CN111518822B - 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体及其分泌表达的方法,属于生物工程技术领域。本发明将普通变形杆菌来源的硫酸软骨素ABC裂解酶进行了定点突变,通过融合信号肽加强了其分泌表达,对表达酶的菌株进行了外膜蛋白敲除,并进一步提供了菌株的培养策略。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体及其分泌表达的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
硫酸软骨素,是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面,糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺(又称N-乙酰氨基半乳糖)二糖单位组成,通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。
硫酸软骨素表现出高的生物活性,如抗癌症、抗动脉粥样硬化作用、抗炎、免疫调节、抗氧化等,不仅在细胞转移、分化、增殖、识别以及组织形成等生物过程中起到了重要的作用,还应用于医药及临床。由于硫酸软骨素的分子量大,生物利用度低,在治疗脊柱损伤、轴突再生、抑制肿瘤发生时,硫酸软骨素的很多功效不能得到有效的发挥。
近年来有实验证明分子量在3500-5300Da的硫酸软骨素,其药理活性最强,对防治风湿性炎症以及伤口愈合等具有更好的疗效。因此,制备低分子量的硫酸软骨素是非常有必要的。
目前,制备低分子量的硫酸软骨素的方法主要有:(1)酸法降解,酸降解是指将硫酸软骨素溶解于酸溶液(如磯酸、盐酸)中在一定的溫度下进行降解,酸降解由于反应比较剧烈会导致硫酸根含量的降低,而且寡糖的自由基清除的能力也会降低;(2)氧化降解法,氧化降解法中最常用的方法是过氧化氢降解法,采用氧化降解法的优点是产物无毒,不需要特殊的后处理,对双糖的结构破坏比较小;(3)酶解法,酶解法是指利用硫酸软骨素酶或透明质酸酶等软骨素降解酶对硫酸软骨素酶解获得寡糖。其中,酶解法因条件温和、专一性强,是目前最常用的降解硫酸软骨素的方法。
硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitinsulfateyase,简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。其中,硫酸软骨素ABC裂解酶,为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶。近几年,国际上对硫酸软骨素ABC裂解酶的关注越来越多,主要集中在提高酶的稳定性。而在硫酸软骨素ABC裂解酶的表达制备方面,目前只能实现胞内表达且胞内表达量很低,不能满足硫酸软骨素寡糖的生产需求。
发明内容
[技术问题]
为了解决上述问题,本发明提供了一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体构建及其分泌表达的方法。
[技术方案]
本发明首先提供了一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体,编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述突变体,以硫酸软骨素A为底物时,突变体的催化效率可达352±21(min-1)。
本发明还提供一种通过融合信号肽提高所述突变体分泌的方法,所述信号肽包括PelB、PhoA或OmpA。
本发明还提供一种通过敲除菌株外膜蛋白提高所述突变体分泌的方法,所述外膜蛋白包括外膜A蛋白(OMPA)、脂蛋白(LPP)或微孔蛋白(Porins)。
本发明还提供一种重组基因工程菌,是将融合了来源于大肠杆菌的信号肽OmpA的编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因连接到pET-28a质粒的XhoI和NdeI酶切位点上,导入敲除了外膜蛋白OMPA的Escherichia coliBL21(DE3)中得到基因工程菌。编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种制备所述硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的方法,是将重组基因工程菌接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中,37℃、220rpm过夜培养后转接到3L发酵罐中进行发酵培养,发酵罐的装液量为1L,发酵培养基为LB培养基,初始转速600rpm,发酵温度30℃,转速与溶氧偶联,控制发酵过程中DO在30%以上(溶氧100%是未接种时,培养基中的溶氧水平),30℃培养1h后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养20h。
[有益效果]
本发明提供了一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体L102T,相比突变前,突变体的酶活提高了50%。
与现有的硫酸软骨素ABC裂解酶的胞内表达的情况相比,本发明提供的硫酸软骨素ABC裂解酶可以实现胞外分泌表达,并且胞外酶活可以达到2.96 U/mL。
附图说明
图1所示为实施例1中构建的各个突变体的酶活。
图2所示为实施例2中融合各种信号肽后的酶活。
图3所示为实施例3中敲除外膜蛋白后酶活的变化情况。
图4所示为实施例4中的摇瓶水平各条件对酶活的影响,其中,图4a:诱导剂浓度,图4b:接种量。
