ES2414054T3 - Un gen que regula el desarrollo de una planta y sus usos - Google Patents

Un gen que regula el desarrollo de una planta y sus usos Download PDF

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Ben J. G. Scheres
Ikram Blilou
Saskia D. H. Folmer
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Abstract

Un método para aumentar la producción de semilla en una planta o para formar más raíces laterales en unaplanta, comparado con una planta tipo natural, que comprende la expresión ectópica de la proteína cdc27B de plantaen células, dominios, tejidos u órganos de una planta, en donde dicha proteína cdc27B de planta se selecciona delgrupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9, (b) un polipéptido con una secuencia como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9, y (c) un polipéptido con una secuencia que es por lo menos 90 % o 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidoscomo se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9.

Description

Un gen que regula el desarrollo de una planta y sus usos
Campo de la invencion
La presente invencion se situa en el campo del desarrollo de plantas. Mas especificamente se hace referencia a un
5 gen aislado y caracterizado requerido para el desarrollo correcto de una planta asi como tambien con mutantes del mismo y con el uso de dichos genes mutantes o del tipo natural para modificar el desarrollo de la planta. Dichos genes se pueden utilizar adicionalmente para imitar o modificar los efectos relacionados con auxina.
Antecedentes de la invencion
En aros recientes se ha caracterizado un gran numero de genes que estan implicados en diferentes aspectos de
10 desarrollo de la planta y/o en el establecimiento de patrones celulares que subyacen de los diferentes tejidos de planta y organos. La identificacion de dichos genes se basa usualmente en el aislamiento de plantas Arabidopsis thaliana mutagenizadas que exhiben aberraciones fenotipicas extremas o menos extremas en organos tal como flores, hojas o raices o que exhiben defectos mas tempranos, por ejemplo durante el desarrollo del embrion. Sin ser exhaustivo, los genes implicados en el establecimiento temprano de meristema de flor y la identidad de organo
15 incluyen LEAFY (LFY), APETALA1 (AP1) y APETALA2 (AP2). Los genes implicados en las ultimas etapas de patron de identidad de organo de flor incluyen APETALA3 (AP3), PISTILLATA (PI) y AGAMOUS (AG). Los genes que controlan el numero de organos de flor incluyen CLAVATA1 (CLV1), CLAVATA3 (CLV3), ETTIN (ETT), PERIANTH (PAN) y TOUSLED (TSL). TOUSLED tambien regula el tamaro de organo de flor. El meristema de flor e identificacion de organo se basa adicionalmente en el gen de INUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) y el tiempo de
20 florecimiento esta regulado mediante por ejemplo los genes CONSTANS (CO) y LUMINIDEPENDENS (LD). El meristema de inflorescencia se puede mantener en un estado indeterminado mediante por ejemplo el gen de TERMINAL FLOWER 1 (TFL). Muchos de los genes que desarrollan flor mencionados codifican los factores de transcripcion de por ejemplo la clase secuencia MADS (por ejemplo AG), la clase ARF (por ejemplo ETT); o las proteinas quinasas del receptor tipo repeticion rico en leucina (por ejemplo CLV1 y CLV2); o las proteinas quinasas
25 (por ejemplo TSL) (Nemhauser et al. 1998, Sessions et al. 1997 y referencias citadas en ambos; Aukerman et al. 1999, Pnueli et al. 1998). Se forma inflorescencia con forma de pin, sin envoltura en plantas A. thaliana mutadas en el gen PIN-FORMED1 (PIN1) (Palme and Galweiler 1999).
El desarrollo del meristema apical de brote (que es la fuente de hoja y primordia de flor) que se basa en por ejemplo WUSCHEL (WUS) mientras que su mantenimiento depende de por ejemplo el gen de factor de transcripcion 30 homeosecuencia similar a KNOTTED SHOOT MERISTEMLESS (STM) y, durante el desarrollo embrionico, en el gen ZWILLE (ZLL). El tamaro de meristema se regula en el desarrollo temprano mediante por ejemplo el gen PRIMORDIA TIMING (PT) y en etapas posteriores mediante por ejemplo CLV1. El indice de formacion de hoja se aumenta en mutantes clavata. La separacion de organos que emanan del meristema apical de brote y la separacion de organos entre si se basa en por lo menos los genes CUP-SHAPED COTYLEDON (CUC1 y CUC2) y en 35 AINTEGUMENTA (ANT). El inicio de formacion de organo lateral del meristema apical de brote requiere los genes MGOUN (MGO). El desarrollo de hoja se controla por un numero de genes que incluyen ARGONAUTE1 (AGO1), PHABULOSA (PHB) y PHANTASTICA (PHAN). La formacion de Tricoma de celulas epidermicas de hoja implica por ejemplo genes GLABROUS1 (GL1), GLABRA2 (GL2), TRANSPARENT TESTA GLABRA (TTG), TRIPTYCHON (TRY) y ZWICHEL (ZWI). El patron de estomas se basa por ejemplo en GL2 y TTG (Benfey et al. 1999, Bowman and
40 Eshed 2000, Doerner 1999, Langdale 1998, Lenhard and Laux 1999, McSteen and Hake 1998 y referencias citadas en todos).
El destino de las celulas epidermicas de raiz esta controlado por genes tal como GL2, TTG y CAPRICE (CPC). El GL2 y TTG reprime la formacion de capilares de raiz mientras que CPC, un factor de transcripcion tipo MYB, es un regulador positivo del destino celular de capilares de raiz.
45 El establecimiento de la corteza de raiz y la endodermis de raiz de tejido del suelo involucran los genes SCARECROW (SCR) que codifican un regulador transcripcional putativo y el SHORT-ROOT relacionado (SHR). El SCR y SHR tambien pueden estabilizar la identidad de celula endodermica. El gen MONOPTEROS (MP) se requiere para el inicio de raiz e hipocotilo. Dependiendo de la resistencia del alelo mutante mp faltan ya sea la raiz o la raiz y el hipocotilo. (Benfey 1999, Helariutta et al. 2000, Scheres and Berleth 1998 y referencias citadas alli).
50 Se muestra que un locus de gen identificado como HOBBIT (HBT), esta implicado en la formacion de meristema de raiz (Willemsen et al. 1998). Los alelos mutantes hbt fuertes resultan en actividad de meristema de raiz deteriorada. Otros defectos en raices de plantula mutante hbt se unen a la falta de establecimiento de columnela e identidades de celulas de caliptra de raiz lateral. Los fenotipos mutantes hbt se pueden rastrear para defectos tempranos en el desarrollo de la region de celulas hipofisiarias embrionicas. Tambien se ha descrito la formacion ectopica de
55 primordia de raiz lateral y las raices laterales en plantula mutante hbt (Willemsen et al. 1998). De acuerdo con el
ultimo articulo se describe que la produccion de auxina o la percepcion de auxina no son defectuosas de manera general en mutantes hbt, sin embargo, la funcion de gen HBT queda por esclarecer.
Uno de los problemas que destacan la presente invencion es proporcionar el gen HBT aislado y sus funciones junto con aplicaciones particularmente utiles de dicho gen en agricultura, horticultura, y cultivos de tejidos y celulas de planta. Se logra una solucion al proporcionar las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Resumen de la invencion
El desarrollo de planta se caracteriza por el control integrado de division celular y procesos de especificacion de identidad celular. El gen Arabidopsis HOBBIT (HBT) parece tener una funcion en el control del ciclo celular y la especificacion del destino celular de los tipos especificos de celula. Esta es la primera vez que se ha demostrado a nivel molecular que un gen de planta conecta la progresion del ciclo celular y la percepcion de serales de patrones.
La presente invencion se relaciona con un metodo para aumentar la produccion de semilla en una planta o para formar mas raices laterales en una planta, comparado con una planta tipo natural, que comprende la expresion ectopica de la proteina cdc27B de planta en celulas, dominios, tejidos u organos de una planta, en donde dicha proteina cdc27B de planta se selecciona del grupo que consiste de:
(a)
un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9,
(b)
un polipeptido con una secuencia como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9, y
(c)
un polipeptido con una secuencia que es por lo menos 90 % o 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9.
La presente invencion tambien se relaciona con una proteina que regula el desarrollo de la planta aislada que comprende uno de los polipeptidos seleccionados del grupo que consiste de:
(a)
un polipeptido con una secuencia como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9, y
(b)
un polipeptido con una secuencia que es por lo menos 90 % o 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9.
La presente invencion se relaciona adicionalmente con un mutante funcionalmente inactivo de la proteina como se definio anteriormente que comprende una secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 24 a 30 o se codifica por cualquiera de los acidos nucleicos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 10 a 23.
La presente invencion tambien se relaciona con un acido nucleico aislado que codifica una proteina que regula el desarrollo de la planta o un mutante funcionalmente inactivo del mismo como se definio anteriormente seleccionado del grupo que consiste de:
(a)
un acido nucleico que consiste de la secuencia de ADN como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 2 a 3 o 10 a 23, o el complemento del mismo,
(b)
un acido nucleico que consiste de las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 2 a 3 o 17 a 23, o el complemento del mismo,
(c)
un acido nucleico que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 8, 9, o 24 a 30,
(d)
un acido nucleico que se degenera como resultado del codigo genetico con relacion a una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 8, 9 o 24 a 30 o con relacion a una secuencia de acidos nucleicos como se define en (a) a (c),
(e)
un acido nucleico que codifica una proteina con una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 90 % o 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da en la SEQ ID NO: 8, 9 o 24 a 30, y
(f)
un acido nucleico que diverge debido a las diferencias en el uso de codon entre los organismos con relacion a las secuencias de nucleotidos que codifica una proteina como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9 o con relacion a una secuencia de acidos nucleicos como se define en (a) a (e).
La presente invencion tambien se relaciona con un vector que comprende una secuencia de acidos nucleicos como se definio anteriormente.
La presente invencion tambien se relaciona con un vector como se definio anteriormente que es un vector de expresion en donde dicha secuencia de acidos nucleicos se vincula funcionalmente a una o mas secuencias de control que permiten la expresion en celulas anfitrionas procarioticas y/o eucarioticas.
La presente invencion se relaciona con una celula anfitriona que contiene una molecula de acido nucleico como se definio anteriormente, o que contiene un vector como se definio anteriormente.
La presente invencion se relaciona adicionalmente con una celula anfitriona como se definio anteriormente, en donde dicha celula anfitriona es una celula bacteriana, de insecto, fungica, de planta o animal.
La presente invencion se relaciona con un metodo para producir un polipeptido como se definio anteriormente que comprende cultivar una celula anfitriona como se definio anteriormente bajo condiciones que permiten la expresion de dicho polipeptido y recuperar dicho polipeptido producido del cultivo.
La presente invencion se relaciona adicionalmente con un anticuerpo que reconoce especificamente una proteina que regula el desarrollo de la planta o un mutante funcionalmente inactivo de la misma como se definio anteriormente o que reconoce inmunologicamente partes activas o epitopos especificos de la misma.
La presente invencion se relaciona con un metodo para efectuar la expresion de una proteina que regula el desarrollo de la planta como se definio anteriormente que comprende la introduccion de un acido nucleico que codifica un polipeptido como se definio anteriormente directamente en una celula, un tejido o un organo de una planta.
La presente invencion tambien se relaciona con un metodo para la produccion de plantas transgenicas, celulas de planta o tejidos de planta que comprende la introduccion de una molecula de acido nucleico como se definio anteriormente en un formato que se puede expresar o un vector como se definio anteriormente en dicha planta, celula de planta o tejido de planta.
La presente invencion se relaciona con un metodo para efectuar la expresion de una proteina que regula el desarrollo de la planta como se definio anteriormente que comprende la introduccion de un acido nucleico como se definio anteriormente vinculado funcionalmente a una o mas secuencias de control o un vector como se definio anteriormente, y en donde dicho acido nucleico se integra establemente dentro del genoma de una celula de planta.
La presente invencion se relaciona con un metodo como se definio anteriormente que comprende adicionalmente regenerar una planta de dicha celula de planta.
La presente invencion tambien se relaciona con una celula de planta transgenica que comprende una secuencia de acidos nucleicos como se definio anteriormente, que se vincula funcionalmente a elementos reguladores que permiten la transcripcion y la expresion de dicho acido nucleico en celulas de planta y en donde dicho acido nucleico se integra establemente dentro del genoma de dicha celula de planta.
La presente invencion se relaciona con una planta transgenica o tejido de planta que comprende una celula de planta transgenica como se definio anteriormente.
La presente invencion tambien se relaciona con una parte que se puede cosechar o un propagulo de una planta como se definio anteriormente en donde dicha parte que se puede cosechar o dichos propagulos comprenden una celula de planta transgenica como se definio anteriormente.
La presente invencion tambien se relaciona con una parte que se puede cosechar como se definio anteriormente que se selecciona del grupo que consiste de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas, tuberculos y bulbos.
La presente invencion tambien se relaciona con la progenie derivada de una planta o partes de planta o propagulos como se definio anteriormente, que comprende un acido nucleico como se definio anteriormente.
Fenotipos del mutante hbt
Antes que fuera revelada la identidad y la funcion del gen HOBBIT, los fenotipos de las plantulas mutantes hobbit de Arabidopsis fueron descritos por Willemsen et al. 1998. Las caracteristicas embrionicas y post-embrionicas del fenotipo hbt se pueden subdividir en dos clases, una relacionada con la division celular y una relacionada con el destino celular. Post-embrionicamente, el gen HBT se requiere para actividad meristematica tanto de meristemas de
raiz como de brote. Esta necesidad se extiende a la formacion de raices laterales y adventicias y raices regeneradas de tejido de callo. La progenie de la celula hipofisiaria (el centro inactivo y la columnela) junto con el capilar de raiz natural e inicial adyacente muestra defectos mas alla de divisiones alteradas. Post-embrionicamente estos muestran defectos de diferenciacion, tal como la ausencia de respuesta a la gravedad que media los granulos de almidon en la columnela de los alelos hbt fuertes.
Las caracteristicas fenotipicas generales de plantulas A. thaliana del mutante hbt son una apariencia 'gruesa', con cotiledoneas e hipocotiledoneas presentes aunque retrasa el crecimiento y reduce severamente el sistema de raiz (Figura 1).
En la presente invencion, dichas plantulas mutantes hbt se caracterizan adicionalmente (ejemplo 1 y 2) y el gen HBT se aisla (ejemplo 8) y sus funciones se caracterizan.
En las raices, se sabe que el marcador caliptra de raiz de columnela especifica de region 35S::B2 se expresa mucho menos y el marcador caliptra de raiz lateral LRC244 no se expresa en el alelo hbt2311 fuerte (figura 2). Esto demuestra que la actividad del gen HBT se requiere para la especificacion del destino celular en las puntas distales de raiz.
Adicionalmente, en celulas de no raiz de mutantes hbt, los inventores encuentran de forma sorprendente la expresion del marcador especifico de raiz (figura 3). Como plantulas de A. thaliana del mutante hbt exhiben la expresion ectopica del marcador especifico caliptra de raiz 35S::B2 vinculado funcionalmente a GUS en las hipocotiledoneas y en las cotiledoneas, los inventores concluyen que la determinacion estable de destino celular en celulas de no raiz tambien requiere la actividad HBT funcional. Tambien la formacion ectopica de los capilares de raiz en las partes aereas de planta del mutante hbt confirma este nuevo hallazgo (Figura 3).
La Figura 4 muestra adicionalmente que el establecimiento de la identidad de las celulas que forma el centro inactivo de puntas de raiz se pierde en plantulas A. thaliana de mutante hbt. El patron de expresion del promotor QC4 se fusiona a GUS (pQC4�::GUS), que es un marcador especifico de region para el centro inactivo ha desaparecido totalmente en el mutante hbt comparado con el centro inactivo tipo natural. El promotor SCARECROW (SCR) ligado a GUS (pSCR::GUS), que es un marcador especifico para la endodermis de raiz se limita a la parte distal. Debido a que solo el centro inactivo de plantulas A. thaliana de mutante hbt se altera (Figura 4), existe una especificidad basal del defecto de especificacion hbt. Estos resultados aplican la funcion del gen HBT en establecer la region de meristema de raiz distal como se discute en Willemsen et al. (1998).
Otro defecto vinculado a mutaciones en el gen HBT se relaciona con morfologia celular. La elongacion de las celulas epidermicas nuevamente formadas parece ser deteriorada por plantulas A. thaliana de mutante hbt y el cultivo de dichas celulas resulta en su hinchazon. Este fenotipo hinchado se ilustra en la Figura 5.
Funcion de HOBBIT
La presente especificacion muestra por primera vez que HOBBIT esta implicado en la regulacion del ciclo celular y tambien en los efectos relacionados con auxina. Estas dos caracteristicas funcionales del gen HOBBIT son muy unicas, debido a que no se identifica otro factor biologico hasta ahora que este implicado en ambos procesos y que forme un enlace entre ambos procesos. Por lo tanto, el gen de la presente invencion se considera como una molecula clave en los procesos biologicos en la celula.
El genotipo embrionico temprano del mutante hbt muestra notablemente similitudes con tres mutantes implicados en respuestas auxina; monopteros (Hardtke and Berleth, 1998), resistente a auxina (axr �) (Bobbie et al. 2000) y bodenlos (Hamann et al. 1999). En todos estos mutantes los planes de division en la celula hipofisiaria se desvian de lo normal, que resulta en una falla para producir los derivados de esta celula, el centro inactivo, el capilar de raiz y el meristema de raiz. Los inventores pusieron en marcha la idea de que tambien se pueden alterar las respuestas de auxina mutantes hbt. Las investigaciones tempranas muestran que la adicion de auxina exogena no rescata el fenotipo mutante y que la percepcion de la auxina todavia es intacta en mutantes hbt (Willemsen et al. 1998). Sin embargo, no se puede establecer relacion entre auxina y HOBBIT.
Ahora, en la presente invencion, los inventores muestran por primera vez que el HOBBIT participa en los procesos mediados por auxina.
