ES2524553T3 - Receptores multiméricos de TNF - Google Patents

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ES2524553T3 ES12176681.0T ES12176681T ES2524553T3 ES 2524553 T3 ES2524553 T3 ES 2524553T3 ES 12176681 T ES12176681 T ES 12176681T ES 2524553 T3 ES2524553 T3 ES 2524553T3
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Abstract

Una proteína de fusión que comprende (i) un dominio extracelular del receptor de la familia de TNF seleccionado entre TNFRSF6 de acuerdo con la SEC ID Nº 6 (ii) un elemento enlazador flexible que tiene una longitud de 2-20 aminoácidos entre los componentes (i) y (iii), y (iii) un dominio de trimerización, seleccionado entre el grupo (G)YIEDAPSDGK FYVRKDGAWV ELPTA de acuerdo con la SEC ID Nº 45 o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 70% con la misma, donde el componente (i) está localizado de forma N-terminal y el componente (iii) está localizado de forma Cterminal.

Description

Receptores multiméricos de TNF
5 La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un dominio extracelular de la familia de receptores de TNF fusionado a un dominio de trimerización, y a una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. La proteína de fusión puede estar presente como un complejo trimérico. Es adecuada para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o investigación. Las proteínas de fusión triméricas que comprenden el dominio extracelular de un receptor de la familia TNF y un dominio Fc de inmunoglobulina son conocidas (por ejemplo, documento WO 95/27735). Esta proteína de fusión es adecuada para el tratamiento de trastornos autoinmunes, enfermedad de injerto contra hospedador, apoplejía, infarto de miocardio o paraplejía.
El documento WO 02/090553 describe proteínas de fusión de receptores de TNF con proteínas de trimerización tales como colectina, conectadas por secuencias enlazadoras de más de 2 o 5 aminoácidos.
15 El documento WO 2004/033486 muestra que antagonistas basados en receptor trimérico deben presentar una avidez aumentada y por lo tanto, eficacia aumentada en comparación con moléculas diméricas. El documento WO 2004/033486 describe un polipéptido de interés y una secuencia de aminoácidos de trimerización, donde los polipéptidos de interés incluyen los dominios extracelulares de receptores. Los receptores adecuados incluyen receptores del factor de necrosis tumoral.
El documento WO 02/00893 describe que los receptores de la superfamilia de TNF son polipéptidos que pueden multimerizarse, incluyendo Fas (CD95R). El documento WO 02/00893 muestra varios dominios que provocan trimerización, por ejemplo, colectina.
25 El documento WO 2008/025516 describe el uso del dominio de fibritina de RB69 como un dominio de trimerización para una proteína de fusión que comprende un dominio de unión del receptor de la superfamilia de TNF, un enlazador flexible, y un dominio de trimerización que es idéntico a la SEC ID Nº 45.
Un objeto de la presente invención fue proporcionar nuevos agentes basados en dominios extracelulares del receptor de la familia TNF que tienen propiedades farmacéuticas mejoradas.
Por tanto, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende
35 (i) un dominio extracelular del receptor de la familia TNF seleccionado entre TNFRSF6 de acuerdo con la SEC ID Nº 6,
(ii) un elemento enlazador flexible que tiene una longitud de 2-20 aminoácidos entre los componentes (i) y (iii), y
(iii) un dominio de trimerización seleccionado entre el grupo (G)YIEDAPSDGKFYVRKDGAWVELPTA de acuerdo con la SEC ID Nº 45 o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 70% con la misma donde el componente (i) está localizado de forma N-terminal y el componente (iii) está localizado de forma C-terminal.
La proteína de fusión puede ser una proteína monomérica o una proteína trimérica. Preferiblemente, la proteína de fusión se presenta como un complejo trimérico que consiste en tres unidades monoméricas idénticas. El complejo trimérico puede asociarse por interacciones no covalentes y/o covalentes mediadas por el dominio de trimerización.
45 Además, el complejo trimérico puede estabilizarse por reticulación química, por ejemplo mediante un enlazador homo-o hetero-multifuncional tal como suberato de (bis)sulfosuccinimidilo.
