WO2006001381A1 - ジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法 - Google Patents

ジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法 Download PDF

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WO2006001381A1
WO2006001381A1 PCT/JP2005/011638 JP2005011638W WO2006001381A1 WO 2006001381 A1 WO2006001381 A1 WO 2006001381A1 JP 2005011638 W JP2005011638 W JP 2005011638W WO 2006001381 A1 WO2006001381 A1 WO 2006001381A1
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WO
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substituted
dipeptide
amino acid
unsubstituted
derivative
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/011638
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shin-Ichi Hashimoto
Hajime Ikeda
Kazuhiko Tabata
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US11/630,397 priority patent/US20080213827A1/en
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Publication of WO2006001381A1 publication Critical patent/WO2006001381A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a culture of a cell having an activity of producing one or more amino acids or amino acid derivatives, a dipeptide or a dipeptide derivative, or a DNA encoding the protein, or a treatment of the culture
  • the present invention relates to a method for producing a dipeptide or a dipeptide derivative using a product.
  • peptide mass synthesis methods For peptide mass synthesis methods, chemical synthesis methods (liquid phase method, solid phase method), enzymatic synthesis methods, and biological synthesis methods using DNA recombination methods are known. . At present, enzymatic synthesis methods or biological synthesis methods are used for long-chain peptides of 50 residues or more, and chemical synthesis methods and enzymatic synthesis methods are mainly used for dipeptides.
  • thermostable aminoacyl-t-RNA synthetase has the problem that it is difficult to prevent enzyme expression and by-product reactions other than the target product.
  • NRPS it is difficult to express the enzyme using the DNA recombination method due to the large size of the enzyme molecule, and the coenzyme 4'phosphopan Tetein (4'-phosphopantetheine) must be supplied, and it is an efficient manufacturing method!
  • 4'-phosphopantetheine which is a coenzyme smaller than the enzyme molecular weight SNRPS, is not required.
  • ⁇ -Gnoretaminocysteine synthetase y-glutamylcysteine synthetase
  • glutathione synthetase glutathione synthetase
  • D-Ala Lou D-Alanin
  • a group of peptide synthetases such as -D-Ala-ligase and poly-y-glutamate synthetase are also known. Most of these enzymes have characteristics such as using D-amino acid as a substrate or catalyzing the formation of a peptide bond at the ⁇ -position carboxyl group. Cannot be used for dipeptide synthesis.
  • bacillicin synthase which is a dipeptide antibiotic derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus.
  • Basilicin synthase has the activity to synthesize bacillicin (L-Ala-L-anticapsin) and L-Ala-L-Alanin (L-Ala- L-Ala). It is known to have other synthetic activity of other dipeptides! It is known! /, NA! /, (See Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Non-patent document 11 has been reported.
  • Patent Document 1 JP-A-58-146539
  • Patent Document 2 JP-A-58-209991
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 58-209992
  • Patent Document 4 JP-A-59-106298
  • Patent Document 5 US Patent No. 5795738
  • Patent Document 6 US Patent No. 5652116
  • Patent Document 7 International Patent Publication No. 00-03009 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)
  • Non-Patent Document 2 Chem. Biol, 7, 373-384 (2000)
  • Non-Patent Document 3 FEBS Lett., 498, 42-45 (2001)
  • Non-Patent Document 4 J. Ind. Microbiol, 2, 201-208 (1987)
  • Non-Patent Document 5 Enzyme. Microbial. TechnoL, 29, 400-406 (2001)
  • Non-Patent Document 6 Nature, 390, 249-256 (1997)
  • Non-Patent Document 7 J. Nat. Prod., 59, 293-296 (1996)
  • Non-Patent Document 8 Tetrahedron, 28, 2999 (1972)
  • Non-Patent Document 9 J. Appl. Microbiol, 86, 29-53 (1999)
  • Non-Patent Document 10 Mol. Microbiol, 38, 794-804 (2000)
  • Non-Patent Document 11 J. Biol. Chem., 273, 22773-22781 (1998)
  • Non-Patent Document 12 Chemistry & Biol., 9, 1355-1364 (2002)
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a dipeptide derivative from an amino acid or an amino acid derivative.
  • the present invention relates to the following (1) to (26).
  • dipeptide or dipeptide derivative (PI)
  • PI dipeptide or dipeptide derivative
  • the dipeptide or dipeptide derivative (PI) is not a compound in which the same or different amino acids selected from the following amino acid group A are bonded by peptide bonds (amino acid group A: L-alanine, L-gluta Min, L-Glutamic acid, L-Norine, L-Leucine, L-Isoleucine, L-Proline, L-Fealanine, L-Tryptophan, L-Methionine, L-Serine, L- Leonin, L-cystine, L-asparagine, L-tyrosine, L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-asppartic acid, L- ⁇ -aminobutyric acid, L-azaserine, L-theanine, L-4- Hydroxyproline, L-3-hydroxyproline, L-orthine, L-citrulline, L-6-diazo-5-oxonorleucine, glycine and j8
  • a protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID Nos: 1 to 8 is represented by any of SEQ ID Nos: 1 to 8
  • amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 the amino acid sequence has one or more amino acids deleted, substituted or added, and is a dipeptide or dipeptide from one or more amino acids or amino acid derivatives Proteins with activity to produce derivatives (PI)
  • [3] It consists of an amino acid sequence having 65% or more homology with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 8, and one or more amino acids or amino acid derivatives to dipeptides. Or a protein with activity to produce dipeptide derivatives (PI)
  • (PI) is generated and accumulated, and the medium force is collected or after the dipeptide or dipeptide derivative (PI) is collected, the dipeptide or dipeptide derivative (PI) is modified to form a dipeptide or dipeptide derivative [hereinafter referred to as dipeptide or A method for producing a dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ), wherein the dipeptide derivative ( ⁇ ) t, u] is produced and the dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ) is collected [however, the dipeptide or dipeptide The derivative ( ⁇ ) is not a compound in which the same or different amino acids of which the amino acid group A force is also selected are bound by peptide bonds].
  • a protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID Nos: 1 to 8 is represented by any of SEQ ID Nos: 1 to 8
  • amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 the amino acid sequence has one or more amino acids deleted, substituted or added, and is a dipeptide or dipeptide from one or more amino acids or amino acid derivatives Proteins with activity to produce derivatives (PI)
  • a cell culture or a treated product of DNA retaining DNA selected from the following [1] to [5] is used as an enzyme source, and the enzyme source, one or more amino acids or amino acid derivatives are used as water.
  • a dipeptide or dipeptide derivative (PI) that is present in an aqueous medium produces and accumulates a dipeptide or dipeptide derivative (PI) in the aqueous medium, and collects the dipeptide or dipeptide derivative (PI) from the medium Production method of (PI) [However, dipeptide or dipeptide derivative (PI) is not a compound in which the same or different amino acids selected from amino acid group A are bound by peptide bonds].
  • PI dipeptide or dipeptide derivative
  • a cell culture or a treated product of DNA retaining DNA selected from the following [1] to [5] is used as an enzyme source, and the enzyme source, one or more amino acids or amino acid derivatives are used as water.
  • the dipeptide or dipeptide derivative (PI) in the aqueous medium to form and accumulate in the aqueous medium, and as it is or after collecting the dipeptide or dipeptide derivative (PI), the dipeptide or dipeptide derivative (PI) A method for producing a dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ), which comprises modifying PI) to produce a dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ), and collecting the dipeptide or dipeptide derivative (PII).
  • a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 or 40, hybridized under stringent conditions, and one or more amino acids or amino acid derivatives dipeptide or dipeptide derivative DNA encoding a protein having an activity to generate (PI)
  • n 1 represents an integer of 1 to 3
  • R la and R lb are the same or different and each represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted A lower alkanoyl, a substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyl, a substituted or unsubstituted aryl or a force representing a substituted or unsubstituted aryl, or one of R la and R lb adjacent nitrogen atoms, A carbon atom adjacent to the nitrogen atom and any one of R 2a and R 2b on the carbon atom may form a substituted or unsubstituted heterocyclic group
  • R 2a and R 2b are the same or Differently, a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted
  • R 3a and R 3b are the same or different and represent a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or R 4 Either R 3a or R 3b on the carbon atom adjacent to HN together with the adjacent carbon atom, nitrogen atom adjacent to the carbon atom and R 4 form a substituted or unsubstituted heterocyclic group If n 2 is 2 or 3, then 2 or 3 R 3a and 2 or 3 R 3b may be the same or different,
  • R 4 is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aralkyl.
  • R 5 represents amino, hydroxy, substituted or unsubstituted lower alkoxy, mono (substituted or unsubstituted lower alkyl) amido di (substituted or unsubstituted lower alkyl) amino or alicyclic heterocyclic group]
  • An amino acid or an amino acid derivative represented by the formula [However, when the amino acid or amino acid derivative is only the formula (I), at least one of R la and R lb is a hydrogen atom, and the amino acid or amino acid derivative is only the formula (II) Wherein R 5 is hydroxy], from the above (1) to (4) !, any one production method.
  • R le and R ld are the same or different and represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, Alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted lower alkanol, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbon, substituted or unsubstituted Represents an aryl or a substituted or unsubstituted alloy
  • R 2e and R 2d are the same or different and each represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted lower alkyl) or formula (IV)
  • R and R 3d are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted aralkyl or a substituted or unsubstituted aryl,
  • R 5 is as defined above), wherein amino acid or amino acid derivative is only formula (III), and at least one of R le and R ld is a hydrogen atom, Or, when the amino acid derivative is only the formula (IV), R 5 is hydroxy.
  • R 3e represents a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted aralkyl or a substituted or unsubstituted aryl
  • amino acid derivative (1) to One of the manufacturing methods in (4).
  • amino acid or amino acid derivative is an amino acid selected from the group consisting of L-amino acid, glycine and
  • L-amino acids are L-alanine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-parin, L-mouth icin, L-isoleucine, L-proline, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-methionine, L-serine, L-threonine, L-cystine, L-asparagine, L-tyrosine, L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-aspartic acid, L- ⁇ -aminobutyric acid, L-azaserine, L-theanine,
  • the above (8) which is an L-amino acid selected from L-4-hydroxyproline, L-3-hydroxyproline, L-ornithine, L-citrulline and L-6-diazo-5-xonorleucine Manufacturing method.
  • R 6a and R 6b are the same or different and each represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted A lower alkanoyl, a substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyl, a substituted or unsubstituted aryl or a force representing a substituted or unsubstituted aroyl, or one of R 6a and R 6b adjacent nitrogen atoms, A carbon atom adjacent to the nitrogen atom and any one of R 7a and R 7b on the carbon atom may form a substituted or unsubstituted heterocyclic group
  • R 7a and R 7b are the same or Differently, a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstitute
  • R 8a is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aralkyl.
  • R 9a and R 9b are the same or different and represent a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or RN
  • R 9a and R 9b on the adjacent carbon atom forms a substituted or unsubstituted heterocyclic group together with the adjacent carbon atom, the nitrogen atom adjacent to the carbon atom and R 8 a. If 11 1 ⁇ 2 3 ⁇ 4 or 3, then 2 or 3 R 9a and 2 or 3 R % are the same or different. You may,
  • R 1Qa represents an amino, hydroxy, substituted or unsubstituted lower alkoxy, mono (substituted or unsubstituted lower alkyl) amido di (substituted or unsubstituted lower alkyl) amino or alicyclic heterocyclic group].
  • R 6A and R 6B are the same or different and are a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted A lower alkanoyl, a substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyl, a substituted or unsubstituted aryl or a force representing a substituted or unsubstituted aroyl, or one of R 6A and R 6B adjacent nitrogen atoms, A carbon atom adjacent to the nitrogen atom and any one of R 7A and R 7B on the carbon atom may form a substituted or unsubstituted heterocyclic group
  • R 7A and R 7B are the same or Differently, a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted
  • R 9A and R 9B are the same or different and each represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or R 8A
  • R 9A and R 9B on the carbon atom adjacent to N forms a substituted or unsubstituted heterocyclic group together with the adjacent carbon atom, the nitrogen atom adjacent to the carbon atom, and R 8A If n 4 ⁇ 2 or 3, then 2 or 3 R 9A and 2 or 3 R 9B may be the same or different,
  • R 1QA is a dipeptide or dipeptide derivative represented by the above-mentioned R 1Qa ] !, any one production method of (1) to (5) above.
  • Dipeptide or dipeptide derivative (PI) is of formula (Villa)
  • R 6e and R 6d are the same or different and are a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Substituted aralkyl, substituted or unsubstituted lower alkanoyl, substituted or unsubstituted lower alkoxycarbol, substituted or unsubstituted aryl, or Represents a substituted or unsubstituted alloy
  • R 7e and R 7d are the same or different and each represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted lower alkyl
  • R 9e and R 9d are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted aralkyl or a substituted or unsubstituted aryl.
  • R 6C , R 6D , R 7C , R 7D , R 9C and R 9D have the same meanings as R 6e , R 6d , R 7 R 7d , R 9e and R 9d , respectively.
  • R 7e represents substituted or unsubstituted methyl
  • R 9e represents a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted aralkyl or a substituted or unsubstituted aryl, or a dipeptide or dipeptide derivative represented by (1) to (7) above.
  • L-amino acid is L-alanine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-parin, L-leucine, L-isoleucine, L-proline, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-methionine, L serine, L- Threonine, L-cysteine, L-asparagine, L-digestion, L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-aspartic acid, L- ⁇ -aminobutyric acid, L-azarine, L-theanine, L—4-hydroxyproline, L—3- The process according to the above (16), wherein hydroxyproline, L-ornithine, L-citrulline and L-6-diazo-5-oxonorleucine are L-amino acids which are also selected.
  • Peptidase has a protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 43 to 46, or has at least 80% homology with an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 43 to 46
  • a protein in which the peptide uptake protein has an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 47 to 51, or a protein having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 47 to 51 And (20) or (22) above, which is a protein having peptide uptake activity.
  • prokaryote is a microorganism belonging to the genus Escherichia, Bacillus, or Corynebaterum.
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia, Bacillus or Corynebaterum are Escherichia coli, Corynebaterum 'Glutamicum, Corynebaterum' Ammoniagenes, Corynebacterium 'Latatfurmentum, Corynebacterum' flavum.
  • a processed product of the culture is a concentrate of the culture, a dried product of the culture, a cell obtained by centrifuging the culture, a dried product of the cell, a freeze-dried product of the cell, the fungus Surfactant treated product of body, ultrasonic treated product of cell, mechanically ground product of cell, solvent treated product of cell, enzyme treated product of cell, protein content of cell It is a product, an immobilized product of the bacterial cell or an enzyme preparation obtained by extraction from the bacterial cell, and a processed product having an activity to produce one or more amino acids or amino acid derivatives.
  • a dipeptide derivative can be efficiently produced from one or more amino acids or amino acid derivatives.
  • FIG. 1 is a diagram showing the construction process of plasmid pPE43.
  • FIG. 2 is a diagram showing the process of constructing plasmid pQE60ywffi.
  • FIG. 3 is a diagram showing the process of constructing pAL-nou and pAL-alb, which are expression plasmid vectors for proteins having the activity of synthesizing linear dipeptides.
  • FIG. 4 is a diagram showing the process of constructing PPE56, an mffi gene expression enhanced vector.
  • vwffi Batinoles' ⁇ gene from 168 strains of subtilis
  • Amp r Ampicillin resistance gene
  • albC albC transfer or albC street transfer
  • SEQ ID NOS: 1 to 8 a protein having an amino acid sequence represented by a shift
  • amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 the amino acid sequence has one or more amino acids deleted, substituted or added, and one or more amino acids or amino acid derivatives.
  • a protein having an activity to form a derivative [3] consisting of an amino acid sequence having 65% or more homology with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 8, and comprising one or more amino acids or amino acid derivatives
  • a protein having the ability to form a substituted or added amino acid, and having one or more types of amino acids or amino acid derivatives, and a dipeptide or dipeptide derivative, and
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added and having the activity of synthesizing the dipeptide represented by the formula (I) is Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Thrid Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (2001) (hereinafter abbreviated as Molecular ⁇ Cloning 3rd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) Protocols' in 'molecular' biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Ac ad. Sci.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-mentioned site-specific mutagenesis. From several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to: L0, and further preferably 1 to 5.
  • amino acids capable of amino acid substitution include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8, or SEQ ID NOs: 37 and 38, when they are compared using known alignment software. In addition, all amino acid sequences are conserved and can contain amino acids. Examples of known alignment software include alignment analysis software included in gene analysis software Genetyx (Software Development Co., Ltd.). Default values can be used as analysis parameters of the analysis software.
  • amino acid positions at which amino acid deletion or attachment can be performed include, for example, SEQ ID NOs: 1 to 8, 37, and 38, N-terminal side and C-terminal side of the amino acid sequence represented by a shift. Can be raised.
  • Amino acids that are substituted or added, which may be deleted, substituted or attached at the same time, may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanin, L-asparagine, L-aspartic acid, L-arginine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-sip Icin, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine , L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin, L-cysteine and the like.
  • amino acids that can be substituted with each other are shown below. Amino acids contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Norleucine, Norin, Norpaline, Alanine, 2-Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butylglycine, t-Butylalanine, Cyclohexinolealanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G Hue-Lualanin, tyrosine
  • amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, 37 and 38 preferably 65% or more, preferably 75% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 37 85% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more of homologous amino acid sequences, and proteins having synthetic activity of dipeptides or dipeptide derivatives It is also a protein used in the present invention. Amino acid sequence homology can be determined using BLAST or FASTA as described above.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is a region conserved among proteins having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOS: 1 to 7, and the Ala-Ala ligase activity of various microorganisms Is a region corresponding to a consensus sequence of a protein having
  • a protein having the activity of synthesizing a peptide or dipeptide derivative is also a protein of the present invention.
  • the homology between the amino acid sequence of the protein and the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 8 is at least 80% or more, usually 90% or more, particularly 95% or more. It is preferable to have.
  • the homology of amino acid sequences can be determined using BLAST or FASTA as described above.
  • the protein used in the present invention is a protein having a synthetic activity of a dipeptide or a dipeptide derivative
  • a transformant expressing the protein of the present invention is prepared using a DNA recombination method, After producing the protein used in the present invention using the transformant, the protein, one or more L amino acids and amino acid derivatives, and ATP are present in an aqueous medium, and the dipeptide or A method for analyzing whether or not a dipeptide derivative is capable of being produced and accumulated by HPLC or the like can be mentioned.
  • a DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 is subjected to stringency under a stringent condition, and a dipeptide or dipeptide derivative is produced from one or more amino acids or amino acid derivatives.
  • DN A encoding a protein having activity
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 or 40 and [5] A DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 or 40 is hybridized under stringent conditions, and one or more amino acids or amino acid derivatives have a dipeptide or dipeptide derivative Examples thereof include DNA encoding a protein having an activity to be produced.
  • DNAs capable of hybridizing under the above stringent conditions are SEQ ID NOs: 9 to 16.
  • a one- or one-hybridization method using a part or all of a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by any of 18, 36, 39 or 40 as a probe This means DNA obtained by using the plaque hybridization method or Southern blot hybridization method, etc. Specifically, using a filter to which DNA derived from colonies or plaques is immobilized, 0 7 to 1. After carrying out a noble hybridization at 65 ° C in the presence of Omol / 1, preferably 0.9 mol / l sodium chloride, 0.1 to 2 times the concentration, preferably 0.
  • 1x SSC solution composition of 1x SSC solution consists of 150mmol / l sodium chloride and 15mmol / l sodium quenate
  • Hybridization is Molecular ⁇ ⁇ Cloning 3rd Edition, Current 'Protocols'In' Molecular ⁇ ⁇ Biolon 1 ⁇ , DNA Cloning 1: and ore Techniques, A Practical Approach, Second Editio n, according to the method described in Oxford University (1995).
  • the DNA that can be hybridized is represented by any one of SEQ ID NOs: 9 to 16, 18, 36, 39, and 40 when calculated based on the above parameters using BLAST and FASTA described above. DNA having a homology of at least 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more with the base sequence to be obtained.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 9 to 16, 18, 36, 39, and 40 is a dipeptide or dipeptide derivative.
  • the fact that it is a DNA encoding a protein having a synthetic activity is confirmed, for example, by producing the protein encoded by the recombinant DNA method and measuring the activity of the protein as described above. be able to.
  • the DNA used in the present invention belongs to the genus Bacillus or Streptomyces using a probe that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NOs: 9 to 16, 18, 36, 39, or 40.
  • Bacillus using Southern DNA hybridization for the chromosomal DNA library of the microorganism to which it belongs, or a primer DNA that can be designed based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 9-16, 18, 36, 39, or 40 It can be obtained by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using a chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus as a cage.
  • DNA sequences encoding amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8, 17, 37, and 38! 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more of a sequence having homology is searched, and based on the base sequence obtained by the search, the sequence has
  • the DNA used in the present invention can also be obtained from the chromosomal DNA, cDNA library, etc. of the organism by the method described above.
  • the obtained DNA is cut as it is or with an appropriate restriction enzyme and incorporated into a vector by a conventional method, and the resulting recombinant DNA is introduced into a host cell, followed by analysis of commonly used nucleotide sequences. Analysis using a nucleotide sequence analyzer such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or 373 ⁇ ⁇ DNA sequencer (manufactured by Perkin Elmer). Thus, the base sequence of the DNA can be determined.
  • the full length is determined by the Southern hybridization method for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe. DNA can be obtained.
  • the target DNA can be prepared by chemical synthesis using an 8905 DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • Examples thereof include DNA having a base sequence represented by 40.
  • vectors incorporating the DNA of the present invention and the DNA used in the production method of the present invention include pBluescriptll KS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6 069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene), pT7Blue (Novagen), pCR II (Invitrogen) and pCR-TRAP (Gen Hunter) It is out.
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Rhihia include Escherichia coli XL1-Blue ⁇ eshelihia coli XL2-Blue ⁇ eshelihia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Escherichia coli ME8415, etc. .
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (JP-A-63-248394), electrovolution method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • Examples of the microorganism having the DNA used in the production method of the present invention obtained by the above method include, for example, Escherichia ', which is a microorganism having a recombinant DNA containing a DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 1. Kori NM522 / pPE43 can be mentioned.
  • the cells used in the present invention include: 0 a bacterium belonging to the genus Bacillus having 3 of the above DNA on the chromosomal DNA, preferably a bacterium belonging to the genus Bacillus having bacillicin synthesis activity, more preferably Bacillus subtilis, Bacteria belonging to the species selected from the group consisting of Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulance, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium and Bacillus pumiluska, more preferably Bacillus subtilis ATCC 15245, Bacillus subtilis ATCC6633, Bacillus NRRL B-120 consisting of Bacillus subtilis IAM1213, Bacillus subtilis IAM1107, Bacillus subtilis IAM1214, Bacillus subtilis ATCC9466, Nautilus subtilis IAM1033, Bacillus subtilis ATCC21555, Bacillus subtilis ciences IFO3022 and Bacillus pumulus 25 Bacteria, to
  • a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the protein used in the present invention is prepared.
  • cells with an improved production rate of the protein can be obtained.
  • Recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing the protein of the present invention can be obtained by introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector.
  • any microorganism such as prokaryote and yeast, animal cell, insect cell, plant cell and the like, which can express the target gene, can be used, preferably a microorganism, more preferably Can include prokaryotes, more preferably bacteria.
  • the expression vector is capable of autonomous replication in the above host cell or can be integrated into a chromosome, and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention can be transcribed. Is used.
  • the recombinant DNA having the DNA used in the present invention is capable of autonomous replication in a prokaryotic organism, and at the same time a promoter, a ribosome binding sequence, and the DNA of the present invention.
  • the DNA used in the production method of the present invention is preferably a recombinant DNA composed of a transcription termination sequence. It includes the genes that control the promoter.
  • Expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all manufactured by Boehringer Mannheim), pHelixl (manufactured by Roche's Diagnostats), pKK233-2 (manufactured by Amersham 'Fanore Macia' Biotech), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-EX (Promega), pQE-8 (Qiagen), pET-3 (Novagen), pKYPIO (JP 58-110600), p KYP200 [Agric. Biol Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol.
  • the promoter can be anything as long as it functions in host cells such as Escherichia coli! For example, im promoter (p), promoter (P;), P
  • promoters examples include promoters, SPOl promoters, SP02 promoters, penP promoters, and the like.
  • P promoters two P promoters in series, ⁇ promoter, lacT7
  • a ⁇ promoter for expression in microorganisms belonging to the genus Bacillus [Appl.
  • a Shine-Dalgarno sequence which is a ribosome binding sequence, and an initiation codon It is preferable to use a plasmid adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Prokaryotes include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corvnebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, and Agronocterum.
  • Agrobacterium Alicyclonocinoles (Alicvclobacillus), Anabena, Anacvstis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Enorebini (Erwinia), Methvlobacterium, Phormidium, Rhodobact ⁇ , RhodoDseudomonas, RhodosDirillum, The genus Scenedesmus, the genus StreDtomvces, the genus Svnechoccus, Imomonasu (Zvmomonas) fine cattle belonging to the genus or the like.
  • Escherichia coli KY3276 Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia 522 Bacillus subtilis A TCC33712, Bacillus megaterium, Bacinoles sp Genes (Brevibacterium ammo niagenes), Brechnobacterium saccharolvticum A TCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brebacteria flavum ATCC14067 Beam * Lactobacillus Sulfur lactofermentum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, co-Rinebatateriumu.
  • Glutamicum (ojynebacterium glutamicum) ATCC13032, Korineba Cutelium glutamicum ATCC14297, Corvne bacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Serratia ficaria, Serratia fontia Serratia liauef aciens, Serratia marcescens, Pseudomonas sp.
  • Agrobacterium radio bacter Agrobacterium radiobacter Jeans (Agrobacterium rhizogenes), Agrobacterium rubi, Anabaena cvlindrica, Anabaena doliolum, Anabaena flos-aauae ) ⁇ Earth Lobactor -Lessence (Arthrobacter aurescens), Arthrobacter citreus, Arthrobacter elobf ormis, Ryo.
  • Chromatium tepidum Chromatium tepidum (Chromatium tepidum), Chromatium tepidum (Chromatium tepidum), Chromatium tepidum (Chromatium tepidum) Chromatium warmingii), Chromatium fluviatile, Erwiniauredovora, Enorevia 'Erwinia carotovora, Erwinia ananas ), Erwinia herbicola, Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methvlobacterium rnodesianum, Methylobacteria ⁇ Exotonoleques (Methvlobacterium extorauens), Phonoremidium ⁇ Phor midium sp.) ATCC 29409, Rhodobacter s seroeroides (Rhodobacter sphaeroides), RhodojDseudomonas, blastica (R
  • Bacteria belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynenocterium, Syudomonas or Streptomyces such as Escherichia, Serratia, Batinoles, Brevibacterium, Species belonging to the genus Corynebacterium, Syudomonas or Streptomyces can be mentioned, and more preferable bacteria are Escherichia coli, Corynebacterium dartamicum, Corynebatterum, Ammoniagenes, Corynebataterum 'Lattofermentum, Corynebacteum' flavum, Corynebataterum 'Ehuciens, Bacillus' Sacillus, Bacillus 'Megaterium, Serratia' Manorescens, Jujumonas 'Putida, Jujumonas' Erginosa, Streptomyces cerevisiae or Streptomyces
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cell.
  • a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69 , 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • electrovolution method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • yeast strains When yeast strains are used as host cells, YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, etc. are used as expression vectors. It is possible to be.
  • Yogu example be used any one as long as it can function in yeast strains, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH flop port motor, gal i promoter, gal 10 promoter, Examples of the promoter include heat shock polypeptide promoter, MF al promoter and CUP 1 promoter.
  • Host cells include the genus Saccharomvces, Schizosaccharomvces fe, Kluweromvces, Tricho sporon, Schwanniomvces, Pichia ) Or yeast strains belonging to the genus Cdida, etc., specifically, Saccharomvces cerevisiae, Schi saccharomv cespombe, Kunoreiberoma ⁇ Fukui “Kluweromvces lactis”, Trichosporon pullulans, “Swannimvces alluvius”, “Pichia pastoris”, “Candida Uteiris” (£ andida utilis), etc. it can.
  • any method can be used as long as it introduces DNA into yeast.
  • the Elect Mouth Position Method [Methods EnzymoL, 194, 182 (1990)]
  • Examples include the plast method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)], the lithium acetate method [J. BacterioL, 153, 163 (1983)], and the like.
  • examples of expression vectors include pcDNAU pcD M8 (sold by Funakoshi), pAGE107 (JP-A-3-22979), pAS3-3 (JP-A-2-227075), pCDM8 [Nature , 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pAMo, pAMoA, etc. Can do.
  • Any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • a promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene an early promoter of SV40, or a metamouth.
  • Thione promoter, retrowinore promoter, heat shock promoter, SRa promoter, etc. wear.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • Host cells include mouse 'myeloma cells, rat' myeloma cells, mouse 'hybridoma cells, human cells such as Namalwa cells or Namalva KJM-1 cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, Examples include African green monkey kidney cells, CHO cells that are Chinese hamster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299). As mouse myeloma cells, SP2 / 0, NSO, etc.
  • Rat 'myeloma cells as YB2 / 0 etc., human fetal kidney cells as HEK293 (ATCC CRL-1573), human leukemia cells as BALL-1, etc., Africa Examples of green monkey kidney cells include COS-l and COS-7.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electoral position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • the lipofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]
  • Virology, 52, 456 (1973) and the like.
  • insect cells When insect cells are used as a host, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and company, New York (1992), 7 Lund-Froto Cornolez 'In'Molecular'Neurology, Molecular Proteins can be produced by the methods described in Biology, A Laboratory Manual, Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • a recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus in the insect cell culture supernatant, the recombinant virus is further infected into insect cells to produce a protein. Can be made.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVLl393, pBlueBacIII (V, both are manufactured by Invitrogen) and the like.
  • baculovirus for example, the autographa californica nu clear polyhedrosis virus; a virus that infects night stealing insects, such as Autographa californica nu clear polyhedrosis virus; That's it.
  • Insect cells include ovary cells of Spodoptera frugi verda (2E2d2 tera frugiE_erda) It is possible to use cultured cells derived from TrichoDlusia ni egg yolk thin cells and silkworm ovary.
  • Spodoptera frugibelda ovarian cells are S19, S11 (Baculovirus' Expression 'Vector Zura' Laboratory 'Mual), etc.)
  • Trichopulcia' second ovary cells are High 5, ⁇ - ⁇ -5 ⁇ 1- Examples of cultured cells derived from silkworm ovary such as 4 (manufactured by Invitrogen) include Bombix mori N4.
  • Examples of a method for co-introducing the above recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-227075), the lipofusion method [Proc. Natl. Acad Sci., USA, 84, 7413 (1987)].
  • expression vectors include Ti plasmids and tobacco mosaic virus vectors.
  • Any promoter can be used as long as it functions in plant cells. Examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the rice actin 1 promoter, and the like.
  • host cells include tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat, barley, and other plant cells.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open No. 59-140885, specially disclosed. Examples include Kaisho 60-70080, WO94 / 00977), electo-poration method (Japanese Patent Publication 60-251887), a method using a particle gun (patent 2606856, Japanese Patent 2517813), and the like.
  • the microorganism used in the production method of the present invention is a microorganism prepared by the method of (1) above, wherein one or more peptidases and one or more proteins having peptide uptake activity (hereinafter referred to as peptide uptake) (Abbreviated as protein) and reduced or lost V, microorganisms, or the activity of three or more peptidases decreased or lost A thing is used suitably.
  • the microorganism is, for example, (a) a microorganism in which the function of one or more peptidases and one or more proteins having peptide uptake activity is reduced or lost, or the function of three or more peptidases.
  • the microorganism in which the activity of one or more peptidases and one or more peptide uptake proteins is reduced or lost is any one or more peptidases as long as the microorganism can grow normally. And microorganisms in which the activity of any one or more peptide uptake proteins is reduced or lost, preferably 1 or more and 9 or less, more preferably 1 or more and 7 or less, more preferably 1 The activity of 4 or less peptidases is reduced or lost, and preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or more and 2 or less, particularly preferably One type of peptide is a microorganism in which the activity of the protein taken up is reduced or lost.
  • the microorganism includes a gene encoding a peptidase (hereinafter abbreviated as a peptidase gene) present on the genomic DNA of the microorganism and a gene encoding a peptide uptake protein (
  • a peptidase gene present on the genomic DNA of the microorganism
  • a gene encoding a peptide uptake protein (hereinafter abbreviated as a peptidase gene) present on the genomic DNA of the microorganism and a gene encoding a peptide uptake protein
  • all or part of the base sequence is deleted.
  • a microorganism in which the activity of the peptidase and the peptide uptake protein is reduced or lost due to base substitution or addition in the base sequence can be mentioned.
  • the peptidase activity is reduced because the peptide degrading activity is lower than that of the peptidase encoded by the gene, except for the deletion, substitution or attachment of the above-mentioned base. In general, it means 80% or less, preferably 50% or less, more preferably 30% or less, further preferably 20% or less, particularly preferably 10% or less, and most preferably 5% or less.
  • the peptide degrading activity of microorganisms is determined by coexisting a peptide serving as a substrate and microbial cells in an aqueous medium and conducting a peptide decomposing reaction, and then determining the amount of remaining peptide by a known method such as HPLC. It can be measured by quantifying it by an analysis method using.
  • any protein having peptide-degrading activity may be used, preferably a protein having high dipeptide-degrading activity, more preferably dipeptidase.
  • More specific peptidases include, for example, PepA having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, PepB having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44, and SEQ ID NO: 45 present in Escherichia coli.
  • PepD having the amino acid sequence represented by PepN
  • PepN having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46
  • PepP [GenBank accession no.
