron ligados del mismo modo que antes, la cepa DH5α de Escherichia coli fue transformada con el ADN ligado obtenido, y se seleccionó un transformante con resistencia a cloranfenicol como índice.
Se extrajo un plásmido de la colonia del transformante seleccionado empleando un método conocido, y se analizó su estructura usando una enzima de restricción, mediante lo cual se confirmó que el vector de expresión en el que el gen bcr había sido ligado al promotor trp se había obtenido. El vector de expresión se designó como pSbcr.
[Ejemplo 2]
Construcción de plásmido de expresión de gen norE
En base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, se sintetizaron los ADNs cebadores que consistían en una secuencia de nucleótidos mostrada en las SEQ ID NO: 32 ó 33 del mismo modo que en el Ejemplo 1 como ADNs cebadores para la amplificación de gen norE. Se llevó a cabo una PCR usando dichos ADNs sintéticos como conjunto de cebadores.
La PCR se llevó a cabo en condiciones similares al Ejemplo 1, excepto que se empleó el conjunto de cebadores mencionado antes como ADN cebador.
El fragmento de ADN amplificado obtenido mediante PCR y pTrS30 fueron digeridos con HindIII y BamHI, respectivamente, ambos ADNs fueron ligados uno al otro del mismo modo que en el Ejemplo 1, y la cepa DH5α de Escherichia coli fue transformada con el ADN ligado.
Se construyó un vector de expresión pTnorE en el que el gen norE estaba ligado al promotor trp mediante extracción del transformante obtenido. Análogamente al Ejemplo 1, pTnorE y pSTV28 fueron digeridos con EcoRI y BamHI, respectivamente. Ambos ADNs fueron ligados uno al otro y se construyó el vector de expresión en el que el gen norE está ligado al promotor trp del mismo modo que en el Ejemplo Experimental 1 y se designó como pSnor.
[Ejemplo 3]
Construcción de plásmido de expresión de gen ydeE
En base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, se sintetizaron los ADNs cebadores que consistían en una secuencia de nucleótidos mostrada en las SEQ ID NO: 34 ó 35 del mismo modo que en el Ejemplo 1 como ADNs cebadores para la amplificación del gen ydeE. Se llevó a cabo una PCR usando los ADNs sintéticos como conjunto de cebadores.
La PCR se llevó a cabo en condiciones similares al Ejemplo 1 excepto que se usó el conjunto de cebadores mencionado antes como ADN cebador.
El fragmento de ADN amplificado obtenido mediante PCR y pSTV28 fueron digeridos con EcoRI y BamHI, respectivamente. Ambos ADNs fueron ligados uno al otro del mismo modo que en el Ejemplo 1, y la cepa DH5α de
Escherichia coli fue transformada con el ADN ligado. Se construyó el vector de expresión en el que el gen ydeE fue ligado al promotor lac mediante el método mencionado anteriormente y se designó como pSydeE.
[Ejemplo 4]
Construcción de plásmido de expresión de gen emrD
En base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, se sintetizaron los ADNs cebadores que consistían en una secuencia de nucleótidos mostrada en las SEQ ID NO: 36 ó 37 del mismo modo que en el Ejemplo 1 como ADNs cebadores para la amplificación del gen emrD. Se llevó a cabo una PCR usando los ADNs sintéticos como conjunto de cebadores.
La PCR se llevó a cabo en condiciones similares al Ejemplo 1 excepto que se usó el conjunto de cebadores mencionado antes como ADN cebador.
El fragmento de ADN amplificado obtenido mediante PCR y pSTV28 fueron digeridos con EcoRI y PstI, respectivamente. Ambos ADNs fueron ligados uno al otro del mismo modo que en el Ejemplo 1, y la cepa DH5α de Escherichia coli fue transformada con el ADN ligado. Se construyó el vector de expresión en el que el gen emrD fue ligado al promotor lac mediante el método mencionado anteriormente y se designó como pSemrD.