El componente (i) de la proteína de fusión es un dominio de unión extracelular de un receptor de la familia TNF. Preferiblemente, el componente (i) es un dominio extracelular del receptor de la familia TNF de mamífero, particularmente humano, incluyendo variantes alélicas y/o derivados del mismo. El receptor de la familia TNF se selecciona entre TNFRSF6 (CD95R, FAS; SEC ID Nº 6). La estructura de este receptor y la localización del dominio extracelular del mismo se describe en un artículo de revisión de Wajant et al. (2003), Essays in Biochemistry 39, 53
71. Puede usarse una diversidad de fragmentos que comprenden todo o una parte del dominio extracelular del receptor de TNF (incluyendo el dominio de unión a ligando) para la producción de proteínas triméricas TNFR-SF.
55 Las regiones para la producción de proteínas triméricas TNFR-SF se mencionan en la Fig. 6, mientras que la invención se limita a TNFRSF6.
Se muestra un dibujo esquemático de la estructura de dominio de CD95R (Fas) de acuerdo con Wajant et al. (2003), supra, en la Fig. 1. La numeración se refiere a la proteína madura. L significa la secuencia señal secretora, CRD un dominio rico en cisteínas, TM un dominio transmembrana y PLAD un dominio de ensamblaje de unión pre-ligando. En una realización especialmente preferida, el componente (i) de la proteína de fusión recombinante se selecciona entre el dominio extracelular del receptor de CD95 humano que comprende los aminoácidos 1 a 169 de la proteína CD95R madura.
65 El componente (ii) es un elemento enlazador flexible localizado entre los componentes (i) y (iii). El elemento enlazador flexible tiene una longitud de 2-20 aminoácidos. El elemento enlazador es preferiblemente un enlazador
de glicina/serina, es decir, un enlazador peptídico que consiste sustancialmente en los aminoácidos glicina y serina. En una realización especialmente preferida, el enlazador tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (GSS)a (GSG)b (SEC ID Nº 41) y (GTT)a (GTG)b (SEC ID Nº 42) donde a o b es 0, 1, 2, 3, 4 o 5, donde cuando a=0 entonces b es 1 y cuando b=0 entonces a es 1. Es evidente para los especialistas en la técnica que en casos en
5 que el dominio extracelular del receptor de la familia TNF o el dominio de unión a ligando del mismo ya termina con una G, dicha G puede formar la primera G del enlazador en la secuencia enlazadora. También es evidente para los especialistas en la técnica que en casos en que el dominio de trimerización ya empieza con una G, dicha G puede formar la última G del enlazador en la secuencia enlazadora.
El componente (iii) es un dominio de trimerización. El componente (iii) es un dominio de trimerización de fibritina de bacteriófago del bacteriófago RB69. El componente (iii) comprende la secuencia de aminoácidos (G)YIEDAPSDGK ELPTA de acuerdo con la SEC ID Nº 45, o una variante de secuencia que tiene una identidad de al menos el 70%, 75%, 80%, 85% o preferiblemente de al menos el 90% con la misma. Ejemplos de variantes de secuencia preferidas se muestran en el documento PCT/EP2007/007517. Se prefiere que el componente (iii) tenga una longitud de 20
15 hasta 30 aminoácidos.
En otra realización preferida adicional, el dominio de trimerización puede glucosilarse de forma artificial, lo que puede conferir solubilidad potenciada a la proteína y puede ser útil para modular la farmacocinética sin limitarse a la misma.
De acuerdo con la norma de N-glucosilación normalmente aceptada, se requiere una secuencia consenso tripeptídica que consiste en N-X-S/T para la N-glucosilación de proteínas.
En la proteína de fusión de la invención, el componente (i) está localizado de forma N-terminal y el componente (iii) 25 está localizado de forma C-terminal.
La proteína de fusión puede comprender adicionalmente un dominio peptídico señal N-terminal, que permite el procesamiento, por ejemplo la secreción extracelular, en una célula hospedadora adecuada. Preferiblemente, el dominio peptídico señal N-terminal comprende una proteasa, por ejemplo, un sitio de escisión por peptidasa señal y por tanto puede eliminarse después de o durante la expresión para obtener la proteína madura. Además, la proteína de fusión puede comprender adicionalmente un elemento flexible C-terminal, que tiene una longitud de por ejemplo 1-50, preferiblemente 10-30 aminoácidos que puede incluir o conectar con un dominio de reconocimiento/purificación, por ejemplo un dominio FLAG, un dominio Strep-tag y/o un dominio poli-His.
