ES2525549T3 - Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos - Google Patents
Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2525549T3 ES2525549T3 ES11189701.3T ES11189701T ES2525549T3 ES 2525549 T3 ES2525549 T3 ES 2525549T3 ES 11189701 T ES11189701 T ES 11189701T ES 2525549 T3 ES2525549 T3 ES 2525549T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- oxidoreductase
- seq
- nucleic acid
- alkyl
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un cofactor con una oxidorreductasa, caracterizado porque se usa una oxidorreductasa que se selecciona del grupo que está constituido por las oxidorreductasas para las que (a) codifica la secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º: 16, o (b) codifica una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia de ácido nucleico mencionada en (a) en condiciones altamente rigurosas.
Description
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11189701
04-12-2014
DESCRIPCIÓN
Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos
La presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce con una oxidorreductasa. La invención se refiere además a nuevas oxidorreductasas para su uso en la reducción enantioselectiva de compuestos cetónicos para dar compuestos de hidroxilo quirales.
Los compuestos de hidroxilo ópticamente activos son módulos quirales valiosos con amplia aplicación para la síntesis de compuestos farmacológicamente activos, sustancias aromáticas, feromonas, compuestos agroquímicos e inhibidores de enzimas. A este respecto se registra en particular en el sector farmacéutico una necesidad creciente de compuestos quirales y por consiguiente tecnologías de síntesis quirales, dado que en el futuro ya apenas se usarán como fármacos los compuestos racémicos.
La reducción asimétrica de compuestos cetónicos proquirales es un sector de la catálisis estereoselectiva, en el que la biocatálisis representa una tecnología de competencia eficiente con respecto a la catálisis química. La hidrogenación asimétrica química requiere el uso de catalizadores de metales pesados con alto grado de toxicidad y contaminantes, de condiciones de reacción extremas y por consiguiente que requieren mucha energía así como grandes cantidades de disolventes orgánicos. Además, estos procedimientos están caracterizados con frecuencia por reacciones secundarias y excesos enantioméricos insuficientes.
Las reducciones de compuestos cetónicos proquirales para dar compuestos de hidroxilo y a la inversa se producen en la naturaleza en numerosas rutas bioquímicas, tanto en el metabolismo primario como en el metabolismo secundario, en cualquier organismo y se catalizan por distintos tipos de alcoholdeshidrogenasas secundarias y oxidorreductasas. Por regla general, estas enzimas dependen de cofactores.
La factibilidad principal del uso de biocatalizadores para la reducción de compuestos cetónicos proquirales para dar compuestos de hidroxilo quirales se demostró en el pasado de manera repetida por medio de sistemas de modelo, trabajándose tanto con oxidorreductasas aisladas como con distintos sistemas de biotransformación de células completas. A este respecto resultó ventajoso el planteamiento biocatalítico esencialmente con respecto a las condiciones de reacción suaves, productos secundarios ausentes y excesos enantioméricos obtenibles con frecuencia esencialmente mejores. El uso de enzimas aisladas es ventajoso en comparación con procedimientos con células completas con respecto al exceso enantiomérico obtenible, la producción de productos de degradación y secundarios como también con respecto al aislamiento del producto. Además no es posible el uso de procesos de células completas en cualquier empresa química, dado que para ello son necesarios un equipamiento especial y conocimientos técnicos.
Recientemente pudo mostrarse que el uso de oxidorreductasas aisladas en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos con disolventes orgánicos es posible de manera sumamente eficaz, económica y también en altas concentraciones (> 5%). En los sistemas descritos, a este respecto el compuesto cetónico que va a reducirse, en la mayoría de los casos poco soluble en agua forma junto con el disolvente orgánico la fase orgánica. Parcialmente puede prescindirse también del propio disolvente orgánico, entonces la fase orgánica se forma por el compuesto cetónico que va a reducirse (documentos DE 10119274, DE 10327454.4, DE 103 37 401.9, DE 103 00 335.5). La regeneración de coenzimas se realiza a este respecto mediante la oxidación simultánea de alcoholes secundarios, usándose en la mayoría de los casos el 2-propanol miscible con agua, económico.
Son ejemplos de oxidorreductasas y deshidrogenasas R-y S-específicas adecuadas de alta enantioselectividad:
carbonilrreductasa de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236, (Enzyme Microb Technol. 1993 Nov;15(11):950-8) ) y Pichia capsulata (documento DE10327454.4). Carbonilrreductasa de Rhodococcus erythropolis (RECR) (documento US 5.523.223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63
(10) (1999), páginas 1721-1729), (Appl Microbiol Biotechnol. Sep de 2003; 62(4):380-6. Epub 26 de abril de 2003), y Rhodococcus ruber (J Org Chem. 24 de enero de 2003; 68(2):402-6.).
Alcoholdeshidrogenasas secundarias R-específicas de organismos del género Lactobacillus (Lactobacillus kefir (documento US5200335), Lactobacillus brevis (documento DE 19610984 A1) (Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. diciembre de 2000; 56 Pt12:1696-8), Lactobacillus minor (documento DE10119274) o Pseudomonas (documento US 05385833) (Appl Microbiol Biotechnol. agosto de 2002; 59(4-5):483-7. Epub 26 de junio de 2002, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532)
Sin embargo, las enzimas conocidas actualmente no son ni remotamente suficientes para aprovechar todo el potencial comercial de reducciones estereoselectivas de compuestos cetónicos. Esto puede basarse por un lado en que las enzimas individuales disponen de propiedades muy distintas con respecto al espectro de sustrato, grados óptimos de pH así como estabilidades frente a temperatura y disolventes, que con frecuencia se complementan mutuamente. Por tanto, incluso enzimas homólogas proporcionalmente similares pueden presentar con respecto a un determinado sustrato un comportamiento de reacción completamente distinto. Por otro lado ni muchos menos todas las enzimas descritas están clonadas ni pueden sobre-expresarse en cantidad suficiente, lo que significa que
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11189701
04-12-2014
estas enzimas no están a disposición para una aplicación industrial. Por tanto es necesario para el aprovechamiento lo más amplio posible del potencial sintético de la hidrogenación asimétrica enzimática, disponer de una cartera lo más amplia posible de distintas oxidorreductasas accesibles industrialmente que además sean adecuadas para una aplicación en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos con disolventes orgánicos.
El objeto de la presente invención son ahora una serie de nuevas oxidorreductasas enantioselectivas, R-y Sespecíficas que se caracterizan por buena estabilidad en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos así como por buena capacidad de expresión en Escherichia coli (>500 unidades/g de biomasa húmeda de E. coli), así como un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral.
Las oxidorreductasas de acuerdo con la invención están caracterizadas porque presentan una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 70 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 8.
Los polipéptidos que corresponden a SEC ID N.º 8 pueden obtenerse a partir de levaduras, en particular a partir de levaduras del género Pichia, Candida, Pachysolen, Debaromyces o Issatschenkia, en particular a partir de Candida nemodendra DSMZ 70647. Es objeto de la invención además una secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º 16, que codifica para la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 8. La oxidorreductasa reduce 2-butanona preferentemente en R-2-butanol y oxida de los dos enantiómeros del 2-butanol preferentemente R-2-butanol.