[Ejemplo 5]
Construcción de plásmido de expresión de gen yeeO
En base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, se sintetizaron los ADNs cebadores que consistían en una secuencia de nucleótidos mostrada en las SEQ ID NO: 38 ó 39 del mismo modo que en el Ejemplo 1 como ADNs cebadores para la amplificación del gen yeeO. Se llevó a cabo una PCR usando los ADNs sintéticos como conjunto de cebadores.
La PCR se llevó a cabo en condiciones similares al Ejemplo 1 excepto que se usó el conjunto de cebadores mencionado antes como ADN cebador.
El fragmento de ADN amplificado obtenido mediante PCR y pSTV28 fueron digeridos con EcoRI y PstI, respectivamente. Ambos ADNs fueron ligados uno al otro del mismo modo que en el Ejemplo 1, y la cepa DH5α de Escherichia coli fue transformada con el ADN ligado. Se construyó el vector de expresión en el que el gen yeeO fue ligado al promotor lac mediante el método mencionado anteriormente y se designó como pSyeeO.
[Ejemplo 6]
Construcción de plásmido de expresión de gen ywfE y de gen ald
(1) Construcción del plásmido de expresión pTrSQE30
Se llevó a cabo una PCR usando ADNs que consistían en la secuencia de nucleótidos mostrada por las SEQ ID NO: 40 ó 41 como conjunto de cebadores y el vector de expresión pQE60 (fabricado por QIAGEN K.K.) como plantilla.
La PCR se llevó a cabo preparando 40 µL de una mezcla de reacción que comprende 10 ng de ADN plásmido, 0,5 µmol/L de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de Pfu ADN polimerasa, 4 µL de tampón para Pfu ADN polimerasa (10x) y 200 µmol/L de cada uno de los dNTPs, y repitiendo 30 veces un ciclo que consistía en reacción a 94ºC durante 1 minuto, reacción a 55ºC durante 2 minutos y reacción a 72ºC durante 3 minutos.
El fragmento de ADN amplificado obtenido mediante PCR y pTrS30 fueron digeridos con ClaI y SphI, respectivamente. Ambos ADNs fueron ligados uno al otro del mismo modo que en el Ejemplo 1 y se transformó la cepa NM522 de Escherichia coli con el ADN ligado. Se construyó un vector de expresión de proteína marcada con His en el C terminal que tenía el promotor trp mediante el método mencionado anteriormente y se designó pTrSQE30.
(2) Construcción del plásmido de expresión pUATQE30
Se realizó una PCR usando ADNs que consistían en las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 42 ó 43 como conjunto de cebadores y ADN cromosomal de Escherichia coli W3110 como plantilla.
La PCR se llevó a cabo preparando 40 µL de una mezcla de reacción que comprende 0,1 µg de ADN cromosomal, 0,5 µmol/L de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de Pfu ADN polimerasa, 4 µL de tampón para Pfu ADN polimerasa (10x) y 200 µmol/L de cada uno de los dNTPs, y repitiendo 30 veces un ciclo que consistía en reacción a 94ºC durante 1 minuto, reacción a 55ºC durante 2 minutos y reacción a 72ºC durante 3 minutos.
El fragmento de ADN amplificado obtenido mediante PCR y pTrSQE30 fueron digeridos con EcoRI y ClaI, respectivamente. Ambos ADNs fueron ligados uno al otro del mismo modo que en el Ejemplo 1 y se transformó la
cepa NM522 de Escherichia coli con el ADN ligado. Se construyó un vector de expresión de proteína marcada con His en el C terminal que tenía un promotor de proteína de estrés (promotor uspA) mediante el método mencionado anteriormente y se designó pUATQE30.
(3) Construcción de plásmido de expresión de gen ywfE y de gen ald
Se llevó a cabo una PCR usando ADNs que consisten en las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 41 ó 42 como conjunto de cebadores y pUATQE30 obtenido antes como plantilla.
La PCR se llevó a cabo preparando 40 µL de una mezcla de reacción que comprende 10 ng de plásmido, 0,5 µmol/L de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de Pfu ADN polimerasa, 4 µL de tampón para Pfu ADN polimerasa (10x) y 200 µmol/L de cada uno de los dNTPs, y repitiendo 30 veces un ciclo que consistía en reacción a 94ºC durante 1 minuto, reacción a 55ºC durante 2 minutos y reacción a 72ºC durante 3 minutos.