35 La Figura 2 muestra un dibujo esquemático de una proteína de fusión preferida de la presente invención que comprende un dominio peptídico señal N-terminal (SP), el dominio CD95 extracelular (E-CD95), un enlazador flexible (GSS)3 GS, un motivo de trimerización, un espaciador adicional, por ejemplo un espaciador de serina para proporcionar flexibilidad de las marcas de purificación y una secuencia de marca (St), por ejemplo el dominio Streptag.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se ha descrito anteriormente. La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN, por ejemplo una molécula de ADN bicatenaria o monocatenaria, o una molécula de ARN. La molécula de ácido nucleico puede codificar la proteína de fusión o un precursor de la misma, por ejemplo una pro-o pre-proforma de la proteína 45 de fusión que puede comprender una secuencia señal u otras partes de aminoácidos heterólogas para la secreción
o purificación que se localizan preferiblemente en el extremo N-y/o C-terminal de la proteína de fusión. Las partes de aminoácidos heterólogas pueden unirse al primero y/o segundo dominio mediante un sitio de escisión por proteasa, por ejemplo un sitio de escisión por proteasa de Factor Xa, trombina o IgA.
La molécula de ácido nucleico puede unirse de forma funcional a una secuencia de control de la expresión, por ejemplo una secuencia de control de la expresión que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora deseada. La molécula de ácido nucleico puede estar localizada en un vector, por ejemplo un plásmido, un bacteriófago, un vector viral, un vector de integración en el cromosoma, etc. Ejemplos de secuencias de control de la expresión y vectores adecuados se describen, por ejemplo, por Sambrook et al. (1989) Molecular
55 Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, y Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons o ediciones más recientes de los mismos.
Pueden usarse diversos sistemas de vector de expresión/célula hospedadora para expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de la presente invención. Las célula hospedadoras adecuadas incluyen, aunque sin limitación, células procariotas tales como bacterias, por ejemplo E. coli, células hospedadoras eucariotas tales como células de levadura, células de insecto, células vegetales o células animales, preferiblemente células de mamífero y, más preferiblemente, células humanas o de roedor, por ejemplo CHO.
Además, la invención se refiere a un organismo no humano transformado o transfectado con una molécula de ácido
65 nucleico como se ha descrito anteriormente. Dichos organismos transgénicos pueden generarse mediante métodos conocidos de transferencia genética incluyendo recombinación homóloga.
La proteína de fusión o el ácido nucleico que codifica la misma puede usarse para aplicaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o investigación.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que 5 comprende como agente activo al menos una proteína de fusión o una molécula de ácido nucleico que codifica la misma como se ha descrito anteriormente.
En esta realización de la invención, la composición puede usarse en la profilaxis y/o tratamiento de trastornos seleccionados entre trastornos causados por, asociados con y/o acompañados por procesos apoptóticos, trastornos autoinmunes, por ejemplo enfermedades reumatoides y/o artríticas, enfermedades degenerativas, por ejemplo enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis múltiple, lesiones del sistema nervioso, por ejemplo, el sistema nervioso central, incluyendo la médula espinal, infartos de miocardio, y fallo cardiaco, apoplejía, y rechazos de transplantes, enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), y pneumonitis, particularmente pneumonitis inducida por radiación. Además, la composición puede usarse para el tratamiento de cánceres, preferiblemente
15 cánceres sólidos, por ejemplo cánceres cerebrales, por ejemplo glioblastomas. Como alternativa, el cáncer a tratar puede ser un cáncer de origen linfoide o mieloide.
La proteína de fusión se administra a un sujeto que lo necesite, particularmente un paciente humano, en una dosis suficiente para el tratamiento de las afecciones específicas por medios adecuados. Por ejemplo, la proteína de fusión puede formularse como una composición farmacéutica junto con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La eficacia terapéutica y toxicidad pueden determinarse de acuerdo con protocolos convencionales. La composición farmacéutica puede administrarse de forma sistémica, por ejemplo por vía intraperitoneal, intramuscular o intravenosa o local, por ejemplo, de forma intranasal, subcutánea o intratecal. Se prefiere administración intravenosa.