  • GenBank AAC75946 PepQ (GenBank AAC76850), PepE (GenBank AAC76991) ), PepT (GenBank AAC74211), Dcp (GenBank AAC74611) and IadA (GenBank AAC7728 4), such as AmpS (GenBank AFO 12285), PepT (GenBank X99339), YbaC (GenBank Z99104), YcdD (GenBank Z99105), YjbG (GenBank Z99 110), YkvY (GenBank Z99111), YqjE (GenBank Z99116), YwaD (GenBank Z99123), etc.
  • a protein having 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more homology with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 43 to 46, and having a beptidase activity also has dipeptide degradation activity. It can be mentioned as a high protein.
  • the homology between the amino acid sequence and the base sequence can be determined using BLAST, FASTA and the like described above.
  • the activity of the peptide uptake protein is reduced because the peptide uptake activity is lower than that of the peptide uptake protein encoded by the above-mentioned gene without deletion, substitution or insertion.
  • 80% or less preferably 50% or less, more preferably 30% or less, further preferably 20% or less, particularly preferably 10% or less, most preferably 5% or less.
  • the peptide uptake activity of microorganisms is determined by a known method in which a peptide serving as a substrate and microbial cells coexist in an aqueous medium, and after the peptide uptake reaction, the amount of peptide remaining in the aqueous medium is determined by a known method. For example, it can be measured by quantification by an analytical method using HPLC or the like.
  • the peptide uptake protein is a protein encoded by a gene that forms an operon on chromosomal DNA, a protein that forms a complex on the cell membrane and expresses peptide uptake activity, and a peptide uptake as a single protein. Any protein that is involved in peptide uptake of microorganisms, such as a protein having activity, is preferred. A protein having high peptide uptake activity can be mentioned.
  • More specific peptide uptake proteins include, for example, DppA having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 present in Escherichia coli, DppB having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, and SEQ ID NO: 49.
  • DppC having the amino acid sequence represented DppD having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50, DppF having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, OppA (GenBank AAC76569), OppB (GenBank AAC76568), OppC (GenBank AAC76567), OppD (GenBank AAC76566), OppF (GenBank AAC76565), YddO (GenBank AAC74556), YddP (GenBank AAC74557), YddQ (GenBank AAC74558), YddR (GenBank AAC74559), YddS (GenBank AAC74560) Present in Bacillus subtilis, such as (GenBank AAC7 3915), MppA (GenBank AAC74411), SapA (GenBank AAC74376), SapB (GenBank AAC74375), SapC (GenBank AAC74374), SapD (GenBank AAC74373), and Sap F (GenBank A
  • a protein having the amino acid sequence represented by BAB99048, BAB99383, BAB99384, BAB 99385, BAB99713, BAB99714, BAB99715, BAB99830, BAB99831, and BAB99832 (all registered numbers in the Japan DNA Data Bank) present in Corynebaterum 'glutamicum
  • proteins having high peptide uptake activity include DppA, DppB, DppC, DppD, DppF, and any amino acid sequence having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 47 to 51.
  • a protein having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more can also be listed as a peptide uptake protein with high peptide uptake activity. That.
  • the homology of the amino acid sequence can be determined using the above-mentioned programs such as BLAST and FASTA.
  • a microorganism in which the activity of three or more peptidases is reduced or lost is a microorganism in which the activity of any three or more peptidases is reduced or lost as long as the microorganism can grow normally.
  • Specific peptidases include peptidases and dipeptidases present in the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Corynebacterium dartamicum.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more homology with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 43 to 46, and having a beptidase activity is also a dipeptide. It can be listed as a protein with high degradation activity.
  • the homology of the amino acid sequences can be determined using the above-mentioned programs such as BLAST and FASTA.
  • microorganisms with reduced or lost activity of peptidase and peptide uptake protein there are no limitations on the method of obtaining microorganisms with reduced or lost activity of peptidase and peptide uptake protein as long as the microorganisms can be obtained. It can be obtained by introducing a base deletion, substitution or addition into the peptidase gene or peptide uptake protein gene of the chromosomal DNA of the microorganism shown below.
  • Examples of a method for introducing a base deletion, substitution or addition into a chromosomal DNA gene of a microorganism include a method utilizing homologous recombination.
  • a mutant gene introduced with a base deletion, substitution or addition may be transformed into a host cell into which a base deletion has been introduced.
  • a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligation with a plasmid DNA having a drug resistance gene can be mentioned.
  • linear DNA containing a gene to which a base deletion, substitution or addition is to be introduced is introduced into the cell, and homologous recombination is performed between the chromosomal DNA and the introduced linear DNA. It is a way to wake up.
  • This method can be applied to any microorganism as long as it efficiently incorporates linear DNA.
  • Preferred microorganisms are those belonging to the genus Escherichia or Bacillus, more preferably Escherichia coli, and even more preferably phages. Serihia 'expressing the recombinant protein group (Red recombination system) it can.
  • pKD46 available from Escherichia coligenetic stock center (Yale University, USA)
  • Escherichia coligenetic stock center Yamamoto University, USA
  • Escherichia coli JM101 stock examples include Escherichia coli JM101 stock.
  • Both the drug resistance gene and the gene that can be used for negative selection have homology with DNA located outside both ends of the region on the chromosomal DNA into which deletion, substitution or addition of bases is to be introduced.
  • any drug resistance gene can be used as long as it is a drug resistance gene that imparts drug resistance to a drug to which the host microorganism is sensitive.
  • examples of drug resistance genes include kanamycin resistance gene, chloramphee-chol resistance gene, gentamicin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene and ampicillin resistance gene. Etc.
  • a gene that can be used for negative selection is a gene that is lethal to a microorganism under certain culture conditions when the gene is expressed in a host microorganism.
  • the gene for example, a ⁇ gene derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus [
  • homology means that the linear DNA has homology to such an extent that homologous recombination occurs in a target region on the chromosomal DNA.
  • Specific homology is as follows: 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 100% homology.
  • the homology of the base sequence can be determined using a program such as BLAST or FASTA.
  • the linear DNA fragment can be prepared by PCR.
  • the desired linear DNA can be obtained by restriction enzyme treatment.
  • Examples of methods for introducing base deletions, substitutions or additions into the chromosomal DNA of microorganisms include the following methods 1 to 4.
  • Method 1 Introduce the linear DNA (a) or (d) above into the host microorganism, and select a transformant in which the linear DNA is inserted into the chromosomal DNA by homologous recombination using drug resistance as an index. Method.
  • Method 2 A microorganism can be obtained by introducing the linear DNA of (b) above into the transformed strain obtained by Method 1 above and deleting the drug gene inserted on the chromosomal DNA by the method. A method of substituting or deleting a region on the chromosomal DNA.
  • the linear DNA of (c) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • DNA that has homology to DNA located outside both ends of the target region for substitution or deletion on the chromosomal DNA is synthesized by ligating DNA in the same direction as that on the chromosomal DNA. Introduce into the transformant obtained in 1],
  • the linear DNA of (d) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • any method for introducing linear DNA into a host microorganism used in the above method any method can be used as long as it introduces DNA into the microorganism.
  • a method using calcium ion. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), electoral position method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], etc. I can give you.
  • the transformant obtained by the above method 4 is cultured in a medium, the protein used in the present invention is produced and accumulated in the culture, and the protein is collected from the culture to produce the protein. can do.
  • the host of the transformant for producing the protein used in the present invention is preferably a prokaryote, a microorganism such as yeast, an animal cell, an insect cell, or a plant cell.
  • the microorganism may be a microorganism, more preferably a prokaryote, more preferably a bacterium, particularly preferably a bacterium belonging to the genus Escherichia, and most preferably Escherichia coli.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a conventional method used for culturing host cells.
  • a medium for culturing a transformant of a microorganism obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host cell a carbon source, a nitrogen source, an inorganic material that can be assimilated by the microorganism is used.
  • a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast
  • a carbon source such as Escherichia coli
  • a nitrogen source an inorganic material that can be assimilated by the microorganism
  • Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it contains salts and the like and can efficiently culture transformants.
  • the carbon source as long as the microorganism can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphates such as ammonium or phosphates, and others. Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells, digested products thereof, and the like can be used.
  • the inorganic salt it is possible to use monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like. it can.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C.
  • the culture time is usually 5-7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline should be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer such as isopropyl 1 ⁇ -D-thiogalatatopyranoside
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • RPMI1640 medium J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)
  • Eagle (Eagle) are used as a medium for culturing transformants obtained using animal cells as hosts.
  • MEM medium Science, 122, 501 (1952)]
  • DMEM medium DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)]
  • 199 medium Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or these
  • a medium in which fetal calf serum or the like is added to the medium can be used.
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 25 to 40 ° C, and the presence of 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, streptomycin and the like may be added to the medium as needed during culture.
  • the culture media for transformants obtained using insect cells as hosts are the commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies).
  • ExCell400, ExCell405 [both manufactured by JRH Biosciences], Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] and the like can be used.
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 6-7, 25-30 ° C, etc. for 1-5 days.
  • antibiotics such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • Transformants obtained using plant cells as hosts are cultured as cells or differentiated into plant cells and organs. can do.
  • As a medium for culturing the transformant commonly used Murashige 'and' Stag (MS) medium, White medium, or a plant hormone such as auxin or cytokinin is added to these mediums. It is possible to use the prepared medium.
  • MS Murashige 'and' Stag
  • White medium or a plant hormone such as auxin or cytokinin is added to these mediums. It is possible to use the prepared medium.
  • the culture is usually carried out under conditions of pH 5-9, 20-40 ° C for 3-60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, insect cell, animal cell or plant cell having a recombinant DNA obtained by ligating the DNA used in the present invention to an expression vector is cultured according to a normal culture method, and the present invention.
  • the protein used in the above can be produced and accumulated, and the protein can be produced by collecting the protein from the culture.
  • a method for producing the protein used in the present invention there are a method of producing in a host cell, a method of secreting it outside the host cell, or a method of producing it on the outer membrane of the host cell.
  • the above method can be selected by changing the structure of the protein to be produced.
  • a protein containing the active site of the protein of the present invention is produced in the form of a signal peptide added in front of the protein, so that the protein is actively released outside the host cell. Can be secreted.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the transgenic animal transgenic non-human animal
  • plant individual transgenic plant
  • These proteins can be used to produce the protein of the present invention.
  • the transformant producing the protein used in the present invention is an animal individual or a plant individual, it is bred or cultivated according to a usual method to produce and accumulate the protein, and the protein is obtained from the animal individual or plant individual. By collecting the protein, the protein can be produced.
  • a transgenic non-human animal into which the DNA used in the present invention has been introduced is bred, and the protein used in the present invention is produced and accumulated in the animal.
  • the protein By collecting the protein, the protein can be produced.
  • the place where the protein in the animal is produced and accumulated include milk of the animal (JP-A 63-309192), eggs and the like.
  • Any promoter can be used as long as it functions in animals.
  • a casein promoter which is a mammary cell specific promoter, / 3 casein promoter, j8 ratatoglobulin promoter, whey An acidic protein promoter or the like is preferably used.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation using an organic solvent, etc.
  • Anion exchange chromatography using resin such as dimethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei), resin such as S-Sepharose FF (Falmasia) Cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and ferrule sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing
  • a purified sample can be obtained by using an electrophoresis method such as electrophoresis alone or in combination.
  • the protein when the protein is produced by forming an insoluble substance in cells, the cells are similarly collected, disrupted, and centrifuged from the precipitate fraction obtained by a conventional method. After recovering the protein, the insoluble material of the protein is dissolved with a protein denaturant. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a dilute solution that does not contain a protein denaturing agent or the concentration of the protein denaturing agent does not denature the protein, and the protein is formed into a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method.
  • the protein used in the present invention or a derivative such as a sugar modification product thereof is secreted extracellularly, the protein or a derivative such as a sugar adduct can be recovered in the culture supernatant.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Obtainable.
  • Examples of the protein thus obtained include a protein having an amino acid sequence ability represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, 37 and 38.
  • the protein used in the present invention can be produced as a fusion protein with another protein and purified using affinity chromatography using a substance having affinity for the fused protein.
  • the proteins to be fused include ⁇ -galatatosidase, protein ⁇ , immunoglobulin G-binding region of protein ⁇ , chloramphee-chol'acetylyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose binding Protein, glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent' protein, FLAG peptide, and any antibody epitope [Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1955)].
  • Substances having affinity for the above-mentioned proteins to be fused include ⁇ -galatatosidase, protein ⁇ , protein G immunoglobulin G-binding domain, chloramphee-chol'acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose binding protein, glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent' protein, FLAG peptide or An antibody that recognizes any antibody epitope, such as immunoglobulin G, can be mentioned.
  • the protein of the present invention can be obtained by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethylcarboxyl method) and tBoc method (tbutyloxycarbon method). Can be manufactured.
  • chemical synthesis should be performed using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, NON, ELMA, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel Vega, PerS India, Shimadzu Corporation. You can also.
  • Enzymatic production methods of dipeptide derivatives include i) the above protein 1, one or more amino acids or amino acid derivatives, and ATP in an aqueous medium, and the dipeptide or dipeptide derivative (PI) in the medium A dipeptide or dipeptide derivative (PI), wherein the dipeptide or dipeptide derivative (PI) is collected from the medium, and ii) one or more proteins of the above 1
  • the amino acid or amino acid derivative and ATP are present in an aqueous medium, and a dipeptide or dipeptide derivative (PI) is produced and accumulated in the medium, or the medium force
  • the dipeptide or dipeptide derivative (PI ) Is collected, the dipeptide or dipeptide derivative (PI) is modified to produce the dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ), and the dipeptide Others can be mentioned a process for producing dipeptide or dipeptide derivative conductor ( ⁇ ) to and collecting the dipeptide derivative ( ⁇ ).
  • a dipeptide or dipeptide derivative (PI) can be produced by modifying the dipeptide or dipeptide derivative (PI) using a known method of organic synthesis or the like.
  • the amino acid or amino acid derivative used as a substrate may be any amino acid or amino acid derivative as long as it is an amino acid or amino acid derivative that serves as a substrate for the protein of 1 above.
  • amino acid or amino acid derivative may be represented by the formula (I)
  • R 1, R 3d and R 5 are as defined above
  • amino acid derivatives or amino acid derivatives [wherein the amino acid or amino acid derivative is only formula (III), R le and R ld At least one is a hydrogen atom, and when the amino acid or amino acid derivative is only the formula (IV), R 5 is hydroxy], more preferably the formula (V) [0135] [Chemical 17]
  • the dipeptide or dipeptide derivative (PI) produced by the above production method is represented by the formula (Vila)
  • a dipeptide derivative represented by the formula (wherein R 7e and R 9e are as defined above) can be exemplified.
  • the dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ) produced by the above production method is represented by the formula (Vllb
  • a dipeptide derivative represented by the formula (wherein R 7E and R 9E are as defined above) can be exemplified.
  • the lower alkyl part of lower alkyl, lower alkoxy, lower alkanoyl, lower alkoxycarbole, mono (lower alkyl) amino and di (lower alkyl) amino is, for example, a straight chain having 1 to 10 carbon atoms, Examples thereof include branched, cyclic, or a combination of these alkyls.
  • linear or branched alkyl examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n -Butyl, isobutyl, se c-butinole, tert-butinole, n-pentinole, neopentinole, n-hexynole, n-heptinole, n-octyl, n-nonyl, n-decyl, etc.
  • alkyl having a combination force with a cyclic group include cyclopropylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclooctylethyl and the like.
  • the two lower alkyl moieties in di (lower alkyl) amino may be the same or different.
  • Examples of the lower alcohol include straight-chain or branched-chain alkanes having 2 to 10 carbon atoms, and more specifically, burs, aryls, 1-probes, 1-butenyl, 3-butenole, 2-pentenole, 4-pentenole, 2-hexenole, 5-hexenole, 2-decenole, 9-decenyl, etc. It is done.
  • lower alkynyl examples include straight-chain or branched alkyl having 2 to 10 carbon atoms, and more specifically, ethul, 2-probule, 3-butul, 4-pentyl, 5-hexyl, 9-decyl, etc.
  • the aryl moiety of aryl, aralkyl and aroyl includes, for example, monocyclic or condensed aryl having two or more condensed rings, more specifically, aryl having 6 to 14 ring carbon atoms.
  • aryl having 6 to 14 ring carbon atoms.
  • ferrule, naphthyl, indul, anthal and the like can be mentioned.
  • Examples of the alicyclic heterocyclic group include monocyclic or condensed alicyclic heterocyclic groups in which two or more rings are condensed, and the types of heteroatoms contained in the alicyclic heterocyclic group and The number is not particularly limited, but for example, from the group consisting of a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom.
  • it may contain one or more selected heteroatoms, such as pyrrolidinyl, 2,5-dioxopyrrolidinyl, thiazolidinyl, oxazolidinyl, piperidyl, 1,2-dihydropyridyl, Piperazinyl, homopiperazinyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, birazolinyl, oxazolinyl, dioxolanyl, tetrahydrobiranyl, tetrahydrothiopyrael, tetrahydrofuryl, tetrahydroquinolyl, tetrahydroisoquinolyl, tetrahydroquinoxalinyl, octahydroquinolyl, dihydroindolyl, dihydroindolyl , 3-Dioxoisoindolinyl and the like.
  • heteroatoms such as pyrrolidinyl, 2,5-di
  • heterocyclic group part of the heterocyclic alkyl examples include an aromatic heterocyclic group, an alicyclic heterocyclic group, and the like, and examples of the aromatic heterocyclic group include monocyclic or two or more rings.
  • aromatic heterocyclic group examples include monocyclic or two or more rings.
  • nitrogen atoms, sulfur atoms and oxygen atomic forces are also included. More specifically, it may contain one or more heteroatoms whose group power is also selected.
  • an aromatic heterocyclic group having 5 to 14 ring atoms such as furyl, chenyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, Triazolyl, tetrazolyl, oxazolyl, oxadiazolyl, thiazolyl, pyridyl, pyrajyl, pyrimidyl, pyridazyl, triazyl, indolyl, indazolyl, benzimidazolyl, benzoo Xazolyl, benzothiazolyl, quinolyl, isoquinolyl, phthalajuryl, naphthyridinyl, quinoxalinyl, quinazolinyl, cinnolinyl, prill, tamaryl and the like.
  • the alicyclic heterocyclic group has the same meaning as described above.
  • the alkylene part of aralkyl and heterocyclic alkyl has the same meaning as that obtained by removing one straight or branched alkyl group hydrogen atom from the lower alkyl.
  • Heterocyclic group formed together with adjacent nitrogen atom and carbon atom adjacent to the nitrogen atom, and heterocyclic group formed together with adjacent carbon atom and nitrogen atom adjacent to the carbon atom As, for example, a 5- or 6-membered monocyclic alicyclic heterocyclic group containing at least one nitrogen atom (the monocyclic alicyclic heterocyclic group is another nitrogen atom, oxygen atom or sulfur).
  • pyrrolidyl may contain an atom), a bicyclic or tricyclic condensed 3- to 8-membered ring, and a condensed heterocyclic group containing at least one nitrogen atom (the condensed heterocyclic group is other May contain a nitrogen atom, oxygen atom or sulfur atom) More specifically, pyrrolidyl, piperidyl, piperazyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, homopiberidinyl, homopiperazinyl, tetrahydropyridyl, tetrahydroquinolyl, tetrahydroisoquinolyl and the like can be mentioned.
  • the substituent in the substituted heterocyclic group formed together with the carbon atom and the nitrogen atom adjacent to the carbon atom is the same or different and can be substituted from 1 to the number of substituents, preferably from 1 to 3, for example, halogen, amino-containing nitro, hydroxy, mercapto, guazino, ure
  • the lower alkyl portion of lower alkyl, lower alkoxy, lower alkanol and lower alkoxycarbonyl, the aryl portion of aralkyl, aralkyl and aroyl, and the alkylene portion of aralkyl are the same as defined above, respectively, and mono or di (lower alkyl) aminocarbo
  • the lower alkyl part in -alkyl and lower alkylthio has the same meaning as the lower alkyl
  • the heterocyclic group part in the heterocyclic carbonyl has the same meaning as the heterocyclic group part in the heterocyclic alkyl
  • halogen represents fluorine, chlorine, Represents bromine and iodine atoms.
  • the two lower alkyl moieties in the di (lower alkyl) aminocarbonyl may be the same or different.
  • the amino acid or amino acid derivative is preferably an amino acid or amino acid derivative selected from the group consisting of L-amino acid, glycine) and j8-alanine ( ⁇ Ala), and their derivatives.
  • L-amino acids include, for example, L-alanine (L-Ala), L-glutamine (L-Gin), L-glutamic acid (L-Glu), L-palin (L-Val), L ), L-Isoleucine (L-lie), L-Proline (L-Pro), L-Fe-Lalanine (L-Phe), L-tryptophan (L-Trp), L-methionine (L-Met), L-serine (L-Ser), L-threon (L-Thr), L-cysteine (L- Cys), L-asparagine (L-Asn), L-tyrosin (L-Tyr), L-lysine (L-Lys), L-arginine (L-Arg), L-
  • one kind of amino acid selected from L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr and j8-Ala or a derivative thereof is used.
  • L-Ala, L-Gln, L-Glu, Gly, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Tr p ⁇ L— Met ⁇ L— Ser, L— Thr , L— Cys, L— Asn, L-Tyr, L-Lys, L— Arg, L— His, L— Asp, L— — AB, ⁇ —Ala ⁇ L— Azaserine ⁇ L— theanine ⁇ L— 4— HYP ⁇ L—3—HYP, L—Orn, L—Cit and L-6-diazo-5-oxo-norleucine selected from one amino acid or a derivative thereof, L-Gln or a derivative thereof is used.
  • the protein used in the present invention is added in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg, per mg of amino acid or amino acid derivative used as a substrate.
  • the amino acid or amino acid derivative used as a substrate is added to an aqueous medium at the beginning or during the reaction so as to have a concentration of 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L.
  • ATP used as an energy source is used at a concentration of 0.5 mmol to 10 mol / L.
  • the aqueous medium used in the above production method may be an aqueous medium of any component and composition as long as the formation reaction of the dipeptide derivative is not inhibited.
  • water, phosphate, carbonate, acetate, borate And buffer solutions such as citrate and tris. It may also contain alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amides such as acetate amide! /.
  • the dipeptide formation reaction is carried out in an aqueous medium at pH 5 to ll, preferably pH 6 to 10, 20 to 50 ° C, preferably 25 to 45 ° C, for 2 to 150 hours, preferably 6 to 120 hours. .
  • a method for producing a dipeptide using a cell culture or a treated product of the culture as an enzyme source i) using the cell culture obtained in the above 4 or the treated product of the culture as an enzyme source, the enzyme Source, one or more amino acids or amino acid derivatives are present in an aqueous medium to form and accumulate a dipeptide or dipeptide derivative (PI) in the aqueous medium, and the dipeptide or dipeptide derivative (PI) is produced from the medium.
  • PI dipeptide or dipeptide derivative
  • the dipeptide or dipeptide derivative (PI) is modified to produce a dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ), and the dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ) is collected. And a method for producing a dipeptide or a dipeptide derivative ( ⁇ ).
  • the dipeptide or dipeptide derivative (PI) can be modified using a known organic synthesis method or the like to produce a dipeptide or dipeptide derivative ( ⁇ ).
  • the types of amino acids and amino acid derivatives used as substrates, the concentration and timing of addition, and the dipeptides produced are the same as those in the enzymatic production method of (1) above.
  • the treated product of the culture includes a concentrate of the culture, a dried product of the culture, a cell obtained by centrifuging the culture, a dried product of the cell, a freeze-dried product of the cell, Surfactant treated product of the bacterial cell, ultrasonic treated product of the bacterial cell, mechanically ground treated product of the bacterial cell, solvent treated product of the bacterial cell, enzyme treated product of the bacterial cell, A protein fraction, an immobilized product of the bacterial cell, or an enzyme preparation obtained by extraction from the bacterial cell, and a processed product having an activity to produce one or more amino acids or amino acid-derived physical strength dipeptides or dipeptide derivatives, etc. I can raise it.
  • the aqueous medium used in the production method using the culture of microorganisms or the treated product of the culture as an enzyme source is in addition to the aqueous medium used in the enzymatic production method of (1) above.
  • the cell culture medium used as the enzyme source can also be used as an aqueous medium.
  • ATP ATP or a compound that can be metabolized by cells to produce ATP
  • sugars such as glucose
  • alcohols such as ethanol
  • acetic acid etc.
  • Organic acids and the like can be added to the aqueous medium.
  • a surfactant or an organic solvent may be added to the aqueous medium.
  • Surfactants include nonionic surfactants such as polyoxyethylene 'octadecylamine (for example, Naimine S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethylammonium bromide and alkyldimethyl.benzylammonide.
  • -Cationic surfactants such as um chloride (eg Cation F2-40 E, manufactured by NOF Corporation), Lauroyl's sarcosinate, etc.
  • Organic solvents such as x-on surfactants, tertiary amines such as alkyldimethylamine (for example, tertiary amine FB, manufactured by NOF Corporation), xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, ethyl acetate
  • x-on surfactants such as alkyldimethylamine (for example, tertiary amine FB, manufactured by NOF Corporation)
  • xylene toluene
  • aliphatic alcohol acetone
  • ethyl acetate ethyl acetate
  • the cell force used in the production method of the present invention Amino acid or amino acid derivative strength As long as it has an activity to produce a dipeptide or dipeptide derivative, one or several types may be used. Can also be used in combination.
  • the type and concentration of the surfactant and the organic solvent can be arbitrarily selected within the range in which the cells used in the present invention have the above activity.
  • the amount of the enzyme source varies depending on the specific activity of the enzyme source, etc., for example, per mg of amino acid or amino acid derivative used as a substrate.
  • the wet cell weight is 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg.
  • the formation reaction of the dipeptide or dipeptide derivative is usually 1 minute in an aqueous medium at pH 5 to ll, preferably pH 6 to 10, 20 to 65 ° C, preferably 25 to 55 ° C, more preferably 30 to 45 ° C. ⁇ 150 hours, preferably 3 minutes to 120 hours, more preferably 30 minutes to 100 hours.
  • the collection of the dipeptide or dipeptide derivative produced and accumulated in the aqueous medium is usually performed by using a normal method using activated carbon, ion-exchange resin or the like. Extraction with an organic solvent, crystallization, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and the like can be performed.
  • the obtained dipeptide or dipeptide derivative is converted into a known organic synthesis reaction [for example, a complete 'organic' transformation ⁇ me ⁇ yonyons ( Comprehensive urganic Transformations), R. and Flock (see Larock J, (1989), etc.) or a method according to them can be used to obtain various dipeptide derivatives.
  • a known organic synthesis reaction for example, a complete 'organic' transformation ⁇ me ⁇ yonyons ( Comprehensive urganic Transformations), R. and Flock (see Larock J, (1989), etc.
  • the isolation and purification of the product in the above production method is a method used in ordinary organic synthesis, For example, filtration, extraction, washing, drying, concentration, crystallization, various chromatographies and the like can be appropriately combined.
  • D-Ala-D-Ala ligase motif [Biochemistry, 30, 1673 (1991)] is encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33, 34 or 35, Among genes excluding genes that have already been identified for their functions, the gene with unknown function ⁇ ⁇ ⁇ is selected as showing the highest homology (29.1%) with the D-Ala-D-Ala ligase motif did.
  • the base sequence of mffi is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Bacillus subtilis 168 strain (ATCC 23857) was added to LB medium [lOg / 1 Batatotrypton (Difco), 5g / l yeast extract (Difco), 5g / l salted sodium] was inoculated and cultured at 30 ° C for 1 hour. After culturing, the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified by the method using saturated funnel described in Current 'Protocols' in 'Molequila' Biomouth.
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 19 to 22 (hereinafter referred to as primer A, primer B, primer C and primer, respectively) D).
  • the Limer A is obtained by adding a base sequence containing a 20i2l recognition sequence to the 5 'end of the region containing the start codon of the chromosomal DNA of Bacillus subtilis: mffi.
  • Primer B has a base sequence containing a ⁇ recognition sequence added to the 5 'end of a base sequence complementary to the sequence containing the stop codon of vwffi.
  • Primer C is a base containing an E ⁇ RI recognition sequence at the 5 'end of the base sequence of the im promoter region of the expression vector pTrS30 [prepared from Escherichia coli JM109 / pTrS30 (FERM BP-5407)] containing a 1m promoter. An array is added.
  • Primer D is obtained by adding a base sequence containing 1 recognition sequence to the 5 ′ end of a sequence complementary to the sequence of the lm promoter region of expression vector pTrS30 containing lm promoter.
  • Primer A and Primer B are used to amplify the mffi gene fragment, and Bacillus subtilis chromosome DN A is used as the ⁇ type.
  • Primer C and Primer D are used to amplify the 1 m promoter region fragment. PCR was performed using pTrS30 as a saddle type.
  • PCR is performed as 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA or 10 ng of pTrS30, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Efii DNA polymerase (Stratagene), 4 ⁇ L of Efii DNA polymerase X
  • Expression vector containing 1m promoter pTrS30 [prepared from Escherichia coli JM109 / pTrS30 (FER M BP-5407)] 0.2 ⁇ g was cleaved with restriction enzymes E ⁇ RI and ⁇ ⁇ , followed by DNA fragmentation by agarose gel electrophoresis And a 4.5 kb DNA fragment was recovered by the same method as described above.
  • the 1.4 kb fragment containing yE obtained above, the 0.3 kb fragment containing the lm promoter region, and the 4.5 kb fragment were reacted at 16 ° C for 16 hours using a ligation kit (Tacarano). Connected.
  • Escherichia coli NM522 strain (manufactured by Stratagene) was transformed with the reaction solution by a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)] After that, it was applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin and cultured at 30 ° C.
  • the reaction product was derivatized by dinitrophenolation method and then analyzed by HPLC method.
  • HPLC method a separation column using a Lichrosorb-RP-18 column manufactured by Kanto Engineering Co., Ltd., 1% ( ⁇ / ⁇ ) phosphoric acid, 25% (v / v) acetonitrile is used as an eluent, 0.7% ml Performed at a flow rate of / min.
  • L-ara-L-glutamine L-Ala-L-Gln
  • Primer E is a base sequence including a region in which the start codon (atg) of yE is replaced with ml recognition sequence (cc ⁇ gg).
  • Primer F is a base sequence containing a region in which the stop codon of ⁇ is replaced with a ⁇ lHI recognition sequence (gg tcc).
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Bacillus subtilis 168 strain (ATCC 23857) as a saddle type, and using the above primer E and primer F as a primer set.
  • PCR is a reaction solution containing 0.1 ⁇ g chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Efii DNA polymerase, 4 ⁇ L of DNA polymerase X 10 buffer, and 200 ⁇ mol / L of each dNTP. 40 ⁇ L was prepared, and the process of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes was repeated 30 times.
  • the amplified DNA is cleaved with restriction enzymes and HI, and the DNA fragments are separated by agarose gel electrophoresis. A kb DNA fragment was recovered.
  • C-terminal His-tagged recombinant expression vector pQE60 (Qiagen) 0.2g was cleaved with restriction enzymes 21 and ⁇ , and DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis. DNA fragments were recovered.
  • Escherichia coli NM522 strain was transformed by a method using calcium ions, and then applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin and cultured at 30 ° C. did.
  • pQE60ywffi a C-terminal His-tagged expression vector, was obtained by extracting a plasmid from a grown colony of transformants according to a known method and analyzing its structure using a restriction enzyme. (Fig. 2).
  • Inoculate Escherichia coli NM522 (Escherichia coli NM522 / pQE60y wffi strain) carrying pQE60ywffi into a large tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and incubate at 28 ° C for 17 hours did.
  • the culture is inoculated into a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured at 30 ° C. for 3 hours, and then isopropyl mono- ⁇ is added so that the final concentration is 1 mmol / L.
  • IPTG Triogalatatopyranoside
  • the reaction product was analyzed in the same manner as in Experimental Example 3 above, and 7.0 g / L L-L-L-L-L-Lalanin (L-Ala- L -Phe) only, 7.0g / L L-arallal L-methionine (L-Ala—L-Met) and 0.03g / L L-Ala-L-Ala , 5.0 g / L L-allar L Leucine (L- Ala-L- Leu) and 0.2 g / L L- Ala— L- Ala, or 1.6 g / L L —It was confirmed that Palin (L-Ala—L-Val) and 0.3 g / L L-Ala—L-Ala were produced and accumulated.
  • mffi gene products can be obtained in the presence of ATP from L-Ala and L-Gln, L-Phe, L-Met, L-Leu or L-Val, L-Ala-L-Gin and L—Ala—L—Ala, L—Ala—L—Phe, L—Ala—L—Met and L—Ala—L—Ala, L—Ala—L—Leu and L—Ala—L—Ala, or L-Ala—has activity to produce L-Val and L-Ala—L-Ala, and has activity to produce Gly—L-Phe or Gly—L-Met from Gly and L-Phe or L-Met It was revealed.
  • Experimental Example 6 Production of dipeptides using His-tagged recombinant enzyme (2)
  • reaction consisting of 0.04 mg of purified His-tagged recombinant enzyme obtained in Experimental Example 4, 100 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 60 mmol / L magnesium chloride, 60 mmol / L ATP Prepare a solution and add it to the reaction solution at 30 mmol / L each of various L-amino acids, Gly or j8 -Ala, which is the combination power of amino acids in the first row and the leftmost column of Table 1, The reaction was performed at 37 ° C for 16 hours. After completion of the reaction, the reaction product was analyzed by HPLC. As a result, it was confirmed that the dipeptides shown in Table 1 were produced.
  • the dipeptides produced by reacting with the two types (or one) of L-amino acids, Gly or ⁇ -Ala listed in the first row and the leftmost column of Table 1 are shown in the frame.
  • ⁇ indicates that the sequence is undefined but a dipeptide has been generated, and
  • X indicates that dipeptide formation has not been confirmed. And blanks indicate not implemented.