La oxidorreductasa de Candida nemodendra presenta una actividad igual frente a R-2-butanol, 2-propanol y R-2octanol, además presenta la enzima también una actividad aproximadamente igual frente a 2-octanona.
La oxidorreductasa de Candida nemodendra es un homodímero con un peso molecular determinado en gel SDS de 27 2 kDa. El grado óptimo de pH para la reacción de reducción se encuentra para esta oxidorreductasa a 6,0 y el grado óptimo de pH para la reacción de oxidación se encuentra en el intervalo de 10-11. La oxidorreductasa de Candida nemodendra presenta una buena estabilidad frente al pH y disolventes y muestra en el intervalo de pH de 6,5 a 9,5 también en tiempos de incubación de varias horas una pérdida de actividad sólo baja. De los dos enantiómeros del 2-octanol oxida preferentemente S-2-octanol. Es muy adecuada también para la reducción del éster 4-haloacetoacetato en ésteres de ácido R-4-halo-3-hidroxibutírico.
La invención se refiere además a proteínas de fusión que están caracterizadas porque representan oxidorreductasas con la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 8, o sus homólogos, que están unidas peptídicamente con otro polipéptido en el extremo N terminal o carboxilo terminal. Las proteínas de fusión pueden separarse por ejemplo más fácilmente de otras proteínas o pueden expresarse de manera recombinante en cantidades mayores.
La invención se refiere además a anticuerpos que se unen específicamente a las oxidorreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 8, o sus homólogos. La preparación de estos anticuerpos se realiza de acuerdo con procedimientos conocidos mediante inmunización de mamíferos adecuados y posterior obtención de los anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.
Ciertas comparaciones de secuencias de aminoácidos pueden realizarse por ejemplo en la Internet en bancos de datos de proteína tales como por ejemplo SWISS-PROT, PIR así como en bancos de datos de ADN tales como por ejemplo EMBL, GenBank etc usando el programa FASTA o el programa BLAST.
El alineamiento óptimo se determina a este respecto con ayuda del algoritmo BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) (Altschul et al. 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87: 2264-2268). Como matriz de puntuación para el cálculo de la analogía de secuencia se tomó como base la matriz PAM30. (Dayhoff; M.O., Schwarz, R.M., Orcutt,
B.C. 1978. "A model of evolutionary change in Proteins in "Atlas of Protein Sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoff (ed) 345-352, National Biomedical Research foundation).
La invención se refiere además a un vector de clonación que contiene una o varias secuencias de ácido nucleico que codifican las carbonilrreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 8, o sus homólogos. La invención comprende además un vector de clonación de este tipo que contiene adicionalmente a la carbonilreductasa una enzima adecuada para la regeneración del NAD(P), tal como por ejemplo formiatodeshidrogenasas, alcoholdeshidrogenasas
o glucosadeshidrogenasa.
La invención se refiere además a un vector de expresión que se encuentra en una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero y contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica las carbonilrreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 8, o sus homólogos y está unida de manera adecuada con una secuencia control de expresión. La invención se refiere además a una célula huésped recombinante que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto, vegetal o de mamífero y se transformó o se transfectó con un vector de expresión de este tipo así como a un procedimiento de preparación para la obtención de una carbonilrreductasa que se basa en el cultivo de una célula huésped recombinante de este tipo.
Ciertos vectores de clonación adecuados son por ejemplo ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratagene), pDrive cloning Vector (Quiagen, Hilden, Alemania), pS Blue, pET Blue, vectores pET LIC (Novagen, Madison,
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11189701
04-12-2014
EE.UU.) así como vectores de clonación de TA-PCR (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).
Ciertos vectores de expresión adecuados son por ejemplo pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1/pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL o pTrx.
Ciertas secuencias control de expresión adecuadas son por ejemplo promotor trp-lac (tac), promotor trp-lac (trc), promotor lac, promotor T7 o promotor λpL.
Las oxidorreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 8, o sus homólogos pueden obtenerse de modo que se cultivan las células E. coli recombinantes mencionadas anteriormente, se induce la expresión de la correspondiente oxidorreductasa y a continuación tras aproximadamente de 10 a 18 horas (h) se rompen las células mediante tratamiento con ultrasonidos, mediante molienda en húmedo con perlas de vidrio en un molino de bolas (Retsch, GmbH, Haan Alemania 10 min, 24 Hz) o por medio de homogeneizador de alta presión. El extracto de células obtenido puede usarse o bien directamente o puede purificarse posteriormente. Para ello, por ejemplo, se centrifuga el extracto de células y el sobrenadante obtenido se somete a una cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico en Q-Sepharose Fast Flow® (Pharmacia).
La invención se refiere además a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un co-factor con una oxidorreductasa, caracterizado porque se usa una oxidorreductasa que presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 70 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 8.
Otra forma de realización preferente del procedimiento de acuerdo con la invención consiste en que el compuesto cetónico presenta la fórmula general I
R1-C(O)-R2 (I)
en la que R1 representa uno de los restos
1) alquilo (C1-C20), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 2) alquenilo (C2-C20), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene hasta cuatro dobles enlaces, 3) alquinilo (C2-C20), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene hasta cuatro triples enlaces, 4) arilo (C6-C14), 5) alquil-(C1-C8)-arilo (C6-C14), 6) heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, o 7) cicloalquilo (C3-C7), estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, y R2 representa uno de los restos 8) alquilo (C1-C6), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 9) alquenilo (C2-C6), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene hasta tres dobles enlaces, 10) alquinilo (C2-C6), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene dos triples enlaces, o 11) alquil-(C1-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o está sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, estando los restos mencionados anteriormente en 8) a 11) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2.
La invención se refiere además a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un co-factor con una oxidorreductasa, que se caracteriza porque se usa una oxidorreductasa para la que
- (a)
- codifica la secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º 16, o para la que
- (b)
- codifica una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia de ácido nucleico mencionada en (a) en condiciones altamente rigurosas.
Por el término arilo se entiende restos de hidrocarburo aromáticos con 6 a 14 átomos de carbono en el anillo. Los restos arilo (C6-C14) son por ejemplo fenilo, naftilo, por ejemplo 1-naftilo, 2-naftilo, bifenililo, por ejemplo 2-bifenililo, 3bifenililo y 4-bifenililo, antrilo o fluorenilo. Los restos bifenililo, restos naftilo y en particular restos fenilo son restos arilo preferentes. Por el término "halógeno" se entiende un elemento de la serie flúor, cloro, bromo o yodo. Por el término "alquilo (C1-C20)" se entiende un resto de hidrocarburo, cuya cadena de carbono es lineal o ramificada y contiene de 1 a 20 átomos de carbono por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo,
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11189701
04-12-2014
heptilo, octilo, nonenilo o decanilo. Por el término "alquilo C0" se entiende un enlace covalente.
Por el término "cicloalquilo (C3-C7)" se entiende restos de hidrocarburo cíclicos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo.