25 La dosis de la proteína de fusión administrada dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, del peso del sujeto, el tipo y gravedad de la enfermedad, el modo de administración y el criterio del médico que prescribe. Para la administración de proteínas de fusión, es adecuada una dosis diaria de 0,001 a 100 mg/kg.
Figuras
Figura 1 Dibujo esquemático de la estructura de dominio de CD95R (Fas) de acuerdo con Wajant et al. (2003). La numeración se refiere a la proteína madura. L significa la secuencia señal secretora, CRD un dominio rico en cisteínas, TM un dominio transmembrana y PLAD un dominio de ensamblaje de unión pre-ligando.
35 Figura 2 Dibujo esquemático de una proteína de fusión preferida de la presente invención que comprende un dominio peptídico señal N-terminal (SP), el dominio CD95 extracelular (E-CD95), un enlazador flexible (GSS)3 GS, un motivo de trimerización, un espaciador adicional, por ejemplo un espaciador de serina para proporcionar flexibilidad de las marcas de purificación y una secuencia de marca (St), por ejemplo el dominio Streptag.
Figura 3 Perfiles de elución de cromatogramas SEC para las proteínas de fusión HS95R-A69St (Fig. 3A), HS95RAT4-St (Fig. 3B), HS95R-ASPD-St (Fig. 3C) y APG101 (Fig. 3D), donde HS95F2-ASPD-St, HS95RAT4-St y APG101 se proporcionan como ejemplos comparativos.
45 Figura 4 Resultados de un análisis SDS-PAGE de las fracciones SEC de las proteínas de fusión de CD95-R triméricas HS95R-A69-St (Fig. 4A), HS95R-AT4-St (Fig. 4B) y HS95R-ASPD-St (Fig. 4C) así como los resultados de la proteína de fusión CD95R-Fc dimérica (APG101, para referencias véase el documento WO 2004/085478; Fig. 4D) en condiciones no reductoras (tinción con plata), donde HS95R-ASPD-St, HS95RAT4-St y APG101 se proporcionan como ejemplos comparativos.
Figura 5 Análisis SDS-PAGE de hs95R-A69-St reticulado con BS3 covalentemente (Fig. 5A), hs95R-AT4-St (Fig. 5B), hs95R-ASPD-St (Fig. 5C) y la proteína de fusión CD95R-Fc dimérica (APG101, Fig. 5D), donde HS95R-ASPD-St, HS95RAT4-St y APG101 se proporcionan como ejemplos comparativos.
55 Figura 6 Proteínas de la superfamilia TNFR, incluyendo secuencias de referencia y localización de dominios de unión a ligando.
Ejemplo
A continuación, se muestran las estructuras básicas de proteínas recombinantes ejemplificadas para el dominio extracelular del receptor de CD95.
1.1 Polipéptido de fusión CD95R-T4 foldon (ejemplo comparativo)
65 La secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína de fusión y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestran en las SEC ID Nº 33 y 34, respectivamente.
A) Aminoácidos Met1-Ala16 Péptido señal B) Aminoácidos Arg17-Glu168 Dominio extracelular del receptor de CD95 humano
5 C) Aminoácidos Gly169-Gly180 Elemento enlazador flexible D) Aminoácidos Tyr181-Leu206 Dominio de trimerización de fibritina de bacteriófago T4 E) Aminoácidos Ser207-Lys224
10 Elemento flexible con motivo Streptag II.
La proteína resultante se denominó hs95R-AT4-St.
1.2 Polipéptido de fusión CD95R-RB69
15 La secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína de fusión y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestran en las SEC ID Nº 35 y 36, respectivamente.
A) Aminoácidos Met1-A1a16
20 Péptido señal B) Aminoácidos Arg17-Glu168 Dominio extracelular del receptor de CD95 humano C) Aminoácidos Gly169-Gly180 Elemento enlazador flexible
25 D) Aminoácidos Tyr181-Ala205 Dominio de trimerización de fibritina del bacteriófago RB69 E) Aminoácidos Ser206-Lys223 Elemento flexible con motivo Streptag II.
30 La proteína resultante se denominó hs95R-A69-St.
1.3 Polipéptido de fusión CD95R-SP-D (ejemplo comparativo)
La secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína de fusión y la correspondiente secuencia de aminoácidos 35 se muestran en las SEC ID Nº 37 y 38, respectivamente.