El fragmento de ADN amplificado obtenido mediante PCR y pPE86 que deriva de plásmido de expresión de gen ywfE de Bacillus subtilis y de gen ald de Bacillus subtilis (descritos en el documento 2006/001379) fue digerido con EcoRI y NcoI, respectivamente. Ambos ADNs fueron ligados uno al otro del mismo modo que en el Ejemplo 1 y se transformó la cepa NM522 de Escherichia coli con el ADN ligado. El plásmido de expresión en el que se ligan el gen ywfE y el gen ald con el promotor uspA fue construido mediante el método mencionado anteriormente y se designó como pPE86usp.
[Ejemplo 7]
Preparación de una cepa con eliminación del gen pepD, gen pepN, gen pepB, gen pepA, operón dpp, gen glnE y gen glnB
Usando como cepa original Escherichia coli JPNDBP7 (WO 2005/045006) donde se habían eliminado el gen pepD, el gen pepN, el gen pepB y el operón dpp, se preparó una cepa con el gen pepA, el gen glnE y el gen glnB en el ADN cromosomal de acuerdo a un método que utiliza el sistema de recombinación homóloga de fago lambda [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
Se prepararon los plásmidos pKD46, pKD3 y pCP20 descritos más adelante por extracción de cepas de Escherichia coli que porta los plásmidos, que fue obtenida del “Escherichia coli Genetic Stock Center” (EE.UU., Universidad de Yale), de acuerdo a un método conocido.
(1) Clonación de fragmento de ADN para eliminación de gen
Las secuencias de nucleótidos del gen pepA que codifica peptidasa de la cepa K12 de Escherichia coli, el gen putA implicado en la degradación de L-prolina, cada uno de los genes glnE y glnB implicados en el control de la biosíntesis de L-glutamina, ya han sido esclarecidas [Science, 5331, 1453-1474 (1977)].
Para eliminar los respectivos genes de pepA, putA, glnE y glnB, se sintetizaron los ADNs que tienen una secuencia de nucleótidos homóloga a la secuencia de nucleótidos de 36 pb por encima y por debajo de los respectivos genes que van a ser eliminados del ADN cromosomal de la cepa K12 de Escherichia coli y la secuencia de nucleótidos que va a ser reconocida por Flp recombinasa derivada de levadura en base a las secuencias de nucleótidos reportadas.
Es decir, se sintetizaron respectivamente los ADNs que tiene las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 40 a 41 como conjunto de cebadores para amplificación del fragmento de ADN para eliminación del gen pepA, los ADNs que consisten en las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 42 y 43 como conjunto de cebadores para amplificación del fragmento de ADN para eliminación del gen putA, los ADNs que tiene las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 44 a 45 como conjunto de cebadores para amplificación del fragmento de ADN para eliminación del gen glnE, los ADNs que consisten en las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 46 y 47 como conjunto de cebadores para amplificación del fragmento de ADN para eliminación del gen glnB.
A continuación, se llevó a cabo una PCR usando los ADNs sintéticos mencionados anteriormente como conjunto de cebadores y pKD3DNA como plantilla. La PCR se llevó a cabo repitiendo 30 veces un ciclo que consistía en reacción a 94ºC durante 1 minuto, reacción a 55ºC durante 2 minutos y reacción a 72ºC durante 3 minutos, usando 40 µL de la mezcla de reacción que comprende 10 ng de ADN plásmido, 0,5 µmol/L de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de Pfu ADN polimerasa, 4 µL de tampón para Pfu ADN polimerasa (10x) y 200 µmol/L de cada uno de los dNTPs.
Los fragmentos de ADN para la eliminación del gen pepA, el gen putA, el gen glnE y el gen glnB, que contenían el gen de resistencia a cloranfenicol, fueron obtenidos mediante la PCR mencionada antes.