El término "heterociclo (C5-C14)" representa un anillo heterocíclico de 5 miembros a 14 miembros monocíclico o bicíclico, que está parcialmente saturado o completamente saturado. Son ejemplos de heteroátomos N, O y S. Son ejemplos de los términos heterociclo (C5-C14) restos que se derivan de pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 2-óxidos de 1,2,3,5-oxatiadiazol, triazolonas, oxadiazolonas, isoxazolonas, oxadiazolidindionas, triazoles, que están sustituidos con F, -CN, -CF3 o -C(O)-O-alquilo (C1-C4), 3-hidroxipirro-2,4dionas, 5-oxo-1,2,4-tiadiazoles, piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinnolina, carbolina y derivados benzocondensados, derivados ciclopentacondensados, ciclohexacondensados o cicloheptacondensados de estos heterociclos. En particular se prefieren los restos 2-o 3pirrolilo, fenilpirrolilo tal como 4-o 5-fenil-2-pirrolilo, 2-furilo, 2-tienilo, 4-imidazolilo, metil-imidazolilo, por ejemplo 1metil-2-, -4-o -5-imidazolilo, 1,3-tiazol-2-ilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, N-óxido de 2-, 3-o 4-piridilo, 2-pirazinilo, 2-, 4-o 5-pirimidinilo, 2-, 3-o 5-indolilo, 2-indolilo sustituido, por ejemplo 1-metil-, 5-metil-, 5-metoxi-, 5-benciloxi-, 5cloro-o 4,5-dimetil-2-indolilo, 1-bencil-2-o -3-indolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-2-indolilo, ciclohepta[b]-5-pirrolilo, 2-, 3-o 4quinolilo, 1-, 3-o 4-isoquinolilo, 1-oxo-1,2-dihidro-3-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 2-benzofuranilo, 2-benzo-tienilo, 2benzoxazolilo o benzotiazolilo o dihidropiridinilo, pirrolidinilo, por ejemplo 2-o 3-(N-metilpirrolidinilo), piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrotienilo o benzodioxolanilo.
Los compuestos preferentes de fórmula I son por ejemplo 4-cloroacetoacetato de etilo, acetoacetato de metilo, ácido etil-8-cloro-6-oxooctanoico, 3-oxovaleriato de etilo, 4-hidroxi-2-butanona, 2-oxovaleriato de etilo, ácido etil-2-oxo-4fenilbutírico, piruvato de etilo, fenilglioxilato de etilo, 1-fenil-2-propanona, 2-cloro-1-(3-clorofenil)etan-1-ona, acetofenona, 2-octanona, 3-octanona, 2-butanona, 1-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]etan-1-onas, 2,5-hexanodiona, 1,4dicloro-2-butanona, acetoxiacetona, cloruro de fenacilo, 4-bromoacetoacetato de etilo, 1,1-dicloroacetona, 1,1,3tricloroacetona o 1-cloroacetona.
Las oxidorreductasas pueden usarse en el procedimiento de acuerdo con la invención o bien de manera completamente purificada o de manera parcialmente purificada o pueden realizarse con células que contienen las oxidorreductasas de acuerdo con la invención. Las células usadas pueden encontrarse a este respecto de manera nativa, permeabilizada o lisada. Preferentemente se usan las oxidorreductasas clonadas de acuerdo con SEC ID N.º 8, o sus homólogos.
Por cada kg de compuesto de fórmula I que va a reaccionar se usan de 5000 a 10 millones de U de oxidorreductasa. (abierto hacia arriba) La unidad enzimática 1 U corresponde a este respecto a la cantidad de enzima que se requiere para hacer reaccionar 1 mol del compuesto de fórmula I por minuto (min).
La propia reducción enzimática se desarrolla en condiciones suaves, de modo que los alcoholes generados no reaccionen posteriormente. Los procedimientos de acuerdo con la invención presentan un alto tiempo de permanencia y una pureza enantiomérica de por regla general más del 95 % de los alcoholes quirales preparados y un alto rendimiento con respecto a la cantidad usada de compuestos cetónicos.
El compuesto de carbonilo se usa en el procedimiento de acuerdo con la invención en una cantidad del 3 % al 50 % con respecto al volumen total, preferentemente del 5 % al 40 %, en particular del 10 % -30 %.
Una forma de realización preferente de la invención está caracterizada además porque el NAD o NADP formado en la reducción se reduce continuamente con un cosustrato para dar NADH o NADPH.
Como cosustrato se usan a este respecto preferentemente alcoholes primarios y secundarios, tales como etanol, 2propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-heptanol, 2-octanol o ciclohexanol.
Estos cosustratos se hacen reaccionar con ayuda de una oxidorreductasa y NAD o NADP para dar los correspondientes aldehídos o cetonas y NADH o NADPH. Debido a ello se produce la regeneración del NADH o NADPH. La proporción del cosustrato para la regeneración asciende a este respecto a del 5 % al 95 % en volumen, con respecto al volumen total.
Para la regeneración del cofactor puede añadirse adicionalmente una alcoholdeshidrogenasa. Las alcoholdeshidrogenasas dependientes de NADH adecuadas pueden obtenerse por ejemplo de levadura de panadería, de Candida boidinii, Candida parapsilosis o Pichia capsulata. Las alcoholdeshidrogenasas dependientes de NADPH adecuadas se producen además en Lactobacillus brevis (documento DE 196 10 984 A1), Lactobacillus minor (documento DE 101 19 274), Pseudomonas (US 5.385.833) o en Thermoanaerobium brockii. Los cosustratos adecuados para estas alcoholdeshidrogenasas son los alcoholes secundarios ya mencionados tales como etanol, 2propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol , 4-metil-2-pentanol, 2-octanol o ciclohexanol.
Además puede realizarse la regeneración del cofactor por ejemplo también por medio de formiato-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formate dehydrogenase). Los cosustratos adecuados de la formiato
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E11189701
04-12-2014
deshidrogenasa son por ejemplo sales del ácido fórmico tales como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio. Preferentemente se realizan los procedimientos de acuerdo con la invención sin embargo sin una deshidrogenasa adicional de este tipo, es decir no tiene lugar una regeneración de coenzima acoplada al sustrato.
La parte acuosa de la mezcla de reacción, en la que se desarrolla la reducción enzimática, contiene preferentemente un tampón, por ejemplo tampón fosfato de potasio, Tris/HCl o trietanolamina, con un valor de pH de 5 a 10, preferentemente un valor de pH de 6 a 9. El tampón puede contener adicionalmente aún iones para la estabilización
o activación de las enzimas, por ejemplo iones zinc o iones magnesio.
La temperatura asciende durante la realización de los procedimientos de acuerdo con la invención convenientemente a de aproximadamente 10 ºC a 70 ºC, preferentemente de 20 ºC a 40 ºC.