A) Aminoácidos Met1-Ala16 Péptido señal B) Aminoácidos Arg17-Glu168
40 Dominio extracelular del receptor de CD95 humano C) Aminoácidos Gly169-Gly180 Elemento enlazador flexible D) Aminoácidos Leu181-Phe335 Dominio de trimerización de la proteína tensioactiva D
45 E) Aminoácidos Gly336-Lys354 Elemento flexible con motivo Streptag II.
La proteína resultante se denominó hs95R-ASPD-SL
50 1.4 Polipéptidos de fusión CD95R-T4 foldon con enlazador acortado (ejemplo comparativo)
La secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína de fusión y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestran en las SEC ID Nº 39 y 40, respectivamente.
55 A) Aminoácidos Met1-Ala16 Péptido señal B) Aminoácidos Arg17-Glu168 Dominio extracelular del receptor de CD95 humano C) Aminoácidos Gly169-Gly171
60 Elemento enlazador flexible D) Aminoácidos Tyr172-Leu197 Dominio de trimerización de fibritina del bacteriófago T4 E) Aminoácidos Ser198-Lys221 Elemento flexible con motivos hexa-histidina y Streptag II.
La proteína resultante se denominó hs95R-DT4-HTSt.
También se construyeron construcciones similares con una longitud de enlazador de ocho o cinco aminoácidos.
5 De forma interesante, un enlazador acortado de 3 aminoácidos provocó una tasa de expresión considerablemente disminuida en comparación con enlazadores más largos de más de 3 aminoácidos.
2. Estrategia de clonación
Los fragmentos de ADN sintético que codifican las proteínas descritas en la sección 1 se subclonaron en la estructura pcDNA4/HisMax (invitrogen) usando los sitios únicos Hind III y Not I del plásmido. Las secuencias que codifican los elementos flexibles C-terminales puede delecionarse si los polipéptidos de fusión se usan para aplicaciones farmacéuticas.
15 3. Expresión y purificación
3.1 Expresión en células Hek 293T
Se cultivaron células Hek 293T en medio DMEM-F12 (Invitrogen) suplementado con FCS al 10%, Penstrep al 1%, Hepes 20 mM pH 7,4 y glucosa 17,5 mM y se transfectaron de forma transitoria con un plásmido que contenía un casete de expresión de una de las proteínas de fusión indicadas anteriormente. Las transfección se realizó usando polietileno-imina de alto peso molecular.
3.2 Expresión en células CHO-K1
25 Se cultivaron células CHO-K1 en F12 GlutaMAX (GibCo), FCS al 10%, Penstrep al 1%, Hepes 10 mM, pH 7,4, y glucosa 17,5 mN. Las células se transfectaron con un plásmido que contenía un casete de expresión para uno de los anteriores polipéptidos de fusión. Las transfección se realizó usando polietilenoimina de alto peso molecular. Los clones celulares estables se seleccionaron antes de la producción de proteína, usando el gen de resistencia a fleomicina de la estructura pcDNA4-HisMax.
3.3 Purificación
Las proteínas de fusión de CD95R se purificaron por afinidad del sobrenadante de cultivo celular mediante columnas
35 de Streptactin Sepharose (IBA GmbH). El Streptactin Sepharose se compactó en una columna, se equilibró con tampón de lavado (TrisHCl 100 mM, NaCl 150 mM pH 8,0) y el sobrenadante de cultivo celular se aplicó a la columna.
Posteriormente, la columna se lavó con 15 ml de tampón de lavado y la proteína de fusión unida se eluyó por etapas mediante la adición de tampón de elución (solución salina tamponada con fosfato, Destiobiotina 2,5 mM pH 7,4). La cantidad de proteína de las fracciones de eluato se cuantificó y se concentraron las fracciones de pico por ultrafiltración y se purificaron adicionalmente por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC).
Se realizó SEC en una columna Superdex 200 usando un sistema de cromatografía Äkta (Äkta purifier, GE
45 Healthcare). La columna se equilibró con solución salina tamponada con fosfato y se cargó el polipéptido de fusión purificado con Streptactin concentrado en la columna SEC a un caudal de 0,5 ml/min. Para una determinación del peso molecular aparente de las proteínas de fusión de CD95R en condiciones nativas, la columna Superdex 200 se calibró con proteínas patrón que tenían un peso molecular conocido. En base al volumen de elución de las proteínas patrón, pudieron determinarse los pesos moleculares aparentes de las proteínas de fusión de CD95R.