Cuando se determina la funcion del gen HOBBIT, los inventores hacen observaciones muy sorprendentes cuando se analiza la estabilidad del CYCB1-GUS y las proteinas de fusion AXR3-GUS. Inesperadamente, ambas proteinas, con relacion a plantulas A. thaliana tipo natural, se estabilizan en plantulas mutantes hbt. Esto se ilustra para CYCB1-GUS en la Figura y para AXR3-GUS en la Figura 7. Con estos experimentos, los inventores muestran por
primera vez una conexion directa entre el gen HOBBIT y sus efectos reguladores en el ciclo celular y su implicacion en auxina, seralizacion, respectivamente.
Por lo tanto la especificacion describe el uso de una planta cdc27B para regular el ciclo celular de una celula y el uso de una planta cdc27B para modular o imitar los efectos relacionados con auxina en una planta o celula de planta.
El CYCB1, es decir ciclina B1, es una ciclina mitotica que se requiere para la activacion de quinasas dependientes de ciclina especificas de fase M (CDK; vease Mironov et al. 1999 y Reed 199� para revision). El recambio proteolitico de ciclina B1 es un prerrequisito para salir de mitosis y para reconfigurar el ciclo celular a la fase G1. La degradacion de ciclina B1 depende del asi llamado "motivo de secuencia de destruccion mitotica en las proteinas de ciclina mitotica B1 y se ejecuta por un complejo de ligasa ubiquitina E3 especializado, el complejo/ciclosoma que promueve la anafase (APC/C). El APC/C es solo activo durante la fase M tardia y durante la fase G1 (Brandeis and Hunt 199�, King et al. 1995, Sudakin et al. 1995, Tyers and Jorgensen 2000).
Se encuentra que el AXR3 es identico a IAA17, un miembro de la familia del gen Aux/IAA puede inducir auxina. Los genes Aux/IAA exhiben expresion especifica de tejido variado, las cineticas de induccion de auxina y las relaciones de respuesta de dosis de auxina (Abel et al. 1995, Ainley et al. 1988, Conner et al. 1990, Rouse et al. 1998, Theologis et al. 1985, Yamamoto et al. 1992). Las proteinas nucleares Aux/IAA de vida corta comprenden hasta 4 dominios altamente conservados. La homo- o heterodimerizacion entre las proteinas Aux/IAA o entre las proteinas Aux/IAA y los factores de respuesta a auxina (ARF, que son los activadores transcripcionales) se efectua a traves de los dominios III y IV (Abel et al. 1994; 1995, Kim et al. 1997, Ulmasov et al. 1997). La degradacion de las proteinas Aux/IAA depende del dominio II y es esencial para la seralizacion normal de auxina (Worley et al. 2000).
Sin embargo, con la estabilizacion de CYCB1-GUS asi como tambien de la proteina de fusion AXR3-GUS, los enlaces directos se hacen entre el gen HOBBIT y sus efectos reguladores en el ciclo celular y en la seralizacion de auxina, respectivamente.
De manera interesante, por lo menos cuatro otros genes de regulacion de desarrollo de planta se han vinculado a la seralizacion de auxina. Estos PIN1 estan implicados en el transporte polar de auxina y su ubicacion polar se controla por otro gen de regulacion de desarrollo de planta, GNOM (Palme and Galweiler 1999; Steinmann et al. 1999); el ETT que tambien se conoce como ARF3 y que se une a los elementos de respuesta a auxina en promotores de genes inducibles por auxina (Nemhauser et al. 1998, Walker and Estelle 1998, y referencias citadas en ambos); y MP, tambien conocido como IAA24, un miembro de los genes AUX/IAA (Nemhauser et al. 1998, Walker y Estelle 1998, y referencias citadas en ambos).
En la presente invencion, los inventores muestran por primera vez que el desarrollo del gen HOBBIT de planta se liga a la seralizacion de auxina.
Otros componentes que se sabe se ligan a la seralizacion de auxina son parte de un complejo de ligasa de ubiquitinacion E3 conocido como SCFTir1 (del Pozo and Estelle 1999, Gray and Estelle 2000). Los complejos SCF pertenecen a una familia diferente de ligasas ubiquitina E3 que describen APC/C y son constitutivamente activas a traves del ciclo celular (vease Tyers and Jorgensen 2000 para revision). Los mutantes A. thaliana tir1 son deficientes en la respuesta a auxina. El TIR1 es el componente de proteina secuencia F de SCFTir1. Las proteinas de secuencia F son responsables de la incorporacion del sustrato especifico para la degradacion proteolitica. Otro gen
A. thaliana, AUXIN-RESISTANT 1 (AXR1) es una enzima que activa la ubiquitina tipo E1 que, en relacion con ECR1, activa la proteina relacionada con ubiquitina RUB1. Se ha observado la modificacion de RUB1 de un A. thaliana cullin/Cdc53, tambien un componente SCF (del Pozo et al. 1999, Gray and Estelle 2000, Tyers and Jorgensen 2000).
El gen HOBBIT, que se identifica por medio de un mapa con base en el metodo de clonacion, codifica un homologo Arabidopsis de un componente APC que parece conectar los procesos biologicos importantes implicados en el desarrollo de planta al acoplar la competencia para responder a la progresion del ciclo celular a auxina. Esto es particularmente importante debido a que el Hobbit, como un factor de competencia a traves de la hormona de auxina, restringe la formacion del patron solo para desviar las celulas. Esta invencion esta soportada por los siguientes datos experimentales.
El complejo que promueve la anafase multisubunitaria (APC) regula la progresion del ciclo celular en levaduras y en animales, al mediar la estabilidad de los reguladores del ciclo celular. En la presente invencion se muestra que el gen Arabidopsis HOBBIT codifica un homologo de uno de los componentes del APC, CDC27/NUC2 (figura 8). El gen HBT tambien puede funcionar como un componente APC, que puede complementar parcialmente la division que detiene el fenotipo en nuc2ts del mutante Schizosaccharomyces pombe (ejemplo , figura 15). Diversos otros componentes del APC que tiene los homologos Arabidopsis y estos se expresan continuamente en todas las celulas divididas. Los transcriptos HBT sin embargo, se acumulan solo en el limite G2/M (ejemplo 7, figura 1�). Estos resultados demuestran que aunque existe evidencia de que el HBT participa en un complejo como APC, existe una
distincion clara entre el HOBBIT identificado novedoso y otros componentes del APC (como cdc27A y cdc2�) ya conocidos en la tecnica.
Tres tipos de celula de raiz distal son dependientes de la seralizacion de auxina para su correcta diferenciacion y es la respuesta a auxina que se altera en las plantulas hbt. Proporcionamos evidencia de que este defecto depende de la acumulacion de la proteina AXR3/IAA17, un represor inestable de respuestas de auxina (ejemplo 3, ejemplo 9, ejemplo 10, ejemplo 11). Estos datos sugieren que la actividad del gen HBT actua como un factor de competencia regulado por el ciclo celular para respuestas de patron mediadas por auxina, ligando asi la progresion del ciclo celular de nivel molecular y la percepcion de las serales de patrones.
Los inventores dilucidan un mecanismo mediante el cual la competencia para responder a las serales de diferenciacion es dependiente de la estabilidad mediada por HBT de la clase Aux/IAA de los reguladores transcripcionales de respuestas de auxina. Este modelo puede explicar la correlacion observada entre la division celular y la capacidad de las celulas para responder a serales de patron en plantas. Adicionalmente, se sugiere que el APC de planta ha evolucionado para adquirir nuevas funciones en el desarrollo multicelular, que difieren de las funciones descritas hasta ahora en el control del ciclo celular.
En la caliptra de raiz de columnela de las raices tipo natural se presenta una acumulacion de auxina, que se puede visualizar por tincion DR5::GUS en estas celulas (ejemplo 9, figura 17). En plantulas hbt este pico DR5 esta ausente, y exhiben una sensibilidad de auxina alterada con respecto a la induccion de actividad DR5::GUS. Esto sugiere que la accion HBT puede implicar la proteolisis de proteinas que regulan las respuestas de auxina. La estabilidad de las proteinas Aux/IAA, para mediar las respuestas de auxina, se regula mediante la ruta de ubiquitina, de tal manera que probablemente fueron candidatos (Guilfoyle et al., 1998; Ulmasov et al., 1999b). En la presente invencion se muestra que el hbt interactua genericamente con un alelo nulo de un miembro de la familia Aux/IAA, axr3-1T (ejemplo 10, figura 18), que sugiere que el HBT tiene una funcion en el ajuste de las respuestas de auxina. La auxina tiene una funcion importante en el patron de meristema de raiz y esto probablemente depende de la distribucion correcta de los miembros de la red de ajuste fino de reguladores positivos y negativos de las respuestas de auxina. Si la destruccion de los factores de respuesta de auxina esta mediada por el ciclo celular que regula la disponibilidad de la proteina HBT, la competencia de las celulas para responder al patron de auxina de molecula se restringe al sitio en donde se producen celulas, los meristemas. En este escenario, el gen HBT es crucial para la interaccion entre la formacion de patron y la division celular en los meristemas de la planta desarrollada. Para nuestro conocimiento este es el primer momento en que se ha reportado que un gen de planta conecta la progresion del ciclo celular y la percepcion de las serales de patron en un nivel molecular. Sin embargo, en sistemas de animales se han descrito algunos ejemplos de conexiones similares, tal como el acoplamiento de la capacidad de las celulas precursoras vulvares de C. elegans para responder a serales que median la seleccion entre los destinos celulares vulvares a diferentes fases del ciclo celular. La funcion descrita aqui para el gen HBT tambien es unica cuando se extiende a la funcion CDC27 como un componente del APC.
Aislamiento del gen HOBBIT
Una forma eficiente con la cual se identifican nuevos genes y posteriormente se estudian es al introducir mutaciones de punto con agentes mutagenizantes quimicos, tal como sulfonato de etil metano (EMS). El metodo mas confiable y directo para luego aislar el gen implicado es por medio de un metodo de clonacion con base en mapa. Este metodo se utiliza para aislar el gen HOBBIT (ejemplo 1 y 2).
El gen HBT se mapea en el cromosoma 2 de A. thaliana en el intervalo entre los marcadores m24 y GPA1 que se confirma por mapeo fino RFLP. En la presente invencion, se sigue un metodo de clonacion basado en mapeo laborioso para aislar el gen HBT. El marco de lectura abierto que contiene mutaciones de sustitucion de nucleotido se identifica y se aisla el cADN correspondiente (ejemplos 1 y 2).
El cADN HBT tipo natural se identifica mediante RT-PCR y se identifica aqui como SEQ ID Nr. 2 (ejemplo 8). Un clon que contiene este cADN se deposita en la coleccion "Belgian Coordinated Collections of Microorganisms", BCCM-LMBP, en Octubre 11, 2000 y se da el numero de acceso LMBP42�5 por la Autoridad Depositaria Internacional. El analisis de secuencia revela que el gen HBT codifica inesperadamente un homologo CDC27. Esta presente en la base de datos GenBank como parte de la secuencia bajo el numero de acceso AC00� 081, mas especificamente con el complemento inverso de los nucleotidos 1 314-20890. La parte relevante de esta secuencia genomica se define en la SEQ ID NO 1. El cADN HBT se identifica en la presente invencion como la SEQ ID NO 2 y otra variante de division de los genes HBT se caracteriza e identifica aqui como la SEQ ID NO 3 (ambas de A. thaliana ecotipo Col-0, Columbia). Ambas variantes de division HBT codifican, sin embargo, los homologos CDC27 que se extienden por 1�2 y 1� aminoacidos de terminal amino, respectivamente, (definido como la SEQ ID NO y como la SEQ ID NO 7 respectivamente) con relacion a la secuencia de proteina predicha anotada en GenBank (AC00�081; ID de proteina AAD2439�.1). Las secuencias de nucleotidos que corresponden a la SEQ ID NOs � y 7 se definen en SEQ ID NOs 4 y 5, respectivamente. Las proteinas HBT de longitud completa se dan por la SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9 respectivamente. Las proteinas HBT son -47 % identicas a otro homologo A. thaliana CDC27 con el numero de
acceso GenBank AC001�45 (ID de proteina AAB� 3�45.1). Para propositos de claridad, los terminos HOBBIT, HBT y AtCDC27B se refieren a las mismas proteinas como se define por la SEQ ID NO 8 (tambien denominado como CDC27B1) y por la SEQ ID NO 9 (tambien denominado como CDC27B2). Dicho otro homologo A. thaliana CDC27 (GenBank AC001�45; ID de proteina AAB�3� 45.1) se denomina como AtCDC27A. Se da una alineacion de AtCDC27A y HBT/AtCDC27B2 en la Figura 8.
Se conocen en la tecnica proteinas CDC27 cuando es parte de un complejo de proteina grande denominado APC/C (cfr. supra). En la levadura, el APC/C consiste de por lo menos 8 proteinas de las cuales tres, CDC1�, CDC23 y CDC27 contienen repeticiones de tetratricopeptido (TPR; Peters et al. 199 �, Small and Peeters 2000).
Los datos experimentales presentados en la presente solicitud son la primera demostracion de que cdc27B en levadura puede ser parte del APC (Figura 15) y que las plantas que carecen de actividad HOBBIT funcional tienen contenido de ADN anormal en la fase S del ciclo celular (es decir entre la fase G1 y G2).
En el proceso para aclarar la funcion del gen HBT, se generan diversos mutantes hbt. Estos mutantes hbt se identifican y caracterizan por los inventores en el nivel genomico y en el nivel de cADN, en las Figuras 9 y 10 se proporciona una vision general de los mismos:
1.
hbt5421: una mutacion de punto del nucleotido adenosina en la posicion �2 (cADN resultante: SEQ ID NO 17; Fig. 9) o posicion �2 (clon genomico resultante: SEQ ID NO 10; Fig. 10) en una timidina, que resulta en una sustitucion de la alanina natural en la valina mutante en la posicion 21 (que resulta en la SEQ ID NO 24; Fig. 9).
2.
hbt5422/hbt5423/hbt5859/hbt9�24: Cuatro mutantes aislados independientemente que llevan la misma mutacion de punto del nucleotido guanosina en la posicion 1503 (clon genomico resultante: SEQ ID NO 11; Fig 10) en una adenosina, que resulta en la insercion de nucleotidos 434-511 del cADN (que resulta en SEQ ID NO 18) y los aminoacidos correspondientes 145-171 de la proteina (que resulta en SEQ ID NO 25).
3.
hbt1� 11: una mutacion de punto del nucleotido guanosina en la posicion 12 �1 (cADN resultante: SEQ ID NO 19; Fig. 9) o en la posicion 2913 (clon genomico resultante: SEQ ID NO 12; Fig. 10) en una adenosina, que resulta en una sustitucion de la glicina natural en la arginina mutante en la posicion 421 (que resulta en SEQ ID NO 2�; Fig. 9).
4.
hbt9�20: una mutacion de punto del nucleotido guanosina en la posicion 3042 (clon genomico resultante: SEQ ID NO 13; Fig. 10) en una adenosina, que resulta en una eliminacion de nucleotidos 1300 a 13�5 (cADN resultante: SEQ ID NO 20; Fig. 9) y los aminoacidos correspondientes 434-455 (que resulta en SEQ ID NO 27; Fig. 9).
5.
hbt 721: una mutacion de punto del nucleotido guanosina en la posicion 33 �0 (clon genomico resultante: SEQ ID NO 14; Fig. 10) en una adenosina, que resulta en una eliminacion de nucleotidos 13 a 1485 (cADN resultante: SEQ ID NO 21; Fig. 9) y los aminoacidos correspondientes 45�-495 (que resulta en SEQ ID NO 28; Fig. 9).
�. hbt2311: una mutacion de punto del nucleotido citosina en la posicion 1555 (cADN resultante: SEQ ID NO: 22; Fig. 9) o position 3530 (clon genomico resultante: SEQ ID NO 15; Fig. 10) en una timidina, que resulta en la formacion de un codon de parada en la posicion de la glutamina natural en la posicion 519 (Fig. 9) y, sin embargo, la eliminacion de los aminoacidos 520 a 744 (que resulta en SEQ ID NO 29; Fig. 9).
7. hbt8052: una mutacion de punto del nucleotido citosina en la posicion 1 10 (cADN resultante: SEQ ID NO 23; Fig. 9) o en la posicion 3� �7 (clon genomico resultante: SEQ ID NO 1�; Fig. 10) en una timidina, que resulta en una sustitucion de la alanina natural en la valina mutante en la posicion 537 (que resulta en SEQ ID NO 30; Fig. 9).
Como dos mutaciones inactivas funcionales, hbf5421 y hbt5422/ hbt5423/ hbt5859/ hbt9�24 ocurren en el dominio de terminal amino CDC27B novedoso de la presente invencion (SEQ ID NO 7), se considera que este dominio es esencial para la actividad de la proteina cdc27B y por lo tanto se considera fuertemente que la proteina anotada con el numero de acceso GenBank AC00� 081 (ID de proteina AAD2439�.1) no es activo y no es funcional.
Con el fin de demostrar la distincion funcional entre el gen identificado novedoso de la presente invencion y otros genes que muestran homologia, la transcripcion de los genes HOBBIT, AtCDC1� (GenBank AC005� 79; ID de proteina AAC83033.1) y AtCDC27A se analiza en embriones A. thaliana (Figura 11) y raices de plantula de A. thaliana (Figura 12). Los transcriptos AtCDC1� se dispersan homogeneamente en todas menos las celulas suspensoras para desarrollar embriones A. thaliana asi como tambien en todas menos las celulas caliptra de raiz en raices de plantula A. thaliana. Los transcriptos AtCDC27A tambien se encuentran en muchas celulas de raiz de plantula A. thaliana. La expresion de gen HBT, sin embargo, exhibe un patron de expresion inesperado irregular en el desarrollo de embriones asi como tambien en tejidos de raiz de plantula. Dichos patrones de expresion irregulares son indicadores de una transcripcion de gen especifica de etapa de ciclo celular. Sin embargo, aunque los
homologos en el nivel de aminoacido, las funciones biologicas de AtCDC27A y HBT son casi con seguridad muy diferentes con base en sus patrones de expresion.