En otra forma de realización preferente de los procedimientos de acuerdo con la invención se realiza la reacción enzimática en presencia de un disolvente orgánico no miscible con agua o miscible con agua sólo de manera limitada. Este disolvente es por ejemplo un dialquil(C1-C6)éter simétrico o asimétrico, un alcano de cadena lineal o ramificada o cicloalcano o un alcohol secundario insoluble en agua, que a la vez representa el cosustrato. Los disolventes orgánicos preferentes son por ejemplo dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de butilo, heptano, hexano, 2-octanol, 2-heptanol, 4-metil-2-pentanol o ciclohexano. El disolvente puede servir a este respecto también simultáneamente como cosustrato para la regeneración del cofactor.
La mezcla de reacción, en caso del uso de disolventes insolubles en agua o cosustratos, está compuesta de una fase acuosa y de una fase orgánica. El sustrato se distribuye de manera correspondiente a su solubilidad entre la fase orgánica y la acuosa. La fase orgánica tiene generalmente una proporción del 5 % al 95 %, preferentemente del 10 % al 90 % con respecto al volumen de reacción total. Las dos fases líquidas se mezclan preferentemente de manera mecánica, de modo que se genera entre las mismas una gran superficie. También en esta forma de realización puede reducirse el NAD o NADP formado en la reducción enzimática con un cosustrato, tal como se ha descrito, de nuevo para dar NADH o NADPH.
La concentración del cofactor NADH o NADPH en la fase acuosa asciende generalmente a de 0,001 mM a 1 mM, en particular de 0,01 mM a 0,1 mM.
En los procedimientos de acuerdo con la invención puede usarse aún un estabilizador de la oxidorreductasa/deshidrogenasa. Los estabilizadores adecuados son por ejemplo glicerina, sorbitol, 1,4-DLditiotreitol (DTT) o dimetilsulfóxido (DMSO).
El procedimiento de acuerdo con la invención se realiza por ejemplo en un recipiente de reacción cerrado de vidrio o metal. Para ello se transfieren los componentes individualmente al recipiente de reacción y se agitan bajo una atmósfera de por ejemplo nitrógeno o aire. El tiempo de reacción asciende a de 1 hora a 48 horas, en particular de 2 horas a 24 horas.
A continuación se procesa la mezcla de reacción. Para ello se separa la fase acuosa, se filtra la fase orgánica. La fase acuosa puede extraerse dado el caso otra vez y como la fase orgánica puede procesarse posteriormente. Después se evapora dado el caso el disolvente de la fase orgánica filtrada.
La invención se refiere además a un procedimiento para la obtención de compuesto de hidroxilo quiral de fórmula II,
R1-C(OH)-R2 (II)
en la que R1 y R2 se definen como anteriormente, que se caracteriza porque
a) se incuba una mezcla que contiene el compuesto racémico de fórmula II en presencia de una de las oxidorreductasas de acuerdo con la invención de acuerdo con SEC ID N.º 8, o sus homólogos, NAD(P) y agua, convirtiéndose un enantiómero de compuesto de hidroxilo de fórmula II en el compuesto cetónico correspondiente y NAD(P)H, y b) se aísla el enantiómero que queda del compuesto de hidroxilo de fórmula II.
En caso del uso de las carbonilrreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 8 se obtienen a este respecto preferentemente los correspondientes compuestos de S-hidroxilo quirales.
Las condiciones de reacción son esencialmente las mismas que en el procedimiento mencionado anteriormente para la reducción enantioespecífica del compuesto cetónico de fórmula I. Sin embargo, en lugar de una reducción enantioselectiva del compuesto cetónico de fórmula I, de la mezcla racémica del compuesto de fórmula II se oxida únicamente un enantiómero del compuesto de hidroxilo de fórmula II de manera enantioselectiva para dar el correspondiente compuesto cetónico. Debido a ello permanece el enantiómero opuesto del compuesto de hidroxilo de fórmula II y puede aislarse. Además, en el procedimiento se usa en lugar de los alcoholes usados como cosustratos tales como etanol, 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol o 2-octanol, sus correspondientes cetonas tales como acetona para la regeneración del NAD. Por ejemplo se hace reaccionar la acetona y NAD(P)H con la oxidorreductasa de acuerdo con la invención o una deshidrogenasa adicional para dar NAD e isopropanol.
5
10
15
20
25
30
35
40
E11189701
04-12-2014
Las formas de realización preferentes de la invención se explican aún en más detalle con los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1:
Cultivo de organismos y selección según la actividad carbonilrreductasa
Para la selección se cultivaron las cepas de levadura Candida nemodendra DSMZ 70647 en el siguiente medio: extracto de levadura (3), extracto de malta (3), peptona (5) y glucosa (10) (los números entre paréntesis son respectivamente g/l). El medio se esterilizó a 121 ºC y las levaduras se cultivaron sin regulación de pH posterior a 25 ºC y en un agitador a 160 revoluciones por minuto (rpm).
A continuación se resuspendieron 125 mg de células con 800 l de tampón de disgregación (trieetanolamina (TEA) 100 mM, pH = 7,0), se mezclaron con 1 g de perlas de vidrio y se trataron durante 10 minutos (min) a 4 ºC en el molino de bolas (Retsch). El sobrenadante (lisado) obtenido tras centrifugación de 2 min a 12000 rpm se usó en la siguiente selección de actividad y para la determinación del exceso enantiomérico (valor ee). Como sustratos se usaron distintas cetonas, tales como 2-butanonas, 2-octanona, 4-cloroacetoacetato de etilo, acetofenona o ácido de etil-2-oxo-4-fenilbutírico.
Mezcla de reacción para la selección de actividad:
860 l KH2PO4/K2PO4 0,1 M pH = 7,0, MgCl2 1 mM
20 l NADPH o NADH (10 mM)
20 l lisado
100 l sustrato (100 mM)
La reacción se siguió durante 1 min a 340 nm.
Mezcla de reacción para la determinación del valor ee:
20 l lisado
100 l NADH o NADPH (50 mM)
60 l sustrato (100 mM)
Las mezclas de reacción para la determinación del ee se extrajeron tras 24 horas (h) por ejemplo con cloroformo y por medio de cromatografía de gases (CG) se determinó el exceso enantiomérico. El exceso enantiomérico se calcula tal como sigue:
Tabla 1
- N.º de DSMZ
- Microorganismo Actividad en U/g de células de organismos huésped
- 2-Butanona
- 2-Octanona
- NADH
- NADPH NADH NADPH
- 70647
- Candida nemodendra 45 ----- 12 ------
DSMZ representa la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellculturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig. Definición de las unidades de enzima: 1 U corresponde a la cantidad de enzima que se requiere para hacer reaccionar 1 mol de sustrato por min.
Ejemplo 2:
Aislamiento y purificación de oxidorreductasas microbianas dependientes de NAD(P)H
Para el aislamiento de las oxidorreductasas microbianas dependientes de NAD(P)H se cultivaron los microorganismos tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Tras alcanzar la fase estacionaria se recogieron las células y mediante centrifugación se separaron del medio. La liberación de enzimas se realizó mediante molienda en húmedo por medio de perlas de vidrio, sin embargo puede conseguirse también mediante otros procedimientos de disgregación. Para ello se suspendieron por ejemplo 100 g de masa húmeda de células con 400 ml de tampón de disgregación (trietanolamina 100 mM, MgCl2 1 mM, pH =7,0) y se homogeneizaron por medio de una prensa francesa.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E11189701
04-12-2014
El extracto bruto obtenido tras la centrifugación (7000 rpm) se purificó posteriormente entonces por medio de FPLC (fast protein liquid chromatography, cromatografía de líquidos rápida de proteínas).
