ES2468315T3 - Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de las plantas - Google Patents

Abstract

Un método para estimular el crecimiento de la raíz o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular que comprende expresión en plantas o partes de plantas de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta seleccionado del grupo que consiste de: (a) ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ADN como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de las mismas, (b) ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de las mismas, (c) ácidos nucleicos que se hibridan específicamente a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o al complemento de las mismas, (d) ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se da en la SEQ ID NO 2, o el complemento de las mismas, (e) ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (d) caracterizados porque dicho ácido nucleico es ADN, ADN genómico, ADNc, ADN o ARN sintético en donde T se reemplaza por U, (f) un ácido nucleico que se degenera a un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o que se degenera a un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e) como resultado del código genético, (g) ácidos nucleicos que son divergentes de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en la SEQ ID NO 2 o que es divergente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos, (h) ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en la SEQ ID NO 2 o ácidos nucleicos como se define en (a) a (e) que son divergentes debido a las diferencias entre alelos, (i) ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en la SEQ ID NO 2, y (j) fragmentos funcionales de ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa.

Description

M�todo para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de las plantas

Campo de la Invención

La presente invención se relaciona en general con un método para modificar las propiedades o características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de las plantas, tales como uno o más de sus procesos de desarrollo y/o sus procesos de adaptación al ambiente, que incluyen la modificación de la iniciación o estimulaci�n o mejora del crecimiento de la raíz, y/o la formación de raíces adventicias, y/o la formación de raíces laterales, y/o geotropismo de las raíces, y/o crecimiento de brotes, y/o dominio apical, y/o a la ramificación, y/o al periodo de senescencia, dicho método comprende expresar una proteína de control de degradación de citoquinina, en particular la citoquinina oxidasa, en la planta, funcionalmente bajo el control de una secuencia promotora regulable, tal como una secuencia promotora específica para la célula, promotora específica para el tejido, o promotora específica para un órgano. Preferiblemente, las características modificadas por la presente invención son características mediadas por citoquinina y/o mediadas por auxina.

Antecedentes de la Invención

Las raíces son un órgano importante de las plantas superiores. Sus principales funciones son anclar la planta en el suelo y absorber agua y nutrientes (nutrición N, minerales, etc.). As�, el crecimiento de la raíz tiene una influencia directa o indirecta en el crecimiento y rendimiento de los órganos aéreos, particularmente bajo condiciones de limitación de nutrientes. Las raíces también son relevantes para la producción de productos vegetales secundarios, tal como compuestos de defensa y hormonas de plantas.

Las raíces también son órganos de almacenamiento en un buen número de cultivos importantes. La remolacha de azúcar es la planta más importante para la producción de azúcar en Europa (260 millones de toneladas/año, 38% de la producción mundial). La mandioca (casaba), ñames y patatas dulces (batatas) son también productores de almidón importantes (aproximadamente 150 millones de toneladas/año cada una). Su contenido en almidón puede ser dos veces tan alto como el de la patata. Las raíces también son el órgano relevante para el consumo en una serie de vegetales (por ejemplo, zanahorias, r�banos), hierbas (por ejemplo, jengibre, c�rcuma), y plantas medicinales (por ejemplo, ginseng). Adicionalmente, algunos de los productos vegetales secundarios encontrados en las raíces son de importancia económica para la industria química y farmacéutica. Un ejemplo son los ñames que contienen moléculas básicas para la síntesis de hormonas esteroides. Otro ejemplo es la shiconina, que es producida por las raíces de la Lithospermum erithrorhizon en cultivos de raíces capilares. La Shikonina se utiliza por sus propiedades antiinflamatorias, antitumorales y para curación de heridas.

Adem�s, el crecimiento de la raíces de las plantas de cultivo mejoradas también mejora la competitividad frente a la maleza y mejora el crecimiento en áreas áridas, al incrementar la accesibilidad y la adsorción de agua.

El crecimiento mejorado de las raíces también es relevante para propósitos ecológicos, tales como la biorremediaci�n y la prevención/detención de la erosión del suelo.

La arquitectura de las raíces es un área que ha permanecido durante mucho tiempo inexplorada a través de los cultivos clásicos, debido a las dificultades al evaluar este rasgo en el campo. As�, la biotecnolog�a podría tener un impacto significativo en la mejora de este rasgo, puesto que no se basa en selecciones a gran escala en el campo. En cambio, los métodos biotecnol�gicos requieren de un entendimiento básico de los componentes moleculares que determinan una característica específica de la planta. Hoy, este conocimiento es solamente fragmentario, y como consecuencia, la biotecnolog�a hasta ahora ha sido incapaz de alcanzar una profunda penetraci�n en esta área.

Un regulador bien establecido del crecimiento de las raíces es la auxina. La aplicación de ácido indol-3-acético (IAA) a las plantas en crecimiento estimula el desarrollo de las raíces laterales y la elongaci�n de las raíces laterales (Torrey, Am J Bot 37: 257-264, 1950; Blakely et al., BotGaz 143: 341-352, 1982; Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994). Las raíces expuestas a un rango de concentraciones de IAA inician al aumentar los números de raíces laterales (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000). Adicionalmente, cuando las raíces habían producido raíces laterales en respuesta a una concentración particular de auxina ex�gena fueron expuestas posteriormente a concentraciones más altas de IAA, se formaron numerosas raíces laterales supernumerarias espaciadas entre las existentes (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000). Por el contrario, el crecimiento de las raíces en agar que contiene inhibidores del transporte de la auxina, que incluye el NPA, reduce el número de raíces laterales (Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994).

Se han aislado mutantes de arabidopsis que contienen niveles incrementados de IAA endogeno (Boerjan et al., Plant Cell 7: 1405-141, 1995; Celenza et al., Gene Dev 9: 2131-2142, 1995; King et al., Plant Cell 7: 2023-2037, 1995; Lehman et al., Cell 85: 183-194, 1996). Se conocen por ser alelos de un locus localizado en el cromosoma 2. Estas

pl�ntulas mutantes tienen raíces adventicias y laterales en exceso, lo que est� de acuerdo con los efectos anteriormente descritos de la aplicación externa de auxina.

El efecto estimulador de las auxinas en la formación de raíces adventicias y laterales sugiere que la sobreproducción de auxinas en las plantas transg�nicas es una estrategia válida para incrementar el crecimiento de las raíces. Aún, también es cuestionable si esto produciría un producto comercial con características mejoradas. A parte de su efecto estimulatorio sobre la formación de las raíces adventicias y laterales, la sobreproducción de auxina dispara otros efectos, tales como la reducción en el número de hojas, la morfología anormal de hojas (hojas estrechas, entorchadas), inflorescencias abortadas, dominio apical incrementado, formación de raíces adventicias en el tallo, la mayoría de las cuales son indeseables desde la perspectiva agron�mica (Klee et al., Genes Devel 1: 86-96, 1987; Kares et al., Plant Mol Biol 15: 225-236, 1990). Por lo tanto, el principal problema con los métodos que se basan en la síntesis incrementada de auxina es un problema de contención, a saber confinar los efectos de la auxina a la raíz. Este problema probablemente no se supera por el uso de promotores específicos del tejido: las auxinas se transportan en la planta y su acción consecuentemente no est� confinada al sitio de la síntesis. Otro aspecto es si las auxinas siempre mejorarán la biomasa total de las raíces. Para plantas cultivadas sobre agar, se ha notado que las concentraciones crecientes estimulaban progresivamente la formación de raíces laterales pero inhibían concurrentemente el crecimiento de estas raíces (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000).

Los problemas anteriormente mencionados en cuanto a la contención de los efectos de la auxina y el mantenimiento del sobrecrecimiento de las raíces se resuelven mediante las realizaciones de las reivindicaciones de la patente.

Resumen de la Invención

La presente invención se relaciona con una materia objeto como se define en las reivindicaciones adjuntas 1 a 10.

La presente especificación describe una construcción genética que comprende un gen que codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa de la Arabidopsis thaliana. Este gen se expresa bajo el control de un promotor regulado. Este promotor puede ser regulado por factores end�genos específicos del tejido o específicos del ambiente, o alternativamente puede ser inducido por la aplicación de productos químicos específicos.

La presente especificación también describe una célula o planta que contiene la construcción genética.

La presente invención se relaciona con un método para modificar la arquitectura y biomasa de las raíces mediante la expresión de un gen de oxidasa citoquinina bajo control de un promotor que es específico para la raíz o para ciertos tejidos o tipos de células de la raíz.

Descripci�n Detallada de la Invención

Para obviar los problemas mencionados anteriormente asociados con el incremento de la biosíntesis de auxina, se decidió seguir un método alternativo. Nuestro razonamiento es que una regulaci�n por disminución de los antagonistas biológicos de las auxinas podría evocar efectos similares o incluso superiores sobre el crecimiento de las raíces en comparación con los niveles de auxina en incremento. Las acciones e interacciones hormonales son extremadamente complejas, pero nuestra hipótesis es que las citoquininas pueden funcionar como antagonistas de auxina con respecto al crecimiento de las raíces. Los estudios hormonales sobre los cultivos de tejidos de plantas han mostrado que la relación de la auxina versus la citoquinina es más importante para la organog�nesis que los niveles absolutos de cada una de estas hormonas, lo cual en efecto indica que estas funciones hormonales como antagonistas -por lo menos en ciertos procesos biológicos. Adicionalmente, la formación de raíces laterales se inhibe por la aplicación ex�gena de citoquininas. De manera interesante, también la elongaci�n es afectada negativamente por el tratamiento con citoquinina, lo cual sugiere que las citoquininas controlan tanto la ramificación de raíces como el sobrecrecimiento de las raíces.

A la vez, los datos de la bibliografía actual indican que incrementar los niveles de citoquinina afecta negativamente el crecimiento de las raíces, pero no se entienden los mecanismos que subyacen bajo este proceso. Los sitios para síntesis de citoquinina en la planta son las puntas de las raíces y los tejidos de brote jóvenes. Las concentraciones end�genas de citoquininas est�n en el rango de los nM. Sin embargo, puesto que su cuantificación es difícil, es necesario extraer grandes cantidades de tejido y no se conocen las concentraciones reales. Tampoco se conoce la compartimentaci�n subcelular de las citoquininas. Se cree en general que las bases libres y las ribosidas se localizan en el citoplasma y en el núcleo, mientras que los gluc�sidos se localizan en la vacuola. También existen diferentes citoquininas con estructuras químicas ligeramente diferentes. Como consecuencia, no se sabe si los efectos de las citoquininas ex�genas deberían ser adscritos a un aumento en la concentración total de citoquinina o más bien a la competencia de otras formas de citoquininas generadas en la planta (las cuales difieren bien en estructura, localización celular o subcelular) para receptores, translocalizadores, transportadores, enzimas de

modificaci�n…

Con el fin de probar la hipótesis de que los niveles de citoquinina en la raíz de hecho exceden el nivel óptimo para el crecimiento de la raíz, se clonaron nuevos genes que codifican citoquinina oxidasas (las cuales son enzimas metabolizantes de la citoquinina) a partir de Arabidopsis thaliana (designada ATCKX) y se expresaron posteriormente bajo un promotor fuerte constitutivo en tabaco transg�nico y Arabidopsis. Los transformantes mostraron la expresión del ATCKX ARNm e incrementaron la actividad de la oxidasa citoquinina y manifestaron una formación y crecimiento de las raíces mejorado. También se observaron efectos negativos sobre el crecimiento de brotes. El último est� de acuerdo con la expresión constitutiva del gen de citoquinina oxidasa en estas plantas, lo que ilustra la importancia de la expresión confinada del gen de citoquinina oxidasa para las propiedades generales de crecimiento de las plantas. La contención de la actividad de citoquinina oxidasa se puede alcanzar utilizando promotores específicos para células, tejidos u órganos, puesto que la degradación de la citoquinina es un proceso limitado a los tejidos o células que expresan la proteína CKX, esto contrasta con los métodos que se basan en la síntesis hormonal, como se explicó anteriormente.

Los efectos negativos observados de la expresión de la citoquinina oxidasa sobre el crecimiento de los brotes demuestran que las citoquininas oxidasas son objetivos interesantes para el diseño o selección de productos químicos promotores del crecimiento. Dichos productos químicos deberían inhibir la actividad de citoquinina oxidasa, deberían preferiblemente no ser transportados a la raíz y deberían ser degradados rápidamente en el suelo, de manera que la aplicación de estos productos químicos no inhiba el crecimiento de la raíz. Las citoquininas también retardan la senescencia de las hojas, lo que significa que los efectos positivos incluirán también el crecimiento y mantenimiento de los tejidos fotosint�ticos. Adicionalmente, la observación de que las citoquininas retrasan la senescencia, mejoran el verdor (contenido de clorofila) de las hojas y reducen el dominio apical de las raíces muestra que las estrategias basadas en la supresión de la actividad CKX (tales como tecnología antisentido, riosomal y de cosupresi�n) en las partes aéreas de las plantas resultarían en una senescencia retrasada, mejorando el verdor de las hojas e incrementando la ramificación.

De la misma forma, los efectos positivos observados de la expresión de la citoquinina oxidasa en el crecimiento de las raíces demuestran que las citoquininas oxidasas son objetivos interesantes para el diseño o selección de herbicidas. Dichos herbicidas deberían inhibir la actividad de la citoquinina oxidasa, preferiblemente no deberían ser transportados hacia los brotes, y deberían ser solubles y relativamente estables en un solvente que se pueda administrar a la raíz a través del suelo.

Estos efectos de la sobreexpresi�n de la citoquinina oxidasa sobre el desarrollo y la arquitectura de la planta eran hasta el momento desconocidos, y como consecuencia, no se pueden prever la presente invención y sus realizaciones.

Los efectos negativos observados sobre el crecimiento de los brotes demuestran que la manipulación de la citoquinina oxidasa también pude ser usada para obtener fenotipos enanos. Los fenotipos enanos son útiles particularmente en cultivos comerciales tales como cereales y árboles frutales por ejemplo.

Realizaciones preferibles de esta especificación se relacionan con el efecto positivo de la expresión de citoquinina oxidasa en el crecimiento y arquitectura de la planta, y en particular en el crecimiento y arquitectura de la raíz. La familia de genes de la citoquinina oxidasa contiene por lo menos seis miembros en la Arabidopsis (véanse ejemplos más abajo) y los presentes inventores han mostrado que hay diferencias cuantitativas en los efectos alcanzados con algunos de estos genes en plantas transg�nicas. Se anticipa que los homólogos funcionales de la citoquinina oxidasa de Arabidopsis descritas se pueden aislar de otros organismos, dada en la evidencia de la presencia de actividades citoquinina oxidasa en muchas plantas verdes (Hare and van Staden, Physiol Plant 91: 128-138, 1994; Jones and Schreiber, Plant Growth Reg 23:123-134, 1997), as� como en otros �rganismos (Armstrong, in Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. Eds Mok and Mok, CRC Press, pp139-154, 1994). Por lo tanto, la secuencia de la citoquinina oxidasa, funcional en la descripción de esta especificación, no necesita ser idéntica a aquella descrita aquí. Esta invención es particularmente útil para cultivos de cereales y cultivos de cotiled�neasmonocotiled�neas en general, y también se pueden utilizar los genes de la citoquinina oxidasa por ejemplo de trigo o maíz Morris et al., 1999; Rinaldi and Comandini, 1999). Se prev� que otros genes con actividades citoquinina oxidasa o con cualquier otra actividad metabolizante de citoquinina (véase Za�imalov� et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, Hooykaas, Hall and Libbenga (Eds.), Elsevier Science, pp141-160, 1997) también se pueden utilizar para el propósito de esta divulgación. De la misma forma, también se pueden utilizar los genes que codifican proteínas incrementarían la actividad metabolizante de la citoquinina end�gena para el propósito de esta divulgación. En principio, también se podrían obtener fenotipos similares al interferir con genes que funcionan en dirección 3’ de la citoquinina tales como los receptores o proteínas involucrados en las rutas de transducci�n de señal de citoquinina.

Para el propósito de esta invención, se se debe entender que el término “crecimiento de raíces” abarca todos los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que constituyen el sistema radicular en diferentes etapas de su desarrollo, tanto en plantas monocotiled�neas como dicotiled�neas. Se se debe entenderentender que el crecimiento mejorado de la raíz puede resultar a partir del crecimiento mejorado de una o más de sus partes que incluyen raíces primarias, raíces laterales, raíces adventicias, etc., todas las cuales caen dentro del alcance de esta invención.

De acuerdo con una primera realización, la presente invención se relaciona con un método para estimular el crecimiento de las raíces y/o potenciar la formación de raíces laterales y/o adventicias y/o alterar el geotropismo de la raíz que comprende la expresión de una citoquinina oxidasa de planta.

En el contexto de la presente invención se debería entender que los términos “expresión y/o “sobreexpresi�n” se usan de manera intercambiable y se relacionan ambos con “una expresión potenciada y/o ect�pica” de una citoquinina oxidasa de una planta. Debe quedar claro que aquí una expresión potenciada de la citoquinina oxidasa de una planta, as� como también la expresión “de novo” de las citoquinina oxidasas es importante. De acuerdo con la especificación, otras proteínas pueden potenciar la actividad metabolizante de la citoquinina de una citoquinina oxidasa de planta.

Se se debe entender adicionalmente que en el contexto de la presente invención la expresión “raíces laterales y/o adventicias” puede significar “raíces laterales y adventicias” pero también “raíces lateral o adventicias”. La potenciación puede existir en la forma de raíces laterales o en la formación de raíces adventicias as� como en la formación de ambos tipos de raíces no primarias, pero no necesariamente.

De acuerdo con una realización adicional, la presente invención se relaciona con un método para estimular el crecimiento de raíces y/o potenciar la formación de raíces laterales o adventicias y/o alterar el geotropismo radicular y/o incrementar el rendimiento que comprende la expresión de una citoquinina oxidasa de planta.

De acuerdo con una realización preferida, la presente invención se relaciona con un método para estimular el crecimiento de las raíces que resultan en un incremento de la masa radicular mediante sobreexpresi�n de una citoquinina oxidasa, preferiblemente una citoquinina oxidasa descrita aquí, preferiblemente en raíces.

La mayor producción de biomasa radicular debida a la sobreexpresi�n de las secuencias promotoras del crecimiento tiene un efecto directo en el rendimiento y un efecto indirecto en la producción de compuestos producidos por células radiculares o células radiculares transg�nicas o cultivos de células de dichas células radiculares transg�nicas. Un ejemplo de un compuesto de interés producido en cultivos de raíces es la shikonina, cuyo rendimiento se puede ser potenciar ventajosamente por dichos métodos.

De acuerdo con una realización más específica, la presente invención se refiere a métodos para estimular el crecimiento radicular o para potenciar la formación de raíces laterales y adventicias o para alterar el geotropismo radicular que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta seleccionado del grupo que consiste de:

(a)

ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ADN tal como se da por cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de los mismos,

(b)

ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o los complementos de los mismos,

(c)

ácidos nucleicos que hibridan específicamente a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o a los complementos de los mismos,

(d)

ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de amino�cidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NO 2, o los complementos de los mismos,

(e)

ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (d), caracterizados por que dicho ácido nucleico es ADN, ADN gen�mico, ADNc, ADN o ARN sintéticos en donde T se reemplaza por U,

(f)

ácidos nucleicos que se degeneran a ácidos nucleicos como los dados en cualquiera de SEQ ID NOs 1 o 25, o los cuales se degeneran a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (e) como resultado del código genético,

(g)

ácidos nucleicos que son divergentes de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NO 2 o los cuales son divergentes de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,

(h)

ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en la SEQ ID NOs 2 o ácidos nucleicos como se define en (a) a (e) que son divergentes debido a las diferencias entre alelos,

(i)

ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en la SEQ ID NO 2, y,

fragmentos funcionales de ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y

En la presente descripción, se han aislado los ácidos nucleicos que codifican las citoquinina oxidasas novedosas de la Arabidopsis thaliana y por primera vez, los presentes inventores pueden demostrar sorprendentemente que la expresión de la citoquinina oxidasas en las plantas transg�nicas o en partes de plantas transg�nicas resultaron en las características relacionadas con las raíces anteriormente mencionadas. Preferiblemente, la expresión de la citoquinina oxidasa debería tomar lugar en las raíces, preferiblemente bajo el control de un promotor especifico de las raíces. Un ejemplo de dicho promotor específico de las raíces se da en la SEQ ID NO 36.

Debe quedar claro que, aunque la invención est� soportada en la sección de ejemplos por varios nuevos genes ATCKX y proteínas, la presente especificación describe el uso de otras citoquinina oxidasas aisladas y expresadas en otras plantas, preferiblemente en la raíces de dichas otras plantas para obtener efectos similares en las plantas como se describe en la sección de ejemplos.

Por lo tanto, la presente especificación describe de manera más general el uso de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta o que codifica una proteína que reduce el nivel de las citoquininas activas en plantas o partes de plantas para estimular el crecimiento de las raíces o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular. Las citoquininas oxidasas preferidas para ser usadas se codifican por ácidos nucleicos que codifican la citoquininas oxidasas como se definió anteriormente y se codifican por los ácidos nucleicos novedosos de la invención que se definen más adelante.

La especificación describe un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de planta novedosa que tiene actividades citoquinina oxidasa seleccionada del grupo consistente de:

(a)

un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o el complemento de los mismos,

(b)

un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN que corresponde a cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34 o los complementos de los mismos,

(c)

un ácido nucleico que hibrida específicamente hacia un ácido nucleico como el dado en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34 o los complementos de los mismos,

(d)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de amino�cidos que comprende el polip�ptido como se da en la SEQ ID NO 32 y el cual es por lo menos similar en un 70%, preferiblemente por lo menos 75%, 80% u 85%, más preferiblemente por lo menos 90% o 95%, o más preferiblemente por lo menos 99% similar a la secuencia de amino�cidos como se da en la SEQ ID NO 4,

(e)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de amino�cidos que es por lo menos 35% similar, preferiblemente 37%, 40%, 45%, 47% o 50%, similar, más preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% similar, más preferiblemente 85%, 90% o 95% similar a la secuencia de amino�cidos como se da en SEQ ID NO 6,

(f)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de amino�cidos que es por lo menos 35% similar, preferiblemente 37%, 40%, 45%, 47% o 50% similar, más preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% similar, lo más preferiblemente 85%, 90% o 95% similar a la secuencia de amino�cidos como se da en las SEQ ID NO 10 o 35,

(g)

un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de amino�cidos como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 4, 6, 10, 32 o 35,

(h)

un ácido nucleico que se degenera a un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 33 o 34 o el cual se degenera a un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,

(i)

un ácido nucleico que es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en el uso de cod�n entre los organismos,

(j)

un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en las SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35 o un ácido nucleico como se define en (a) a (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos.

(k)

un ácido nucleico que codifica un fragmento inmunol�gicamente activo de una citoquinina oxidasa codificado por un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento inmunol�gicamente activo de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (j),

(l)

un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificado por un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34 o un fragmento funcional de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (j), en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y

(m)

un ácido nucleico que codifica una proteína como se define en SEQ ID NO 4, 6, 10 o 35, dado que dicho ácido nucleico no es el ácido nucleico como est� depositado bajo ninguno de los siguientes números de accesos Genbank: AC005917, AB024035 y AC023754.

La especificación también describe un ácido nucleico aislado el cual es ADN, ADNc, ADN gen�mico o ADN sintético,

o ARN en donde T se reemplaza por U.

La especificación también describe una molécula de ácido nucleico de por lo menos 15 nucleótidos en longitud que hibrida específicamente con o que amplifica específicamente un ácido descrito aquí.

La especificación también describe un vector que comprende un ácido nucleico descrito aquí. Dicho vector puede ser un vector de expresión en donde el ácido nucleico se enlaza de manera operativa con una o más secuencias de control lo que permite la expresión de dicha secuencia en células anfitrionas procari�ticas y/o eucari�ticas.

Se debe entender que para la expresión de los genes de citoquinina oxidasa en monocotiled�neas, se debe utilizar una secuencia de ácidos nucleicos que corresponde a la secuencia del ADNc para evitar una unión equivocada de intrones en las monocotiled�neas. Las secuencias de ADNc preferidas que se van a expresar en las monocotiled�neas tienen una secuencia de ácidos nucleicos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NOs 25 a 30 y 34.

La especificación también describe una célula anfitriona que contiene cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos o vectores descritas aquí. Dicha célula anfitriona se escoge del grupo que comprende células bacterianas, de insectos, f�ngicas, de plantas o animales.

La especificación describe un polip�ptido aislado codificable por un ácido nucleico descrito aquí, o un homólogo o derivado del mismo, o un fragmento inmunol�gicamente activo o funcional del mismo. Los polip�ptidos preferidos comprenden secuencias de amino�cidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 32 y 35, o un homólogo o derivado de las mismas, o un fragmento inmunol�gicamente activo y/o funcional de las mismas. La especificación describr un polip�ptido que tiene una secuencia de amino�cidos como se da en las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 35, o un homólogo o derivado de los mismos, o un fragmento inmunol�gicamente activo y/o funcional de los mismos. Los fragmentos funcionales preferidos de los mismos son aquellos fragmentos que est�n desprovistos de su p�ptido de señal.

La especificación describe adicionalmente un método para producir un polip�ptido descrito aquí que comprende cultivar una célula anfitriona descrita aquí bajo condiciones que permiten la expresión del polip�ptido y recuperar el polip�ptido producido del cultivo.

La especificación también describe un anticuerpo que reconoce específicamente un polip�ptido descrito aquí o un ep�topoep�topo específico del mismo.

La especificación describe adicionalmente un método para la producción de plantas, células de plantas o tejidos de plantas transg�nicos que comprenden la introducción de una molécula de ácido nucleico descrita aquí en un formato expresable o un vector descrito aquí en dicha planta, célula de planta o tejido de planta.

La especificación también describe un método para la producción de plantas, células de plantas o tejidos de plantas alterados, que comprende la introducción de un polip�ptido descrito aquí directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta.

La especificación describe un método para efectuar la expresión de un polip�ptido descrito aquí que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico descrita aquí unida de manera operativa con una o más secuencias de control o un vector descrito aquí de manera estable en el genoma de una célula de planta. La especificación describe adicionalmente con el método como se describió anteriormente que comprende adicionalmente la regeneración de una planta a partir de dicha célula de planta.

La especificación también describe una célula de planta transg�nica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos descrita aquí la cual se enlaza de manera operativa a elementos reguladores que permiten la trascripción y/o expresión de dicho ácido nucleico en las células de plantas o que son obtenibles por un método como se explicó anteriormente.

La descripción describe una célula de planta transg�nica como se describió aquí anteriormente en donde el ácido nucleico descrito aquí se integra de manera estable en el genoma de dicha célula de planta.

La especificación describe adicionalmente una planta transg�nica o un tejido de planta que comprende células de planta descritas aquí y también una parte que se puede recolectar de dicha planta transg�nica, seleccionada preferiblemente del grupo consistente de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, raíces, tubérculos, rizomas y bulbos. La especificación también describe la progenia derivada de cualquiera de dichas plantas o partes de planta transg�nicas.