Las Figuras 3A, B, C y D muestran los perfiles de elución de cromatogramas SEC para las proteínas de fusión HS95R-A69St (Fig. 3A), HS95R-AT4-St (Fig. 3B), HS95R-ASPD-St (Fig. 3C) y APG101 (Fig. 3D). Las ejecuciones SEC individuales se realizaron en diferentes configuraciones con respecto a la cantidad de muestra, volumen de carga y calibración.
55 El peso molecular aparente para HS95R-A69St (Fig. 3A) se estimó en 258 kD; el peso molecular aparente para HS95R-AT4-St (Fig. 3B) se estimó en 267 kD; el peso molecular aparente para HS95R-ASPD-St (Fig. 3C) se estimó en 276 kD; y el peso molecular aparente de APG101 (proteína de fusión CD95R-Fc dimérica) se estimó en 240 kD (Fig. 3D). Tomados junto con los experimentos de reticulación mostrados en Figura 5A, B y C, los datos indican que las proteínas de fusión están presentes como complejos triméricos glucosilados bien definidos.
Las Figuras 4A, B, C y D muestran los resultados de un análisis SDS-PAGE de las fracciones SEC de las proteínas de fusión de CD95-R triméricas HS95R-A69-St (Fig. 4A), HS95R-AT4-St (Fig. 4B) y HS95R-ASPD-St (Fig. 4C) así como los resultados de la proteína de fusión CD95R-Fc dimérica (APG101; Fig. 4D) en condiciones no reductoras
65 (tinción con plata).
El estado trimérico de las proteínas de fusión se analizó por estudios de reticulación covalente. Se incubó una cantidad constante de las proteínas a analizar (200 ng) durante 30 min. a temperatura ambiente con cantidades crecientes de suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3), un reactivo de reticulación bifuncional. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de Tris/HCl 10 mM, pH 7,5. Solamente las cadenas polipeptídicas en estrecha
5 proximidad entre sí se reticulan covalentemente.
Las Figuras 5A, B y C muestran un análisis SDS-PAGE de hs95R-A69-St reticulado con BS3 covalentemente (Fig. 5A), hs95RAT4-St (Fig. 5B), hs95R-ASPD-St (Fig. 5C) y la proteína de fusión CD95R-Fc dimérica (APG101, Fig. 5D). Las figuras muestran que a bajas concentraciones de BS3, solamente sucede formación de producto covalente dimérico y trimérico. A mayores concentraciones de BS3, aumentan los productos de reticulación triméricos y multiméricos.
El efecto anti-apoptótico de las proteínas de fusión de CD95R se analizó en células Jurkat. La activación de los sistemas CD95R en células Jurkat por unión extracelular de ligando CD95 al CD95R unido a membrana provoca 15 muerte celular apoptótica. El ensayo mide un afecto antagonista de las proteínas de fusión receptoras sobre la actividad pro-apoptótica de ligando CD95 recombinante añadido. Como control interno, se usó la proteína de fusión CD95R-Fc dimérica APG101. Las células Jurkat se cultivaron en matraces con medio RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) suplementado con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicinas. Antes del ensayo, se sembraron 100.000 células por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos. La adición de diferentes concentraciones de CD95L a los pocillos estuvo seguida de una incubación de 3 horas a 37ºC. Las células se lisaron añadiendo tampón de lisis (HEPES 250 mM, MgCl2 50 mM, EGTA 10 mM, Triton-X-100 al 5%, DTT 100 mM, AEBSF 10 mM, pH 7,5) y las placas se pusieron en hielo durante 30 minutos. La apoptosis se demuestra por una actividad aumentada de Caspasa 3 y Caspasa 7. Por tanto, se usó la escisión del sustrato de Caspasa 3/7 específico Ac-DEVD-AFC (Biomol) para determinar el grado de apoptosis. De hecho, la actividad
25 Caspasa se correlaciona con el porcentaje de células apoptóticas determinadas morfológicamente después de tinción de las células con yoduro de propidio y Hoechst-33342. Para el ensayo de actividad Caspasa, se transfirieron 20 l de lisado celular a una placa de microtitulación negra de 96 pocillos. Después de la adición de 80 l de tampón que contenía HEPES 50 mM, sacarosa al 1%, CHAPS al 0,1%, Ac-DEVD-AFC 50 M, y DTT 25 mM, pH 7,5, la placa se transfirió a un lector de placa de microtitulación Tecan GeniosPro y se controló el aumento en la intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación 400 nm, longitud de onda de emisión 505 nm).