  • the Escherichia coli NM522 / pQE60ywffi strain obtained in Experimental Example 4 was inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured at 28 ° C. for 17 hours. Inoculate the culture solution into a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, incubate at 30 ° C for 3 hours, and then add IPTG to a final concentration of lmmol / L. Then, the mixture was further incubated at 30 ° C for 4 hours. The culture solution was centrifuged to obtain wet cells.
  • Primer G is a sequence of a region including upstream from the start codon of yE of chromosomal DNA of Bacillus subtilis 168 strain.
  • Primer ⁇ is a sequence complementary to the sequence including the downstream of the entire vwffi codon.
  • PCR consists of 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of DNA polymerase, 4 ⁇ L of DNA polymerase X 10 buffer, and 200 ⁇ mol / L of each dNTP. Prepare 40 ⁇ L of the solution, and repeat the process for 30 minutes at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes.
  • the solution was applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin at 30 ° C. Cultured overnight.
  • pYWFEl a plasmid containing the gene corresponding to the mffi gene (From ATCC15245 strain, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 36), pYWFE2 (from ATCC6633 strain, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10), pYWFE3 (from IAM1213 strain, from SEQ ID NO: 11) DNA having the nucleotide sequence represented), pYWFE4 (derived from IAM1107 strain, having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12) PYWFE5 (from IAM1214 strain, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 13), pYWFE6 (from ATCC9466 strain, DN A having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9), pYWFE7 (from IAM1033 strain) DNA having the
  • PCR was carried out using the chromosomal DNA of the NRRL B-12025 strain prepared above as a cage and using the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 27 and 28 as a primer set.
  • PCR consists of 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Z-taq polymerase (Tacarano), 5 ⁇ L of Z-taq polymerase X 10 buffer (Tacarano) ), Prepare 50 ⁇ L of a reaction solution containing 200 ⁇ mol / L of each dNTP, and repeat the process 30 times at 98 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. It was.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed by a method using calcium ions, and then applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin and cultured at 30 ° C overnight. .
  • the plasmid obtained from the transformant obtained above was extracted and the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of about 0.8 kb was determined.
  • the nucleotide numbers 358 to 1 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 were determined.
  • the 160th nucleotide sequence was confirmed.
  • the plasmid was cleaved with EcoRI, and DNA fragments were obtained by agarose gel electrophoresis. Separated.
  • the DNA fragment was purified using Gene Clean II kit. About 0.5 g of the purified DNA fragment was subjected to DIG labeling using DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I (Roche Diagno Status). DIG labeling was performed according to the instructions attached to the kit.
  • Chromosomal DNA of NRRL B-12025 strain is completely digested with SlHI, ECORL Hindlll, KpnL Pstl, Sacl, Sail and I, and the DNA fragments are separated by agarose electrophoresis. (Roche's Diagno Status).
  • the probe DNA and the nylon membrane were contacted at 65 ° C. for 16 hours, and then the nylon membrane was used for 5 minutes at room temperature using a solution having 0.1% SDS and 2 ⁇ SSC force. Wash twice and then wash twice using a solution consisting of 0.1% SDS and 0.5 X SSC at 65 ° C for 15 minutes.Other operations, conditions, and detection of hybridized DNA are as described above. DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I was performed according to the instructions attached to the kit.
  • chromosomal DNA of NRRL B-12025 strain was completely digested with Mindlll and I, respectively, and the DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis.
  • a 3-4 kbp fragment was purified from each restriction enzyme-digested DNA using the GeneClean II kit and self-circulated using the ligation kit.
  • PCR consists of 10 ng of circular DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of pyrobest polymerase (Takara Bio), 5 ⁇ L of pyrobest polymerase X 10 buffer (Takara Bio), 200 ⁇ Prepare 50 ⁇ L of each reaction solution containing mol / L of each dNTP, and leave it at 98 ° C for 5 seconds. The process was repeated 30 times at 5 ° C for 30 seconds and at 72 ° C for 3 minutes and 30 seconds.
  • the solution was applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin at 30 ° C. Cultured overnight.
  • pYWFE10 is a plasmid containing the gene corresponding to the ⁇ gene. (DNA derived from NRRL B-12025 strain, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16) was obtained and confirmed.
  • the base sequence of each gene corresponding to the y ⁇ gene contained in pYWFEl to pYWFE10 obtained above was determined using a base sequence analyzer 373 ⁇ ⁇ DNA sequencer.
  • amino acid sequence of the protein encoded by the gene contained in pYWFEl, pYWFE6 and pYWFE7 was the same as the amino acid sequence of the protein encoded by the ⁇ ⁇ gene.
  • PYW FE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5, pYWFE8 The amino acid sequence of the protein encoded by the genes contained in pYWFE9 and pYWFElO was different from the amino acid sequence of the protein encoded by the mffi gene.
  • pYWFE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5, pYWFE8, pYWFE9, pYWFElO and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene corresponding to the gene contained in pYWFE1 and pYWFE7 are shown in SEQ ID NOs: 2 to 8 and 1. They are shown in SEQ ID NOs: 10-16 and 36, respectively.
  • PCR consists of 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Efii DNA polymerase, 4 ⁇ L of DNA polymerase X 10 buffer, and 200 ⁇ mol / L of each dNTP. 40 ⁇ L of the solution was prepared, and the process of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes was repeated 30 times.
  • E. coli NM522 was transformed by a method using calcium ions, and then applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin and cultured at 30 ° C.
  • Escherichia coli NM522 / pQE60ywffil to NM522 / pQE60ywffil0 strains obtained above were inoculated into a test tube containing 8 ml of LB medium each containing 50 g / ml ampicillin, and 17 hours at 28 ° C. Cultured. Inoculate the culture into a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and incubate at 30 ° C for 3 hours, and then add IPTG to a final concentration of lmmol / L. Then, the mixture was further cultured at 30 ° C for 4 hours. The His-tagged recombinant enzyme was purified from the wet cells obtained by centrifuging the culture solution using HisTrap according to the instruction manual.
  • Recombinant enzyme obtained in Experimental Example 9 0.04 mg, 100 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 60 mmol / L magnesium chloride, 60 mmol / L ATP, 30 mmol / L L-Ala and 30 mmol / A 0.1 ml reaction solution consisting of L L-Gin was prepared and reacted at 37 ° C for 16 hours.
  • KM73 medium (2 g / l yeast extract (Difco), lOg / 1) containing 1% glycine supplemented with Streptomyces' Noursei IFO 15452 and Streptomyces albolus IFO 14147, respectively.
  • Soluble starch (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)]
  • KP medium [15g / l glucose, lOg / 1 glycerol, lOg / 1 polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), lOg / 1 meat extract (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) 4 g / l calcium carbonate] and inoculated overnight at 28 ° C.
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • BRCj Biological Resources and enter
  • the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified according to the method described in Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manuahjohn Inns Foundation.
  • Primer J DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 41 and 42 (hereinafter referred to as primer J and primer respectively) using a 8905 DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems based on the albC gene salt sequence.
  • Called K DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems based on the albC gene salt sequence.
  • Primer J is obtained by adding a base sequence containing a tel recognition sequence to the 5 'end of the region containing the start codon of the dhC gene of Streptomyces noursei chromosomal DNA.
  • Primer K is obtained by adding a base sequence containing a recognition sequence to the 5 ′ end of a base sequence complementary to the sequence containing the stop codon of the albC gene.
  • PCR was performed using the above primer J and primer K as a primer set, and Streptomyces noursei or Streptomyces albolus chromosomal DNA as a saddle type.
  • PCR is 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Tafl DNA polymerase (Takara Bio), 5 ⁇ L of E [I DNA polymerase X 10 Prepare 50 L of a reaction solution containing buffer solution (Takara Bio Inc.), 200 ⁇ mol / L dNTP and 5 ⁇ L dimethyl sulfoxide, and then prepare for 94 minutes at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, 72 1 minute at ° C This process was repeated 30 times.
  • the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 3.4 kb DNA fragment was recovered by the same method as described above.
  • Escherichia coli NM522 strain was transformed by a method using calcium ions, and then applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin.
  • the nucleotide sequence of the DNA portion derived from actinomycetes inserted into each plasmid was determined using the nucleotide sequence determination device 373A.DNA sequencer.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 was found in pAL_alb.
  • DNA encoding a protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39 is contained, and pAL-nou contains DNA having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, that is, SEQ ID NO: It was confirmed that DNA having a base sequence represented by 40 was contained.
  • Experimental Example 12 Production of dipeptides using bacterial cells as enzyme source
  • H PLC The analysis by H PLC was performed under the conditions of measuring ODS-HA column (manufactured by YMC) as a separation column, 30% (v / v) acetonitrile with an eluent, and measuring UV absorption at 215 nm at a flow rate of 0.6 ml / min. .
  • the same reaction mixture was analyzed by HPLC under the following conditions, and the linear dipeptide (hereinafter simply referred to as dipeptide), L-Leuyl-L-Phe, and L-Fuelalall L-leucine (L-Phe-L-Leu) was measured.
  • dipeptide linear dipeptide
  • L-Leuyl-L-Phe L-Leuyl-L-Phe
  • L-Fuelalall L-leucine L-Phe-L-Leu
  • Both dipeptides were derivatized by the F-moc method and analyzed using HPLC.
  • HPLC For analysis by HPLC, ODS-HG5 (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) is used for the separation column, and solution A as the eluent (adjusted to pH 4.8 with acetic acid 6ml 1 ⁇ 20% (v / v) acetonitrile and triethylamine)
  • Up to 20 minutes, when 20 minutes have passed, apply a linear gradient so that liquid A: liquid B 1: 1, and detect dipeptides at a flow rate of 0.6 ml / min, excitation wavelength of 254 nm, and fluorescence wavelength of 630
  • Escherichia coli NM522 / pAL-nou strain was cultured. After completion of the culture, wet cells were obtained by centrifugation, washed with 60 mmol / L potassium phosphate buffer (pH 7.2), and suspended in 20 mmol / L potassium phosphate buffer containing 10 mmol / L imidazole. The suspension was sonicated at 4 ° C to obtain a cell disruption solution. This cell disruption solution (10 ml, containing 0.863 mg protein) is passed through an Amersham His tag purification column, and 15 ml of 20 mmol / L potassium phosphate buffer containing 10 mmol / L imidazole is passed.
  • the His-tagged dh £ protein was purified in the column.
  • a reaction solution having the same composition as Example 2 (reaction solution composition: 60 mmol / L potassium phosphate buffer (pH 7.2), 10 mmol / L magnesium chloride, (A reaction solution consisting of 10 mmol / L ATP, lg / L L-Leu, and lg / L L-Phe) 2 ml was passed through and incubated at 30 ° C with the substrate retained in the column. . After 24 hours, the reaction solution in the force ram was eluted with 3 ml of the reaction solution having the same composition, and the cyclodipeptide and dipeptide in the reaction solution were quantified in the same manner as in Experimental Example 12.
  • SEQ ID NOs: 82 to 85 DNAs having the sequences described in SEQ ID NOs: 82 to 85 (hereinafter, primer L, primer M, primer N, primer O, respectively) were synthesized.
  • the sequence of SEQ ID NO: 82 is a region containing the Shine-Dalgarno sequence, which is the ribosome binding sequence of the yE gene of the plasmid pQ E60ywffi, and a sequence containing a 0 ⁇ 1 recognition sequence on the 5 'side. Is.
  • the sequence of SEQ ID NO: 83 is obtained by adding a sequence containing a SiHI recognition sequence on the 5 ′ side of a sequence complementary to the sequence containing the stop codon of the mffi gene.
  • the sequence of SEQ ID NO: 84 is obtained by adding a sequence containing an EmRI recognition sequence to the 5 ′ side of the sequence of the lm promoter region of the expression vector pTrS30 containing the im promoter.
  • the sequence of SEQ ID NO: 85 is obtained by adding a sequence containing a 20 ⁇ 1 recognition sequence to the 5 ′ side of a sequence complementary to the sequence of the lm promoter region of an expression vector pTrS30 containing a 1 m promoter.
  • PCR using the plasmid pQE60ywffi as a cocoon-type, using the above primer L and primer ⁇ ⁇ for amplification of the yE gene fragment, and primer ⁇ and primer O as the primer set for amplification of the lm promoter region fragment, respectively. went. PCR was performed using 40 ng of reaction solution containing 10 ng of pQE60ywffi, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Efii DNA polymerase, 4 L of X10 buffer for EfiiDNA polymerase, and 200 ⁇ mol / L of each dNTP. This was carried out by repeating the process consisting of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes 30 times.
  • the expression vector pTrS30 containing 0.2 ⁇ g of the lm promoter was cleaved with restriction enzymes E ⁇ RI and E I HI, and then the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis. Similarly, the 4.5 kb DNA fragment was recovered.
  • a 1.4 kb fragment containing the mffi gene, a 0.3 kb fragment containing the im promoter region and a 4.5 kb fragment were ligated for 16 hours at 16 ° C using a ligation kit o
  • Escherichia coli NM522 was transformed using the reaction solution by a method using calcium ions, and then applied to an LB agar medium containing ampicillin g / ml, followed by incubation at 30 ° C.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method to obtain pPE56, an expression vector containing the gene downstream of the im promoter.
  • the structure of the vector was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 4).
  • a strain lacking a specific gene on the Escherichia coli chromosome DNA was prepared according to a method using a lambda phage homologous recombination system [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
  • the plasmids pKD46, pKD3 and pCP20 described below were obtained by obtaining a Escherichia coli strain carrying the plasmid from the Escherichia coliidenetic stock center (Yale University, USA) and extracting the strain by a known method. Used.
  • a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 56 A gene having a sequence and a gene having a base sequence represented by SEQ ID NO: 57, an E having a base sequence represented by SEQ ID NO: 58, an EE ⁇ gene having a base sequence represented by SEQ ID NO: 59, a sequence number
  • the 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems was used.
  • SEQ ID NOs: 62 and 63 as primer sets for amplifying DNA fragments for EgED gene deletion
  • SEQ ID NOs: 64 and 65 as primer sets for amplifying DNA fragments for ESEN gene deletion
  • Primer sets for amplifying DNA fragments for gene deletion As SEQ ID NOs: 6 and 67
  • SEQ ID NOs: 68 and 69 as primer sets for amplifying DNA fragments for ESEE gene deletion
  • SEQ ID NOs: 70 and 71 as primer sets for amplifying DNA fragments for dm operon deletion
  • PCR was performed using the synthetic DNA as a primer set and pKD3DNA as a saddle.
  • PCR includes 10 ng of plasmid DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of £ fli DNA polymerase, 4 ⁇ L of Efii DNA polymerase X 10 buffer, 200 ⁇ mol / L of each containing deoxyNTP
  • the reaction solution the process consisting of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes was repeated 30 times.
  • the obtained upper layer was mixed with 2 volumes of cold ethanol and allowed to stand at ⁇ 80 ° C. for 30 minutes.
  • the solution is centrifuged and contains DeoD gene, DepN gene, ⁇ »gene, ⁇ ⁇ ⁇ gene, and chloramphee-cole resistance gene for EE operon deficiency A DNA fragment was obtained.
  • Escherichia coli JM101 strain After transforming Escherichia coli JM101 strain with pKD46, it was applied to an LB agar medium containing 100 mg / L ampicillin and cultured at 30 ° C, and Escherichia coli JM101 strain (hereinafter referred to as Escherichia strain) that retains pKD46. 'Cori JM101 / pKD46) was selected.
  • Plasmid pKD46 has a ⁇ Red recombinase gene, and the expression of the gene can be induced by L-arabinose. Therefore, homologous recombination occurs at high frequency when E. coli containing pKD46 grown in the presence of L-arabinose is transformed with linear DNA. Since pKD46 has a temperature-sensitive origin of replication, the plasmid can be easily removed by growing at 42 ° C.
  • Escherichia coli JM101 / pKD46 obtained by culturing in the presence of 10 mmol / L L-arabinose and 50 ⁇ g / ml ampicillin was obtained by the above-described method using the electric pulse method.
  • the selected chloramphene-chol metabolite was inoculated on an LB agar medium containing 25 mg / L chloramphee-chol, cultured at 42 ° C for 14 hours, and then a single colony was isolated. Each colony obtained was replicated on LB agar medium containing 25 mg / L chloramphee-chol and LB agar medium containing lOOmg / 1 ampicillin, cultured at 37 ° C, chloramphecol-resistant and ampicillin. by selecting the colonies showing sensitivity were obtained P KD46 deficient strain.
  • the pKD46-dropped strain obtained above was transformed with pCP20 and selected on an LB agar medium containing lOOmg / 1 ampicillin to obtain a pKD46-dropped strain retaining pCP20. .
  • Plasmid PCP20 has a yeast-derived Flp recombinase gene, and the expression of the gene can be induced at 42 ° C.
  • the gene created above, DeDN gene, DeDB gene, DepA gene and d Since the nucleotide sequence recognized by Flp recombinase is present at both ends of the chloramphee-cholesterol resistance gene in the DNA fragment containing the chloramphee-collet resistance gene for the deficiency of the operon, It can be removed.
  • the pKD46-cleaved strain with PCP20 obtained above was inoculated into an LB agar medium without any added drug, cultured at 42 ° C for 14 hours, and then a single colony was isolated. Each colony obtained was replicated in LB agar medium containing no drug, LB agar medium containing 25 mg / L chloramphee-col and LB agar medium containing 100 mg / L ampicillin, and cultured at 30 ° C. -Colonies showing call sensitivity and ampicillin sensitivity were selected.
  • Chromosomal DNA was prepared from each of the strains selected above according to a conventional method (Biotechnical Experiments, edited by Japan Society for Biotechnology, pages 97-98, Bafukan, 1992). Based on the internal base sequence of the DeDD gene, which is the target gene for deletion! /, And using the DNA having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 72 and 73 as a primer set, the chromosomal DNA was made into a saddle type PCR was performed.
  • PCR includes 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Efii DNA polymerase, 4 ⁇ L of Efii DNA polymerase X 10 buffer, 200 ⁇ mol / L of each deoxyNTP L
  • the above reaction solution was used by repeating the process consisting of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes 30 times.
  • the Escherichia coli JPD1 strain obtained in (2) above was transformed with pKD46, applied to an LB agar medium containing lOOmg / 1 ampicillin, and cultured at 30 ° C to retain pKD46.
  • ⁇ ! JJPDI (hereinafter referred to as Escherichia coli JPDl / pKD46) was selected.
  • Escherichia coli JPDl / pKD46 was subjected to chloramf for gene deletion by electric norus method.
  • the DNA fragment containing the echor resistance gene was introduced, and the DNA fragment containing the chloramphenicol resistance gene for ⁇ ⁇ ⁇ gene deletion on the chromosomal DNA of Escherichia coli JPDl / pKD46
  • DeDN message De.
  • a gene For the A gene, DepB gene, or dDD operon-deficient strain, use the DNA fragment containing each gene or operon-deficient chloramphee-chol-resistant gene prepared in (1) above and use the same method as in (2) above. It was produced by.
  • each gene-deficient strain was obtained by the above method is that the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NOs: 74 to 81 was designed and synthesized based on the internal base sequence of each defective gene as a primer set. And was confirmed by PCR as in (2) above.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 74 and 75 is for ESEN ⁇ C loss confirmation
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 76 and 77 is for ESE ⁇ loss confirmation
  • the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 78 and 79 is for confirming EgEfi ⁇ C loss
  • the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 80 and 81 is a primer set for confirming dm operon deficiency. .
  • the operon-deficient strain obtained by the above method is Escherichia coli JDPP1
  • the DepN gene-deficient strain is Escherichia coli JPN1
  • 'Coli JPA1 strain and gene-deficient strain were named Escherichia coli JPB7 strain.
  • JPNDDP36 strain De.
  • Escherichia coli JPNDAP5 strain, a DeDB gene, a DepD gene, a ⁇ E gene and a quadruple deficient in an operon The gene-deficient strain was named Escherichia coli JPND-7. Table 2 shows the names of defective genes in each gene-deficient strain.
  • the strains lacking the genes encoding various beptidases and dipeptide uptake proteins obtained in Experimental Example 16 were transformed with the plasmid pPE56 constructed in Experimental Example 15 to obtain a transformant showing ampicillin resistance.
  • the obtained transformant was inoculated into a test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured at 28 ° C for 17 hours.
  • the culture broth was added to 8 ml of an aqueous medium containing 100 g / ml ampicillin and amino acid (dipotassium hydrogen phosphate 16 g / L, potassium dihydrogen phosphate 14 g / L, ammonium sulfate 5 g / L, taenoic acid (anhydrous ) Lg / L, casamino acid (Difco) 0.5g / L, L-Pro lg / L, L-Ala 2.5g / L, L-Gin 2.5g / L, Glucose 10g / l, Vitamin B 10mg / L
  • L Magnesium sulfate heptahydrate 25mg / l, Iron sulfate heptahydrate 50mg / l, 10mol / l Sodium hydroxide solution adjusted to PH7.2.
  • L-Gln is sterilized by filtration through a 10-fold concentrated solution, and glucose, vitamin B, magnesium sulfate 7hydrate, and iron sulfate 7hydrate are separately cooked
  • the product in the supernatant was derivatized by the F-moc method and then analyzed by the HPLC method.
  • HPLC method ODS-HG5 (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) was used as the separation column, and A solution (acetic acid 6 ml / l, 20% (v / v) acetonitrile and triethylamine was used as the eluent.
  • microorganisms lacking two or less peptidases, and microorganisms lacking only one peptide-incorporating protein show low dipeptide production and accumulation, but one or more In microorganisms lacking peptidase and one peptide uptake protein, or in microorganisms in which the activity of three or more peptidases has been lost, it was found that the production and accumulation of dipeptides increased significantly.
  • the culture broth was added to 8 ml of an aqueous medium containing 100 g / ml ampicillin and amino acid (dipotassium hydrogen phosphate 16 g / l, potassium dihydrogen phosphate 14 g / l, ammonium sulfate 5 g / 1, citrate ( Anhydrous) lg / l, casamino acid (Difco) 0.5g / l, L-Pro lg / l, L-Ala 2.5g / 1, L-Val 2.5g / l, glucose 10g / l, vitamin 10mg / l , Magnesium sulfate heptahydrate 25mg / l, Iron sulphate heptahydrate 50mg / l, adjusted to ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 7.2 with 10mol / l sodium hydroxide solution Glucose, vitamin B, Magnesium sulfate heptahydrate , Iron se
  • 1% was added to a test tube containing 2) after cooking and allowed to react at 30 ° C for 24 hours.
  • the aqueous medium was centrifuged to obtain a supernatant.
  • Microorganisms deficient in 2 or less peptidases and microorganisms deficient in only one peptide-incorporating protein do not produce dipeptides, but have 3 or more peptidase genes.
  • Deficient microorganisms, or microorganisms deficient in one or more peptidase genes and one peptide uptake protein were found to be dipeptide-producing Experiment 19 Large loss of peptidase and dipeptide uptake protein activity Evaluation of productivity of glycyl-L-glutamine (hereinafter referred to as Gly-L-Gln) using intestinal strains
  • Gly-L-Gln glycyl-L-glutamine
  • operon-deficient strains encoding various beptidase genes and dipeptide uptake proteins were selected.
  • PPE56 was used for transformation. The obtained transformant was inoculated into a test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 g / ml of ampicillin and
  • the culture solution was added to 8 ml of an aqueous medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and amino acid (dipotassium hydrogen phosphate 16 g / l, potassium dihydrogen phosphate 14 g / l, ammonium sulfate 5 g / L, Taenoic acid (anhydrous) lg / L, casamino acid (Difco) 0.5g / L, L-Pro lg / L, Gly 2.5g / L, L-Gin 2.5g / L, glucose lOg / L, vitamin B lOmg / L, magnesium sulfate heptahydrate 2
  • amino acid dipotassium hydrogen phosphate 16 g / l, potassium dihydrogen phosphate 14 g / l, ammonium sulfate 5 g / L, Taenoic acid (anhydrous) lg / L, casamino acid (Difco) 0.5g
  • microorganisms lacking 2 or less peptidase genes and microorganisms lacking only one peptide uptake protein did not produce dipeptides, but more than 3 kinds of peptides.
  • Microorganisms deficient in peptidase and those deficient in two or more peptidase genes and one peptide uptake protein were found to produce dipeptides.
  • Table 6-1 is L-Ala and L-Ala derivatives
  • Table 6-2 is L-Ala and L-Phe derivatives
  • Table 6-3 is L-Ala and L-Glu derivatives
  • Table 6-4 is L-Ala
  • Table 6-5 shows the results of experiments using L-Ala and L-Lys derivatives as substrates, and the abbreviations of amino acids and amino acid derivatives used as substrates. The names are as follows.
  • Glu (OtBu) Gnoretamic acid- ⁇ -t butylesterol
  • the structure of the compound in the reaction solution was identified based on the chemical shift of the ⁇ -position proton.
  • the concentration of each compound was calculated based on the signal area of the proton at position a with the TSP area as the internal standard (Table 7).
  • L-Ala-L-Ala was calculated based on the signal area of the proton at the j8 position because the signals of the proton at the ⁇ position overlapped at low concentrations.
  • the values in parentheses indicate the chemical shift of the a-position proton of each compound (unit: ppm).
  • reaction solution 2 Reaction solution using CN-Ala and Phe as substrates
  • Reaction solution 4 Reaction solution using Ala and NH -Phe as substrate (Reaction solution 4)
  • reaction solution 5 Reaction solution using Ala and Kinurenine as substrates
  • Reaction solution 6 Ala (3.79), Phe— NH (4.02), Ala— Phe— NH (3.90, 4.60)
  • reaction solution 9 Reaction solution using Ala and Asp (OtBu) as substrates
  • Reaction solution 10 Reaction solution using Ala and Lys (Boc) as substrates
  • Reaction solution 12 Reaction solution using Ala and cyc (6) Ala as substrate
  • N- [2- (Acetylamino) propiool] phenolanine (10 mg, 0.036 mmol) obtained in Example 2 was suspended in ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (5 mL), and 1- ( Add 3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (14 mg, 0.073 mmol), 1-hydroxybenzotriazole (15 mg, 0.11 mmol) and piperidine (40 ⁇ L, 0.40 mmol) to 50 ° Stir at C for 24 hours. Add water to the reaction mixture and extract three times with black mouth form.
  • SEQ ID NO: 21 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 22 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 25 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 26 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 27 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 28 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 32 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 33 -Description of artificial sequence Amino acid sequence used for database search
  • SEQ ID NO: 52 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 54 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 58 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 60 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 62 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 63 Description of artificial sequence: synthetic DNA SEQ ID NO: 64- -Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID NO: 65--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID NO: 66--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID NO: 67- -Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID NO: 68--Artificial Sequence Description Synthetic DNA SEQ ID NO: 69--Artificial Sequence Description Synthetic DNA SEQ ID NO: 70--Artificial Sequence Description Synthetic DNA SEQ ID NO: 71--Artificial Sequence Description: Synthetic DNA SEQ ID NO: 72--Artificial Sequence Description: Synthetic DNA SEQ ID NO: 73--Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 74- -Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 75--Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 76--Description of artificial sequence: Synthetic DNA sequence No.