Todas las oxidorreductasas de acuerdo con la invención pudieron purificarse mediante combinaciones distintas de cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo en Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) o Uno Q (Biorad, Múnich, Alemania), de cromatografía de interacción hidrófoba, por ejemplo en Octylsepharose Fast Flow o Butylsepharose Fast Flow (Pharmacia), cromatografía en cerámica-hidroxiapatita y permeación en gel.
Ejemplo 4:
Estrategia de clonación general de una alcoholdeshidrogenasa enantioselectiva aislada de levaduras
Se extrae ADN cromosómico de acuerdo con el procedimiento descrito en "Molecular cloning" de Manniatis & Sambrook. El ácido nucleico resultante sirve como matriz para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores degenerados. A este respecto se derivan cebadores en 5’ de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 66; 72; 80) y los cebadores en 3’ de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 67; 73, 81) con inclusión del código genético específico para el organismo (SEC ID N.º 68; 69; 74; 75; 82; 83).
La amplificación se realiza en tampón de PCR [Tris-HCl 67 mM (pH 8,3), (NH4)2SO4 16 mM, MgCl2 115 mM, Tween 20 al 0,01 %], mezcla de desoxi-nucleotidotrifosfato (dNTPs) 0,2 mM, 40 pmol por cebador y 2,5 U de polimerasa BioTherm Star (Genecraft, Lüdingshausen, Alemania)]. Tras una activación de la polimerasa BioTherm Star (8 min 95 ºC) y 45-50 ciclos posteriores de una PCR Touch-Down se enfría la reacción hasta 4 ºC y toda la mezcla de reacción de PCR se aplica en un gel de agarosa al 1 % para su análisis.
El fragmento específico que resulta de la reacción en cadena de la polimerasa se liga en el vector de clonación TA pCR2.1 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se secuencia con los cebadores M13 rev (SEC ID N.º 65) y M13 uni (SEC ID N.º 128) con ayuda del secuenciador de ADN ABI.
Las zonas de extremo 5’ y 3’ terminales de la secuencia génica codificante se determinan con ayuda del procedimiento RACE (rapid amplification of cDNA ends, amplificación rápida de extremos de ADNc). Basándose en la secuencia de ácido nucleico del fragmento específico se construyen oligonucleótidos para 3’-RACE y 5’-RACE. Como matriz para la síntesis de la primera cadena de ADNc con ayuda del sistema 3’-RACE (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) sirve ARN total preparado a partir de las células. Sigue una amplificación y una reamplificación del ADNc específico con ayuda de oligonucleotidos 3’-RACE (SEC ID N.º 76; 77; 84; 85). A continuación se aplica la mezcla de reacción para su análisis en un gel de agarosa al 1 %. El fragmento específico, que lleva la información de secuencia flanqueante en 3’ ausente, se liga de manera aislada en un vector de clonación TA pCR2.1 y se secuencia.
Las secuencias codificantes y no codificantes en extremo 5’ terminal se determinan con ayuda del sistema 5’-RACE (Invitrogen). Para ello se acumula con ayuda de oligo dT-celulosa (NEB, Beverly, EE.UU.) ARNm a partir del ARN total obtenido previamente y se aplica en la síntesis de la primera cadena de ADNc con los oligonucleótidos específicos del gen (SEC ID N.º 70; 71; 78; 79; 86; 87). La amplificación y reamplificación posteriores del ADNc específico da como resultado un fragmento que se liga para el análisis en un vector de clonación TA pCR2.1 (Invitrogen). El plásmido que contiene el fragmento se analiza con ayuda de un secuenciador de ADN ABI. Por consiguiente se obtiene la información de secuencia ausente sobre el extremo en 5’ del gen.
Basándose en la secuencia que codifica el gen de longitud completa se construyen cebadores específicos para una clonación posterior de este segmento de ADN en un sistema de expresión adecuado. Para ello se modifican por ejemplo el cebador en 5’ con una secuencia de reconocimiento para Nde I, o con una secuencia de reconocimiento para Sph I, o para BamHI y cebador en 3’ con una secuencia de reconocimiento para Hind III.
El ADN cromosómico sirve como matriz en la siguiente PCR. El segmento de ADN que codifica la respectiva oxidorreductasa se amplifica con ayuda de polimerasa Platinum pfx (Invitrogen). El producto de PCR resultante se trata tras la purificación a través de un gel agarosa al 1 % con correspondientes ADN endonucleasas y se liga en la estructura principal del vector pET21a (Novagen, Madison, EE.UU.), o la estructura principal del vector pQE70 (Qiagen, Hilden, Alemania) tratada con las mismas endonucleasas.
El constructo de expresión producido se lleva a la secuenciación en cepa de expresión BL21 Star (Invitrogen), o RB791 (E. coli genetic stock, Yale, EE.UU.).
Ejemplo 5:
Estrategia de clonación general de una oxidorreductasa enantioselectiva aislada de bacterias
Se extrae ADN cromosómico de acuerdo con el procedimiento descrito en "Molecular cloning" de Manniatis & Sambrook. El ácido nucleico resultante sirve como matriz para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores degenerados. A este respecto se derivan cebadores en 5’ de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 104; 112) y los cebadores en 3’ de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 105; 113) con inclusión del código
10
15
20
25
30
35
40
45
E11189701
04-12-2014
genético específico para el organismo (SEC ID N.º 106; 107; 114; 115).
La amplificación se realiza en tampón de PCR [Tris-HCl 67 mM (pH 8,3), (NH4)2SO4 16 mM, MgCl2 115 mM, Tween 20 al 0,01 %], mezcla de desoxi-nucleotidotrifosfato (dNTPs) 0,2 mM, 40 pmol por cebador y 2,5 U de polimerasa BioTherm Star (Genecraft, Lüdingshausen, Alemania)]. Tras una activación de la polimerasa BioTherm Star (8 min 95 ºC) y 45-50 ciclos posteriores de una PCR Touch-Down se enfría la reacción hasta 4 ºC y toda la mezcla de reacción de PCR se aplica en un gel de agarosa al 1 % para su análisis.
El fragmento específico que resulta de la reacción en cadena de la polimerasa se liga en el vector de clonación TA pCR2.1 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se secuencia con los cebadores M13 rev (SEC ID N.º 65) y M13 uni (SEC ID N.º 128) con ayuda del secuenciador de ADN ABI.