En resumen, los inventores muestran por primera vez que el cdc27B/HOBBIT esta implicado en respuestas relacionadas con auxina, que la expresion HOBBIT se acopla al ciclo celular y que tiene una funcion posible en el APC. Los inventores encuentran que HOBBIT es un factor de competencia a traves de la hormona auxina. Los inventores tambien encuentran que el HOBBIT restringe la formacion del patron para dividir solo las celulas.
Dichos aspectos de la invencion conducen a la formulacion de las siguientes realizaciones preferidas de la presente invencion.
Descripcion detallada de la invencion
Aislamiento de cADN cdc27B y secuencias de proteina codificadas
El gen HBT codifica un homologo CDC27/NUC2.
El gen HBT se ubica en el cromosoma 2 cerca al marcador molecular mi148. La identificacion de ORF T2G17.20 como el gen HBT se determina por secuenciamiento de los alelos mutantes y se verifica mediante la terminacion de homocigotos hbt2311 utilizando un fragmento genomico de 9 kb que abarca el locus HBT (ejemplos 1 y 2).
Para confirmar la division predicha del cADN HBT, se aislan dos clones de una coleccion de cADN Col-0 (Giraudat et al., 1992). Adicionalmente, el ARN se aisla de raices Col-0 y se realiza un RT-PCR. El secuenciamiento de los cADN confirma las desviaciones en anotacion que observamos entre estos tres cADN y el ORF publicado (ID de proteina AC00�081). Adicionalmente estos experimentos de secuencia revelan por lo menos dos variantes de division. Una fraccion pequera de los cADN carece de 12 pares base, que resulta en un primer dominio TPR con 30 a diferencia de 34 aminoacidos genericos. La mayor parte de los cADN representan la version larga. La significancia funcional de las versiones de division alternativas del mARN HBT no es clara. El tamaro del transcripto, 2.5 kb, se confirma mediante analisis Northernblot. El analisis de Proteccion RNasa revela dos inicios transcripcionales potenciales, con las cajas TATA y CAAT en la direccion 5' putativa (ejemplo 8).
La comparacion de las secuencias de cADN y genomicas revela que el gen HBT contiene 15 exones y 14 intrones, que resulta en una proteina predicha de 745 residuos. La caracteristica mas sobresaliente de la proteina HBT es la presencia de 10 dominios con los residuos consensus de Repeticiones de Peptido Tetratrico (TPR), uno en la mitad del terminal amino de la proteina y un estiramiento de nueve dominios en la mitad del terminal carboxilo. Estos dominios TPR estan implicados en las interacciones proteina-proteina. La comparacion de la secuencia de proteina HBT con otras revela que la proteina HBT comparte la mayor homologia con las proteinas CDC27/BIMA/NUC2 de organismos distantes evolutivos tal como levadura, mamiferos y Drosofila. Adicionalmente, la distribucion de los dominios TPR en la proteina HBT, el dominio de repeticion conservada 5 y 7, y la repeticion aberrante TPR en el dominio 4 son tipicos para ortologos CDC27. Se ha mostrado que las proteinas CDC27 son un componente del Complejo que Promueve Anafase (APC) o Cicleosoma, implicadas en la progresion del ciclo celular mediante objetivos de proteina ubicuos (Lamb et al., 1994; King et al., 1995). Esta presente una secuencia relacionada con HBT en el genoma Arabidopsis. La proteina AtCDC27a deducida (ACC no.: BAB01271) comparte una homologia general de 41 % con HBT. La homologia en la region que contiene los dominios TPR es 5 % (vease figura 8). Con base en la secuencia de proteina y la homologia con proteinas CDC27, hipotetizamos que la proteina HBT puede regular la estabilidad de las proteinas objetivo por medio de la ruta de de ubiquinacion.
De acuerdo con lo anterior la invencion representa una secuencia de ADN aislada con la secuencia de nucleotidos como se da en la SEQ ID NOs 2 a 3, que codifica una proteina que regula el desarrollo de la planta con la secuencia de aminoacidos como se da en la SEQ ID NOs 8 o 9, que comprende una secuencia de aminoacidos novedosa requerida para la funcion de la proteina como se da en la SEQ ID NOs � y 7, respectivamente. Mas especificamente, dicha secuencia de ADN aislada codifica las proteinas HOBBIT tipo natural que son homologo CDC27.
El termino "proteina que regula el desarrollo de la planta" como se utiliza adelante se refiere a una proteina de planta CDC27. Ejemplos especificos de las proteinas de planta CDC27 son las proteinas cdc27b identificadas y descritas aqui.
Se incorpora adicionalmente en la presente invencion las secuencias de ADN aisladas con la secuencia de nucleotidos como se da en la SEQ ID NOs 10 a 23 que codifica funcionalmente mutantes inactivos de dicha proteina que regula el desarrollo de la planta con la secuencia de aminoacidos como se da en la SEQ ID NOs 24 a 30.
La presente especificacion describe un acido nucleico aislado que codifica por lo menos parte de una proteina novedosa que regula el desarrollo de la planta o que codifica un fragmento inmunologico y/o funcional de dicha
proteina o que codifica funcionalmente mutantes inactivos de dicha proteina que regula el desarrollo de la planta, seleccionados del grupo que consiste de:
(a)
un acido nucleico que comprende por lo menos parte de la secuencia de ADN como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 1 a 5, 10-23, o el complemento del mismo,
(b)
un acido nucleico que consiste de la secuencia de ADN como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 1 a 5, 10 a 23, o el complemento del mismo,
(c)
un acido nucleico que comprende las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 15, 10-23, o el complemento de las mismas,
(d)
un acido nucleico que hibrida, preferiblemente que hibrida especificamente, con la secuencia de nucleotidos como se define en (a) (b) o (c),
(e)
un acido nucleico que codifica una proteina con una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 50 % identica, preferiblemente 55 %, �0 %, �5 %. 70 % o 75 % identica, mas preferiblemente 80 %, 85 % o 90 % identica, mucho mas preferiblemente 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 8, 9 o 24 a 30,
(f)
un acido nucleico que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs , 7, 8, 9, o 24 a 30,
(g)
un acido nucleico que se degenera como resultado del codigo genetico con relacion a una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 8, 9 o 24 a 30, o con relacion a una secuencia de acidos nucleicos como se define en (a) a (f),
(h)
un acido nucleico que diverge debido a las diferencias en el uso de codon entre los organismos con relacion a una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 8, 9 o 24 a 30.
o con relacion a una secuencia de acidos nucleicos como se define en (a) a (f),
(i)
un acido nucleico que diverge debido a las diferencias entre los alelos con relacion a una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 8, 9 o 24 a 30 o con relacion a una secuencia de acidos nucleicos como se define en (a) a (f),
(j)
un acido nucleico que codifica un fragmento o un fragmento funcional y/o un fragmento inmunologicamente activo de una proteina se codifica por una secuencia de ADN como se da en la SEQ ID NOs 1 a 5 o 10 a 23 o como se define en uno cualquiera de (a) a (i),
(k)
un acido nucleico que hibrida especificamente a una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido como se da en la SEQ ID NO o 7, y,
(l)
un acido nucleico que codifica una proteina como se define en cualquiera de la SEQ ID NOs a 9 o 24 a 30 o como se define en uno cualquiera de (a) a (k) interrumpido al intervenir las secuencias de ADN, dado que dicho acido nucleico no es el acido nucleico como se deposita bajo el numero de acceso GenBank AC00� 081.
La presente especificacion describe secuencias de acidos nucleicos que hibridan con secuencias unicas de los acidos nucleicos que codifican la proteina que regula el desarrollo de la planta de la invencion. Debe quedar claro que la persona experta en la tecnica puede identificar facilmente y seleccionar los tramos de secuencias que son unicos para la proteina de la invencion cuando se compara por ejemplo en la figura 8 de la secuencia de aminoacidos de Cdc27A y HBT/Cdc27B. Las secuencias de acidos nucleicos que codifican estas partes unicas se pueden deducir facilmente de esto.
La presente especificacion describe acidos nucleicos aislados como se menciono anteriormente bajo (a) a (I) que son ADN, cADN, ADN genomico o ADN sintetico, o ARN en donde T se reemplaza por U.
Tambien parte de la especificacion son moleculas de acido nucleico de por lo menos 15 nucleotidos de longitud que hibridan especificamente con por lo menos una de las moleculas de acido nucleico de la invencion como se definio anteriormente o amplificando especificamente las moleculas de acido nucleico definidas anteriormente.
De acuerdo con otra realizacion, la invencion se relaciona con un vector que comprende una secuencia de acidos nucleicos de la invencion. Este vector puede ser un vector de expresion en donde dicha secuencia de acidos
nucleicos se vincula funcionalmente a una o mas secuencias de control que permite la expresion en celulas anfitrionas procarioticas y/o eucarioticas.
Tambien las celulas anfitrionas que contienen una molecula de acido nucleico de la invencion son parte de la presente invencion. Las celulas anfitrionas preferidas de acuerdo con la invencion son celulas bacterianas, de insecto, fungica, de planta o animales.
La presente especificacion describe adicionalmente una proteina que regula el desarrollo de la planta aislada que comprende uno de los polipeptidos seleccionados del grupo que consiste de:
(a)
un polipeptido como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs � a 9,
(b)
un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 50 % identica, preferiblemente 55 %, �0 %, �5 %, 70 % o 75 % identica, mas preferiblemente 80 %, 85 % o 90 % identica, mucho mas preferiblemente 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs a 9, y
(c)
un polipeptido se codifica por un acido nucleico como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 1 a 3.
La presente especificacion describe adicionalmente una proteina que regula el desarrollo de la planta aislada que consiste de una secuencia de aminoacidos como se da en la SEQ ID NO 8 o 9. De acuerdo con otra realizacion, las proteinas de acuerdo con la invencion son proteinas CDC27, tal como la proteina cdc27B de plantas, u homologos funcionales de los mismos. De acuerdo con otra realizacion, la invencion se relaciona con la proteina cdc27B de plantas de A. thaliana, tal como la proteina AtCDC27B.
La especificacion se relaciona adicionalmente con proteinas con una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 50 % identica, preferiblemente 55 %, �0 %, �5 %, 70 % o 75 % identica, mas preferiblemente 80 %, 85 % o 90 % identica, mucho mas preferiblemente 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da.
La especificacion describes tambien homologos, derivados y/o fragmentos inmunologicamente activos de la proteina que regula el desarrollo de la plantas de acuerdo con la invencion, fragmentos de los mismos y proteinas que comprenden dichos homologos, derivados y/o fragmentos inmunologicamente activos de dicha proteina que regula el desarrollo de la planta o fragmentos de los mismos.
Como tal, la presente invencion tambien se relaciona con un polipeptido aislado que se puede codificar por una molecula de acido nucleico de la invencion como se define en las reivindicaciones.
Analisis de alelos mutantes.
El ADN genomico de mutantes hbt homocigotos (ejemplo 1) se amplifica en el locus HBT y se secuencia. Esto conduce a la identificacion de cambios de par base unicos en diez alelos mutantes. Para el alelo debil e5�, que no complementa otros alelos hbt (Willemsen et al., 1998), no se puede identificar mutacion en la region genomica que incluye 1070 bp de la region promotora en la direccion 5' y 230 bp en la direccion 3' de la seral de poliadenilacion (datos no mostrados). Aunque la lesion molecular en hbte5� permanece no identificada, el analisis RT-PCR muestra que los mutantes e5� tienen niveles de transcripto HBT fuertemente reducidos, que sugieren efectos epigeneticos en la transcripcion HBT.
En el alelo Col-0, 2311, se introduce un codon de parada en la posicion 519. Las proteinas truncadas resultantes carecen de parte principal de los dominios TPR, lo que puede indicar que estos alelos son nulos; en el mutante nuc2-��3 S. pombe sensible a temperatura, un cambio de aminoacidos en uno de los dominios TPR resulta en letalidad de esporas en tetradas como un mutante nulo y construcciones que llevan versiones de la proteina NUC2 con truncaciones en los dominios TPR no pueden complementar nuc2-��3 (Hirano et al., 1988, 1990). A pesar de la ausencia de muchos dominios TPR en estos tres alelos hbt, no se observan letalidad gametofitica y disminucion metafase. Adicionalmente, todos los alelos Col (excepto el alelo debil e5�) provocan fenotipos similares a pesar de diferentes defectos moleculares, consistente con la nocion que todos son nulos.
De acuerdo con lo anterior, en otra realizacion, la invencion se relaciona con mutantes funcionalmente inactivos de la proteina que regula el desarrollo de la plantas de la invencion, que consiste de una secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 24 a 30, o se codifica por un acido nucleico como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 10 a 23. La expresion "fragmento funcional" se relaciona con un fragmento de la proteina mutante que comprende la mutacion.
La invencion se relaciona adicionalmente con los polipeptidos como se define en las reivindicaciones que tienen la capacidad de regula el desarrollo de planta.
Cualquiera de dichas proteinas se puede producir en un sistema biologico, por ejemplo un cultivo celular. Alternativamente cualquiera de dichas proteinas se fabrica quimicamente por ejemplo mediante sintesis de peptido de fase solida. Dichas proteinas o fragmentos de las mismas pueden ser parte de una proteina de fusion como en el caso de por ejemplo un ensayo de dos hibridos que permite por ejemplo la identificacion de proteinas que interactuan con la proteina que regula el desarrollo de la planta de acuerdo con la invencion.
Por lo tanto, de acuerdo con otra realizacion, la invencion tambien se relaciona con un metodo para producir un polipeptido de la invencion que comprende cultivar una celula anfitriona especificada anteriormente adicionalmente bajo condiciones que permiten la expresion del polipeptido y recuperar el polipeptido producido del cultivo.
Las proteinas o fragmentos de los mismos que se pueden obtener mediante un metodo como se describe aqui son adicionalmente utiles por ejemplo para modular la interaccion entre una proteina que regula el desarrollo de la planta como se define en la invencion e interactuar patrones de proteina identificados de acuerdo con la invencion. Los peptidos quimicamente sintetizados son particularmente utiles por ejemplo como una fuente de antigenos para la produccion de antisuero y/o anticuerpos.
La presente invencion asi adicionalmente abarca antisuero y/o anticuerpos que reconocen especificamente la proteina que regula el desarrollo de la planta de acuerdo con la invencion o partes inmunologicamente activas o epitopos de las mismas. Said antisuero y/o anticuerpos son utiles en muchas areas relacionadas con la invencion que incluyen: (i) identificacion de cualquier organismo, preferiblemente plantas, de otra proteina que regula el desarrollo de la plantas y sus genes de acuerdo con la invencion; (ii) cuantificacion de la sintesis en organismos y/o organismos recombinantes de la proteina que regula el desarrollo de la planta de acuerdo con la invencion; (iii) purificacion de la proteina que regula el desarrollo de la planta de acuerdo con la invencion; (iv) inmunoprecipitacion de la proteina que regula el desarrollo de la planta de acuerdo con la invencion por ejemplo como una forma de identificar otros patrones de proteina que se complejan con dicha proteina que regula el desarrollo de la planta; (v) inmunoubicacion de la proteina que regula el desarrollo de la planta de acuerdo con la invencion que se expresa en un organismo o un organismo recombinante.
Uso de cdc27B en plantas
Durante las diferentes etapas del desarrollo de planta se integra la accion de la formacion de patron y la morfogenia luego de las posiciones de organos, tejidos y tipos celulares individuales en posiciones apropiadas. En contraste con sistemas de animal en donde el movimiento de las celulas contribuye al desarrollo, las plantas estan rodeadas por una pared celular rigida que permite poco movimiento. Por estas razones, la formacion de patron y la morfogenia de la planta tienen lugar en los sitios de produccion de celulas, los meristemas. En estos meristemas, las serales de patrones pueden proporcionar la informacion necesaria para crear las diferencias en los indices de division y planes y el alargamiento directo de celulas cuando dejan el meristema. La diferenciacion de las celulas inicia como celulas que dejan el meristema. Con todos estos procesos diferentes que ocurren en el mismo lugar y al mismo tiempo es importante conectar la division celular y la formacion de patrones.
De forma interesante, la formacion de patrones y la division celular comparte mecanismos reguladores comunes. Un mecanismo importante para controlar la progresion del ciclo celular es la destruccion de las proteinas reguladoras por medio de la ruta ubicua. En esta ruta, las moleculas ubicuas se unen a las proteinas objetivo mediante ligasas ubicuas como SKP1, CDC53/CULLIN y el complejo de proteina secuencia F (SCF) y el Complejo que Promueve Anafase (APC). Despues de esto las ahora proteinas 'marcadas' se destruyen por el Proteasoma 2�S. Esta ruta ubicua tambien sirve como una funcion crucial que balancea las moleculas de respuesta positiva y negativa de una molecula importante para desarrollo de planta, auxina. En la presente invencion, los homologos de Arabidopsis de componentes de la ruta proteolitica mediada por ubiquitina en la progresion del ciclo celular y la respuesta de auxina se ha identificado y las mutaciones en los genes correspondientes confieren un amplio rango de defectos de crecimiento, que muestran la funcion central de estos procesos en el desarrollo de planta.
iUna funcion para el gen HBT en ajuste con las respuestas de auxina?
La idea basica de que HBT esta implicado en las respuestas de auxina se origina a partir de tres observaciones diferentes. Primero, los tipos celulares defectuosos en Hobbit tambien son dependientes de auxina y tambien son defectuosos en respuesta a auxina (vease Figura 17(i): la maquinaria de respuesta a auxina de la celula es intacta, pero la respuesta a auxina se altera y la Figura 17(j): las hipocotiledoneas en mutantes hbt han ganado sensibilidad, en donde no responde normalmente a auxina. Segundo, el mutante ARX3 "ganancia de funcion" de plantas mutantes, muestran las mismas caracteristicas fenotipicas como los mutantes hbt y tercero, las respuesta de auxina implica las proteinas que regulan auxina o ubiquinacion.
Cuando se evalua un elemento de respuesta a auxina sintetico, las plantulas hbt muestran una sensibilidad a auxina alterada para la auxina sintetica, 2,4 D, y para la auxina endogena, IAA (ejemplo 9, figura 17). Aunque pueden codificar la auxina, es necesaria una concentracion mucho mayor para inducir una respuesta transcripcional.