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Abstract

　本発明によれば、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法を提供することができる。

Description

明 細 書
ジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体力 ジペプチドまたはジぺプチ ド誘導体を生成する活性を有する蛋白質または該蛋白質をコードする DNAを保有 する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を用いたジペプチドまたはジペプチド 誘導体の製造法に関する。
背景技術
[0002] ペプチドの大量合成法につ!ヽては、化学合成法 (液相法、固相法）、酵素的合成 法および DNA組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、 50残基以 上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ 、ジペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護'脱保護などの操作が必 要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法と はいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好まし い方法ではない。
[0003] 酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の 逆反応を利用した方法 (非特許文献 1参照）、耐熱性アミノアシル t-RNA合成酵素を 利用する方法（特許文献 1〜4参照）、非リボゾームペプチドシンセターゼ (以下、 NR PSと称す)を利用する方法 (非特許文献 2、 3および特許文献 5、 6参照）が知られて いる。
しかし、タンパク質分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官 能基の保護 '脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解 反応の阻止が困難と!/ヽつた問題点がある。耐熱性アミノアシル t-RNA合成酵素を利 用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題 点がある。 NRPSを利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なために DNA組換え 法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である 4' ホスフォパン テテイン (4'-phosphopantetheine)の供給が必要であり、効率的な製造法とは!、えな い。
[0004] 一方、酵素分子量力 SNRPSより小さぐ補酵素である 4'-phosphopantetheineを必要 としな ヽ γ—グノレタミノレシスティンシンセターゼ ( y -glutamylcysteine synthetase)、グ ルタチオンシンセターゼ（glutathione synthetase) , D-ァラ-ルー D-ァラニン（D-Ala
—D- Ala)リガーゼ（D- Ala— D- Ala ligase)、ポリ一 y—グルタミン酸シンセターゼ（pol y- y -glutamate synthetase)等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。これら の酵素の殆どは D—アミノ酸を基質に用いる、または γ位のカルボキシル基でのぺ プチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、 L—アミノ酸のひ位カルボキシ ル基でペプチド結合するジペプチドの合成に用いることはできな 、。
[0005] L アミノ酸の a位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生 成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質である バシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン (L-ァラ -ル— L- アンチカプシン、 L-Ala-L-anticapsin)及び L-ァラ-ルー L-ァラニン（L- Ala— L- Ala )を合成する活性を有することは知られている力 その他のジペプチドの合成活性に つ!、ては知られて!/、な!/、（非特許文献 4および 5参照)。
[0006] 一方、全ゲノム情報の解明されたバチルス ·サチリス (Bacillus subtilis) 168株（非特 許文献 6参照）におけるバシリシン生合成酵素遺伝子群に関しては、 vwfA〜Fの ORF を含むバシリシンオペロンを増幅するとバシリシンの生産性が増加することが知られ て 、る（特許文献 7参照)。し力しこれらの ORFの中に 2種以上のアミノ酸をペプチド 結合で連結する活性を有する蛋白質をコードする ORFが含まれているか、含まれて V、るとすれば、どの ORFが該蛋白質をコードするかにつ!、ては知られて!/、な!/、。
[0007] ある種の微生物は 2つのアミノ酸が環状につながった環状ジペプチド (ジケトビペラ ジン)構造を持つ化合物を生成することも知られている（非特許文献 7、 8および 9参 照）。ジケトピペラジンの生合成については、 Streptomvces acidiscabiesの Thaxtomin 生合成過程では NRPSによって cyclo-(L- 4- nitrotryptophy卜 L- phenylalanine)構造が 合成される（非特許文献 10参照）こと、およびバチルス属細菌の NRPSの一部のモジ ユールの作用によってフエ-ルァラニンとプロリンから cyclo(phenylalany卜 proline)が生 成すること（
非特許文献 11参照）が報告されている。
[0008] 一方、抗生物質であるアルボノルシン（albonoursin)の生産株として知られて!/、るス トレプトマイセス ·ノウルセィ (Streptomvcesnoursei) ATCC11455株では NRPS酵素とは 全く類似性のな 、蛋白質 (albC遣伝子産物)がシクロ（L フエニルァラ-ル L一口 イシン） [cyclo(L- phenylalany卜 L- leucine)]構造の合成を担っていること、 albC遺伝子 人した Escherichia coliおよび Streptomvces lividansの; ¾·½: ^夂に cvclo aipeptide o xidaseを作用させるとアルボノルシンが検出されたとの報告はある（非特許文献 12参 照） 1S ^遺伝子産物が直鎖状のジペプチドを生成するとの報告はない。
[0009] 以上のように、バシリシン合成酵素群に含まれる酵素等が、アミノ酸およびアミノ酸 誘導体から様々なジペプチド誘導体を生成する活性があることは知られて 、な 、。 特許文献 1：特開昭 58-146539号公報
特許文献 2：特開昭 58-209991号公報
特許文献 3：特開昭 58-209992号公報
特許文献 4 :特開昭 59-106298号公報
特許文献 5：米国特許第 5795738号
特許文献 6：米国特許第 5652116号
特許文献 7：国際公開特許第 00-03009号パンフレット
非特許文献 1 :J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)
非特許文献 2 : Chem. Biol, 7, 373-384 (2000)
非特許文献 3 : FEBS Lett., 498, 42-45 (2001)
非特許文献 4 :J. Ind. Microbiol, 2, 201-208 (1987)
非特許文献 5 : Enzyme. Microbial. TechnoL, 29, 400-406 (2001)
非特許文献 6 : Nature, 390, 249-256 (1997)
非特許文献 7 : J. Nat. Prod., 59, 293-296 (1996)
非特許文献 8 : Tetrahedron, 28, 2999 (1972)
非特許文献 9 : J. Appl. Microbiol, 86, 29-53 (1999)
非特許文献 10 : Mol. Microbiol, 38, 794-804 (2000) 非特許文献 11 :J. Biol. Chem., 273, 22773-22781 (1998)
非特許文献 12 : Chemistry & Biol., 9, 1355-1364 (2002)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の目的は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチド誘導体を製造する 方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明は、以下の（1)〜（26)に関する。
(1)以下の [1]〜 [7]の 、ずれかに記載の蛋白質、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸 誘導体、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジぺ プチド誘導体 [以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)という]を生成、蓄積さ せ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を採取することを特徴と するジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)の製造法 [但し、ジペプチドまたはジぺ プチド誘導体 (PI)は、下記アミノ酸群 Aから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸が ペプチド結合によって結合したィ匕合物ではな 、 (アミノ酸群 A： L-ァラニン、 L-グルタ ミン、 L-グルタミン酸、 L-ノ リン、 L-ロイシン、 L-イソロイシン、 L-プロリン、 L-フエ-ル ァラニン、 L-トリプトファン、 L-メチォニン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-システィン、 L- ァスパラギン、 L-チロシン、 L-リジン、 L-アルギニン、 L-ヒスチジン、 L-ァスパラギン酸 、 L- α -ァミノ酪酸、 L-ァザセリン、 L-テアニン、 L- 4-ヒドロキシプロリン、 L- 3-ヒドロキ シプロリン、 L-オル-チン、 L-シトルリン、 L- 6-ジァゾ -5-ォキソノルロイシン、グリシン および j8 -ァラニン）]。
[ 1 ]配列番号 1〜8の 、ずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、置換または付加したアミノ酸配列力 なり、かつ 1種以上のアミノ酸またはァミノ 酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白 質
[3]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドま たはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[4]配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列 を有し、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体カもジペプチドまたはジぺプチ ド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[5]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失
、置換または付加したアミノ酸配列力もなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[7]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体力 ジペプチドまた はジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
(2)以下の [1]〜 [7]の 、ずれかに記載の蛋白質、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸 誘導体、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジぺ プチド誘導体 (PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体力 該ジペプチドまた はジペプチド誘導体 (PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI) を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体 [以下、ジペプチドまたはジペプチド誘 導体 (ΡΠ) t 、う]を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)を採取す ることを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)の製造法 [但し、ジぺプ チドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)は、前記アミノ酸群 A力も選ばれる同一のまたは 異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合したィ匕合物ではない]。
[ 1 ]配列番号 1〜8の 、ずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、置換または付加したアミノ酸配列力 なり、かつ 1種以上のアミノ酸またはァミノ 酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白 質
[3]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドま たはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質 [4]配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列 を有し、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体カもジペプチドまたはジぺプチ ド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[5]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失
、置換または付加したアミノ酸配列力もなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[7]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体力 ジペプチドまた はジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
(3)以下の [1]〜 [5]から選ばれる DNAを保持する細胞の培養物または該培養物 の処理物を酵素源に用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水 性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を 生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を採取す ることを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)の製造法 [但し、ジぺプ チドまたはジペプチド誘導体 (PI)は、前記アミノ酸群 Aから選ばれる同一のまたは異 なるアミノ酸がペプチド結合によって結合したィ匕合物ではない]。
[1]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列を有する DNA
[2]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列 を有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸 またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を 有する蛋白質をコードする DNA
[3]配列番号 18で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体から ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードす る DNA
[4]配列番号 39または 40で表される塩基配列を有する DNA
[5]配列番号 39または 40で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質を コードする DNA
(4)以下の [1]〜 [5]から選ばれる DNAを保持する細胞の培養物または該培養物 の処理物を酵素源に用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水 性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を 生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体力 該ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を修飾し、ジペプチド またはジペプチド誘導体 (ΡΠ)を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (P II)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)の製造法。
[1]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列を有する DNA
[2]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列 を有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸 またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を 有する蛋白質をコードする DNA
[3]配列番号 18で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体から ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードす る DNA
[4]配列番号 39または 40で表される塩基配列を有する DNA
[5]配列番号 39または 40で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質を コードする DNA
(5)アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (I)
[化 1]
Figure imgf000009_0001
[0013] (式中、 n1は 1〜3の整数を表し、
Rlaおよび Rlbは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級ァルケ-ル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換 もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは 非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のァロイルを表す力、または Rlaおよび Rlbのいずれか一方力 隣接する窒 素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上の R2aおよび R2bの いずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ R2aおよび R2bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または RlaRlbNに隣接する炭素原子上の R2aおよ び R2bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子なら びに Rla及び Rlbの 、ずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形 成してもよぐ nが 2または 3である場合、 2つまたは 3つの R2aおよび 2つまたは 3つの R2b はそれぞれ同一でも異なって 、てもよ 、）または式 (II)
[0014] [化 2]
Figure imgf000009_0002
[0015] [式中、 n2は前記 n1と同義であり、 R3aおよび R3bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表す力、または R4HNに隣接する炭素原子上の R3aおよび R3bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子および R4と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、 n2が 2または 3であ る場合、 2つまたは 3つの R3aおよび 2つまたは 3つの R3bはそれぞれ同一でも異なって いてもよく、
R4は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級ァ ルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ -ル、置換もしくは非置換のァラルキル
、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ力 ルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは非置換のァロイルを表 すか、または R4が隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該 炭素原子上の R3aおよび R3bの 、ずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複 素環基を形成してもよぐ
R5はァミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ (置換もしくは非置 換の低級アルキル)アミ入ジ (置換もしくは非置換の低級アルキル)ァミノまたは脂環 式複素環基を表す]で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体 [但し、アミノ酸またはァ ミノ酸誘導体が式 (I)のみであるとき、 Rla及び Rlbの少なくとも一方は水素原子であり、 アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (II)のみであるとき、 R5はヒドロキシである]である、 上記（1)〜（4)の!、ずれか 1つの製造法。
(6)アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (III)
[0016] [化 3]
Figure imgf000010_0001
[0017] (式中、 Rleおよび Rldは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級ァ ルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ- ル、置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換 もしくは非置換の低級アルコキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールまたは 置換もしくは非置換のァロイルを表し、
R2eおよび R2dは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アル キルを表す)または式 (IV)
[0018] [化 4]
Figure imgf000011_0001
[0019] (式中、 R および R3dは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級ァ ルキル、置換もしくは非置換のァラルキルまたは置換もしくは非置換のァリールを表 し、
R5は前記と同義である）で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体 [但し、アミノ酸また はアミノ酸誘導体が式 (III)のみであるとき、 Rle及び Rldの少なくとも一方は水素原子で あり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (IV)のみであるとき、 R5はヒドロキシである]で ある、上記（1)〜(4)のいずれか 1つの製造法。
(7)アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (V)
[0020] [化 5]
Figure imgf000011_0002
[0021] (式中、 R ま置換もしくは非置換のメチルを表す)または式 (VI) [0022] [化 6]
Figure imgf000012_0001
[0023] (式中、 R3eは置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のァラルキル または置換もしくは非置換のァリールを表す)で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導 体である上記（1)〜 (4)の 、ずれか 1つの製造法。
(8)アミノ酸またはアミノ酸誘導体が L—アミノ酸、グリシンおよび |8—ァラニン力 な る群より選ばれるアミノ酸またはその誘導体である、上記（1)〜 (4)のいずれか 1つの 製造法。
(9) L—アミノ酸が L—ァラニン、 L—グルタミン、 L—グルタミン酸、 L—パリン、 L—口 イシン、 L—イソロイシン、 L—プロリン、 L—フエ二ルァラニン、 L—トリプトファン、 L— メチォニン、 Lーセリン、 Lースレオニン、 L—システィン、 Lーァスパラギン、 L—チロシ ン、 L—リジン、 L—アルギニン、 L—ヒスチジン、 L—ァスパラギン酸、 L— α—ァミノ 酪酸、 L—ァザセリン、 L—テアニン、 L— 4—ヒドロキシプロリン、 L— 3—ヒドロキシプ 口リン、 L—オル二チン、 Lーシトルリンおよび L— 6—ジァゾ -5-ォキソノルロイシンから 選ばれる L—アミノ酸である、上記（8)の製造法。
(10)ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΙ)が式 (Vila)
[0024] [化 7]
Figure imgf000012_0002
(Vila) [式中、 n3aおよび n4aはそれぞれ前記 nと同義であり、
R6aおよび R6bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級ァルケ-ル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換 もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは 非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のァロイルを表す力、または R6aおよび R6bのいずれか一方力 隣接する窒 素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上の R7aおよび R7bの いずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ R7aおよび R7bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または R6 6bNに隣接する炭素原子上の R7aおよ び R7bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子なら びに R6aおよび R6bの 、ずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を 形成してもよぐ n3aが 2または 3である場合、 2つまたは 3つの R7aおよび 2つまたは 3つの R7bはそれぞれ同一でも異なっていてもよぐ
R8aは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級ァ ルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ -ル、置換もしくは非置換のァラルキル
、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ力 ルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは非置換のァロイルを表 す力 または R が隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつ R9aおよび R9bと結 合する炭素原子ならびに該炭素原子上の R9aおよび R9bのいずれか一方と一緒になつ て置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R9aおよび R9bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表す力、または R Nに隣接する炭素原子上の R9aおよび R 9bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子および R8 aと一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ 11½カ¾または 3であ る場合、 2つまたは 3つの R9aおよび 2つまたは 3つの R%はそれぞれ同一でも異なって いてもよく、
R1Qaはァミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ (置換もしくは非 置換の低級アルキル)アミ入ジ (置換もしくは非置換の低級アルキル)ァミノまたは脂 環式複素環基を表す]で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（1) 〜（5)の 、ずれか 1項に記載の製造法。
(11)ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)が式 (Vllb)
[0026] [化 8]
Figure imgf000014_0001
(Vll b)
[0027] [式中、 n3Aおよび ιΛまそれぞれ前記 nと同義であり、
R6Aおよび R6Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級ァルケ-ル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換 もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは 非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のァロイルを表す力、または R6Aおよび R6Bのいずれか一方力 隣接する窒 素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上の R7Aおよび R7Bの いずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ R7Aおよび R7Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または R6AR6BNに隣接する炭素原子上の R7Aおよ び R7Bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子なら びに R6Aおよび R6Bのいずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を 形成してもよぐ n3 ¾または 3である場合、 2つまたは 3つの R7Aおよび 2つまたは 3つ の R7Bはそれぞれ同一でも異なっていてもよぐ R8Aは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級ァ ルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ -ル、置換もしくは非置換のァラルキル
、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ力 ルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは非置換のァロイルを表 す力 または R8Aが隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつ R9Aおよび R9Bと結 合する炭素原子ならびに該炭素原子上の R9Aおよび R9Bのいずれか一方と一緒になつ て置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R9Aおよび R9Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または R8ANに隣接する炭素原子上の R9Aおよび R9Bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子および R8Aと一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ n4^2または 3で ある場合、 2つまたは 3つの R9Aおよび 2つまたは 3つの R9Bはそれぞれ同一でも異なつ ていてもよく、
R1QAは前記 R1Qaと同義である]で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上 記（1)〜（5)の!、ずれか 1つの製造法。
( 12)ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)が式 (Villa)
[0028] [化 9]
Figure imgf000015_0001
(Villa)
[0029] (式中、 R6eおよび R6dは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級ァ ルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ- ル、置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換 もしくは非置換の低級アルコキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールまたは 置換もしくは非置換のァロイルを表し、
R7eおよび R7dは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アル キルを表し、
R9eおよび R9dは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキルまたは置換もしくは非置換のァリールを表し、
R1Qaは前記と同義である）で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（ 1)〜（6)の!、ずれか 1つの製造法。
(13)ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)が式 (Vlllb)
[0030] [化 10]
Figure imgf000016_0001
(Vlllb)
[0031] (式中、 R6C、 R6D、 R7C、 R7D、 R9Cおよび R9Dはそれぞれ前記 R6e、 R6d、 R7 R7d、 R9eおよび R9dと同義であり、
R1QAは前記と同義である）で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記（ 1)〜（6)の!、ずれか 1つの製造法。
(14)ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)が式 (IXa)
[0032] [化 11]
Figure imgf000016_0002
(IXa) [0033] (式中、 R7eは置換もしくは非置換のメチルを表し、
R9eは置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のァラルキルまたは置 換もしくは非置換のァリールを表す)で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体 である上記（1)〜（7)の 、ずれか 1項に記載の製造法。
(15)ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)が式 (IXb)
[0034] [化 12]
Figure imgf000017_0001
(IXb)
[0035] (式中、 R7Eおよび R9Eはそれぞれ前記 R7eおよび R9eと同義である）で表されるジぺプチ ドまたはジペプチド誘導体である上記（1)〜（7)の 、ずれか 1つの製造法。
(16)ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)ある!/、はジペプチドまたはジペプチド 誘導体 (ΡΠ)が L アミノ酸、グリシン、および |8—ァラニン、ならびにそれらの誘導体 力 選ばれる同一または異なるアミノ酸またはアミノ酸誘導体がペプチド結合したジ ペプチドまたはジペプチド誘導体である、上記（1)〜（8)の 、ずれか 1つの製造法。
(17) L アミノ酸が L ァラニン、 L グルタミン、 L グルタミン酸、 L—パリン、 L— ロイシン、 L—イソロイシン、 L—プロリン、 L—フエ二ルァラニン、 L—トリプトファン、 L —メチォニン、 L セリン、 L—スレオニン、 L システィン、 L ァスパラギン、 L チ 口シン、 L リジン、 L アルギニン、 L ヒスチジン、 L ァスパラギン酸、 L— α ァ ミノ酪酸、 L ァザセリン、 L テアニン、 L— 4—ヒドロキシプロリン、 L— 3—ヒドロキシ プロリン、 L—オル二チン、 Lーシトルリンおよび L— 6—ジァゾ -5-ォキソノルロイシン 力も選ばれる L -アミノ酸である、上記（ 16)の製造法。
(18)細胞が微生物の細胞である、上記（3)〜（17)のいずれか 1つの製造法。
(19)微生物が原核生物である、上記（18)の製造法。 (20)原核生物が 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のペプチド取り込み活性 を有する蛋白質 (以下、ペプチド取込み蛋白質とも 、う）の活性が低下または喪失し た微生物である上記（19)の製造法。
(21)原核生物が 3種以上のぺプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物であ る、上記（20)の製造法。
(22)ぺプチダーゼが配列番号 43〜46の!ヽずれかで表されるアミノ酸配列を有する 蛋白質、または配列番号 43〜46のいずれかで表されるアミノ酸配列と 80%以上の 相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつべプチダーゼ活性を有する蛋白質である、 上記（20)または（21)の製造法。
(23)ペプチド取込み蛋白質が配列番号 47〜51のいずれかで表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質、または配列番号 47〜51のいずれかで表されるアミノ酸配列と 80% 以上の相同性を有する蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質で ある、上記（20)または（22)の製造法。
(24)原核生物がェシエリヒア属、バチルス属またはコリネバタテリゥム属に属する微 生物である、上記（19)〜（23)のいずれか 1つの製造法。
(25)ェシエリヒア属、バチルス属またはコリネバタテリゥム属に属する微生物がェシェ リヒア'コリ、コリネバタテリゥム 'グルタミクム、コリネバタテリゥム'アンモニアゲネス、コリ ネバクテリゥム 'ラタトフアーメンタム、コリネバクテイルム 'フラバム、コリネバクテリウム' エフイシエンス、バチルス ·サチルスまたはバチルス 'メガテリゥムである上記（24)の 製造法。
(26)培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して 得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理 物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、 該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体 より抽出して得られる酵素標品であり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体 力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する処理物であることを 特徴とする、上記（3)〜（25)の 、ずれか 1つの製造法。
発明の効果 [0036] 本発明により、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチド誘導体を効 率的に製造することができる。
図面の簡単な説明
[0037] [図 1]図 1はプラスミド pPE43の構築過程を示す図である。
[図 2]図 2はプラスミド pQE60ywffiの構築過程を示す図である。
[図 3]図 3は、直鎖ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の発現プラスミドベクターで ある pAL- nouおよび pAL- albの構築過程を示す図である。
[図 4]図 4は、: mffi遺伝子発現強化型ベクターである PPE56の構築過程を示す図であ る。
符号の説明
[0038] vwffi:バチノレス 'サチリス 168株由来の ^遺伝子
Plm:トリプトファンプロモーター遺伝子
PJ^:T5プロモーター
Ampr：アンピシリン耐性遺伝子
kef：ラタトースリプレッサー遺伝子
albC： albC遣伝子または albC街似遣伝子
発明を実施するための最良の形態
[0039] 1.本発明の方法で用いられる蛋白質
本発明の方法で用いられる蛋白質としては、
[ 1 ]配列番号 1〜8の 、ずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、置換または付加したアミノ酸配列力 なり、かつ 1種以上のアミノ酸またはァミノ 酸誘導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、 [3]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドま たはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[4]配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列 を有し、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体カもジペプチドまたはジぺプチ ド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[5]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[6]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失
、置換または付加したアミノ酸配列力もなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、およ び
[7]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体力 ジペプチドまた はジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
[0040] 上記において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からな り、かつ式 (I)で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、 Molecular Clonin g, A Laboratory Manual, Thrid Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (2001) (以下、モレキュラ^ ~·クロー-ング第 3版と略す）、 Current Protocols in Molecular Bi ology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、カレント'プロトコールズ'イン'モレキュ ラー'バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4 431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異 導入法を用いて、配列番号 1〜8、 37および 38のいずれかで表されるアミノ酸配列 力もなる蛋白質をコードする DNAに部位特異的変異を導入することにより、取得する ことができる。
[0041] 欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されな 、が、上記の部位特異 的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1個か ら数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜： L0個、さらに好ましくは 1〜5個で ある。
配列番号 1〜8、 37および 38のいずれかで表されるアミノ酸配列において 1以上の アミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、 1 または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されて 、てもよ 、。 [0042] アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号 1〜8、または配列番号 37および 38で表されるアミノ酸配列を公知のァライメントソフトウェアを用いてそれぞ れの間で比較したときに、すべてのアミノ酸配列にお!、て保存されて 、な 、アミノ酸 をあげることができる。公知のァライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフ トウエア Genetyx (ソフトウェア開発株式会社）に含まれるァライメント解析ソフトをあげ ることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることがで きる。
[0043] また、アミノ酸の欠失または付カ卩が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号 1〜8、 37および 38の 、ずれかで表されるアミノ酸配列の N末端側および C末端側を あげることができる。
欠失、置換または付カ卩は同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然 型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 Lーァラニン、 Lーァスパラギン 、 L ァスパラギン酸、 L アルギニン、 L グルタミン、 L グルタミン酸、グリシン、 L ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L一口イシン、 L—リジン、 L メチォニン、 L—フエ二 ルァラニン、 L—プロリン、 Lーセリン、 Lースレオニン、 L—トリプトファン、 Lーチロシン 、 L—パリン、 L システィンなどがあげられる。
[0044] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン G群：フエ-ルァラニン、チロシン
また、本発明で用いられる蛋白質がジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活 性を有するためには、配列番号 1〜8、 37および 38のいずれかで表されるアミノ酸配 列、好ましくは配列番号 1または 37で表されるアミノ酸配列との相同性が 65%以上、 好ましくは 75%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好 ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を有して 、ることが望まし 、。
[0045] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol, 215, 403(1990)]。 BLASTに基づ 、て BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例 えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによって アミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score=50、 wordlength=3と する。 BLAST Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフオル トパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 WW w. ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0046] また、配列番号 1〜8、 37および 38のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは 配列番号 1または 37で表されるアミノ酸配列と 65%以上、好ましくは 75%以上、より 好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上、最も好 ましくは 98%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 なり、かつジペプチドまたはジ ペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質もまた本発明で用いられる蛋白質である 。アミノ酸配列の相同性は、上記したように BLASTや FASTAを用いて決定することが できる。
[0047] 配列番号 17で表されるアミノ酸配列は、配列番号 1〜7で表されるアミノ酸配列を 有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物の Ala-Alaリガ一 ゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ま しくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつジぺプチ ドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である
[0048] 配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ま しくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質力 ジペプチドまたは ジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸 配列と配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性力 少なくとも 80 %以上、通常は 90%以上、特に 95%以上の相同性を有していることが好ましい。
[0049] アミノ酸配列の相同性は、上記したように BLASTや FASTAを用いて決定することが できる。
本発明で用いられる蛋白質が、ジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を 有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えば DNA組換え法を用いて本 発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明で用 いられる蛋白質を製造した後、該蛋白質、 1種以上の L アミノ酸およびアミノ酸誘導 体、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジぺ プチド誘導体が生成、蓄積する力否かを HPLC等により分析する方法をあげることが できる。
2.本発明で用いられる DNA
本発明で用いられる DNAとしては、
[1]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列を有する DNA、
[2]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列 を有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸 またはアミノ酸誘導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有す る蛋白質をコードする DNA、
[3]配列番号 18で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体から ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードする DN A、
[4]配列番号 39または 40で表される塩基配列を有する DNA、および [5]配列番号 39または 40で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコー ドする DNA、などをあげることができる。
[0050] 上記のストリンジェントな条件下でハイブリダィズ可能な DNAとは、配列番号 9〜16
、 18、 36、 39または 40のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有す る DNAの一部、または全部をプローブとして、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、 プラーク ·ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法 等を用いることにより得られる DNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク 由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. Omol/1、好ましくは 0. 9mol /1の塩ィ匕ナトリウム存在下、 65°Cでノヽイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃 度、好ましくは 0. 1倍濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmol/l 塩化ナトリウム、 15mmol/lクェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65°C条件下でフィルタ 一を洗浄することにより同定できる DNAをあげることができる。ハイブリダィゼーシヨン は、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 3版、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バ ィォロン1 ~~、 DNA Cloning 1:し ore Techniques, A Practical Approach, Second Editio n, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイ ブリダィズ可能な DNAとして具体的には、上記した BLASTおよび FASTA等を用いて 、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号 9〜16、 18、 36、 39および 4 0のいずれかで表される塩基配列と少なくとも 75%以上、好ましくは 85%以上、さら に好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有する DNAをあげるこ とがでさる。
[0051] 配列番号 9〜16、 18、 36、 39および 40のいずれかで表される塩基配列と相補的 な塩基配列を有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAが、 ジペプチドまたはジペプチド誘導体の合成活性を有する蛋白質をコードする DNAで あることは、例えば上記したように、組換え DNA法を用いて該 DNAにコードされる蛋 白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
4.本発明で用いられる DNAの調製 本発明に用いられる DNAは、例えば、配列番号 9〜16、 18、 36、 39または 40で 表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、バチルス属また はストレプトマイセス属に属する微生物の染色体 DNAライブラリーに対するサザンノヽ イブリダィゼーシヨン、または配列番号 9〜16、 18、 36、 39または 40で表される塩基 配列に基づき設計することができるプライマー DNAを用いた、バチルス属に属する 微生物の染色体 DNAを铸型とした PCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]に より取得することができる。
[0052] また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号 1〜8、 17、 37および 38 の!、ずれかで表されるアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列と 75%以上、好ま しくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましく は 98%以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に 基づき、該塩基配列を有する生物の染色体 DNA、 cDNAライブラリ一等から上記し た方法により本発明に用いられる DNAを取得することもできる。
[0053] 取得した DNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりべク ターに組み込み、得られた組換え体 DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられ る塩基配列解析方法、例えばジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 ( 1977)]あるいは 373Α· DNAシークェンサ一（パーキン ·エルマ一社製）等の塩基配列 分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決定することができる。
[0054] 塩基配列を決定した結果、取得された DNAが部分長であった場合は、該部分長 D NAをプローブに用いた、染色体 DNAライブラリーに対するサザンハイブリダィゼー シヨン法等により、全長 DNAを取得することができる。
更に、決定された DNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ'バイオシステムズ 社製 8905型 DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする DNAを調 製することちでさる。
[0055] 上記のようにして取得される DNAとして、例えば、配列番号 9〜16、 36、 39または
40で表される塩基配列を有する DNAをあげることができる。
本発明の DNAおよび本発明の製造法に用いられる DNAを組み込むベクターとし ては、 pBluescriptll KS(+) (ストラタジーン社製）、 pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6 069 (1990)]、 pCR- Script Amp SK(+) (ストラタジーン社製）、 pT7Blue (ノバジェン社製 )、 pCR II (インビトロジェン社製）および pCR- TRAP (ジーンハンター社製）などをあげ ることがでさる。
[0056] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属に属する微生物などをあげることができる。ェシ工 リヒア属に属する微生物としては、例えば、ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) XL1- B lueゝェシエリヒア'コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒア'コリ MC1000、 ェシエリヒア'コリ KY3276、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシエリ ヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒア'コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、ェシエリヒア'コリ ME8415 等をあげることができる。
[0057] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクトロボレ ーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられる DNAを保有する微生物と しては、例えば配列番号 1で表される配列を有する DNAを含有する組換え体 DNA を保有する微生物であるェシエリヒア'コリ NM522/pPE43をあげることができる。
4.本発明に用いられる細胞の調製
(1)本発明に用いられる細胞としては、 0上記 3の DNAを染色体 DNA上に有するバ チルス属に属する細菌、好ましくはバシリシン合成活性を有するバチルス属に属する 細菌、より好ましくはバチルス'サチリス、バチルス 'アミロリケファシエンス、バチルス' コアギュランス、バチルス'リケニフォルミス、バチルス 'メガテリゥムおよびバチルス 'プ ミルスカ なる群より選ばれる種に属する細菌、さらに好ましくは、バチルス'サチリス ATCC 15245、バチルス ·サチリス ATCC6633、バチルス ·サチリス IAM1213、バチルス 'サチリス IAM1107、バチルス'サチリス IAM1214、バチルス'サチリス ATCC9466、ノ チルス ·サチリス IAM1033、バチルス ·サチリス ATCC21555、バチルス ·アミ口リケファ シエンス IFO3022およびバチルス ·プミルス NRRL B-12025からなる群より選ばれる 株である細菌、 ii)上記 3の DNAを染色体 DNA上に有するストレプトマイセス属に属 する細菌、好ましくはアルボノルシン合成活性を有するストレブトマイセス属に属する 細菌、より好ましくはストレプトマイセス ·アルボラスまたはストレプトマイセス ·ノウルセ ィより選ばれる種に属する細菌、さらに好ましくは、ストレプトマイセス'アルボラス IFO 14147、ストレプトマイセス 'ノウルセィ ATCC 11455または IF015452、 iii)モレキュラ^ ~ · クロー-ング第 3版、カレント'プロトコールズ 'イン'モレキユラ一'バイオロジー等に記 載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記 3の方法により取得した DN Αを宿主細胞に導入することにより調製することができる形質転換体、をあげることが できる。
[0058] 本発明に用いられる DNAをもとにして、必要に応じて、本発明で用いられる蛋白質 をコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。また、該蛋白質をコー ドする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換するこ とにより、該蛋白質の生産率が向上した細胞を取得することができる。
該 DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換え体 DNAを作製する。
[0059] 該組換え体 DNAを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、本 発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、原核生物および酵母等の微生物の細胞、動物細胞、昆虫細胞 、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることがで き、好ましくは微生物、より好ましくは原核生物、さらに好ましくは細菌をあげることが できる。
[0060] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる DNAを転写 できる位置にプロモーターを含有して 、るものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明に用いられる DNAを 有する組換え体 DNAは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモータ 一、リボソーム結合配列、本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる DNA 、転写終結配列より構成された組換え体 DNAであることが好ましい。プロモーターを 制御する遺伝子が含まれて 、てもよ 、。 [0061] 発現ベクターとしては、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイ ム社製）、 pHelixl (ロシュ'ダイァグノステイタス社製）、 pKK233-2 (アマシャム'ファノレ マシア'バイオテク社製）、 pSE280 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-Ι (プロメガ社製 )、 pQE-8 (キアゲン社製）、 pET-3 (ノバジェン社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 p KYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、 pLSAl[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1 989)]、 pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescriptll SK (+) 、 pBluescript II KS (-) (ストラタジーン社製）、 pTrS30 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS3 0(FERM BP- 5407)より調製]、 pTrS32 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS32(FERM BP- 54 08)より調製]、 pPAC31 (W098/ 12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、 pSTV28(宝 酒造社製)、 pUC118 (宝酒造社製）、 pPAl (特開昭 63- 233798)、 pWH1520 (MoBiTec 社製）、 pCS299P(WO 00/63388)、 pVLT31 [Gene, 123, 17 (1993)]および pIJ702 (Ge netic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manuahjohn Innes Foundation)等 を例示することができる
プロモーターとしては、ェシエリヒア'コリ等の宿主細胞中で機能するものであれば 、かなるものでもよ!ヽ。例えば、 imプロモーター（p )、 プロモーター（P ；)、 Pプ
trp iac L 口モーター、 pプロモーター、 p プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来する
R SE
プロモーター、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等をあ げることができる。また P を 2つ直列させたプロモーター、 ^プロモーター、 lacT7プ
trp
口モーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用 いることがでさる。
[0062] さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるための !Δプロモーター [Appl.