(2) Preparación de Escherichia coli JPNDBP7 con defecto de gen pepA
La cepa JPNDBP7 de Escherichia coli fue transformada con pKD46, el transformante se propagó sobre un medio de agar LB que contenía 100 mg/L de ampicilina y se cultivó a 30ºC para seleccionar la cepa JPNDBP7 de Escherichia coli que porta pKD46 (denominado a partir de este punto como Escherichia coli JPNDBP7/pKD46).
El plásmido pKD46 tiene el gen de recombinasa λRed y la expresión de dicho gen puede ser inducida por Larabinosa. Por tanto, se produce una recombinación homóloga con una alta frecuencia cuando Escherichia coli que porta pKD46 en presencia de L-arabinosa es transformada con ADN lineal. Además, puesto que el pKD46 tiene un origen de replicación sensible a la temperatura, el plásmido puede ser curado fácilmente mediante cultivo a 42ºC.
Un fragmento para la eliminación del gen pepD obtenido anteriormente, que contiene un gen de resistencia a cloranfenicol, fue introducido en Escherichia coli JPNDBP7/pKD46 obtenida mediante cultivo en presencia de 10 mmol/L de L-arabinosa y 50 µg/mL de ampicilina con el método de pulso eléctrico. Se incorporó un transformante en el que el fragmento de ADN para la eliminación de gen pepA que contiene un gen de resistencia a cloranfenicol en el ADN cromosomal de Escherichia coli JPNDBP7, y se fue propagado en un medio de agar LB (Bacto Tripton 10 g/L, Extracto de Levadura Bacto 5 g/L, cloruro sódico 5 g/L, agar 15 g/L) que contenía 25 mg/L de cloranfenicol y se cultivó a 30ºC para la selección.
La cepa de resistencia de cloranfenicol seleccionada fue inoculada en un medio de agar LB que contenía 25 mg/L de cloranfenicol, se cultivó durante 14 h a 42ºC y se separaron colonias sencillas. Cada una de las colonias obtenidas fue replicada en un medio agar LB que contenía 25 mg/L de cloranfenicol y un medio de agar LB que contenía 100 mg/L de ampicilina cultivada 37ºC, y las colonias que mostraron resistencia a cloranfenicol y sensibilidad a ampicilina fueron seleccionadas para producir la cepa curada de pKD46.
A continuación, la cepa curada de pKD46 obtenida antes fue transformada con pCP20 y seleccionada sobre un medio de agar LB que contenía 100 mg/L de ampicilina para producir la cepa curada de pKD46 que porta pCP20.
El plásmido pCP20 tiene el gen de recombinasa Flp derivado de levadura y la expresión de este gen puede ser inducida a 42ºC.
Asimismo, ambos extremos de los fragmentos de ADN para la eliminación del gen pepA, el gen putA, el gen glnE o el gen glnB que contienen un gen de resistencia a cloranfenicol, que fueron preparados antes, tienen una secuencia de nucleótidos reconocible por recombinasa Flp. Por lo tanto, el gen de resistencia puede ser curado fácilmente mediante recombinación homóloga catalizada por recombinasa Flp.
Además, la expresión de recombinasa Flp y el curado de pCP20 se pueden introducir simultáneamente cultivando una cepa que porta pCP20 a 42ºC, ya que el pCP20 tiene un origen de replicación sensible a la temperatura.
La cepa curada de pKD46 que porta pCP20 obtenida antes fue inoculada en un medio de agar LB libre de fármaco, cultivada durante 14 h a 42ºC y se separaron colonias individuales. Cada una de las colonias obtenidas fue replicada en un medio de agar LB libre de fármaco, un medio de agar LB que contiene 25 mg/L de cloranfenicol y un medio de agar LB que contiene 100 mg/L de ampicilina, cultivada a 30ºC y se seleccionaron las colonas que mostraron sensibilidad a cloranfenicol y sensibilidad a ampicilina.
Se preparó el ADN cromosomal de cada cepa seleccionada antes. La cepa confirmada mediante PCR como defectuosa en gen pepA sobre el ADN cromosomal fue tomada como cepa defectuosa en gen pepA y se designo como cepa Escherichia coli JPNDABP.