Tambien observamos una restauracion parcial del genotipo mutante hbt en mutantes dobles hbt axr3-1T. El gen AXR3/IAA17 es un regulador de percepcion de auxina y mutaciones semi-dominantes en este gen confieren defectos de crecimiento pleiotropico, todos relacionados con una respuesta de auxina elevada (Ouellet et al., 2001). El involucramiento de auxina en diversos procesos de crecimiento y organos implica que en cada tejido puede hacer un balance especifico de los reguladores positivos y negativos de las respuestas de auxina. Diversas observaciones sugieren que el HBT puede tener una funcion en el control de este balance en el meristema. Primero, la sensibilidad de auxina se altera en plantulas hbt (ejemplo 9, figura 17). Segundo, existe una interaccion genetica con el alelo axr3-1T (ejemplo 10, figura 18). y tercero, la expresion del gen HBT se confina a la poblacion de celulas divididas en las meristemas y es por lo tanto dependiente de la progresion del ciclo celular (ejemplos 4 y 7, figuras 11, 12 y 1�). Sin embargo, la presencia de la proteina HBT solo en la fase G2/M en el ciclo celular, puede proporcionar un unico mecanismo regulador en las plantas, de tal manera que media el retiro de los reguladores de auxina, en una fase especifica del ciclo celular. Para nuestro conocimiento este es el primer ejemplo en plantas en donde un componente regulado por el ciclo celular confina la competencia para responder a una seral de patron al meristema. En animales existen pocos ejemplos de una conexion directa entre la progresion del ciclo celular y la capacidad de las celulas para responder a las rutas de transduccion de seral. Por ejemplo, la capacidad de celulas precursoras vulvares C. elegans para responder a serales que median la seleccion entre destinos celulares vulvares se acopla a diferentes fases del ciclo celular (Wang and Sternberg, 1999).
Sin embargo, se puede utilizar la regulacion de la estabilidad de proteina en sistemas de desarrollo ampliamente diferentes para regular la competencia.
La especificacion describe el uso de una planta cdc27B caracterizada en que la modificacion o imitacion de los efectos relacionados con auxina se basa en la modulacion de la estabilidad de proteinas reguladoras de serales de patron.
La especificacion describe el uso de una planta cdc27B en donde dicha modulacion o imitacion de los efectos relacionados con auxina resulta en destino celular alterado de una celula y/o formacion de patrones alteradas en una planta o celula de planta, por ejemplo un aumento en el numero de meristemas de planta o un aumento en el tamaro de meristemas de planta que ocurren en forma natural.
Combinado con la division celular post-embrionica que disminuye esto se puede tomar para sugerir una funcion del gen HBT en la regulacion del ciclo celular. No obstante, favorecemos la hipotesis que el gen HBT tiene una funcion mas especializada que ha divergido de la funcion que las proteinas CDC27 de componentes APC sirven en la progresion del ciclo celular. Esta preferencia se basa en diversas observaciones. Primero, los embriones hbt pueden llevar numerosas rondas de division celular sin problemas severos, que sugiere que el APC Arabidopsis puede mediar la progresion del ciclo celular en la ausencia de la actividad de gen HBT. Segundo, la division celular disminuye solo cuando tambien existen diversos problemas de diferenciacion celular, que resulta entre otros en la perdida de identidad de ciertos tipos de celulas. Tercero, las mutaciones nuc2 en S. pombe resultan en una disminucion de metafase. Aunque la division celular post-embrionica cesa en plantulas hbt esto no esta acomparado por una disminucion de metafase (Hirano et al., 1988, 1990). y finalmente, otros componentes APC con una estructura de proteina similar en Arabidopsis, AtCDC1�, AtCDC23 y AtCDC27a todos muestran patrones de expresion similares. Sus transcriptos estan presentes en un alto nivel en todas las celulas divididas. En contraste, el gen HBT se expresa a un bajo nivel y se acumula solo en la transicion G2/M. Sin embargo consideramos si los defectos provocados por mutaciones en el gen HBT se pueden deber al establecimiento de los objetivos APC no relacionados con la division celular.
Se han identificado los homologos de Arabidopsis de componentes de la ruta proteolitica mediada por ubiquitina en la progresion del ciclo celular y la respuesta de auxina y mutaciones en los genes correspondientes que confieren un amplio rango de defectos de crecimiento, que muestran la funcion central de estos procesos en el desarrollo de planta.
El gen HOBBIT codifica un homologo de un componente APC que parece conectar estos procesos al acoplar la competencia para responder a auxina a la progresion del ciclo celular. Esto es particularmente importante debido a que Hobbit, como un factor de competencia a traves de la hormona de auxina, se restringe a la formacion de patrones solo para dividir las celulas.
Esta invencion esta soportada por los siguientes datos experimentales.
Resultados experimentales
Mutantes hbt que exhiben diversos defectos de diferenciacion celular en la etapa post-embrionica.
En un estudio previo, el primer defecto morfologico detectado en embriones mutantes hbt se muestra que es una interrupcion de la orientacion invariante de planos de division celular en una celula fundadora para el meristema de
raiz, la celula hipofisea (Willemsen et al., 1998). Esto conduce a defectos mofologicos en los tipos de celulas que surgen de esta celula fundadora; el centro inactivo y la columnela. Estos defectos morfologicos estan acomparados por defectos de diferenciacion, debido a que diversos marcadores que se expresan normalmente en estos tipos de celulas, no estan expresados en plantulas hbt (Willemsen et al, 1998).
Esto se determina si los defectos de diferenciacion celular se confinan en estos tipos de celulas distales, o si otras regiones de la raiz tambien tienen defectos de diferenciacion. Por lo tanto, analizamos la actividad del promotor de gen SCARECROW (SCR), visualizado por una construccion que lleva el gen b-glucuronidasa (GUS) fusionado al promotor SCR, en el fondo de mutante hbt (ejemplo 3). EL gen SCR se expresa normalmente en la capa de tejido de suelo de regiones mas proximas de la raiz y en la endodermis (Figura 4B). Como se ilustra en la Figura 4D, existe expresion SCR::GUS en la raiz de plantula hbt, pero solo en la parte distal. En la posicion en donde estaria el centro inactivo de raices tipo natural (demostrado por la construccion QC4�::GUS en la figure 4 A), no existe tincion GUS en el fondo de mutante hbt (Figura 4 C). Por lo tanto concluimos que el defecto de diferenciacion celular distal postembrionico es especifico de region, consistente con un requerimiento especifico para la funcion del gen HBT en la diferenciacion celular dentro del dominio distal del meristema de raiz.
Mientras que los defectos de raiz distal en el mutante hbt ocurren en la region con defectos embrionicos tempranos, otras regiones de la plantula desarrollan defectos de diferenciacion celular post-embrionicamente. La estatura reducida de plantulas hbt sugiere que los defectos de expansion celular ocurren en los mutantes. Las inspeccion mas cercana de los tamaros de celulas y formas de celulas en mutantes hbt revela de hecho las diferencia dramaticas con el tipo natural como se ve por ejemplo en la Figura 5, en donde la exploracion de los EM muestran la superficie irregular de las hipocotiledoneas de plantulas hbt comparado con una plantula tipo natural. Las celulas mutantes tienen tamaro reducido y se hinchan. El meristema apical de brote (SAM) en mutantes hbt contiene un domo de celulas de forma irregular que se dividen inicialmente para dar una cantidad significativa de celulas de progenie. Aunque una zona central unica da primordia de organo cuando flanquea en SAM tipo natural, se inician primordia de organo en posiciones variables en mutantes hbt y esta primordia frecuentemente falla en crecer para dar hojas. Despues de inicio repetido de primordia de organo aberrante, cesa la actividad SAM. En experimentos tempranos se prueba si el fenotipo mutante hbt se puede rescatar mediante tratamiento con diversas hormonas de planta. No se detecta dicho rescate (Willemsen et al., 1998), sin embargo se observa una re-especificacion dramatica de celulas epidermicas en hipocotiledoneas de plantulas hbt que se tratan con etileno. En las hipocotiledoneas de estas plantulas hbt se induce un gran numero de crecimientos ectotopicos, que son fuertemente similares a los capilares de raiz. Con plantulas germinadas en la oscuridad, se obtienen resultados similares.
Los defectos en la regulacion epidermica del destino celular no solo se observan despues de induccion (por ejemplo con etileno), pero la separacion de los sitios tricoblasto y atricoblasto en archivos de celulas en la epidermis de raiz tambien se altera en los mutantes hbt. Una construccion que lleva el promotor del gen GLABRA2 (GL2), implicado en especificacion de atricoblasto, fusionado al gen GUS (Masucci et al., 199�) se cruza en el alelo hbt2311 y en la progenie de este cruce muestra la actividad ectotopica en la epidermis de plantulas hbt. El GL2 codifica una proteina de homeodominio requerida para diferenciacion de atricoblasto, y la expresion se restringe a aquellos archivos de celulas que contienen atricoblastos en la raiz tipo natural. Sin embargo, aunque el patron de expresion es mas o menos similar al patron tipo natural, las celulas de capilares de raiz en mutantes hbt tambien muestran alta actividad del promotor GL2. Nuestros datos sugieren que el gen HBT se requiere para el mantenimiento de la eleccion de diferenciacion celular en las celulas epidermicas.
Aunque los defectos hbt durante embriogenia se confinan regionalmente, los fenotipos post-embrionicos en mutantes hbt son mas diversos, que sugiere que HBT se requiere para diversos procesos de desarrollo.
El gen HBT complementa parcialmente los mutantes nuc2 de levadura.
Para investigar si el HBT y AtCDC27a puede funcionar como un componente del APC, se clonan los cADN de longitud completa en un vector de levadura con un promotor represible tiamina y se transforman en una cepa S. pombe nuc2ts. El cADN HBT parcialmente rescata el fenotipo nuc2 en la temperatura restrictiva, restaurando en forma reproducible el crecimiento a aproximadamente 4 veces mayor densidad comparado con el control de vector vacio (figura 15). La complementacion no se completa como indices de crecimiento y la densidad final son respectivamente 5 y 10 veces menor comparado con la temperatura permisiva (compare Figura 15A y 15B). Concluimos que la proteina HBT tiene la capacidad de interactuar con y puede reemplazar el S. pombe nuc2 en el APC de levadura, consistente con su interaccion propuesta con el complejo de planta de homologo. En contraste, en la induccion de temperatura permisiva de expresion de gen AtCDC27a parece ser toxico en S. pombe (Figura 15A).
Este resultado es una prueba indirecta que el HBT puede ser parte de un complejo APC en levadura.
El HOBBIT es parte del complejo APC en plantas.
La evidencia que cdc27B/HBT es parte del complejo APC en plantas o que es parte de un complejo similar que aun no se ha caracterizado, se genera por inmunoprecipitacion y experimentos de coinmunoubicacion. Estos experimentos se realizan con protocolos estandar (Sambrook and Russel, 2001) y con anticuerpos que reconocen especificamente la proteina Hobbit y proteinas del complejo APC. Con el fin de mejorar la deteccion de la proteina HBT en la coinmunoprecipitacion, se utiliza una proteina HBT marcada con el epitopo y de acuerdo con lo anterior, un anticuerpo que reconoce especificamente este epitopo.
Los mutantes Hbt han alterado la fase S.
Como se demuestra en los experimentos del ejemplo 12 y en la figura 20, los inventores encuentran sorprendentemente que los mutantes hbt tienen un defecto en la fase S del ciclo celular. Las celulas de hipocotiledoneas del mutante hbt tienen un contenido nuclear mayor en los picos 2C y 4C (que corresponde de manera general a la fase G1 y G2 respectivamente) que las celulas tipo natural y no existe separacion clara entre la etapa 2C y la etapa 4C como en las celulas WT. En esta transicion las celulas parecen tener una variedad de la cantidad de ADN. Estos resultados demuestran claramente que los mutantes hbt tienen problemas con la progresion correcta de la fase S. Por lo tanto los inventores concluyen que el hbt se necesita para una terminacion exitosa de la fase S, posiblemente a traves de la funcion en el APC o un complejo similar a APC. Aparentemente la proteina HOBBIT cumple una funcion como un modulador de progresion de fase S. Este es el primer momento que se demuestra que el cdc27B/ HOBBIT esta implicado en la replicacion de ADN. Es sorprendente, que los inventores son capaces de demostrar un primer enlace entre la proteina cdc27B/HOBBIT y el APC.
Se conoce bien por la persona experta en la tecnica que un contenido de ADN aumentado en celulas de planta puede ser una indicacion para endoreduplicacion. Esto ocurre cuando existe replicacion de ADN sin mitosis sucesiva y etapa de citoquinasis. La endoreduplicacion en semillas es particularmente interesante para la industria de la agrobiotecnologia, debido a que es una forma de mejorar el contenido de semilla y por lo tanto calidad de semilla.
Analisis de expresion de gen HBT.
Para evaluar si la distribucion del transcripto HBT proporciona claves en sus funciones diversas en el desarrollo, analizamos la distribucion del mARN HBT mediante hibridacion in situ (ejemplos 4 y 7). Los transcriptos HBT se detectan en niveles similares en todos los organos de la planta, tambien en el meristema de raiz, pero en cantidades mas pequeras.
En los experimentos de hibridacion in situ, las sondas sintetizadas de diferentes regiones de cADN (vease ejemplo 7) dan resultados similares. Los datos mostrados en la figura 1� se obtienen de sondas que corresponden a la region 5', que contiene la secuencia unica. Las sondas codificantes se toman a lo largo del control y esta seral no se detecta sobre el fondo. La distribucion del transcripto HBT varia durante diferentes etapas de embriogenia y tambien entre las celulas dentro de un embrion (Figura 1�A-D). Hasta la etapa triangular, solo una seral baja es detectable en la mayoria de celulas embrionicas. A partir del inicio de la etapa clave temprana el nivel de expresion es mayor en celulas particulares. La distribucion puntiforme y estocastica de estas celulas con mayores niveles de mARN HBT sugiere que la expresion se eleva en una fase especifica del ciclo celular. La co-ubicacion de los transcriptos HBT y AtCYCB2 en secciones unicas de embriones en etapa tardia revelan que ocurre acumulacion de transcripto HBT pico en las mismas celulas que acumulan el mensaje AtCYCB2 (Figura 1�J-L), que sugiere que la transcripcion HBT alcanza niveles maximos de fase G2/M.
Debido a que la secuencia HBT muestra alta homologia con AtCDC27, comparamos los patrones de expresion de ambos genes. La abundancia de mARN AtCDC27 es altamente ubicua durante todas las etapas embrionicas (Figura 1�G-I). Este patron de expresion contrasta con el patron puntiforme y bajo de HBT. El AtCDC1� exhibe niveles de transcripto ubicuos y altos similares (Figura 11).
Tambien localizamos los transcriptos HBT y AtCDC27 en plantulas jovenes. Las secciones de raices que hibridan con HBT muestran de nuevo expresion puntiforme solo en las celulas activamente divididas (Figura 1�M-O). Las hibridaciones in situ con la sonda HBT en otras partes de las plantas, tal como flores y sitios de inicio de raiz lateral que muestra resultados similares (datos no mostrados). Los niveles de transcripto AtCDC27 (Figura 12D, 1�P-R) y AtCDC1� (Figura 12 C) son uniformemente altos en todas las celulas divididas.
En estirpes que segregan el alelo hbt fuerte 2311, no se observa diferencia en el nivel de expresion o patron entre los embriones mutantes y tipo natural (compare Figura 1�D y E) que sugiere que durante funcion HBT de embriogenia no se requiere para la regulacion de su propia transcripcion.