Las zonas flanqueantes en 5’ y 3’ de la secuencia génica codificante se determinan con ayuda del procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa inversa (iPCR). Basándose en la secuencia de ácido nucleico del fragmento interno específico se construyen oligonucleótidos de SEC ID N.º 100; 101; 102; 103; 108; 109; 110; 111; 116; 117; 118; 119. El ADN genómico se digiere con ayuda de una endonucleasa de restricción y se usa en una religación, de modo que circularizan segmentos de ADN más pequeños. Esta mezcla de religación se usa entonces como matriz para una iPCR y cebadores de SEC ID N.º 100; 102; 108; 110; 116; 118. La señal de PCR se refuerza mediante PCR anidada posterior con cebadores de SEC ID N.º 101; 103; 109; 111; 117; 119. El fragmento específico resultante se liga tras la elución del gel de agarosa al 1 % en el vector pCR2.1 (Invitrogen).
Por consiguiente, el análisis de secuenciación del vector pCR2.1 que contiene el fragmento proporciona la información de secuencia ausente sobre zonas codificantes en 3’ y 5’ del gen de alcoholdeshidrogenasa / reductasa.
Basándose en la secuencia que codifica el gen de longitud completa (SEC ID N.º 12; 13; 14) se construyen cebadores específicos para una clonación posterior de este segmento de ADN en un sistema de expresión adecuado. A este respecto se modifican cebador en 5’ con una secuencia de reconocimiento para Nde I, o con una secuencia de reconocimiento para Sph I, o para BamHI y cebador en 3’ con una secuencia de reconocimiento para Hind III (SEC ID N.º 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127).
La amplificación del ADN de longitud completa que codifica la proteína a partir del ADN genómico con restricción y ligación posterior en el vector de expresión se realiza tal como se ha descrito en el ejemplo 3. La cepa de expresión BL21Star (Invitrogen), o RB791 (E. coli genetic stock, Yale, EE.UU.) se transforma con el constructo de expresión producido.
Ejemplo 6:
Expresión de alcoholdeshidrogenasas / reductasas recombinantes en E. coli
Las cepas de Escherichia coli transformadas con el constructo de expresión BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), o RB791 (E. coli genetic stock, Yale, EE.UU.) se cultivaron en 200 ml de medio LB (1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 1 % de NaCl) con ampicilina (50 g / ml), o carbenicilina (50 g / ml), hasta que se consiguió una densidad óptica medida a 550 nm de 0,5. La expresión de proteína recombinante se indujo mediante adición de isopropiltiogalactósido (IPTG) en una concentración de 0,1 mM. Tras inducción durante 8 horas, o tras inducción durante 16 horas a 25 ºC y 220 rpm se recogieron las células y se congelaron a -20 ºC. Para la prueba de actividad se mezclaron 10 mg de células con 500 l de tampón TEA 100 mM pH 7,0 y 500 l de perlas de vidrio y se trataron durante 10 min por medio de un molino de bolas. El lisado obtenido se usó entonces de manera diluida para las mediciones correspondientes. La prueba de actividad se compone tal como sigue: 870 l de tampón TEA 100 mM pH 7,0, 160 g de NAD(P)H, 10 l de lisado celular diluido. La reacción se inició con la adición de 100 l de una solución de sustrato 100 mM a la mezcla de reacción.
- vector de expresión
- cepa de expresión sustrato Actividad U / g
- SEC ID N.º 8
- pET21a BL21 Star CLAEE 7000 U/g
Ejemplo 7:
Caracterización de las oxidorreductasas recombinantes 7a: grado óptimo de pH
Se prepararon los tampones mencionados en la tabla 4. La concentración de los respectivos componentes de tampón ascendía respectivamente a 50 mM.
E11189701
04-12-2014
Tabla 4
- Valor de pH
- Sistema tampón Valor de pH Sistema tampón
- 4
- acetato de Na/ácido acético 7,5 KH2PO4/K2PO4
- 4,5
- acetato de Na/ácido acético 8 KH2PO4/K2PO4
- 5
- acetato de Na/ácido acético 8,5 KH2PO4/K2PO4
- 5,5
- KH2PO4/K2PO4 9 Glicina/NaOH
- 6
- KH2PO4/K2PO4 9,5 Glicina/NaOH
- 6,5
- KH2PO4/K2PO4 10 Glicina/NaOH
- 7
- KH2PO4/K2PO4 11 Glicina/NaOH
Reducción del grado de óptimo de pH de la mezcla de reacción de medición (30 ºC): 870 l de los sistemas tampón mencionados respectivamente en la tabla 3 5 20 l NAD(P)H 10 mM 10 l enzima diluida Se incubó durante aproximadamente de 2 a 3 min, después se realizó la adición de 100 l de solución de sustrato (100 mM) Como sustrato se usaron, dependiendo de la oxidorreductasa, 2-butanona o 2-octanona. La reacción se siguió 10 durante 1 min a 340 nm. Para la determinación del grado óptimo de pH se determinó la reacción enzimática en el
respectivo tampón mencionado en la tabla 4. Para la determinación del grado óptimo de pH para la reacción de oxidación se usó como cofactor NAD(P) y como sustrato 2-propanol o 2-octanol. En la tabla 5 están agrupados los resultados para las oxidorreductasas de acuerdo con la invención.
Tabla 5:
- N.º de DSMZ
- microorganismo grado óptimo de pH de reducción grado óptimo de pH de oxidación
- 70647
- Candida nemodendra 6 10-11
15
7b: estabilidad frente a pH
La determinación de la actividad de las oxidorreductasas recombinantes se sometió a estudio mediante almacenamiento en los sistemas tampón mencionados en la tabla 4. Para ello se fijaron los distintos tampones (50 mM) en el intervalo de pH de 4 a 11 y las oxidorreductasas preparadas de acuerdo con el ejemplo 4 se diluyeron con
20 esto. Tras incubación durante 30, 60 y 120 min se extrajeron de la mezcla de reacción 10 l y se usaron en la prueba de la actividad de acuerdo con el ejemplo 1.
El valor de partida es a este respecto el valor de medición, que se obtuvo directamente tras la dilución (1:20) de la enzima en tampón fosfato de potasio 50 mM pH = 7,0. Este valor correspondía en las condiciones predeterminadas a una modificación de la extinción de aproximadamente 0,70 /min y se estableció como el valor del 100 % y todos
25 los valores de medición siguientes se establecieron con respecto a este valor en proporción.
En la tabla 6 están agrupados los intervalos de pH para las oxidorreductasas de acuerdo con la invención, presentando la enzima, con incubación durante 120 min, no menos del 50 % de la actividad de partida.
Tabla 6:
- N.º de DSMZ
- Microorganismo Estabilidad frente a intervalo de pH
- 70647
- Candida nemodendra 6,5-9,5
Claims (5)
- E1118970104-12-2014REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un cofactor con una oxidorreductasa, caracterizado porque5 se usa una oxidorreductasa que se selecciona del grupo que está constituido por las oxidorreductasas para las que
- (a)
- codifica la secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º: 16, o
- (b)
- codifica una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia de ácido nucleico mencionada en (a) en condiciones altamente rigurosas.