La especificación describe un método para estimular el crecimiento radicular que comprende la expresión de un ácido nucleico descrito aquí o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.

Una célula de planta o un cultivo de tejidos es un cultivo de células de plantas o de tejidos de plantas producido artificialmente que se hace crecer en un medio especial, bien sea líquido o sólido, que proporciona a estas células o tejidos de plantas todos los requerimientos necesarios para el crecimiento y/o producción de ciertos compuestos. Los cultivos de células y/o tejidos de plantas se pueden utilizar para la propagación rápida de las plantas y para la producción de plantas transg�nicas por nombrar unos pocos ejemplos. La formación de raíces puede ser difícil para algunos esquejes o bajo algunas condiciones en dichos cultivos y se puede utilizar la expresión de un gen de citoquinina oxidasa en dichas células o tejidos de plantas cultivadas para potenciar la formación de raíces. El cultivo de células y/o tejidos de plantas también se puede ser utiliza para la producción industrial de compuestos valiosos. Compuestos de producción posibles son productos farmacéuticos, pesticidas, pigmentos, cosméticos, perfumes, aditivos para alimentos, etc. Un ejemplo de dicho producto es la shikonina, que se produce por las raíces de la planta Lithospermum erythrorhizon. Un ejemplo de un cultivo de tejido de planta es el cultivo de una raíz pilosa, el cual es una masa artificialmente producida de raíces capilares. Las raíces de L. erythrorhizon son difíciles de recolectar en grandes cantidades y al preparar los cultivos de raíces capilares, el producto final Shikonina se puede preparar industrialmente a un índice más rápido del que ocurriría normalmente. Como se describe aquí, la expresión de la citoquinina oxidasa potencia el crecimiento y desarrollo de las raíces y por lo tanto se puede utilizar con ventaja en dichos procedimientos de cultivo de células y tejidos de plantas. Por lo tanto, esta especificación, describe un método para estimular el crecimiento y desarrollo de las raíces que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta, preferiblemente una citoquinina oxidasa descrita aquí, en un cultivo de célula o tejido de una planta transg�nica que comprende dichas células de planta transg�nica.

La especificación adicionalmente describe un método para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias que comprende la expresión de un ácido nucleico descrito aquí o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.

La especificación también describe un método para alterar el geotropismo radicular que comprende alterar la expresión de un ácido nucleico descrito aquí que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.

La especificación también describe métodos para potenciar el vigor temprano y/o para modificar la relación raíz/brote y/o para mejorar la resistencia a las plagas y/o para incrementar la tolerancia a la sequía y/o para promover la propagación in vitro de esquejes que comprenden la expresión de un ácido nucleico descrita qui que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.

La especificación adicionalmente describe métodos para incrementar el tamaño de las raíces o el tamaño del meristema de las raíces que comprende la expresión de un ácido nucleico descrito aquí o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en raíces.

La describe adicionalmente un método para incrementar el tamaño de un meristema de brote que comprende la regulaci�n por disminución de la expresión de un ácido nucleico descrito aquí, preferiblemente en brotes.

La especificación también describe un método para retardar la senescencia de las hojas que comprende la regulaci�n por disminución de la expresión de cualquiera de la citoquinina oxidasas de la especificación en hojas, preferiblemente en hojas senescentes. También la descripción describe un método para alterar la senescencia de las hojas que comprende la expresión de una de las citoquinina oxidasas en las hojas senescentes.

La especificación también describe métodos para incrementar el grosor de las hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico descrito aquí o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en hojas.

La especificación también describe un método para reducir el tamaño de los vasos que comprende la expresión de un ácido nucleico descrito aquí o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en los vasos.

La especificación describe adicionalmente un método para incrementar el tamaño de los vasos que comprende la regulaci�n por disminución de la expresión de un ácido nucleico descrito aquí en plantas o en partes de plantas.

La especificación también describe un método para mejorar la capacidad de pl�ntulas para permanecer erguidas que comprenden expresión de un ácido nucleico que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en las pl�ntulas.

Adicionalmente la presente especificación describe cualquiera de los métodos anteriormente descritos, dichos métodos llevan a un incremento en el rendimiento.

La invención se relaciona adicionalmente con cualquiera de los métodos de la invención en donde dicha expresión de dichos ácidos nucleicos ocurre bajo el control de un promotor constitutivo fuerte. En una realización preferida, la invención se relaciona con cualquiera de los métodos de la invención en donde dicha expresión de dicho ácido nucleico ocurre bajo el control de un promotor que se expresa preferiblemente en raíces. En la Tabla 5, se incluye una lista no exhaustiva de los promotores de raíces específicos. Un promotor es preferido que se va a utilizar en los métodos de la invención es el promotor homólogo de la raíz de clavata que tiene una secuencia como se da en la SEQ ID NO 36.

La especificación describe un método para modificar el destino de las células y/o modificar el desarrollo de las plantas y/o modificar la morfología de las plantas y/o modificar la bioquímica de las plantas y/o modificar la fisiología de las plantas y/o modificar el índice de progresión del ciclo celular que comprende la modificación de la expresión en células tejidos u órganos particulares de una planta, de un ácido nucleico descrito aquí

La especificación también describe un método para obtener un crecimiento potenciado, y/o un rendimiento incrementado y/o una senescencia alterada de una célula, tejido y/o órgano de planta y/o una frecuencia incrementada de la formación de órganos laterales en una planta, que comprende la expresión ect�pica de un ácido nucleico descrito aquí.

La especificación también se relaciona con un método para promover y extender la actividad de división celular en células en condiciones de crecimiento adversas y/o en estr�s, que comprende la expresión ect�pica de una secuencia de ácidos nucleicos descrito aquí.

La especificación describe un método para identificar y obtener proteínas que interact�an con un polip�ptido descrito aquí que comprende una prueba de selección en donde se usa un polip�ptido descrito aquí.

La especificación se relaciona con un método para identificar y obtener proteínas que interact�an con un polip�ptido descrito aquí que comprende una prueba de selección de dos híbridos en donde un polip�ptido descrito aquí en donde se utiliza como un cebo y una biblioteca de ADNc como presa.

La especificación describe adicionalmente un método para modular la interacción entre un polip�ptido descrito aquí y proteínas asociadas que interact�an obtenibles por un método como se describió anteriormente.

La especificación describe un método para identificar y obtener compuestos que interact�an con un polip�ptido descrito aquí que comprende las etapas de:

a) Proveer un sistema de dos híbridos en donde un polip�ptido descrito aquí y una proteína que interact�a asociada obtenible por un método como el que se describió anteriormente,

b) hacer interactuar dicho compuesto con el complejo formado por los polip�ptidos expresados como se define en a), y,

c) llevar a cabo (en tiempo real) la medición de la interacción de dicho compuesto con dicho polip�ptido o el complejo formado por los polip�ptidos expresados como se define en a).

La especificación describe adicionalmente un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos que específicamente se enlazan a un polip�ptido descrito aquí, que comprende:

a) Combinar un polip�ptido descrito aquí con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de complejos, y,

b) detectar la formación de complejos, en donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla que específicamente enlaza dicho polip�ptido.

La especificación también describe un método como se describió anteriormente en donde dicho compuesto o mezcla inhibe la actividad de dicho polip�ptido descrito aquí y se puede utilizar para el diseño racional de productos químicos.

La especificación también describe el uso de un compuesto o mezcla identificados por medio de un método como se describió anteriormente tal como un regulador del crecimiento de planta o herbicida.

La especificación también describe un método para la producción de un regulador de crecimiento de planta o composición herbicida que comprende las etapas de métodos de selección del compuesto descrito anteriormente y formular los compuestos obtenidos de dichas etapas en una forma adecuada para la aplicación en agricultura o en cultivo de células o tejidos de plantas.

La especificación también describe un método para incrementar la ramificación que comprende la expresión de un ácido nucleico descrito aquí en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o yemas axilares.

La especificación también describe un método para mejorar la resistencia al alojamiento que comprende la expresión de un ácido nucleico descrito aquí en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o yemas axilares.

La especificación también describe un método para el diseño de o selección de productos químicos promotores del crecimiento o herbicidas que comprenden el uso de un ácido nucleico desciro aquí o en un vector aquí.

La especificación describe el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polip�ptido descrito aquí para aumentar el rendimiento.

La especificación también describe el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o un polip�ptido descrito aquí para estimular el crecimiento de las raíces.

La especificación también descrbe el uso de una molécula de ácido nucleico descrita aquí, un vector descrito aquí o un polip�ptido descrito aquí para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias.

La especificación también describe el uso de una molécula de ácido nucleico descrita aquí, un vector descrito aquí o un polip�ptido descrito aquí para alterar el geotropismo de las raíces.

La especificación describe adicionalmente el uso de una molécula de ácido nucleico descrita aquí, un vector descrito aquí o un polip�ptido descrito aquí para potenciar el vigor temprano y/o para modificar la relación raíz/brote y/o para mejorar la resistencia al alojamiento y/o para incrementar la tolerancia a la sequía y/o para promover la propagación in vitro de esquejes.

La especificación también describe el uso de una molécula de ácido nucleico descrita aquí, un vector recombinante descrito aquí o un polip�ptido descrito aquí para modificar el desarrollo de las plantas y/o para modificar la morfología de las plantas y/o para modificar la bioquímica de las plantas y/o para modificar la fisiología de las plantas.

La especificación describe adicionalmente una composición de diagnóstico que comprende por lo menos una molécula de ácido nucleico descrita aquí, un vector descrito aquí, un polip�ptido descrito aquí ,o un |anticuerpo descrito aquí.

La especificación describe adicionalmente el uso de un rizoma transg�nico que tiene un crecimiento y desarrollo radicular potenciado debido a la expresión de una citoquinina oxidasa en procedimientos de injerto con un vástago para producir una planta o árbol con características agrícolas u hortícolas mejoradas. El vástago puede ser transg�nico o no transg�nico. Las características específicas previstas son aquellas conferidas por los sistemas radiculares e incluyen un anclaje mejorado de la planta/árbol en el suelo y/o un absorción mejorada del agua lo que resulta, por ejemplo en la tolerancia mejorada a la sequía, y/o un absorción mejorada de los nutrientes del suelo y/o un transporte mejorado de las sustancias orgánicas a través de la planta y/o una secreción mejorada de sustancias en el suelo tales como por ejemplo los fitosider�foros, y/o una respiración mejorada y/o una resistencia mejorada a enfermedades y/o un rendimiento mejorado. Una ventaja de utilizar rizomas transformados AtCKX para el injerto, además de su sistema radicular potenciado, es la senescencia retardada de las hojas en el injerto, como se describe aquí (véase Figura 12 A). Las plantas o árboles preferidos incluyen plantas o árboles que no crecen bien sobre sus propias raíces y que se injertan en entornos cultivados tales como las variedades comercialmente explotables de vides, cítricos, albaricoques, almendras, ciruelas, melocotones, manzana, peras, cerezas, nueces, higos, avellano y níspero.

Como se mencion� supra, las auxinas, y citoquininas actúan como antagonistas en ciertos procesos biológicos. Por ejemplo, la relación citoquinina/auxina regula la producción de raíces y brotes con una alta concentración de auxina lo que resulta en la producción de brotes. Como se describe en esta invención, la expresión de las citoquinina oxidasas en el tabaco y en Arabidopsis resulta en un desarrollo potenciado de las raíces consistente con los efectos potenciados de la auxina. Las auxinas también est�n involucradas en el desarrollo de los frutos. El tratamiento de las partes femeninas de las flores con auxina resulta en el desarrollo de frutas partenoc�rpicas en algunas especies vegetales. El desarrollo de las frutas partenoc�rpicas ha sido diseñado por ingeniería genética en diversas plantas de cultivo hortícola a través de biosíntesis incrementada de auxinas en los órganos reproductores femeninos (WO 0105985).

Por lo tanto, esta especificación describe un método para inducir el rasgo partenoc�rpico en plantas, dicho método consiste en disminución por regulaci�n de la expresión de una o más citoquinina oxidasas o de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en los órganos reproductores femeninos tales como la placenta, óvulos y tejidos derivados de la misma. se puede utilizar la región promotora de DefH9 de la Antirrhinum majus o uno de sus homólogos, que confiere alta especificidad en la expresión en placenta y óvulos, para este propósito.

La presente especificación describe adicionalmente aspectos y realizaciones como se describe en (I) a (LXII) adelante:

(I)

Uso de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta o que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas para estimular el crecimiento de la raíz o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular.

(II)

Un método para estimular el crecimiento de la raíz o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias

o para alterar el geotropismo radicular que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta seleccionado del grupo que consiste de:

(a)

ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ADN como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o el complemento de las mismas,

(b)

ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o el complemento de las mismas,

(c)

ácidos nucleicos que se hibridan específicamente a cualquiera de las SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o al complemento de las mismas,

(d)

ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de amino�cidos como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 32 o 35, o el complemento de las mismas,

(e)

ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (d) caracterizados porque dicho ácido nucleico es ADN, ADN gen�mico, ADNc, ADN o ARN sintético en donde T se reemplaza por U,

(f)

un ácido nucleico que se degenera a un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o que se degenera a un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e) como resultado del código genético,

(g)

ácidos nucleicos que son divergentes de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 35 o que es divergente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de

(a)

a (e), debido a las diferencias en el uso de cod�n entre los organismos,

(h)

ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 35 o ácidos nucleicos como se define en (a) a (e) que son divergentes debido a las diferencias entre alelos,

(i)

ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 35,

(j)

fragmentos funcionales de ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (I) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y

(k)

ácidos nucleicos que codifican una citoquinina oxidasa de planta, o que comprende expresión, preferiblemente en raíces, de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

(III) Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de planta novedosa que tiene actividad de citoquinina oxidasa seleccionado del grupo que consiste de:

(a)

un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o el complemento de las mismas,

(b)

un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o el complemento de las mismas,

(c)

un ácido nucleico que se hibrida específicamente a un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o el complemento de las mismas,

(d)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de amino�cidos que comprende el polip�ptido como se da en la SEQ ID NO 32 y que es por lo menos 70% similar a la secuencia de amino�cidos como se da en la SEQ ID NO 4,

(e)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de amino�cidos que es por lo menos 47% similar a la secuencia de amino�cidos como se da en la SEQ ID NO 6,

(f)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de amino�cidos que es por lo menos 47% similar a la secuencia de amino�cidos como se da en la SEQ ID NO 10 o 35,

(g)

un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de amino�cidos como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 4, 6, 10, 32 o 35,

(h)

un ácido nucleico que se degenera a un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 33 o 34 o que se degenera a un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,

(i)

un ácido nucleico que es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35 o que es divergente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en el uso de cod�n entre los organismos,

(j)

un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en las SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35, o un ácido nucleico como se define en (a) a (g) que es divergente debido a las diferencias entre alelos,

(k)

un ácido nucleico que codifica un fragmento inmunol�gicamente activo de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento inmunol�gicamente activo de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (j),

(l)

un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento funcional de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (j), en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y

(m)

un ácido nucleico que codifica una proteína como se define en la SEQ ID NO 4, 6, 10 o 35, dado que dicho ácido nucleico no es el ácido nucleico que se deposita bajo cualquiera de los siguientes números de acceso Genbank: AC005917, AB024035, y AC023754.

(IV)

Un ácido nucleico aislado como se establece en (III) anterior que es ADN, ADNc, ADN gen�mico o ADN sintético, o ARN en donde T se reemplaza por U.

(V)

una molécula de ácido nucleico de por lo menos 15 nucleótidos en longitud que se hibridan específicamente con un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior.

(VI)

una molécula de ácido nucleico de por lo menos 15 nucleótidos en longitud que específicamente amplifica un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior.

(VII) Un vector que comprende un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior.

(VIII) Un vector como se establece en (VII) anterior, que es un vector de expresión en donde el ácido nucleico se enlaza de forma operativa a una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicho ácido nucleico en células anfitrionas procariotas y/o eucariotas.

(IX)

Una célula anfitriona que contiene un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior, o un vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior.

(X)

La célula anfitriona como se establece en (IX) anterior, en donde la célula anfitriona es una célula bacteriana, de insecto, f�ngica, de planta o animal.

(XI)

Un polip�ptido aislado codificable por un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior, o un homólogo

o un derivado del mismo, o un fragmento inmunol�gicamente activo o un fragmento funcional del mismo.

(XII) El polip�ptido como se establece en (XI) anterior, que tiene una secuencia de amino�cidos como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 4, 6, 10 o 35, o un homólogo o un derivado del mismo, o un fragmento inmunol�gicamente activo o un fragmento funcional del mismo.

(XIII) Un método para producir un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior, que comprende cultivar una célula anfitriona como se establece en (IX) o (X) anterior, bajo condiciones que permiten la expresión del polip�ptido y recuperar el polip�ptido producido del cultivo.

(XIV) Un anticuerpo que reconoce específicamente un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior o un ep�topo específico del mismo.

(XV) Un método para la producción de plantas transg�nicas, células de planta o tejidos de planta que comprende la introducción de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior en un formato que se puede expresar o un vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior en dicha planta, célula de planta o tejido de planta.

(XVI) Un método para la producción de plantas alteradas, células de planta o tejidos de planta que comprende la introducción de un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta.

(XVII) Un método para efectuar la expresión de un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior, que comprende la introducción de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior enlazado de forma operativa a una o más secuencias de control o un vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior de forma estable en el genoma de una célula de planta.

(XVIII) El método como se establece en (XVI) o (XVII) anterior que comprende adicionalmente regenerar una planta a partir de dicha célula de planta.

(XIX) Una célula de planta transg�nica que comprende un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior, que se enlaza de forma operativa a elementos reguladores que permiten transcripción y/o expresión de dicho ácido nucleico en células de planta o una célula transg�nica de planta que se puede obtener por un método como se establece en (XVI) o (XVII) anterior.

(XX) La célula transg�nica de planta como se establece en (XVIII) anterior en donde dicho ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior se integra de manera estable en el genoma de dicha célula de planta.

(XXI) Una planta transg�nica o tejido de planta que comprende células de planta como se establece en (XIX) o (XX) anterior.

(XXII) Una parte que se puede cosechar de una planta como se establece en (XXI) anterior.

(XXIII) La parte que se puede cosechar de una planta como se establece en (XXII) anterior que se selecciona del grupo que consiste de semillas, hojas, frutos, cultivos de vástago, rizomas, raíces, tubérculos y bulbos.

(XXIV) La progenie derivada de cualquiera de las plantas o partes de plantas de cualquiera como se establece en

(XXI) a (XXIII) anterior.

(XXV) Un método para estimular el crecimiento de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) anterior o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

(XXVI) Un método para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) anterior o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

(XXVII) Un método para alterar el geotropismo radicular que comprende alterar la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) anterior o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

(XXVIII) Un método de cualquiera como se establece en (XXV) a (XXVII) anterior, dicho método lleva a un aumento en el rendimiento.

(XXIX) El método de cualquiera como se establece en (XXV) a (XXVIII) anterior en donde ocurre dicha expresión de dicho ácido nucleico bajo el control de un promotor constitutivo fuerte.

(XXX) El método de cualquiera como se establece en (XXV) a (XXVIII) anterior en donde ocurre dicha expresión de dicho ácido nucleico bajo el control de un promotor que se expresa preferiblemente en raíces.

(XXXI) Un método para identificar y obtener proteínas que interact�an con un polip�ptido como se establece en (XI)

o (XII) anterior que comprende una prueba de selección en donde un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior.

(XXXII) El método como se establece en (XXXI) anterior, que comprende una prueba de selección de dos híbridos en donde un se utilizan polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior como un cebo y una colección de ADNc como presa.

(XXXIII) Un método para modular la interacción entre un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior y que interact�an con proteínas asociadas que se pueden obtener por un método de acuerdo con (XXXI) o (XXXII).

(XXXIV) Un método para identificar y obtener compuestos que interact�an con un polip�ptido como se establece en

(XI) o (XII) anterior que comprende las etapas de:

a) proporcionar un sistema de dos híbridos en donde se expresan un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior y una proteína que interact�a asociada que se puede obtener por un método de acuerdo con (XXXI) o (XXXII),

b) hacer interactuar dicho compuesto con el complejo formado por los polip�ptidos expresados como se define en (a), y,

c) desarrollar medición de interacción de dicho compuesto con dicho polip�ptido o el complejo formado por los polip�ptidos expresados como se define en (a).

(XXXV) Un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos que se unen específicamente a un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior, que comprende:

a) combinar un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de complejo, y,

b) detectar la formación de complejo, en donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla que se une específicamente a dicho polip�ptido.

(XXXVI) Un método de cualquiera como se establece en (XXXI) a (XXXV) anterior en donde dicho compuesto o mezcla inhibe la actividad de dicho polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior y se puede utilizar para el diseño racional de productos químicos.

(XXXVII) Uso de un compuesto o mezcla identificada por medio de un método de cualquiera de (XXXI) a (XXXV) como un regulador de crecimiento de planta o herbicida.

(XXXVIII) Un método para producción de una regulador de crecimiento de planta o composición herbicida que comprende las etapas del método de cualquiera como se establece en (XXXI) a (XXXV) anterior y formular los compuestos obtenidos a partir de dichas etapas en una forma adecuada para la aplicación en agricultura o célula de planta o cultivo de tejido.

(XXXIX) Un método para el diseño de o selección de productos químicos o herbicidas que promueven crecimiento que comprenden el uso de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) o un vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior.

(XL) Uso de una molécula de ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II), el vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior, un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior para aumentar el rendimiento.

(XLI) Uso de una molécula de ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II), el vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior, un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior para estimular el crecimiento de la raíz.

(XLII) Uso de una molécula de ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II), el vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior, un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias.

(XLIII) Uso de una molécula de ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II), el vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior, un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior para alterar el geotropismo radicular.

(XLIV) Composición diagnóstica que comprende por lo menos una molécula de ácido nucleico de cualquiera como se establece en (III) a (VI) anterior, el vector como se establece en (VII) o (VIII) anterior, un polip�ptido como se establece en (XI) o (XII) anterior o un anticuerpo como se establece en (XIV) anterior.

(XLV) Un método para incrementar el tamaño del meristemo de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) o que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raíces.

(XLVI) Un método para incrementar el tamaño de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) o que comprende la expresión de otro ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raíces.

(XLVII) Un método para incrementar el tamaño del meristemo del brote que comprende regulaci�n por disminución de expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II), preferiblemente en brotes.

(XLVIII) Un método para retrasar la senescencia de hojas que comprende la regulaci�n por disminución de expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) en hojas, preferiblemente en hojas con senescencia.

(XLIX) Un método para alterar senescencia de hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) en hojas con senescencia.

(L)

Un método para incrementar el grosor de hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) o que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

(LI)

Un método para reducir el tamaño de vaso que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) o que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

(LII) Un método para incrementar el tamaño de vaso que comprende la regulaci�n por disminución de expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) en plantas o partes de plantas.

(LIII) Un método para inducir partenocarpia que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en

(III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) o que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas, preferiblemente en la placenta, óvulos y tejidos derivados de los mismos.

(LIV) Un método para mejorar la capacidad de las pl�ntulas para permanecer erguidas que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) o que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en pl�ntulas, preferiblemente en las raíces de pl�ntulas.

(LV) Un método para incrementar la ramificación que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) en plantas o partes de plantas.

(LVI) Un método para mejorar resistencia al alojamiento que comprende la expresión de un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II) en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o yemas axilares.

(LVII) Uso de un rizoma transg�nico en procedimientos de injerto con un vástago para mejorar las características relacionadas con la raíz de la planta o árbol resultante caracterizadas en un crecimiento potenciado de la raíz debido a la expresión de una citoquinina oxidasa de planta en dicho rizoma.

(LVIII) Uso como se establece en (LVII) anterior, en donde dicha citoquinina oxidasa de planta se codifica por un ácido nucleico como se establece en (III) o (IV) anterior o un ácido nucleico como se define en (II).

(LIX) Una planta transg�nica que comprende un rizoma transg�nico que expresa una citoquinina oxidasa de planta como se establece en (LVII) o (LVIII) anterior y que comprende adicionalmente un vástago.

(LX) Una parte que se puede cosechar de una planta como se establece en (LIX) anterior.

(LXI) Un método para estimular el crecimiento y desarrollo de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta en una célula transg�nica de planta o cultivo de tejido.

(LXII) Un método como se establece en (LXI) en donde dicho ácido nucleico es por lo menos uno de los ácidos nucleicos de (III) o como se define en (II).

Definiciones y Elaboraciones de las Realizaciones Los expertos en la técnica estarán al tanto de que la invención descrita aquí est� sujeta a variaciones y modificaciones diferentes a aquellas descritas específicamente. Se debe entender que la invención descrita aquí incluye todas dichas variaciones y modificaciones.

La presente invención es aplicable a cualquier planta en particular a plantas monocotiled�neas y dicotiled�neas que incluyen legumbres de alimentación o forraje, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o malezas seleccionadas de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astalia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp.,Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp; Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomele s spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermun mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodlum spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochioa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo Incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Laudetia simplex,. Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medlcago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárrago, br�coli, repollitas de Bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, col rizada, linaza, berza común, lentejas, colza de semillas oleosas, quingomb�, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha de azúcar, ca�a de azúcar, girasol, tomates, calabacín, y t�, entre otros, o las semillas de cualquier planta específicamente nombrada anteriormente o un cultivo de tejido, célula u órgano de cualquiera de las especies anteriores.

A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprenden” y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” se entender� que implica la inclusión de un entero o etapa establecida o grupos de enteros o etapas pero no la exclusión de ningún otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas.

Como se usa aquí, el término “derivado de” ser� tomado para indicar que un entero particular o grupo de enteros ha sido originado de las especies especificadas, pero necesariamente no se ha obtenido directamente de la fuente especificada.

Los términos “proteína (s)”, “p�ptido (s)” u “oligop�ptido (s)”, cuando se usan aquí se refieren a amino�cidos en una

forma polim�rica de cualquier longitud. Dichos términos incluyen también modificaciones conocidas de amino�cidos tales como formación de enlaces disulfuro, cisteinilaci�n, oxidación, glutationilaci�n, metilaci�n, acetilaci�n, farnesilaci�n, biotinalaci�n, estearoilaci�n, formilaci�n, adición de ácido lipoico, fosforilaci�n, sulfaci�n, ubiquitinaci�n, miristoilaci�n, palmitoilaci�n, geranilaci�n, ciclizaci�n (por ejemplo formación de ácido piroglut�mico) oxidación, desamidaci�n, deshidrataci�n, glicocilaci�n (por ejemplo pentosas, hexosaminas, N-acetil hexosaminas, dexoihexosas, hexosas, ácido si�lico, etc.) y acilaci�n as� como residuos de amino�cidos de origen no natural, residuos de L-amino�cidos y residuos de D-amino�cidos.