Sensibilidad de auxina de plantulas hbt
Aunque los experimentos tempranos revelan que las plantulas hbt pueden codificar la auxina (IAA; Willemsen et al., 1998), las pruebas estandar en este momento no pueden revelar cambios en la respuesta de auxina en mutantes hbt. Sin embargo, han emergido nuevos metodos para detectar las respuestas de auxina, por ejemplo con elementos de promotor de respuesta a auxina sinteticos que unen los factores de transcripcion ARF, tal como DR5::GUS (Ulmasov et al., 1997). Debido a que tambien existe una semejanza del fenotipo de embrion temprano hbt a mutantes axr�, bdl y mp (Hardtke and Berleth, 1998; Hamann et al., 1999; Hobbie et al 2000), utilizamos la construccion DR5:: GUS para volver a investigar las respuestas de auxina en plantulas hbt. En raices de plantula tipo natural existe un maximo de tincion DR5::GUS en la parte superior de la columnela (Figura 17A). Este pico esta ausente en plantulas hbt (Figura 17F) en donde no es visible la tincion GUS. Debido a que la especificacion de las celulas de columnela es defectuoso en plantulas hbt, esperamos saber si las celulas mutantes hbt son capaces de codificar auxina. Por lo tanto, se incuban plantulas hbt durante 3 dias en medio que contiene diferentes concentraciones de la auxina sintetica 2,4 D, y se analiza la expresion DR5::GUS. En bajas concentraciones de 2,4 D aplicado (5.10-9 M hasta 5.10-8 M; Figura 17B y 17C) existe una expresion ectopica del promotor DR5:: GUS en el meristema de las raices tipo natural. En estas concentraciones no existe tincion observada en plantulas hbt (Figura 17G y H). Solo en una concentracion de 5.10-7 M 2,4 D existe un pico DR5 en el polo de raiz de hbt, cuando la expresion en la raiz tipo natural ya es muy intensa y a traves de la raiz completa (Figura 17D y 17I). A 5.10-M 2,4 D las tinciones DR5::GUS muestran una situacion diferente. Aunque nunca observamos ninguna expresion ectopica DR5 en las hipocotiledoneas de plantulas tipo natural, las hipocotiledoneas hbt muestran una expresion DR5 fuerte (Figura 17E y 17J). La aplicacion del acido acetico indol (IAA) con las mismas concentraciones da resultados similares. La expresion DR5::GUS en embriones hbt no muestra diferencias comparado con el tipo natural, tampoco despues de induccion 2,4 D. Tomaos juntos, estos datos sugieren que aunque las celulas en la plantula hbt pueden codificar la auxina, lo hacen con una eficiencia diferente. Por lo tanto es posible que el gen HBT tenga una funcion en la percepcion de niveles auxina.
hbt y axr31-T muestra una interaccion genetica
Las mutaciones que estabilizan la proteina AXR3 exhiben especificacion reducida de columnela y baja pero actividad DR5::GUS correctamente localizada (Sabatini et al., 1999). En plantulas hbt la especificacion de columnela y actividad DR5::GUS tambien se reducen fuertemente o estan ausentes, que sugiere que el AXR3 se puede estabilizar en el fondo de mutante hbt. Para investigar si estos defectos hbt requieren la proteina AXR3 funcional cruzamos el alelo hbt2311 a un alelo de insercion de axr3-1, designado, axr3-1 T (ejemplo 10). Aunque este alelo es un alelo presuntivamente nulo el transposon se inserta en el primer exon no tiene el fenotipo mutante. En la generacion F2 de este cruce, las hipocotiledoneas de los dobles hbt2311 axr3-1T tienen una hipocotiledonea mayor comparado con el mutante hbt2311 unico (Figura 18A). Las mediciones de longitud celular epidermica muestran que las diferencias en longitud de hipocotiledonea entre los mutantes dobles hbt2311 axr3-1T y los mutantes unicos hbt2311 se deben a una elongacion de celula aumentada (Figura 18C). Las hipocotiledoneas axr3-1 mutantes muestran una elongacion reducida solo cuando las plantulas se germinan en la oscuridad, provocado por una reduccion en el tamaro de la celula (Leyser et al., 199�). Las hipocotiledoneas de plantula mutante unica hbt2311 y las hipocotiledoneas mutantes dobles hbt2311 axr3-1T germinados en la oscuridad, sin embargo no muestran una reduccion, pero un aumento en la longitud de la hipocotiledonea (Figura 18B). De nuevo, este aumento en la longitud de la hipocotiledonea se debe a un aumento en el tamaro celular (Figura 18C). No se observan diferencias en los tamaros de hipocotiledoneas para el mutante unico axr3-1T, ni para plantulas con genotipos heterocigotos (datos no mostrados). Tambien observamos evidencia preliminar para el rescate del crecimiento de raiz y especificacion del tipo celular de columnela en mutantes dobles hbt2311 axr3-1T (datos no mostrados). Juntos, estos resultados muestran que el mutante axr3-1 y el mutante hbt interactuan ente si en un nivel genetico, que restaura parcialmente los defectos de elongacion observados para hipocotiledoneas hbt y probablemente diversos otros defectos. Por lo tanto postulamos que el HBT regula la estabilidad de la proteina AXR3.
Los mutantes HBT contienen mayores niveles de proteina ARX3
Los inventores muestran por primera vez existe de hecho una estabilizacion de la proteina ARX3 en mutantes hbt. Esto se muestra indirectamente por medio de tincion GUS (ejemplo 3, figura 7). Se hacen estudios adicionales con experimentos PT-PCR en plantas mutantes hbt y tipo natural (ejemplo 11). En la figura 19 A se demuestra que en los mutantes hbt el transcripto no se regula por aumento acertadamente comparado con el nivel de transcripto de ARX3 en elWT. Por el contrario, un nivel inferior del transcripto ARX3 se demuestra en el fondo de mutante hbt.
En un segundo experimento (figura 19B y ejemplo 11), el nivel de proteina ARX3 en la planta tipo natural y en tres mutantes hbt diferentes se revela por SDS-PAGE de extractos de planta seguido por Western blot e inmunotincion. Mientras que la planta tipo natural no se detecta la proteina ARX3, esta presente una seral clara ARX3 en todos los extractos de los mutantes hbt.
En un tercer experimento (figura 19C, ejemplo 11) se demuestra que la proteina reconocida por el suero anti ARX3 es de hecho la proteina ARX3 correcta. Esto se prueba por el hecho que la seral de ARX3 de los mutantes hbt se puede eliminar de nuevo al cruzar los mutantes con la planta arx3GT3958. Esta planta tiene una mutacion en el gen
ARX3 y no tiene expresion de la proteina ARX3. En estas plantas cruzadas, no se puede detectar o se detecta poca proteina ARX3 con el antisuero ARX3 (figura 19C).
Identificacion de otros objetivos de HOBBIT
Por medio de los proteomicos, que comparan el perfil de proteina de plantas Arbadospis tipo natural y los mutantes hbt, se pueden identificar manchas de proteina en geles 2-D que difieren entre el tipo natural y el mutante mediante su presencia/ausencia o mediante su intensidad. Estos posibles objetivos se caracterizan adicionalmente mediante espectrofotometria.
Tambien se realiza un experimento de dos hibridos, utilizando cdc27B/HOBBIT como una proteina de cebo con el fin de identificar otros objetivos o interactuar con proteinas de HOBBIT. Adicionalmente, tambien los alelos mutantes hbt se utilizan en la deteccion de Dos Hibridos con el fin de mapear los dominios funcionales de la proteina HOBBIT y para identificar las regiones en las proteinas en donde los patrones que interactuan de HOBBIT se unen.
Sin estar limitado por la teoria o modo de accion, se puede prever facilmente que el gen HOBBIT/HBT/AtCDC27B que regula el desarrollo de la planta de la invencion esta implicado en la modulacion del destino celular y/o la regulacion del patron de celula en tejidos meristematicos. Esta declaracion se basa en las aberraciones fenotipicas de plantulas A. thaliana de mutante hbt y combinacion de estos datos con el patron de expresion irregular del gen HBT y la estabilizacion de la proteina de fusion AXR3-GUS.
Mas especificamente, aunque el HBT se expresa probablemente en una forma dependiente del ciclo celular, la modulacion del destino celular y/o patron a traves de HBT probablemente se basa en la modulacion de los objetivos regulados del ciclo no celular o seral tal como AXR3. Sin embargo, las decisiones de destino celular y/o la formacion de los patrones de celulas se toman probablemente en celulas divididas. Como tal, las plantas pueden restringir la modulacion del destino celular y/o la regulacion de la formacion de patrones celular para tejidos meristematicos.
Adicionalmente, y de nuevo sin estar limitado por ninguna teoria o modo de accion, la observacion de mutaciones en el gen HOBBIT/HBT/AtCDC27B que afecta la estabilidad de las proteinas de control de ciclo celular, como se ejemplifica mediante la estabilizacion de CYCB1-GUS, es indicador de una funcion de HOBBIT/HBT/AtCDC27B en la regulacion del ciclo celular. El patron irregular inesperado de la expresion de gen HOBBIT serala adicionalmente una funcion especializada de HOBBIT en la regulacion del ciclo celular.
Otra teoria o modo de accion para el gen HOBBIT/HBT/AtCDC27B, de nuevo sin estar limitado por esto, se relaciona con la estabilizacion de la proteina de fusion AXR3-GUS. Esta observacion destaca la funcion de HOBBIT en mediar los efectos relacionados con auxina.
La especificacion describe el uso de cdc27B para modificar el destino celular y/o la formacion de patrones y/o desarrollo de planta y/o morfologia de planta y/o bioquimica de planta y/o fisiologia de planta que comprende la modificacion de expresion en celulas particulares, preferiblemente celulas ciclicas, en particular dominios, tejidos o organos de una planta, preferiblemente que comprende celulas ciclicas, de una secuencia genetica que codifica una proteina que regula el desarrollo de la planta, preferiblemente una proteina que regula el desarrollo de la planta se codifica por un acido nucleico de la invencion vinculado funcionalmente a una secuencia promotora operable de planta.
Cuando se hace referencia aqui a "el uso de cdc27B" significa el uso de una proteina cdc27B asi como tambien el uso de un que codifica cdc27B. El termino proteina cdc27B contempla claramente aqui cualquier homologo, derivado, fragmento funcional o fragmento inmunologicamente activo de una proteina cdc27B. Adicionalmente en realizaciones particulares, cdc27b es cdc27B de planta. En una realizacion adicional de la invencion, la proteina que regula el desarrollo de la planta es una proteina HOBBIT/ HBT/CDC27B de acuerdo con la invencion, tal como por ejemplo, la proteina A. thaliana HOBBIT/HBT/AtCOC27B. Tambien se describe un homologo biologicamente activo o derivado del mismo. La presente especificacion contempla claramente el uso de homologos funcionales de proteina que regula el desarrollo de la plantas de acuerdo con la presente invencion. De acuerdo con lo anterior, la presente invencion no esta limitada en aplicacion al uso de la secuencia de nucleotidos que codifica la proteina A. thaliana que regula el desarrollo de la planta. Se puede esperar que los genes y proteinas similares a una definido aqui como
A. thaliana estan presentes en otras especies de planta y se pueden aislar por medio de tecnicas conocidas en el arte. Tambien mutantes de eliminacion, que carecen de uno o mas aminoacidos comparado con la secuencia de aminoacidos como se define en la presente solicitud, se consideran como homologos. Estos genes similares tambien estan dentro del alcance de la presente invencion como se define en las reivindicaciones.
Por lo tanto el uso de cdc27B como se indica aqui se puede lograr mediante la modificacion del nivel expresion de un gen cdc27B en una celula por ejemplo mediante expresion ectopica, la regulacion por disminucion de la expresion, que controla la secuencia endogena etc.
Alternativamente el uso de cdc27B como se indica aqui se puede lograr al influenciar el nivel de actividad de proteina en la celula por ejemplo mediante la administracion de la proteina cdc27B, al utilizar agentes de bloqueo cdc27B etc.
La modulacion de la expresion en una planta de una proteina que regula el desarrollo de la planta o un homologo o derivado del mismo como se define en la especificacion actual tal como una proteina cdc27B puede producir un rango de fenotipos deseables en plantas, tal como, por ejemplo, al modificar una o mas caracteristicas de desarrollo, morfologicas, bioquimicas, o fisiologicas que incluyen: (i) modificar la longitud del G1 y/o S y/o G2 y/o la fase M del ciclo celular de una planta; (ii) modificar la fase G1/S y/o S/G2 y/o G2/M y/o M/G1 de transicion de una celula de planta; (iii) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de la division celular; (iv) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de replicacion de ADN; (v) modificacion del tamaro de celula; (vi) modificar del inicio, promocion, estimulacion o mejora de semilla y/o tamaro de semilla y/o desarrollo de semilla; (vii) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de formacion de tuberculos; (viii) modificacion del numero de tuberculos; (ix) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de la formacion de frutos; (x) modificar el numero de frutos; (xi) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de formacion de hojas; (xii) modificar el numero de hojas; (xiii) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de inicio y/o desarrollo de brotes; (xiv) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de inicio y/o desarrollo de raiz; (xv) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora del inicio y/o desarrollo de raiz lateral; (xvi) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de formacion de flores; (xvii) modificar el momento del florecimiento; (xviii) modificar del numero de flores; (xix) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de formacion de nodulo y/o funcion de nodulo; (xx) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de la frondosidad de la planta; (xxi) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de enanismo en la planta; (xxii) modificar el inicio, promocion, estimulacion o mejora de senescencia; (xxiii) modificar el espesor del tallo y/o las caracteristicas de resistencia y/o resistencia del tallo al viento y/o longitud del tallo; (xxiv) modificar la tolerancia y/o resistencia al estres biotico tal como infeccion por patogenos; (xxv) modificacion la tolerancia y/o resistencia al estes abiotico tal como estres de sequia o estres por salinidad; (xxvi) imitar o modificar las respuestas relacionadas con auxina; (xxvii) modular las respuestas tropicas de las plantas; (xxviii) modular la vascularizacion de las plantas, organos de planta o tejidos de planta; (xxix) modificar la respuesta de evasion de tono.
Una persona experta en la tecnica reconocera que las auxinas estan implicadas entre otros en la formacion de patrones. De acuerdo con lo anterior, en otro ejemplo el efecto relacionado con auxina define el destino celular y/o la formacion de patrones.
La presente invencion tambien se relaciona con un metodo para la produccion de plantas transgenicas, celulas de planta o tejidos de planta que comprende la introduccion de una molecula de acido nucleico de la invencion en un formato que se puede expresar o un vector como se definio anteriormente en dicha planta, celula de planta o tejido de planta. Se hace referencia al ejemplo 5 y otras partes de la descripcion para la descripcion del formato que se puede expresar del gen y vector.
Los metodos para efectuar la expresion de una proteina que regula el desarrollo de la planta tal como la proteina cdc27B de planta, o un homologo o derivado de la misma como se describe en la especificacion actual en una celula de planta, tejido u organo, incluye la introduccion de la proteina directamente dentro de dicha celula, tejido u organo tal como mediante microinyeccion de medios balisticos o, alternativamente, la introduccion estable de una molecula de acido nucleico aislado que codifica dicha proteina en un formato que se puede expresar dentro del genoma de una celula de planta. Por lo tanto, dicho acido nucleico se puede ligar funcionalmente a una o mas secuencias de control o se puede integrar en un vector de acuerdo con la invencion y/o se puede integrar establemente dentro del genoma de una celula de planta.
Los metodos para efectuar la expresion de una proteina que regula el desarrollo de la planta tal como la proteina cdc27B de planta, o un homologo o derivado de la misma como se define en la especificacion actual en plantas completas incluyen la regeneracion de las plantas completas de dichas celulas transformadas en las que se introduce una molecula de acido nucleico aislado que codifica dicha proteina en un formato que se puede expresar.
La invencion tambien se relaciona con celulas de planta y plantas que comprende cualquiera de los acidos nucleicos
o vectores de la presente invencion.
Adicionalmente, la presente invencion se extiende claramente a cualquier celula de planta o planta producida por cualquiera de los metodos descritos aqui, y a todas las partes de planta y propagulos de los mismos como se define en las reivindicaciones. La presente invencion se extiende adicionalmente para abarcar la progenie derivada de una celula primaria transformada o transfectada, tejido, organo o planta completa que se ha producido por cualquiera de dichos metodos, el unico requerimiento es que dicha progenie exhiba las mismas caracteristicas genotipicas y/o genotipicas como aquellas caracteristicas que se han producido en el progenitor mediante el desempero de cualquiera de dichos metodos. La invencion tambien se extiende a partes cosechables de una planta, como se reivindica tal como pero no limitado a semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas, tuberculos y bulbos.
La especificacion comprende metodos para imitar o modular las respuestas relacionadas con auxina mediante el uso de cdc27B. Dentro del alcance de la especificacion esta el uso de cdc27b para conectar la progresion del ciclo celular y las serales de patrones, mas particularmente la competencia para responder a auxina. Sin embargo la especificacion comprende el uso de un componente regulado con el ciclo celular, preferiblemente cdc27B, para confinar la competencia para responder a la seral de patron en el meristema. De acuerdo con lo anterior, el uso de cdc27B es la expresion modificada en celulas particulares, preferiblemente en celulas ciclicas, en particular dominios, tejidos o organos de una planta, preferiblemente que comprende celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o un homologo o derivado de la misma como se define en la especificacion, ligado a un promotor especifico de celula, especifico de tejido o un promotor operable de planta especifico de organo. La ventaja de imitar o modular las respuestas relacionadas con auxina por medio de la expresion modificada de dicho gen que regula el desarrollo de la planta o el producto de gen comprende el hecho que imitar o modular la respuesta relacionada con auxina se puede limitar a las celulas, preferiblemente celulas ciclicas, en las que se expresa dicho gen o producto de gen. Esto no es verdadero en el caso de aplicacion de auxina topica que provoca los efectos pleiotropicos debido al transporte de auxina posterior a traves de la planta en la direccion basal.
Imitar un efecto relacionado con auxina, significa llevar a cabo un efecto que se puede establecer por auxina. Imitar los efectos relacionados con auxina puede tener lugar en la presencia o ausencia de auxina. Imitar los efectos relacionados con auxina tambien puede significar modular la competencia de las celulas que no pueden responder normalmente a auxina, preferiblemente se utiliza para aumentar esta competencia.
La especificacion describe adicionalmente la modulacion o imitacion de un efecto relacionado con auxina se basa en la modulacion de la estabilidad de las proteinas reguladoras de serales de patron. Estas serales de patron incluyen hormonas de planta tal como auxina, etileno y otras. Mas particularmente, depende de la modulacion de los reguladores de auxina o incluso mas, la modulacion de la estabilidad de la clase AUX/IAA de los reguladores transcripcionales de auxina. Adicionalmente, depende de la estabilidad de la proteina reguladora ARX3. Este tipo de proteinas se degradan en una fase particular del ciclo celular, tal como la fase de transicion G2-M.
La auxina es una hormona de planta pleiotropica y por lo tanto el resultado de modular o imitar los efectos relacionados con auxina se ejemplifica, pero no se limita a los siguientes ejemplos. Para otros efectos relacionados con auxina se hace referencia a la literatura cientifica en el campo y conocida por la persona experta en la tecnica.
Una serie de ejemplos de la especificacion actual preve la expresion ectopica de un gen HOBBIT que regula el desarrollo de la planta, por ejemplo un gen de planta cdc27b, por ejemplo como se define en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 3 o el producto de gen como se define en SEQ ID NO 8 o 9 o un homologo o derivado del mismo como se define supra en celulas particulares o especificas, dominios, tejidos o organos de meristemas de planta que se espere mejore la competencia de dichas celulas, dominios, tejidos o organos para responder a serales que definen el destino celular y/o la formacion de patrones. La formacion de tejidos o organos novedosos y/o una disposicion novedosa (con relacion a plantas que exhiben patrones de expresion de gen natural HBT) por lo tanto puede ser el resultado. Ejemplos ilustrativos incluyen alterar el numero de flores y la disposicion floral como el resultado de la incorporacion de celulas no divididas en el meristema y/o la formacion de patrones; alterar los patrones de ramificacion de tallo al cambiar el tamaro del grupo celular competente para el crecimiento local; o alterar los patrones de ramificacion de raiz al cambiar la distribucion y el tamaro de primordia de raiz lateral. Adicionalmente se puede prever que la expresion ectopica de un gen HOBBIT (por ejemplo el gen de planta cdc27) a traves del ciclo celular, y asi no se restringe en la expresion especifica del ciclo celular natural, mejorara adicionalmente las decisiones del destino celular y las respuestas de patron. Los requerimientos de los promotores operables de planta para lograr las realizaciones mencionadas adelante se pueden determinar facilmente por el artesano experto quien tambien sera capaz de seleccionar un promotor operable de planta adecuado. Una lista no exhaustica ilustrativa de promotores operables de planta que posiblemente se puede utilizar se incluye adicionalmente en la presente invencion.