Microbiol. BiotechnoL, 35, 594-599 (1991)Ίやコリネパクテリゥム（Corvnebacterium) 属に属する微生物中で発現させるための P54-6プロモーター [Appl. Microbiol. Biote chnol, 53, 674-679 (2000)]、シユードモナス属に属する微生物中で発現させるため の tacプロモーター [Gene, 123, 17-24 (1993)]、ストレプトマイセス属に属する微生物 中で発現させるための xvlAプロモーター（Genetic Manipulation of Streptomyces: a L aboratory Manuahjohn Innes Foundation)なども用 ヽること力 Sでさ 。
[0063] リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンと の間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま 、。 本発明に用いられる DNAを発現ベクターに結合させた組換え体 DNAにお 、ては 、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を 配置することが好ましい。
このような組換え体 DNAとしては、例えば pPE43をあげることができる。
原核生物としては、ェシエリヒア属、セラチア（Serratia)属、バチルス属、ブレビバタ テリゥム（Brevibacterium)属、コリネパクテリゥム（Corvnebacterium)属、ミクロバタテリ ゥム属 (Microbacterium)、シユードモナス (Pseudomonas)属、ァグロノくクテリゥム (Agr obacterium)属、アリシクロノくチノレス属 (Alicvclobacillus)、アナべナ (Anabena)属、ァ ナシスティス (Anacvstis)属、ァスロバクタ一 (Arthrobacter)属、ァゾトパクター (Azoto bacter)属、クロマチゥム（Chromatium)属、エノレビニァ（Erwinia)属、メチロバクテリウ ム (Methvlobacterium)属、フォノレミディゥム (Phormidium)属、口ドノくクタ一 (Rhodobact §Ε)属、ロドシユードモナス（RhodoDseudomonas)属、ロドスピリゥム（RhodosDirillum)鼠 、セネデスムス (Scenedesmus)属、ストレプトマイセス（StreDtomvces)属、シネコッカス (Svnechoccus)属、ザィモモナス (Zvmomonas)属等に属する微牛.物、例えば、エシ リヒア.コリ XLト Blueゝェシエリヒア'コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒ ァ 'コリ DH5 a、ェシエリヒア'コリ MC1000
、ェシエリヒア'コリ KY3276、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシ エリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒア' コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、バチルス'サチリス A TCC33712,バチルス 'メガテリゥム、バチノレス ·エスピー（Bacillus sp.) FERM BP- 603 0、バチルス 'アミロリケファスエンス、バチルス 'コアギュランス、バチルス'リケニフォル ミス、バチルス'プミルス、ブレビパクテリゥム ·アンモニアゲネス (Brevibacterium ammo niagenes)、ブレヒノヽクァリゥム 'ィマリオフイノレム (Brevibacterium immariophilum AT CC14068、ブレビバクテリウム*サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolvticum) A TCC14066、ブレビバクテリウム'フラバム（Brevibacterium flavum) ATCC14067、ブレ ビバクテリウム*ラクトフアーメンタム（Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869、コ リネバタテリゥム.グルタミカム（ ojynebacterium glutamicum) ATCC13032、コリネバ クテリゥム ·グルタミカム ATCC14297、コリネバタテリゥム ·ァセトァシドフィルム (Corvne bacterium acetoacidophilum) ATCC13870、ミクロバタテリゥム ·アンモニアフィルム (Mi crobacterium ammoniaphilum) ATCC15354、セラチア -フイカリア（Serratia ficaria)、 セラチア ·フォンチコラ (Serratia fonticola)、セラチア ·リケファシエンス (Serratia liauef aciens)、セラチア ·マノレセッセンス (Serratia marcescens)、シユードモナス ·エスピー ( Pseudomonas sp.) D— 0110、ァグロバクテリウム'ラジオノくクタ一（Agrobacterium radio bacter)、ァグロノくクテリゥム ·リゾジーンズ (Agrobacterium rhizogenes)、ァグロノくクテ リウム ·ノレビ（Agrobacterium rubi)、アナべナ.シリンドリカ (Anabaena cvlindrica)、アナ べナ ·ドリオ/レム (Anabaena doliolum)、アナべナ 'フロスアクア (Anabaena flos-aauae) ゝアースロバクタ一.オーレッセンス (Arthrobacter aurescens)、アースロノくクタ一 'シト レウス (Arthrobacter citreus)、アースロバクタ一 ·グロブフオノレミス (Arthrobacter elobf ormis)、了. ~~スロノくクタ1 ~~ 'ヒドロ力1 ~~ホクノレタ カス (Arthrobacter hvdrocarboglutami cus)、アース口パクター'ミソレンス（Arthrobacter mvsorens)、アースロバクタ一'ニコ チアナ (Arthrobacter nicotianae)、アースロノくクタ一 'パラフイネウス (Arthrobacter raffineus)、アースロノくクタ一.プロトフオノレミェ（Arthrobacter protophormiae)、アース ロノ クタ一 ·ロセオノ ラフイナス (Arthrobacter roseoparaffinus 、アース
ロバクタ一'スルフレウス (Arthrobacter sulforeus)、アースロバクタ一 ·ウレァファシェ ンス（Arthrobacter ureafaciens)、クロマチゥム 'ブァリ（Chromatium buderi)、クロマチ ゥム，テピタム (Chromatium tepidum 、クロマチゥム 'ヒノサム（Chromatium vinosum) 、クロマチウム'ヮ一ミンギ（Chromatium warmingii)、クロマチゥム 'フノレビアタティレ（C hromatium fluviatile)、ェ/レビ-ァ ·ウレドノくラ（Erwiniauredovora)、エノレビ-ァ '力ロト ノ ラ (Erwinia carotovora)、エノレビ-ァ ·ァナス (Erwinia ananas)、エノレビ-ァ ·ヘリコラ (Erwinia herbicola)、ェルビ-ァ 'パンクタタ (Erwinia punctata)、ェルビ-ァ 'テレウス (Erwinia terreus)、メチ口/くクテリゥム ·口デンァナム (Methvlobacterium rnodesianum )、メチロバクテリゥム ·ェクソトノレクエンス (Methvlobacterium extorauens)、フオノレミデ ィゥム ·エスピー（Phormidium sp.) ATCC29409,ロドパクター ·力プスラタス (Rhodobac ter capsulatus)、口ドノくクタ一'スフエロ ァス (Rhodobacter sphaeroides 、口 rシユー ドモナス ·ブラスチカ（RhodojDseudomonas, blastica)、ロドシユードモナス ·マリナ (Rhod opseudomonas marina)、ロドシュ1 ~~ドモナス'ノ ルストリス (Rhodopseudomonas palustr is)、ロドスピリゥム ·リブラム (Rhodospirillum rubrum)、ロドスピリゥム ·サレキシゲンス ( Rnodospirillum salexigens)、口トスピリゥム *サリナフム (Rhodospirillum salinarum)、ス トレプトマイセス ·アンボファシエンス (Streptomvces ambofaciens)、ストレプトマイセス' オーレオファシエンス (Streptomvces aureofaciens) 、ストレプトマイセス ·ァゥレウス（ treptomvces aureus)、ストレプトマイセス ·フンンシアイ； yス (Streptomvces lungicidicu s)、ストレプトマイセス ·グリセォクロモゲナス（Streptomvces griseochromogenes)、スト レプトマイセス ·グリセウス (Streptomvces griseus)、ストレプトマイセス ·リビダンス (Stre ptomvces lividans、ストレプトマ セス ·オリポクリセウス (atreptomvces olivognseus)、 ストレプトマイセス ·ラメウス (Streptomvces rameus)、ストレプトマイセス ·タナシェンシ ス (Streptomvces tanashiensis)、ストレプトマイセス ·ビナセウス (Streptomvces vinaceu s)、ザィモモナス ·モビリス (Zvmomonas mobilis)等をあげることがでる。好まし ヽ原核 生物としては、ェシエリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネ ノ クテリウム属、シユードモナス属またはストレブトマイセス属等に属する細菌、例えば 上記したェシエリヒア属、セラチア属、バチノレス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテ リウム属、シユードモナス属またはストレブトマイセス属等に属する種をあげることがで き、より好ましい細菌としてはェシエリヒア'コリ、コリネバクテリウム'ダルタミクム、コリネ バタテリゥム.アンモニアゲネス、コリネバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム、コリネバクテ イルム'フラバム、コリネバタテリゥム 'エフイシエンス、バチルス'サチルス、バチルス' メガテリゥム、セラチア'マノレセッセンス、シユードモナス'プチダ、シユードモナス 'ェ ルギノーサ、ストレプトマイセス ·セリカラーまたはストレプトミセス ·リビダンスをあげるこ とができ、特に好ましくはェシエリヒア'コリをあげることができる。
組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクトロボレ ーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 ( ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を用 いることがでさる。
[0066] プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モーター、 gal iプロモーター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモ 一ター、 MF a lプロモーター、 CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることが できる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomvces)属、シゾサッカロマイセス（Sch izosaccharomvces) fe、クルィベロマイセス (Kluweromvces) 、トリコス ロン (Tricho sporon)属、シヮニォマイミセス（Schwanniomvces)属、ピチア (Pichia)属、またはキヤ ンデイダ (C dida)属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロ マイセス ·セレビシェ (Saccharomvces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス ·ボンべ (Schi zosaccharomv cespombe)、クノレイベロマ ττス ·フク "イス (Kluweromvces lactis)、トリ コスポロン ·プルランス (Trichosporon pullulans)、シヮニォマイセス ·ァノレビウス (Schw anniomvces alluvius)、ピチア ·ノストリス (Pichia pastoris)、キャンディダ ·ウテイリス（£ andida utilis)等をあげることができる。
[0067] 組換え体 DNAの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 ( 1990)]、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチ ゥム法 [J. BacterioL, 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcD M8 (フナコシ社より巿販）、 pAGE107 (特開平 3- 22979)、 pAS3- 3 (特開平 2- 227075)、 pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、 pcDNAI/Amp (インビトロジェン社製）、 pREP4 (ィ ンビトロジェン社製）、 pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、 pAGE210、 pAMo、 p AMoA等を用いることができる。
[0068] プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーターあるいはメタ口チォネインのプロモーター、レトロウイノレ スのプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
[0069] 宿主細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット 'ミエローマ細胞、マウス'ハイブリ ドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞またはナマルバ KJM-1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ 'ハム スターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299)等をあげることができる。 マウス ·ミエローマ細胞としては、 SP2/0、 NSO等、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2 /0等、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞として は BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS-l、 COS-7等をあげることが できる。
[0070] 組換え体 DNAの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]、リン酸カルシウム法（特開平 2-227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]、 Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげること ができる。
[0071] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and company, New York (1992)、 7ルント-フ—ロト コーノレズ 'イン'モレキュラー'ノ ィォロジ一、 Molecular Biology, A Laboratory Manual 、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産すること ができる。
[0072] 即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、 pVL1392、 pVLl 393、 pBlueBacIII (V、ずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
[0073] バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica nu clear polyhedrosis virus;等を用 ヽること »でさ 。
昆虫細胞としては、スポドプテラ ·フルギベルダ (2E2d2 tera frugiE_erda)の卵巣細胞 、トリコプルシア，二 (TrichoDlusia ni)の卵巢細朐、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用 いることがでさる。
[0074] スポドプテラ ·フルギベルダの卵巣細胞としては S19、 S1 1 (バキュロウィルス'イクスプ レツシヨン'ベクターズァ 'ラボラトリー 'マ-ユアル)等、トリコプルシア '二の卵巣細胞 としては High 5、 ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4 (インビトロジェン社製)等、カイコ卵巣由来の培養細 胞としてはボンビクス'モリ (Bombvx mori) N4等をあげることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2 -227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等をあげ ることがでさる。
[0075] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、ィネアクチ ン 1プロモーター等をあげることができる。
[0076] 宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファ ルファ、イネ、コムギ、ォォムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium)を用いる方法 ( 特開昭 59-140885、特開昭 60-70080、 WO94/00977)、エレクト口ポレーシヨン法（特 開昭 60-251887)、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法 (特許第 2606856、特 許第 2517813)等をあげることができる。
[0077] 酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは 糖鎖が付加された蛋白質を生産する細胞を得ることができる。
(2)本発明の製造法に用いられる微生物としては、上記 (1)の方法により調製される 微生物において、 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のペプチド取り込み活性 を有する蛋白質 (以下、ペプチド取込み蛋白質と略す)の活性が低下または喪失して V、る微生物、または 3種以上のぺプチダーゼの活性が低下または喪失して 、る微生 物が好適に用いられる。
[0078] 該微生物は、例えば (a) 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のペプチド取り込 み活性を有する蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または 3種以上のぺプ チダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、上記 (1)の方法によりジペプチドを 生成する活性を有する蛋白質を生産する能力またはポリリン酸キナーゼ活性を有す る蛋白質を生産する能力を付与する方法、または (b)上記 (1)の方法により調製する ことができるジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を生産する能力またはポリリ ン酸キナーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の、 a) 1種以上の ぺプチダーゼおよび 1種以上のペプチド取り込み蛋白質、または b) 3種以上のぺプ チダーゼ、の機能を低下または喪失させる方法等の!/、ずれの方法によっても取得す ることがでさる。
[0079] 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のペプチド取込み蛋白質の活性が低下ま たは喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意 の 1種以上のぺプチダーゼおよび任意の 1種以上のペプチド取込み蛋白質の活性 が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは 1種以上 9種以下、 より好ましくは 1種以上 7種以下、さらに好ましくは 1種以上 4種以下のぺプチダーゼ の活性が低下または喪失しており、かつ好ましくは 1種以上 5種以下、より好ましくは 1 種以上 3種以下、さらに好ましくは 1種以上 2種以下、特に好ましくは 1種のペプチド 取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
[0080] 該微生物としては、より具体的には、該微生物のゲノム DNA上に存在するぺプチ ダーゼをコードする遺伝子（以下、ぺプチダーゼ遺伝子と略す)およびペプチド取込 み蛋白質をコードする遺伝子（以下、ペプチド取込み蛋白質遺伝子）のうち、 1種以 上のぺプチダーゼ遺伝子の塩基配列および 1種以上のペプチド取込み蛋白質遺伝 子の塩基配列において、該塩基配列の全部または一部が欠失しているため、または 該塩基配列中に塩基の置換または付加があるために該ぺプチダーゼおよび該ぺプ チド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
[0081] ぺプチダーゼの活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置換または付カロ がな 、遺伝子がコードするぺプチダーゼに比べ、ペプチド分解活性が低くなつており 、通常は 80%以下、好ましくは 50%以下、より好ましくは 30%以下、さらに好ましくは 20%以下、特に好ましくは 10%以下、最も好ましくは 5%以下に低下していることを 意味する。
[0082] 微生物のペプチド分解活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中 に共存せしめ、ペプチド分解反応を行った後、残存しているペプチド量を公知の方 法、例えば HPLCなどを用いた分析法によって定量することにより測定することがで きる。
上記べプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれで もよぐ好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジぺプチダーゼ をあげることができる。
[0083] より具体的なぺプチダーゼとしては、例えばェシエリヒア'コリに存在する、配列番号 43で表されるアミノ酸配列を有する PepA、配列番号 44で表されるアミノ酸配列を有 する PepB、配列番号 45で表されるアミノ酸配列を有する PepD、配列番号 46で表さ れるアミノ酸配列を有する PepN、 PepP[GenBank accession no. (以下、 GenBankと略 す） AAC75946]、 PepQ (GenBank AAC76850)、 PepE (GenBank AAC76991)、 PepT (GenBank AAC74211)、 Dcp (GenBank AAC74611)および IadA (GenBank AAC7728 4)など、バチルス'サチリスに存在する AmpS (GenBank AFO 12285)、 PepT (GenBank X99339)、 YbaC (GenBank Z99104)、 YcdD (GenBank Z99105)、 YjbG (GenBank Z99 110)、 YkvY (GenBank Z99111)、 YqjE (GenBank Z99116)、 YwaD (GenBank Z99123) など、コリネバタテリゥム 'グルタミカムに存在する BAB97732、 BAB97858, BAB98080 、 BAB98880、 BAB98892、 BAB99013、 BAB99598および BAB99819 (いずれも日本 D NAデータバンクの登録番号)で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質などをあげるこ とができ、ジぺプチダーゼとしては、配列番号 43〜46で表されるアミノ酸配列を有す る PepA、 PepB、 PepDおよび PepN、並びに PepQ、 PepE, IadAをあげることができる。ま た、配列番号 43〜46のいずれかのアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、 より好ましくは 95%以上の相同性を有し、かつべプチダーゼ活性を有する蛋白質も ジペプチド分解活性が高い蛋白質としてあげることができる。アミノ酸配列や塩基配 列の相同性は、上記した BLASTおよび FASTA等を用いて決定することができる。 [0084] また、ペプチド取込み蛋白質の活性が低下しているとは、上記した塩基の欠失、置 換または挿入がない遺伝子がコードするペプチド取込み蛋白質に比べ、ペプチド取 り込み活性が低くなつており、通常は 80%以下、好ましくは 50%以下、より好ましくは 30%以下、さらに好ましくは 20%以下、特に好ましくは 10%以下、最も好ましくは 5 %以下に低下していることを意味する。
[0085] 微生物のペプチド取り込み活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体 中に共存せしめ、ペプチド取り込み反応を行った後、水性媒体中に残存しているべ プチド量を公知の方法、例えば HPLCなどを用いた分析法によって定量することによ り測定することができる。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体 DNA上でオペロンを形成する遺伝 子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してペプチド取り込み 活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてペプチド取り込み活性を有する 蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与している蛋白質であればいずれでも よぐ好ましくはペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。
[0086] より具体的なペプチド取り込み蛋白質としては、例えばェシエリヒア'コリに存在する 配列番号 47で表されるアミノ酸配列を有する DppA、配列番号 48で表されるアミノ酸 配列を有する DppB、配列番号 49で表されるアミノ酸配列を有する DppC、配列番号 5 0で表されるアミノ酸配列を有する DppD、配列番号 51で表されるアミノ酸配列を有す る DppF、 OppA(GenBank AAC76569)、 OppB (GenBank AAC76568)、 OppC (GenBa nk AAC76567)、 OppD (GenBank AAC76566)、 OppF (GenBank AAC76565)、 YddO (GenBank AAC74556)、 YddP (GenBank AAC74557)、 YddQ (GenBank AAC74558) 、 YddR (GenBank AAC74559)、 YddS (GenBank AAC74560)、 YbiK (GenBank AAC7 3915)、 MppA (GenBank AAC74411)、 SapA (GenBank AAC74376)、 SapB (GenBank AAC74375)、 SapC (GenBank AAC74374)、 SapD (GenBank AAC74373)、および Sap F (GenBank AAC74372)など、バチルス'サチリスに存在する DppA (GenBank CAA40 002)、 DppB (GenBank CAA40003)、 DppC (GenBank CAA40004)、 DppD (GenBank CAA40005)、 DppE (GenBank CAA40006)、 OppA (GenBank CAA39787)、 OppB (G enBank CAA39788)、 OppC (GenBank CAA39789)、 OppD (GenBank CAA39790)、 OppF (GenBank CAA39791)、 AppA (GenBank CAA62358)、 AppB (GenBank CAA6 2359)、 AppC (GenBank CAA62360)、 AppD (GenBank CAA62356)、 AppF (GenBank CAA62357) , YclF (GenBank CAB12175)および YklD (GenBank CAB13157)など、 コリネバタテリゥム 'グルタミカムに存在する BAB99048、 BAB99383、 BAB99384、 BAB 99385、 BAB99713、 BAB99714, BAB99715、 BAB99830、 BAB99831、 BAB99832 (い ずれも日本 DNAデータバンクの登録番号)で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質 などをあげることができ、また、ペプチド取り込み活性が高い蛋白質としては、配列番 号 47〜51で表されるアミノ酸配列を有する DppA、 DppB、 DppC、 DppD、 DppFおよ びそれらいずれかのアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 9 5%以上の相同性を有する蛋白質もペプチド取り込み活性が高いペプチド取り込み 蛋白質としてあげることができる。
[0087] 上記アミノ酸配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて 決定することができる。
3種以上のぺプチダーゼの活性が低下または喪失して 、る微生物としては、該微 生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の 3種以上のぺプチダーゼの活性が低 下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは 3種以上 9種以下、より 好ましくは 3種以上 6種以下、さらに好ましくは 3種または 4種のぺプチダーゼの活性 が低下または喪失している微生物をあげることができる。
[0088] 具体的なぺプチダーゼとしては、上記したェシエリヒア'コリ、バチルス ·サチリスおよ びコリネバクテリウム.ダルタミカムに存在するぺプチダーゼおよびジぺプチダーゼを あげることができる。また、配列番号 43〜46のいずれかのアミノ酸配列と 80%以上、 好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな り、かつべプチダーゼ活性を有する蛋白質もジペプチド分解活性が高 ヽ蛋白質とし てあげることができる。
[0089] 上記アミノ酸配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて 決定することができる。
ぺプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物 は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以 下に示す微生物の染色体 DNAのぺプチダーゼ遺伝子やペプチド取り込み蛋白質 遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。
[0090] 微生物の染色体 DNAの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法と しては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利 用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩 基の欠失等を導入した ヽ宿主細胞内では自
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ヽ薬剤耐性遺伝子を有す るプラスミド DNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげる ことができる。
[0091] 該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標に して相同組換えによって染色体 DNA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形 質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しな!ヽ培地で数時間〜 1 日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、 前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体 DN A上において 2回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体 DNA 上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体
DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認する ことができる。
[0092] 上記方法により、染色体 DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を 導入することができる微生物としては、ェシエリヒア属、バチルス属またはコリネバクテ リウム属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換 えを利用した方法としては、直鎖 DNAを用いた方法をあげることができる。
[0093] 具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖 D NAを細胞内に取り込ませ、染色体 DNAと導入した直鎖 DNAとの間で相同組換え を起こさせる方法である。本方法は、直鎖 DNAを効率よく取り込む微生物であれば、 いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはェシエリヒア属またはバチル ス属に属する微生物、より好ましくはェシエリヒア'コリ、さらに好ましくはえファージ由 来の組換えタンパク質群 (Red組換え系）を発現しているシエリヒア'コリをあげることが できる。
[0094] λ Red組換え系を発現しているェシエリヒア'コリとしては、 λ Red組換え系遺伝子 を有するプラスミド DNAである pKD46 [ェシエリヒア'コリジェネティックストックセンタ 一（米国エール大学)より入手可能]を保有するェシエリヒア'コリ JM101株等をあげる ことができる。
相同組換えに用いられる DNAとしては、
(a)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の 外側に位置する DNAと相同性を有する DNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する 直鎖 DNA、
(b)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の 外側に位置する DNAと相同性を有する DNAを直接連結した DNAを有する直鎖 D NA、
(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両 端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端 の外側に位置する DNAと相同性を有する DNAを有する直鎖 DNA、
(d)上記 (a)の直鎖 DNAにお 、て、薬剤耐性遺伝子と染色体 DNA上の領域の両 端の外側に位置する DNAと相同性を有する DNAの間に、さらに酵母由来の Flp rec ombinase [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5875 (1985)〕が認識する塩基配列を有 する DNA、
をあげることができる。
[0095] 薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付 与する薬剤耐性遺伝子であれば、 ヽずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる 。宿主微生物にェシエリヒア'コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば 、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフエ-コール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺 伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリ ン耐性遺伝子等をあげることができる。
[0096] ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を 発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のこ とをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来の^遺伝子〔
Appl. Environ. Microbiol, 59, 1361- 1366 (1993)〕、およびェシエリヒア属に属する微 生物由来の 遺伝子 [Genomics, 72, 99-104(2001)〕等をあげることができる。
[0097] 上記の直鎖 DNAの両末端に存在する、染色体 DNA上の置換または欠失の導入 対象となる領域の両端の外側に位置する DNAと相同性を有する DNAは、直鎖 DN Aにおいて、染色体 DNA上の方向と同じ方向に配置され、その長さは 10bp〜100bp 程度が好ましぐ 20bp〜50bp程度がより好ましぐ 30〜40bp程度がさらに好ましい。 酵母由来の Flp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組 換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号 52で 表される塩基配列を有する DNA、および該 DNAにお ヽて 1個〜数個の塩基が欠失 、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来の Hp recombinaseが認識し 、相同組換えを触媒する塩基配列を有する DNAをあげることができる。
[0098] 相同性を有するとは、上記直鎖 DNAが、染色体 DNA上の目的とする領域におい て、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては 、 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 100% の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて決定 することができる。
[0099] 上記直鎖 DNA断片は、 PCRにより作製することができる。また上記直鎖 DNAを含 む DNAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖 DNAを得る ことちでさる。
微生物の染色体 DNAに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、 以下の方法 1〜4があげられる。
方法 1：上記 (a)または (d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に 該直鎖 DNAが染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択す る方法。
方法 2：上記方法 1により取得された形質転換株に、上記 (b)の直鎖 DNAを導入し、 該方法により染色体 DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物 の染色体 DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法 3 :
[ 1 ]上記 (c)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体 DNA上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置する DNAと 相同性を有する DNAを、染色体 DNA上における方向と同一の方向で連結した DN Aを合成し、上記 [1]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、 上記 [2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬 剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体 D NA上から削除された株として選択する方法。
方法 4 :
[ 1 ]上記 (d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記 [ 1 ]で得られた形質転^ に Hp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入 し、該遺伝子を発現させた後、上記 [1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する 方法。
[0100] 上記方法で用いられる、直鎖 DNAを宿主微生物に導入する方法としては、該微生 物へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムィ オンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（ 特開昭 63- 248394)、エレクト口ポレーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕 等をあげることができる。
[0101] 方法 2または方法 3 [2]で用いられる直鎖 DNAにおいて、該 DNAの中央部付近に 、染色体 DNA上に挿入した 、任意の遺伝子を組み込んだ直鎖 DNAを用いることに より、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体 DNA上に 挿人することができる。
上記方法 2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体 DNA上には薬剤耐 性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子 を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およ びネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り 返すことにより、容易に染色体 DNA上の位置の異なる 2以上の領域に塩基の欠失、 置換または付加を有する微生物を製造することができる。
5.本発明に用いられる蛋白質の製造法
上記 4の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明に用いら れる蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することにより、該蛋白 質を製造することができる。
[0102] 本発明に用いられる蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、原 核生物および酵母等の微生物、動物細胞、昆虫細胞等または植物細胞等いずれで あってもよぐ好ましくは微生物、より好ましくは原核生物、さらに好ましくは細菌、特 に好ましくはェシエリヒア属に属する細菌、最も好ましくはェシエリヒア 'コリをあげるこ とがでさる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の 方法に従って行うことができる。
[0103] エシ リヒア 'コリ等の原核生物および酵母等の真核生物を宿主細胞として得られた 微生物の形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素 源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然 培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース 、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭 水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール 類等を用いることができる。
[0104] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。 [0105] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9 .0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行う。
[0106] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 k£プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル一 β —D—チォガラタトピラノシド等を、 imプロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添カ卩してもよい。
[0107] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI1640培地 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle)の MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、 DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959)]、 199培 地 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した 培地等を用いることができる。
[0108] 培養は、通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
2
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生 物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地 (ファーミンジェン社製)、 Sf-900 II SFM培地（ライフ'テクノロジ ーズ社製）、 ExCell400、 ExCell405 [いずれも JRHバイオサイエンシーズ社製]、 Grace' s Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
[0109] 培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で 1〜5日間行う。 また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこ れら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いるこ とがでさる。
[0110] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
上記のとおり、本発明に用いられる DNAを発現ベクターに連結した組換え体 DNA を保有する微生物、昆虫細胞、動物細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方法に従って培養し、本発明で用いられる蛋白質を生成、蓄積させ、該 培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
[0111] 本発明で用いられる蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿主細胞、および生産させる蛋白質の構造を変えることにより上記方法を 選択することができる。
本発明で用いられる蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される 場合、ポールソンらの方法 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、または特 開平 05-336963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿 主細胞外に積極的に分泌させることができる。
[0112] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋 白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿 主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。 [0113] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分ィ匕させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジエニック非ヒト動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。 本発明で用いられる蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の 場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成、蓄積させ、該 動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造するこ とがでさる。
[0114] 動物個体を用いて本発明で用いられる蛋白質を製造する方法としては、例えば公 知の方法 [Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996)、 Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996)、 Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に該蛋白 質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明に用いられる DNAを導入したトランスジェ-ッ ク非ヒト動物を飼育し、本発明に用いられる蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該 動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物 中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク (特開昭 63- 309192)、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物 で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的な プロモーターである aカゼインプロモーター、 /3カゼインプロモーター、 j8ラタトグロブ リンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
[0115] 植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明で用い られる蛋白質をコードする DNAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織 培養， 20 (1994)、組織培養， 21 (1995)、 Trends BiotechnoL, 15, 45 (1997)]に準じて 栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取する ことにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
[0116] 本発明で用いられる蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された該蛋白質を 単離'精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。 例えば、本発明に用いられる蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には 、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕 機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕 し、無細胞抽出液を得る。
[0117] 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジ ェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製)等レジ ンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF (フアルマシア社製)等 のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセ ファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過 法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動 等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることが できる。
[0118] また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回 収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋 白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。 該可溶化液を、 蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度 に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後 、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
[0119] 本発明に用いられる蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌され た場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収すること ができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性 画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精 製標品を得ることができる。