“Homólogos” de una proteína de la invención son aquellos p�ptidos, oligop�ptidos polip�ptidos, proteínas y enzimas

que contienen sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de amino�cidos que se relaciona con dicha proteína con respecto a la cual son homólogos, sin alterar una o más de sus propiedades funcionales, en particular sin reducir la actividad del resultante. Por ejemplo, un homólogo de dicha proteína consistir� de una variante de secuencia de amino�cidos bioactivos de dicha proteína. Para producir dichos homólogos, los amino�cidos presentes en la dicha proteína se pueden remplazar por otros amino�cidos que tienen propiedades similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento hidr�fobohidr�fobo, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras a helicoidales o de 1-laminares, y as� sucesivamente. Una revisión de las propiedades físicas y químicas de los amino�cidos se da en la Tabla 1.

Las variaciones sustitucionales de una proteína descrita aquí son aquellas en las cuales por lo menos se ha eliminado un residuo de dicha secuencia de amino�cidos de la proteína y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de amino�cidos son típicamente de residuos individuales, pero también se pueden aglomerar dependiendo de las restricciones funcionales colocadas sobre el polip�ptido; las inserciones ser�n usualmente del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de amino�cidos, y las eliminaciones variarán desde aproximadamente 1 a 20 residuos. Preferiblemente, las sustituciones de amino�cidos comprenderán sustituciones de amino�cidos conservadoras, tales como aquellos descritos supra.

Tabla 1. Propiedades de amino�cidos de origen natural

Propiedades de Carga/hidrofobicidad

Grupo natural Amino�cido

No polares hidrófobos

Alif�tico alif�tico, que contiene S aromático inino ala, ile, leu, val met phe, trp pro

Polares no cargados

Alif�tico amida aromático hidroxilo sulfhidrilo gly asn, gln tyr ser, thr cys

Cargados positivamente

Básico arg, his, lys

Cargados negativamente

ácido asp, glu

Las variantes de secuencias de amino�cidos de inserción de una proteína descrita aquí son aquellas en las cuales uno o más residuos de amino�cidos se introducen en sitios predeterminados en dicha proteína. Las inserciones 10 pueden comprender fusiones amino terminales y/o carboxi terminales as� como inserciones de intrasecuencia de amino�cidos individuales o múltiples. En general, las inserciones dentro de la secuencia de amino�cidos ser�n menores que las fusiones de terminales amino o carboxilo, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o p�ptidos de fusión de terminal amino o carboxi incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador transcripcional como se usa en un sistema de dos híbridos, proteínas para recubrimiento

15 de fagos, (histidina)6- tag, glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de unión de maltosa, dihidrofolato reductasa, ep�topo Tag•100/ep�topo(EETARFQPGYRS), ep�topo c-myc (EQKLISEEDL), ep�topo FLAG� (DYKDDDK) LacZ, CMP (p�ptido de unión de la calmodulina), ep�topo HA (YPYDVPDYA), ep�topo de la proteína C (EDQVDPRLIDGK) y ep�topo VSV (YTDIMNRLGK).

Las variaciones de eliminación de una proteína descrita aquí se caracterizan por la eliminación de uno o más 20 amino�cidos de la secuencia de amino�cidos de dicha proteína.

Las variantes de amino�cido de la proteína de la invención se pueden hacer fácilmente utilizando técnicas de síntesis de p�ptidos bien conocidas en el arte, tales como síntesis de p�ptidos en fase sólida y similares, o mediante manipulaciones de ADN recombinante. La manipulación de las secuencias de ADN para producir proteínas variantes se manifiestan como variantes de sustitución, de inserción o de eliminación bien conocidas en la técnica. Por

25 ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en secuencias conocidas que tienen ADN son bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como la mutag�nesis por M13, juego mutag�nesis por T7- gen in vitro (USB, Cleveland, OH), el juego de mutag�nesis Dirigida a Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutag�nesis dirigida a un sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutag�nesis dirigidas a un sitio.

30 De acuerdo de la presente invención los porcentajes de “identidad” y/o “similitud” entre secuencias de ADN y/o proteínas se pueden calcular utilizando programas de ordenador conocidos en la técnica tales como los programas DNAstar/MegAlign en combinación con el método Clustal.

“Los Derivados” de una proteína de la invención son aquellos p�ptidos, oligop�tidos, polip�ptidos, proteínas y enzimas que comprenden por lo menos cinco residuos de amino�cidos contiguos de dicho polip�ptido pero que

35 retienen la actividad biológica de dicha proteína. Un “derivado” puede comprender adicionalmente residuos de

amino�cidos de origen natural, alterados por glicosilaci�n, acilaci�n o que no son de origen natural en comparación con la secuencia de amino�cidos de una forma presente en la naturaleza de dicho polip�ptido. Alternativamente o adicionalmente, un derivado puede comprender uno o más sustituyentes diferentes de amino�cidos comparados con la secuencia de amino�cidos de una forma natural de dicho polip�ptido, por ejemplo una molécula mensajera u otro ligando, unido covalente o no covalentemente a la secuencia de amino�cidos tal como, por ejemplo, una molécula mensajera que se une al mismo para facilitar su detección.

Con “inmunol�gicamente activo” se da a entender que una molécula o un fragmento específico de la misma tal como

ep�topos específicos o haptenos específicos son reconocidos, por ejemplo, por unirse a los anticuerpos. Se pueden determinar ep�topos específicos utilizando, por ejemplo, técnicas de barrido de p�ptidos como se describe en Geysen et al. (1996) (Geysen, H.M., Rodda, S.J. and Mason, T.J. (1986). A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol. 23, 709-715.)

El término “fragmento de una secuencia” o “parte de una secuencia” significa una secuencia truncada de la secuencia original referida. La secuencia truncada (secuencia de ácidos nucleicos o proteínas) puede variar ampliamente en longitud; el tamaño mínimo de una secuencia es una secuencia de suficiente tamaño para proveer una secuencia con por lo menos una función y/o actividad comparable a la secuencia original referida (por ejemplo “fragmento funcional”), mientras que el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es sustancialmente mayor que aquel requerido para proporcionar la actividad y/o función deseada de la secuencia original.Típicamente, la secuencia de amino�cido truncada variar� desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 amino�cidos de longitud. Más típicamente, sin embargo, la secuencia tendr� un máximo de aproximadamente 50 amino�cidos de longitud, preferiblemente un máximo de aproximadamente 60 amino�cidos. En general es deseable seleccionar secuencias de por lo menos 10, 12 o 15 amino�cidos hasta un máximo de aproximadamente 20 o 25 amino�cidos.

Los fragmentos funcionales también pueden incluir los que comprenden un ep�topo que es específico para las proteínas descritas aquí. Los fragmentos funcionales preferidos tienen una longitud de por lo menos, por ejemplo, 5, 10, 25, 100, 150 0 200 amino�cidos.

Se debe entender por lo tanto que los fragmentos funcionales pueden ser o no fragmentos inmunol�gicamente activos.

En el contexto de la presente especificación se incorporan homólogos derivados y/o fragmentos inmunol�gicamente y/o funcionalmente activos de las citoquinina oxidasas como se definió supra. Los homólogos, derivados y/o fragmentos inmunol�gicamente y/o funcionalmente activos particularmente preferidos de las proteínas de citoquinina oxidasas que se contemplan para su uso en la presente invención son derivados de plantas, más específicamente de Arabidopsis thaliana, aún más específicamente dichas citoquinina oxidasas son la Arabidopsis thaliana (At)CKX,

o son capaces de ser expresadas en las mismas. La presente especificación describe claramente el uso de homólogos o derivados funcionales y/o de fragmentos inmunol�gicamente activos de las proteínas AtCKX y no se limita en aplicación al uso de la secuencia de nucleótidos que codifica una de dichas proteínas AtCKX.

Cualquiera de dichas proteínas, polip�ptidos, p�ptidos y fragmentos de los mismos se pueden producir en un sistema biológico, por ejemplo un cultivo celular. Alternativamente, cualquiera de dichas proteínas, polip�ptidos, p�ptidos y fragmentos de los mismos pueden ser manufacturados químicamente, por ejemplo, por síntesis de p�ptidos en fase sólida. Dichas proteínas o fragmentos de las mismas pueden ser parte de una proteína de fusión como es en el caso de por ejemplo, una prueba de dos híbridos que permite, por ejemplo, la identificación de proteínas que interact�an con una citoquinina oxidasa descrita aquí.

Las proteínas o fragmentos de las mismas son adicionalmente útiles por ejemplo, para modular la interacción entre una citoquinina oxidasa descrita aquí y asociados prote�nicos que interact�an mediante un método descrito aquí. Los p�ptidos sintetizados químicamente son particularmente útiles, por ejemplo, como una fuente de ant�genos para la producción de antisueros y/o anticuerpos.

“Anticuerpos” incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales, sintéticos o de cadena pesada as� como fragmentos

de anticuerpos tales como Fab, Fv o scFv. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por las técnicas que se describen por ejemplo, en Liddle and Cryer (1991) que comprende la fusión de células de mieloma de ratón en células de bazo derivadas de animales inmunizados. Adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos para una molécula o fragmentos de la misma se pueden obtener al utilizar métodos como los descritos en por ejemplo Harlow and Lane (1988). En el caso de anticuerpos dirigidos contra p�ptidos pequeños tales como fragmentos de una prote�nacdescrita aquí, dichos p�ptidos generalmente se acoplan a una proteína portadora antes de la inmunizaci�n de los animales. Dichas proteínas portadoras incluyen hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino, (BSA), ovoalb�mina y toxoides de tétano. La proteína portadora potencia la respuesta inmune en el animal y proporciona ep�topos para los sitios de unión del receptor de las células T. El término

“anticuerpos” incluye adicionalmente derivados de los mismos tales como anticuerpos marcados. Marcadores de

anticuerpos incluyen fosfatasa alcalina, PKH2, PKH26, PKH67, fluoresce�na (FITC), Hoechst 33258, R-fiocoeritrina (PE), rodamina (TRITC), Rojo Quantum, Rojo Texas, Cy3, biotina, agarosa, peroxidasa y esferas de oro. Las herramientas en la biología molecular que se basan en anticuerpos contra una proteína incluyen análisis de transferencia de gel, selección de la expresión por bibliotecas que permiten la identificación de genes, métodos cuantitativos para proteínas incluyendo ELISA y RIA, purificación de proteínas por inmunoafinidad, inmunoprecipitaci�n de proteínas (véase por ejemplo el ejemplo 6) e inmunolocalizaci�n. Otros usos de anticuerpos y especialmente de anticuerpos pept�dicos incluyen el estudio del procesamiento proteol�tico (Loffler et al. 1994, Woulfe et al. 1994), la determinación de sitios activos en las proteínas (Lerner 1982), el estudio de precursores de posicionamiento post-traduccional y (Baron and Baltimore 1982, Lerner et al. 1981), identificación de dominios de proteínas involucrados en la interacción proteína-proteína (Murakami et al. 1992) y el estudio del uso de ex�n en la expresión genética (Tamura et al. 1991).

La presente especificación también describe los anticuerpos que específicamente reconocen una citoquinina oxidasa

o un homólogo, derivados o fragmentos de la misma como se definió supra. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de una planta, más específicamente una de la citoquinina oxidasas de la Arabidopsis thaliana (ATCKX).

Los términos “gene o (s)”, “polinucle�tidos (s)”, “ácido nucleico (s)”, “secuencia de ácidos nucleicos (s)”, “secuencia de nucleótidos (s)” o “molécula de ácido nucleico (s)”, cuando se usan aquí se refieren a nucleótidos, bien sea ribonucle�tidos o desoxirribonucle�tidos o combinaciones de ambos, en una forma polim�rica de cualquier longitud. Dichos términos incluyen adicionalmente ADN y ARN de cadena doble y cadena sencilla. Dichos términos también incluyen modificaciones a nucleótidos conocidas tales como metilaci�n, ciclizaci�n y “tapones”, y sustitución de uno

o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. Las modificaciones de nucleótidos incluyen la adición de acridina, amina, biotina, azul cascada, colesterol, CY3�, CY5�, CY5.5�, Dabicil, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans, 6-FAM, fluoresce�na, 3´-glicerilo, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfato psoraleno, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, TAMRA, TET, AMCA-S�, SE, BODIPY�, Marina Blue�, Pacific Blue�, Oregon Green�, Rhodamine Green�, Rhodamine Red�, Rhodol Green� y Texas Red�. Las modificaciones en la estructura principal de los polinucle�tidos incluyen metilfosfonato, 2´-OMe-metilfosfonato ARN, fosforotiorata, ARN, 2´-OMeARN. Las modificaciones de base incluyen 2-amino-dA, 2-aminopurina, 3´-(ddA), 3´dA-(cordicepina), 7-deaza-dA, 8-Br-dA, 8oxo-dA, N6-Me-dA, un sitio ab�sico (despaciador) biotina dT, 2´-OMe-5Me-C, 2´-OMe-propinil-C, 3´-(5-Me-dC), 3´(ddC), 5-Br-dC, 5-1dC, 5-Me-dC, 5-F-dC, carboxi-dT, dA convertible, dC convertible, dG convertible, dT convertible, dU convertible, 7-deaza-dG, 8-Br-dG, 8-oxo-dG, O6-Me-Dg, S6-DNP-dG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2´-OMe-inosina, 2´-dL, 06-fenil-dL, 4-metil-indol, 2´-desoxinebularina, 5-nitroiridol, 2-aminopurina, dP(análogo de la purina), dK(análogo de la pirimidina), 3-nitropirrol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotina-dT, carboxi-dT, O4-Me-dT, O4-triazol dT, 2´-OMepropinil-U, 5-Br-dU, 2´-dU, 5´-F-dU, 5-I-dU, O4-triasol-dU. Dichos términos también abarcan ácidos nucleicos pept�dicos (PNA), un análogo de ADN en el cual la estructura principal es un seudop�ptido que consiste de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina en vez de un azúcar. Los PNA imitan el comportamiento del ADN y se unen de manera complementaria a las cadenas de ácidos nucleicos. La estructura principal neutra de los PNA resulta en una unión más fuerte y en una especificidad mayor que la alcanzada normalmente. Adicionalmente, las propiedades químicas, físicas y biológicas únicas de los PNA se han explotado para producir herramientas biomoleculares poderosas, agentes antisentido y ant�genos, sondas moleculares y biosensores.

La presente invención también describe secuencias de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de un ácido nucleico descrito aquí y preferiblemente de 15 a 50 nucleótidos. Estas secuencias pueden, de manera ventajosa, ser usadas como sondas para hibridar específicamente a las secuencias como se define anteriormente o cebadores para iniciar la amplificación o replicaci�n especifica de secuencias de la invención como se definió anteriormente, o similares. Dichas secuencias de ácidos nucleicos se pueden producir de acuerdo con técnicas bien conocidas en el arte, tales como por medios recombinantes o sintéticos. También se pueden utilizar en conjuntos de diagnóstico o similares para detectar la presencia de un ácido nucleico descrito aquí. Estas pruebas en general comprenden poner en contacto la sonda con la muestra bajo condiciones de hibridación y detectar la presencia de cualquier formación de dúplex o tr�plex entre la sonda y cualquier ácido nucleico en la muestra.

Se pueden producir las secuencias de ácido nucleico utilizando dichos medios recombinantes o sint[eticos, tales como por ejemplo utilizando mecanismos de clonaci�n por PCR los cuales generalmente involucran realizar un par de cebadores, los cuales pueden ser aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos en una región del gen que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con el ARNm, ADNc o ADN gen�mico de una célula, llevando a cabo una reacción en cadena de polimerasa bajo condiciones que provocan la amplificación de la región deseada, aislando la región amplificada o fragmento y recuperando el ADN amplificado. En general, dichas técnicas tal como se definen aquí son bien conocidas en el arte, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).

Una “secuencia de codificación” o “marco de lectura abierto” u “ORF” se define como una secuencia de nucleótidos

que se puede ser transcribir en ARNm y/o traducir en un polip�ptido cuando se coloca bajo el control de secuencias de control apropiadas o secuencias reguladoras, es decir, cuando dicha secuencia de codificación u ORF est� presente en un formato que se puede expresar. Dicha secuencia de codificación de ORF se une por un cod�n de inicio de traducción 5´ y un cod�n de detención de traducción 3´. Una secuencia de codificación u ORF puede incluir, pero no se limita a ARN, ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes, secuencias de nucleótidos manufacturadas sintéticamente o ADN gen�mico. Dicha secuencia de codificación u ORF se puede interrumpir mediante la intervención de secuencias de ácidos nucleicos.

5 Los genes y secuencias de codificación que codifican esencialmente la misma proteína pero que se aíslan de diferentes fuentes pueden consistir de secuencias de ácidos nucleicos divergentes sustancialmente. De manera recíproca, se pueden diseñar las secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente divergentes para efectuar la expresión de esencialmente la misma proteína. Dichas secuencias de ácidos nucleicos son el resultado de, por ejemplo, la existencia de diferentes alelos de un gen dado, de la degeneración del código genético o de diferencias

10 en el uso de codones. As�, como se indica en la Tabla 2, los amino�cidos tales como metionina y tript�fano son codificados por un cod�n individual mientras que otros amino�cidos tales como arginina, leucina y serina se pueden traducir a partir de seis codones diferentes. Las diferencias en el uso de cod�n preferido se ilustran en la Tabla 3 para Agrobacterium tumefaciens (una bacteria), A. thaliana, M. sativa (dos plantas dicotiled�neas) y Oryza sativa (una planta monocotiled�nea). Para extraer un ejemplo, el cod�n GGC (para glicina) es el cod�n más

15 frecuentemente usado en A. tumefaciens (36.2 ‰), es el segundo más frecuentemente utilizado en O. sativa pero se usa con frecuencia much�simo menor en A. thaliana y M. sativa (9 ‰ y 8.4 ‰ respectivamente). De los cuatro codones posibles que codifican la glicina (véase Tabla 2), dicho cod�n GGC se usa más preferiblemente en A. tumefaciens y O. sativa. Sin embargo, en A. thaliana este, es el cod�n GGA (y GGU) mientras que en M. sativa este es el cod�n GGU (y GGA).

20 La secuencias de ADN como se define en la presente invención se pueden interrumpir por secuencias de intervención. Con “secuencias de intervención” se entiende cualquier secuencia de ácidos nucleicos que interrumpe una secuencia de codificación que comprende dicha secuencia de ADN de la invención o que interrumpe el formato que se puede expresar de una secuencia de ADN que comprende dicha secuencia de ADN de la invención. La eliminación de la secuencia de intervención restaura dicha secuencia de codificación o dicho formato que se puede

25 expresar. Ejemplos de secuencias de intervención incluyen intrones y secuencias de ADN movilizables tales como transposones. Con “secuencia de ADN movilizable” se entiende cualquier secuencia de ADN que se puede movilizar como resultado de un evento de recombinación.

Tabla 2. Degeneración del código genético Tabla 3. Uso de codones indicados en los diferentes organismos dados como frecuencia por cada mil codones (http://www.kazusa.or.ip/codon). (continuación) (continuación)

Amino�cido

Código de tres letras Código de una letra Codones posibles

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Asparagina

Asn N AAC AAU

�cido asp�rtico

Asp D GAC GAU

Ciste�na

Cys C UGC UGU

�cido Glut�mico

Glu E GAA GAG

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Glicinas

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Metionina

Met M AUG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Serina

Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Triftopano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU GUU

Valina

Val V GUA GUC GUG

Posibles codones “DETENCIÓN”

UAA

UAG UGA

Cod�n

Agrobacterium tumefaciens Arabidopsis thaliana Medicago sativa Oryza sativa

UUU

13.9 22.5 24.1 11.3

UUC

24.3 20.7 16.9 26.3

UUA

3.5 12.9 10.4 4.7

UUG

13.2 21.0 22.4 11.8

UCU

7.0 24.6 19.8 10.1

UCC

14.8 10.8 7.7 16.9

UCA

7.4 17.8 17.2 9.7

UCG

18.2 8.9 3.2 10.8

UAU

12.3 15.2 16.6 9.2

UAC

10.3 13.7 14.0 20.6

UAA

0.9 0.9 1.2 0.9

UAG

0.6 0.5 0.8 0.8

UGU

3.0 10.8 10.6 5.0

UGC

7.4 7.2 5.8 14.3

UGA

1.8 1.0 0.8 1.3

UGG

12.2 12.7 10.0 12.8

CUU

19.1 24.3 28.3 14.6

CUC

25.7 15.9 12.0 28.0

CUA

5.2 10.0 8.8 5.7

CUG

31.6 9.9 8.5 22.1

CCU

7.7 18.3 23.2 11.8

CCC

10.6 5.3 5.3 12.5

CCA

8.9 16.1 22.6 12.2

CCG

20.7 8.3 3.6 16.7

Cod�n

Agrobacterium tumefaciens Arabidopsis thaliana Medicago sativa Oryza sativa

CAU

10.6 14.0 14.6 9.2

CAC

9.1 8.7 9.1 14.6

CAA

11.2 19.7 23.2 11.9

CAG

24.9 15.2 12.3 24.6

CGU

12.2 8.9 10.1 6.8

CGC

25.5 3.7 4.2 15.9

CGA

8.2 6.2 4.2 4.2

CGG

13.2 4.8 1.8 9.7

AUU

15.4 22.0 29.4 13.8

AUC

36.9 18.5 14.7 25.5

AUA

6.2 12.9 11.7 7.2

AUG

24.7 24.5 21.7 24.4

ACU

6.4 17.8 20.8 10.3

ACC

20.9 10.3 11.7 18.6

ACA

9.1 15.9 18.9 10.0

ACG

18.8 7.6 2.8 10.8

AAU

13.5 22.7 25.0 12.9

AAC

18.7 20.9 18.7 25.1

AAA

13.6 31.0 32.2 12.0

AAG

24.4 32.6 35.1 39.4

AGU

5.7 14.0 12.6 7.3

AGC

15.8 11.1 8.8 16.9

AGA

5.3 18.7 13.6 7.7

AGG

6.5 10.9 11.7 14.9

Cod�n

Agrobacterium tumefaciens Arabidopsis thaliana Medicago sativa Oryza sativa

GUU

16.6 27.3 34.7 15.0

GUC

29.3 12.7 9.9 22.8

GUA

6.1 10.1 10.0 5.7

GUG

19.7 17.5 16.5 25.0

GCU

17.4 28.0 34.6 19.8

GCC

35.8 10.3 11.4 33.2

GCA

19.5 17.6 25.9 15.6

GCG

31.7 8.8 3.4 25.3

GAU

25.8 36.8 40.0 21.5

GAC

28.0 17.3 15.5 31.6

GAA

29.9 34.4 35.9 17.1

GAG

26.3 32.2 27.4 41.1

GGU

16.5 22.2 28.7 16.3

GGC

36.2 9.0 8.4 34.7

GGA

12.5 23.9 27.3 15.0

GGG

11.3 10.2 7.4 16.6

“Hibridación” es el proceso en donde secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homólogas se hibridan entre s�. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, es decir, los ácidos nucleicos 5 complementarios est�n en solución. Las herramientas en la biología molecular que se basan en tal proceso incluyen PCR, hibridación sustractiva y determinación de la secuencia de ADN. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Shepharose o cualquier otra resina. Las herramientas en biología molecular que se basan en dicho proceso que incluye el aislamiento de ARNm poli (A+). El proceso de hibridación puede ocurrir adicionalmente con 10 uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como membrana de nitrocelulosa o nylon o inmovilizado por ejemplo mediante fotolitograf�a por ejemplo en un soporte de vidrio silíceo (el último conocido como disposiciones o microdisposiciones de ácidos nucleicos o como chips de ácidos nucleicos). Las herramientas en biología molecular que se basan en tal proceso incluyen el análisis de separación por gel de ARN y ADN, hibridación por colonia, hibridación en placa e hibridación por microdisposici�n. Con el fin de permitir 15 que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido nucleico son desnaturalizadas generalmente de manera térmica o química (por ejemplo mediante NaOH) para fusionar una doble cadena en dos cadenas individuales y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias a partir de ácidos nucleicos de cadena individual. La restricción de la hibridación es influenciada por condiciones tales como la temperatura, concentración de sal y composición reguladora de hibridación. Las condiciones de alta restricción para la hibridación incluyen alta temperatura y/o bajas 20 concentraciones de sal (las sales incluyen NaCl y Na3-citrato) y/o la inclusión de formamida en el regulador de hibridación y/o disminución de la concentración de compuestos tales como SDS (detergentes) en el regulador de hibridación y/o la exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilenglicol (que promueven la aglomeración molecular) del regulador de hibridación. Las condiciones convencionales de hibridación se describen en por ejemplo, Sambrook et al. (1989) pero el experto en la técnica apreciar� que se pueden diseñar numerosas 25 condiciones diferentes de hibridación en función de la homología conocida o esperada y/o de la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos. De manera suficiente las condiciones de hibridación de baja restricción son particularmente preferidas para aislar ácidos nucleicos heter�logos a las secuencias de ADN definidas supra. Los

elementos que contribuyen a dicha heterolog�a incluyen alelismo, degeneración del código genético y diferencias en el uso de cod�n preferido como se discutió anteriormente.

Claramente, la presente especificación, describe el uso de secuencias de ADN que codifican una citoquinina oxidasa, homólogo, derivado o fragmentos inmunol�gicamente activos y/o funcionales de la misma como se definió anteriormente en cualquier método de hibridación. La presente especificación también describe adicionalmente secuencias de ADN que hibridan a dichas secuencias de ADN. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de plantas, más específicamente la Arabidopsis thaliana (At) CKX. Para efectuar la expresión de una proteína en una célula, tejido u órgano, preferiblemente de origen vegetal, la proteína se puede introducir directamente en dicha célula, tal como por microinyecci�n o por medios balísticos o alternativamente, una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína se puede introducir en dicha célula, tejido u órgano en un formato que se pueda expresar.

Preferiblemente, la secuencia de ADN descrita aquí comprende una secuencia codificante o un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína de citoquinina oxidasa o un homólogo derivado de la misma o fragmentos inmunol�gica y/o funcionalmente activos de la misma como se definió supra. La proteína preferida descrita aquí comprende la secuencia de amino�cidos de dicha citoquinina oxidasa. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de planta y más específicamente una Arbabidopsis thaliana (At)CKX.

Con “vector” o “secuencia de vector” se refiere a una secuencia de ADN que se puede introducir en un organismo por transformación y que se puede mantener de manera estable en dicho organismo. El mantenimiento de un vector es posible por ejemplo en cultivos de Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Otros vectores tales como fag�midos y vectores c�smidos se pueden mantener y multiplicar en bacterias y/o virus. Las secuencias de vectores generalmente comprenden un conjunto de sitios únicos reconocidos por enzimas de restricción, sitios de clonaci�n múltiple (MCS) en donde se puede insertar una o más secuencias sin vector.

Con “secuencia sin vector” concordantemente se hace referencia a una secuencia de ADN que est� integrada en uno o más de los sitios del MCS comprendido dentro de un vector.