La especificacion describe un metodo para alterar, preferiblemente aumenta, el tamaro de meristemas de planta que ocurren en forma natural mediante la expresion ectopica del gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen, tal como un gen cdc27B o producto de gen (o proteina), o un homologo o derivado del mismo como se define en la descripcion. En este caso, los promotores adecuados para controlar la expresion de dicho gen que regula el desarrollo de la planta o el producto de gen incluyen por ejemplo un promotor especifico meristema o un promotor activo en celula periferica a dicho meristema. Como resultado de esto, el numero de organos emanado y/o el indice de emanacion de organo de dicho meristema se puede modificar, preferiblemente aumenta. La presente especificacion asi tambien describe un metodo para modificar, preferiblemente aumentar, el numero de organos y/o el indice de emanacion de organo del meristema de planta mediante la expresion ectopica de de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o un homologo o derivado de la misma como se define en la descripcion. De nuevo, dicho gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen se puede unir funcionalmente a los promotores tal como de un meristema de promotor especifico o un promotor activo en celulas perifericas para dicho meristema.
Se describe adicionalmente un metodo para aumentar el numero de meristemas de planta mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o un homologo o derivado de la misma como se describe bajo el control de un promotor constitutivo, especifico de celula, especifico de tejido, especifico de organo o promotor operable de planta inducible. Los organos ectopicos preferiblemente emergeran de celulas ciclicas.
Como resultado de esto, se puede inducir la formacion de organo ectopico partiendo de todas las partes de planta en el caso de un promotor constitutivo, o de dicha celula, tejido u organo en donde dicho promotor operable o en una forma aleatorio en el caso de utilizar un promotor operable de planta inducible.
Las aplicaciones utiles de dichos metodos incluyen el aumento del numero de flores en una planta que es un rasgo deseable en por ejemplo plantas ornamentales u horticolas, por ejemplo para aumentar la eficiencia de la produccion de flores de corte o para crear variedades de flor abundantes. Una distribucion mas favorable de flores a lo largo del eje apical-basal de la planta tambien se puede efectuar. El tiempo de florecimiento acortado en el caso por ejemplo produccion de flor de corte puede mejorar adicionalmente la productividad como mas rondas de cosecha se permiten en una estacion de cultivo unica. El aumento del numero de flores tambien puede encontrar su uso en la agricultura como el numero de flores y la produccion de semilla se correlacionan. El tiempo de florecimiento acortado puede aumentar adicionalmente la produccion de semilla al permitir mas series de cosecha durante una unica estacion de siembra.
Otras aplicaciones utiles de dichos metodos incluyen aumentar el numero de hojas que es un rasgo particularmente deseado en la produccion de por ejemplo forraje o cultivos forrajeros, los cultivos producidos para ser ensilados o de cultivos de leguminosas. El aumento del numero de hojas de pastos es deseable para tierras de pasto asi como tambien para cespedes.
La especificacion describe el uso de una planta cdc27 para modular o imitar los efectos relacionados con auxina en una planta o celula de planta en donde dicha modulacion o imitacion resulta en una modificacion de, por ejemplo un aumento, en el numero de organos o tejidos, y/o modificacion del indice de emanacion de organo o tejido de un meristema de plantas, y/o una modificacion de la disposicion de organos y/o tejidos en una planta. Todavia otras aplicaciones utiles de dichos metodos incluyen la activacion de meristemas y/o el aumento del numero de meristemas que forma por ejemplo frutos, tuberculos o bulbos o la activacion de meristemas que forman por ejemplo remolacha, nabo, rabano etc. Sin embargo se pueden obtener mas bulbos o tuberculos o frutos mas grandes, remolacha, nabos o rabano etc. La especificacion actual asi claramente tambien describe un metodo para aumentar la produccion de planta mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, del gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o un homologo o derivado de la misma como se describe en la especificacion, ligado a un promotor operable de planta. La produccion se define por lo tanto como la cantidad de organos producidos que incluyen semillas, hojas, bulbos, tuberculos, remolacha, nabos o rabano etc.
Por lo tanto, la especificacion describe el uso de una planta cdc27B para imitar o modular los efectos relacionados con auxina que resulta en un aumento de produccion de la planta.
La activacion de lateral del meristema de raiz y/o el aumento del numero de lateral del meristema de raiz bajo condiciones de por ejemplo deprivacion de nutrientes puede ayudar a una planta a explorar activamente el suelo para nuevas fuentes de nutrientes. La especificacion describe tambien un metodo para mejorar el indice de supervivencia de las plantas bajo condiciones limitantes de nutrientes mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o a homologo o derivado del mismo como se describe. Preferiblemente se selecciona un promotor expresable de raiz, preferiblemente inducible por limitacion de nutrientes, para lograr dicho indice de supervivencia mejorado.
Otras respuestas relacionadas con auxina incluyen respuestas tropicas tal como gravitropismo y fototropismo. Mejorar la respuesta gravitropica puede ayudar a una planta en dirigir la penetracion profunda de sus raices en el suelo en la busqueda de agua, por ejemplo bajo condiciones de sequia. Mejorar la respuesta fototropica puede ayudar a una planta en por ejemplo la emergencia temprana de la plantula por encima del suelo bajo condiciones de luz baja o en por ejemplo re-establecimiento rapido de la capacidad fotosintetica al exhibir las hojas por encima de la superficie acuosa de los campos flotantes. Sin embargo se describen metodos para mejorar el indice de supervivencia de las plantas bajo condiciones de sequia mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o un homologo o derivado de la misma como se describe y para mejorar la emergencia de plantulas mediante la expresion ectopica de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o un homologo o derivado de la misma como se describe. Los promotores inducibles de luz o sequia, respectivamente, son buenos candidatos para ser ligados funcionalmente a dicho gen de regulacion de desarrollo de planta o producto de gen.
La especificacion describe el uso de una planta cdc27B para imitar o modular los efectos relacionados con auxina que resulta en un indice de supervivencia aumentado de plantas, por ejemplo bajo condiciones de sequia.
La formacion de raiz inducida por auxina frecuentemente se utiliza en la regeneracion de plantas transgenicas tambien se puede imitar o mejorar mediante una presion ectopica a tiempo, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen de regulacion de desarrollo de planta o producto de gen como se describe. Se describe aqui un metodo para imitar o mejorar la regeneracion de raiz en protocolos de cultivo de tejido mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o un homologo
o derivado de la misma como se describe en la especificacion en la ausencia o presencia, respectivamente, de una fuente exogena de auxina.
La especificacion tambien describe el uso de una planta cdc27B para imitar o modular los efectos relacionados con auxina que resulta en la imitacion de generacion de raiz en plantas.
Otras respuestas relacionadas con auxina incluyen la respuesta de evasion de tono. Los efectos de tono de dosel incluyen conjunto reducido de semillas, desarrollo truncado de frutos y germinabilidad de semilla reducida. La auxina se ha implementado en el establecimiento de respuesta de evasion de tono (Morelli and Ruberti 2000, y referencias citadas alli). Se puede prever un metodo con el cual la respuesta de evasion de tono se mejora mediante la expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen o un homologo o derivado de la misma como se describe en la especificacion. Preferiblemente, se utiliza un promotor inducible de luz roja lejana (FR) para permitir dicho metodo e incluso mas preferiblemente, un promotor inducido por cambios en la relacion de luz roja a FR (R), por ejemplo el promotor del gen Arabidopsis Athb-2 homeosecuencia (Carabelli et al. 199�).
La especificacion describe el uso de una planta cdc27B para imitar o modular los efectos relacionados con auxina que resulta en una respuesta de evasion de tono aumentada.
Todavia otra respuesta relacionada con auxina incluye el establecimiento de hebras vasculares continuas basales de fuentes auxina (por ejemplo Worley et al. 2000 y referencias citadas alli). La imitacion de efectos de auxina en por ejemplo una forma aleatoria o al aumentar el numero de meristemas que inician ramas en por ejemplo tallos de arbol puede establecer un sistema vascular completo. Dichos tallos son de interes para por ejemplo carpinteros para la produccion artesanal de muebles que contienen tablas de madera o estantes que muestran el patron vascular exclusivo. Dichos tallos tambien son de interes para propositos de recubrimiento. El establecimiento de una nueva vasculatura es por supuesto tambien imperativo para el desarrollo apropiado de cualquier nuevo organo descrito. Sin embargo, se describe un metodo para la alteracion, preferiblemente la estimulacion, de la formacion de hebras vascular y patron mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen tal como una planta cdc27b gene o producto de gen, o un homologo o derivado de la misma como se describe.
Otra respuesta relacionada con auxina se relaciona con la produccion de frutos partenocarpicos. Las plantas de tabaco, berenjena y tomate que expresan el IAA (acido indol acetico, la auxina de planta principal) del gen biosintetico iaaM de Pseudomonas syringae pv savastanoi de hecho produce frutos partenocarpicos comercializables (Ficcadenti et al. 1999, Rotino et al. 1997). Por lo tanto, tambien se describe un metodo para producir frutos partenocarpicos mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, utilizando un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen, tal como una planta cdc27b, o un homologo o derivado de la misma como se define en la especificacion.
Sera claro para el artesano experto que muchos, si no todos, de los metodos descritos anteriormente se benefician de y se mejoran mediante la funcion de HBT en el ciclo celular. Por lo tanto se describe el uso de cdc27b en la regulacion del ciclo celular. Debido a que se demuestra por los inventores que el gen HOBBIT participa en un complejo como APC, se describe el uso de cdc27B para modular la actividad de un complejo como APC. Con un complejo como Apc significa un complejo de proteina, funcional en una cierta etapa del ciclo celular (por ejemplo en la transicion G1/S y/o G2/M) que se involucra en el etiquetado de las proteinas (es decir las proteinas de ciclo celular
o proteinas de no ciclo celular) para la degradacion de la proteina. El complejo APC se sabe que es activo en ambas fases de transicion y esta implicado en la degradacion de las proteinas de ciclo celular como ciclina B. La expresion de gen HBT muestra un pico en la transicion G2/M y la proteina tambien esta implicada en la estabilidad de proteinas de no ciclo celular. Por lo tanto como se describe, el ciclo celular se regula por cdc27B en la transicion de fase G2/M. A partir de sus datos experimentales, los inventores pueden concluir que HOBBIT esta implicado en la progresion correcta de la fase S del ciclo celular y por lo tanto se describe el uso de cdc27B para modular la replicacion de ADN. Adicionalmente, se sabe que se reconoce por el artesano que la replicacion mejorada de ADN sin mitosis consecuente y citoquinesis puede resultar en endoreduplicacion. La mitosis se puede bloquear al prolongar la vida util de las proteinas de ciclo celular como ciclina B. El uso de cdc27b para modular la endoreduplicacion en una planta se describe aqui. Finalmente, cuando la replicacion de ADN se bloquea en tejidos especificos, por ejemplo en los gamatocitos una persona experta en la tecnica puede inducir esterilidad en plantas. De acuerdo con lo anterior, se describe el uso de cdc27B para modular, por ejemplo inducir esterilidad en plantas.
Al afectar negativamente la vida util de por ejemplo ciclinas mitoticas tal como ciclina B1, es claro que por lo menos la transicion de la fase M a una fase G1 posterior se acorta. Sin embargo, el indice de division celular se afecta positivamente mediante expresion HBT ectopica que contribuye, como se menciono, a muchos de los metodos descritos supra. De acuerdo con lo anterior, la especificacion describe un metodo para mejorar o aumentar el ciclo celular o el indice de division celular mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen, por ejemplo un gen de planta cdc27B o producto de gen, o un homologo o derivado de la misma como se describe. La mejora o aumento del ciclo celular significa empujar las celulas en el ciclo celular o aumentar la poblacion de celulas que se dividen.
Cuando se afecta la actividad del meristema apical por ejemplo es posible efectuar una reduccion en el numero de organos laterales que emanan de dicho meristema y/o reducir el indice de formacion de organo lateral.
Por lo tanto, la especificacion describe el uso de una planta cdc27B para la regulacion del ciclo celular que resulta en una activacion o alteracion, por ejemplo un aumento en el tamaro, de meristemas de planta que ocurren en forma natural, o que resulta en un aumento en el numero de organos o tejidos, y/o modificacion del indice de emanacion de organo o tejido del meristema, y/o una modificacion de la disposicion de organos, y/o tejidos en una planta.
Las aplicaciones utiles incluyen la creacion de variedades de planta enanas. Otra aplicacion se relaciona con la abrogacion de por ejemplo adaptabilidad de meristema de brote lateral de tomate. Como resultado no se forman brotes adventicios y no se requiere mas poda manual.
Sin embargo, se describe un metodo para reducir la adaptabilidad o actividad de meristemas de planta naturales mediante la regulacion por disminucion de la expresion, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen, tal como un gen de planta cdc27B o producto de gen, o un homologo o derivado de la misma como se describe o mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de mutantes de dicho gen de regulacion de desarrollo de planta o producto de gen . Ejemplos de dichos mutantes se describen en la invencion y sus secuencias se representan en la SEQ ID NOs 10 a 23 (secuencias de acidos nucleicos) y SEQ ID NOs 24 a 30 (secuencia de aminoacidos).
El fenotipo de hinchazon de celulas epidermicas en plantulas A. thaliana de mutante hbt tambien se puede explotar. Los tejidos de planta o organos que consiste de pocas celulas grandes tienen la ventaja de que contiene menos material de pared celular que un tejido de planta u organo del mismo tamaro pero que consiste de mas celulas pequeras. Esto tiene la ventaja potencial de aumentar la digestibilidad de dichos tejidos de planta u organos que consiste de dichas celulas grandes. Una expresion deteriorada en el tiempo, preferiblemente en celulas ciclicas, del gen HBT o producto de gen o una expresion ectopica a tiempo, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen mutante hbt o producto de gen asi puede resultar en por ejemplo hojas o frutos de tamaro normal pero con celulas grandes con dichas hojas o frutos que exhiben una digestabilidad mejorada. Tambien se presenta un metodo para aumentar el tamaro de celulas de planta en un tejido u organo y asi para mejorar la digestabilidad de dicho tejido de planta u organo mediante la regulacion por disminucion de la expresion, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen, tal como un gen de planta cdc27b o producto de gen, o un homologo o derivado de la misma como se describe.
o mediante expresion ectopica, preferiblemente en celulas ciclicas, de mutantes de dicho gen de regulacion de desarrollo de planta o producto de gen de acuerdo con la descripcion.
Una serie de patogenos de planta explotan la maquinaria de ciclo celular del anfitrion que resulta en crecimiento neoplasico inducido por patogeno visible como por ejemplo agallas. Los tejidos de planta nuevamente formados frecuentemente se requieren para la supervivencia del patogeno y provocan en muchos casos problemas con el comercio de plantas infectadas o partes de las mismas tal como frutos o flores. Dichos patogenos incluyen bacterias patogenicas de planta que incluyen Agrobacterium tumefaciens, Rhodococcus fascians, Pseudomonas syringae pv savastanoi, Xanthomonas campestris pv citri y Erwinia herbicola, hongos patogenicos de plantas que incluyen Plasmodiophora brassicae, Crinipellis perniciosa, Pucciniastrum geoppertianum, Taphrina wiesneri, Ustilaga maydis, Exobasidium vaccinii, E. camelliae, Entorrhiza casparyana y Apiosporina morbosum e insectos que inducen agallas patogenicas de plantas que incluyen los acaros Mayetiola poae. La tolerancia del anfitrion o resistencia contra el ataque por dichos patogenos se puede aumenta al reprimir el crecimiento neoplasico inducido por patogeno. Debido a su funcion en la regulacion del ciclo celular y la seralizacion de auxina, la abrogacion de la funcion HBT durante el ataque por patogenos puede contribuir a la represion del crecimiento de planta neoplasica y sin embargo con el establecimiento de resistencia de patogeno aumentada.
Se describe un metodo para aumentar la resistencia de una planta contra el crecimiento de planta neoplasico inducido por patogenos mediante la regulacion por disminucion de la expresion, preferiblemente en celulas ciclicas, de un gen que regula el desarrollo de la planta o producto de gen, tal como un gen de planta cdc27b o producto de gen, o un homologo o derivado de la misma como se describe o mediante la expresion ectopica, preferiblemente en
celulas ciclicas, de mutantes de dicho gen de regulacion de desarrollo de planta o producto de gen como se describe.
La presente invencion es aplicable a cualquier planta, en particular plantas monocotiledoneas y plantas dicotiledoneas que incluyen un forraje o legumbre forrajera, planta ornamental, cultivo de alimento, arbol, o arbusto seleccionado de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, yropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davellia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroidas, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, esparrago, brocoli, col, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, col rizada, lino, col rizada, lenteja, colza, quimbombo, cebolla, papa, arroz, soja, paja, remolacha azucarera, cara de azucar, girasol, tomate, calabaza, y te, entre otros, o las semillas de cualquier planta denominada especificamente anteriormente o un tejido, celula u organo de cultivo de cualquiera de las especies anteriores.
Se describe un metodo para identificar y obtener agonistas de una proteina que regulan el desarrollo de la planta o un homologo o derivado de la misma como se define en la actualidad.
Preferiblemente dichos agonistas son compuestos quimicos que pueden encontrar usos como por ejemplo reguladores de crecimiento de plantas o herbicidas. Se expresan los metodos para identificar dichos compuestos que incluyen la adicion de dichos compuestos en un sistema de dos hibridos de levadura en donde dicha proteina que regula el desarrollo de la planta y una proteina que interactua con dicha proteina que regula el desarrollo de la planta como se identifica utilizando un metodo de la especificacion actual. Otro dicho metodo comprende el uso de por ejemplo el aparato BIACore (Pharmacia) para medicion en tiempo real de interaccion de cualquiera de dichos compuestos con dicha proteina que regula el desarrollo de la planta o con dicha proteina que regula el desarrollo de la planta complejado con una proteina que interactua con dicha proteina que regula el desarrollo de la planta como se identifica utilizando un metodo de la especificacion actual.