[0120] このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号 1〜8、 37および 38のい ずれかで表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明に用いられる蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合 した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたァフィユティークロマトグラフィーを利用して 精製することちでさる。 [0121] 融合させる蛋白質としては、 β -ガラタトシダーゼ、プロテイン Α、プロテイン Αのィム ノグロブリン G結合領域、クロラムフエ-コール'ァセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Arg )、ポリ（Glu)、プロテイン G、マルトース結合タンパク質、グルタチオン S-トランスフエ ラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag)、 Sペプチド、 DNA結合タンパク質ドメイン、 Tac 抗原、チォレドキシン、グリーン 'フルォレツセント'プロテイン、 FLAGペプチド、およ び任意の抗体のェピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学， 13, 469-474 (19 95)〕。
[0122] 上記した融合させる蛋白質に親和性をもつ物質としては、 β -ガラタトシダーゼ、プ 口ティン Α、プロテイン Αのィムノグロブリン G結合領域、クロラムフエ-コール'ァセチ ルトランスフェラーゼ、ポリ（Arg)、ポリ（Glu)、プロテイン G、マルトース結合タンパク 質、グルタチオン S-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag)、 Sペプチド、 DN A結合タンパク質ドメイン、 Tac抗原、チォレドキシン、グリーン 'フルォレツセント'プロ ティン、 FLAGペプチドまたは任意の抗体のェピトープを認識する抗体、例えばィム ノグロブリン Gなどをあげることができる。
[0123] 具体的には、本発明に用いられる蛋白質をプロテイン Aとの融合タンパク質として 生産した場合には、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 Gen es Develop., 4, 1288 (1990)]、特開平 5- 336963、 WO94/23021に記載の方法など、
Flagペプチドとの融合蛋白質として生産した場合は、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8
6, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)などに記載の方法に準じて融合蛋 白質を精製することができる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたァフィ-テ ィークロマトグラフィーで精製することもできる。
[0124] 上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、 Fmoc法 (フルォレニルメチ ルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法 により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、 Advanced ChemTech社、ノ ~" ン，ェルマ^ ~"社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 Synthecel Ve ga社、 PerS印 tive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することも できる。
6.本発明のジペプチド誘導体の製造法 (1)酵素的製造法
ジペプチド誘導体の酵素的製造法としては、 i)上記 1の蛋白質、 1種以上のアミノ酸 またはアミノ酸誘導体、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジぺプ チドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまた はジペプチド誘導体 (PI)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘 導体 (PI)の製造法、および ii)上記 1の蛋白質、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジぺプ チド誘導体 (PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体力 該ジペプチドまたは ジペプチド誘導体 (PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を 修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)を生成させ、該ジペプチドまたは ジペプチド誘導体 (ΡΠ)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘 導体 (ΡΠ)の製造法をあげることができる。
[0125] ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を公知の有機合成の手法等を用いて修飾 することによりジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)を製造することができる。 上記製造法において、基質に用いられる 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体 は、上記 1の蛋白質の基質になるアミノ酸またはアミノ酸誘導体であればいずれのァ ミノ酸およびアミノ酸誘導体を用いてもょ ヽ。
[0126] 上記アミノ酸またはアミノ酸誘導体としては、式 (I)
[0127] [化 13]
Figure imgf000049_0001
[0128] (式中、
Figure imgf000049_0002
Rla、 Rlb、 R2aおよび R2。はそれぞれ前記と同義である）または式 (II)
[0129] [化 14]
Figure imgf000050_0001
[0130] [式中、 n2、 R3a、 R3b、 R4及び R5はそれぞれ前記と同義である]で表されるアミノ酸また はアミノ酸誘導体 [但し、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (I)のみである とき、 Rla及び Rlbの少なくとも一方は水素原子であり、 1種以上のアミノ酸またはァミノ 酸誘導体が式 (II)のみであるとき、 R5はヒドロキシである]をあげることができ、好ましく は式 (ΠΙ)
[0131] [化 15]
Figure imgf000050_0002
[0132] (式中、 Rle、 Rla、 R2eおよび はそれぞれ前記と同義である）または式 (IV)
[0133] [化 16]
Figure imgf000050_0003
(式中、 R 、 R3d及び R5はそれぞれ前記と同義である）で表されるアミノ酸またはァミノ 酸誘導体 [但し、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (III)のみであるとき、 Rle及び Rldの 少なくとも一方は水素原子であり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (IV)のみである とき、 R5はヒドロキシである]をあげることができ、より好ましくは式 (V) [0135] [化 17]
Figure imgf000051_0001
[0136] (式中、 R ま前記と同義である）または式 (VI)
[0137] [化 18]
Figure imgf000051_0002
[0138] (式中、 R ま前記と同義である）で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体をあげること ができる。
上記製造法で製造されるジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)としては式 (Vila)
[0139] [化 19]
Figure imgf000051_0003
[0140] (式中、 n n R6a、 R6b、 R7a、 R7b、 R 、 R9a、 R9。および R1Qaはそれぞれ前記と同義であ る）で表されるジペプチド誘導体をあげることができ、好ましくは式 (Villa)
[0141] [化 20]
Figure imgf000052_0001
(Villa)
[0142] (式中、 R6e、 R6d、 R7e、 R7d、 R9 R9dおよび R1Qaはそれぞれ前記と同義である)で表される ジペプチド誘導体をあげることができ、より好ましくは式 (IXa)
[0143] [化 21]
Figure imgf000052_0002
[0144] (式中、 R7eおよび R9eはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド誘導体をあ げることができる。
上記製造法で製造されるジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)としては式 (Vllb
)
[0145] [化 22]
[0146] (式中、 η3Α、 ι R6A、 R6B、 R7A、 R7B、 R8A、 R9A、 R9Bおよび R1()Aはそれぞれ前記と同義で ある）で表されるジペプチド誘導体をあげることができ、好ましくは式 (Vlllb)
[0147] [化 23]
Figure imgf000053_0001
[0148] (式中、 R6e、 R6D、 R7e、 R7D、 R9 R9Dおよび R1QAはそれぞれ前記と同義である）で表され るジペプチド誘導体をあげることができ、より好ましくは式 (IXb)
[0149] [化 24]
Figure imgf000053_0002
(IXb)
[0150] (式中、 R7Eおよび R9Eはそれぞれ前記と同義である）で表されるジペプチド誘導体をあ げることができる。但し、 L-ァラニン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、 L-パリン、 L-ロイ シン、 L-イソロイシン、 L-プロリン、 L-フエ二ルァラニン、 L-トリプトファン、 L-メチォ二 ン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-システィン、 L-ァスパラギン、 L-チロシン、 L-リジン、 L -アルギニン、 L-ヒスチジン、 L-ァスパラギン酸、 L- α -ァミノ酪酸、 L-ァザセリン、 L- テアニン、 L- 4-ヒドロキシプロリン、 L- 3-ヒドロキシプロリン、 L-オル二チン、 L-シトルリ ン、 L-6-ジァゾ -5-ォキソノルロイシン、グリシンおよび j8—ァラニンから選ばれる同 一のまたは異なるアミノ酸がペプチド結合したィヒ合物はジペプチド誘導体から除く。
[0151] 式（I)〜（VI)、 (Vila)ゝ (Vllb)、（Villa)、（Vlllb)、（IXa)及び（IXb)の各基の定義に おいて、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノィル、低級アルコキシカルボ -ル、モノ (低級アルキル)ァミノ及びジ (低級アルキル)ァミノの低級アルキル部分とし ては例えば炭素原子数 1から 10の直鎖状、分枝鎖状、環状またはこれらの組み合わ せ力もなるアルキルがあげられ、より具体的には、直鎖または分枝鎖状のアルキルと しては、例えばメチル、ェチル、 n-プロピル、イソプロピル、 n-ブチル、イソブチル、 se c-ブチノレ、 tert-ブチノレ、 n-ペンチノレ、ネオペンチノレ、 n-へキシノレ、 n-へプチノレ、 n-ォ クチル、 n-ノニル、 n-デシル等が挙げられ、環状のアルキルとしては、例えばシクロプ ロピノレ、シクロブチノレ、シクロペンチノレ、シクロへキシノレ、シクロへプチノレ、シクロオタ チル、シクロデシル、ノルァダマンチル、ァダマンチル、ビシクロ [2.2.1]ヘプチル、ビ シクロ [2.2.2]ォクチル、ビシクロ [3.3.0]ォクチル、ビシクロ [3.3.1]ノ-ル等があげられ、 直鎖または分枝鎖状と環状との組み合わせ力 なるアルキルとしては、例えばシクロ プロピルメチル、シクロペンチルメチル、シクロォクチルェチル等があげられる。なお、 ジ (低級アルキル)ァミノにおける 2つの低級アルキル部分は同一でも異なっていても よい。
[0152] 低級ァルケ-ルとしては、例えば炭素原子数 2から 10の直鎖または分枝鎖状のアル ケ-ルが挙げられ、より具体的にはビュル、ァリル、 1-プロべ-ル、 1-ブテニル、 3-ブ テ-ノレ、 2-ペンテ-ノレ、 4-ペンテ-ノレ、 2-へキセ-ノレ、 5-へキセ-ノレ、 2-デセ-ノレ、 9 -デセニル等があげられる。
低級アルキニルとしては、例えば炭素原子数 2から 10の直鎖または分枝鎖状のアル キ-ルが挙げられ、より具体的にはェチュル、 2-プロビュル、 3-ブチュル、 4-ペンチ -ル、 5-へキシュル、 9-デシ-ル等があげられる。
[0153] ァリール、ァラルキル及びァロイルのァリール部分としては、例えば単環性または 2 つ以上の環が縮合した縮環性のァリール、より具体的には、環構成炭素原子数が 6 から 14のァリール、例えばフエ-ル、ナフチル、インデュル、アントラ-ル等があげら れる。
脂環式複素環基としては、例えば単環性または 2つ以上の環が縮合した縮環性の 脂環式複素環基があげられ、脂環式複素環基に含まれるヘテロ原子の種類及び個 数は特に限定されないが、例えば窒素原子、硫黄原子及び酸素原子からなる群から 選ばれるヘテロ原子を 1または 2個以上含んでいてもよぐより具体的には、例えばピ ロリジニル、 2,5-ジォキソピロリジニル、チアゾリジニル、ォキサゾリジニル、ピペリジル 、 1,2-ジヒドロピリジル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリ ニル、ビラゾリニル、ォキサゾリニル、ジォキソラニル、テトラヒドロビラニル、テトラヒドロ チォピラエル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒ ドロキノキサリニル、ォクタヒドロキノリル、ジヒドロインドリル、 1,3-ジォキソイソインドリニ ル等があげられる。
[0154] 複素環アルキルの複素環基部分としては、例えば芳香族複素環基、脂環式複素環 基等があげられ、芳香族複素環基としては、例えば単環性または 2つ以上の環が縮 合した縮環性の芳香族複素環基があげられ、芳香族複素環基に含まれるヘテロ原 子の種類及び個数は特に限定されないが、例えば窒素原子、硫黄原子及び酸素原 子力もなる群力も選ばれるヘテロ原子を 1または 2個以上含んでいてもよぐより具体 的には、環構成原子数 5から 14の芳香族複素環基、例えばフリル、チェニル、ピロリ ル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリァゾリル、テトラゾリル、ォキサゾリル、ォキサジァゾリ ル、チアゾリル、ピリジル、ピラジュル、ピリミジ -ル、ピリダジ -ル、トリアジ-ル、インド リル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾォキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノリ ル、イソキノリル、フタラジュル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノ リニル、プリ-ル、タマリ-ル等があげられる。また、脂環式複素環基は前記と同義で ある。
[0155] ァラルキル及び複素環アルキルのアルキレン部分は、前記低級アルキルのうち、直 鎖または分枝鎖状のアルキル力 水素原子を一つ除いたものと同義である。
隣接する窒素原子および該窒素原子に隣接する炭素原子と一緒になつて形成さ れる複素環基、ならびに隣接する炭素原子および該炭素原子に隣接する窒素原子 と一緒になつて形成される複素環基としては、例えば少なくとも 1個の窒素原子を含 む 5員または 6員の単環性脂環式複素環基 (該単環性脂環式複素環基は、他の窒素 原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）、 3〜8員の環が縮合した二環 または三環性で少なくとも 1個の窒素原子を含む縮環性複素環基 (該縮環性複素環 基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい)等があげられ、 より具体的にはピロリジ -ル、ピペリジル、ピペラジ -ル、モルホリニル、チオモルホリ ニル、ホモピベリジニル、ホモピペラジニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロキノリル、 テトラヒドロイソキノリル等があげられる。
[0156] 置換低級アルキル、置換低級アルケニル、置換低級アルキニル、置換低級アルコ キシ、置換低級アルカノィル、置換低級アルコキシカルボニル、置換ァラルキル、置 換ァリール、置換ァロイル、置換複素環アルキル、モノ (置換低級アルキル)アミ入低 級アルキル (置換低級アルキル)アミ入ジ (置換低級アルキル)ァミノならびに隣接する 窒素原子および該窒素原子に隣接する炭素原子と一緒になつて形成される置換複 素環基、ならびに隣接する炭素原子および該炭素原子に隣接する窒素原子と一緒 になって形成される置換複素環基における置換基としては、同一または異なって置 換数 1から置換可能な数の、好ましくは置換数 1〜3の、例えばハロゲン、アミ入ニトロ 、ヒドロキシ、メルカプト、グァ-ジノ、ウレイド、シァ入ホルミル、カノレボキシ、アミノカ ルボニル、ジァゾァセチル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノィル、低級 アルコキシカルボ-ル、モノもしくはジ (低級アルキル)ァミノカルボ-ル、低級アルキ ルチオ、ァリール、ァラルキル、ァロイル、複素環カルボ-ル等があげられる。ここで 低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノィル及び低級アルコキシカルボニルの 低級アルキル部分、ァリール、ァラルキル及びァロイルのァリール部分ならびにァラ ルキルのアルキレン部分はそれぞれ前記と同義であり、モノもしくはジ (低級アルキル) ァミノカルボ-ル及び低級アルキルチオにおける低級アルキル部分は前記低級アル キルと同義であり、複素環カルボニルにおける複素環基部分は、前記複素環アルキ ルにおける複素環基部分と同義であり、ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各 原子を表す。なお、ジ (低級アルキル)ァミノカルボ-ルにおける 2つの低級アルキル 部分は同一でも異なって ヽてもよ ヽ。
[0157] 上記アミノ酸またはアミノ酸誘導体として、好ましくは L—アミノ酸、グリシンの )お よび j8—ァラニン（β Ala)およびそれらの誘導体力 なる群より選ばれるアミノ酸また はアミノ酸誘導体をあげることができる。 L—アミノ酸としては、例えば L—ァラニン (L- Ala)、 L—グルタミン（L- Gin)、 L—グルタミン酸（L- Glu)、 L—パリン（L- Val)、 L一口 イシン（L- Leu)、 L—イソロイシン（L- lie)、 L—プロリン（L- Pro)、 L—フエ-ルァラニン (L- Phe)、 L—トリプトファン（L- Trp)、： L—メチォニン（L- Met)、 L—セリン（L- Ser)、 L —スレオ-ン（L- Thr)、 L システィン（L- Cys)、 L ァスパラギン（L- Asn)、 L—チロ シン（L-Tyr)、 L リジン（L-Lys)、 L アルギ-ン（L-Arg)、 L ヒスチジン（L- His)、 Lーァスパラギン酸（L- Asp)、 L aーァミノ酪酸（L- α - AB)、 L ァザセリン（L- Az aserine)、 L テア-ン（L- theanine)、 L— 4—ヒドロキシプロリン（L- 4- HYP)、 L— 3— ヒドロキシプロリン（L- 3- HYP)、 L—オル-チン（L-Orn)、 L シトルリン（L- Cit)およ び L 6—ジァゾ -5-ォキソノルロイシン（L- 6- diazo- 5- OXO- norleucine)などをあげる ことができる。
また、上記製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸またはアミノ酸誘導体としては 、 L- Ala、 Gly、 L- Met、 L- Ser、 L- Thrおよび j8 - Alaから選ばれる 1種のアミノ酸または その誘導体と L- Ala、 L-Gln, L- Glu、 Gly、 L- Val、 L-Leu, L- Ile、 L- Pro、 L- Phe、 L-Tr pゝ L— Metゝ L— Ser、 L— Thr、 L— Cys、 L— Asn、 L-Tyr, L-Lys, L— Arg、 L— His、 L— Asp、 L— — AB、 β—Alaゝ L— Azaserineゝ L— theanineゝ L— 4— HYPゝ L— 3— HYP、 L— Orn、 L— Citお よび L- 6- diazo- 5- oxo- norleucineから選ばれる 1種のアミノ酸またはその誘導体との 組み合わせ、 L-Glnまたはその誘導体と L-Pheまたはその誘導体との組み合わせ、お よび L- a -ABまたはその誘導体と L-Gln、 L-Argおよび L- a -ABから選ばれる 1種の アミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、さらに好ましくは L-Alaまたはその誘導体 と L— Ginゝ Glyゝ L— Val、 L— Leuゝ L— Ile、 L— Pheゝ L— Trpゝ L— Metゝ L— Serゝ L— Thrゝ L-Cys 、 L- Asn、 L- Tyr、 L- Lys、 L- Arg、 L- His、 L- a - AB、 L- Azaserine、 L- Citおよび L- th eanine力 選ばれる 1種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、 Glyまたはその 誘導体と L— Gln、 Gly, L— Phe、 L— Trp、 L— Met、 L— Ser、 L— Thr、 L— Cys、 L-Tyr, L-Lys 、 L-Arg、 L- a -ABおよび L-Citから選ばれる 1種のアミノ酸またはその誘導体との組 み合わせ、 L- Metまたはその誘導体と L- Phe、 L- Met、 L- Ser、 L- Thr、 L- Cys、 L-Tyr 、 L-Lysおよび L-Hisから選ばれる 1種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、 L- Serまたはその誘導体と L- Gln、 L- Phe、 L- Ser、 L- Thr、 L-Tyr, L- Hisおよび L- a - ABから選ばれる 1種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、 L-Thrまたはその 誘導体と L- Gln、 L-Phe, L- Leu、 L- Thrおよび L- α -ABから選ばれる 1種のアミノ酸ま たはその誘導体との組み合わせ、 L-Glnまたはその誘導体と L-Pheまたはその誘導 体との組み合わせ、 β -Alaまたはその誘導体と L- Phe、 L-Met、 L- Hisおよび L- Citか ら選ばれる 1種のアミノ酸またはその誘導体との組み合わせ、および L- a -ABまたは その誘導体と L-Gln、 L-Argおよび L- a -ABから選ばれる 1種のアミノ酸またはその誘 導体との組み合わせをあげることができる。
[0159] 上記製造法において、本発明に用いられる蛋白質は、基質として用いるアミノ酸ま たはアミノ酸誘導体 lmgあたり 0.01〜100mg、好ましくは 0.1mg〜10mg添加する。 上記製造法において、基質として用いるアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、 0.1〜500 g/L、好ましくは 0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中 に添カ卩する。
[0160] 上記製造法において、エネルギー源として用いる ATPは、 0.5mmol〜10mol/Lの濃 度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチド誘導体の生成反応を阻害 しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよぐ例えば、水、りん酸塩、 炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クェン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる 。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸ェチルなどのエステル類、 アセトンなどのケトン類、ァセトアミドなどのアミド類を含有して 、てもよ！/、。
[0161] ジペプチドの生成反応は水性媒体中、 pH5〜l l、好ましくは pH6〜10、 20〜50°C、 好ましくは 25〜45°Cの条件で 2〜150時間、好ましくは 6〜120時間行う。
(2)細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる製造法
細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法 としては、 i)上記 4で得られる細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用 い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒体中に存在せしめ 、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成、蓄積させ、該媒 体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を採取することを特徴とするジぺ プチドまたはジペプチド誘導体 (PI)の製造法、および ii)細胞の培養物または該培養 物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を 水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI )を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体力 該ジペプチドまたはジペプチド誘導 体 (PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を修飾し、ジぺプ チドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導 体 (ΡΠ)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)の製造 法をあげることができる。
[0162] ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を公知の有機合成の手法等を用いて修飾 することによりジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)生成することができる。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸およびアミノ酸誘導体の種類、使 用濃度および添加時期、並びに生産されるジペプチドは、上記 6の（1)の酵素的製 造法のものと同様である。
[0163] 培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離 して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤 処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理 物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該 菌体より抽出して得られる酵素標品であり、かつ 1以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導 体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する処理物などをあ げることができる。
[0164] また、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源とした製造法において用 いられる水性媒体としては、上記 6の（1)の酵素的製造法に用いられる水性媒体に 加え、酵素源として用いた細胞の培養液も水性媒体として用いることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、 ATPの供給源として、 ATPまたは細 胞が代謝して ATPを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノール のようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができ る。
[0165] さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよ い。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン'ォクタデシルァミン (例えばナイミーン S -215、 日本油脂社製)などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモ -ゥム 'ブ ロマイドやアルキルジメチル.ベンジルアンモ -ゥムクロライド（例えばカチオン F2- 40 E、 日本油脂社製)などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル'ザルコシネートなどの ァ-オン系界面活性剤、アルキルジメチルァミン (例えば三級アミン FB、 日本油脂社 製)などの三級アミン類など、有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコー ル、アセトン、酢酸ェチルなどをあげることができ、本発明の製造法に用いる細胞力 アミノ酸またはアミノ酸誘導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活 性を有する限りにお 、て 、ずれを用いてもよぐ 1種または数種を混合して使用する こともできる。界面活性剤および有機溶媒の種類および濃度は、本発明に用いられ る細胞が上記活性を有する範囲にぉ 、て任意に選ぶことができ、例えば界面活性剤 は、通常 0. 1〜50 g/1の濃度で用いられ、有機溶剤は、通常 0.1〜50 ml/1の濃度で用 いられる。
[0166] 細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量 は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸または アミノ酸誘導体 lmgあたり湿細胞重量として 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg添加す る。
ジペプチドまたはジペプチド誘導体の生成反応は水性媒体中、 pH5〜ll、好ましく は pH6〜10、 20〜65°C、好ましくは 25〜55°C、より好ましくは 30〜45°Cの条件で通常 1 分間〜 150時間、好ましくは 3分間〜 120時間、より好ましくは 30分間〜 100時間行う。
[0167] 上記 6の（1)または（2)の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジぺプチ ドまたはジペプチド誘導体の採取は、活性炭やイオン交換榭脂などを用いる通常の 方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロ マトグラフィ一等により行うことができる。
(3)ジペプチドまたはジペプチド誘導体を修飾することによるジペプチド誘導体の製 造法
上記 6の（1)または（2)の製造法にぉ 、て得られたジペプチドまたはジペプチド誘 導体を、公知の有機合成反応 [例えば、コンプリへンシブ 'オーガニック 'トランスフォ ~~メ ~~ンヨンズ (Comprehensive urganic Transformations)、 R.し.フロック (LarockJ着 、（1989年)等参照]またはそれらに準じた方法に付すことによって種々のジペプチド 誘導体を得ることができる。
[0168] 上記製造法における生成物の単離、精製は、通常の有機合成で用いられる方法、 例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み 合わせて行うことができる。
以下に実験例を示し、本発明に用いられる DNA、蛋白質および細胞の調製方法 を説明するが、該調製方法は下記実験例に制限されるものではない。
実験例 1 データベースを利用したジペプチド合成活性を有する蛋白質の検索 バチルス'サチリス 168株由来の D-Ala-D-Alaリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列 [Nat ure, 390, 249-256 (1997) ]をクエリーとして、バチルス'サチリス 168株のゲノム DNA のデータベースである Subtilist(http：〃 genolist.pasteur.fr/SubtiList/)のホモロジー検 索機能を用いて、バチルス'サチリス 168株のゲノム DNA配列中に存在する相同性 を有する蛋白質をコードする遺伝子を検索した。
[0169] その結果抽出された配列のうち、 D-Ala-D-Alaリガーゼモチーフ [Biochemistry, 30 , 1673 (1991) ]である配列番号 33、 34または 35で表されるアミノ酸配列をコードし、 かつ既にその機能が同定されている蛋白質をコードする遺伝子を排除したもののうち 、 D-Ala-D-Alaリガーゼモチーフと最も高い相同性 (29.1%)を示すものとして機能未 知遺伝子 γ Εを選択した。
[0170] ； mffiの塩基配列を配列番号 9、該塩基配列にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を 配列番号 1に示した。
実験例 2 y^遺伝子発現株の造成
実験例 1で得られた塩基配列情報に従い、バチルス ·サチリスの; mffi遺伝子断片を 以下のようにして取得した。
[0171] まず、バチルス'サチリス 168株（ATCC 23857)を LB培地 [lOg/1バタトトリプトン（デ ィフコ社製）、 5g/lイーストエキス (ディフコ社製）、 5g/l塩ィ匕ナトリウム]に植菌し 30°C で一晚静置培養した。培養後、カレント 'プロトコールズ'イン'モレキユラ一'バイオ口 ジ一に記載の飽和フ ノールを用いる方法により、該微生物の染色体 DNAを単離 精製した。
[0172] パーセプティブ'バイオシステムズ（Perseptive Biosystems)社製 8905型 DNA合成 機を用いて、配列番号 19〜22で表される塩基配列を有する DNA (以下、それぞれ プライマー A、プライマー B、プライマー Cおよびプライマー Dと呼ぶ）を合成した。プ ライマー Aは、バチルス'サチリスの染色体 DNAの: mffiの開始コドンを含む領域の 5' 末端に 20i2l認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマー Bは、 vwffiの 終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の 5'末端に β ΐΗΙ認識配列を含む塩基 配列を付加したも
のである。またプライマー Cは、 1mプロモーターを含む発現ベクター pTrS30 [ェシエリ ヒア'コリ JM109/pTrS30(FERM BP- 5407)より調製]の imプロモーター領域の塩基配 列の 5'末端に E^RI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマー Dは 、lmプロモーターを含む発現ベクター pTrS30の lmプロモーター領域の配列と相補 的な配列の 5'末端に 1認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
[0173] ； mffi遺伝子断片の増幅には上記のプライマー Aおよびプライマー B、铸型としてバ チルス ·サチリスの染色体 DN Aを用 、、 1mプロモーター領域の断片の増幅にはプラ イマ一 Cおよびプライマー D、铸型として pTrS30を用いて PCRを行った。 PCRは、铸 型として 0.1 μ gの染色体 DNAまたは 10ngの pTrS30、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2. 5 unitsの Efii DNAポリメラーゼ (ストラタジーン社製)、 4 μ Lの Efii DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液 (ストラタジーン社製)、各 200 mol/Lの dNTP(dATP、 dGTP、 dCTPおよび d TTP)を含む反応液 Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間のェ 程を 30回繰り返すことにより行った。
[0174] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、プライマー Aおよびプライマー B を用 、た PCRでは y^遺伝子断片に相当する約 1.4kb、プライマー Cおよびプライマ 一 Dを用いた反応では imプロモーター領域の DNA断片に相当する約 0.3kbの DNA 断片がそれぞれ増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量の TE[10 mmol/ L Tris- HCl(pH8.0)、 lmmol/L EDTA]飽和フエノール/クロ口ホルム（lvol/lvol)溶液 を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷エタノー ルを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して DNAを沈殿さ せた後、該 DNAを Lの TEに溶解した。
[0175] 該溶解液それぞれ 5 μ Lを用い、プライマー Αおよびプライマー Βで増幅した DNA を制限酵素02lおよび S lHIで、またプライマー Cおよびプライマー Dで増幅した D NAを制限酵素 EcoRIおよび Xholで切断し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断 片を分離した後、ジーンクリーン IIキット（GENECLEAN II kit, BIO 101社製）を用い て、 ^を含む 1.4kbおよび lmプロモーター領域を含む 0.3kbの DNA断片をそれぞ れ回収した。
[0176] 1mプロモーターを含む発現ベクター pTrS30 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS30(FER M BP- 5407)より調製] 0.2 μ gを制限酵素 E^RIおよび ^ΗΙで切断後、ァガロースゲ ル電気泳動により DNA断片を分離し、上記と同様の方法により 4.5kbの DNA断片を 回収した。
上記で得られた y Eを含む 1.4kb断片、 lmプロモーター領域を含む 0.3kb断片およ び 4.5kbの断片をライゲーシヨンキット (タカラノィォ社製)を用いて、 16°Cで 16時間反 応させ連結した。
[0177] 該反応液を用いてェシエリヒア'コリ NM522株 (ストラタジーン社製）を、カルシウムィ オンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]によって形質転換 した後、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°Cでー晚培養し た。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてその構造を解析することにより、 imプロモーター下流に; mffiが連結 された発現ベクターである PPE43が取得されていることを確認した（図 1)。
実験例 3 ジペプチドの生産
実験例 2で得られた pPE43を保有するェシエリヒア'コリ NM522 (ェシエリヒア'コリ N M522/pPE43株）を 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地が入った太型試験 管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
[0178] 終濃度 60mg/mlの該湿菌体、 120mmol/Lのリン酸カリウムバッファー（pH7.4)、 60m mol/Lの塩化マグネシウム、 60mmol/Lの ATP、 30mmol/Lの L- Ala、 30mmol/Lの L- Gl n、 0.4%のナイミーン S— 215からなる 0.1mlの反応液を調製し、 37°Cで 3分間反応を 行った。
反応終了後、反応生成物をジニトロフエノール化法で誘導体化した後に HPLC法に より分析した。 HPLC法による分析は、分離カラムに関東ィ匕学社製の Lichrosorb- RP- 18カラムを用い、溶離液として 1%(ν/ν)リン酸、 25%(v/v)ァセトニトリルを用い、 0.7ml /分の流動速度で行った。その結果反応液中に 120mg/Lの L -ァラ-ル— L—グルタ ミン（L-Ala-L-Gln)が生成蓄積して 、ることを確認した。
[0179] 対照菌株であるベクターのみを含むェシエリヒア'コリ NM522/pTrS31株の菌体では L-Ala-L-Glnの生成は認められなかった。
実験例 4 C末端 Hisタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
上記 DNA合成機を用いて、配列番号 23および 24で表される塩基配列を有する D NA (以下、それぞれプライマー E、プライマー Fと呼ぶ）を合成した。プライマー Eは、 y Eの開始コドン (atg)を ml認識配列（cc^gg)に置換した領域を含む塩基配列で ある。プライマー Fは、 γ Εの終止コドンを ^ lHI認識配列（gg tcc)に置換した領域 を含む塩基配列である。
[0180] バチルス ·サチリス 168株（ATCC 23857)の染色体 DNAを铸型とし、上記プライマ 一 Eおよびプライマー Fをプライマーセットとして用いて PCRを行った。 PCRは、 0.1 μ gの染色体 DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2.5 unitsの Efii DNAポリメラーゼ、 4 μ Lの DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液、 200 μ mol/Lの各 dNTPを含む反応液 40 μ L を調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間の工程を 30回繰り返すことによ り行った。
[0181] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、； mffi断片に相当する約 1.4kbの 断片が増幅して 、ることを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール/クロロホ ルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷 エタノールを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られ た DNAの沈殿を 20 μ Lの ΤΕに溶解した。
[0182] 該溶解液 5 μ Lを用い、増幅した DNAを制限酵素 および HIで切断し、ァガ ロースゲル電気泳動により DNA断片を分離した後、ジーンクリーン IIキットを用いて、 y Eを含む 1.4kbの DNA断片を回収した。
C末端 Hisタグ付加型組換え体発現ベクター pQE60 (キアゲン社製) 0.2gを制限酵 素 21および β ΐΗΙで切断後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 上記と同様の方法により 3.4kbの DNA断片を回収した。
[0183] 上記で得られた ywffiを含む 1.4kbの DNA断片と 3.4kbの DNA断片をライゲーシヨン キットを用いて、 16°Cで 16時間反応させ連結した。
該連結反応液を用 V、てェシエリヒア ·コリ NM522株をカルシウムイオンを用いる方法 によって形質転換した後、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 3 0°Cでー晚培養した。
[0184] 生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてその構造を解析することにより、 C末 Hisタグ付加型 発現べクタ 一である pQE60ywffiが取得されていることを確認した（図 2)。
pQE60ywffiを保有するェシエリヒア'コリ NM522 (ェシエリヒア'コリ NM522/pQE60y wffi株）を、 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地の入った太型試験管に接種 し 28°Cで 17時間培養した。該培養液を 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 50mlの LB培地 の入った 250ml容三角フラスコに接種し 30°Cで 3時間培養した後、終濃度が lmmol/L になるようにイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド (IPTG)を添カロし、さらに 30 °Cで 4時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、 His Trap (Hisタグ付カ卩タンパク精製キット、 Amersham Pharmasia Biotech社製）を用いて、 説明書に従い Hisタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例 5 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（1)
(i)実験例 4で取得した精製した Hisタグ付加組換え型酵素 0.04mg、 100mmol/Lの Tr is- HCl(pH8.0)、 60mmol/Lの塩化マグネシウム、 60mmol/Lの ATP、 30mmol/Lの L- Al a、 30mmol/Lの L- Ginからなる 0.1mlの反応液を調製し、 37°Cで 16時間反応を行った。
[0185] 反応終了後、上記実験例 3と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中に 3 .7g/Lの L- Ala - L- Ginと 0.3g/Lの L -ァラ-ル L ァラニン（L- Ala - L- Ala)が生 成蓄積して 、ることを確認した。
(ii)酵素を 0.01mg、 L- Ginの代わりに L- Phe、 L- Met、 L- Leuまたは L- Valを含有する 以外は、上記 (i)の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記 (i)の反応条件で反応 させた。
[0186] 反応終了後、上記実験例 3と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中に それぞれ、 7.0g/Lの L ァラ -ル一 L フエ-ルァラニン（L- Ala— L- Phe)のみ、 7.0g /Lの L -ァラ-ル L メチォニン（L- Ala— L- Met)および 0.03g/Lの L- Ala - L- Ala 、 5.0g/Lの L -ァラ-ル L ロイシン（L- Ala - L- Leu)および 0.2g/Lの L- Ala— L- Al a、または 1.6g/Lの L ァラ-ルー L—パリン（L- Ala— L- Val)および 0.3g/Lの L- Ala— L-Alaが生成蓄積して 、ることを確認した。
(iii)酵素を 0.01mg、 L- Alaの代わりに Gly、 L- Ginの代わりに L- Pheまたは L- Metを含 有する以外は、上記（1)の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（1)の反応条 件で反応させた。
[0187] 反応終了後、上記実験例 3と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中に それぞれ 5.2g/Lのグリシル— L フエ-ルァラニン（Gly— L-Phe)または l.lg/Lのグリ シル— L—メチォニン（Gly— L-Met)が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成から ATPを除くとジペプチドは全く生成されなカゝつた。
以上の結果から、； mffi遺伝子産物は、 ATP存在下において、 L-Alaと L-Gln、 L-Phe 、 L— Met、 L— Leuまたは L— Valとから、 L— Ala— L— Ginおよび L— Ala— L— Ala、 L— Ala—L— Phe、 L— Ala— L— Metおよび L— Ala— L— Ala、 L— Ala— L— Leuおよび L— Ala— L— Ala、また は L-Ala— L-Valおよび L-Ala— L-Alaを生成する活性、 Glyと L- Pheまたは L- Metとか ら Gly— L-Pheまたは Gly— L-Metを生成する活性を有することが明らかになった。 実験例 6 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（2)
実験例 4で得られた精製した Hisタグ付加組換え型酵素 0.04mg、 100mmol/Lの Tris - HCl(pH8.0)、 60mmol/Lの塩化マグネシウム、 60mmol/Lの ATPからなる 0.1mlの反応 液を調製し、表 1の第 1行目と最左列のアミノ酸の組み合わせ力 なる各種 Lーァミノ 酸、 Glyまたは j8 -Alaをそれぞれ 30mmol/Lずつになるように反応液に添カ卩し、 37°Cで 16時間反応を行った。反応終了後、反応生成物を HPLC分析したところ、表 1に示す ジペプチドが生成して 、ることが確認された。
[0188] [表 1-1]
Figure imgf000067_0001
[0189] [表 1-2]
Figure imgf000068_0001
[表 1-3] 表 1 3
Figure imgf000069_0001
表 1の第 1行目と最左列に記載の 2種類 (もしくは 1種類)の L—アミノ酸、 Glyまたは β -Alaを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内に記載した。〇は配 列は未確定だがジペプチドが生成したこと、 Xはジペプチドの生成が確認されな力つ たこと、および空欄は未実施を示す。
実験例 7 Hisタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実験例 4で得られたェシエリヒア'コリ NM522/pQE60ywffi株を 50 μ g/mlのアンピシリ ンを含む 8mlの LB培地の入った太型試験管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。該培 養液を 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 50mlの LB培地の入った 250ml容三角フラスコ に接種し 30°Cで 3時間培養した後、終濃度が lmmol/Lになるように IPTGを添加し、さ らに 30°Cで 4時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。
[0192] 200g/Lの湿菌体、 50g/Lのグルコース、 5g/Lのフィチン酸（33%の濃水酸化ナトリウ ム溶液を用いて中性になるよう希釈）、 15g/Lのリン酸二水素カリウム、 5g/Lの硫酸マ グネシゥム · 7水和物、 4g/Lのナイミーン S-215、 10ml/Lのキシレン、 200mmol/Lの L- Ala、 200mmol/Lの L- Ginからなる 20mlの反応液（pH7.2)を 50ml容量のビーカーに入 れ、 32°C、 900rpmの条件下で 2時間反応を行った。反応中は 2mol/Lの水酸ィ匕カリウ ムを用いて反応液の pHを 7.2に保った。
[0193] 反応生成物を実験例 3記載の方法と同様の方法で分析したところ、 25mg/Lの L-A1 a— L-Glnの蓄積が確認された。
実験例 8 バチルス属に属する各種微生物カゝらの; mffi遺伝子に相当する遺伝子のク ローニングとその解析
配列番号 9で表される塩基配列に基づき、バチルス'サチリス ATCC15245、 ATCC 6633、 IAM1213, IAM1107, IAM1214, ATCC9466、 IAM1033、 ATCC21555、バチル ス.アミロリケファシエンス IFO3022,およびバチルス'プミルス NRRL B- 12025に存 在する y E遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
[0194] まず、バチルス'サチルス ATCC15245, ATCC6633、 IAM1213, IAM1107, IAM121 4、 ATCC9466、 IAM1033、 ATCC21555、バチルス 'アミロリケファシエンス IFO3022、 およびバチルス'プミルス NRRL B-12025をそれぞれ LB培地に植菌し 30°Cでー晚静 置培養した。培養後、カレント 'プロトコールズ'イン'モレキュラー 'バイオロジーに記 載の飽和フ ノールを用いる方法により、該微生物の染色体 DNAをそれぞれ単離 精製した。
[0195] パーセプティブ'バイオシステムズ社製 8905型 DNA合成機を用いて、配列番号 25 および 26で表される塩基配列を有する DNA (以下、それぞれプライマー G、プライマ 一 Hと呼ぶ）を合成した。プライマー Gは、バチルス'サチリス 168株の染色体 DNAの y Eの開始コドンより上流を含む領域の配列である。プライマー Ηは、 vwffiの終始コ ドンより下流を含む配列と相補的な配列である。
[0196] バチノレス'サチノレス ATCC 15245, ATCC6633、 IAM1213, IAM1107, IAM1214, AT CC9466、 IAM1033、 ATCC21555、またはバチルス 'アミロリケファシエンス IFO3022 の染色体 DNAを铸型とし、上記プライマー Gおよびプライマー Hをプライマーセットと して用いて PCRを行った。 PCRは、 0.1 μ gの染色体 DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマ 一、 2.5 unitsの DNAポリメラーゼ、 4 μ Lの DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液、 20 0 μ mol/Lの各 dNTPを含む反応液 40 μ Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72 °Cで 3分間の工程を 30回繰
り返すことにより行った。
[0197] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、； mffi断片に相当する約 1.4kbの 断片が増幅して 、ることを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール/クロロホ ルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷 エタノールを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られ た DNAの沈殿を 20 μ Lの ΤΕに溶解した。