Los “Vectores de expresión” forman un subconjunto de vectores los cuales, en virtud de comprender las secuencias reguladoras o de control apropiadas habilitan la creación de un formato que se puede expresar para la inserción de secuencias sin vector permitiendo as� la expresión de la proteína codificada por dichas secuencias sin vector. Los vectores de expresión son conocidos en la técnica porque habilitan la expresión de las proteínas en organismos que incluyen bacterias (por ejemplo E. coli), hongos (por ejemplo S. cerevislae, S. pombe, Pichia pastoris), células de insectos (por ejemplo vectores de expresión baculoviral), células de animales (por ejemplo células COS o CHO) y células de plantas (por ejemplo vectores de expresión basados en el virus X de la patata).

La presente especificación incluye claramente cualquier citoquinina oxidasa, homólogo, derivado y/o fragmento inmunol�gicamente activo y/o funcional de la misma como se definió supra. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de planta más, más específicamente una Arabidopsis thaliana (At)CKX.

Como una alternativa a la producción de proteínas mediada por el vector de expresión en sistemas biológicos, se puede aplicar la síntesis química de proteínas. Los p�ptidos sintéticos se pueden manufacturar en fase de solución o en fase sólida. Sin embargo, la síntesis de p�ptidos en fase sólida (Merrifield 1963) es la manera más común e involucra la adición secuencial de amino�cidos para crear una cadena de p�ptidos lineal. La síntesis de p�ptidos en fase sólida incluye ciclos consistentes de tres etapas: (i) inmovilización del amino�cido de terminal carboxi de la cadena creciente de p�ptidos a un soporte o resina sólidos; (ii) ensamble de la cadena, un proceso que consiste de activación, acoplamiento y desprotecci�n del amino�cido que se va a añadir a la cadena de p�ptido en crecimiento; y (iii) división que involucra la remoción de la cadena pept�dica completa a partir de la resina y remoción de los grupos protectores de las cadenas laterales de los amino�cidos. Los métodos comunes en la síntesis de p�ptidos en fase sólida incluyen Fmoc/tBu (9-fluorenilmetiloxicarbonil/t-butil) y Boc (t-butiloxicarbonilo) como los grupos protectores de terminal amino de los amino�cidos. Grupos protectores de cadena lateral de amino�cidos incluyen metilo (Me), Formilo (CHO), etilo (Et), acetilo (Ac), t-butilo (t-Bu), anisilo, bencilo (Bzl), trifluoroacetilo (Tfa), Nhidoxisuccinimida (ONSu, Osu), benzoilo (Bz), 4- metilbencilo (Meb), tioanicilo, tiopercilo, bencil oximetilo (Bom), 4nitrofenilo (ONp), benciloxicarbonilo (Z), 2-nitrobenzoilo (NBz), 2-nitrofenilsulfenilo (Nps), 4-toluenosulfonilo (Tosilo, Tos), pentafluorofenilo (Pfp), difenilmetilo (Dpm), 2-chlorobenciloxicarbonilo (Cl-Z), 2,4,5-triclorofenilo, 2bromobenciloxicarbonilo (Br-Z), trifenilmetilo (Tritilo, Trt), y 2,5,7,8-pentametil-croman-6-sulfonilo (Pmc). Durante el ensamble de la cadena, el Fmoc o el Boc se eliminan resultando en un terminal amino activado del residuo de amino�cidos unido a la cadena en crecimiento. El terminal carboxi del amino�cido entrante es activado por conversión en un éster altamente reactivo, como por ejemplo, mediante HBTU. Con tecnologías actuales (por ejemplo el sintetizador PerSeptive Biosystems 9050, Sintetizador de P�ptidos Applied Biosystems Modelo 431A), se puede manufacturar p�ptidos lineales de hasta 50 residuos. Est� disponible un cierto número de guías para producir p�ptidos que son adecuados para su uso en sistemas biológicos que incluyen (i) limitar el uso de amino�cidos difíciles tales como cys, met, trp (fácilmente oxidados y/o degradados durante la síntesis de p�ptidos) o arg; (ii) minimizar los amino�cidos hidrófobos (pueden impedir la solubilidad de los p�ptidos); y (iii) evitar un ácido glut�mico terminal en amino (puede ciclizarse a piroglutamato).

Por “formato que se puede expresar” se entiende que la molécula de ácido nucleico aislada est� en una forma

adecuada para ser transcrita en ARNm y/o traducida para producir una proteína, ya sea de manera constitutiva o siguiendo inducción mediante una señal intracelular o extracelular, tal como un estímulo ambiental o de estr�s (mit�genos, anoxia, hipoxia, temperatura, sal, luz, deshidrataci�n, etc.) o un compuesto químico tal como IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosido) tal como un antibiótico (tetraciclina, ampicilina, rifampicina, kanamicina) una hormona (por ejemplo giberelina, auxina, citoquinina, glucocorticoides, brasinosteroide, etileno, ácido absc�sico, etc.), un análogo de una hormona ( ácido indolac�tico (IAA) 2,4-D, etc.), un metal (zinc, cobre, hierro, etc.) o dexametasona, entre otros. Como ser� conocido por aquellos expertos en la técnica, la expresión de una proteína funcional puede también requerir una o más modificaciones posttraduccionales, tales como glicosilaci�n, fosforilaci�n, desfosforilaci�n, o una o más interacciones proteína–proteína, entre otras. Se incluyen todos estos procesos dentro del alcance del término “formato que se puede expresar.

Preferiblemente, la expresión de una proteína en una célula, tejido u órgano específico, preferiblemente de origen vegetal se efectúa al introducir y expresar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicha proteína, tal como una molécula de ADNc, un gen gen�mico, una molécula de oligonucle�tido sintética, una molécula de ARNm o un marco de lectura abierto, a dicha célula, tejido u órgano, en donde dicha molécula de ácido nucleico se coloca de manera operativa en conexión con secuencias reguladoras o de control adecuadas que incluyen un promotor, preferiblemente un promotor que se puede expresar en una planta y una secuencia de terminación.

La referencia aquí a un “promotor” se debe tomar en su contexto más amplio e incluyen las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen gen�mico eucari�tico clásico, que incluye la caja TATA la cual se requiere para una iniciación de la transcripción exacta, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores o de control adicionales (esto es, secuencias activadoras en dirección 5´, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión genética en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o en una forma específica para un tejido.

El término “promotor” también incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procari�tico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10.

El término “promotor” también se utiliza para describir una molécula sintética o de fusión, o derivados que confieren, activan o potencian la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Los promotores pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para potenciar adicionalmente la expresión y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la cual se conecta de manera operativa. Se pueden colocar dichos elementos reguladores adyacentes a una secuencia promotora heter�loga para conducir la expresión de la molécula de ácido nucleico en respuesta a, por ejemplo, cobre, glucocorticoides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, AMPc, ácido absc�sico, auxina, heridas, etileno, jasmonato o ácido salicílico o para conferir la expresión de una molécula de ácido nucleico a células, tejidos y órganos específicos tales como meristemas, hojas, raíces, embriones, flores, semillas o frutos.

En el contexto de la presente invención, el promotor preferiblemente es una secuencia promotora que se puede expresar en una planta. También se describen los promotores que también funcionan o funcionan únicamente en células que no provienen de plantas tales como bacterias, células de levadura, células de insectos y células de animales. Por “que se puede expresar en una planta”, se entiende que la secuencia promotora, que incluye cualquier elemento regulador adicional añadido a la misma o contenido en la misma, es por lo menos capaz de inducir, conferir, activar o potenciar la expresión en una célula, tejido u órgano de una planta, preferiblemente una célula, tejido u órgano de una planta monocotiled�nea o dicotiled�nea.

Los términos “operable en planta” y “operable en una planta”, cuando se usan aquí, con respecto a una secuencia promotora, deben tomarse como equivalentes a una secuencia promotora que se puede expresar en planta.

Los promotores regulables como parte de un sistema de expresión v�rico binario en una planta también son conocidos para las personas expertas (Yadav 1999 - W09922003; Yadav 2000 - WO0017365).

En el contexto presente, una “secuencia promotora regulable” es un promotor que es capaz de conferir expresión sobre un gen estructural en una célula, tejido u órgano en particular o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, opcionalmente bajo condiciones específicas, aunque generalmente no confieren expresión a través de la planta bajo todas las condiciones. De acuerdo con ello, una secuencia promotora regulable puede ser una secuencia promotora que confiere expresión sobre un gen al cual est� conectada de manera operable en una localización particular dentro de la planta o alternativamente, a través de la planta bajo un conjunto específico de condiciones, tales como la inducción siguiente de la expresión del gen mediante un compuesto químico u otro elicitor.

Preferiblemente, el promotor regulable utilizado en el desarrollo de la presente invención confiere expresión en una localización específica dentro de la planta, ya sea constitutivamente o siguiendo la inducción, sin embargo no en la planta completa bajo ninguna circunstancia. Incluidos dentro del alcance de dichos promotores est�n las secuencias promotoras específicas para células, secuencias promotoras específicas para tejidos, secuencias promotoras específicas para órganos, secuencias promotoras de genes específicas para el ciclo celular, secuencias promotoras inducibles y otras secuencias promotoras constitutivas que pueden haber sido modificadas para conferir expresión en una parte particular de la planta en cualquier momento dado, tal como mediante la integración de dicho promotor constitutivo dentro de un elemento genético trasponible (Ac, Ds, Spm, En, u otros transposones).

De la misma forma, el término “específico para tejido” se debe tomar para indicar que la expresión est� predominantemente en un tejido o tipo de tejido particular, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusivo en dicho tejido o tipo de tejido.

De la misma forma, el término “específico para órganos” se debe tomar para indicar que la expresión est� predominantemente en un órgano, preferiblemente de origen vegetal, aunque no de manera necesaria exclusivamente en dicho órgano.

De la misma forma, el término “específico de ciclo celular”, se debe tomar para indicar que la expresión es predominantemente cíclica y que ocurre en una o más fases, no necesariamente consecutivas del ciclo celular si bien no necesariamente de forma exclusiva en células cíclicas, preferiblemente de origen vegetal.

Aquellos expertos en la técnica son conscientes que “un promotor inducible” es un promotor de la actividad transcripcional que se incrementa o induce en respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. De la misma forma, la persona experta en la técnica entender� que un “promotor constitutivo” es un promotor que es transcripcionalmente activo a lo largo de la mayoría de, pero no necesariamente de todas las partes de un organismo, preferiblemente una planta, durante la mayor parte de, pero no necesariamente todas las fases de su crecimiento y desarrollo.

Aquellas personas expertas en la técnica ser�n fácilmente capaces de seleccionar secuencias promotoras apropiadas para su uso en la expresión apropiada reguladora de la proteína de citoquinina oxidasa a partir de fuentes públicamente disponibles o fácilmente disponibles, sin experimentación indebida.

Colocar una molécula de ácido nucleico bajo el control regulador de una secuencia promotora o en una conexión operativa con una secuencia promotora significa posicionar dicha molécula de ácido nucleico de manera tal que la expresión es controlada por la secuencia promotora. Un promotor es usualmente, pero no necesariamente, posicionado en dirección 5´ o en el extremo 5’, y dentro de 2 kb del sitio de inicio de la transcripción, de la molécula de ácido nucleico que regula. En la construcción de combinaciones promotor/gen estructural heter�logas se prefiere generalmente posicionar el promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del gen que es aproximadamente la misma que la distancia entre el promotor y el gen que controla en su disposición natural (esto es, el gen desde el cual se deriva el promotor). Como se conoce en la técnica, se puede acomodar alguna variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora. De la misma forma, el posicionamiento preferido de un elemento de secuencia reguladora con respecto a un gen heter�logo que puede ser colocado bajo su control se define por el posicionamiento del elemento en su configuración natural (esto es, el gen del cual es derivado). De nuevo, como se conoce en la técnica, también puede ocurrir alguna variación en esta distancia.

Ejemplos de promotores adecuados para uso en construcciones de genes descritos aquí incluyen aquellos enumerados en la Tabla 4, entre otros. Los promotores enumerados en la Tabla 4 se proporcionan para solamente propósitos de ejemplificación y no se limitan por la lista proporcionada aquí. Aquellos expertos en la técnica estarán fácilmente en posición de proveer promotores adicionales que son útiles en llevar a cabo la presente invención.

En el caso de promotores constitutivos o promotores que inducen la expresión a través de la planta completa, se prefiere que dichas secuencias sean modificadas mediante la adición de secuencias de nucleótidos derivadas de uno o más de los promotores específicos de tejido enumerados en la Tabla 4, o alternativamente, secuencias de nucleótido derivadas de uno o más de los anteriores promotores inducibles específicos de tejido mencionados, para conferir especificidad al tejido en los mismos. Por ejemplo, el promotor CaMV 35S se puede modificar mediante la adición de la secuencia promotora Adh1 del maíz, para conferir una expresión específica de raíz regulada de manera anaerobia, como se describió previamente (Ellis et al., 1987). Otro ejemplo describe conferir una expresión genética abundante para raíz o específica de raíz al fusionar el promotor CaMV35S con elementos de la proteína de maíz rica en glicina del gen GRP3 (Feix and Wulff 2000 - WO0015662). Dichas modificaciones se pueden alcanzar mediante experimentación de rutina por las personas expertas en la técnica.

El término “terminador” se refiere a una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN 3’ no traducidas que contienen una señal de poliademilaci�n, la cual facilita la adición de secuencias de poliademilato al extremo 3’ de un transcripto primario.

Los terminadores activos en las células derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas se conocen y describen en la literatura. Se pueden aislar a partir de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas.

Tabla 4. Ejemplos de promotores que se pueden expresar en plantas para uso en el desarrollo de la presente invención (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS, ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

α-amilasa (Amy32b)

aleurona Lanahan, M.B., et al., Plant Cell 4.203211, 1992; Skriver, K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7266-7270,1991

Gen similar a catepsina β

aleurona Cejudo, F.J., et al. Plant Molecular Biology 20:849-856, 1992.

Agrobacterium rhizogenes rolB

Cambium Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456462 , 1997

AtPRP4

Flores http://salus.medium.edu/mmg/tiemey/html

Chalconas sintasa (chsA)

Flores Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol.15, 95-109, 1990.

LAT52

Anteras Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245 (1989)

Apetala-3

Flores

Quitinasa

Frutas (bayas, uvas, etc.) Thomas et al. CSIRO Plant Industry, Urrbrae, South Australia, Australia; http.//winetitles.com.au/gwrdc/csh951.html

rbcs-3A

Tejido verde (por ejemplo hojas) Lam, E. et al., The Plant Cell 2: 857-866, 1990.; Tucker et al., Plant Physiol. 113: 1303-1308, 1992.

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS, ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Genes específicos de hojas

Hoja Baszczynski, et al., Nucl. Acid Res.16.4732,1988.

AtPRP4

Hoja http://salus.medium.edu/mmg/ tiemey/html

Promotor de gen de la adenina metiltransferasa del virus chlorella

Hoja Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93

Promotor del gen aldP de la rosa

Hoja Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674

Promotor rbsc de arroz o tomate

Hoja Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000

Pinus cab-6

Hoja Yamamoto et a/., Plant Call Physiol. 35:773-778, 1994.

Promotor de rubisco

Hoja

Cab (proteína enlazante de clorofila a/b)

Hoja

SAM 22

Hoja senescente Crowell, et al., Plant Mol. Biol. 18: 459466, 1992.

Gen ltp (gen de transferencia de lipidos)

Fleming, et al, Plant J. 2, 855-862.

Gen de R. japonicum nif

Nódulo Patente de Estados Unidos No. 4, 803, 165

Gen de B. japonicum nif

Nódulo Patente de Estados Unidos No. 5, 008, 194

GmENOD40

Nódulo Yang, et al., The Plant J. 3: 573-585.

PEP carboxiasa (PEPC)

Nódulo Pathirana, et al., Plant Mol. Biol. 20: 437450, 1992.

Legaemoglobina (Lb)

Nódulo Gordon, et al., J. Exp. Bot. 44: 1453-1465, 1993.

Gen del virus Tungro bacilliform

floema Bhattacharyya-Pakrasi, et al, The Plant J. 4: 71-79, 1992

Genes específicos del polen

Polen; microespora Albani, et al., Plant Mol. Biol. 15: 605, 1990; Albani, et al., Plant Mol. Biol. 16: 501, 1991)

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS, ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Zm13

Polen Guerrero et al Mol. Gen. Genet. 224: 161-168 (1993)

Gen apg

Microespora Twell et al Sex. Plant Reprod. 6: 217-224 (1993)

Gen específico para el polen del maíz

Polen Hamilton, et al., Plant Mol. Biol. 18: 211218,1992.

Gen expresado en polen de girasol

Polen Baltz, et al., The Plant J. 2: 713-721, 1992

Gen específico del polen de B. napus

Polen; anteras; tapetum Amoldo, et al., J. Cell. Biochem., Abstract No. Y101, 204, 1992.

Genes que se expresan en raíces

Raíces Tingey, et al., EMBO J. 6:1, 1987.

Gen inducible por auxina de tabaco

punta de raíz Van der Zaal, et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.

β-tubulina

Raíz Oppenheimer, et al., Gene 63: 87, 1988.

Genes específicos de raíz de tabaco

Raíz Conkling, et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.

Gen G1-3b de B. napus

raíz Patente de Estados Unidos No. 5, 401, 836

SbPRP1

Raíces Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993.

AtPRP1; AtPRP3

Raíces; pilosidades de raíces http://salus.medium.edu/mmg/ tierney/ html

Gen RD2

�rteza de la raíz http://www2.cnsu.edu/ncsu/research

Gen TobRB7

Vasculatura de raíz http://www2.cnsu.edu/ncsu/ research

AtPRP4

Hojas; flores; primordios laterales de raíces http://salus.medium.edu/mmg/tierney/ html

Genes específicos de semillas

Semilla Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS, ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Alb�mina de nuez de Brasil

Semilla Pearson, et al., Plant Mol. Biol. 18: 235245, 1992.

Legumina

Raíz Ellis, et al., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988

Glutelina (arroz)

Semilla Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208:1522, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.

Zeina

Semilla Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3): 323-32 1990

napA

Semilla Stalberg, et al, Planta 199: 515-519,1996.

Glutenina-1 de trigo LMW y HMW

Endospermo Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989

Trigo SPA

Semilla Albani et al, Plant Cell, 9: 171-184,1997

α, β, γ-gliadinas de trigo

Endospermo EMBO 3:1409-15, 1984

Promotor de cebada ltr1

Endospermo

Horde�na de cebada B1-C-D

Endospermo Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:75060, 1996

DOF de cebada

Endospermo Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 5362, 1998

blz2

endospermo EP99106056.7

Promotor sintético

endospermo Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629640, 1998.

prolamina NRP33 de arroz

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885889, 1998

α-globulina Glb-1 de arroz

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885889, 1998

arroz OSH1

embrión Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

α-globulina REB/OHP-1 de arroz

Endospermo Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

ADP-glucosa PP de arroz

endospermo Trans Res 6:157-68, 1997

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS, ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

familia genética de ESR del maíz

endospermo Plant J 12: 235-46, 1997

γ-kafirina de sorgo

endospermo PMB 32:1029-35, 1996

KNOX

embrión Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999

oleosina de arroz

embrión y aleur�n Wu et at, J. Biochem., 123: 386, 1998

oleosina de girasol

semilla (embrión y semilla seca) Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873876, 1992

LEAFY

meristemo de brote Weigel et al., Cell 69:843-859,1992.

Arabidopsis thaliana knat1

meristemo de brote Número de acceso AJ131822

Malus doméstica kn1

meristemo de brote Número de acceso Z71981

CLAVATA 1

meristemo de brote Número de acceso AF049870

genes específicos del estigma

Estigma Nasrallah, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5551, 1988; Trick, et al., Plant Mol. Biol. 15: 203, 1990.

gen de patatina clase 1

tubérculo Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386395,1991.

arroz PCNA

meristemo Kosugi et al, Nucleic Acids Research 19:1571-1576, 1991; Kosugi S. y Ohashi Y, Plant Cell 9: 1607-1619, 1997.

tubulina de guisante TubA1

Células en division Stotz and Long, Plant Mol. Biol. 41, 601614. 1999

Arabidopsis de cdc2a

células en ciclizaci�n Chung and Parish, FEBS Lett, 3; 362 (2):215-9, 1995

Arabidopsis Rop1A

Anteras; polen maduro más tubos de polen Li et al. 1998 Plant Physiol 118, 407-417.

Arabidopsis AtDMC1

Asociados con meiosis Klimyuk and Jones 1997 Plant J. 11, 1-14.

Guisante PS-IAA4/5 y PS-IAA6

Inducible por auxina Wong et al. 1996 Plant J. 9, 587-599.

Farneciltransferasa de guisante

Tejidos meristem�ticos; floema cerca de los tejidos en crecimiento; reprimido por luz y azúcar Zhou et al. 1997 Plant J. 12, 921-93

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS, ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Ciclina B1; 1 de tabaco (N. sylvestris)

Células en división/ tejido meristem�tico Trehin et al. 1997 Plant Mol.Biol. 35, 667672.

Ciclinas mit�ticas CYS (tipo A) y CYM (tipo B) de catharanthus roseus

Células en división/ tejido meristem�tico Ito et al. 1997 Plant J. 11, 983-992

Arabidopsis cycl At (=cyc B1;1) y cyc3aAt (tipo A)

Células en división/ tejido meristem�tico Shaul et al. 1996 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93, 4868-4872.

Caja promotora Arabidopsis tef1

Células en división/ tejido meristem�tico Regad et al. 1995 Mol. Gen. Genet. 248, 703-711.

Catharanthus roseus cyc07

Células en división/ tejido meristem�tico Ito et al. 1994 Plant Mol. Biol. 24, 863-878.

II: EJEMPLOS DE PROMOTORES CONSTITUTIVOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Actina

Constitutivo McElroy et al, Plant Cell, 2: 163-171,1990

CAMV 35S

Constitutivo Odell et al, Nature, 313: 810-812,1985

CaMV 19S

Constitutivo Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456462, 1997

GOS2

Constitutivo de Pater et al, Plant J. 2: 837-844, 1992

ubiquitina

Constitutivo Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675689, 1992

ciclofilina de arroz

Constitutivo Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25: 837843, 1994

histona H3 de maíz

Constitutivo Lepetit et al, Mol. Gen. Genet 231: 276285, 1992

histona H3 de alfalfa

Constitutivo Wu et al., Nucleic Acids Res. 17: 30573063, 1989; Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641-649, 1988

actina 2

Constitutivo An et al, Plant J. 10 (1); 107-121, 1996

III: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES POR ESTR�S

NOMBRE

ESTR�S REFERENCIA

P5CS (delta(1)-pirrol�n-5carboxilato sintasa)

sal, agua Zhang et al. Plant Science. 129: 81-89, 1997

cor15a

frío Hajela et al., Plant Physiol. 93:1246-1252, 1990

cor15b

frío Wlihelm et al., Plant Mol Biol. 23:10731077, 1993

cor15a (-305 a +78 nt)

frío, sequía Baker et al., Plant Mol Biol. 24: 701-713, 1994

rd29

sal, sequía, frío Kasuga et al., Nature Biotechnology 18: 287-291, 1999

prote�nas de choque por calor, que incluyen promotores artificiales que contienen el elemento de choque por calor (HSE)

calor Barros et al., Plant Mol Biol 19: 665-75, 1992. Marrs et al., Dev Genet. 14: 27-41, 1993. Schoffl at al., Mol Gen Gent, 217: 246-53, 1989.

smHSP (proteínas pequeñas de choque por calor)

calor Waters et al, J Experimental Botany 47: 325-338, 1996

wcs 120

frío Ouellet et al., FEBS Lett. 423: 324-328, 1998

ci7

frío Kirch et al., Plant Mol Biol 33: 897-909, 1997

Adh

frío, sequedad, hipoxia Dolferus et al., Plant Physiol 105: 107587, 1994

pwsi18

Agua: sal y sequia Joshee et al., Plant Cell Physiol 39: 64-72, 1998

ci21A

frío Schneider et al., Plant Physiol 113: 33545, 1997

Trg-31

sequía Chaudhary et al., Plant Mol Biol 30: 124757, 1996

osmotina

osm�tico Raghothama et al., Plant Mol Biol 23: 1117-28, 1993

Rab17

osm�tico, ABA Vilardell et al., Plant Mol Biol 17: 985-93, 1991

IapA

heridas, ambiental WO99/03977 University of California/INRA

IV: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES POR PAT�GENOS

NOMBRE

PAT�GENO REFERENCIA

RB7

Nem�todos de los nódulos de raíces (Meloidogyne US5760386 -North Carolina State University; Opperman et al (1994) Science

spp).

263: 221-23.

PR-1, 2, 3,4,5, 8, 11

f�ngico, viral, bacteriano Ward et al (1991) Plant Cell 3: 1085-1094; Reiss et al 1996; Lebel et al (1998), Plant J, 16 (2): 223-33; Melchers et al (1994), Plant J, 5 (4):469-80; Lawton et al (1992), Plant Mol Biol, 19(5): 735-43.

HMG2

nem�todos W09503690 -Virginia Tech Intellectual Properties Inc.

Abi3

nem�todos Cyst (heterodera spp.) No publicado

ARM1

nem�todos Barthels et al., (1997) The Plant Cell 9, 2119-2134. WO 98/31822 – Plant Genetic Systems

Att0728

nem�todos Barthels et al., (1997) The Plant Cell 9, 2119-2134. PCT/EP98/07761

Att1712

nem�todos Barthels et al., (1997) The Plant Cell 9, 2119-2134. PCT/EP98/07761

Gst1

Diferentes tipos de pat�genos Strittmatter et al (1996) Mol. Plant-Microbe Interact. 9, 68-73.

LEMMI

nem�todos WO 92/21757 -Plant Genetic Systems

CLE

Geminivirus PCT/EP99/03445 – CINESTAV

PDF1.2

Incluyendo la Alternaria brassicicola y la Botrytis cinerea f�ngicas Manners et al (1998), Plant Mol Biol, 38(6): 1071-80.

Thi2.1

Fusarium oxysporum f sp. matthiolae – f�ngico Vignutelli et al (1998) Plant J;14(3): 28595

DB#226

nem�todos Bird and Wilson (1994) Mol. Plant-Microbe interact., 7, 419-42 WO 95.322888

DB#280

nem�todos Bird and Wilson (1994) Mol. Plant-Microbe Interact., 7, 419-42 WO 95.322888

Cat2

nem�todos Niebel et al (1995) Mol Plant Microbe Interact 1995 May-Jun;8(3):371-8

Tub

nem�todos Aristizabal et al (1996), 8th International Congress on Plant-Microbe Interaction, Knoxville US B-29

(continuación)

IV: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES POR PAT�GENOS

NOMBRE

PAT�GENO REFERENCIA

SHSP

nem�todos Fenoll et al (1997) In: Cellular and molecular aspects of plant-nematode interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F.M.W. Grundler and S.A. Ohl (Eds.),

Tsw12

nem�todos Fenoll et al (1997) In: Cellular and molecular aspects of plant-nematode interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F.M.W. Grundler and S.A. Ohl (Eds.)