Antes de la adición de CD95L a las células Jurkat, se incubó una cantidad constante de CD95L durante 30 min. a 37ºC con diferentes concentraciones de la proteína de fusión CD95R-Fc dimérica comparativa y las proteínas de fusión triméricas de la invención. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 1:
35 Tabla 1: Valores de CE50 para proteínas de fusión de CD95R multiméricas
CE50
ng/ml
APG101
594,5
hs95R-AT4-St
92,6
hs95R-A69-St
87,6
hs95R-ASPD-St
573,3
Puede observarse que las proteínas triméricas tienen un valor de CE50 inferior que indica una mayor potencia antiapoptótica en comparación con APG 101.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Apogenix GmbH 45 <120> Receptores multiméricos de TNF
<130> 40203P EP-WO-1
<160> 61
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 455 55 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TNFRSF1a (TNFR1)
<400> 1
<210> 2
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF1b (TNF-R-II)
<400> 2
<210> 3
<211> 435 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF3 (LTBR)
<400> 3
<210> 4
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TNFRSF4
10 <400> 4
<210> 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF5 (CD40)
<400> 5
<210> 6
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF6 (CD95R, FAS)
<400> 6
<210> 7
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF6b
<400> 7
<210> 8
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF7
<400> 8
<210> 9
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF8
<400> 9
<210> 10
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF9
<400> 10
<210> 11
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF10a
<400> 11
<210> 12
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF10b
<400> 12
<210> 13
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF10c
<400> 13
<210> 14
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF10d
<400> 14
<210> 15
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF11a (RANGO)
<400> 15
<210> 16
<211> 401
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TNFRSF11b (OPG)
<400> 16
<210> 17
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF12a
<400> 17
<210> 18
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF13b (TACI)
<400> 18
<210> 19
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF13c (BAFF-R)
<400> 19
<210> 20
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF14
<400> 20
<210> 21
<211> 427
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TNFRSF16 (NGFR) 10
<400> 21
<210> 22
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF17 (BCMA)
<400> 22
5
<210> 23
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TNFRSF18-var1
15
<400> 23
<210> 24
<211> 255
<212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TNFRSF18-var2 10
<400> 24
<210> 25
<211> 423 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF19
<400> 25
<210> 26
<211> 430
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5 <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TNFRSF19L
<400> 26 10
<210> 27
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF21
<400> 27
<210> 28
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF25-var1
<400> 28
<210> 29
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF25-var2
<400> 29
<210> 30
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF25-var3
<400> 30
<210> 31
<211> 372
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TNFRSF25-var4
<400> 31
<210> 32
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <223> TNFRSF27 (EDA2R)
<400> 32
<210> 33
<211> 722
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SPN-hs95R-AT4-St
<400> 33
5
<210> 34
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
10
<220>
<223> SPN-hs95R-AT4-St
<400> 34
15
<210> 35
<213> Artificial
<220>
<223>
SPN-hs95R-A69-St 10 <400> 35
<210> 36
<213> Artificial
<220>
<223>
SPN-hs95R-A69-St 10
<400> 36 <210> 37
<211> 1109 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223>
SPN-hs95R-ASPD-St 10 <400> 37
<210> 38
<213> Artificial
<220>
<223>
SPN-hs95R-ASPD-St 10
<400> 38
<210> 39
<213> Artificial
<220>
<223>
SPN-hs95R-DT4-HtSt 10
<400> 39
15 <210> 40
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> SPN-hs95R-DT4-HtSt
<400> 40
<210> 41
<211> 6 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> elemento enlazador 10
<220>
<221> REPETICIÓN
<222> (1)..(3)
<223> 0, 1, 2, 3, 4 o 5 repeticiones
<220>
<221> REPETICIÓN 5 <222> (4)..(6)
<223> 0, 1, 2, 3, 4 o 5 repeticiones
<400> 41
<210> 42
<211> 6