Dichos agonistas son patrones de proteina capaz de interactuar con dicha proteina que regula el desarrollo de la planta. Como se describe supra, los metodos para identificar dichas proteinas que incluyen por ejemplo un sistema de dos hibridos e inmunoprecipitacion.
Por lo tanto, la presente especificacion describe un metodo para identificar y obtener proteinas que interactuan con una proteina que regula el desarrollo de la planta que comprende un ensayo de deteccion de dos hibridos en donde se utilizan un polipeptido de acuerdo con la invencion como un cebo y una coleccion de cADN de planta como presa.
Adicionalmente, la presente especificacion describe un metodo para modular la interaccion entre una proteina que regula el desarrollo de la planta de la invencion, tal como la proteina cdc27B de planta, e interactuar los patrones de proteina que se pueden obtener mediante un metodo como se define.
Un metodo para identificar y obtener compuestos que interactuan con una proteina que regula el desarrollo de la planta como se describe comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar un sistema de dos hibridos de levadura en donde se expresan un polipeptido de la invencion y una proteina que interactua con dicha proteina que regula el desarrollo de la planta, o una proteina que interactua se puede obtener mediante el metodo descrito anteriormente,
b) interactuar dicho compuesto con el complejo formado mediante los polipeptidos expresados como se define en a),
c) detectar un segundo complejo, en donde la presencia de dicho segundo complejo identifica un compuesto que se une especificamente a uno de dicho polipeptidos o a dicho segundo complejo, y,
d) identificar el compuesto.
Un metodo para identificar y obtener compuestos que interactuan con una proteina que regula el desarrollo de la planta, tal como una planta cdc27b que comprende medicion en tiempo real de interaccion de dicho compuesto con dicha proteina que regula el desarrollo de la planta o el complejo formado por dicha proteina que regula el desarrollo de la planta y una proteina que interactua con este, dicha proteina que interactua opcionalmente se puede obtener mediante el metodo descrito anteriormente.
Tambien se describe un metodo para identificar compuestos o mezclas de compuestos que se unen especificamente a un polipeptido de la invencion como se definio anteriormente, que comprende:
a) combinar un polipeptido de la invencion con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formacion del complejo,
b) detectar la formacion del complejo, en donde la presencia de un complejo identificado, o es indicador de una molecula que se une especificamente a dicho polipeptido, y
c) identificar el compuesto.
Como tal, la especificacion tambien describe el uso de una molecula identificada por medio de un metodo como se describio anteriormente como una planta regulador de crecimiento o herbicida.
En cualquiera de los metodos descritos anteriormente, una proteina que regula el desarrollo de la planta es una proteina cdc27B de planta, preferiblemente la proteina A.thaliana AtCD27B, o un homologo biologicamente activo o derivado del mismo.
Tambien se describe un metodo para la produccion de un regulador de crecimiento de planta o composicion herbicida que comprende las etapas de los metodos descritos anteriormente y formular los compuestos obtenidos de dichas etapa en una forma adecuada para aplicacion en agricultura o celula de planta o cultivo de tejido.
La especificacion describe el uso de cualquiera de los acidos nucleicos o moleculas de acido nucleico, los vectores, los polipeptidos o los anticuerpos de la invencion para modificar destino celular, para modificar la formacion de patrones, para modificar desarrollo de planta y/o para modificar la morfologia de planta y/o para modificar la fisiologia de la planta y/o para modificar la bioquimica de la planta.
La especificacion tambien describe una composicion diagnostica que comprende por lo menos un acido nucleico o molecula de acido nucleico, un vector, un polipeptido o un anticuerpo de la invencion.
Diversos otros asuntos que se relacionan con la funcion del gen HBT tambien se describen. Mas elementos del fenotipo mutante hbt, diferente a los descritos aqui, se rescatan mediante estabilidad aumentada de la proteina AXR3, a pesar del rescate de elongacion de hipocotiledoneas parciales. Las celulas de las plantulas hbt tienen forma irregular y muchos se transfieren. Mediante el cruce de la planta con actividad hbt alterada con otras plantas, una llega a ser una planta con caracteristicas deseadas y la forma deseada de la celula. Por ejemplo las hipocotiledoneas de los mutantes dobles axr3-1T hbt tienen una forma mas regular. El rescate parcial del crecimiento de raiz se acompara por la presencia de granulos de almidon y un pico de auxina en las celulas de columnela de la punta de raiz. Tambien el HBT tiene funciones relacionadas con auxina en la planta madura. En mutantes hbt es dificil determinar estas funciones debido a que el desarrollo se disminuye en la etapa de plantula en mutantes hbt. Se sabe de los estudios de mutante, esta auxina es importante pero con funciones aun pobremente definidas, por ejemplo, desarrollo de flores. Las mutaciones en los genes implicados en el transporte de auxina polar, tal como PIN1, resulta entre otros en el desarrollo de inflorescencias sin envoltura, con forma de pin (Galweiler et al., 1998). El mutante hbt exhibe diversos ciclos celulares y defectos de diferenciacion celular.
Los efectos que deciden porque los planes de division se alteran en el grupo de raiz futuro del embrion tambien se describe. Tambien se describe el efecto que hace que se detenga la division celular en la plantula hbt. Tambien se
describe efecto que decide la expresion que regula el ciclo celular de HBT y que relaciona la expresion en los procesos mencionados anteriormente. Los efectos que deciden porque la diferenciacion celular, los defectos se restringen a areas especificas en la plantula hbt tambien se describe.
Definiciones y elaboraciones para las realizaciones
Los terminos "proteinas", "peptidos" o "oligopeptidos", cuando se utilizan aqui se refiere a aminoacidos en una forma polimerica de cualquier longitud. Dichos terminos tambien incluyen modificaciones de aminoacido conocidas tal como formacion de enlace disulfuro, cisteinilacion, oxidacion, glutationilacion, metilacion, acetilacion, farnesilacion, biotinilacion, estearoilacion, formilacion, adicion de acido lipoico, fosforilacion, sulfacion, ubiquinacion, miristoilacion, palmitoilacion, geranilgeranilacion, ciclizacion (por ejemplo formacion de acido piroglutamico), oxidacion, desamidacion, deshidratacion, glucosilacion (por ejemplo pentosas, hexosaminas, N-acetilhexosaminas, deoxihexosas, hexosas, acido sialico etc.), acilacion y radiomarcas (por ejemplo 125I, 131I, 35S, 14C, 32P, 33P, 3H) asi como tambien residuos de aminoacido que ocurren en forma no natural, residuos de L-aminoacido y residuos de Daminoacido.
"Homologos" de una proteina de la invencion son aquellos peptidos, oligopeptidos, polipeptidos, proteinas y enzimas que contienen sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoacido con relacion a dicha proteina con respecto a la cual son un homologo, sin alterar una o mas de sus propiedades funcionales, en particular sin reducir la actividad del resultante. Por ejemplo, un homologo de dicha proteina consistira de una variante de secuencia de aminoacidos bioactiva de dicha proteina. Para producir dichos homologos, los aminoacidos presentes en dicha proteina se pueden reemplazar por otros aminoacidos que tienen propiedades similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento hidrofobo, antigenicidad, propension a formar o romper las estructuras helicoidales a o estructuras de lamina �, y asi sucesivamente. Una revision de las propiedades fisicas y quimicas de aminoacidos se da en la Tabla 1.
Tabla 1. Propiedades de aminoacidos que ocurren en forma natural.
Propiedades de carga / hidrofobicidad
Grupo lateral Aminoacido
hidrofobo no polar
alifatico alifatico, que contiene S aromatico imino ala, ile, leu, val met phe, trp pro
polar no cargado
alifatico amida aromatico hidroxilo sulfhidrilo gly asn. gin tyr ser, thr cys
cargado positivamente
basico arg, his, lys
cargado negativamente
acido asp, gly
Las variantes sustitucionales de una proteina de la invencion son aquellas en las que por lo menos un residuo en dicha secuencia de aminoacidos de proteina se ha retirado y se inserta un residuo diferente insertado en su lugar. Las sustituciones de aminoacidos son normalmente de residuos unicos, pero se pueden agrupar dependiendo de restricciones funcionales puestas en el polipeptido; las inserciones usualmente seran del orden de aproximadamente 1-10 residuos de aminoacido, y las eliminaciones variaran de aproximadamente 1-20 residuos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoacido comprenderan sustituciones de aminoacido conservadoras, tal como aquellas descritas supra.
Las variantes de insercion de la secuencia de aminoacidos de una proteina de la invencion son aquellas en las que uno o mas residuos de aminoacido se introducen en un sitio predeterminado en dicha proteina. Las inserciones pueden comprender las fusiones del terminal amino y/o de terminal carboxi asi como tambien inserciones intrasecuencia de aminoacidos unicos o multiples. De manera general, las inserciones dentro de la secuencia de
aminoacidos seran mas pequeras que las fusiones de terminal amino o carboxilo, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteinas o peptidos de fusion de terminal amino o carboxi incluyen el dominio de union
o el dominio de activacion del activador transcripcional como se utiliza en el sistema de dos hibridos de levadura, proteinas de cubrimiento de fago, etiqueta (histidina) , glutationa S-transferasa, proteina A, proteina de union a maltosa, reductasa dihidrofolato, epitopo Tag0100 (EETARFQPGYRS), epitopo c-myc (EQKLISEEDL), epitopo FLAG® (DYKDDDK), lacZ, CMP (peptido de union a calmodulina), epitopo HA (YPYDVPDYA), epitopo de proteina C (EDQVDPRLIDGK) y epitopo VSV (YTDIEMNRLGK).
Las variantes de eliminacion de una proteina de la invencion se caracterizan por el retiro de uno o mas aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de dicha proteina.
Las variantes de aminoacido de una proteina de la invencion se pueden hacer facilmente utilizando tecnicas sinteticas de peptido bien conocidas en el arte, tal como sintesis de peptido de fase solida y similares, o mediante manipulaciones de ADN recombinante. La manipulacion de las secuencias de ADN para producir proteinas variantes que se manifiestan como variantes de sustitucion, de insercion o de eliminacion se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, las tecnicas para elabora las mutaciones de sustitucion en sitios predeterminados en ADN que tiene la secuencia conocida se conocen bien por aquellos expertos en el arte, tal como mediante mutagenia M13, equipo de mutagenia in vitro de Gen T7 (USB, Cleveland, OH), equipo de mutagenia Dirigida a Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagenia dirigida a sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenia dirigida a sitio. Otra alternativa para manipular las secuencias de ADN para producir proteinas variantes, que se manifiestan como variantes de sustitucion, de insercion o de eliminacion comprenden modificacion de gen in vivo objetivo que se puede lograr mediante oligonucleotidos de ARN/ADN quimerico como se describe mediante por ejemplo Palmgren (1997), Trends Genet. 13, 348 y Yoon et al. (199 �), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2071-207�.
"Derivados" de una proteina de la invencion son aquellos peptidos, oligopeptidos, polipeptidos, proteinas y enzimas que comprenden por lo menos aproximadamente cinco residuos de aminoacido contiguos de dicho polipeptido pero que retienen la actividad biologica de dicha proteina. Un "derivado" puede comprender adicionalmente residuos de aminoacido que se presentan en forma natural adicionales, glucosilados alterados, que se presentan en forma no natural o acilados comparado con la secuencia de aminoacidos de una forma que se presenta en forma natural de dicho polipeptido. Alternativamente o adicionalmente, un derivado puede comprender uno o mas sustituyentes de no aminoacido comparado con la secuencia de aminoacidos de una forma que se presenta en forma natural de dicho polipeptido, por ejemplo una molecula indicadora u otro ligando, unido covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoacidos tal como, por ejemplo, una molecula indicadora que se une a la misma para facilitar su deteccion.
Con "inmunologicamente activo" significa que una molecula o fragmentos especificos de los mismos tal como epitopos o haptenos se reconocen por, es decir se unen a los anticuerpos.
En el contexto de la presente invencion se incorporan homologos, derivados y/o fragmentos inmunologicamente activos de cualquier HOBBIT de la invencion o proteinas mutantes HOBBIT como se define supra.
"Anticuerpos" incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales, sinteticos o de cadena pesada asi como tambien fragmentos de anticuerpos tal como fragmentos Fab, Fv o scFv. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante las tecnicas como se describe en por ejemplo Liddle and Cryer (1991) que comprenden la fusion de celulas de mieloma de raton en celulas de bazo derivadas de animales inmunizados. Adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos en una molecula o fragmentos de los mismos se pueden obtener al utilizar los metodos como se describe en por ejemplo Harlow and Lane (1988). En el caso de anticuerpos dirigidos contra peptidos pequeros tal como fragmentos de una proteina de la invencion, dichos peptidos se acoplan de manera general a una proteina portadora antes de la inmunizacion de los animales. Dichos portadores de proteina incluyen hemociania de lapa californiana (KLH), albumina de suero bovino (BSA), ovalbumina y Tetano toxoide. La proteina portadora mejora la respuesta inmune del animal y proporciona epitopos para sitios de union del receptor de celula
T. El termino "anticuerpos" adicionalmente incluye derivados de los mismos tal como anticuerpos marcados. Las marcas de anticuerpo incluyen fosfatasa alcalina, PKH2, PKH2�, PKH �7, fluoresceina (FITC), Hoecst 33258, Rficoeritrina (PE), rodamina (TRITC), Quantum Red, Texas Red, Cy3, biotina, agarosa, peroxidasa, esferas doradas y radiomarcas (por ejemplo 125I, 131I, 35S, 14C, 32P, 33P 3H). Las herramientas en biologia molecular se basan en anticuerpos contra una proteina que incluye analisis de transferencia de gel de proteina, deteccion de colecciones de expresion que permiten identificacion de genes, metodos cuantitativos de proteina que incluyen ELISA y, RIA, purificacion de inmunoafinidad de proteinas, inmunoprecipitacion de proteinas (por ejemplo Magyar et al. 1997) e inmunoubicacion (por ejemplo Terras et al. 1995). Otros usos de anticuerpos y especialmente de anticuerpos de peptido incluyen el estudio de procesamiento proteolitico (Loffler et al. 1994, Woulfe et al. 1994), la determinacion de los sitios activos de proteina (Lerner 1982), el estudio de precursor y procesamiento post-traduccional (Baron and Baltimore 1982, Lerner et al. 1981, Semler et al. 1982), identificacion de los dominios de proteina implicados en las interacciones de proteina-proteina (Murakami et al. 1992) y el estudio de uso de exones en expresion de genes (Tamura et al. 1991).
�0
Se incorporan en la presente invencion anticuerpos que reconocen un HOBBIT o proteina u homologo mutante HOBBIT, derivado o fragmento del mismo como se define supra.
Los terminos "genes", "polinucleotidos", "secuencia de acidos nucleicos", "secuencia de nucleotidos", "secuencia de ADN" o "molecula de acido nucleico", cuando se utilizan aqui se refiere a nucleotidos, ribonucleotidos o desoxiribonucleotidos o una combinacion de ambos, en una forma polimerica de cualquier longitud. Dichos terminos incluyen adicionalmente ADN y ARN de hebra sencilla o de hebra doble. Dichos terminos tambien incluyen modificaciones de nucleotidos conocidas tal como metilacion, ciclizacion y 'caps' y sustitucion de uno o mas de los nucleotidos que se presentan en forma natural con un analogo tal como inosina. Las modificaciones de nucleotidos incluyen la adicion de acridina, amina, biotina, cascada azul, colesterol, Cy3®, Cy5®, Cy5.5® Dabcilo, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans, -FAM, fluoresceina, 3'-glicerilo, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, psoralen fosfato, rodamina, ROX, tiol (SH), separadores, TAMRA, TET, AMCA-S®, SE, BODIPYY®, Marina Blue®, Pacific Blue®, Oregon Green®, Rhodamine Green®, Rhodamine Red®, Rhodol Green® y Texas Red®. Las modificaciones de la estructura principal de polinucleotido incluyen metilfosfonato, ARN de 2'-OMe-metilfosfonato, fosforotiorato, ARN, ARN 2'-OMe. Las modificaciones base incluyen 2-amino-dA, 2-aminopurina, 3'-(ddA), 3'dA(cordicepina), 7-deaza-dA, 8-Br-dA, 8oxo-dA, N -Me-dA, sitio abasico (dSpacer), biotina dT, 2'-OMe-5Me-C, 2'-OMe-propinil-C, 3'-(5-Me-dC), 3'-(ddC), 5Br-dC, 5-IdC, 5-Me-dC, 5-F-dC, carboxi-dT, dA convertible, dC convertible, dG convertible, dT convertible, dU convertible, 7- deaza-dG, 8-Br-dG, 8-oxo-dG, O �-Me-dG, S �-DNP-dG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2'-OMe-inosina, 2'dl, 0�-fenildl, 4-metil-indol, 2'-desoxinebularina, 5-nitroindol, 2-aminopurina, dP(analogo purina), dK (analogo pirimidina), 3-nitropirrol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotin-dT, carboxi-dT, O4-Me-dT, O4-triazol dT, 2'-OMe-propinil-U, 5-BrdU, 2'-dU, 5-F-dU, 5-I-dU, O4-triazol dU y radiomarcas (por ejemplo 125I, 131I, 35S, 14C, 32P, 33P, 3H). Dichos terminos tambien abarcan acidos nucleicos de peptido (PNA), un analogo de ADN en el que la estructura principal es un seudopeptido que consiste de unidades N-(2-aminoetil)-glicina a diferencia de azucar. Los PNA imitan el comportamiento del ADN y unen las hebras de acido nucleico complementarias. La estructura principal neutra de PNA resulta en union mas fuerte y especificidad mayor de lo que se logra normalmente. Adicionalmente, las propiedades quimicas unicas, fisicas y biologicas de PNA se han explotado para producir herramientas biomoleculares poderosas, agentes anticodificantes y antigeno, sondas moleculares y biosensores.