Hs1 (pro1)

nem�todos WO 98/122335 – Jung

NsLTP

viral, f�ngico, bacteriano Molina & Garc´ia-Olmedo (1993) FEBS Lett, 316 (2): 119-22

RIP

viral, f�ngico Tumer et al (1997) Proc Natl Acad Sci U S A, 94 (8):3866-71

Ejemplos de terminadores particularmente adecuados para uso en constructos genéticos descritos aquí incluyen el gen terminador de nopalina sintasa de la Agrobacterium tumefaciens (NOS), la secuencia terminadora de gen de

5 octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (OCS), la secuencia terminadora de gen de (CaMV) 35S del virus mosaico de la coliflor, la secuencia terminadora de la ADP-glucosa pirofosforilaza de Oryza sativa (t3’Bt2), la secuencia terminadora de gen de la ze�na de la Zea mays, el terminador de gen de rbcs-1A, y las secuencias terminadoras de gen rbcs-3A, entre otros.

Secuencias promotoras preferidas aquí incluyen promotores específicos de raíz tales como pero no limitados a los 10 enumerados en la Tabla 5 y que se bosquejan en los Ejemplos.

Tabla 5. Ejemplos de promotores específicos de raíz para uso en la ejecución de la presente invención

NOMBRE

ORIGEN REFERENCIA

SbPRP1

Soja Suzuki et al., Plant Mol Biol, 21: 109-119,1993

Fragmento 636 bp de la TobRB7

Tabaco Yamamoto et al., Plant Cell 3:371-382,1991

GGPS3

Arabidopsis Okada et al., Plant Physiol 122: 1045-1056, 2000

Fragmento 580 bp de prxEa

Arabidopsis Wanapu and Shinmyo, Ann N Y Acad Sci 782: 107-114, 1996

Promotor Ids2

Cebada Okumura et al., Plant Mol Biol 25: 705-719, 1994

AtPRP3

Arabidopsis Fowler et al., Plant Physiol 121: 1081-1092, 1999

Aquellos expertos en la técnica estarán atentos a secuencias promotoras y secuencias terminadoras adicionales que pueden ser adecuadas para desarrollar la invención. Dichas secuencias se pueden utilizar fácilmente sin ninguna 15 experimentación indebida.

De acuerdo con la presente invención, “expresión ect�pica” o “sobreexpresi�n ect�pica” de un gen o una proteína se refieren a patrones de expresión y/o niveles de expresión de dicho gen o proteína que normalmente no ocurre bajo condiciones naturales, más específicamente significan expresión incrementada y/o niveles de expresión incrementada. La expresión ect�pica se puede alcanzar de diversas maneras que incluyen el enlace operativo de dicha proteína que codifica la secuencia de codificación con un promotor homólogo o heter�logo aislado con el fin de crear un gen quimérico y/o que enlaza de manera operativa dicha secuencia codificadora a su propio promotor aislado (esto es, el promotor no aislado que conduce de manera natural la expresión de dicha proteína) con el fin de

crear una duplicación de gen recombinante o un efecto de multiplicación de gen. Con “coexpresi�n ect�pica” se

entiende la expresión ect�pica o la sobreexpresi�n ect�pica de dos o más genes o proteínas. Los mismos, o más preferiblemente, promotores diferentes se utilizan para conferir expresión ect�pica de dichos genes o proteínas.

Preferiblemente, la secuencia promotora utilizada en el contexto de la presente invención se enlaza de manera operativa a una secuencia codificadora o a un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína citoquinina oxidasa o un homólogo derivado o un fragmento inmunol�gicamente activo y/o funcional de la misma como se definió supra.

“La regulaci�n por disminución de la expresión” como se usa aquí significa disminuir los niveles de la expresión g�nica y/o niveles de producto del gen activo y/o niveles de la actividad del producto del gen. Las reducciones en la expresión se pueden alcanzar por ejemplo mediante la adición de secuencias codificadoras o partes de las mismas en una orientación en sentido (si resulta en una cosupresi�n) o en una orientación antisentido relacionada a la secuencia promotora y adicionalmente por ejemplo mediante mutag�nesis de inserción (por ejemplo, inserción de T-ADN o inserción de transposones) o por estrategias de silenciamiento de genes como se describen por ejemplo Angell y Baulcombe (1998 - WO9836083), Lowe et al. (1989 - WO9853083), Lederer et al. (1999- WO9915682) o Wang et al. (1999 - WO9953050). Los constructos genéticos buscados con la expresión de silenciamiento de gen pueden tener la secuencia del nucleótido y dicho gen (o una o más partes del mismo contenidas en una orientación sentido y/o antisentido con respecto a la secuencia del promotor. Otro método para regular por descenso la expresión del gen comprende el uso de ribozimas.

La modulación, incluyendo reducir el nivel de los productos del gen activo o la actividad del producto del gen se puede alcanzar al administrar o exponer las células, tejidos órganos u organismos a dicho producto del gen o a un homólogo, derivado y/o fragmento inmunol�gicamente activo del mismo. La inmunomodulaci�n es otro ejemplo de una técnica capaz de niveles de regulaci�n por descenso de un producto de gen activo y/o de la actividad del producto del gen y comprende la administración de, o la exposición a los anticuerpos que expresan dicho producto de gen a o en células, tejidos, órganos u organismos donde se deben modular los niveles de dicho producto de gen y/o actividad de producto de gen. Dichos anticuerpos comprenden “planticuerpos”, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos IgG y anticuerpos de camello de cadena pesada as� como fragmentos de los mismos.

La modulación, que incluye disminuir el nivel de productos activos de gen o de la actividad del producto de gen pueden alcanzar adicionalmente al administrar o exponer las células, tejidos, órganos u organismos a un agonista de dicho producto de gen o de la actividad del mismo. Dichos agonistas incluyen proteínas (que comprenden por ejemplo, quinasas y proteinasas) y compuestos químicos identificados de acuerdo con la invención presente como se describió anteriormente.

En el contexto de la presente invención se prev� la regulaci�n por disminución de la expresión de un gen de citoquinina oxidasa como se definió anteriormente. Preferiblemente dicho gen de citoquinina oxidasa es un gen de citoquinina oxidasa de una planta, más específicamente un AtCKX. La invención comprende adicionalmente la regulaci�n por disminución de niveles de una proteína de citoquinina oxidasa o de una actividad de citoquinina oxidasa mediante la cual dicha proteína de citoquinina oxidasa ha sido definida anteriormente. Preferiblemente dicha proteína citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de una planta más específicamente una AtCKX.

Por el término “modificar el destino de la planta y/o el desarrollo y/o la morfología y/o la bioquímica y/o la fisiología de la planta” se da a entender que una o más características de desarrollo y/o morfológicas y/o bioquímicas y/o fisiológicas de una planta se alteran mediante el desarrollo de una o más etapas descritas aquí.

“Destino de células” se refiere al tipo de célula o características celulares de una célula particular que se producen durante el desarrollo de la planta o de un proceso celular para la misma, en particular durante el ciclo celular o como consecuencia de un proceso de ciclo celular.

“Desarrollo de planta” o el término “característica de desarrollo de planta” o un término similar, cuando se usa aquí se tomar� el significado de cualquier proceso celular de una planta que est� involucrado en la determinación del destino de desarrollo de una célula de una planta, en particular el tipo de tejido u órgano específico en el cual se desarrollar� una célula progenitora. Dichos procesos celulares relevantes para el desarrollo de las plantas ser�n conocidos por aquellos expertos en la técnica. Dichos procesos incluyen, por ejemplo, morfogénesis, fotomorfog�nesis, desarrollo de brotes, desarrollo de raíces, desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo, elongaci�n del tallo, floraci�n, y mecanismos reguladores involucrados en determinar el destino de la célula, en particular un proceso o un proceso regulador que involucra el ciclo celular.

“Morfología de planta” o el término “característica de la morfología de la planta” o término similar, cuando se usa aquí ser� entendido por aquellos expertos en la técnica como referencia a la apariencia externa de una planta, que incluye uno cualquiera o más rasgos estructurales o combinación de rasgos estructurales de la misma. Dichos rasgos estructurales incluyen la forma, tamaño, número, posición, color, textura, disposición, y patrones de cualquier célula, tejido u órgano o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, incluyendo la raíz, tallo, hoja, brote, pecíolo, tricoma, flor, pétalo, estigma, estilo, estambre, polen, óvulo, semilla, embrión, endospermo, recubrimiento de semilla, aleurona, fibra, fruto, cambium, madera, duramen, par�nquima, ar�nquima, elemento de tamiz, floema, o tejido vascular, entre otros.

“Bioquímica de la planta” o el término “característica bioquímica de la planta” o un término similar cuando se use

aqu�, ser� entendido por aquellos expertos en la técnica como referencia a los procesos metabólicos y catalíticos de una planta, que incluyen el metabolismo primario y secundario y los productos de los mismos, que incluyen cualquier molécula pequeña, macromoléculas o compuestos químicos, tales como pero no limitados a almidones, azúcares, proteínas, p�ptidos, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas de ácidos nucleicos, celulosas, hemicelulosas, callosas, lectinas, fibras, pigmentos tales como antocianinas, vitaminas, minerales, micronutrinetes o macronutrientes, que son producidos por las plantas.

“Fisiología de la planta” o el término “característica fisiológica de una planta” o términos similares, cuando se usen se entenderán como referencia a los procesos funcionales de una planta, que incluye procesos de desarrollo tales como crecimiento, expansión y diferenciación, desarrollo sexual, reproducción sexual, producción de semillas, desarrollo de semillas, llenado de granos, reproducción asexual, división celular, latencia, germinación, adaptación a la luz, fotos�ntesis, expansión de hojas, producción de fibras, crecimiento secundario o producción de madera, entre otros; respuestas de una planta a factores aplicados externamente tales como metales, productos químicos, hormonas, factores de crecimiento, ambiente factores de estr�s ambiental (por ejemplo anoxia, hipoxia, alta temperatura, baja temperatura, deshidrataci�n, luz, duración del día, inundación, sal, metales pesados, entre otros), que incluyen respuestas adaptativas de las plantas a dichos factores aplicados externamente.

Los medios para introducir ADN recombinante en los tejidos o células de una planta incluyen, pero no se limitan, a la transformación utilizando CACl2 y variaciones de la misma, en particular el método descrito por Hanahan (1983), absorción directa de ADN en los protoplastos (Krens et al, 1982 Paszkowski et al, 1984), absorción de protoplastos mediados por PEG (Armstrong et al, 1990), bombardeo con micropart�culas, electroporaci�n (Fromm et al, 1985), microinyecci�n de ADN (Crossway et al, 1986), bombardeo con micropart�culas de esquejes o células de tejido (Christou et al, 1998; Sanford, 1988), infiltración al vacío de tejidos con ácidos nucleicos, o en el caso de las plantas, transferencia mediada por T-ADN desde Agrobacterium al tejido de la planta como se describe esencialmente por An et al. (1985), Dodds et al., (1985), Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b, 1985). Los métodos para la transformación de plantas monocotiled�neas son bien conocidos en la técnica e incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (Cheng et al., 1997 - WO9748814; Hansen 1998 - WO9854961; Hiei et al., 1994 - WO9400977; Hiei et al., 1998 - WO9817813; Rikiishi et al., 1999 - WO9904618; Saito et al., 1995 - WO9506722), bombardeo con microproyectiles (Adams et al., 1999 - US5969213; Bowen et al., 1998 - US5736369; Chang et al:, 1994 -WO9413822; Lundquist et al., 1999 - US5874265/US5990390; Vasil and Vasil, 1995 - US5405765. Walker et al., 1999 - US5955362), absorción de ADN (Eyal et al., 1993 -WO9318168), microinyecci�n de células de agrobacterium (von Holt, 1994-De 4309203), y sonicaci�n (Finer et al, 1997- US5693512).

Para el bombardeo con micropart�culas de células, una micropart�cula es impulsada hacia una célula para producir una célula transformada. Se puede utilizar cualquier metodología y aparato para transformación celular por balística adecuado. Aparatos y procedimientos de ejemplo se describen por Stomp et al. (Patente Estadounidense No. 5,122,466) y Sanford y Wolf (Patente Estadounidense No. 4,945,050). Cuando se utilizan procedimientos de transformación balística, el constructo del gen puede incorporar un pl�smido capaz de replicar en la célula que va a ser transformada. Ejemplos de micropart�culas adecuadas para su uso en dichas sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 �m. El constructo de ADN puede ser depositado sobre la micropart�cula por cualquier técnica adecuada, tal como mediante precipitación.

Una planta completa se puede regenerar a partir de la célula transformada o transfectada; de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. El tejido de planta capaz de una propagación clonal subsecuente, bien por organog�nesis o embriog�nesis, puede ser transformado con un constructo de gen descrito aquí y regenerar una planta completa a partir del mismo. El tejido particular escogido variar� dependiendo de los sistemas de propagación clonales disponibles, para, y más adecuados a, las especies particulares que est�n siendo transformadas. Ejemplos de objetivos de tejido incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristem�tico existente (por ejemplo meristemo apical, yemas axilares y meristemos de raíz), y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiled�n y meristemo de hipocotilo.

El término “organog�nesis” tal como se usa aquí significa un proceso mediante el cual brotes y raíces se desarrollan

secuencialmente a partir de centros meristem�ticos.

El término “embriog�nesis”, tal como se usa aquí, significa un proceso mediante el cual brotes y raíces se desarrollan juntos de una forma concertada (no secuencialmente), bien a partir de células somáticas o gametos.

Preferiblemente, la planta producida de acuerdo con el método de la invención se transfecta o transforma con una secuencia genética, o es susceptible a la introducción de una proteína, por medios reconocidos en la técnica, tales como el bombardeo con microproyectiles, microinyecci�n, transformación mediada por Agrobacterium (incluyendo la transformación in planta), fusión de protoplastos o electroporaci�n, entre otros. Más preferiblemente dicha planta es producida por transformación mediada por Agrobacterium.

La transformación mediada por Agrobacterium o la transformación agrol�stica de las plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en la transferencia de parte de las secuencias de vector de la transformación, llamadas el ADN-T, al núcleo y por integración de dicho ADN-T en el genoma de dicha eucariota.

Con “Agrobacterium” se entiende un miembro de la Agrobacteriaceae con más preferiblemente Agrobacterium o Rhizobacterium y más preferiblemente Agrobacterium tumefaciens.

Con “ADN-T” o ADN transferido, se indica que parte del vector de transformación flanqueado por las fronteras del ADN-T el cual es, después la activación de gener de Agrobacterium vir, unido a las fronteras de ADN-T y es transferido como un ADN de cadena sencilla al núcleo de una célula eucariota.

Cuando se usa aquí, con “fronteras de ADN-T”, “región de frontera de ADN-T”, o “región de frontera”, se indica ya sea la frontera de ADN-T (BR) de la derecha, o la frontera de ADN-T (Lb) de la izquierda. Dicha frontera comprende una secuencia núcleo flanqueada por una región interna de frontera como parte del ADN-T que flanquea la frontera y/o una región de frontera externa como parte del esqueleto vector que flanquea la frontera. La secuencia núcleo comprende 22 bp en caso de los vectores tipo octopina y 25 bp en caso de los vectores tipo nopalina. Las secuencias de núcleo en la región de frontera derecha y en la región de frontera izquierda forman repeticiones imperfectas. Las secuencias de núcleo en la frontera son indispensables para el reconocimiento y procesamiento del complejo de unión con Agrobacterium que consiste de por lo menos VirD1 y VirD2. Las secuencias núcleo que flanquean un ADN-T son suficientes para promover la transferencia de dicho ADN-T. Sin embargo, es baja la eficiencia de la transformación utilizando vectores de transformación que portan dicho ADN-T únicamente flanqueado por dicha secuencias núcleo. Las regiones de frontera interna y frontera externa son conocidas por modular la eficiencia de la transferencia de ADN-T (Wang et al, 1987). Un elemento que potencia la transferencia de ADN-T ha sido caracterizado y reside en la región de la frontera externa derecha y se denomina sobreconductora (Peralta et al. 1986, van Haaren et al. 1987).

Con “vector de transformación de ADN-T” o “vector ADN-T” se entiende cualquier vector que abarque una secuencia ADN-T flanqueada por una frontera de ADN-T derecha e izquierda que consisten de por lo menos las secuencias de núcleo de frontera derecha e izquierda, respectivamente, y se utiliza para la transformación de cualquier célula eucari�tica.

Con “secuencia de esqueleto de vector de ADN-T” o secuencias de esqueleto de vector de ADN-T” se entiende todo el ADN de un vector que contiene ADN-T que cae por fuera de las fronteras del ADN-T y, más específicamente, por fuera de los sitios de unión de las repeticiones imperfectas del núcleo de frontera.

La presente especificación describe vectores de ADN-T optimizados de tal manera que la integración del esqueleto del vector en el genoma de una célula eucari�tica se minimiza o est� ausente. Con “vector de ADN-T optimizado” se entiende un vector de ADN-T diseñado bien para disminuir o abolir la transferencia de secuencias del esqueleto del vector al genoma de una célula eucari�tica. Tales vectores de ADN-T son conocidos para los que est�n familiarizados con la técnica e incluyen aquellos descritos por Hanson et al. (1999) y by Stuiver at al. (1999 -WO9901563).

La presente especificación describe claramente la inclusión de una secuencia de ADN que codifica una citoquinina oxidasa, homólogo, derivado o fragmento inmunol�gicamente activo y/o funcional de la misma como se definió anteriormente, en cualquier vector de ADN-T que comprende vectores de transformación binaria, vectores de transformación superbinaria, vectores de transformación cointegrada, vectores de transformación derivados de Ri as� como en vectores de transporte de ADN-T usados en la transformación agrol�stica. Preferiblemente, dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa de planta, más específicamente una Arabidopsis thaliana (At) CKX.

Con “vector de transformación binaria” se entiende un vector de transformación de ADN-T que comprende:

(a)

una región de ADN-T que comprende por lo menos un gen de interés y/o por lo menos un marcador activo seleccionable en la célula eucari�tica que va a ser transformada; y

(b)

una región de esqueleto de vector que comprende por lo menos los orígenes de replicaci�n activa en E. coli y Agrobacterium y marcadores para la selección en E. coli y Agrobacterium.

Las fronteras de ADN-T del vector de transformación binaria se pueden derivar de pl�smidos tipo octopina o tipo nopalina Ti o de ambos. El ADN-T de un vector binario solamente es transferido a una célula eucari�tica en conjunto con un pl�smido de ayuda.

Con “pl�smido de ayuda” se entiende un pl�smido que se mantiene de manera estable en el Agrobacterium y que por lo menos porta un conjunto de genes vir necesarios que permiten la transferencia del ADN-T. Dicho conjunto de genes vir se puede derivar ya sea de los pl�smidos tipo octopina o tipo nopalina Ti o de ambos.

Con “vector de transformación superbinaria” se entiende un vector de transformación binaria que porta adicionalmente en la región del esqueleto del vector una región vir del pl�smido Ti pTiBo542 de la cepa supervirulenta A. tumefaciens A281 (EP0604662, EP0687730). Los vectores de transformación binaria son utilizados en conjunto con un pl�smido de ayuda.

Con “vector de transformación cointegrado” se entiende un vector ADN-T que comprende por lo menos:

(a)

una región ADN-T que comprende por lo menos un gen de interés y/o por lo menos un marcador seleccionable activo en plantas; y

(b)

una región de esqueleto de vector que comprende por lo menos orígenes de replicaci�n activos en Escherichia coli y Agrobacterium, y marcadores para selección en E. coli y Agrobacterium, y un conjunto de genes vir necesarios para habilitar la transferencia del ADN-T.

Las fronteras de ADN-T y dicho conjunto de genes vir de dicho vector ADN-T se pueden derivar de los pl�smidos tipo octopina o tipo nopolina Ti o de ambos.

Con “vectores de transformación de planta derivado de Ri” se entiende un vector de transformación binaria en el cual las fronteras de ADN-T son derivadas de un pl�smido Ti y dicho vector de transformación binario se usa en conjunto con un pl�smido Ri “de ayuda” que porta el conjunto necesario de genes vir.

Como se usa aquí, el término “gen marcador seleccionable” o “marcador seleccionable” o “marcador para selección” incluye cualquier gen que confiere un fenotipo sobre una célula en la cual se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que son transfectan o transforman con un constructo de gen descrito aquí o un derivado del mismo. Genes marcadores seleccionables adecuados contemplados aquí incluyen el de resistencia a ampicilina (AMPr), gen de resistencia a tetraciclina (TCr), gen de resistencia bacteriana a la canamicina (KANr), gen de resistencia a la fosfinotricina, gen de fosfotransferasa neomicina (NPTIL), gen de resistencia a la higromicina, gen de β-glucuronidasa (GUS), gen de cloramfenicol acetil transferasa (CAT), gen de la proteína de fluorescencia verde (gfp) (Haseloff et al, 1997), y gen luciferasa, entre otros.

Con “agrol�sticos”, “transformación agrol�stica” o “transferencia agrol�stica” se entiende aquí un método de transformación que combina características de la transformación mediada por Agrobacterium y de la administración de ADN biol�stico. Como tal, un ADN-T que contiene el pl�smido objetivo es cosuministrado con ADN/ARN habilitando la producción in planta de VirD1 y VirD2 con o sin VirE2 (Hansen y Chilton 1996; Hansen et al. 1997; Hansen and Chilton 1997 -WO9712046). Con “ADN foráneo” se entiende cualquier secuencia de ADN que se introduce en el genoma del anfitrión por técnicas de recombinación. Dicho ADN foráneo incluye por ejemplo una secuencia de ADN-T o una parte de la misma tal como la secuencia de ADN-T que comprende el marcador seleccionable en un formato que se puede expresar. El ADN foráneo incluye adicionalmente secuencias interventoras de ADN como se definió anteriormente. Con “evento de recombinación” se entiende cualquier evento de recombinación específico de un sitio o u/n evento de recombinación efectuado por “salto” de transposones.

Con “recombinasa” se entiende cualquier recombinasa específica del sitio o una transposasa.

Con “sitio de recombinación” se entiende cualesquier sitios de recombinación específica para el sitio o secuencias de frontera del transpos�n.

Con “evento de recombinación específico del sitio” se entiende un evento catalizado por un sistema que consiste generalmente de tres elementos: una pareja de secuencias de ADN (las secuencias o sitios de recombinación específicas del sitio) y una enzima específica (la recombinasa específica del sitio). La recombinasa específica del sitio cataliza una reacción de recombinación solamente entre dos secuencias de recombinación específicas del sitio dependiendo de la orientación de las secuencias de recombinación específicas del sitio. Las secuencias que intervienen entre dos sitios de recombinación específicos del sitio se invierten en la presencia de la recombinasa específica del sitio cuando las secuencias de recombinación específicas del sitio se orientan en direcciones opuestas con respecto una a otra (esto es, repeticiones invertidas). Si las secuencias de recombinación específicas del sitio se orientan en la misma dirección una con respecto a la otra (esto es, repeticiones directas), entonces cualquiera de las secuencias que intervienen ser�n eliminadas por interacción con la recombinasa específica del sitio. As�, si las secuencias de recombinación específicas del sitio est�n presentes como repeticiones directas en ambos extremos de una secuencia de ADN foráneo integrada al genoma eucari�tico, tal integración de dichas secuencias puede ser revertida posteriormente por interacción de las secuencias de recombinación específicas del sitio con las correspondientes recombinasas específicas del sitio.

Se puede usar un gran número de diferentes sistemas de recombinasa específicos que incluyen pero no se limita al sistema Cre/Iox del bacteri�fago P1, el sistema FLP/FRT de la levadura, la recombinasa Gin del fago Mu, la recombinasa Pin de E. coli, la PinB, PinD y PinF de la Shigella, y el sistema R/RS del pl�smido pSR1. Las recombinasas en general son integrasas, resolvasas o flipasas. También las recombinasas duales específicas se pueden usar en conjunto con repeticiones directas o indirectas de los dos sitios de recombinación específicos del sitio correspondientes a la recombinasa específica dual (WO99/25840). Los dos sistemas de recombinasa específicos del sitio preferido son los sistemas del bacteri�fago P1 Cre/Iox y la levadura FLP/FRT. En estos sistemas una recombinasa (Cre o FLP) interact�a específicamente con su respectiva secuencia de recombinación específica del sitio (Iox o FRT respectivamente) para invertir o escindir las secuencias que intervienen. Las secuencias de recombinación específicas del sitio para cada uno de estos dos sistemas son relativamente cortas (34 bp para Iox y 47 bp para FRT). Algunos de estos sistemas ya han sido usados con alta eficiencia en plantas tales como tabaco (Dale et al. 1990) y Arabidopsis (Osborne et al. 1995). Los sistemas de recombinación específicos del sitio tienen muchas aplicaciones en biología molecular de plantas que incluyen los métodos para controlar la recombinación homóloga (por ejemplo US5527695), para inserción específica, apilaci�n de genes, etc. (WO99/25821) y para la resolución de patrones de integración complejos de ADN-T o para la escisión de un marcador seleccionable (WO99/23202).

Aunque las secuencias de recombinación específica del sitio deben ser unidas a los extremos del ADN que se va a escindir o se va a invertir, el gen que codifica la recombinasa específica del sitio se puede localizar en cualquier lugar. Por ejemplo, el gen de la recombinasa podría ya estar presente en el ADN de la eucariota o podría ser suministrado por un fragmento de ADN introducido posteriormente bien introducido de manera directa en las células, a través de cruzamiento o a través de polinizaci�n cruzada. Alternativamente, una proteína recombinasa sustancialmente purificada podría ser introducida directamente en la célula eucari�tica, por ejemplo por microinyecci�n o bombardeo con partículas. Típicamente, la región de codificación de recombinasa específica del sitio ser� unida de manera operable a las secuencias reguladoras que permiten la expresión de la recombinasa específica del sitio en la célula eucari�tica.

Con “evento de recombinación efectuado por salto de transpos�n” o “recombinación mediada por transposasa” se entiende un evento de recombinación catalizado por un sistema consistente de tres elementos: un par de secuencias de ADN (las secuencias de frontera del transpos�n) y una enzima específica (la transposasa). La transposasa cataliza una reacción de recombinación solamente entre dos secuencias de frontera de transpos�n que est�n dispuestas como repeticiones invertidas. Se pueden utilizar diversos sistemas diferentes transpos�n/transposasa que incluyen pero no se limita al sistema Ds/Ac, el sistema Spm y el sistema Mu. Estos sistemas se originan a partir del maíz pero se ha demostrado que por lo menos que el sistema Ds/Ac y el sistema Spm también funcionan en otras plantas (Federoff et al. 1993, Schlappi et al. 1993, Van Sluys et al. 1987). Se prefieren los trasnposones tipo Ds y Spm que son delineados por secuencias de frontera 11 bp y 13 bp respectivamente.

Aunque las secuencias de frontera del transposor deben estar unidas a los extremos del ADN que se va a escindir, el gen que codifica la transposasa se puede localizar en cualquier lugar. Por ejemplo, el gen de recombinasa podría ya estar presente en el ADN de la eucari�tica o podría ser suministrado por un fragmento de ADN introducido posteriormente bien sea introducido directamente en las células, a través de entrecruzamiento o de polinizaci�n cruzada. Alternativamente, una proteína de transposasa sustancialmente purificada se podría introducir directamente en las células, por ejemplo, por microinyecci�n o por bombardeo con partículas.