图5所示为实施例5中的不同发酵时间的酶活。
具体实施方式
序列表中为相关核苷酸序列信息:
SEQ ID NO.1是编码硫酸软骨素ABC裂解酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2是编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因的核苷酸序列。
硫酸软骨素酶ABC的酶活的测定方法:
以硫酸软骨素为底物,底物浓度为5 g/L,用Tris-HCl缓冲液 (pH7.4)溶解底物。酶活测定的反应体系为1 mL,含40 μL酶液和960 μL硫酸软骨素底物溶液。30℃反应1 min,通过分光光度计测定在232 nm处的吸光值变化。酶活定义单位:每分钟转化1 μmol底物所需要的酶量为1 U。
硫酸软骨素酶ABC的相对酶活的计算方法:相对酶活=突变体酶活/野生型酶活。
实施例1硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的制备方法
合成普通变形杆菌来源的硫酸软骨素酶ABC,编码的该硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列如SEQ ID NO.1所示。通过序列对比选取第125、154、322、309位氨基酸位点,分别进行饱和突变。将编码原始硫酸软骨素酶ABC的基因或者经过PCR突变后所得到的基因连接到pET-28a质粒XhoI和NdeI酶切位点上,导入Escherichia coliBL21(DE3)中,获得表达原始硫酸软骨素酶ABC或硫酸软骨素酶ABC突变体的重组大肠杆菌菌株。将所得重组菌株接种于LB培养基中,37℃过夜培养后转接于装有LB培养基的250mL三角摇瓶,30℃培养1h,加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导后,置于27℃培养20h。
从重组大肠杆菌中获取酶的过程:培养完成后,将发酵液于4℃、6800rpm离心10min,弃掉上清,用20mM Tris-HCl重悬菌体2-3次,用超声细胞破碎仪破碎后12000rpm高速离心20min,获得胞内粗酶,胞内粗酶液过膜后用100mM咪唑洗脱获得原始硫酸软骨素酶ABC或硫酸软骨素酶ABC突变体的纯酶。测定原始硫酸软骨素酶ABC或硫酸软骨素酶ABC突变体的活力,结果如图1所示,突变体L102T具有最高的酶活,相比于突变前,突变体L102T的活力提高了50%。
实施例2 将酶基因与信号肽融合实现胞外分泌表达人工序列
实验过程:从大肠杆菌BL21基因组中克隆出信号肽PelB、PhoA、OmpA,分别融合到编码突变体的基因中,使得翻译的氨基酸序列的N端融合有信号肽。将所得融合基因连接到pET-28a质粒XhoI和NdeI酶切位点上,导入Escherichia coliBL21(DE3)中,获得重组大肠杆菌菌株。以表达没有融合信号肽的基因的重组菌为对照组。将所得重组菌株接种于LB培养基中,37℃过夜培养后转接于装有LB培养基的250mL三角摇瓶,30℃培养1h,加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导后,置于27℃培养20h。
用于测定胞内酶活的酶液的收集方法:培养完成后,将发酵液于4℃、6800rpm离心10min,弃掉上清,用20mM Tris-HCl重悬菌体2-3次,用超声细胞破碎仪破碎后12000 rpm高速离心20min,获得胞内粗酶。
用于测定胞外酶活的酶液的收集方法:培养完成后,将发酵液于4℃、6800rpm离心10min,取上清即为胞外粗酶。
分别测定胞内粗酶、胞外粗酶的活力,结果如图2所示,未融合信号肽的对照组没有检测到胞外酶活,全部为胞内酶活。PelB、PhoA、OmpA这三种信号肽中,融合信号肽OmpA时,取得的胞外酶活最高,可以达到0.3U/mL。
实施例3 敲除菌株外膜蛋白提高酶的胞外分泌表达量
实验过程:将pCas9质粒化转到BL21(DE3)感受态细胞,涂布卡那霉素平板,30℃培养。提取上述平板的单菌落,接种于含卡那霉素的SOB培养基中,30℃过夜培养12h。以2%接种量转接含卡那霉素的SOB液体培养基中,30℃培养至OD600为0.1时,加入终浓度为10mmol/L的***糖诱导重组酶表达。继续培养至OD为0.6时,冰浴菌液10min,4℃、4000r/min离心5min,收集菌体细胞。用预冷的10%甘油洗涤菌体细胞3次,浓缩100倍,制备得到电转化感受态细胞。
将连接有编码L102T突变体的、融合有信号肽OmpA的基因的pET-28a质粒大导入电转化感受态细胞进行电转,对转化子进行PCR验证以及DNA测序验证以确定基因组改造的正确性。之后将质粒pCas9和pTargetF消除。然后,将敲除菌株外膜蛋白,且消除了质粒pCas9和pTargetF的重组菌株接种于LB培养基中,37℃过夜培养后按10%接种量转接于装有LB培养基的250mL三角摇瓶,30℃培养1h,加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导后,置于27℃培养20h。
用于测定胞外酶活的酶液的收集方法:摇瓶培养完成后,将发酵液于4℃、6800rpm离心10min,取上清即为胞外粗酶。结果如图3所示,敲除OMPA外膜蛋白所得菌株胞外酶活最高,可以达到0.68U/mL。
实施例4 摇瓶发酵优化
实验过程:
关于诱导剂的浓度:将用于表达突变体L102T的重组大肠杆菌(E. coliBL21(DE3)-pET-28a-L102T)接种于LB培养基,37℃过夜培养后按10%接种量转接于250 mL三角摇瓶,30℃培养1 h,分别加入终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mMIPTG诱导后,置于27℃培养20h。