[0198] 上記で得られた各菌株染色体 DNA由来の 1.4kb断片と pCR-blunt (インビトロジェ ン社製)を、ライゲーシヨンキットを用いて、 16°Cで 16時間反応を行い連結した。
該反応液を用 V、てェシエリヒア ·コリ NM522株をカルシウムイオンを用 V、る方法によ つて形質転換した後、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°C で一晩培養した。
[0199] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてそれぞれの構造を解析することにより、; mffi遺伝子に相当する遺伝 子を含むプラスミドである pYWFEl (ATCC15245株由来、配列番号 36で表される塩 基配列を有する DNA)、 pYWFE2 (ATCC6633株由来、配列番号 10で表される塩基 配列を有する DNA)、 pYWFE3 (IAM1213株由来、配列番号 11で表される塩基配列 を有する DNA)、 pYWFE4 (IAM1107株由来、配列番号 12で表される塩基配列を有 する DNA)、 pYWFE5 (IAM1214株由来、配列番号 13で表される塩基配列を有する DNA)、 pYWFE6 (ATCC9466株由来、配列番号 9で表される塩基配列を有する DN A)、 pYWFE7 (IAM1033株由来、配列番号 36で表される塩基配列を有する DNA)、 pYWFE8 (ATCC21555株由来、配列番号 14で表される塩基配列を有する DNA)、 p YWFE9 (IFO3022株由来、配列番号 15で表される塩基配列を有する DNA)が取得 されていることを確認した。
[0200] 一方、バチルス'プミルス NRRL B-12025由来の Eに相当する遺伝子（配列番号 16で表される塩基配列を有する DNA)は以下のように取得した。
上記で調製した NRRL B-12025株の染色体 DNAを铸型にし、配列番号 27および 2 8で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットとして用いて、 PCRを行った。 PCRは、 0.1 μ gの染色体 DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2.5 unitsの Z- taqポリメ ラーゼ (タカラノィォ社製）、 5 μ Lの Z- taqポリメラーゼ用 X 10緩衝液 (タカラノィォ社 製）、 200 μ mol/Lの各 dNTPを含む反応液 50 μ Lを調製し、 98°Cで 5秒間、 55°Cで 30 秒間、 72°Cで 1分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0201] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、約 0.8kbの断片が増幅しているこ とを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール/クロ口ホルム溶液を添カ卩し、混 合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷エタノールを加えて 混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られた DNAの沈殿を 20 μ Lの ΤΕ〖こ した。
[0202] 上記で得られた各菌株染色体 DNA由来の 0.8kb断片と pGEM T-easy (プロメガ社 製)を、ライゲーシヨンキットを用いて、 16°Cで 16時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてェシエリヒア'コリ DH5 α株をカルシウムイオンを用いる方法によ つて形質転換した後、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°C で一晩培養した。
[0203] 上記で得られた形質転換体力ゝらプラスミドを抽出して、約 0.8kbの挿入 DNA断片の 塩基配列を決定したところ、配列番号 16で表される塩基配列中の塩基番号 358〜1 160番カ なる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドを EcoRIで切断した後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片 を分離した。該 DNA断片をジーンクリーン IIキットを用いて精製した。約 0.5 gの該 精製 DNA断片を、 DIG-ハイプライム DNAラベリング &デテクシヨンスターターキット I (ロシュ'ダイァグノステイタス社製)を用いて、 DIGラベルイ匕した。 DIGラベルイ匕は、該 キット添付の説明書に従って行った。
[0204] 上記で得られた DIGラベル化 DN Aを用いて、 NRRL B-12025株の染色体 DNAの サザン解析を行った。
NRRL B- 12025株の染色体 DNAを S lHI、 ECORL Hindlll, KpnL Pstl, Sacl, Sail および Iを用いてそれぞれ完全消化し、ァガロース電気泳動により DNA断片を分 離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ (ロシュ'ダイァグノステイタス 社製)に転移させた。
[0205] UVを照射することにより、該ナイロン膜に DNA断片を固定した後、上記プローブ D NAおよび該ナイロン膜を用いてサザンノヽイブリダィゼーシヨンを行った。
ハイブリダィゼーシヨンは、該プローブ DNAと該ナイロン膜を 65°Cで 16時間接触さ せ、その後該ナイロン膜を、 0.1%SDSおよび 2 X SSC力もなる溶液を用い、室温で 5分 間、 2回洗浄し、さらに 0.1%SDSおよび 0.5 X SSCからなる溶液を用い、 65°Cで 15分間 、 2回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダィズした DN Aの検 出は、上記した DIG-ハイプライム DNAラベリング &デテクシヨン スターターキット Iに 添付されている説明書に準じて行った。
[0206] その結果、 tUndlllおよび Egilの完全消化断片の 3.5kbp付近に発色が見られた。
次に、 NRRL B-12025株の染色体 DNAを Mindlllおよび Iを用いてそれぞれ完全 消化し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離した。それぞれの制限酵素 消化 DNAから 3-4kbpの断片をジーンクリーン IIキットを用いて精製し、ライゲーシヨン キットを用いて自己環化させた。
[0207] 上記で決定した 0.8kbの DNA断片の塩基配列に基づき、配列番号 29および 30で 表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環化 DNAを铸型として PCRを行 つた。 PCRは、 10ngの環化 DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2.5 unitsの pyrobest ポリメラーゼ (タカラバイオ社製）、 5 μ Lの pyrobestポリメラーゼ用 X 10緩衝液 (タカラ バイオ社製）、 200 μ mol/Lの各 dNTPを含む反応液 50 μ Lを調製し、 98°Cで 5秒間、 5 5°Cで 30秒間、 72°Cで 3分 30秒間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0208] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、約 3.0kbの断片が増幅しているこ とを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール/クロ口ホルム溶液を添カ卩し、混 合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷エタノールを加えて 混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られた DNAの沈殿を 20 μ Lの ΤΕ〖こ した。
[0209] 上記で得られた DNA断片と Zero Blunt PCR Cloning Kit (インビトロジェン社製）と をライゲーシヨンキットを用いて連結した。
該反応液を用 V、てェシエリヒア ·コリ NM522株をカルシウムイオンを用 V、る方法によ つて形質転換した後、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°C で一晩培養した。
[0210] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用 ヽてその構造を解析することにより、 Ϊ Ε遺伝子に相当する遺伝子を含 むプラスミドである pYWFE10 (NRRL B-12025株由来、配列番号 16で表される塩基配 列を有する DNA)が得られて 、ることを確認した。
上記で得られた pYWFEl〜pYWFE10に含まれる y^遺伝子に相当する各遺伝子 の塩基配列を塩基配列分析装置 373Α· DNAシークェンサ一を用いて決定した。
[0211] pYWFEl、 pYWFE6および pYWFE7に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のァミノ 酸配列は、 ϊ Ε遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と同一であった力 PYW FE2、 pYWFE3、 pYWFE4、 pYWFE5、 pYWFE8、 pYWFE9および pYWFElOに含まれ る遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、； mffi遺伝子にコードされる蛋白質 のアミノ酸配列と異なって 、た。
pYWFE2、 pYWFE3、 pYWFE4、 pYWFE5、 pYWFE8、 pYWFE9、 pYWFElOおよび pY WFE1と pYWFE7に含まれる 遺伝子に相当する遺伝子にコードされる蛋白質の アミノ酸配列を配列番号 2〜8および 1に、該遺伝子の塩基配列を配列番号 10〜16 および 36にそれぞれ示した。
実験例 9 C末端 Hisタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチノレス'サチノレス ATCC 15245, ATCC6633、 IAM1213, IAM1107, IAM1214, AT CC9466、 IAM1033、 ATCC21555、またはバチルス 'アミロリケファシエンス IFO3022 の染色体 DNAを铸型とし、実験例 2記載のプライマー Aおよびプライマー Bをプライ マーセットとして用いて PCRを行った。 PCRは、 0.1 μ gの染色体 DNA、 0.5 μ mol/L の各プライマー、 2.5 unitsの Efii DNAポリメラーゼ、 4 μ Lの DNAポリメラーゼ用 X 1 0緩衝液、 200 μ mol/Lの各 dNTPを含む反応液 40 μ Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°C で 2分間、 72°Cで 3分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0212] バチルス ·プミルス NRRL B-12025の染色体 DNAを铸型とした場合は、配列番号 3 1および 32で表される塩基配列を有する DNAをプライマーセットとして用い、上記と 同様の条件で PCRを行った。
該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、； mffi断片に相当する約 1.4kbの DNA断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエ ノール/クロ口ホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上 層に、 2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を 遠心分離して得られた DN Aの沈殿を 20 μ Lの TEに溶解した。
[0213] 該溶解液のそれぞれ 5 μ Lを用い、増幅した DNAを制限酵素 Nmlおよび EamHiで 切断し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離した後、ジーンクリーン IIキ ットを用いて、: mffi遺伝子に相当する遺伝子を含む 1.4kbの DNA断片を回収した。 次に C末端 Hisタグ付加型組換え体発現ベクター pQE60 0.2 gを制限酵素 tolお よび E lHIで切断後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、上記と同 様の方法により 3.4kbの DNA断片を回収した。
[0214] 上記で得られたバチルス ·サチルス 168株の E遺伝子に相当する遺伝子を含む 1.4kbの DNA断片、および 3.4kbの DNA断片をライゲーシヨンキットを用いて、 16°C で 16時間反応を行 ヽそれぞれ連結した。
該反応液を用いて大腸菌 NM522株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転 換した後、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°Cでー晚培養 した。
[0215] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、 C末 Hisタグ付加型遺伝子発現 ベクターである pQE60ywffil (ATCC15245由来の遺伝子を含有するベクター）、 pQE6 0ywffi2 (ATCC6633由来の遺伝子を含有するベクター）、 pQE60ywffi3 (IAM1213由来 の遺伝子を含有するベクター）、 pQE60ywffi4 (IAM1107由来の遺伝子を含有するべ クタ一）、 pQE60ywffi5 (IAM1214由来の遺伝子を含有するベクター）、 pQE60ywffi6 ( ATCC9466由来の遺伝子を含有するベクター）、 pQE60ywffi7 (IAM1033由来の遺伝 子を含有するベクター）、 pQE60ywffi8 (ATCC21555由来の遺伝子を含有するべクタ 一）、 pQE60ywffi9 (IFO3022由来の遺伝子を含有するベクター）、および pQE60ywffi 10 (NRRL B-12025由来の遺伝子を含有するベクター）が取得されていることを確認し た。
[0216] 上記で得られたェシエリヒア'コリ NM522/pQE60ywffil〜NM522/pQE60ywffil0株を 、それぞれ 50 g/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地の入った試験管に接種し、 2 8°Cで 17時間培養した。該培養液を 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 50mlの LB培地の 入った 250ml容の三角フラスコに接種し 30°Cで 3時間培養した後、終濃度が lmmol/L になるように IPTGを添加し、さらに 30°Cで 4時間培養した。該培養液を遠心分離して 得られた湿菌体から、 HisTrapをその使用説明書に従って用いて、 Hisタグ付加組換 え型酵素を精製した。
実験例 10 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実験例 9で得られた組換え型酵素 0.04mg、 100mmol/Lの Tris- HCl(pH8.0)、 60mmol /Lの塩化マグネシウム、 60mmol/Lの ATP、 30mmol/Lの L- Alaおよび 30mmol/Lの L- Ginからなる 0.1mlの反応液を調製し、 37°Cで 16時間反応を行った。
[0217] 反応終了後、実験例 3記載の方法により反応液を分析した結果、それぞれ、 3.0-3 •5g/Lの L- Ala— L- Ginおよび 0.25〜0.3g/Lの L- Ala— L- Alaが生成、蓄積しているこ とが確認された。
また、上記反応液組成から ATPを除くと L-Ala-L-Glnおよび L-Ala-L-Alaは全く生 成されなかった。
[0218] 以上の結果から、実験例 8で得られた遺伝子の産物は、いずれも ATP存在下で L- Alaと L-Glnとから L-Ala-L-Glnおよび L-Ala-L-Alaを生成する活性を有することが明 らかになつた。 実験例 11 遺伝子およびその類縁遺伝子の取得
ストレプトマイセス 'ノウルセィの^ 遺伝子の塩基配列 [Chemistry & Biol., 9, 1355 (2002)]に基づき、ストレプトマイセス 'ノウルセィおよびストレプトマイセス.アルボラス より^遺伝子およびその類縁遺伝子を、以下の方法で取得した。
[0219] まず、ストレプトマイセス 'ノウルセィ IFO 15452株とストレプトマイセス'アルボラス IFO 14147株を、それぞれ、 1%グリシン添カ卩した KM73培地 [2g/lイーストエキス（ディフコ社 製)、 lOg/1可溶性デンプン (和光純薬工業社製)]、 KP培地 [15g/lグルコース、 lOg/1 グリセロール、 lOg/1ポリペプトン (日本製薬株式会社製)、 lOg/1肉エキス (極東製薬 工業株式会社製)、 4g/l炭酸カルシウム]に植菌し 28°Cで一晩振とう培養した。なお、 ストレプトマイセス ·ノウルセィ IF015452株およびストレプトマイセス ·アルボラス IF014 147株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 生物資源部門 [National Institut e of Technology and Evaluation (NITE) Biological Resourceし enter (BRCj」 ( τ 292- 0 818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8)より分譲を受けた。
[0220] 培養後、 Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manuahjohn Innes F oundationに記載の方法に従って該微生物の染色体 DNAを単離精製した。
albC遣伝子の塩某配列に基づき、パーセプティブ ·バイオシステムズ社製 8905型 D NA合成機を用いて、配列番号 41および 42で表される塩基配列を有する DNA (以 下、それぞれプライマー J、プライマー Kと呼ぶ）を合成した。プライマー Jは、ストレプト マイセス ·ノウルセィの染色体 DNAの dhC遺伝子の開始コドンを含む領域の 5'末端 に tel認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマー Kは、 albC遣伝 子の終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の 5'末端に Π認識配列を含む塩 基配列を付加したものである。
[0221] 上記のプライマー Jおよびプライマー Kをプライマーセットに、铸型としてストレプトマ イセス ·ノウルセィまたはストレプトマイセス ·アルボラスの染色体 DNAを用いて PCR を行った。 PCRは、铸型として 0.1 μ gの染色体 DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2 .5 unitsの Tafl DNAポリメラーゼ (タカラバイオ社製)、 5 μ Lの E [I DNAポリメラー ゼ用 X 10緩衝液 (タカラバイオ社製)、各 200 μ mol/Lの dNTP、 5 μ Lのジメチルスルホ キシドを含む反応液 50 Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間か らなる工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0222] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、約 0.7kbの DNA断片が増幅して
V、ることを確認した後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール/クロ口ホルム溶液を 添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷エタノール を加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して DNAを沈殿させ た後、該 DNAをそれぞれ Lの TEに溶解した。
[0223] 該溶解液それぞれ 5 μ Lを用い、増幅した DNAを制限酵素^ Iおよび Πで切断 し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離した後、ジーンクリーン IIキットを 用いて、 700bpの DNA断片をそれぞれ回収した。
ファージ T5プロモーターを含む発現ベクター pQE60 0.2 μ gを制限酵素 および Πで切断後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、上記と同様の方 法により 3.4kbの DNA断片を回収した。
[0224] 上記で得られた各放線菌由来の 0.7kb断片および pQE60由来の 3.4kbの断片をライ ゲーシヨンキットを用いて、 16°Cで 16時間反応させ連結した。
該反応液を用いてェシエリヒア'コリ NM522株を、カルシウムイオンを用いる方法に よって形質転換した後、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30
°Cでー晚培養した。
[0225] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてその構造を解析することにより、ファージ T5プロモーター下流にスト レプトマイセス ·ノウルセィ由来の DNAが連結された発現ベクターである pAL- nou、 およびストレプトマイセス ·アルブラス由来の DNAが連結された発現ベクターである p AL-albが取得されて!、ることを確認した（図 3)。
[0226] それぞれのプラスミドに挿入された放線菌由来の DNA部分の塩基配列を塩基配 列決定装置 373A.DNAシークェンサ一を使って決定したところ、 pAL_albには配列番 号 37で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA、すなわち配列番号 39で表される塩基配列を有する DNAが含有され、 pAL-nouには配列番号 38で表さ れるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA、すなわち配列番号 40で表され る塩基配列を有する DNAが含有されていることを確認した。 実験例 12 菌体を酵素源に用いたジペプチドの製造
実験例 11で得られた pAL- nouまたは pAL- albを保有するェシエリヒア'コリ NM522 ( ェシエリヒア'コリ NM522/pAL- nou株または NM522/pAL- alb株）およびプラスミドを保 有しない NM522株を 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 10mlの LB培地が入った試験管（ プラスミドを持たない株の場合にはアンピシリンは無添加、以下同様）に接種し、 30°C で 17時間培養した。この培養液 0.5mlを 50mlの LB培地が入った 250ml容の三角フラス コにそれぞれ植菌し、 30°Cで 1時間振とう培養した後、 IPTGを終濃度 lmmol/Lになる ように添加し、さらに 4時間培養を継続した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得 した。
[0227] 終濃度 100mg/mlの該湿菌体、 60mmol/Lのリン酸カリウムバッファー（pH7.2)、 10m mol/Lの塩化マグネシウム、 10mmol/Lの ATP、 lg/Lの L- Leu、 lg/Lの L- Pheからなる 3.0mlの反応液を調製し、 30°Cで反応を行った。反応 1時間後にサンプリングし、ァセ トニトリルを 20%(v/v)になるように加えた後、反応生成物を HPLCを用いて分析した。 H PLCによる分析は、分離カラムに ODS- HAカラム (YMC社製）、溶離液として 30%(v/v )ァセトニトリルを用い、流速 0.6ml/min、 215nmの紫外吸収を測定する条件で行った。
[0228] その結果、ェシエリヒア'コリ NM522/pAL- nou株の反応液中には 36.7mg/lのシクロ（ L 口イシルー L—フエ-ルァラニン） [cyclo(L- Leu- L- Phe)]の蓄積が確認されたが、 ェシエリヒア'コリ NM522株の反応液中には cyclo(L- Leu- L- Phe)はまったく検出されな 力つた。同じ反応液を以下の条件で HPLCによって分析し、直鎖ジペプチド (以下、 単にジペプチドと称す）である L ロイシル L フエ-ルァラニン (L- Leu-L- Phe)お よび L—フエ-ルァラ-ル L ロイシン (L- Phe-L- Leu)を測定した。
[0229] 両ジペプチドは F-mocィ匕法で誘導体ィ匕した後に HPLCを用いて分析した。 HPLCに よる分析は、分離カラムに ODS- HG5 (野村ィ匕学社製)、溶離液として A液 (酢酸 6ml 1\ 20%(v/v)ァセトニトリル、トリェチルァミンにて pH4.8に調整）および B液 (酢酸 6 ml/l、 70%(v/v)ァセトニトリル、トリェチルァミンにて pH4.8に調整）を用い、分析開始 後 5分までは A液: B液 =8 : 2、 5分〜 20分までは、 20分経過したときに A液: B液 = 1： 1になるようにリニアーグラジェントをかけ、流動速度 0.6ml/分、励起波長 254nm、蛍 光波長 630nmでジペプチドを検出する条件で行った。 [0230] その結果、ェシエリヒア'コリ NM522/pAL- nou株の反応液中には 21.9mg/Lの L- Leu - L-Pheと 12.0mg/Lの L-Phe-L-Leuが蓄積して!/、ることが確認された。また対照株とし て用いたェシエリヒア 'コリ NM522株の反応液中には!/、ずれのジペプチドも検出され なかった。
このことから、実験例 11で取得されたシクロジペプチド合成酵素はジペプチドを合 成する能力をもつことが明らかになった。
実験例 13 精製酵素を用いたジペプチドの製造（1)
実験例 12と同様にェシエリヒア'コリ NM522/pAL- nou株を培養した。培養終了後、 遠心分離によって湿菌体を取得し、 60mmol/Lのリン酸カリウムバッファー（pH7.2)で 洗浄後、 10mmol/Lイミダゾール含有 20mmol/Lリン酸カリウムバッファーに懸濁した。 この懸濁を 4°Cで超音波処理して菌体破砕液を取得した。この菌体破砕液 (10ml、蛋 白質 0.863mgを含む)をアマシャム社製 Hisタグ精製カラムに通塔し、 10mmol/Lのイミ ダゾールを含有する 20mmol/Lのリン酸カリウムバッファー 15mlを通塔することによる 洗浄を行い、 Hisタグつき dh£蛋白質をカラム内にて精製した。次にこの Hisタグ付き の albC蛋白質を保持するカラムに、実施例 2と同組成の反応液 (反応液組成： 60mmol /Lのリン酸カリウムバッファー（pH7.2)、 10mmol/Lの塩化マグネシウム、 10mmol/Lの ATP、 lg/Lの L-Leu、 lg/Lの L-Pheからなる反応液) 2mlを通塔し、カラム内に基質を 保持した状態で、 30°Cにて、インキュベートした。 24時間後、同組成の反応液 3mlで力 ラム内の反応液を溶出し、実験例 12と同様の方法により反応液中のシクロジぺプチ ドおよびジペプチドを定量した。
[0231] その結果、 cyclo(L-Leu-L-Phe) 6.8mg/L、 L- Leu- L- Phe 28.7mg/Lおよび L- Phe- L -Leu 18.5mg/Lが生成していることが分力つた。 ATPを含まない反応液で同様にイン キュペートした場合は、シクロジペプチド、ジペプチドともに検出されな力つた。
実験例 14 精製酵素を用いたジペプチドの製造 (2)
基質のアミノ酸を他のアミノ酸に換える以外は実験例 13と同様の方法で酵素反応 を行い、生成物を分析した。反応液は、基質のアミノ酸を、 lg /Lの L-Ala、 L-Leuま たは L-Pheに置き換えた以外は実験例 13と同じ組成の溶液を用いた。
[0232] その結果、反応開始後 24時間で、それぞれ 9.41 mg/Lの L-Ala-L-Ala、 7.85mg/L の L- Leu- L- Leu、または 5.20mg/Lの L- Phe- L- Pheが生成していることが分かった。 実験例 15 ^遺伝子の発現を強化した大腸菌の造成
パーセプティブ'バイオシステムズ社製 8905型 DNA合成機を用いて、配列番号 82 〜85に記載の配列をそれぞれ有する DNA (以下、それぞれプライマー L、プライマ 一 M、プライマー N、プライマー O)を合成した。配列番号 82の配列は、プラスミド pQ E60ywffiの y E遺伝子のリボソーム結合配列であるシャインーダルガノ配列を含む領 域にっ 、て 5'側に0^1認識配列を含む配列を付カ卩したものである。配列番号 83の 配列は、: mffi遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列の 5'側に S iHI認識配 列を含む配列を付カ卩したものである。また配列番号 84の配列は、 imプロモーターを 含む発現ベクター pTrS30の lmプロモーター領域の配列について 5'側に EmRI認識 配列を含む配列を付カ卩したものである。配列番号 85の配列は、 1mプロモーターを含 む発現ベクター pTrS30の lmプロモーター領域の配列と相補的な配列の 5'側に 20^1 認識配列を含む配列を付加したものである。
[0233] プラスミド pQE60ywffiを铸型とし、 y E遺伝子断片の増幅には上記のプライマー L およびプライマー Μを、 lmプロモーター領域の断片の増幅にはプライマー Νおよび プライマー Oをそれぞれプライマーセットとして用いた PCRを行った。 PCRは、 10ng の pQE60ywffi、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2.5 unitsの Efii DNAポリメラーゼ、 4 L の EfiiDNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液、 200 μ mol/Lの各 dNTPを含む 40 μ Lの反応液 を調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間からなる工程を 30回繰り返す ことにより行った。
[0234] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、プライマー Lおよびプライマー M を用 、た PCRでは ^遺伝子断片に相当する約 1.4kb、プライマー Nおよびプライマ 一 Oを用いた反応では imプロモーター領域の断片に相当する約 0.3kbの断片がそれ ぞれ増幅して 、ることを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール/クロ口ホル ム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離後、得られた上層に 2倍容量の冷エタ ノールをカ卩えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られた D NAを 20 μ 1の ΤΕに溶解した。
[0235] 上記で得られたそれぞれの DNA溶液 5 μ 1を用い、プライマー Lおよびプライマー Mで増幅した DNAを制限酵素 20i2lおよび S lHIで、またプライマー Nおよびプライ マー oで増幅した DNAを制限酵素 EmRiおよび0 iで切断し、ァガロースゲル電気 泳動により DNA断片を分離した後、ジーンクリーン IIキットにより、それぞれ y E遺伝 子を含む 1.4kbおよび プロモーター領域を含む 0.3kbの DNA断片を回収した。
[0236] 0.2 μ gの lmプロモーターを含む発現ベクター pTrS30を制限酵素 E^RIおよび E I HIで切断後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、同様に 4.5kbの DN A断片を回収した。
上記で得られた: mffi遺伝子を含む 1.4kb断片、 imプロモーター領域を含む 0.3kb断 片および 4.5kbの断片をライゲーシヨンキットを用いて、 16°Cで 16時間、連結反応を行 つた o
[0237] 該反応液を用いて大腸菌 NM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質 転換した後、アンピシリン g/mlを含む LB寒天培地に塗布して、 30°Cでー晚培養 した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 im プロモーター下流に 遺伝子を含む発現ベクターである pPE56を得た。該ベクター の構造を制限酵素消化により確認した（図 4)。
実験例 16 DeDD遣伝子、 DeDN遣伝子、 DeDB遣伝子、 DeDA遣伝子および dDDオペ口 ン欠損株の作製
ェシエリヒア'コリ染色体 DNA上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージ の相同組換え系を利用した方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000) ]に従って作製した。
[0238] 以下に記載のプラスミド pKD46、 pKD3および pCP20は、ェシエリヒア'コリジエネティ ックストックセンター（米国エール大学)から該プラスミドを保持するェシエリヒア'コリ 株を入手し、当該株力 公知の方法により抽出して用いた。
( 1)遺伝子欠損用 DNA断片のクローユング
エシ リヒア 'コリ K12株の染色体 DNA上に存在する配列番号 53で表される塩基配 列を有する 遺伝子、配列番号 54で表される塩基配列を有する Ε^Ε 遺伝子、配 列番号 55で表される塩基配列を有する 遺伝子、配列番号 56で表される塩基配 列を有する 遺伝子および配列番号 57で表される塩基配列を有する 遺伝 子、配列番号 58で表される塩基配列を有する E 、配列番号 59で表される塩基配 列を有する EE^遺伝子、配列番号 60で表される塩基配列を有する 遺伝子およ び配列番号 61で表される塩基配列を有する 遺伝子を欠損させることを目的に、 パーセプティブ ·バイオシステムズ社製 8905型 DNA合成機を用 ヽ、ェシエリヒア 'コリ K12株の染色体 DNA上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置 する 36bpからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号 52で表される酵母 由来 Flp recombinaseが認識する塩基配列を有する DNAを合成した。ただし、 ^ΕΕΔ 遺伝子、 dDDB遣伝子、 dDDC遣伝子、 dDDD遣伝子および dDDF遣伝子は、オペロンを 形成しているので、該ォペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基 配列を有する DNAを合成した。
[0239] すなわち、 EgED遺伝子欠損用 DNA断片増幅用プライマーセットとして配列番号 6 2および 63、 ESEN遺伝子欠損用 DNA断片増幅用プライマーセットとして配列番号 6 4および 65、 遺伝子欠損用 DNA断片増幅用プライマーセットとして配列番号 6 6および 67、 ESEE遺伝子欠損用 DNA断片増幅用プライマーセットとして配列番号 6 8および 69、 dmオペロン欠損用 DNA断片増幅用プライマーセットとして配列番号 7 0および 71で表される塩基配列からなる DNAをそれぞれ合成した。
[0240] 次に、上記合成 DNAをプライマーセットとして用い、 pKD3DNAを铸型として PCR を行った。 PCRは 10ngのプラスミド DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2.5unitsの £f liDNAポリメラーゼ、 4 μ Lの Efii DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液、 200 μ mol/Lの各 de oxyNTPを含む Lの反応液を用い、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間か らなる工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0241] それぞれの反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅して V、ることを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール Zクロ口ホルムを添カロし 、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に 2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、 - 80°Cで 30分間放置した。該溶液を遠心分離し、 DeoD遣伝子、 DepN遣伝子、 ΡΘΡΒ» 伝子、 Ε^ΕΔ遺伝子および EEオペロン欠損用クロラムフエ-コール耐性遺伝子含有 DNA断片を取得した。
( 2) 遺伝子欠損ェシエリヒア'コリ JM 101の作製
ェシエリヒア'コリ JM101株を pKD46で形質転換した後、 100mg/Lのアンピシリンを含 む LB寒天培地に塗布して、 30°Cで培養することで pKD46を保持するェシエリヒア 'コリ JM101株（以下、ェシエリヒア'コリ JM101/pKD46と称す）を選択した。
[0242] プラスミド pKD46は、 λ Red recombinase遺伝子を有し、該遺伝子の発現は L-ァラビ ノースにより誘導することができる。よって、 L-ァラビノース存在下で生育させた pKD4 6を保有する大腸菌を、直鎖 DNAを用いて形質転換すると、高頻度で相同組換えが 起こる。また pKD46は温度感受性の複製起点を有するために、 42°Cで生育させること により、プラスミドを容易に脱落させることができる。
[0243] 10mmol/Lの L-ァラビノースと 50 μ g/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られた ェシエリヒア'コリ JM101/pKD46に、電気パルス法により上記で取得した EgED遺伝子 欠損用クロラムフエ-コール耐性遺伝子含有 DNA断片を導入し、大腸菌 JM101の染 色体 DNA上に ESED遺伝子欠損用クロラムフエ-コール耐性遺伝子含有 DNA断片 が相同組換えにより組込まれた形質転 ·を 25mg/Lのクロラムフエ-コールを含む L B寒天培地 (バタトトリプトン 10g/L、バクトイーストエキストラタト 5g/L、塩化ナトリウム 5g/L、寒天 15g/L)に塗布し、 30°Cで培養することで選択した。
[0244] 選択したクロラムフエ-コール而性株を、 25mg/Lのクロラムフエ-コールを含む LB 寒天培地に植菌し、 42°Cで 14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロ ニーを 25mg/Lのクロラムフエ-コールを含む LB寒天培地、及び lOOmg/1のアンピシリ ンを含む LB寒天培地にレプリカし、 37°Cで培養し、クロラムフエ-コール耐性かつァ ンピシリン感受性を示すコロニーを選択することにより、 PKD46脱落株を取得した。
[0245] 次に上記で得られた pKD46脱落株を pCP20を用いて形質転換し、 lOOmg/1のアンピ シリンを含む LB寒天培地上で選択することにより、 pCP20を保持する pKD46脱落株を 取得した。
プラスミド PCP20は、酵母由来 Flp recombinase遺伝子を有し、該遺伝子の発現は 42 °Cで誘導することができる。
また、上記で作製した 遺伝子、 DeDN遣伝子、 DeDB遣伝子、 DepA遣伝子及び d 迎ォペロン欠損用クロラムフエ-コール耐性遺伝子含有 DNA断片の、クロラムフエ- コール耐性遺伝子の両端には Flp recombinaseが認識する塩基配列が存在するため 、 Flp recombinaseが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させるこ とがでさる。
[0246] さらに、 pCP20は温度感受性の複製起点を有して 、るため、 pCP20保持株を 42°Cで 生育させることにより、 Flp recombinaseの発現と pCP20の脱落を同時に誘導すること ができる。
上記で取得した PCP20保有 pKD46脱落株を薬剤無添加の LB寒天培地に植菌し、 4 2°Cで 14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加 LB 寒天培地、 25mg/Lのクロラムフエ-コールを含む LB寒天培地および 100mg/Lのアン ピシリンを含む LB寒天培地にレプリカして、 30°Cで培養し、クロラムフエ-コール感受 性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
[0247] 上記で選択した各株からそれぞれ染色体 DNAを常法 (生物工学実験書、日本生 物工学会編 97〜98ページ、培風館、 1992年)に従って調製した。欠損の標的遺伝子 である DeDD遣伝子の内部塩基配列に基づ!/、て設計した配列番号 72および 73で表 される塩基配列を有する DNAをプライマーセットとして用い、染色体 DNAを铸型に した PCRを行った。 PCRは、 0.1 μ gの染色体 DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2.5 unitsの Efii DNAポリメラーゼ、 4 μ Lの Efii DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液、 200 μ mol /Lの各 deoxyNTPを含む Lの反応液を用い、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°C で 3分間からなる工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0248] 上記 PCRにおいて、増幅 DNA断片が検出されなカゝつた株を 遺伝子欠損株と し、ェシエリヒア'コリ JPD1株と名づけた。
(3)ェシエリヒア'コリ JM101の染色体 DNA上の 遺伝子および 遺伝子が欠 損した株の作製
上記（2)で得られたェシエリヒア 'コリ JPD1株を pKD46で形質転換した後、 lOOmg/1 のアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°Cで培養することにより pKD46を保 持するェシエリヒア ^!JJPDI (以下、ェシエリヒア'コリ JPDl/pKD46と称す）を選択した 。ェシエリヒア'コリ JPDl/pKD46に、電気ノルス法により 遺伝子欠損用クロラムフ ェ-コール耐性遺伝子含有 DNA断片を導入し、ェシエリヒア'コリ JPDl/pKD46の染 色体 DNA上に Ε^Ε 遺伝子欠損用クロラムフエニコール耐性遺伝子含有 DNA断片 が相同糸且換えに
より組込まれた形質転換株を取得した。
[0249] 次に、上記（2)と同様の操作を行うことにより、染色体 DNA上力 クロラムフエニコ ール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、該株をェシエリヒア 'コリ JPDN2と名づけた。 (4)ェシエリヒア'コリ JM101の染色体 DNA上の 遺伝子、 pepA遣伝子、 pepB遣 伝子または dmオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
DeDN遣伝子、 De。A遣伝子、 DepB遣伝子または dDDオペロンの欠損株は、上記（1) で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフエ-コール耐性遺伝子含有 D NA断片を用い、上記 (2)と同様の方法により作製した。
[0250] 上記方法により各々の遺伝子欠損株が取得されたことは、各々の欠損遺伝子の内 部塩基配列に基づき設計、合成した配列番号 74〜81で表される塩基配列を有する DNAをプライマーセットとして用い、上記（2)と同様の PCRにより確認した。ここで、 配列番号 74および 75で表される塩基配列カゝらなる DNAは ESEN^C損確認用、配列 番号 76および 77で表される塩基配列カゝらなる DNAは ESE ^損確認用、配列番号 78および 79で表される塩基配列カゝらなる DNAは EgEfi^C損確認用、配列番号 80お よび 81で表される塩基配列からなる DNAは dmオペロン欠損確認用プライマーセッ トである。
[0251] 上記方法で取得された オペロン欠損株をェシエリヒア'コリ JDPP1株、 DepN遣伝 子欠損株をェシエリヒア 'コリ JPN1株、
Figure imgf000086_0001
'コリ JPA1株、 遺伝子欠損株をェシエリヒア ·コリ JPB7株と名付けた。
また、上記（3)の方法に準じて、 DeDD遣伝子、 DeDN遣伝子、 De。A遣伝子、 ΡΘΡΒ» 伝子および EEオペロン力 なる群より選ばれる 2以上の遺伝子またはオペロンの多 重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、上記 (2)と同様の PC Rにより確認した。前記方法で取得された 遺伝子および dmオペロンが欠損した 二重遺伝子欠損株をェシエリヒア'コリ JPDP49株、 DeDB遣伝子、 DepD遣伝子および D SE 遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をェシエリヒア'コリ JPDNB43株、 遺伝 子、 遺伝子および オペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をェシエリヒア'コリ
JPNDDP36株、 De。A遣伝子、 DepD遣伝子、 遺伝子および オペロンが欠損し た四重遺伝子欠損株をェシエリヒア'コリ JPNDAP5株、 DeDB遣伝子、 DepD遣伝子、 ββ E 遺伝子および^オペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をェシエリヒア'コリ JPND ΒΡ7株と名づけた。表 2は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。
[0252] [表 2] 表 2
Figure imgf000087_0001
[0253] 実験例 17 ぺプチダーゼおよびジペプチド取り込み活性が喪失したェシエリヒア，コリ を用いた L- Ala- L- Ginおよび L- Ala- L- Alaの生産性の評価
実験例 16で得られた各種べプチダーゼおよびジペプチド取り込み蛋白質をコード する遺伝子の欠損株を、実験例 15で造成したプラスミド pPE56を用いて形質転換し、 アンピシリン耐性を示す形質転換株を取得した。
[0254] 得られた形質転換株を 50 μ g/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地の入った試験 管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。該培養液を 100 g/mlのアンピシリンおよびァ ミノ酸を含む 8mlの水性媒体 (リン酸水素二カリウム 16g/L、リン酸二水素カリウム 14 g/L、硫酸アンモニゥム 5g/L、タエン酸 (無水） lg/L、カザミノ酸 (Difco社製） 0.5g/ L、 L-Pro lg/L、 L- Ala 2.5g/L、 L- Gin 2.5g/L、グルコース 10g/l、ビタミン B 10mg/
1
L、硫酸マグネシウム · 7水和物 25mg/l、硫酸鉄 7水和物 50mg/l、 10mol/lの水酸化 ナトリウム溶液を用いて PH7.2に調整。 L-Glnは 10倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、 グルコース、ビタミン B、硫酸マグネシウム · 7水和物、硫酸鉄 · 7水和物は別個に蒸煮
1
後添加）を試験管に 1%添加し、 30°Cで 24時間反応させた。該水性媒体を遠心分離 し上清を取得した。
[0255] 該上清中の生産物を F-mocィ匕法で誘導体ィ匕した後に HPLC法により分析した。 HP LC法による分析は、分離カラムに ODS- HG5 (野村ィ匕学社製)を用い、溶離液として A液 (酢酸 6ml/l、 20%(v/v)ァセトニトリル、トリェチルァミンにて pH4.8に調整）およ び B液 (酢酸 6ml/l、 70%(v/v)ァセトニトリル、トリェチルァミンにて pH4.8調整）を用 い、分析開始後 5分までは A液: B液 =8 : 2、 5分〜 20分までは、 20分で A液: B液 = 1 ： 1になるようにリニアーグラジェントをかける条件で分析を行った。分析結果を表 3に 示す。
[0256] [表 3] 表 3
Figure imgf000088_0001
[0257] 表 3から、 2種以下のぺプチダーゼが欠損した微生物、 1種のペプチド取り込み蛋 白質のみが欠損した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量は低いが、 1種以上の ぺプチダーゼおよび 1種のペプチド取り込み蛋白質が欠損した微生物、または 3種 以上のぺプチダーゼの活性が喪失した微生物では、ジペプチドの生成、蓄積量が大 幅に増加していることがわかった。
実験例 18 ぺプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌 株を用いた L ァラニル Lーノ リン（以下、 L-Ala-L-Valと称す)の生産性の評価 実験例 17と同様に、各種べプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質をコードす る遺伝子の欠損大腸菌株を、 pPE56を用いて形質転換した。得られた形質転換株を 50 g/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地の入った試験管に接種し、 28°Cで 17時 間培養した。該培養液を 100 g/mlのアンピシリンおよびアミノ酸を含む 8mlの水性媒 体 (リン酸水素二カリウム 16g/l、リン酸二水素カリウム 14g/l、硫酸アンモ-ゥム 5g /1、クェン酸（無水） lg/l、カザミノ酸（Difco社製） 0.5g/l、L- Pro lg/l、 L- Ala 2.5g /1、L-Val 2.5g/l、グルコース 10g/l、ビタミン 10mg/l、硫酸マグネシウム · 7水和 物 25mg/l、硫酸鉄 · 7水和物 50mg/l、 10mol/lの水酸化ナトリウム溶液で ρΗ7.2に 調整。グルコース、ビタミン B、硫酸マグネシウム · 7水和物、硫酸鉄 · 7水和物は別個
1
に蒸煮後に添加）が入った試験管に 1%添加し、 30°Cで 24時間反応させた。該水性 媒体を遠心分離し上清を取得した。
[0258] 該上清中の生成物を、実験例 17記載の方法により分析した。結果を表 4に示す。
[0259] [表 4]
表 4
Figure imgf000090_0001
[0260] 表 4力ら、 2種以下のぺプチダーゼが欠損した微生物、および 1種のペプチド取り込 み蛋白質のみが欠損した微生物はジペプチドを生産しないが、 3種以上のぺプチダ ーゼ遺伝子が欠損した微生物、または 1種以上のぺプチダーゼ遺伝子および 1種の ペプチド取り込み蛋白質が欠損した微生物は、ジペプチドを生産することがわ力つた 実験例 19 ぺプチダーゼおよびジペプチド取り込み系蛋白質の活性が喪失した大 腸菌株を用いたグリシル— L—グルタミン (以下、 Gly-L-Glnと称す)の生産性の評価 実験例 17と同様に各種べプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質をコ ードするオペロンの欠損株を、 pPE56を用いて形質転換した。得られた形質転換株を 、 50 g/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地の入った試験管に接種し、 28°Cで 17 時間培養した。
[0261] 該培養液を 100 μ g/mlのアンピシリンおよびアミノ酸を含む 8mlの水性媒体（リン酸 水素二カリウム 16g/l、リン酸二水素カリウム 14g/l、硫酸アンモ-ゥム 5g/L、タエ ン酸 (無水） lg/L、カザミノ酸 (ディフコ社製） 0.5g/L、 L-Pro lg/L、 Gly 2.5g/L、 L- Gin 2.5g/L、グルコース lOg/L、ビタミン B lOmg/L、硫酸マグネシウム · 7水和物 2
1
5mg/L、硫酸鉄 7水和物 50mg/L、 10mol/Lの水酸化ナトリウム溶液を用いて pH7.2 に調整。 L-Glnは 10倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミン B、硫酸
1 マグネシウム · 7水和物、硫酸鉄 · 7水和物は別個に蒸煮後添加）が入った試験管に 1 %添加し、 30°Cで 24時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。
[0262] 該上清中の生成物を、実験例 17記載の方法より分析した。結果を表 5に示す。
[0263] [表 5] 表 5
Figure imgf000091_0001
[0264] 表 5から、 2種以下のぺプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および 1種のぺプチ ド取り込み蛋白質のみが欠損した微生物は、ジペプチドを生産しな力つたが、 3種以 上のぺプチダーゼが欠損した微生物、および 2種以上のぺプチダーゼ遺伝子および 1種のペプチド取り込み蛋白質が欠損した微生物は、ジペプチドを生産することがわ かった。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0265] アミノ酸およびアミノ酸誘導体を基質に用いたジペプチド誘導体の酵素的製造法 実験例 4で取得した精製した Hisタグ付加組換え型酵素 40mg/L、 100mmol/Lの Tri s- HCl(pH9.0)、 30mmol/Lの塩化マグネシウム、 10mmol/Lの ATP、各 10mmol/Lの表 6記載のアミノ酸またはアミノ酸誘導体力もなる 0.1mlの反応液を調製し、 37°Cで 2時 間反応を行った。
反応終了後、反応液の 100倍量の停止緩衝液 (4mol/L尿素、 100mmol/L EDTA-2 ナトリウム塩)を反応液に加えて反応を停止し、酵素反応により ATPが消費される際に 生じる ADP量を HPLCを用いて分析することにより、反応が進行していることを確認し た。 HPLCによる分析は、カラムに Develosil C30- UG- 5 (150 X 4.6mm、野村化学社製 )、移動相に 200mmol/Lの酢酸および 200mmol/Lのトリエチルァミンからなる溶液（pH 6.6)を用い、流速 1.0ml/
分、室温、 254nmの紫外吸収を測定する条件で行った。結果を表 6に示す。
[表 6-1]
Figure imgf000092_0001
[表 6-3] 表 6 3
Figure imgf000093_0001
[表 6-4]
Figure imgf000093_0002
表 6— 1は L- Alaと L- Ala誘導体、表 6 - 2は L- Alaと L- Phe誘導体、表 6— 3は L- Ala と L- Glu誘導体、表 6— 4は L- Alaと L- Asp誘導体、表 6— 5は L- Alaと L- Lys誘導体を 基質に用いた実験結果であり、基質として用いたアミノ酸およびアミノ酸誘導体の略 称は以下のとおりである。
Ala： L-ァラニン
Phe ： L-フエ-ルァラニン
Glu ： L-グルタミン酸
Asp ： L-ァスパラギン酸
Lys ： L-リジン
Cl-Ala： β—クロ口— L—ァラニン