- 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto cetónico presenta la 10 fórmula general IR1-C(O)-R2 (I),en la que R1 representa uno de los restos1) alquilo (C1-C20), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 2) alquenilo (C2-C20), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene hasta cuatro15 dobles enlaces, 3) alquinilo (C2-C20), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene hasta cuatro triples enlaces, 4) arilo (C6-C14), 5) alquil-(C1-C8)-arilo (C6-C14),20 6) heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, o 7) cicloalquilo (C3-C7), estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2,25 y R2 representa uno de los restos 8) alquilo (C1-C6), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 9) alquenilo (C2-C6), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene hasta tres dobles enlaces, 10) alquinilo (C2-C6), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene dos triples30 enlaces, o 11) alquil-(C1-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o está sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, estando los restos mencionados anteriormente en 8) a 11) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2.
- 35 3. Vector de clonación, que contiene una o varias secuencias de ácido nucleico que codifican la oxidorreductasa de acuerdo con SEC ID N.º: 8.
- 4. Vector de expresión, que se encuentra en una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero in vitro y contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la oxidorreductasa de acuerdo con SEC ID N.º: 8 y está unida con una secuencia control de expresión.
- 40 5. Célula huésped recombinante que es una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero y se transformó o se transfectó con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4.
- 6. Oxidorreductasa para su uso en un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque es codificada por la secuencia de ácido nucleico que se selecciona del grupo que está constituido por SEC ID N.º: 16 y una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia SEC ID N.º:45 16 en condiciones altamente rigurosas.
- 7. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un co-factor, caracterizado porque se usa una oxidorreductasa que presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 70 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la secuencia de50 aminoácidos SEC ID N.º: 8.57
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT12612005 | 2005-07-27 | ||
| AT0126105A AT502395B1 (de) | 2005-07-27 | 2005-07-27 | Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2525549T3 true ES2525549T3 (es) | 2014-12-26 |
Family
ID=37216025
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES11189701.3T Active ES2525549T3 (es) | 2005-07-27 | 2006-07-20 | Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos |
| ES11189708.8T Active ES2534657T3 (es) | 2005-07-27 | 2006-07-20 | Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos |
| ES11189703.9T Active ES2524167T3 (es) | 2005-07-27 | 2006-07-20 | Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES11189708.8T Active ES2534657T3 (es) | 2005-07-27 | 2006-07-20 | Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos |
| ES11189703.9T Active ES2524167T3 (es) | 2005-07-27 | 2006-07-20 | Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20090311762A1 (es) |
| EP (5) | EP1907556A1 (es) |
| JP (1) | JP2009502148A (es) |
| KR (2) | KR101354546B1 (es) |
| CN (1) | CN101273137A (es) |
| AT (1) | AT502395B1 (es) |
| AU (1) | AU2006274252B2 (es) |
| CA (5) | CA2821719C (es) |
| DK (3) | DK2428576T3 (es) |
| ES (3) | ES2525549T3 (es) |
| HU (1) | HUE024985T2 (es) |
| PL (3) | PL2426209T3 (es) |
| PT (3) | PT2428576E (es) |
| SI (3) | SI2428576T1 (es) |
| WO (1) | WO2007012428A1 (es) |
| ZA (1) | ZA200800732B (es) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT501928B1 (de) | 2004-10-27 | 2010-09-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen |
| CN101528917B (zh) * | 2006-10-02 | 2015-07-29 | 科德克希思公司 | 用于制备立体异构纯的他汀类及其合成中间体的组合物和方法 |
| JP2010517574A (ja) | 2007-02-08 | 2010-05-27 | コデクシス， インコーポレイテッド | ケトレダクターゼおよびその使用 |
| JP2010536385A (ja) | 2007-08-24 | 2010-12-02 | コデクシス， インコーポレイテッド | （ｒ）−３−ヒドロキシチオランの立体選択的生成のための改善されたケトレダクターゼポリペプチド |
| JP5973131B2 (ja) | 2007-09-13 | 2016-08-23 | コデクシス， インコーポレイテッド | アセトフェノンの還元のためのケトレダクターゼポリペプチド |
| TWI601825B (zh) * | 2007-09-27 | 2017-10-11 | Ｉｅｐ有限公司 | 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法 |
| KR20100061571A (ko) | 2007-09-28 | 2010-06-07 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 케토리덕타제 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| WO2009046153A1 (en) | 2007-10-01 | 2009-04-09 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of azetidinone |
| SI2329013T1 (sl) | 2008-08-27 | 2016-03-31 | Codexis, Inc. | Polipeptidi ketoreduktaze za proizvodnjo 3-aril-3-hidroksipropanamina iz 3-aril-3-ketopropanamina |
| US8288141B2 (en) | 2008-08-27 | 2012-10-16 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine |
| US8273554B2 (en) | 2008-08-29 | 2012-09-25 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (4S)-3-[(5S)-5-(4-fluorophenyl)-5-hydroxypentanoyl]-4-phenyl-1,3-oxazolidin-2-one |
| EP2226386A1 (de) | 2009-03-05 | 2010-09-08 | IEP GmbH | Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen |
| CN102803233B (zh) | 2009-06-22 | 2017-03-01 | 爱思开生物制药株式会社 | 制备氨基甲酸(r)‑1‑芳基‑2‑四唑基‑乙酯的方法 |
| EP2467473B1 (en) | 2009-08-19 | 2016-03-23 | Codexis, Inc. | Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine |
| US8404461B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-03-26 | SK Biopharmaceutical Co. Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| JP2013511498A (ja) * | 2009-11-24 | 2013-04-04 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 水性生体変換混合物からのアルカノールの単離方法 |
| EP2566497B1 (en) | 2010-05-04 | 2015-07-29 | Codexis, Inc. | Biocatalysts for ezetimibe synthesis |
| BR112014031474A2 (pt) | 2012-06-18 | 2017-08-01 | Laboratorio Chimico Int S P A | processo para preparar um composto, uso de uma oxidoredutase, uso de uma oxidoredutase e composto |
| WO2014086702A2 (de) * | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Basf Se | Enzymatische reduktion von hydroxymethylfurfuralen |
| DE102013104418B4 (de) | 2013-04-30 | 2018-09-27 | Cambrex Iep Gmbh | Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol |
| CA2958211C (en) * | 2014-08-25 | 2023-09-26 | Hli Cellular Therapeutics, Llc | Extracellular matrix compositions |
| CN108441433B (zh) * | 2018-03-31 | 2021-08-20 | 湖南科技大学 | 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用 |