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> elemento enlazador
20 <220>
<221> REPETICIÓN
<222> (1)..(3)
<223> 0, 1, 2, 3, 4 o 5 repeticiones
25 <220>
<221> REPETICIÓN
<222> (4)..(6)
<223> 0, 1, 2, 3, 4 o 5 repeticiones
30 <400> 42
<210> 43 35 <211> 27
<212> PRT
<213> Fago T4 de Enterobacteria
<400> 43 40
<210> 44
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago RB32 de Enterobacteria
<400> 44
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> Fago RB69 de Enterobacteria
<400> 45
10 <210> 46
<211> 27
<212> PRT
<213> Geobacter bemidjiensis Bem
15 <400> 46
<210> 47 20 <211> 27
<212> PRT
<213> Fago JS98-C3 de Enterobacteria
<400> 47 25
<210> 48
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago JS98-C3 de Enterobacteria
<400> 48
<210> 49
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago JS98 de Enterobacteria
<400> 49
5 <210> 50
<211> 27
<212> PRT
<213> Vibriofago KVP40
10 <400> 50
<210> 51 15 <211> 27
<212> PRT
<213> Vibriofago KVP40
<400> 51 20
<210> 52
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago BcepNazgul de Burkholderia
<400> 52
<210> 53
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago BcepNazgul de Burkholderia
<400> 53
<210> 54
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago Aeh1 de Aeromonas
<400> 54
<210> 55
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago Aeh1 de Aeromonas
<400> 55
<210> 56
<211> 26
<212> PRT
<213> Fago MP22 25
<400> 56
30 <210> 57
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago DMS3 de Pseudomonas
35 <400> 57
<210> 58
<211> 27
<212> PRT
<213> Fago RB49 de Enterobacteria
<400> 58
<210> 59
<211> 375
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SP-D 20
<400> 59
<210> 60
<211> 271
<212> PRT
<213> Homo sapiens 5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> colectina-11
10 <400> 60
<210> 61
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <223> tenascina
<400> 61

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una proteína de fusión que comprende
    (i)
    un dominio extracelular del receptor de la familia de TNF seleccionado entre TNFRSF6 de acuerdo con la SEC ID Nº6
    (ii)
    un elemento enlazador flexible que tiene una longitud de 2-20 aminoácidos entre los componentes (i) y (iii), y
    (iii) un dominio de trimerización, seleccionado entre el grupo (G)YIEDAPSDGK FYVRKDGAWV ELPTA de acuerdo con la SEC ID Nº 45 o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 70% con la misma,
    donde el componente (i) está localizado de forma N-terminal y el componente (iii) está localizado de forma Cterminal.
  2. 2.
    La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde el receptor de la familia de TNF se selecciona entre los aminoácidos 1 a 169 de TNFRSF6 humano maduro de acuerdo con la SEC ID Nº 6.
  3. 3.
    La proteína de fusión de la reivindicación 1 o 2, donde el componente (iii) comprende al menos una sustitución de aminoácido.
  4. 4.
    La proteína de fusión de la reivindicación 3, donde el componente (iii) comprende un mutante que no se une a manosa.
  5. 5.
    La proteína de fusión de la reivindicación 1, 2 o 4 donde el componente (iii) comprende los aminoácidos 110-271, 116-271, o 121-271 o 110-147, 110-148, 110-149, 110-150, 110-151, 116-147, 116-148, 116-149, 116-150, 116-151, 121-147, 121-148, 121-149, 121-150, o 121-151 de colectina-11 humana de la SEC ID Nº 60.
  6. 6.
    La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones previas que comprende adicionalmente un dominio peptídico señal N-terminal, que puede comprender un sitio de escisión por proteasa o/y un elemento flexible Cterminal que puede comprender y/o conectar con un dominio de reconocimiento/purificación.
  7. 7.
    La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones previas que está presente como un complejo trimérico, donde el complejo puede consistir en tres proteínas de fusión idénticas.
  8. 8.
    Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones previas.
  9. 9.
    Una célula transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.
  10. 10.
    Un organismo no humano transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación
  11. 8.
  12. 11.
    Una composición farmacéutica que comprende como agente activo una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.
  13. 12.
    Una composición de diagnóstico que comprende como agente activo una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.
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