DE acuerdo con la presente especificación, las secuencias de frontera del transposor se incluyen en una secuencia de ADN foráneo de tal manera que caigan fuera de dicha secuencia de ADN y transformen dicho ADN en una entidad similar al transpos�n que puede moverse por la acción de una transposasa.

Puesto que los transposones se reintegran frecuentemente en otra localización el genoma del anfitrión, la segregación de la progenie de los anfitriones en los cuales se deja actuar la transposasa podría ser necesario separar los anfitriones transformados que contienen por ejemplo solamente la huella del transpos�n y los anfitriones transformados que aún contienen el ADN foráneo.

De acuerdo con la presente especificación, el elemento genético se induce preferiblemente para movilizarse, tal como, por ejemplo, mediante la expresión de una proteína recombinasa en la célula que entre en contacto con el sitio de integración del elemento genético y facilite un evento de recombinación en el mismo, escindiendo el elemento genético completamente o alternativamente, dejando una “huella” generalmente de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud o mayor, en el sitio de integración original. Estos anfitriones y partes de anfitriones que se han producido de acuerdo con el método de la invención se pueden identificar mediante hibridación de ácidos nucleicos estándar y/o técnicas de amplificación para detectar la presencia del elemento genético movilizable o un constructo genético que comprende el mismo. Alternativamente, en el caso de células anfitrionas, tejidos y anfitriones donde el elemento genético movilizable ha sido escindido, es posible detectar una huella en el genoma del anfitrión que ha sido dejada después del evento de escisión, utilizando tales técnicas. Tal como se usa aquí, el término “huellas” se debe tomar para hacer referencia a cualquier derivado de un elemento genético movilizable o constructo de gen que comprende el mismo tal como se describió aquí cuando se produce por escisión, eliminación u otro tipo de remoción del elemento genético movilizable del genoma de una célula previamente transformada con dicho constructo de gen. Una huella generalmente comprende por lo menos una copia sencilla de los sitios o los transposones utilizados para promover la escisión. Sin embargo, una huella puede comprender secuencias adicionales derivadas del constructo del gen, por ejemplo secuencias de nucleótidos derivadas de la secuencia de frontera izquierda, de la secuencia de frontera derecha, del origen de la replicaci�n, de la codificación de recombinasa o de la secuencia de recombinación de la transposasa si se usa, u otras secuencias de nucleótidos derivadas de vectores. De acuerdo con ello, una huella es identificable de acuerdo con la secuencia de nucleótido del locus de recombinación o transpos�n del constructo de gen usado, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos correspondiente o complementarias a un sitio Iox o un sitio frt.

El término “ciclo celular” significa los eventos bioquímicos y estructurales cíclicos asociados con el crecimiento y con la división de las células y en particular con la regulaci�n de la replicaci�n del ADN y la mitosis. El ciclo celular incluye fases llamadas: G0, Gap1 (G1), síntesis de ADN (S), Gap2 (G2), y mitosis (M). Normalmente estas cuatro fases ocurren de manera secuencial, sin embargo el ciclo celular también incluye ciclos modificados donde una o más fases est�n ausentes lo que resulta en un ciclo celular modificado tal como endomit�sis, acitoquin�sis, poliploide, polit�nia y endorreduplicaci�n.

El término “progresión del ciclo celular” se refiere al proceso de pasar a través de las diferentes fases del ciclo celular. El término “índice de progresión del ciclo celular” de acuerdo con lo anterior se refiere a la velocidad a la cual se ejecutan dichas fases del ciclo celular lo los lapsos de tiempo requeridos para concretar dichas fases de ciclo celular.

Con “prueba de dos híbridos” se entiende cualquier prueba que se base en la observación de que muchos factores de transcripción eucari�ticos comprenden dos dominios, un dominio de unión del ADN (DB) y un dominio de activación (AD) los cuales, cuando son separados físicamente (esto es, interrupción de la unión covalente) no efectúan la expresión del gen objetivo. Dos proteínas capaces de interactuar físicamente con una de dichas proteínas fusionadas al DB y la otra de dichas proteínas fusionadas al AD reunirán los dominios DB y AD del factor de transcripción resultando en la expresión del gen objetivo. El gen objetivo en el ensayo de dos híbridos de levadura es usualmente un gen indicador como el gen β-galactosidasa. La interacción entre las proteínas asociadas en la prueba de dos híbridos de levadura por lo tanto se puede cuantificar al medir la actividad del producto gen indicador (Bartel y Fields. 1997). De manera alternativa, se puede utilizar un sistema de dos híbridos de un mamífero el cual incluye una proteína fluorescente verde quimérica por ejemplo, que codifica el gen indicador (Shioda et al., 2000).

Adicionalmente, las simulaciones de multiplicación y el redise�o por ordenador de las unidades estructurales de la proteína descrita aquí se pueden llevar a cabo utilizando programas de ordenador apropiados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 1 (1995), 675-679). La modelaci�n por ordenador de la multiplicación de proteínas se puede utilizar para los análisis conformacionales y energéticos de modelos de proteínas y p�ptidos detallados (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med.Biol. 376 (1995), 37-45). En particular, se pueden usar los programas apropiados para la identificación de sitios interactivos de citoquinina oxidasas, sus ligandos u otras proteínas interactuantes mediante búsquedas asistidas por ordenador de secuencias de p�ptidos complementarias (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Sistemas de ordenador apropiados para el diseño de proteínas y p�ptidos se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann, N. Y. Acac. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Los resultados obtenidos del análisis por ordenador anteriormente descrito se pueden utilizar por ejemplo, para la preparación de peptidomim�ticos de la proteína descritos aquí o fragmentos de la misma. Dichos análogos pseudopept�dicos de la secuencia de amino�cidos natural de la proteína pueden imitar muy eficientemente la proteína original (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por ejemplo, la incorporación de residuos Ω amino�cidos aquirales en una proteína descrita aquí o un fragmento de la misma resultan la sustitución de enlaces amino por unidades polimetileno de una cadena alif�tica, proveyendo por lo tanto una estrategia conveniente para construir un p�ptido mimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777). Los análogos peptidomim�ticos superactivos de hormonas pept�dicas pequeñas en otros sistemas se describen en la técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Los peptidomim�ticos apropiados de la proteína descrita aquí también se pueden identificar por la síntesis de las bibliotecas combinatoriales peptidomim�ticas a través de aminoalquilaci�n sucesiva y de pruebas de los compuestos resultantes, por ejemplo, en cuanto a sus propiedades de unión, inhibidoras de la quinasa y/o inmunol�gicas. Los métodos para la generación y uso de las bibliotecas combinatoriales peptidomim�ticas se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715.

Adicionalmente, una estructura tridimensional y/ o cristalográfica de la proteína descrita aquí se puede utilizar para el diseño de inhibidores peptidomim�ticos de la actividad biológica de la proteína descrita aquí (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Ruterber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Los compuestos que van a obtenerse o identificarse en los métodos descritos aquí pueden ser compuestos que son capaces de enlazar con cualquiera de los ácidos nucleicos, p�ptidos o proteínas de la invención. Otros compuestos interesantes para ser identificados son los compuestos que modulan la expresión de los genes o las proteínas de la invención de tal manera que bien la expresión de dicho gen o proteína es potenciada o disminuida por la acción de dicho compuesto. Alternativamente el compuesto puede ejercer su acción al potenciar o disminuir la actividad de cualquiera de las proteínas descritas aquí. Aquí, las proteínas preferidas son citoquina oxidasas novedosas.

Dicho compuesto o pluralidad de compuestos puede estar comprendida en, por ejemplo, muestras, por ejemplo extractos celulares de, por ejemplo plantas, animales o microorganismos. Adicionalmente, dichos compuestos pueden ser conocidos en la técnica pero hasta ahora no conocidos por ser capaces de suprimir o activar las proteínas que interact�an con la citoquinina oxidasa. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células que puede comprender un cultivo celular o de tejidos. Los parámetros adecuados para el método de la invención son conocidos por las personas expertas en la técnica y est�n, por ejemplo, descritos en general en Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, third edition (1994), en particular Capítulo 17. La pluralidad de compuestos, por ejemplo, se puede agregar a la mezcla de reacción, al medio de cultivo o inyectada en la célula.

Si una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos se identifica en el método descrito aquí, entonces es posible aislar el compuesto de la muestra original identificada por contener el compuesto capaz de actuar como un agonista, o puede adicionalmente subdividirse la muestra original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de diferentes compuestos, de manera que reduzca el número de sustancias diferentes por muestra y repita el método con la subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden llevarse a cabo varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el método descrito aquí comprenda solamente un número limitado de o solamente una sustancia. Preferiblemente dicha muestra comprende sustancias o propiedades químicas y/o físicas similares, y más preferiblemente dichas sustancias son idénticas. Preferiblemente, el compuesto identificado de acuerdo con el método anteriormente descrito o su derivado es formulado adicionalmente en una forma adecuada para la aplicación en el cultivo de plantas o en el cultivo de células y tejidos de plantas.

El término “vigor temprano” se refiere a la capacidad de la planta para crecer rápidamente durante su desarrollo

temprano, y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un aparato fotosint�tico bien desarrollado.

El término “resistencia a alojamiento” o “capacidad para permanecer erguida” se refiere a la capacidad de una planta para fijarse por s� misma al suelo. Para plantas con un hábito de crecimiento erecto o semierecto este término se refiere a la capacidad de mantener una posición vertical bajo condiciones adversas (ambientales). Esta virtud se relaciona con el tamaño, profundidad y morfología del sistema radicular.

El término “injerto” como se usa aquí, se refiere a poner juntas las partes de dos plantas diferentes de manera que se unan entre si y la savia pueda fluir, formado as� una nueva planta individual que pueda crecer y desarrollarse. Un injerto consiste entonces de dos partes: (i) la parte inferior es la raíz tal como se cita aquí y esencialmente consiste del sistema radicular y una porción del tallo, y (ii) la parte superior, el vástago o injerto, que da lugar a las partes aéreas de la planta.

Como se usa aquí tblastn se refiere a una familia de herramienta de alineamiento que es parte del BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básica) de programas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). BLAST apunta a identificar regiones de alineamiento local óptimo, esto es el alineamiento de alguna porción de las dos secuencias de amino�cidos o proteínas, para detectar relaciones entre las secuencias que comparten solamente regiones aisladas de similitud (Altschul et al., 1990). En la presente invención, tblastn del conjunto de programas BLAST 2.0 se utilizó para comparar la secuencia de proteína de citoquinina oxidasa de maíz contra una base de datos de secuencia de nucleótidos traducido din�micamente en todos los marcos de lectura (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)).

Los siguientes ejemplos y figuras se dan a manera de ilustración de la presente invención y no son de ninguna manera limitantes.

Breve Descripción de las Figuras

Figura 1. Representación esquemática de genes de citoquinina oxidasa de plantas.

Se muestran las estructuras de diferentes genes de citoquinina oxidasa aislados de maíz (ZmCKX1, número de acceso AF044603, Biochem. Biophys. Res. Com. 255: 328-333, 1999) y Arabidopsis (AtCKX1 a AtCKX4). Los exones se denominan con “E” y se representan por cajas sombreadas.Los intrones se representan por cajas blancas. Se indican adicionalmente los tamaños del gen (en Kb, encima de cada estructura), los números de acceso del gen (bajo los nombres) y una barra de tamaño que representa 0.5 kb.

Figura 2. Alineación de secuencias de amino�cidos de citoquinina oxidasa de plantas.

La secuencia de amino�cidos de citoquinina oxidasas del maíz (ZMCKX1) y Arabidopsis (AtCKX1 a AtCKX4) se alinean. Residuos de amino�cidos idénticos se marcan por una caja negra, y residuos de amino�cidos similares est�n en una caja gris. Grupos de similitud de amino�cidos: (M,I,L,V), (F,W,Y), (G,A,), (S,T), (R,K,H), (E,D), (N,Q),

Figura 3. Análisis Northern blot de plantas de tabaco y Arabidopsis que expresan AtCKX1

(A)

análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente (líneas 1-8) en comparación con tabaco silvestre tipo SNN (línea 9)

(B)

comparación de expresión de gen inducido por tetraciclina en hojas después de 12 horas inducción con un clon constitutivamente expresado. Líneas 2-9 hojas de cuatro diferentes clones AtCKX1-W38TetR (+,-, con o sin tratamiento con tetraciclina), línea 1, clon que expresa constitutivamente 35S::AtCKX1.

(C)

Análisis northern blot de plantas del gen que expresa constitutivamente AtCKX1 de plantas de Arabidopsis. Líneas 2-4, tres clones 35S::AtCKX1 que expresan constitutivamente en comparación con planta tipo Arabidopsis (línea 1).

Figura 4. Características de crecimiento de plantas de Arabidopsis 35S::AtCKX1 transg�nicas

(A)

Dos tipos de pl�ntulas silvestres (izquierda) comparados con dos pl�ntulas que expresan 35S::AtCKX1 (derecha). N�tese la formación incrementada de raíces adventicias y la ramificación de raíces incrementada en las siembras transg�nicas. Las imágenes fueron tomadas 14 días después de la germinación. Las plantas fueron cultivadas in vitro sobre medio MS en cajas de petri en una posición vertical.

(B)

Como A, pero con raíces teñidas con azul de toluidina.

(C)

Vista superior de una caja de petri con pl�ntulas hasta de 35S::AtCKX1 transg�nico tres semanas después de la germinación.

(D)

Una planta transg�nica 35S::AtCKX1 se hace crecer en cultivo líquido. Las raíces de las pl�ntulas tipo silvestre crecieron pobremente bajo estas condiciones (no mostradas).

(E)

Transformantes (TO) que expresan el gen 35S::AtCKX1 (tres plantas a la derecha) una planta tipo silvestre se muestra en la izquierda.

(F)

Fenotipo de plantas T1 cultivadas en suelo. Planta tipo silvestre (izquierda) comparada con dos plantas transg�nicas 35S::AtCKX1.

Figura 5: Fenotipo de plantas de Arabidopsis que sobreexpresan AtCKX2 Generación T1 de plantas de Arabidopsis que expresan 35S::AtCKX2 (dos plantas a la derecha) comparadas con tipo silvestre (planta a la izquierda).

Figura 6. Análisis northern blot de plantas de tabaco y arabidopsis que expresan AtCKX2

(A)

Análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente (líneas 1-7) en comparación con tabaco tipo silvestre SNN (línea 8)

(B)

Análisis northern blot de plantas de Arabidopsis que expresan constitutivamente el gen AtCKX2. Líneas 2 a 8, siete diferentes clones que expresan constitutivamente 35S::AtCKX2 en comparación con planta de Arabidopsis tipo silvestre (línea 1).

Figura 7. Fenotipo de brote de plantas de tabaco que expresan AtCKX1 y AtCKX2

(A)

Vista superior de plantas de seis semanas de edad.

(B)

Plantas de tabaco en la etapa de floraci�n.

(C)

Cinética de la elongaci�n de tallos. Las flechas marcan el surgimiento de la floraci�n. Edad de las plantas (días después de la germinación) y el número de hojas en esa etapa se indica encima de las flechas. Las barras indican SD; n = 12.

(D)

Número de hojas (n = 12) formadas entre el día 68 y el día 100 después de la germinación y área superficial final de estas hojas (100% de tipo silvestre es 3646 � 144cm2; n = 3).

(E)

Comparación del tamaño y senescencia de la hoja. Las hojas tienen números de nodos 4, 9, 12, 16 y 20 de la parte superior (de izquierda a derecha).

Figura 8. Fenotipo de raíz de plantas de tabaco transg�nicas que expresan AtCKX

(A)

Pl�ntulas 17 días después de la germinación.

(B)

Sistema radicular de plantas crecidas en el suelo en la etapa de floraci�n.

(C)

Longitud de raíces, número de raíces laterales (LR) y raíces adventicias (AR) en el día 10 después de la germinación.

(D)

Curva de respuesta a la dosis de la inhibición del crecimiento de raíces por citoquinina ex�gena. Las barras indican � SD; n = 30.

Figura 9. Crecimiento de meristemos de brote axilar en plantas de tabaco que expresan 35S::AtCKX1.

Figura 10: Histología de los meristemos de brote, hojas y meristemos de raíz de plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1 versus tabaco tipo silvestre (WT).

(A)

Sección mediana longitudinal a través del meristemo apical del brote vegetativo. P, hoja primordio.

(B)

Tejido vascular en venas de segundo orden de hojas. X, xilema, PH, un agrupamiento de floema.

(C)

Secciones transversales de hojas completamente desarrolladas.

(D)

Microscopia de barrido electrónico de la epidermis superior de la hoja.

(E)

ápices de raíz teñidos con DAPI, RM, meristemo de raíz.

(F)

Secciones longitudinales medianas en meristemos de raíz 10 días después de la germinación. RC, punta de raíz; PM, promeristemo.

(G)

Secciones transversales de raíces 10 mm del ápice. E, epidermis, C1-C4, capa de célula cortical, X, xilema, PH, floema. Las barras son 100 �m.

Figura 11. Análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan AtCKX3 y AtCKX4.

(A)

Análisis northern blot de plantas de tabaco que constitutivamente expresan AtCKX3. Las designaciones de las líneas indican números de plantas transg�nicas e individuales. WT es tabaco tipo SNN silvestre. La mancha en la parte superior fue ensayada con una sonda especifica AtCKX3, la mancha en la parte inferior con una sonda específica para el ARNr 25S y sirve como control para la carga de ARN.

(B)

Análisis northern blot de plantas de tabaco que expresan constitutivamente AtCKX4. Las designaciones de líneas indican números de plantas transg�nicas individuales, WT es tabaco SNN tipo silvestre. La mancha en la parte superior fue probada con una sonda especifica AtCKX4, la mancha inferior con una sonda específica para el ARNr 25S y sirve como un control para la carga de ARN.

Figura 12: Injertos recíprocos de plantas de tabaco transg�nicas AtCKX2 y plantas tipo silvestre.

(A)

Dos plantas a la izquierda: Control (vástago injertado WT sobre una raíz base WT). Dos plantas a la derecha: vástago WT injertado sobre una raíz de base transg�nica AtCKX2-38.

(B)

Izquierda: Control (vástago injertado WT sobre una raíz de base WT). Derecha: vástago de planta AtCKX2-38 injertado sobre raíz de base WT.

(C)

Magnificaci�n del área radicular. Izquierda: Control (vástago injertado WT sobre una raíz de base WT). Derecha: vástago WT injertado sobre una raíz de base transg�nica AtCKX2-38.

(D)

Formación de raíces adventicias.

Izquierda: control (vástago injertado WT sobre una raíz de base WT). Derecha: vástago injertado WT sobre una raíz transg�nica AtCKX 2-38.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Breve descripción de las secuencias divulgadas en la presente especificación.

Seq ID No

Descripción

1

AtCKX1 gen�mico

2

AtCKX1 proteína

3

AtCKX2 gen�mico

4

AtCKX2 proteína

5

AtCKX3 gen�mico

6

AtCKX3 proteína

7

AtCKX4 gen�mico

8

AtCKX4 proteína

9

AtCKX5 gen�mico (versión corta)

10

AtCKX5 proteína (versión corta)

11

AtCKX6 gen�mico

12

AtCKX6 proteína

13

Cebador 5’ AtCKX1

14

Cebador 3’ AtCKX1

15

Cebador 5’ AtCKX2

16

Cebador 3’ AtCKX2

17

Cebador 5’ AtCKX3

18

Cebador 3’ AtCKX3

19

Cebador 5’ AtCKX4

20

Cebador 3’ AtCKX4

21

Cebador 5’ AtCKX5

22

Cebador 3’ AtCKX5

23

Cebador 5’ AtCKX6

24

Cebador 3’ AtCKX6

25

AtCKX1 ADNc

(continuación)

Seq ID No

Descripción

26

AtCKX2 ADNc

27

AtCKX3 ADNc

28

AtCKX4 ADNc

29

AtCKX5 ADNc (versión corta)

30

AtCKX6 ADNc

31

AtCKX2 ADNc fragmento

32

AtCKX2 ADNc fragmento de p�ptido

33

AtCKX5 gen�mico (versión larga)

34

AtCKX5 ADNc (versión larga)

35

AtCKX5 proteína (versión larga)

36

Promotor homólogo de raíz clavata

Ejemplo 2. Identificación de genes que codifican citoquinina oxidasa candidatos de la Arabidopsis thaliana.

Se identificaron seis genes diferentes de Arabidopsis thaliana que portan una similitud de secuencia al gen de la

5 citoquinina oxidasa del maíz (Morris et al., Biochem Biophys Res Comm 255:328-333, 1999; Houda-Herin et al. Plant J 17:615-626; WO 99/06571). Estos genes fueron encontrados seleccionando seis traducciones de marco de secuencias de nucleótido de bases de datos gen�micas públicas con la secuencia de proteínas del maíz, empleando el programa tblastn. Estas secuencias se designan como genes similares a la citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana o AtCKX. Se numerados arbitrariamente desde AtCKX1 hasta AtCKX6. La lista de más abajo resume la

10 información sobre estos genes. Las fronteras ORF señaladas y las proyecciones de proteínas son indicativas, con el fin de ilustrar por aproximación la divergencia en secuencia de proteínas entre la citoquinina oxidasas de Arabidopsis y de maíz, as� como entre las diferentes citoquinina oxidasas de Arabidopsis. Las fronteras ORF y las secuencias de proteínas mostradas no deberían ser tomadas como evidencias concluyentes para el modo de acción de estos genes AtCKX. Para comparaciones de ADN y secuencias de proteínas se utilizó el programa MegAlign de DNAstar.

15 Este programa utiliza el método Clustal para las alineaciones. Para alineaciones múltiples de proteínas y secuencias de ADNc la diferencia por espacio vacío y la diferencia en longitud por espacio vacío fueron establecidas en 10 cada una. Para alineamientos en forma de par de proteína los parámetros fueron como sigue: Ktuple en 1; diferencia de espacio vacío en 3: ventana en 5; diagonales salvadas en 5. Para alineamientos pareados de los ADNc los parámetros fueron como sigue: Ktuple en 2; diferencia de espacio vacío en 5; ventana en 4; las diagonales salvadas

20 en 4. Los grupos de similitud para alineaciones de proteínas fueron: (M,I,L,V), (F,W,Y), (G,A), (S,T), (R,K,H), (E,D), (N,Q). Los valores que se indican entre el ADNc y secuencias de proteína de Arabidopsis representan los valores más bajos y más altos encontrados con todas la combinaciones.

A. Nombre de gen: AtCKX1 (proteína similar a la citoquinina oxidasa y Arabidopsis thaliana 1, SEQ ID NO1)

Localizaci�n en la base de datos (número de acceso, localización en bac): AC002510, cromosoma Arabidopsis 25 thaliana II sección 225 de 255 de la secuencia completa. Secuencia desde los clones T32G6.

ORF predicho en la base de datos:

15517..16183, 16415..16542, 16631..16891, 16995..17257, 17344..17752

La secuencia de ADNc AtCKK1 se enumera en SEG ID NO 25 Secuencia de proteína predicha: SEQ ID NO 2 Homologías % de identidad con ADNc de Z. mays:

31.5

% (Dnastar/MegAlign-método Clustal) % de similitud con proteína de Z. mays:

32.2

% (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):

38.2 % (AtCKX2) -54.1 % (AtCKK6) (Dnastar/MegAlign-método Clustal) % de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):

37.1 % (AtCKX2) -58.1 % (AtCKX6) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).

B. Nombre de gen: AtCKX2 (proteína 2, SEG ID NO. 3 similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thliana).

Localizaci�n en base de datos (No. de acceso, localización en bac): AC005917, cromosoma 2 de Arabidopsis thaliana sección 113 de 255 de la secuencia completa. Secuencia de los clones F27 F23-F3 P11.

ORF predicho en la base de datos:

Complemento 40721..41012, 41054..41364, 41513..41770, 42535..42662, 43153..4371

Por favor n�tese: La secuencia ADNc identificada por el inventor utilizando el programa de predicción de genes NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) fue diferente que el anotado en la base de datos. Con base en la nueva secuencia de ADNc el ORF predicho en la base de datos fue revisado:

Complemento Y 40721..41012, 41095..41364, 41513..41770, 42535..42662, 43153..43711

La secuencia de proteína codificada por este ADNc se enumera en SEG ID NO. 4. El ADNc de AtCKX2 se clona por RT-PCR a partir de RNA total de tejido de planta transg�nica AtCKX2 con el conjunto de una etapa RT-PCR (Qiagen, Hilden, Alemania), y se secuencia utilizando un conjunto de reacción de secuenciaci�n cíclica ABI PRISM Big Dye Terminator (Perkin Elmer Applied Biosystems Division). Esto confirma que la secuencia ADNc identificada y predicha por el inventor era correcta. La nueva secuencia ADNc AtCKX2 se enumera en SEQ ID NO. 26. Un fragmento 84-bp correspondiente a los nucleótidos 1171 a 1254 del ADNc AtCKX2 est� listado en SEQ ID NO 31. La secuencia de p�ptidos correspondiente de esta secuencia ADNc 84-bp se enumera como SEQ ID NO 32.

Homolog�as

% de identidad con ADNc de Z. mays:

38.4 % (Dnastar/MegAlign-método Clustal) % de similitud con proteína de Z. mayz:

37.5 % (Dnastar/MegAlign-método Clustal) % de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):

34.9 % (AtCKX6)-64.5 % (AtCKX4) (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):

36.5 % (AtCKX6)-66.1 % (AtCKX4) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).

C. Nombre de gen: AtCKX3 (proteína 3, similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana SEC ID NO. 5)

Localizaci�n en la base de datos (número de acceso, localización en bac): AB024035, ADN gen�mico de Arabidopsis thaliana, cromosoma 5, clon P1: MHM17, secuencia completa. No hay predicción del ORF en base de datos.

El gen fue identificado por el inventor utilizando varios programas de predicción de genes incluyendo GRAIL (ftp://arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan (http://CCR-081.mit.edu/GEN SCAN.html) y NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).

Complemento, 29415..29718, 29813..30081, 30183..30443, 30529..30656, 32107..32716. La nueva secuencia AtCKX3 ADNc identificada por el inventor se enumera como SEQ ID NO. 27. Secuencias de proteínas predicha con base en la predicción propia ORF: SEQ ID NO. 6. Homologías % de identidad con ADNc de Z. mays:

38.7

% (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con proteína de Z maíz:

39.2

% (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):

38.8

% (AtCKX6) -51.0 % (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):

39.9

(AtCKX6)-46.7% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).

D. Nombre de gen: AtCKX4 (proteína 4similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana, SEQ ID NO 7). Localización en base de datos (número de acceso, localización en bac): 1) AL079344 cromosoma 4 ADN de Arabidopsis thaliana, clon BAC VÉASE T16L4 (proyecto ESSA). 2) AL161575, cromosoma 4 ADN de Arabidopsis thaliana, fragmento contiguo No. 71. ORF predicho en la base de datos: 1) 1) 76187..76814, 77189..77316, 77823..78080, 78318..78586, 78677..78968 2) 101002..101629, 102004..102131, 102638..102895, 103133..103401, 103492..103783. La secuencia de ADNc AtCKX4 se listan en la SEQ ID NO. 28. Secuencia de proteína predicha: SEG ID NO. 8. Homologías % de identidad con ADNc de Z. mays:

41.0 % (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con proteína de Z. mays:

41.0 % (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de identidad con otros ADNsc de Arabidopsis (rango):

35.2 % (AtCKX6) -64.5 % (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):

35.1 % (AtCKX6) -66.1 % (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign-m´�todo Clustal).