| CN108753851B (zh) * | 2018-05-28 | 2022-05-20 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物 |
| US20230002795A1 (en) * | 2019-06-13 | 2023-01-05 | Asymchem Laboratories (Tianjin) Co., Ltd. | Ketoreductase mutant and method for producing chiral alcohols |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03127998A (ja) | 1989-10-13 | 1991-05-31 | Taunzu:Kk | 尿素の定量法 |
| DE4014573C1 (es) | 1990-05-07 | 1991-10-10 | Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De | |
| US5200355A (en) | 1990-12-10 | 1993-04-06 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method for manufacturing a mask read only memory device |
| US5385833A (en) | 1992-02-26 | 1995-01-31 | The Scripps Research Institute | Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase |
| US5523223A (en) | 1992-03-13 | 1996-06-04 | Forschungszentrum Julich Gmbh | Ketoester reductase for conversion of keto acid esters to optically active hydroxy acid esters |
| JP3574682B2 (ja) * | 1993-09-24 | 2004-10-06 | ダイセル化学工業株式会社 | 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法 |
| US5523233A (en) * | 1995-05-03 | 1996-06-04 | Merck & Co., Inc. | Enzymatic hydrolysis of 3,3-diethyl-4-[(4-carboxy)phenoxy]-2-azetidinone esters |
| DE19610984A1 (de) | 1996-03-21 | 1997-09-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen |
| JP4753273B2 (ja) * | 1999-07-21 | 2011-08-24 | 株式会社カネカ | 光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法 |
| TWI275645B (en) * | 2000-02-16 | 2007-03-11 | Daicel Chemical Industries Ltd. | (R)-2-octanol dehydrogenases, methods for producing the enzymes, DNA encoding the enzymes, and methods for producing alcohols using the enzymes |
| DE10037101A1 (de) * | 2000-07-27 | 2002-02-07 | Degussa | Rekombinant hergestellte Enzyme mit verbesserter NAD(H)-Akzeptanz |
| DE10119274A1 (de) * | 2001-04-20 | 2002-10-31 | Juelich Enzyme Products Gmbh | Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen |
| AU2003214111A1 (en) * | 2002-03-18 | 2003-09-29 | Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. | Alcohol dehydrogenases with high solvent and temperature stability |
| DE10218689A1 (de) * | 2002-04-26 | 2003-11-20 | Degussa | ADH aus Rhodococcus erythropolis |
| DE10300335B4 (de) | 2003-01-09 | 2008-06-26 | Iep Gmbh | Oxidoreduktase |
| US20050037946A1 (en) * | 2003-01-13 | 2005-02-17 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating cardiovascular disease using 1722, 10280, 59917, 85553, 10653, 9235, 21668, 17794, 2210, 6169, 10102, 21061, 17662, 1468, 12282, 6350, 9035, 1820, 23652, 7301, 8925, 8701, 3533, 9462, 9123, 12788, 17729, 65552, 1261, 21476, 33770, 9380, 2569654, 33556, 53656, 44143, 32612, 10671, 261, 44570, 41922, 2552, 2417, 19319, 43969, 8921, 8993, 955, 32345, 966, 1920, 17318, 1510, 14180, 26005, 554, 16408, 42028, 112091, 13886, 13942, 1673, 54946 or 2419 |
| DE10327454A1 (de) * | 2003-06-18 | 2005-01-20 | Juelich Enzyme Products Gmbh | Oxidoreduktase aus Pichia capsulata |
| JP2007502111A (ja) * | 2003-08-11 | 2007-02-08 | コデクシス， インコーポレイテッド | ４−置換３−ヒドロキシ酪酸誘導体およびビシナルなシアノ，ヒドロキシ置換カルボン酸エステルの生成のための酵素的プロセス |
| EP1654354A1 (en) * | 2003-08-11 | 2006-05-10 | Codexis, Inc. | Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides |
| JP2005095022A (ja) * | 2003-09-22 | 2005-04-14 | Daicel Chem Ind Ltd | 光学活性アルコールの製造方法 |
| EP1731618A1 (en) | 2005-06-07 | 2006-12-13 | Prodotti Chimici E Alimentari Spa | Process for the selective oxydation of colic acid |
| AT503486B1 (de) * | 2006-04-11 | 2008-05-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden |
-
2005
- 2005-07-27 AT AT0126105A patent/AT502395B1/de not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-07-20 SI SI200631899T patent/SI2428576T1/sl unknown
- 2006-07-20 PT PT111897088T patent/PT2428576E/pt unknown
- 2006-07-20 JP JP2008523190A patent/JP2009502148A/ja active Pending
- 2006-07-20 US US11/996,968 patent/US20090311762A1/en not_active Abandoned
- 2006-07-20 ES ES11189701.3T patent/ES2525549T3/es active Active
- 2006-07-20 EP EP06776315A patent/EP1907556A1/de not_active Withdrawn
- 2006-07-20 CA CA2821719A patent/CA2821719C/en active Active
- 2006-07-20 EP EP11189703.9A patent/EP2428574B1/de not_active Not-in-force
- 2006-07-20 PT PT111897039T patent/PT2428574E/pt unknown
- 2006-07-20 EP EP11189707A patent/EP2428575A1/de not_active Withdrawn
- 2006-07-20 CA CA2821720A patent/CA2821720C/en active Active
- 2006-07-20 PT PT111897013T patent/PT2426209E/pt unknown
- 2006-07-20 DK DK11189708T patent/DK2428576T3/en active
- 2006-07-20 WO PCT/EP2006/007150 patent/WO2007012428A1/de active Application Filing
- 2006-07-20 EP EP11189708.8A patent/EP2428576B1/de active Active
- 2006-07-20 PL PL11189701T patent/PL2426209T3/pl unknown
- 2006-07-20 ZA ZA200800732A patent/ZA200800732B/xx unknown
- 2006-07-20 AU AU2006274252A patent/AU2006274252B2/en not_active Ceased
- 2006-07-20 HU HUE11189708A patent/HUE024985T2/hu unknown
- 2006-07-20 CA CA2625834A patent/CA2625834C/en active Active
- 2006-07-20 ES ES11189708.8T patent/ES2534657T3/es active Active
- 2006-07-20 PL PL11189703T patent/PL2428574T3/pl unknown
- 2006-07-20 SI SI200631878T patent/SI2426209T1/sl unknown
- 2006-07-20 ES ES11189703.9T patent/ES2524167T3/es active Active
- 2006-07-20 EP EP11189701.3A patent/EP2426209B1/de not_active Not-in-force
- 2006-07-20 CN CNA2006800356804A patent/CN101273137A/zh active Pending
- 2006-07-20 DK DK11189701.3T patent/DK2426209T3/da active
- 2006-07-20 CA CA2869218A patent/CA2869218C/en active Active
- 2006-07-20 SI SI200631849T patent/SI2428574T1/sl unknown
- 2006-07-20 CA CA2821717A patent/CA2821717C/en active Active
- 2006-07-20 DK DK11189703.9T patent/DK2428574T3/da active
- 2006-07-20 PL PL11189708T patent/PL2428576T3/pl unknown
- 2006-07-20 KR KR1020137022212A patent/KR101354546B1/ko active IP Right Grant
-
2008
- 2008-02-26 KR KR1020087004580A patent/KR101341392B1/ko active IP Right Grant
-
2011
- 2011-10-25 US US13/280,876 patent/US9040265B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2525549T3 (es) | Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos | |
| US7575909B2 (en) | Oxidoreductase from pichia capsulata | |
| JP2007523617A6 (ja) | ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素 | |
| ES2365159T3 (es) | Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de cetocompuestos. | |
| ES2358015T3 (es) | Oxidorreductasa. | |
| US9045780B2 (en) | Process for the stereoselective enzymatic reduction of keto compounds | |
| US7771977B2 (en) | Alkane polyol dehydrogenase | |
| CN118256462A (en) | Aldehyde ketone reductase mutant and application thereof |