关于接种量:将用于表达突变体L102T的重组大肠杆菌(E. coliBL21(DE3)-pET-28a-L102T)接种于LB培养基,37℃过夜培养后按1%、4%、10%接种量转接于250 mL三角摇瓶,30℃培养1 h,加入终浓度为0.5mMIPTG诱导后,置于27℃培养20h。
结果:如图4所示,接种量10%,IPTG浓度0.5mM,酶活最高,可以达到1.46U/mL。
实施例5 发酵罐发酵培养
3L发酵罐培养:将实施例3构建的利用信号肽OmpA表达L102T突变体的敲除了OMPA外膜蛋白的重组菌株接种于含50mL LB培养基的250mL摇瓶中,37℃、220rpm过夜培养后转接到3L发酵罐中进行发酵培养,发酵罐的装液量为1L,发酵培养基为LB培养基,初始转速600rpm,发酵温度30℃,转速与溶氧偶联,控制发酵过程中DO在30%以上(溶氧100%是未接种时,培养基中的溶氧水平),30℃培养1h后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养20h,发酵结束后,4℃、6800rpm离心10min收集发酵上清液。
结果:如图5所示,诱导培养20h,发酵上清液中的酶活力最高,为2.96 U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体及其分泌表达的方法
<130> BAA190514A
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2994
<212> DNA
<213> 普通变形杆菌
<400> 1
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ggaacatcat cccttgaagg tcaatatggc atgatggcat tcgatcttat ttatcccgcc 2160
aatcttgagc gttttgatcc taatttcact gcgaaaaaga gtgtattagc cgctgataat 2220
cacttaattt ttattggtag caatataaat agtagtgata aaaataaaaa tgttgaaacg 2280
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ggcaatggtt acttaattac tcaagcagaa aaagtaaatg taagtcgcca acatcaggtt 2460
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ttttatcagc cagcatcaat tgaagacaaa tggatcaaaa aggttaataa acctgcaatt 2760
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atgactcgcc aaaaagcagc aactcctgtc accatcaatg tcacgattaa tggcaaatgg 2880
caatctgctg ataaaaatag tgaagtgaaa tatcaggttt ctggtgataa cactgaactg 2940
acgtttacga gttactttgg tattccacaa gaaatcaaac tctcgccact ccct 2994
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ggtaacatac ttataatgca agcgaatgca tt 32
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ggtaacatac ttatagttca agcgaatgca tt 32
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<213> 人工序列
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ggtgtgtgta ctgtttatac cagcggt 27
Claims (2)
1.一种制备硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的方法,其特征在于,是将重组基因工程菌接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中,37℃、220rpm过夜培养后转接到3L发酵罐中进行发酵培养,发酵罐的装液量为1L,发酵培养基为LB培养基,初始转速600rpm,发酵温度30℃,转速与溶氧偶联,控制发酵过程中培养基中的溶氧量是通气搅拌开始后、接种前的培养基中的饱和溶氧量的30%以上,30℃培养1h后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养20h;
所述重组基因工程菌的宿主是敲除了外膜A蛋白OMPA的Escherichia coli BL21(DE3),所述重组基因工程菌携带了表达载体,所述表达载体是以pET-28a质粒为骨架,并在XhoI和NdeI酶切位点***了融合了来源于大肠杆菌的信号肽OmpA的编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因,编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述信号肽替换为PelB或PhoA。
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