CN-Ala： β -シァノ- L-ァラニン
cyc(5)Ala： β -シクロペンチル- DL-ァラニン
cyc(3)Ala： β—シクロプロピルァラニン
cyc(6)Ala： β -シクロへキシルァラニン
Cl-Phe :4—クロ口フエニノレアラニン
F-Phe :4—フルオロフェニルァラニン
Ni-Phe ： p—ニトロフエニノレアラニン
NH -Phe： p-ァミノフエ二ルァラニン
2
Phe-NH ：フエ二ルァラニンアミド
2
Kynurenin： L— ヌレニン
Glu(OMe) ：グルタミン酸- γ -メチルエステル
Glu(OEt) ：グルタミン酸- γ -ェチルエステル
Glu(OtBu) ：グノレタミン酸- γ -tブチルエステノレ
Glu(OBzl) ：グルタミン酸- γ -ベンジルエステル
Asp(OMe) ：ァスパラギン酸- 13 -メチルエステル
Asp(OtBu)：ァスパラギン酸- β - 1ブチルエステル
Asp(OBzl) ：ァスパラギン酸- 13 -ベンジルエステル
Lys(Ac) ：ァセチルリジン
Lys(Boc) ： Boc-リジン
表 6に示すように、コントロールである基質無添カ卩区、および L- Ala、 L- Phe、 L - Glu、 L-Asp、 L-Lysをそれぞれ単独の基質に用いた試験区での ADP生成量は 0.02〜0.16 mmol/Lであったのに対し、表 1に示すアミノ酸およびアミノ酸誘導体の組み合わせで は、 0.54〜6.43mmol/Lもの ADPが生成して!/、た。
[0272] また、プロトン NMR分析により上記と同様の反応条件で反応させた反応液中に存在 する化合物の構造解析を行った。ただし、反応に用いた基質アミノ酸およびアミノ酸 誘導体は、反応液 1、 4、 10および 11は 20mmol/L、その他の反応液は 10mmol/Lの 濃度で用いた。
プロトン NMR分析は、 Bruker社製の DMX500を用い、以下の条件下で行った。 温度： 303K
標準物質： lmmol/Lの 3- (Trimethylsilyl)- Propionic acid- D4 sodium salt(TSP) 媒体:反応液 4、 10および 11は軽水、その他の反応液は重水
反応液中の化合物の構造は、 α位のプロトンのケミカルシフトに基づき同定した。 各化合物の濃度は TSPの面積を内部標準とし、 a位のプロトンのシグナル面積を元 に算出した (表 7)。ただし、 L-Ala-L-Alaは濃度が低ぐ α位のプロトンのシグナルが 重なり合うため、 j8位のプロトンのシグナル面積を元に算出した。なお、括弧内は、各 化合物の a位プロトンのケミカルシフト (単位は ppm)を表す。
[0273]
C卜 Alaおよび Pheを基質に用いた反応液 (反応液 1)
Cl-Ala(4.20), Phe(4.02)、 Cト Ala— Phe(3.93, 4.50)、 Aziridine— 2— carboxylic acid[Azc]( 2.73)、 Azc-Phe(2.59, 4.47)
CN-Alaおよび Pheを基質に用いた反応液 (反応液 2)
CN— Ala(3.87)、 Phe(4.00)、 Cト Ala— Phe(3.71, 4.48)
Alaおよび C卜 Pheを基質に用いた反応液 (反応液 3)
Ala(3.79)、 CI— Phe(3.97)、 Ala— CI— Phe(3.90, 4.43)
Alaおよび NH -Pheを基質に用いた反応液 (反応液 4)
2
Ala(3.78)、 NH— Phe(3.93)、 Ala— NH— Phe(3.95, 4.39)、 Ala— Ala( j8 ; 1.55, 1.36)
2 2
Alaおよび Kinurenineを基質に用いた反応液（反応液 5)
Ala(3.79)、 Kinurenine(4.16)、 Ala— Kinurenine(3.96, 4.64)
Alaおよび Phe-NHを基質に用いた反応液 (反応液 6) Ala(3.79)、 Phe— NH (4.02)、 Ala— Phe— NH (3.90, 4.60)
2 2
Alaおよび Glu(OMe)を基質に用いた反応液 (反応液 7)
Ala(3.79)、 Glu(OMe)(3.76)、 Ala— Glu(OMe)(4.05, 4.18)、 Ala— Ala( j8； 1.55, 1.36) Alaおよび Glu(OtBu)を基質に用いた反応液 (反応液 8)
Ala(3.79)、 Glu(OtBu)(3.76)、 Ala- Glu(OtBu)(4.04, 4.18)
Alaおよび Asp(OtBu)を基質に用いた反応液 (反応液 9)
Ala(3.81)、 Asp(OtBu)(3.98)、 Ala- Asp(OtBu)(4.04, 4.46)
Alaおよび Lys(Boc)を基質に用いた反応液 (反応液 10)
Ala(3.78)、 Lys(Boc)(3.73)、 Ala— Lys(Boc)(4.02, 4.14)
Alaおよび cyc(3)Alaを基質に用いた反応液 (反応液 11)
Ala(3.78)、 cyc(3)Ala (3.82)、 Ala— cyc(3)Ala (4.08, 4.24)
Alaおよび cyc(6)Alaを基質に用いた反応液 (反応液 12)
Ala(3.79)、 cyc(6)Ala (3.76)、 Ala— cyc(6)Ala (4.02, 4.22)
[表 7]
表 7
Figure imgf000096_0001
[0275] 表中の「overlap」はシグナルの重なりによって正確な定量ができなかったことを示す 上記結果から、本発明の製造法により、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を基質として 、直接アミノ酸とアミノ酸誘導体がペプチド結合したジペプチド誘導体が製造できるこ とが明ら力となった。
実施例 2
[0276] N- [2- (ァセチルァミノ)プロピオ-ル]フエ-ルァラニンの製造
実験例 6で得られた L- Ala- L- phe (100 mg, 0.423 mmol)を塩化メチレン（10 mL)に 懸濁し、室温でピリジン（10 mL)及び無水酢酸（1 mL, 11 mmol)を加える。室温で 24 時間撹拌した後、水を加えクロ口ホルムで 3回抽出する。有機層を飽和食塩水で洗浄 し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去することにより、 N-[ 2- (ァセチルァミノ)プロピオ-ル]フエ-ルァラニンを得る。
実施例 3
[0277] 1- {2- [N- ((ァセチルァミノ)ァセチル)ァミノ]- 3-フエ-ルプロピオ-ル}ピペリジンの製 造
実施例 2で得られる N-[2- (ァセチルァミノ)プロピオ-ル]フエ-ルァラニン（10 mg, 0. 036 mmol)を Ν,Ν-ジメチルホルムアミド（5 mL)に懸濁し、室温で 1-(3-ジメチルァミノ プロピル)- 3-ェチルカルボジイミド塩酸塩（14 mg, 0.073 mmol) , 1-ヒドロキシベンゾト リアゾール（15 mg, 0.11 mmol)及びピぺリジン（40 μ L, 0.40 mmol)を加え 50 °Cで 24 時間撹拌する。反応混合物に水を加え、クロ口ホルムで 3回抽出する。有機層を 10% 塩酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で溶 媒を留去する。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すること により、 1- {2- [N- ((ァセチルァミノ)ァセチル)ァミノ]- 3-フエ-ルプロピオ-ル}ピベリジ ンを得る。
配列表フリーテキスト
[0278] 配列番号 19 人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 20—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 21—人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 22 -人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 23 -人工配列の説明 ：合成 DNA
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配列番号 25 -人工配列の説明 ：合成 DNA
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配列番号 29 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 30 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 31 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 32 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 33 -人工配列の説明 ：データベースサ -チに -用いたアミノ酸配列 配列番号 34 -人工配列の説明 ：データベースサ -チに -用いたアミノ酸配列 配列番号 35 -人工配列の説明 ：データベースサ -チに -用いたアミノ酸配列 配列番号 41 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 42 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 52 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 53 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 54 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 55 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 56 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 57 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 58 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 59 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 60 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 61 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 62 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 63 -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 64- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 65 - -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 66 - -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 67- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 68 - -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 69 - -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 70- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 71 - -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 72- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 73 - -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 74- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 75 - -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 76 - -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 77- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 78 - -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 79 - -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 80 -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 81 -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 82 -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 83 -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 84 -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 85 -人工配列の説明 ：合成 DNA

Claims

請求の範囲
以下の [1]〜 [7]の 、ずれかに記載の蛋白質、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジぺプ チド誘導体 [以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)という]を生成、蓄積させ 、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を採取することを特徴とす るジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)の製造法 [但し、ジペプチドまたはジぺプ チド誘導体 (PI)は、下記アミノ酸群 Aから選ばれる同一のまたは異なるアミノ酸がぺ プチド結合によって結合したィ匕合物ではな 、 (アミノ酸群 A： L-ァラニン、 L-グルタミン 、 L-グルタミン酸、 L-ノ リン、 L-ロイシン、 L-イソロイシン、 L-プロリン、 L-フエ-ルァラ ニン、 L—トリプトファン、 L—メチォニン、 L—セリン、 L—スレオニン、 L—システィン、 L—ァス パラギン、 L-チロシン、 L-リジン、 L-アルギニン、 L-ヒスチジン、 L-ァスパラギン酸、 L- α -ァミノ酪酸、 L-ァザセリン、 L-テアニン、 L- 4-ヒドロキシプロリン、 L- 3-ヒドロキシプ 口リン、 L-オル二チン、 L-シトルリン、 L- 6-ジァゾ -5-ォキソノルロイシン、グリシンおよ び j8 -ァラニン）]。
[ 1 ]配列番号 1〜8の 、ずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、置換または付加したアミノ酸配列力 なり、かつ 1種以上のアミノ酸またはァミノ 酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白 質
[3]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドま たはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[4]配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列 を有し、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体カもジペプチドまたはジぺプチ ド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[5]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失
、置換または付加したアミノ酸配列力もなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質 [7]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体力 ジペプチドまた はジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
以下の [1]〜 [7]の 、ずれかに記載の蛋白質、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドまたはジぺプ チド誘導体 (PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該媒体力 該ジペプチドまたは ジペプチド誘導体 (PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を 修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体 [以下、ジペプチドまたはジペプチド誘 導体 (ΡΠ) t 、う]を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)を採取す ることを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)の製造法 [但し、ジぺプ チドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)は、前記アミノ酸群 A力も選ばれる同一のまたは 異なるアミノ酸がペプチド結合によって結合したィ匕合物ではない]。
[ 1 ]配列番号 1〜8の 、ずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、置換または付加したアミノ酸配列力 なり、かつ 1種以上のアミノ酸またはァミノ 酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白 質
[3]配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドま たはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[4]配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列 を有し、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体カもジペプチドまたはジぺプチ ド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[5]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失
、置換または付加したアミノ酸配列力もなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質 [7]配列番号 37または 38で表されるアミノ酸配列と 65%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体力 ジペプチドまた はジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質
[3] 以下の [1]〜[5]から選ばれる DNAを保持する細胞の培養物または該培養物の処 理物を酵素源に用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒 体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成 、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を採取すること を特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)の製造法 [但し、ジペプチドま たはジペプチド誘導体 (PI)は、前記アミノ酸群 Aから選ばれる同一のまたは異なるァ ミノ酸がペプチド結合によって結合したィ匕合物ではない]。
[1]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列を有する DNA
[2]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列 を有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸 またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を 有する蛋白質をコードする DNA
[3]配列番号 18で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体から ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードす る DNA
[4]配列番号 39または 40で表される塩基配列を有する DNA
[5]配列番号 39または 40で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質を コードする DNA
[4] 以下の [1]〜[5]から選ばれる DNAを保持する細胞の培養物または該培養物の処 理物を酵素源に用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を水性媒 体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成 、蓄積させ、そのまま、または該媒体力 該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI) を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を修飾し、ジペプチドまた はジペプチド誘導体 (ΡΠ)を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ) を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)の製造法。
[1]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列を有する DNA
[2]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列 を有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸 またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を 有する蛋白質をコードする DNA
[3]配列番号 18で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体から ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質をコードす る DNA
[4]配列番号 39または 40で表される塩基配列を有する DNA
[5]配列番号 39または 40で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘 導体力 ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)を生成する活性を有する蛋白質を コードする DNA
アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (I)
[化 25]
Figure imgf000103_0001
(式中、 nは 1〜3の整数を表し、
Rlaおよび Rlbは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級ァルケ-ル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換 もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは 非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のァロイルを表す力、または Rlaおよび Rlbのいずれか一方力 隣接する窒 素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上の R2aおよび R2bの いずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ
R2aおよび R2bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または RlaRlbNに隣接する炭素原子上の R2aおよ び R2bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子なら びに Rla及び Rlbの 、ずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形 成してもよぐ nが 2または 3である場合、 2つまたは 3つの R2aおよび 2つまたは 3つの R2b はそれぞれ同一でも異なって 、てもよ 、）または式 (II)
[化 26]
Figure imgf000104_0001
[式中、 は前記 n1と同義であり、
R3aおよび R3bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表す力、または R4HNに隣接する炭素原子上の R3aおよび R3bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子および R4と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、 n2が 2または 3であ る場合、 2つまたは 3つの R3aおよび 2つまたは 3つの R3bはそれぞれ同一でも異なって いてもよく、
R4は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級ァ ルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ -ル、置換もしくは非置換のァラルキル
、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ力 ルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは非置換のァロイルを表 すか、または R4が隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該 炭素原子上の R3aおよび R3bの 、ずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複 素環基を形成してもよぐ
R5はァミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ (置換もしくは非置 換の低級アルキル)アミ入ジ (置換もしくは非置換の低級アルキル)ァミノまたは脂環 式複素環基を表す]で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体 [但し、アミノ酸またはァ ミノ酸誘導体が式 (I)のみであるとき、 Rla及び Rlbの少なくとも一方は水素原子であり、 アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (II)のみであるとき、 R5はヒドロキシである]である請 求項 1〜4のいずれか 1項に記載の製造法。
アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (III)
[化 27]
Figure imgf000105_0001
(式中、 Rleおよび Rldは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級ァ ルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ- ル、置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換 もしくは非置換の低級アルコキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールまたは 置換もしくは非置換のァロイルを表し、
R2eおよび R2dは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アル キルを表す)または式 (IV)
[化 28]
Figure imgf000106_0001
(式中、 R3eおよび R3dは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級ァ ルキル、置換もしくは非置換のァラルキルまたは置換もしくは非置換のァリールを表
R5は前記と同義である）で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体 [但し、アミノ酸また はアミノ酸誘導体が式 (III)のみであるとき、 Rle及び Rldの少なくとも一方は水素原子で あり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (IV)のみであるとき、 R5はヒドロキシである]で ある請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載の製造法。
アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式 (V)
[化 29]
Figure imgf000106_0002
(式中、 R ま置換もしくは非置換のメチルを表す)または式 (VI)
[化 30]
Figure imgf000106_0003
(式中、 R3eは置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のァラルキル または置換もしくは非置換のァリールを表す)で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導 体である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の製造法。
[8] アミノ酸またはアミノ酸誘導体が L アミノ酸、グリシンおよび |8—ァラニン力 なる群 より選ばれるアミノ酸またはその誘導体である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の
[9] L アミノ酸が L—ァラニン、 L グルタミン、 L グルタミン酸、 L—パリン、 L—口イシ ン、 L—イソロイシン、 L—プロリン、 L—フエ二ルァラニン、 L—トリプトファン、 Lーメチ ォニン、 L セリン、 L—スレオニン、 L システィン、 L ァスパラギン、 L チロシン、 L リジン、 L アルギニン、 L ヒスチジン、 L ァスパラギン酸、 L- a—ァミノ酪酸 、 L ァザセリン、 L—テアニン、 L— 4ーヒドロキシプロリン、 L— 3—ヒドロキシプロリン 、 L—オル-チン、 Lーシトルリンおよび L— 6—ジァゾ -5-ォキソノルロイシンから選ば れる L アミノ酸である、請求項 8記載の製造法。
[10] ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)が式 (Vila)
[化 31]
Figure imgf000107_0001
[式中、 n3aおよび n4aはそれぞれ前記 n1と同義であり、
R6aおよび R6bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級ァルケ-ル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換 もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは 非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のァロイルを表す力、または R6aおよび R6bのいずれか一方力 隣接する窒 素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上の R7aおよび R7bの いずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ R7aおよび R7bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または R6 6bNに隣接する炭素原子上の R7aおよ び R7bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子なら びに R6aおよび R6bの 、ずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を 形成してもよぐ n3aが 2または 3である場合、 2つまたは 3つの R7aおよび 2つまたは 3つの R7bはそれぞれ同一でも異なっていてもよぐ
R8aは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級ァ ルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ -ル、置換もしくは非置換のァラルキル
、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ力 ルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは非置換のァロイルを表 す力 または R が隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつ R9aおよび R9bと結 合する炭素原子ならびに該炭素原子上の R9aおよび R%のいずれか一方と一緒になつ て置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R9aおよび R9bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または- R N-に隣接する炭素原子上の R9aおよ び R9bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およ び R8aと一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ n4a力 ¾または 3 である場合、 2つまたは 3つの R9aおよび 2つまたは 3つの R%はそれぞれ同一でも異な つていてもよく、
R1Qaはァミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ (置換もしくは非 置換の低級アルキル)アミ入ジ (置換もしくは非置換の低級アルキル)ァミノまたは脂 環式複素環基を表す]で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である請求項 1
〜5の 、ずれか 1項に記載の製造法。
ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)が式 (Vllb)
[化 32]
(VI l b)
[式中、 n3Aおよび ιΛまそれぞれ前記 n1と同義であり、
R6Aおよび R6Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級ァルケ-ル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換 もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは 非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もし くは非置換のァロイルを表す力、または R6Aおよび R6Bのいずれか一方力 隣接する窒 素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上の R7Aおよび R7Bの いずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ R7Aおよび R7Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または R6AR6BNに隣接する炭素原子上の R7Aおよ び R7Bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子なら びに R6Aおよび R6Bのいずれか一方と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を 形成してもよぐ n3 ¾または 3である場合、 2つまたは 3つの R7Aおよび 2つまたは 3つ の R7Bはそれぞれ同一でも異なっていてもよぐ
R8Aは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級ァ ルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ -ル、置換もしくは非置換のァラルキル
、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ力 ルボニル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは非置換のァロイルを表 す力 または R8Aが隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつ R9Aおよび R9Bと結 合する炭素原子ならびに該炭素原子上の R9Aおよび R9Bのいずれか一方と一緒になつ て置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、 R9Aおよび R9Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換のァリールまたは置換もしくは 非置換の複素環アルキルを表すか、または- R8AN-に隣接する炭素原子上の R9Aおよ び R9Bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およ び R8Aと一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよぐ n4A力 ¾または 3 である場合、 2つまたは 3つの R9Aおよび 2つまたは 3つの R9Bはそれぞれ同一でも異な つていてもよく
R1QAは前記 R1Qaと同義である]で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である請 求項 1〜5のいずれか 1項に記載の製造法。
Figure imgf000110_0001
(式中、 R6eおよび R6dは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級ァ ルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキ- ル、置換もしくは非置換のァラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノィル、置換 もしくは非置換の低級アルコキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールまたは 置換もしくは非置換のァロイルを表し、
R7eおよび R7dは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アル キルを表し、
R9eおよび R9dは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァラルキルまたは置換もしくは非置換のァリールを表し、 R1Qaは前記と同義である）で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である請求 項 1〜6のいずれか 1項に記載の製造法。 ジペプチドまたはジペプチド誘導体（ΡΠ)が式 (Vlllb)
[化 34]
Figure imgf000111_0001
(Vl llb)
(式中、 Rb\ RB R' R' しおよび Ryuはそれぞれ前記 RM、 。、 R' R' R および R9dと同義であり、
R1QAは前記と同義である）で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である請求 項 1〜6のいずれか 1項に記載の製造法。
[14] ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)が式 (IXa)
[化 35]
Figure imgf000111_0002
(IXa)
(式中、 R7eは置換もしくは非置換のメチルを表し、
R9eは置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のァラルキルまたは置 換もしくは非置換のァリールを表す)で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体 である請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の製造法。
[15] ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (ΡΠ)が式 (IXb)
[化 36]
Figure imgf000112_0001
(IXb)
(式中、 R7Eおよび R9Eはそれぞれ前記 R7eおよび R9eと同義である）で表されるジぺプチ ドまたはジペプチド誘導体である請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の製造法。
[16] ジペプチドまたはジペプチド誘導体 (PI)ある ヽはジペプチドまたはジペプチド誘導体
(PII)力 L アミノ酸、グリシン、および |8—ァラニン、ならびにそれらの誘導体から 選ばれる同一または異なるアミノ酸またはアミノ酸誘導体がペプチド結合したジぺプ チドまたはジペプチド誘導体である、請求項 1〜8の 、ずれか 1項に記載の製造法。
[17] L アミノ酸が L ァラニン、 L グルタミン、 L グルタミン酸、 L—パリン、 L 口イシ ン、 L—イソロイシン、 L—プロリン、 L—フエ二ルァラニン、 L—トリプトファン、 Lーメチ ォニン、 L セリン、 L—スレオニン、 L システィン、 L ァスパラギン、 L チロシン、 L リジン、 L アルギニン、 L ヒスチジン、 L ァスパラギン酸、 L- a—ァミノ酪酸 、 L ァザセリン、 L—テアニン、 L— 4ーヒドロキシプロリン、 L— 3—ヒドロキシプロリン 、 L—オル-チン、 Lーシトルリンおよび L— 6—ジァゾ -5-ォキソノルロイシンから選ば れる L アミノ酸である、請求項 16記載の製造法。
[18] 細胞が微生物の細胞である、請求項 3〜 17のいずれか 1項に記載の製造法。
[19] 微生物が原核生物である、請求項 18記載の製造法。
[20] 原核生物が 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のペプチド取り込み活性を有す る蛋白質 (以下、ペプチド取り込み蛋白質とも 、う）の活性が低下または喪失した微 生物である、請求項 19記載の製造法。
[21] 原核生物が 3種以上のぺプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である、請 求項 19記載の製造法。
[22] ぺプチダーゼが配列番号 43〜46の 、ずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白 質、または配列番号 43〜46のいずれかで表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同 性を有するアミノ酸配列を有し、かつべプチダーゼ活性を有する蛋白質である、請求 項 20または 21記載の製造法。
[23] ペプチド取込み蛋白質が配列番号 47〜51のいずれかで表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質、または配列番号 47〜51のいずれかで表されるアミノ酸配列と 80%以 上の相同性を有する蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質であ る、請求項 20または 22記載の製造法。
[24] 原核生物がエシ リヒア属、バチルス属またはコリネバタテリゥム属に属する微生物で ある、請求項 19〜23のいずれか 1項に記載の製造法。
[25] ェシエリヒア属、バチルス属またはコリネバタテリゥム属に属する微生物力 ェシエリヒ ァ.コリ、コリネバタテリゥム 'グルタミクム、コリネバクテリウム'アンモニアゲネス、コリネ バタテリゥム.ラタトフアーメンタム、コリネバクテイルム'フラバム、コリネバクテリウム'ェ フイシエンス、バチルス ·サチルスまたはバチルス 'メガテリゥムである、請求項 24記載 の製造法。
[26] 培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得ら れる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、 該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌 体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より 抽出して得られる酵素標品であり、かつ 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体から ジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する処理物であることを特徴 とする、請求項 3〜25の 、ずれか 1項に記載の製造法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008126783A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-23 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. ジペプチドの製造法
US7939505B2 (en) 2007-05-04 2011-05-10 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2212419A1 (en) * 2007-10-31 2010-08-04 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Cyclodipeptide synthases (cdss) and their use in the synthesis of linear dipeptides
KR101185045B1 (ko) 2008-12-09 2012-09-26 서울대학교산학협력단 펩타이드?당 결합체를 이용한 당 가수분해 효소에 대한 특이적 저해제 및 이의 스크리닝 방법
CN102190705B (zh) * 2011-03-25 2012-12-26 天津启仁医药科技有限公司 精-鸟二肽合成方法
CN112280755B (zh) * 2020-11-06 2023-03-14 深圳瑞德林生物技术有限公司 一种突变酶及其应用和酶催化法制备三胜肽的工艺

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000003009A2 (de) * 1998-07-10 2000-01-20 Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gene zur biosynthese von anticapsin und bacilysin, ihre isolierung und verwendung
WO2003010189A1 (en) * 2001-07-26 2003-02-06 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing dipeptide, peptide synthase to be used therein and process for producing peptide synthase
US20040171106A1 (en) * 2002-12-26 2004-09-02 Hashimoto Shin-Ichi Process for producing dipeptides
US20050106703A1 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Microorganisms producing dipeptides and process for producing dipeptides using the microorganisms
WO2005052153A1 (ja) * 2003-11-27 2005-06-09 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ジペプチドの製造法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2365594A1 (en) * 1999-03-29 2000-10-05 Holland Sweetener Company V.O.F. Microbiological production method for .alpha.-l-aspartyl-l-phenylalanine
FR2841260B1 (fr) * 2002-06-21 2004-10-22 Commissariat Energie Atomique Polynucleotides et polypeptides codes par lesdits polynucleotides impliques dans la synthese de derives des dicetopiperazines
US20070243581A1 (en) * 2004-04-21 2007-10-18 Hashimoto Shin-Ichi Process for Producing Dipeptides

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000003009A2 (de) * 1998-07-10 2000-01-20 Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gene zur biosynthese von anticapsin und bacilysin, ihre isolierung und verwendung
WO2003010189A1 (en) * 2001-07-26 2003-02-06 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing dipeptide, peptide synthase to be used therein and process for producing peptide synthase
WO2003010307A1 (en) * 2001-07-26 2003-02-06 Ajinomoto Co., Inc. Peptide synthase gene, peptide synthase and process for producing dipeptide
WO2003010187A1 (fr) * 2001-07-26 2003-02-06 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de dipeptides, l-aminoacide amide hydrolase s'utilisant dans ce contexte et procede de production de l-aminoacide amide hydrolase
US20040171106A1 (en) * 2002-12-26 2004-09-02 Hashimoto Shin-Ichi Process for producing dipeptides
US20050106703A1 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Microorganisms producing dipeptides and process for producing dipeptides using the microorganisms
WO2005052153A1 (ja) * 2003-11-27 2005-06-09 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ジペプチドの製造法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GALPERIN M.Y. ET AL: "A diverse superfamily of enzymes with ATP-dependent carboxylate-amine/thiol ligase activity.", PROTEIN SCI., vol. 6, no. 12, 1997, pages 2639 - 2643, XP002991771 *
GLASER P. ET AL: "Basillus subtilis genome project: cloning and sequencing of the 97 kb region from 325 degrees to 333 degrees.", MOL MICROBIOL., vol. 10, no. 2, 1993, pages 371 - 384, XP002105620 *
KUNST F. ET AL: "The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis.", NATURE., vol. 390, no. 6657, 1997, pages 249 - 256, XP000919353 *
See also references of EP1767628A4 *
TABATA K ET AL: "ywfE in Bacillus subtilis codes for a novel enzyme, L-amino acid ligase.", J BACTERIOL., vol. 187, no. 15, 2005, pages 5195 - 5202, XP008054400 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008126783A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-23 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. ジペプチドの製造法
US8673590B2 (en) 2007-04-06 2014-03-18 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Method for producing dipeptide
US7939505B2 (en) 2007-05-04 2011-05-10 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
US8501824B2 (en) 2007-05-04 2013-08-06 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
US8877729B2 (en) 2007-05-04 2014-11-04 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
US9339461B2 (en) 2007-05-04 2016-05-17 Marina Biotech, Inc. Arginine-based lipids for delivery of therapeutics
US9731016B2 (en) 2007-05-04 2017-08-15 Marina Biotech, Inc. Tyrosine-based lipids for delivery of therapeutics

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