A continuación, usando la cepa Escherichia coli JPNDABP como cepa original y de acuerdo a un método similar al anterior, se introdujo la eliminación de gen putA, la eliminación de gen glnE y la eliminación de gen glnB en este orden para producir la cepa que tiene eliminados los genes pepD, pepN, pepA, pepB, putA, glnE y glnB, así como el multigen operón dpp. La cepa obtenida fue designada como cepa Escherichia coli JPNDABPUTGEB.
[Ejemplo 8]
Producción L-alanil-L-glutamina (L-Ala-L-Gln)
El JPNDABPUTGEB obtenido en el Ejemplo 7 fue transformado con el pPE86usp obtenido en el Ejemplo 6 para producir Escherichia coli JPNDABPUTGEB/pPE86usp que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene actividad de dipéptido sintasa.
A continuación, la Escherichia coli JPNDABPUTGEB/pPE86usp fue transformada con pSbcr, pSnorE, pSydeE, pSemrD o pSyeeO, que fueron obtenidos en los Ejemplos 1 – 5. Los transformantes obtenidos fueron designados Escherichia coli JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSbcr, JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSnorE, JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSydeE, JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSemrD, JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSyeeO, respectivamente. Del mismo modo, también se obtuvo un transformante (JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSTV28) que portaba pSTV28.
El transformante obtenido antes fue inoculado en un tubo de ensayo de mayor tamaño que contenía 8 mL de medio LB que contiene 50 µg/mL de ampicilina y 25 µg/mL de cloranfenicol y la mezcla se cultivó durante 17 h a 30ºC. El medio cultivado se añadió a un tubo de ensayo que contenía 8 mL de un medio de cultivo (16 g/L de hidrogenofosfato dipotásico, 14 g/L de dihidrogenofosfato potásico, 2 g/L de sulfato amónico, 1 g/L de ácido cítrico (anhidro), 1 g/L de ácido casamino (fabricado por Difco), 10 g/L de glucosa, 10 mg/L de vitamina B1, 2 g/L de sulfato magnésico heptahidratado, 10 mg/L de sulfato de manganeso pentahidratado, 50 mg/L de sulfato férrico heptahidratado, 0,1 g/L de L-Pro; ajustado a pH 7,2 con 10 mol/L de disolución de hidróxido sódico; se añadió glucosa, vitamina B1, sulfato magnésico heptahidratado, sulfato férrico heptahidratado y L-Pro tras autoclavado por separado) al 1%, y la mezcla se cultivó durante 24 h a 30ºC. El medio de cultivo se centrifugó para obtener el sobrenadante. El producto cultivado resultante del sobrenadante del cultivo fue derivatizado con el método F-moc, y el producto resultante se analizó con HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
- cepa
- L-Ala-L-Gln (g/L)
- JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSTV28
- 0,34
- JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSbcr
- 0,55
- JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSnorE
- 0,62
- JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSydeE
- 0,69
- JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSemrD
- 0,52
- JPNDABPUTGEB/pPE86usp/pSyeeO
- 0,55
Tal como se muestra en la Tabla 1, la cantidad acumulada de L-Ala-L-Gln en el medio de cultivo aumentó al potenciar la expresión del gen bcr, norE, ydeE, emrD ó yeeO. Estos resultados demuestran que los productos génicos anteriores son proteínas que tienen actividad de transporte de dipéptidos, mediante el cual el dipéptido de la célula es exportado extracelularmente.
[Ejemplo 9]
Producción de L-alanil-L-leucina (L-Ala-L-Leu), L-alanil-L-valina (L-Ala-L-Val, L-alanil-L-isoleucina (L-Ala-L-Ile), Lalanil-L-tirosina (L-Ala-L-Tyr).