E. Nombre de gen: AtCKX5 (proteína 5similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana, SEQ ID NO. 9).

Localizaci�n en base de datos (número de acceso, localización en bac): AC023754, F1 B16, secuencia completa, cromosoma 1. No hay predicción del ORF en la base de datos.

El gen fue identificado por los inventores utilizando diversos programas de predicción de genes incluyendo GRAIL (ftp://arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan (http://CCR-081.mit.edu/GEN SCAN.html) y NetPlantGene (http: //www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).

43756..44347, 44435..44562, 44700..44966, 45493..45755, 46200..46560 La nueva secuencia de ADNc AtCKX5 identificada y predicha por el inventor se enumera en SEQ ID NO.27. La secuencia de proteína predicha para este ADNc se enumera en SEQ ID NO. 10. Un segundo cod�n de inicio potencial ATG est� presente con 9 nucleótidos en dirección 5´en la secuencia gen�mica. No es claro cuál de estos dos codones de inicio codifica el primer amino�cido de la proteína. Por lo tanto, un segundo potencial AtCKX5 ADNc que se inicia en este cod�n en dirección 5´ también se enumera en esta invención como SEQ ID NO. 34. La secuencia gen�mica correspondiente se enumera como SEQ ID NO. 33 y la proteína codificada como SEQ ID NO. 35.

Homolog�as

% de identidad con ADNc de Z. mays:

39.1 % (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con proteína de Z. mays:

36.6 % (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):

40.1

% (AtCKX2) -44.0% (AtCKX3) (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):

41.6

% (AtCKX4) -46.4% (AtCKX6) y (Dnastar/MegAlign-método Clustal).

F. Nombre de gen: AtCKX6 (proteína 6 similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana, SEQ ID NO. 11).

Localizaci�n en base de datos (número de acceso, localización en bac): AL163818, cromosoma 3 de ADN de Arabidopsis thaliana, clon P1MAA21 (proyecto ESSA). ORF predicho en la base de datos: 46630..47215,47343..47470,47591 ..47806, 47899..48161, 48244..48565 La secuencia de ADNc AtCKX6 se

enumera como SEQ ID NO. 30. Secuencia de proteína predicha: SEQ ID NO. 12. Homologías % de identidad con ADNc de Z. mays:

37.3 % (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con proteína de Z. mays:

36.1 % (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de identidad con otros ADNc de Arabidopsis (rango):

34.9

% (AtCKX2) -54.1% (AtCKX1) (Dnastar/MegAlign-método Clustal). % de similitud con otras proteínas de Arabidopsis (rango):

35.1

% (AtCKX4) -58.1% (AtCKX1) (Dnastar/MegAlign-método Clustal).

Los genes AtCKX3 y AtCKX5 no fueron anotados como citoquinina oxidasas putativas en la base de datos y no se dieron ORF para estos genes. Adicionalmente, el ORF (y consecuentemente las estructuras de las proteínas) predichas para AtCKX2 fueron diferentes de nuestra propia predicción y nuestra predicción fue confirmada por el secuenciamiento del ADNc AtCKX2.

Una comparación de la estructura g�nica de los genes AtCKX de Arabidopsis 1 a 4 y del gen CKX de maíz se muestra en la Figura 1.

Las proteínas predichas codificadas por los genes AtCKX de Arabidopsis mostraron entre 32 % y 41 % de similitud en secuencia con la proteína de maíz, mientras que mostraron entre 35% y 66% de similitud de secuencia entre uno y otro. Debido a esta conservación reducida de la secuencia, no es claro a priori si los genes AtCKX de Arabidopsis codifican proteínas con actividad de citoquinina oxidasa. Una alineación de las proteínas predichas AtCKX de

5 Arabidopsis 1 a 4 y el gen CKX de maíz se muestra en la Figura 2.

Ejemplo 3. Plantas transg�nicas que sobreexpresan AtCKX1 muestran una actividad incrementada de citoquinina oxidasa y una morfología alterada de la planta

1. Descripción del proceso de clonaci�n

Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR el gen AtCKX1 de Arabidopsis thaliana, acceso 10 Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonar est�n en minúscula):

Secuencia de cebador 5´: cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG (SEQ ID NO:13).

Secuencia del cebador 3´: gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT (SEQ ID NO: 14).

Un fragmento de PCR 2235-bp, amplificado por estos cebadores se inserta en el sitio Sal I de pUC19. El inserto se secuencia y se confirm� que el producto de amplificación de PCR no contenía mutaciones. El fragmento Sall/Sall de

15 este vector se subclona en el sitio Sall en dirección 3’ de un promotor 35 SCaMV modificado (que llevaba tres secuencias de operador de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El constructor resultante se introduce en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.

2. Análisis molecular de las estirpes transg�nicas.

20 Varias estirpes transg�nicas fueron identificadas tales que sintetizan el transcripto AtCKX1 a niveles altos (Figura 3). Las estirpes transg�nicas que expresan el transcripto AtCKX1 también mostraron actividad de citoquinina oxidasa incrementada según se determin� mediante un ensayo estándar de la actividad de la citoquinina oxidasa con base en la conversión de [2-3H]iP a adenina como ha sido descrito (Motyka et al., 1996).

Esto se ejemplifica para dos estirpes de tabaco y dos de Arabidopsis en la tabla 6. Este resultado prueba que el gen 25 AtCKX1 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.

Tabla 6. Actividad de la citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transg�nicas AtCKX1

Muestra de hoja

Especie de planta

Estirpe de planta Actividad de citoquinina oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

Arabidopsis

Col-0 tipo silvestre 0.009

CKX1-11

0.024

CKX1-22

0.026

CKX1-22

0.027

Tabaco

SNN tipo silvestre 0.004

CKX1-SNN-8

0.016

CKX1-SNN-28

0.021

3. Descripción genot�pica de las estirpes transg�nicas.

3.1 En tabaco:

30 Las plantas tenían un fenotipo enano con dominancia apical reducida (Figura 7A, B y C) e incrementaron la producción de raíces (Figura 8). Cinco categorías de fenotipo: 1) fuerte- 2 clones.

2) intermedio- 3 clones. 3) débil- 4 clones. 4) plantas altas (como WT), con gran inflorescencia- 5 clones 5) similar a WT, 9 clones.

5 Altura (véase figura 7B y C). -WT: entre 100 a 150 cm -débil: aproximadamente 75 cm -intermedio: aproximadamente 40 a 45 cm (tallo principal aproximadamente 25 cm pero con sobrecrecimiento por

ramificaciones laterales). 10 -fuerte: aproximadamente 10 cm Los transg�nicos AtCKX1-48 y AtCKKI-50 desplegaron un fenotipo fuerte. Adelante est�n las mediciones de la elongaci�n de los tallos en comparación con las plantas WT:

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

D�as después de la germinación

Altura (cm) Altura (cm) Altura (cm)

47

9,5 �0,5 1,3 � 0,3 1,2 � 0,2

58

22,4 � 2,3 2,2 � 0,3 2,3 � 0,3

68

35,3 � 2,6 3,1 � 0,5 2,6 � 0,5

100

113,3 � 9,8 7,1 � 0,8 4,8 � 0,9

117

138,6 � 8,1 8,7 � 0,7 6,6 �0,9

131

139,0 � 9,3 9,3 � 0.7 8,6 � 1,0

152

136,6 � 10,4 10,9 � 1,1 10,0 � 1,0

165

11,8 �1,9 11,4 � 1,4

181

16,5 � 1,7 14,9 � 1,2

198

19,5 �1,5 18,1 �1,3

15 Parte experimental. Las plantas fueron cultivadas en suelo en un invernadero. Los datos fueron recolectados de por lo menos 10 plantas por línea.

Hojas (véase Figura 7 D y E)

La forma de las hojas de los expresores transg�nicos AtCKX1 es lanceolada (larga y estrecha): la proporción

anchura a longitud de las hojas maduras se reduce de 1:2 en plantas tipo silvestre a 1:3 en transg�nicos AtCKX1 20 (Figura 7E). El número de hojas y la superficie de las hojas se reduce en comparación con WT (véase Figura 7D).

Tambi�n se not� una diferencia prominente para la progresión de la senescencia de las hojas. En tabaco WT, la

senescencia de las hojas comienza en las hojas más basales y lleva a una reducción uniforme del pigmento de las

hojas (Figura 7E). En contraste, el envejecimiento de las hojas de plantas AtCKX1 con fuerte expresión permaneció

en verde a lo largo de las venas de las hojas y se hizo amarillo en las regiones intercostales, lo que indica una 25 senescencia de hojas alterada. La textura de las hojas más viejas fue más rígida.

Ra�ces Plantas cultivadas in vitro que expresaban el gen altamente se pueden distinguir fácilmente de las WT por su capacidad para formar más raíces que son más gruesas (más fuertes) (Figura 8A), as� como por formar raíces aéreas a lo largo del tallo.

La raíz primaria era más larga y el número de raíces laterales y adventicias era más alto como se ilustra en la Figura 5 8C para pl�ntulas que sobreexpresaban AtCKX1-50 (véase también ejemplo 9).

La curva de respuesta a la dosis de la inhibición del crecimiento de raíces por citoquinina ex�gena muestra que las raíces de las pl�ntulas transg�nicas eran más resistentes a la citoquinina que las raíces WT (Figura 8D). La resistencia de los transg�nicos AtCKX1 al iPR es menos marcada que para AtCKX2, lo cual es consistente con los cambios más pequeños en la citoquininas tipo iP en estas últimas (véase Tabla 10).

10 Se observa un gran incremento en la biomasa de raíces para plantas adultas cultivadas en suelo (véase Figura 8B para una planta cultivada en suelo durante cuatro a cinco meses) a pesar del hecho de que el crecimiento de las partes aéreas de la planta se ve altamente reducido.

Distancia internodal

15 • Fenotipo intermedio: el quinto internodo por debajo de la inflorescencia tiene aproximadamente 2.5 cm de longitud y el noveno internodo tenía aproximadamente 0.5 cm de longitud en comparación con 5 cm y 2 cm para la longitud del quinto y noveno internodo respectivamente, en plantas WT.

• Fenotipo fuerte: planta AtCKX1-50. La longitud del vigesimo internodo de la parte inferior medido el día 131 después de la germinación era 1,3 � 0.4 mm comparado con 39,2 � 3,8 mm para WT.

20 Dominacia apical y ramificación

Se forman más ramificaciones laterales que indican una dominancia apical reducida en comparación con las plantas WT durante el crecimiento vegetativo (véase Figura 9). Las ramificaciones laterales hicieron sobrecrecer el tallo principal, alcanzando una altura de 40 a 45 cm para expresores intermedios AtCKX1. Incluso aparecieron ramificaciones secundarias. Sin embargo, las yemas no se liberaron completamente de la dominancia apical, esto

25 es, los brotes laterales no continuaron realmente su desarrollo. La dominación apical reducida podría deberse a la producción reducida de auxina por el meristemo apical de los brotes más pequeños (véase ejemplo 10).

Desarrollo reproductivo.

Se retrasa la aparición de la floraci�n en los transg�nicos AtCKX1, se reduce el número de flores y las semillas producidas por cápsula. El tamaño de las flores no se altera en las plantas transg�nicas y el peso de las semillas

30 individuales fue comparable con el peso de las semillas de las plantas tipo silvestre. Los datos para dos transg�nicos representativos AtCKX1 se resumen más abajo:

A. Inicio de la floraci�n.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

Tiempo (DAG)

de floraci�n 106,2 � 3,3 193,3 � 4,3 191,8 � 3,8

Parte experimental:

35 Datos recolectados para por lo menos diez plantas por línea. La elongaci�n completa de la primera flor se define como el inicio de la floraci�n. DAG = días después de la germinación.

B. Número de capsulas de semillas por planta.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

N�mero de cápsulas

83.33 � 5,13 2,00 � 1,00 2,60 � 1,67

Parte experimental. El número de cápsulas de semillas se determina en por lo menos cinco plantas diferentes. Por 40 favor observe que estas plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero durante el período de invierno.

Esto afecta negativamente el número de flores que se forman, en particular en los clones transg�nicos. Sin embargo, el cuadro general que forman un número reducido de flores es correcto, n.d., no determinado.

C. Rendimiento de semillas/cápsula (mg).

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

N�mero de cápsulas

87,41 � 28,75 23,83 � 13,36 61,8 � 40,66

Parte experimental. El rendimiento de semillas se determina para por lo menos doce cápsulas de semillas. El tamaño de las cápsulas de semillas es muy variable, por lo tanto las desviaciones estándar son grandes. n.d., no determinado.

D. Peso de 100 semillas (mg).

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

Peso de semillas (mg)

9,73 � 0,44 10,70 � 1,60 9,54 � 0,94

10 Parte experimental: La biomasa de semillas fue determinada como el peso de 100 semillas de por lo menos cinco cápsulas de semillas diferentes. n.d., no determinado.

3.2 En Arabidopsis

-

El inicio de la germinación fue el mismo que para WT.

-

El sistema radicular total fue agrandado y se potencia el número de raíces laterales y raíces adventicias (véase 15 Figura 4A a D).

-

El crecimiento de los órganos aéreos se reduce resultando en un fenotipo enano (véase Figura 4E y F) y se reduce la biomasa de las hojas. Se retrasa la formación de hojas y flores.

-

El ciclo de vida es más largo comparado con WT y el rendimiento de semillas es más bajo comparado con WT.

Los siguientes datos morfom�tricos ilustran estos fenotipos: 20 Desarrollo de raíces

A. Longitud total del sistema radicular.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Longitud (mm)

32,5 76,5 68,4

B. Longitud de raíz primaria.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Longitud (mm)

32,3 � 3,8 52,3 � 4,8 39,9 � 4,2

25 C. Longitud de raíces laterales (LR).

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Longitud (mm)

0,2 � 0,4 15,6 � 11,0 10,4 � 7,6

D. Longitud de raíces adventicias.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Longitud (mm)

0,03 � 0,18 8,6 � 8,5 19,1 � 11,0

E. Número de raíces laterales (LR).

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

N�mero de LR

0,3 � 0.5 10,4 � 5,4 2,6 � 1,1

F. Número de raíces adventicias (AR).

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

N�mero de AR

0,03 � 0,18 1,6 � 1,1 2,6 � 1,1

Parte experimental: Las mediciones se llevan a cabo en plantas ocho días después de la germinación in Vitro sobre medio MS. Por lo menos se registraron 17 plantas por línea.

Desarrollo de Brotes.

A. Superficie de hojas.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11-7 T3 Plantas homocigotas AtCKX1-11-12 T3 Plantas homocigotas AtCKX1-15-1 T3 Plantas homocigotas

Superficie de hojas (cm2)

21,16 � 1,73 2,28 � 0,58 2,62 � 0,28 1,66 � 0,22

Parte experimental: Se midió el área superficial de las hojas de hojas de roseta principales formadas después de 30 días después de la germinación. Se analizaron tres plantas por clon. Desarrollo reproductivo. Inicio de la floraci�n

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11-T3 Plantas heterocigotas AtCKX2-2-T2 Plantas heterocigotas AtCKX2-5-T2 Plantas heterocigotas

Tiempo de floraci�n

43,6 � 5,8 69,7 � 9,4 51,2 � 4,1 45,1 � 6,9

Parte experimental Las plantas se cultivaron bajo condiciones de invernadero. Por lo menos se analizaron 13 plantas por clon. DAG = días después de la germinación.

Conclusi�n: El análisis de las plantas transg�nicas AtCKX1 de Arabidopsis confirm� grandes resultados obtenidos

20 del tabaco e indican la naturaleza general de las consecuencias de un contenido de citoquinina reducido. El sistema radicular total fue agrandado (longitud total de raíces se increment� aproximadamente 110 a 140% en los transg�nicos AtCKX1), los brotes se desarrollaron más lentamente (floraci�n retardada) y se redujo la biomasa de hojas. El rendimiento de semillas también fue más bajo en los transg�nicos (datos no mostrados).

Ejemplo 4. Plantas transg�nicas que sobreexpresan AtCKX2 muestran actividad de citoquinina oxidasa incrementada y morfología de la planta alterada.

1: Descripción del proceso de clonaci�n

Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR del gen AtCKX2 de Arabidopsis thaliana, acceso 5 Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonaci�n est�n en letras minúsculas):

Secuencia de cebador 5’: gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC (SEQ ID NO: 15).

Secuencia de cebador 3’: gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC (SEQ ID NO:16).

Un fragmento de PCR 3104-bp, amplificado por estos cebadores, se inserta en el sitio Kpnl de pUC19. El inserto se secuencia para verificar que no se introdujeron diferencias a la secuencia publicada por el procedimiento de PCR. El

10 fragmento Kpnl/Kpnl de este vector se subclona en el sitio Kpnl en dirección 3’ de un promotor CaMV 35S modificado (que llevaba tres secuencias de operador tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El constructor resultante se introduce en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.

2. Análisis molecular de las estirpes transg�nicas.

15 Se identifican varias líneas transg�nicas que sintetizan el transcripto AtCKX2 a niveles altos (Figura 6). Las estirpes transg�nicas que expresan el transcripto AtCKX2 también muestran una actividad incrementada de citoquinina oxidasa. Esto es ejemplificado por dos líneas de tabaco y tres de Arabidopsis en la Tabla 7. Este resultado prueba que el gen AtCKX2 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.

7. Actividades de citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transg�nicas AtCKX2

Muestra

Especie de planta y tejido

Estirpe de planta Actividad de citoquinina oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

Callo de Arabidopsis

Tipo silvestre Col-0 0.037

CKX2-15

0.351

Muestra

Especie de planta y tejido

Estirpe de planta Actividad de citoquinina oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

CKX2-17

0.380

CKX2-55

0.265

Hojas de Tabaco

Tipo silvestre SNN 0.009

CKX2-SNN-18

0.091

CiCX2-SNN-19

0.091

3. Descripción fenot�pica de las estirpes transg�nicas.

3.1 En tabaco (véase Figura 7 a 10): Tres categorías de fenotipo:

25 1) Fuerte-15 clones (similar al fenotipo intermedio de AtCKX1) 2) Débil-6 clones 3) Otros-similar a plantas WT, 7 clones

Partes aéreas de plantas.

Las observaciones concernientes a la altura, distancia internodal, ramificación, forma de hojas y amarillamiento de las plantas es similar a las de los transg�nicos AtCKX1 con algunas diferencias cuantitativas generalmente menores en que las características de enanismo fueron más severas en transg�nicos AtCKX1 que en transg�nicos AtCKX2 (compárese plantas AtCKX1 con plantas AtCKX2 en la Figura 7A y B). Esto se ilustra más abajo para las mediciones de elongaci�n del tallo y de la distancia internodal de clones con fuerte fenotipo AtCKX2-38 y AtCKX2-40.

Elongaci�n de tallo.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-38 AtCKX2-40

D�as después de la elongaci�n

Altura (cm) Altura (cm) Altura (cm)

47

9,5 � 0,5 2,4 � 0,1 2,6 � 0.2

58

22,4 � 2,3 5,5 � 0,7 5,3 � 0,5

68

35,3 � 2,6 7,1 � 0,8 7,0 � 0,7

100

113,3 � 9,8 15,5 � 2.5 20,3 � 6.4

117

138,6 � 8,1 19,8 � 3,8 29,5 � 6,0

(continuación)

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-38 AtCKX2-40

D�as después de la elongaci�n

Altura (cm) Altura (cm) Altura (cm)

131

139,0 � 9,3 26,5 � 7,0 33,4 � 5,8

152

136,6 � 10,4 33,7 � 6,3 33,9 � 6,4

165

36,2 � 4,3

Parte experimental: Las plantas fueron cultivadas en el suelo en un invernadero. Los datos fueron recolectados a partir de por lo menos 10 plantas por línea.

Distancia internodo

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-38

Distancia internodal (mm)

39,2 � 3,8 7,2 � 1,6

15 Parte experimental: La longitud del vigésimo internodo a partir de la parte inferior fue medida en el día 131 después de la germinación.

Ra�ces

Las plantas cultivadas in vitro que expresan altamente el gen se pueden distinguir fácilmente de las plantas WT por su capacidad para formar más raíces las cuales son más gruesas (más fuertes) as� como por formar raíces aéreas a 20 lo largo del tallo.

La raíz primaria es más larga y el número de raíces laterales y adventicias es más alto según se ilustra en la figura 8C para pl�ntulas que sobreexpresan AtCKX2-38 (véase también ejemplo 9).

La curva de dosis-respuesta de la inhibición del crecimiento de la raíz por citoquinina ex�gena muestra que las raíces de pl�ntulas transg�nicas fueron más resistentes a la citoquinina que las raíces WT (Figura 8D). La resistencia de los transg�nicos AtCKX1-28 a iPR es menos marcada que para AtCKX2-38, lo cual es consistente con los cambios más pequeños en la citoquininas del tipo iP en la última (véase Tabla 10).

Un incremento en el peso fresco y seco de la biomasa de raíz de las líneas TO de plantas transg�nicas AtCKX2 comparadas con WT se observa para plantas cultivadas en el suelo, tal como se ilustra en la siguiente tabla:

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2 (T0)

Peso fresco (g)

45,2 � 15,4 77,1 � 21,3

Peso seco (g)

6,3 � 1,9 8,6 � 2,2

Parte experimental: Seis plantas WT y seis líneas independientes T0 del clon 35S:: AtCKX2 fueron cultivadas en suelo. Después de la floraci�n el sistema radicular fue lavado con agua, el suelo fue eliminado tanto como fue posible y se midió el peso fresco y el peso seco.

Un incremento en peso fresco y peso seco de la biomasa radicular también se observa para la progenie F1 de los 10 transg�nicos AtCKX2 cultivados en hidrop�nicos en comparación con WT, como se ilustra en la siguiente tabla:

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-38 AtCKX2-40

RA�Z peso fresco (g)

19,76 � 6,79 33,38 � 7,76 50,04 � 15,59

RA�Z peso seco (g)

2,36 � 0,43 2.61 � 0,39 3,52 � 1,06

BROTE peso fresco (g)

159,8 � 44,53 33,66 � 2,67 48,84 � 11,83

Relaci�n peso fresco BROTE/RAÍZ

8,24 � 0,63 1,04 � 0,18 1,08 � 0,51

Parte experimental: Las plantas cultivadas en suelo se transfieren 60 días después de la germinación a un sistema hidrop�nico (solución de Hoagland) y se cultivan por 60 días adicionales. La solución hidrop�nica fue aireada

15 continuamente y remplazada por solución fresca cada tercer día.

En resumen, las plantas transg�nicas cultivadas en solución hidrop�nica formaron aproximadamente 65 a 150% más biomasa de raíz (peso fresco) que las plantas tipo silvestre. El incremento en peso fresco fue 10a 50%. Esta diferencia es posiblemente debida en parte al volumen celular más grande de los transg�nicos. Esto reduce la porción relativa de paredes celulares, la cual forma el volumen de materia seca. La biomasa de brotes fue reducida a

20 20% a 70% de los brotes tipo silvestre. La diferencia en peso fresco lleva a una desviación en la proporción brote/raíz, la cual es aproximadamente 8 en tipo silvestre pero aproximadamente 1 en los clones transg�nicos.

Conclusi�n:

Un incremento en el crecimiento de las raíces y la biomasa se observa para pl�ntulas transg�nicas AtCKX2 y plantas adultas cultivadas bajo condiciones diferentes en comparación con los controles WT a pesar del hecho de

25 que se reduce el crecimiento de las partes aéreas de la planta. Las diferencias cuantitativas se observan entre plantas transg�nicas diferentes: se observan incrementos más altos en las biomasas radiculares para los clones de expresión más fuerte.

Desarrollo reproductivo

Se retrasa el inicio de la floraci�n en los transg�nicos AtCKX2, y se reduce el número de flores y el rendimiento en

30 semillas por cápsula. Estos efectos fueron muy similares a los observados en las plantas transg�nicas AtCKX1 pero fueron menos prominentes en las transg�nicas AtCKX2, como se indica en las tablas más abajo. El tamaño de las flores no fue alterado en las plantas transg�nicas y el peso de las semillas individuales fue comparable al peso de las semillas de las plantas tipo silvestre.

A. Inicio de floraci�n Parte experimental: Datos recolectados para por lo menos 10 plantas por línea. La elongaci�n completa de la primera flor fue definida como inicio de la floraci�n. DAG = días después de la germinación.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40

Tiempo floraci�n (DAG)

de 106,2 � 3,3 193,3 � 4,3 191,8 � 3,8 140,6 � 6,5 121,9 � 9,8

B. Número de cápsulas de semilla por planta

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40

N�mero cápsulas

de 83,33 � 5,13 2,00 � 1,00 2,60 � 1,67 4,30 � 2,58 n.d.

Parte experimental: El número de cápsulas de semillas se determina por lo menos para 5 plantas diferentes. Por favor, n�tese que estas plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero durante el período de invierno. Esto afecta negativamente el número de flores que se forman, en particular en los clones transg�nicos. Sin embargo, el cuadro general que ellas forman un número reducido de flores es correcto. n.d., no determinado.

10 C. Rendimiento de semillas/cápsula (mg)

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40

Semilla/ cápsulas (mg)

87.41 � 28.75 23,83 � 13,36 61,8 � 40,66 46,98 � 29,30 n.d.

Parte experimental: El rendimiento en semillas se determina para por lo menos 12 cápsulas de semillas. El tamaño de las cápsulas de semillas es muy variable, por lo tanto las desviaciones son fueron grandes. n.d., no determinado

D. Peso de 100 semillas (mg)

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40

Peso de semillas (mg)

9,73 � 0,44 10,70 � 1,60 9,54 � 0,94 10,16 � 0,47 n.d.

Parte experimental: La biomasa de semillas se determina como el peso de 100 semillas de por lo menos 5 cápsulas de semillas diferentes. n,d., no determinado

3.2 En arabidopsis:

Se obtienen los siguientes datos morfom�tricos para transg�nicos AtCKX2: 20 Desarrollo de raíces

A. Longitud total del sistema radicular

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Longitud (mm)

32,5 50,6 48,5

B. Longitud de raíz primaria C. Longitud de raíces laterales

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Longitud (mm)

32,3 � 3,8 30,7 � 4,8 31,6 � 6,8

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Longitud (mm)

0,2 � 0,4 5,5 � 9,0 1,9 � 2,5

D. Longitud de raíces adventicias

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Longitud (mm)

0,03 � 0,18 14,4 � 10,2 14,9 � 9,1

E. Número de raíces laterales (LR)

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

N�mero de LR

0,3 � 0,5 2,9 � 2,3 1,9 � 1,0

F. Número de raíces adventicias (AR)

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

N�mero de AR

0,03 � 0,18 1,8 � 0,9 1,8 � 1,0

Parte experimental: Las mediciones se llevan a cabo en plantas 8 d.a.g . in vitro sobre medio MS. Por lo menos se 10 registran 17 plantas por línea.