Se transformó Escherichia coli JPNDDP36 (WO 05/45006) con pPE86usp obtenido en el Ejemplo 6 y el transformante obtenido se designó JPNDDP36/pPE86usp. La Escherichia coli JPNDDP36/pPE86usp se transformó con pSbcr, pSnorE, pSydeE, pSemrD y pSyeeO, que fueron obtenidos en los Ejemplos 1 – 5, respectivamente, y los transformantes obtenidos fueron designados como Escherichia coli JPNDDP36/pPE86usp/pSbcr, JPNDDP36/pPE86usp/pSnorE, JPNDDP36/pPE86usp/pSydeE, JPNDDP36/pPE86usp/pSemrD y JPNDDP36/pPE86usp/pSyeeO, respectivamente. Del mismo modo, también se obtuvo un transformante (JPNDDP36/pPE86usp/pSTV28) que porta pSTV28.
El transformante obtenido fue inoculado en un tubo de ensayo de mayor tamaño que contenía 8 mL de medio LB que contiene 50 µg/mL de ampicilina y 25 µg/mL de cloranfenicol y la mezcla se cultivó durante 17 h a 30ºC. El medio cultivado se añadió a un tubo de ensayo que contenía 8 mL de un medio acuoso que contenía 100 µg/mL de ampicilina, 25 µg/mL de cloranfenicol y aminoácido (L-Leu ó L-Val ó L-Ile ó L-Tyr) (16 g/L de hidrogenofosfato dipotásico, 14 g/L de dihidrogenofosfato potásico, 2 g/L de sulfato amónico, 1 g/L de ácido cítrico (anhidro), 1 g/L de ácido casamino (fabricado por Difco), 0,1 g/L de L-Pro, 2 g/L de L-Leu (ó L-Val, L-Ile, L-Tyr), 10 g/L de glucosa, 10 mg/L de vitamina B1, 2 g/L de sulfato magnésico heptahidratado, 50 mg/L de sulfato férrico heptahidratado, 10 mg/L de sulfato de manganeso pentahidratado; ajustado a pH 7,2 con 10 mol/L de disolución de hidróxido sódico; se añadió glucosa, vitamina B1, sulfato magnésico heptahidratado, sulfato férrico heptahidratado y L-Pro tras autoclavado por separado) al 1%, y la mezcla se cultivó durante 24 h a 30ºC. El medio acuoso se centrifugó para obtener el sobrenadante.
El producto resultante del sobrenadante del cultivo fue derivatizado con el método F-moc, y el producto resultante se analizó con HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
- cepa
- L-Ala-L-Leu (g/L)
- JPNDDP36/pPE86usp/pSTV28
- 0,12
- JPNDDP36/pPE86usp/pSbcr
- 0,29
- JPNDDP36/pPE86usp/pSnorE
- 0,39
- JPNDDP36/pPE86usp/pSydeE
- 0,39
- JPNDDP36/pPE86usp/pSemrD
- 0,56
- JPNDDP36/pPE86usp/pSyeeO
- 0,26
- L-Ala-L-Val (g/L)
- JPNDDP36/pPE86usp/pSTV28
- 0,68
- JPNDDP36/pPE86usp/pSbcr
- 1,65
- JPNDDP36/pPE86usp/pSnorE
- 1,40
- JPNDDP36/pPE86usp/pSydeE
- 2,21
- JPNDDP36/pPE86usp/pSemrD
- 1,25
- JPNDDP36/pPE86usp/pSyeeO
- 1,46
- L-Ala-L-Ile (g/L)
- JPNDDP36/pPE86usp/pSTV28
- 0,26
- JPNDDP36/pPE86usp/pSbcr
- 1,13
- JPNDDP36/pPE86usp/pSnorE
- 0,84
- JPNDDP36/pPE86usp/pSydeE
- 1,15
- JPNDDP36/pPE86usp/pSemrD
- 0,43
- JPNDDP36/pPE86usp/pSyeeO
- 0,51
- L-Ala-L-Tyr (g/L)
- JPNDDP36/pPE86usp/pSTV28
- 0,25
- JPNDDP36/pPE86usp/pSbcr
- 0,33
- JPNDDP36/pPE86usp/pSnorE
- 0,81
- JPNDDP36/pPE86usp/pSydeE
- 0,54
- JPNDDP36/pPE86usp/pSemrD
- 0,32
- JPNDDP36/pPE86usp/pSyeeO
- 0,22
Tal como se muestra en la Tabla 2, las cantidades acumuladas de dipéptidos diferentes a L-Ala-L-Gln en el medio de cultivo también aumentó al potenciar la expresión del gen bcr, norE, ydeE, emrD ó yeeO. Estos resultados demuestran que los productos génicos anteriores son proteínas que tienen actividad de transporte de dipéptidos en
5 general.