Desarrollo de brotes

Superficie de hojas

L�nea

Tipo silvestre AtCKX2-2 T2 Plantas heterocigotas AtCKX2-5 T2 Plantas heterocigotas AtCKX2-9 T2 Plantas heterocigotos

Superficie de hojas (cm2)

21,16 � 1,73 8,20 � 2,35 8,22 � 0,55 7,72 � 0,85

Parte experimental: Se mide el área superficial de hojas de roseta principales formadas después de 30 días después 15 de la germinación. Se analizan tres plantas por clon.

Desarrollo reproductivo

Inicio de la floraci�n Parte experimental: Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero. Por lo menos 13 plantas por clon fueron analizadas. DAG = días después de la germinación.

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-11 T3 Plantas heterocigotas AtCKX2-2 T2 Plantas heterocigotas AtCKX2-5 T2 Plantas heterocigotos

Tiempo de floraci�n (DAG)

43,6 � 5,8 69,7 � 9,4 51,2 � 4,1 45,1 � 6,9

Conclusi�n: Los transg�nicos de arabidopsis AtCKX2 han reducido la biomasa de hojas y un fenotipo de enanismo similar a los transg�nicos AtCKX1 (compare Figura 5 con Figura 4F). El sistema radicular total también se había

5 agrandado en Arabidopsis transg�nico AtCKX2. Longitud de raíz total se incrementa aproximadamente 50% en transg�nicos AtCKX2. Los transg�nicos AtCKX1 tiene raíces primarias más largas, más raíces laterales y forman más raíces adventicias. Los transg�nicos AtCKX2 carecen del crecimiento potenciado de la raíz primaria pero forman más raíces laterales y raíces adventicias que WT.

Resumen:

10 Los fenotipos observados para transg�nicos AtCKX2 son muy similares pero no idénticos a los transg�nicos AtCKX1 los cuales a su vez son muy similares pero no idénticos a los resultados obtenidos para los transg�nicos de tabaco. Esto confirma la naturaleza general de las consecuencias del contenido reducido de citoquinina en estas dos especies de plantas y por lo tanto, también se pueden esperar fenotipos similares en otras especies de plantas. La principal diferencia entre tabaco y Arabidopsis es la carencia de crecimiento de raíces primarias potenciadas en

15 plantas que sobreexpresan AtCKX2 (datos no mostrados).

Ejemplo 5. Plantas transg�nicas que sobreexpresan AtCKX3 muestran actividad de citoquinina oxidasa incrementada y alteran la morfología de la planta.

1: Descripción del proceso de clonaci�n

Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR el gen AtCKX3 de Arabidopsis thaliana, acceso 20 Columbia (las secuencias no homólogas utilizadas para clonaci�n est�n en minúscula):

Secuencia de cebador 5’ gcggtaccTTCATTGATAAGAATCAAGCTATTCA (SEQ ID NO: 17).

Secuencia de cebador 3´ gcggtaccCAAAGTGGTGAGAACGACTAACA (SEQ ID NO: 18).

Un fragmente DPCR 3397-bp, producido por esta amplificación por PCR, se inserta en el sitio Kpnl del pBluescript. El inserto se secuencia para confirmar que el producto de PNR no tenía cambios de secuencia comparado con el

25 gen. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector se subclona en el sitio Kpnl en dirección 3’ de un promotor CaMV 35S modificado (portador de tres secuencias operadoras de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al.,1992). El constructo resultante se introduce en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.

2. Análisis molecular de las estirpes transg�nicas.

30 Se identifican varias estirpes transg�nicas de tabaco que sintetizan el transcripto AtCKX3 a niveles altos (figura 11A). Las estirpes de tabaco transg�nico que expresaban el transcripto AtCKX3 también muestran una actividad incrementada de citoquinina oxidasa. Esto es ejemplificado para tres plantas en la tabla 8. Esto prueba que el gen AtCKX3 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.

Tabla 8. Actividad de citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transg�nicas AtCKX4

Muestra

Especie y tejido de planta

Estirpe de planta Actividad de citoquinina oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

Hojas de tabaco

SNN tipo silvestre 0.011

CKX3-SNN-3

0.049

CKX3-SNN-6

0.053

CKX3-SNN-21

0.05

3. Análisis fenot�pico de la planta

Los fenotipos generados por sobreexpresi�n del gen AtCKX3 en tabaco y Arabidopsis son similares básicamente a las de las plantas que expresan AtCKX1 y AtCKX2, esto es, una formación de raíz y enanismo potenciados. Sin embargo, las sobreexpresi�n del gen AtCKX3 en tabaco result� en un fenotipo más fuerte comparado con AtCKX2. En este sentido la expresión de AtCKX3 es más similar a la sobreexpresi�n de AtCKX1.

Ejemplo 6. Plantas transg�nicas que sobreexpresan AtCKX4 muestran actividad incrementada de citoquinina oxidasa en morfología alterada de la planta.

5 1. Descripción del proceso de clonaci�n

Los siguientes cebadores fueron usados para amplificar por PCR el gen AtCKX4 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonaci�n est�n en minúsculas):

Secuencia del cebador 5´: gcggtaccCCCATTAACCTACCCGTITG (SEQ ID NO:19).

Secuencia del cebador 3´: gcggtaccAGACGATGAACGTACTTGTCTGTA (SEQ ID NO:20).

10 Un fragmento de PCR 2890-bp, producido por esta amplificación por PCR, se inserta en el sitio Kpnl del pBluescript. El inserto se secuencia para confirmar que el producto de PCR no tenía cambios de secuencia comparado con el gen. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector se subclona en el sitio Kpnl en dirección 3’ de un promotor CaMV 35S modificado (portador de tres secuencias operadoras de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El constructo resultante se introduce en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada

15 por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.

2. Análisis molecular de las estirpes transg�nicas.

Varias estirpes transg�nicas de tabaco sintetizaron el transcripto AtCKX4 a niveles altos (Figura 11 B.). Las estirpes transg�nicas que expresaban el transcripto AtCKX4 también mostraron actividades citoquinina oxidasa incrementada. Esto es ejemplificado por 3 estirpes de Arabidopsis y 3 de tabaco en la Tabla 9. Este resultado

20 muestra que el gen AtCKX4 codifica una proteína con actividades citoquinina oxidasa.

Tabla 9. Actividades citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transg�nicas AtCKX4

Muestra

Especie y tejido de planta

Estirpe de planta Actividad de citoquinina oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

Callode Arabidopsis

Col-0 tipo silvestre 0.037

CKX4-37

0.244

CKX4-40

0.258

CKX4-41

0.320

hojas de Tabaco

SNN tipo silvestre 0.011

CKX4-SNN-3

0.089

CKX4-SNN-18

0.085

CKX4-SNN-27

0.096

Por encima de todo, los datos muestran que los valores aparentes Km, para las cuatro citoquinina oxidasas est�n en el rango de 0.2 a 9.5 �M con iP como sustrato, lo cual demuestra adicionalmente que las proteínas codificadas por

25 AtCKX1 a 4 son en efecto enzimas citoquinina oxidaxas como se describe aquí.

3. Análisis fenot�pico de plantas

Los fenotipos generados por la sobrexpresi�n del gen AtCKX4 en tabaco y Arabidopsis son similares básicamente a los de las plantas que expresan AtCKX1 y AtCKX2, esto es, formación de raíces potenciada, dominación apical reducida, enanismo y amarillamiento de las regiones intercostales en hojas más viejas de tabaco. Un fenotipo

30 adicional en tabaco es hojas lanceoladas (proporción longitud a anchura alterada).

Observaciones generales sobre las plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX

En general, el análisis fenot�pico demostr� que la sobreexpresi�n del gen AtCKX provoca alteraciones de desarrollo drásticas en los brotes y en el sistema radicular de la planta en tabaco, incluyendo el desarrollo potenciado del sistema radicular y el enanismo de la parte aérea de la planta. Otros efectos tales como la senescencia alterada de las hojas, formación de raíces adventicias en tallos, y otros fueron observados también como se describe aquí. Las alteraciones fueron muy similares pero no idénticas para los diferentes genes. En tabaco, las sobreexpresiones de AtCKX1 y AtCKX3 fueron similares como en AtCKX2 y AtCKX4. En general, los dos primeros mostraron una más alta expresión de los cambios, particularmente en el brote. Por lo tanto, un gen de citoquinina oxidasa en particular puede ser preferido para alcanzar los fenotipos que se describen en las realizaciones de esta invención.

Ejemplo 7. Clonaci�n del gen AtCKX5

Los siguientes cebadores se utilizaron para amplificar por PCR el gen AtCKX5 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para la clonaci�n est�n en minúscula):

Secuencia del cebador 5’: ggggtaccTTGATGAATCGTGAAATGAC (SEQ ID NO: 21)

Secuencia del cebador 3’: ggggtaccCTTTCCTCTTGGTTTTGTCCTGT (SEQ ID NO: 22)

La secuencia del cebador 5’ incluye los dos codones de inicio potenciales de la proteína AtCKX5, el cod�n de inicio máximo 5’ est� subrayado y un segundo AtG est� indicado en cursivas. Un fragmento de PCR 2843-bp, producido por esta amplificación por PCR, se inserta en un producto cerrado en un extremo en un vector de clonaci�n pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen).

Ejemplo 8. Clonaci�n del gen AtCKX6

se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR el gen AtCKX6 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para la clonaci�n est�n en minúsculas):

Secuencia de cebador 5’ gctctagaTCAGGAAAAGAACCATGCTTATAG (SEQ ID NO: 23)

Secuencia de cebador 3’: gctctagaTCATGAGTATGAGACTGCCTTTTG (SEQ ID NO: 24)

Un fragmento de PCR 1949-bp, producido por esta amplificación de PCR, se inserta en un producto de extremo cerrado pCRBlunt II-TOPO como vector de clonaci�n (Invitrogen)

Ejemplo 9. Prueba de crecimiento de pl�ntulas de tabaco que demuestran vigor temprano de transg�nicos AtCKX

Semillas de transg�nicos que sobreexpresaban AtCKX1-50 y AtCKX2-38 y de tabaco WT fueron cultivadas in vitro sobre medio MS, puestos en un cuarto de cultivo 4 días después del tratamiento por frío y germinaron después de 6 días. Se hacen observaciones sobre el crecimiento de las pl�ntulas 10 días después de la germinación (véase también figura 8C) y se resumen más abajo. Por lo menos 20 individuos fueron registrados por clon. Datos similares han sido obtenidos en otros dos experimentos.

A. Longitud total del sistema radicular

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Longitud (mm)

61,1 122,0 106,5

B. Longitud de raíz primaria

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Longitud (mm)

32,3 � 2,6 50,8 � 4,5 52,4 � 4,8

C. Longitud de raíces laterales

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Longitud (mm)

9,8 � 5,5 18,0 � 8,1 13,0 � 6,0

D. Longitud de raíces adventicias

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Longitud (mm)

19,0 � 5,0 53,0 � 12,0 42,0 � 9,8

E. Número de raíces laterales (LR)

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

N�mero de LR

19,0 � 0,9 6,5 � 2,2 5,6 � 2,0

F. Número de raíces adventicias (AR)

L�nea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

N�mero de AR

2,2 � 0,6 3,5 � 0,9 3,6 � 1,3

Plantas AtCKX1 y AtCKX2, observaciones generales:

Las pl�ntulas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1 y AtCKX2 tienen 60% más de raíces adventicias y 3 veces más de raíces laterales que las plantas de control no transformadas 10 días después de la germinación. La longitud de la raíz primaria se increment� en aproximadamente en 70%. Esto – junto con más y más largas raíces laterales y

10 raíces secundarias, result� en un incremento de 70 a 100% de la longitud radicular total. Estos resultados mostraron que la sobreexpresi�n de la citoquinina oxidasa potencia el crecimiento y desarrollo tanto de la raíz principal como de las raíces adventicias, resultando en un vigor temprano.

Ejemplo 10. Análisis histológico de morfología de plantas alteradas en plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1

15 El análisis microscópico de diferentes tejidos revela que los cambios morfológicos en transg�nicos AtCKX son reflejados por cambios distinguibles en número de células e índice de formación de células (véase figura 10). El meristemo apical del brote (SAM) de transg�nicos AtCKX1 es más pequeño que en el tipo silvestre y más pocas células ocupan el espacio entre la zona central y la zona periférica de la formación del órgano lateral, pero las células tienen el mismo tamaño (figura 10A). El número reducido de células y tamaño de las SAM como

20 consecuencia del contenido reducido de citoquinina indica que las citoquininas juegan un papel en el control de proliferaci�n de SAM. No se presentaron cambios obvios en el patrón de diferenciación, sugiriendo que la organización espacial de las zonas de diferenciación SAM es principalmente independiente del número de células y de la concentración local de citoquinina. El patrón general de tejido de las hojas en sobreexpresi�n de citoquinina oxidasa no cambi�. Sin embargo, el tamaño del floema y el xilema es significativamente reducido (figura 10B). En

25 contraste, el tamaño promedio de células del par�nquima y de las células epid�rmicas se increment� de 4 a 5 veces (figura 10 C, D). Nuevas células de transg�nicos AtCKX1 se forman a 3 a 4% del índice de las hojas de tipo silvestre y el número final de hojas se estima en el rango de 5 a 6% del tipo silvestre. Esto indica un absoluto requerimiento de citoquinina en hojas para mantener el ciclo de división celular. Ni el tamaño de las células ni la forma de las células de los órganos florales fueron alterados y el rendimiento en semillas por cápsulas fue similar en el tipo

30 silvestre y en plantas transg�nicas AtCKX. La población celular de meristemos de raíz de las plantas transg�nicas AtCKX1 se agrand� aproximadamente cuatro veces y el número de células tanto en la columnela central como en la lateral fue potenciado (figura 10 E, F), El diámetro final de la raíz se increment� en un 60% debido a un diámetro incrementado en todos los tipos de raíz de células de la raíz. Los patrones de raíces radiales fueron idénticos en el tipo silvestre y en transg�nicos, con excepción, de que frecuentemente se not� una cuarta capa de células de

35 corteza en la raíces transg�nicas (figura 10G). El número de células incrementado y la longitud celular ligeramente reducida �ndica que el crecimiento radicular potenciado es debido a un número incrementado de células de ciclizaci�n más que al crecimiento incrementado de las células. En la presencia de un contenido disminuido de citoquinina, las células del meristemo de la raíz deben sufrir rondas adicionales de mitosis antes de que salgan del meristemo y comiencen a elongarse. La salida del meristemo es por lo tanto regulada por un mecanismo que es

40 sensible a las citoquininas. Aparentemente, las citoquininas tienen un papel regulador negativo en el meristemo de la raíz y las concentraciones de citoquinina tipo silvestre son inhibidoras para el desarrollo de un sistema radicular máximo. Por lo tanto, al reducir el nivel de citoquininas activas al sobreexpresar las citoquininas oxidasas estimula al desarrollo de la raíz, lo que resulta en un incremento en el tamaño de la raíz con más raíces laterales y adventicias en comparación con las plantas WT.

Ejemplo 11. Las plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1 y AtCKX2 tienen un contenido de citoquinina reducido

Entre los 16 diferentes metabolitos de citoquinina que fueron medidos, el cambio más grande ocurrió en la citoquininas de tipo iP sobrexpresadores AtCKX2 (tabla 10): El descenso general en el contenido de citoquininas tipo 5 iP es más pronunciado en plantas que expresan AtCKX2 que en transg�nicos AtCKX1. Los transg�nicos AtCKX1 muestran un fenotipo más fuerte en el brote. No se sabe qué metabolito de la citoquinina es relevante para los diferentes rasgos que se analizan. Puede ser que diferentes formas de citoquinina jueguen papeles diferentes en los diversos procesos de desarrollo. Se notaron alteraciones menores parfa citoquininas tipo Z, las cuales podrían ser debidas a una diferente accesabilidad del sustrato o a una especificidad del sustrato más baja de la proteína. El

10 contenido total de metabolitos iP y Z en clones transg�nicos individuales est� entre 31% y 63% del tipo silvestre. La reserva en citoquinina de los O-glucosidos también disminuye en los transg�nicos (Tabla 10). La concentración de N-glucosidos y citoquininas tipo DHZ fue muy baja y no fue o no fue marginalmente alterada en pl�ntulas transg�nicas (datos no mostrados).

Ejemplo 12. Los experimentos de injerto muestran que el enanismo y el desarrollo de raíces potenciado debido a la sobreexpresi�n de AtCKX est� confinado a los tejidos transg�nicos.

Para investigar cuales efectos fenot�picos de la sobreexpresi�n de citoquinina oxidasa est�n restringidos a los tejidos que se expresan, esto es, si son rasgos autónomos en células u órganos, se llevaron a cabo experimentos de injerto. Se hicieron injertos recíprocos entre una planta de tabaco transg�nica AtCKX2 y una planta de tabaco UVT. La planta transg�nica utilizada en este experimento es AtCKX2-38, la cual exhibe un fuerte fenotipo caracterizado por crecimiento potenciado de raíces y desarrollo reducido de las partes aéreas de la planta. Como se describe en los ejemplos 3 a 6, estos son dos importantes fenotipos que resultaron de la sobreexpresi�n de citoquinina oxidasa en tabaco y Arabidopsis.

Las plantas tenían aproximadamente 15 cm de altura cuando fueron injertadas y la unión del injerto tenía aproximadamente 10 cm por encima del suelo. La figura 12 muestra plantas 15 semanas después del injerto. Los principales resultados fueron que: (i) El fenotipo aéreo de un vástago WT injertado sobre una raíz de reserva transg�nica fue similar al injerto de control WT (igual al vástago WT sobre rizoma WT). De manera importante, esto muestra que la sobreexpresi�n del transgen AtCKX2 en el rizoma no indujo el enanismo de las partes aéreas no transg�nicas de la planta (véase figura 12 A). El crecimiento de raíces mejorado de la reserva de raíces transg�nicas se mantiene, la que indica que el crecimiento radicular mejorado de los transg�nicos AtCKX es autónomo y no depende del brote transg�nico AtCKX (figura 12C). De manera interesante, los vástago es WT injertados sobre las reservas de raíz transg�nicas lucían más saludables y estaban más desarrollados. De forma notable, la senescencia de las hojas basales se retras� en estas plantas (véase figura 12 A); (ii) el vástago transg�nico injertado sobre el rizoma WT se mostr� similar a la parte aérea de la planta transg�nica de la cual se deriva , esto es, el fenotipo de enanismo del brote también es autónomo y no depende del crecimiento mejorado de la raíz (véase figura 12B).

Adicionalmente a la mejor apariencia antes mencionada de los brotes WT injertados sobre una rizoma transg�nica, la formación de raíces adventicias sobre la parte basal de los brotes WT es notable (figura 12D, planta de la derecha). La formación de raíces adventicias también se present� en el tallo de los transg�nicos AtCKX pero no sobre los tallos de los injertos de control WT (figura 12D, planta de la izquierda) por lo tanto parece ser un rasgo no autónomo.

En resumen, se divulga en esta invención que la formación potenciada de raíces y el enanismo del brote en tabaco que sobreexpresa AtCKX son rasgos autónomos que pueden ser desacoplados por procedimientos de injerto. Sorprendentemente, el injerto de un vástago WT sobre un rizoma transg�nico AtCKX se traduce en plantas de crecimiento más vigoroso y en un retardo de la senescencia de las hojas.

Como alternativa al injerto, podrían usarse promotores específicos de tejidos para desacoplar los efectos fenot�picos autónomos de la sobreexpresi�n de citoquinina. Por lo tanto, se divulga en esta invención que la coexpresi�n de la citoquinina oxidasa en una manera específica para un tejido se puede utilizar para alterar la morfología de una planta tal como el brote o su sistema radicular.

Ejemplo 13. La sobreexpresi�n de un gen AtCKX bajo un promotor específico de raíz en plantas transg�nicas lleva a una producción incrementada de raíces

Un gen AtCKK (véase ejemplo 4) se clona bajo control del promotor homólogo de la raíz clavata de Arabidopsis (SEQ IS NO 36), el cual es un promotor que conduce una expresión específica de la raíz. Otros promotores específicos de la raíz también se pueden utilizar para propósitos de esta invención. Véase la tabla 5 para promotores específicos de raíz de ejemplo.

Las plantas transg�nicas que expresan el gen AtCKX específicamente en las raíces muestran una producción de raíces incrementadas sin afectar negativamente el crecimiento y desarrollo de las partes aéreas de la planta. Se observan efectos positivos sobre la senescencia de las hojas y el crecimiento de las partes aéreas de la planta.

Ejemplo 14. Supresión de un gen AtCKK bajo un promotor inducido de senescencia en plantas transg�nicas lleva a una senescencia retardada de las hojas y a un rendimiento de semillas mejorado.

Un constructo de gen quimérico derivado de un gen AtCKX y diseñado para suprimir la expresión de genes de citoquinina oxidasa end�genos se clona bajo el control de un promotor de senescencia inducida. Por ejemplo, se pueden utilizar los promotores derivados de genes asociados con la senescencia (SAG) tales como el promotor SGA12 (Quirino et al., 2000). Las plantas transg�nicas que suprimen los genes de citoquinina oxidasa end�genos específicamente en las hojas senescentes muestran una senescencia retardada de las hojas y un mayor rendimiento en semillas sin afectar negativamente la morfología y desarrollo de la planta.

Ejemplo 15. Sobreexpresi�n de un gen AtCKX en los órganos reproductivos femeninos lleva a un desarrollo partenoc�rpico del fruto.

El marco de lectura abierto de un gen AtCKX se clona bajo el control de un promotor que confiere sobreexpresi�n en los órganos reproductivos femeninos tal como por ejemplo el promotor Defy9 de Antirrhinum majus o uno de sus homólogos, el cual tiene una alta especificidad en la placenta y los óvulos. Las plantas transg�nicas con actividad potenciada de citoquinina oxidasa en estos tejidos muestra un desarrollo partenoc�rpico de frutos.

5 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Werner, Tomás Schm�lling, Thomas

<120> Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de las plantas

<130> CROP-005-EP1-DIV1

<150> EP 00870132.8 10 <151> 2000-06-16

<150> EP 01870053.4

<151> 2001-03-16

<150> US 60/258,415

<151> 2000-12-27 15 <160> 36

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1

<211> 2236

<212> ADN 20 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

<210> 2

<211> 575

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 2991

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

<210> 4

<211> 501

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 3302

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

<210> 6

<211> 523

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

<210> 7

<211> 2782

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 7

<210> 8

<211> 524

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 8

<210> 9

<211> 2805

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 9

<210> 10

<211> 536

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

<210> 11

<211> 1936

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 11

<210> 12

<211> 504

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 12

<210> 13

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 13 cggtcgacat gggattgacc tcatccttac g 31

<210> 14

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 14 gcgtcgactt atacagttct aggtttcggc agtat 35

<210> 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 15 gcggtaccag agagagaaac ataaacaaat ggc 33

<210> 16

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 16 gcggtaccca attttacttc caccaaaatg c 31

<210> 17

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 17 gcggtacctt cattgataag aatcaagcta ttca 34

<210> 18

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 18 gcggtaccca aagtggtgag aacgactaac a 31

<210> 19

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 19 gcggtacccc cattaaccta cccgtttg 28

<210> 20

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 20 gcggtaccag acgatgaacg tacttgtctg ta 32

<210> 21

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 21 ggggtacctt gatgaatcgt gaaatgac 28

<210> 22

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 22 ggggtaccct ttcctcttgg ttttgtcctg t 31

<210> 23

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 23 gctctagatc aggaaaagaa ccatgcttat ag 32

<210> 24

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucle�tido: cebador o sonda

<400> 24 gctctagatc atgagtatga gactgccttt tg 32

<210> 25

<211> 1728

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 25

<210> 26

<211> 1506

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 26

<210> 27

<211> 1572

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 27

<210> 28 10 <211> 1575

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 28

<210> 29

<211> 1611

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 29

<210> 30

<211> 1515

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 30

<210> 31

<211> 84

<212> ADN 10 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 31

<210> 32

<211> 28 15 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 32

<210> 33

<211> 2814

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 33

<210> 34 10 <211> 1620

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 34

<210> 35

<211> 539

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana 10 <400> 35

<210> 36

<211> 842

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 36

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para estimular el crecimiento de la raíz o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias

   o para alterar el geotropismo radicular que comprende expresión en plantas o partes de plantas de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta seleccionado del grupo que consiste de:

   (a)

   ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ADN como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de las mismas,

   (b)

   ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de las mismas,

   (c)

   ácidos nucleicos que se hibridan específicamente a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o al complemento de las mismas,

   (d)

   �cidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de amino�cidos como se da en la SEQ ID NO 2, o el complemento de las mismas,

   (e)

   ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (d) caracterizados porque dicho ácido nucleico es ADN, ADN gen�mico, ADNc, ADN o ARN sintético en donde T se reemplaza por U,

   (f)

   un ácido nucleico que se degenera a un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o que se degenera a un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e) como resultado del código genético,

   (g)

   ácidos nucleicos que son divergentes de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en la SEQ ID NO 2 o que es divergente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en el uso de cod�n entre los organismos,

   (h)

   ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en la SEQ ID NO 2 o ácidos nucleicos como se define en (a) a (e) que son divergentes debido a las diferencias entre alelos,

   (i)

   ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en la SEQ ID NO 2, y

   (j)

   fragmentos funcionales de ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa.

2. 2.

   Un método de la reivindicación 1, dicho método lleva a un aumento en el rendimiento.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1 en donde ocurre dicha expresión de dicho ácido nucleico bajo el control de un promotor constitutivo fuerte o bajo el control de un promotor que se expresa preferiblemente en raíces.

4. 4.

   Uso de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1, un vector de expresión que comprende un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 enlazado de forma operativa a una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicho ácido nucleico en células anfitrionas procariotas y/o eucariotas, un polip�ptido codificable por un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento funcional del mismo, para incrementar la biomasa de raíz o para estimular el crecimiento de la raíz o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular; en donde dicho homólogo, derivado o fragmento funcional tiene actividad de citoquinina oxidasa.

5. 5.

   Un método para incrementar el tamaño del meristemo de la raíz o para incrementar el tamaño de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raíces.

6. 6.

   Un método para alterar senescencia de hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 en hojas con senescencia.

7. 7.

   Un método para mejorar la capacidad de las pl�ntulas para mantenerse erguidas que comprende la expresión de un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 en pl�ntulas, preferiblemente en las raíces de pl�ntulas.

8. 8.

   Un método para incrementar ramificación de brote que comprende la expresión de un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 en plantas o partes de plantas.

9. 9.

   Un método para mejorar resistencia al alojamiento que comprende la expresión de un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o yemas axilares.

10. 10.

    Un método para estimular el crecimiento y desarrollo de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 en una célula transg�nica de planta o cultivo de tejido.