“Texto Libre de Listado de Secuencias”
SEQ ID NO: 30 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
SEQ ID NO: 31 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
SEQ ID NO: 32 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
10 SEQ ID NO: 33 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético. SEQ ID NO: 34 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético. SEQ ID NO: 35 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético. SEQ ID NO: 36– explicación de secuencia artificial: ADN sintético. SEQ ID NO: 37 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
15 SEQ ID NO: 38 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético. SEQ ID NO: 39 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético. SEQ ID NO: 40 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético. SEQ ID NO: 41 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético. SEQ ID NO: 42 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
SEQ ID NO: 43 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
SEQ ID NO: 44 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
SEQ ID NO: 45 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
SEQ ID NO: 46 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
5 SEQ ID NO: 47 – explicación de secuencia artificial: ADN sintético.
Aplicabilidad Industrial
Según la presente invención, potenciando la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de la célula microbiana al exterior de las células microbianas de un microorganismo, se puede producir de manera eficiente un dipéptido usando el microorganismo.
- Listado de secuencias
- <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
- 5
- <120> Ppara producir dipéptidos
- <130> 1944
- 10
- <150> JP2007-99956 <151> 2007-04-06
- <160> 47
- 15 20
- <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 1491 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (201)..(1388)
- 25
- <400> 1
<210> 2
<211> 1674
5 <212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS 10 <222> (201)..(1571)
<400> 2
<210> 3
<211> 1488
5 <212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS 10 <222> (201)..(1385)
<400> 3
<210> 4
<211> 1485
5 <212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS 10 <222> (201)..(1382)
<400> 4
<210> 5
<211> 1944
5 <212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS 10 <222> (201)..(1841)
<400> 5
<210> 6
<211> 396
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 6
<210> 7
<211> 457
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 7
<210> 8
<211> 395
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 8
<210> 9
<211> 394
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 9
<210> 10
<211> 547
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
<210> 11
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 11
<210> 12
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis ATCC6633
<400> 12
<210> 13
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis IAM1213
<400> 13
<210> 14
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis IAM1107
<400> 14
<210> 15
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis IAM1214
<400> 15
<210> 16
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis ATCC21555
<400> 16
<210> 17
<211> 472
<212> PRT
<213> Bacillus amyloliquefaciens IF03022
<400> 17
<210> 18
<211> 476
<212> PRT
<213> Bacillus pumilus NRRL B-12025
<400> 18
<210> 19
<211> 93
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 19
<210> 20
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 20
<210> 21
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis ATCC6633
<400> 21
<210> 22
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis IAM1213
<400> 22
<210> 23
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis IAM1107
<400> 23
<210> 24
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis IAM1214
<400> 24
<210> 25
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis ATCC21555
<400> 25
<210> 26
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens IF03022
<400> 26
<210> 27
<211> 1428
<212> DNA
<213> Bacillus pumilus NRRL B-12025
<400> 27
<210> 28
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis ATCC 15245 y Bacillus subtilis IAM 1033
<400> 28
<210> 29
<211> 279
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 29
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
<400> 30
tttaagcttt gactttcagg agcccgttg 29
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
<400> 31
tttgagctca tatatcgggg gaatgatag 29
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
<400> 32
tttaagctta aaaggtgttc acgtgcaga 29
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético 79
<400> 33
- tttggatcct tagcgggatg ctcgttgca
- 29
- <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 34
- atagaattct taacagttga ttcgttagtc
- 30
- <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 35
- ataggatcct caacaaagcg cgggctgccc
- 30
- <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 36
- tttgaattcg gtgataatga aaaggcaaag
- 30
- <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 37
- tttctgcagt taaacgggct gcccctgat
- 29
- <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 38
- tttgaattcg ttgttgaggc acatcttaa
- 29
- <210> 39
- <211> 29 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 39
- tttctgcagt tattccgaca caactggct
- 29
- <210> 40 <211> 56 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 40
- atggagttta gtgtaaaaag cggtagcccg gagaaagtgt aggctggagc tgcttc
- 56
- <210> 41 <211> 56 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 41
- ttactcttcg ccgttaaacc cagcgcggtt taacagcata tgaatatcct ccttag
- 56
- <210> 42 <211> 56 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 42
- catcatggat atttcacgat aacgttaagt tgcaccgtgt aggctggagc tgcttc
- 56
- <210> 43 <211> 56 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 43
- agatgccgga ggaggttgta acatcctccg gctacccata tgaatatcct ccttag
- 56
- <210> 44 <211> 56 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220>
- <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 44
- gttgagcggc tgccagagcc tttagccgag gaatcagtgt aggctggagc tgcttc
- 56
- <210> 45 <211> 56 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 45
- ctgccagctt gcccgcacca gttcacgctc tgcggtcata tgaatatcct ccttag
- 56
- <210> 46 <211> 56 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 46
- ctggacgatg tccgcgaagc actggccgaa gtcggtgtgt aggctggagc tgcttc
- 56
- <210> 47 <211> 56 <212> DNA <213> Secuencia Artificial
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA sintético
- <400> 47
- tgccgcgtcg tcctcttcac cggtacggat gcgaatcata tgaatatcct ccttag
- 56
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Un microorganismo procariótico que sobreexpresa cualquiera de entre ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa e hidrolasa de amida de aminoácido L, donde dichas ligasa de aminoácido L, prolina imino peptidasa e hidrolasa de amida de aminoácido L tienen actividad de síntesis de dipéptidos yen las que la actividad de una proteína para transportar un dipéptido de una célula microbiana hacia el exterior de dicha célula microbiana (referida a partir de este punto como actividad de transporte de dipéptidos) es superior a la de la cepa original, mediante la transformación de la cepa original con un ADN que codifica una proteína con actividad de transporte de dipéptidos,donde dicha proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos se describe en cualquiera de los siguientes apartados [1] a [3]:7[1] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada por cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10,[2] una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se han eliminado, sustituido o añadido entre 1 y 20 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos,[3] una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con un 80% o más de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10, y que tiene actividad de transporte de dipéptidos.
- 2. El microorganismo de la reivindicación 1, que se obtiene transformando la cepa original con un ADN descrito en cualquiera de los siguientes apartados [1] a [3]:[1] un ADN que codifica una proteína de cualquiera de los puntos [1] a [3] de la reivindicación 1,[2] un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la región codificadora tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5,[3] un ADN que se hibrida con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de una región codificadora de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 5 en condiciones severas, y que codifica la proteína que tiene actividad de transporte de dipéptidos.
-
- 3.
- El microorganismo de la reivindicación 1 ó 2, que pertenece al género Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.
-
- 4.
- Un proceso para producir un dipéptido que comprende:
permitir que un cultivo o un cultivo tratado del microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un aminoácido, éster de aminoácido o amida de aminoácido estén presentes en un medio acuoso, dejar que se forme y se acumule el dipéptido en el medio acuoso y recuperar el dipéptido del medio acuoso. -
- 5.
- Un proceso para producir un dipéptido que comprende:
cultivar el microorganismo de la reivindicación 1 ó 2 y que tiene la capacidad de producir al menos un tipo de aminoácido de entre los aminoácidos que constituyen el dipéptido en un medio, permitir que se forme y se acumule el dipéptido en el medio, y recuperar el dipéptido del cultivo. -
- 6.
- El proceso de la reivindicación 4 ó 5, donde el microorganismo pertenece al género Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Pseudomonas o Streptomyces.
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