Una "secuencia codificante" o "marco de lectura abierto" o "ORF" se define como una secuencia de nucleotidos que se puede transcribir en mARN y/o se traduce en un polipeptido cuando se pone bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas, es decir cuando dicha secuencia codificante u ORF esta presente en un formato que se puede expresar. Dicha secuencia codificante de ORF se une mediante un codon de inicio de traduccion 5' y un codon de parata de traduccion 3'. Una secuencia codificante o ORF puede incluir, pero no se limita a ARN, mARN, cADN, secuencia de nucleotidos recombinante, secuencia de nucleotidos fabricado sinteticamente o ADN genomico. Dicha secuencia codificante u ORF se puede interrumpir al intervenir las secuencias de acidos nucleicos. Los genes y secuencias codificantes que codifican esencialmente la misma proteina pero se aisla de diferentes fuentes pueden consistir de secuencias de acidos nucleicos sustancialmente divergentes. Reciprocamente, las secuencias de acidos nucleicos sustancialmente divergentes se pueden diserar para efectuar la expresion de esencialmente la misma proteina. Dichas secuencias de acidos nucleicos son el resultado de por ejemplo la existencia de diferentes alelos de un gen dado, de la degeneracion del codigo genetico o de diferencias en el uso de codon. Sin embargo, como se indica en la Tabla 2, los aminoacidos tal como metionina y triptofan se codifican por un codon unico mientras que otros aminoacidos tal como arginina, leucina y serina se pueden traducir cada uno de hasta seis diferentes codones. Las diferencias en el uso preferido de codon se ilustran adelante para Agrobacterium tumefaciens (una bacteria), A. thaliana, M. sativa (dos plantas dicotiledoneas) y Oryza sativa (una planta monocotiledonea). Estos ejemplos se extraen de (http: //www.kazusa.or.jp/codon). Para dar un ejemplo, el codon GGC (para glicina) es el codon mas frecuentemente utilizado en A. tumefaciens (3 .2 %), es el segundo codon mas frecuentemente utilizado en O. sativa pero se utiliza en frecuencias mucho menores en A. thaliana y M. sativa (9 % y 8.4 %, respectivamente). De los cuatro codones posibles que codifican glicina. (vease Tabla �), dicho codon GGC se utiliza mas preferiblemente en A. tumefaciens y O. sativa. Sin embargo, en A. thaliana este es el codon GGA (y GGU) mientras que en M. sativa este es el codon GGU (y GGA).
"Hibridacion" es el proceso en donde la secuencia de nucleotidos complementaria sustancialmente homologa para hibridar entre si. El proceso de hibridacion puede ocurrir completamente en la solucion, es decir acidos nucleicos complementarios estan en la solucion. Las herramientas en la biologia molecular se basan en dichos procesos que incluyen la reaccion de cadena polimerasa (PCR; y todos los metodos basados en esto), hibridacion sustractiva, extension del cebador aleatorio, mapeo de nucleasa S1, extension de cebador, transcripcion inversa, sintesis de cADN, exhibicion diferencial de ARN, y determinacion de la secuencia de ADN. El proceso de hibridacion tambien puede ocurrir con uno de los acidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como globulos magneticos, globulos de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en la biologia molecular que se basan en dicho proceso incluyen el aislamiento de mARN poli (A+). El proceso de hibridacion adicionalmente puede ocurrir con uno de los acidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte solido tal como una nitrocelulosa o membrana de nylon o se inmovilizan mediante por ejemplo fotolitografia para por ejemplo un soporte de vidrio siliceo (el ultimo conocido como disposiciones o microdisposiciones de acido nucleico o como chips de acido nucleico). Las herramientas en la biologia molecular que se basan en dicho proceso incluyen analisis de transferencia de gel de ARN o ADN, hibridacion de colonia, hibridacion de placa, hibridacion in situ y hibridacion de microdisposicion. Con el
fin de permitir que ocurra hibridacion, las moleculas de acido nucleico son de manera general termicamente o quimicamente desnaturalizadas para fundir una hebra doble en dos hebras sencillas y/o para retirar horquillas u otras estructuras secundarias de acidos nucleicos de hebra sencilla. La exigencia de hibridacion se influencia por condiciones tal como temperatura, concentracion de sal y composicion de regulador de hibridacion. Las condiciones 5 de alta exigencia para hibridacion incluyen alta temperatura y/o baja concentracion de sal (las sales incluyen NaCl y citrato Na3) y/o la inclusion de formamida en el regulador de hibridacion y/o disminuir la concentracion de compuestos tal como SDS (detergente) en el regulador de hibridacion y/o exclusion de compuestos tal como sulfato de dextrano o polietilenglicol (que promueve la aglomeracion molecular) del regulador de hibridacion. Las condiciones de hibridacion convencionales se describen en por ejemplo Sambrook et al. (1989) pero el experto
10 apreciara que numerosas condiciones de hibridacion diferentes se pueden diserar en funcion de la homologia esperada o conocida y/o la longitud de la secuencia de acidos nucleicos. Se prefieren particularmente condiciones de hibridacion de suficiente baja exigencia para aislar los acidos nucleicos heterologas a las secuencias de ADN de la invencion definido supra. Los elementos que contribuyen a dicha heterologia incluyen alelismo, degeneracion del codigo genetico y diferencias en el uso preferido de codon como se discute supra.
15 La descripcion es el uso de las secuencias de ADN de la invencion que codifican un HOBBIT o proteina mutante HOBBIT, homologo, derivado y/o fragmento inmunologico del mismo como se define en cualquier metodo de hibridacion. Se describen adicionalmente secuencias de ADN que hibridan a dichas secuencias de ADN de la invencion. Las secuencias de ADN como se define en la presente invencion se pueden interrumpir mediante las secuencias que intervienen. Con "secuencias que intervienen" significa cualquier secuencia de acidos nucleicos que
20 interrumpe una secuencia codificante que comprende dicha secuencia de ADN de la invencion o que interrumpe el formato que se puede expresar de una secuencia de ADN que comprende dicha secuencia de ADN de la invencion. El retiro de la secuencia que interviene restaura dicha secuencia codificante o dicho formato que se puede expresar. Ejemplos de las secuencias que intervienen incluyen intrones, las secuencias movilizables de ADN tal como transposones y etiquetas de ADN tal como por ejemplo un T-ADN. Con "secuencia de ADN movilizable" significa
25 cualquier secuencia de ADN que se puede movilizar como el resultado de un evento de recombinacion.
Tabla 2. Degeneracion del codigo genetico.
Aminoacido
Codigo de tres letras Codigo de una letra Codones posibles
Alanina
Ala A GCA GCC GCG GCU
Arginina
Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Asparagina
Asn N AAC AAU
Acido Aspartico
Asp D GAC GAU
Cisteina
Cys C UGC UGU UGU
Acido Glutamico
Glu E GAA GAG
Glutamina
Gln Q CAA CAG
Glicina
Gly G GGA GGC GGG GGU
Histidina
His H CAC CAU
Isoleucina
lie I AUA AUC AUU
Leucina
Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Lisina
Lys K AAA AAG
Metionina
Met M AUG
Fenilalanina
Phe F UUC UUU
(continuacion)
Aminoacido
Codigo de tres letras Codigo de una letra Codones posibles
Prolina
Pro P CCA CCC CCG CCU
Serina
Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina
Thr T ACA ACC ACG ACU
Triptofan
Trp W UGG
Tirosina
Tyr Y UAC UAU
Valina
Val V GUA GUC GUG GUU
Treonina
Thr T ACA ACC ACG ACU
Triptofan
Trp W UGG
Tirosina
Tyr Y UAC UAU
Valina
Val V GUA GUC GUG GUU
Codones posibles de "PARADA"
UAA
UAG UGA
Para efectuar la expresion de una proteina en una celula, tejido u organo, preferiblemente de origen de planta, la proteina se puede introducir directamente a dicha celula, tal como mediante microinyeccion o medios balisticos o 5 alternativamente, una molecula de acido nucleico aislado que codifica dicha proteina se puede introducir dentro de dicha celula, tejido u organo en un formato que se puede expresar.
Preferiblemente, la secuencia de ADN de la invencion comprende una secuencia codificante o marco de lectura abierto (ORF) que codifica un HOBBIT o proteina mutante HOBBIT o un homologo o derivado de la misma o un activo inmunologico del mismo como se define supra. La proteina preferida de la invencion comprende la secuencia
10 de aminoacidos de dicho HOBBIT o proteina mutante HOBBIT.
Con "vector" o "secuencia de vector" significa una secuencia de ADN que se puede introducir en un organismo mediante transformacion y se puede mantener establemente en dicho organismo. Es posible el mantenimiento del vector en por ejemplo cultivos de Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Otros vectores tal como fagemidos y vectores cosmidos se pueden mantener y 15 multiplicar en bacterias y/o virus. Las secuencias de vector comprenden de manera general un conjunto de sitios unicos reconocidos por enzimas de restriccion, multiples sitios de clonacion (MCS), en donde se puede insertar una
o mas secuencias de no vector.
Con "secuencia de no vector" de acuerdo con lo anterior significa una secuencia de ADN que se integra en uno o mas de los sitios de MCS estan comprendidos dentro de un vector.
20 "Vectores de expresion" forman un subconjunto de vectores que, por virtud de comprender las secuencias reguladoras apropiadas que permite la creacion de un formato que se puede expresar de la secuencia de no vector insertada, permitiendo asi la expresion de la proteina se codifica por dichas secuencias de no vector. Los vectores de expresion se conocen en la tecnica que permite la expresion de la proteina en organismos que incluyen bacterias (por ejemplo E. coli, hongos (por ejemplo S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris), celulas de insecto (por ejemplo
25 vectores de expresion de baculovirus), celulas de animal (por ejemplo celulas COS o CHO) y celulas de planta (por ejemplo vectores de expresion con base en X de virus de papa, vease por ejemplo Vance et al. 1998 -WO9844097).
La especificacion actual describe cualquier vector o vector de expresion que comprende una secuencia de ADNde no vector que codifica un HOBBIT o proteina mutante HOBBIT, homologo, derivado y/o fragmento inmunologicamente activo del mismo como se define supra.
Como una alternativa para la produccion de proteina mediada por el vector de expresion en sistemas biologicos, se puede aplicar sintesis de proteina quimica. Los peptidos sinteticos se pueden fabricar en fase de solucion o en fase solida. La sintesis de peptido de fase solida (Merrifield 19 �3) es, sin embargo, la forma mas comun e implica la adicion secuencial de los aminoacidos para crear una cadena de peptido lineal. La sintesis de peptido de fase solida incluye ciclos que consisten de tres etapas: (i) inmovilizacion del aminoacido de terminal caboxi de la cadena de peptido de cultivo en un soporte solido o resina; (ii) ensamble de cadena, un proceso que consiste de activacion, acoplamiento y desproteccion del aminoacido que se va a agregar a la cadena de peptido de cultivo; y (iii) division que incluye el retiro de la cadena de peptido completa de la resina y el retiro de los grupos protectores de las cadenas laterales de aminoacido. Los metodos comunes en la sintesis de peptido de fase solida incluyen Fmoc/tBu (9-fluorenilmetiloxicarbonil/ t-butil) y Boc (t-butiloxicarbonil) como los grupos protectores de terminal amino de aminoacidos. Los grupos protectores de cadena lateral de aminoacido incluyen metilo (Me), formilo (CHO), etilo (Et), acetilo (Ac), t-butilo (t-Bu), anisilo, bencilo (Bzl), trifluroacetilo (Tfa), N-hidroxisuccinimida (ONSu, OSu), benzoilo (Bz), 4-metilbenzilo (Meb), tioanizilo, tiocresilo, benciloximetilo (Bom), 4-nitrofenilo (ONp), benciloxicarbonilo (Z), 2nitrobenzoilo (NBz), 2-nitrofenilsulfenilo (Nps), 4-toluenosulfonilo (Tosyl,Tos), pentafluorofenilo (Pfp), difenilmetilo (Dpm), 2-clorobenciloxicarbonilo (CI-Z), 2,4,5-triclorofenilo, 2-bromobenciloxicarbonilo (Br-Z), trifenilmetilo (Tritilo, Trt), y 2,5,7,8-pentametil-croman- -sulfonilo (Pmc). Durante el ensamble de cadena, se retiran Fmoc o Boc que resulta en un terminal amino activado del residuo de aminoacido unido a la cadena de cultivo. El terminal carboxi del aminoacido que ingresa se activa mediante conversion en un ester altamente reactivo, por ejemplo mediante HBTU. Con las tecnologias actuales (por ejemplo sintetizado PerSeptive Biosystems 9050, Sintetizador de Peptido Applied Biosystems Modelo 431A), se pueden fabricar peptidos lineales de hasta 50 residuos. Esta disponible una serie de directrices para producir peptidos que son adecuados para uso en sistemas biologicos que incluyen (i) limitar el uso de aminoacidos dificiles tal como cys, met, trp (facilmente oxidado y/o degradado durante la sintesis del peptido) o arg; (ii) minimizar los aminoacidos hidrofobos (puede deteriorar la solubilidad del peptido); y (iii) evitar un acido glutamico de terminal amino (puede ciclizar a piroglutamato).
"Formato que se puede expresar" significa que la molecula de acido nucleico aislada esta en una forma adecuada para ser transcrito en mARN y/o ser traducido para producir una proteina, constitutivamente o luego de induccion por una seral intracelular o extracelular, tal como un estimulo ambiental o estres (mitogenos, anoxia, hipoxia, temperatura, sal, luz, deshidratacion, etc.) o un compuesto quimico tal como IPTG (isopropil-�-Dtiogalactopiranosida) o tal como un antibiotico (tetraciclina, ampicilina, rifampicina, canamicina), hormona (por ejemplo gibberelina, auxina, citoquinina, glucocorticoide, brassinosteroide, etileno, acido abscisico etc.), analogo de hormona (acido yodoacetico (IAA), 2,4-D, etc.), metal (zinc, cobre, hierro, etc.), o dexametasona, entre otros. Como se conocera por aquellos expertos en la tecnica, la expresion de una proteina funcional tambien puede requerir una
o mas modificaciones post-traduccionales, tal como glucosilacion, fosforilacion, desfosforilacion, o una o mas interacciones de proteina-proteina, entre otros. Todos dichos procesos se incluyen dentro del alcance del termino "formato que se puede expresar".
Preferiblemente, la expresion de una proteina en una celula especifica, tejido, u organo, preferiblemente de origen de planta, se efectua al introducir y expresar una molecula de acido nucleico aislado que codifica dicha proteina, tal como una molecula de cADN, gen genomico, molecula sintetica de oligonucleotido, molecula de mARN o marco de lectura abierto, a dicha celula, tejido u organo, en donde dicha molecula de acido nucleico se pone funcionalmente en conexion con secuencias reguladoras adecuadas que incluyen un promotor, preferiblemente un promotor expresable de planta, y una secuencia terminadora.
La referencia aqui a un "promotor" se toma en su contexto mas amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genomico eucariotico clasico, que incluye la secuencia TATA que se requiere para el inicio exacto de transcripcion, con o sin una secuencia CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir secuencias activantes en la direccion 5', mejoradores e inactivadores) que alteran la expresion de gen en respuesta al estimulo de desarrollo y/o externo, o en una forma especifica de tejido.
El termino "promotor" tambien incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un procariotico clasico, en cuyo caso puede incluir una secuencia 35 y/o las secuencias reguladoras transcripcionales 10.
El termino "promotor" tambien se utiliza para describir una molecula de fusion o sintetica, o derivado que confiere, activa o mejora la expresion de una molecula de acido nucleico en una celula, tejido u organo.
Los promotores pueden contener copias adicionales de uno o mas elementos reguladores especificos, para mejorar adicionalmente la expresion y/o alterar la expresion espacial y/o la expresion temporal de una molecula de acido nucleico a la que se conecta funcionalmente. Dichos elementos reguladores se pueden poner adyacentes a una secuencia promotora heterologa para dirigir la expresion de una molecula de acido nucleico en respuesta a por
ejemplo cobre, glucocorticoides, dexametasona, tetraciclinas, gibberelina, cAMP, acido abscisico, auxina, heridas, etileno, jasmonato o acido salicilico o para conferir la expresion de una molecula de acido nucleico a celulas especificas, tejidos o organos tal como meristemas, hojas, raices, embriones, flores, semillas o frutos. En el contexto de la presente invencion, el promotor preferiblemente es una secuencia promotora expresable de planta. Los promotores, sin embargo, que tambien funcionan o funcionan unicamente en celulas de no planta tal como bacterias, celulas de levadura, celulas de insecto y celulas de animal no se excluyen de la invencion. "Expresable de planta" significa que la secuencia promotora, que incluye cualesquiera elementos reguladores adicionales agregados o contenidos alli, es por lo menos capaz de inducir, conferir, activar o mejorar la expresion en una celula de planta, tejido u organo, preferiblemente celulas de plantas monocotiledoneas o dicotiledoneas, tejido, u organo.
Los terminos "operable de planta" y "operable en una planta" cuando se utilizan aqui, con respecto a una secuencia promotora, se debe tomar que es equivalente a una secuencia promotora expresable de planta.
En el presente contexto, una "secuencia de promotor regulable" es un promotor que es capaz de conferir expresion en un gen estructural en una celula particular, tejido, u organo o grupo de celulas, tejidos o organos de una planta, opcionalmente bajo condiciones especificas, sin embargo no confiere de manera general expresion a traves de la planta bajo todas las condiciones. De acuerdo con lo anterior, una secuencia de promotor regulable puede ser una secuencia de promotor que confiere expresion en un gen al que se conecta funcionalmente en una ubicacion particular dentro de la planta o alternativamente, a traves de la planta bajo un conjunto especifico de condiciones, tal como luego de induccion de expresion de gen mediante un compuesto quimico u otro inductor.
Preferiblemente, el promotor regulable utilizado en el desempero de la presente invencion confiere expresion en una ubicacion especifica dentro de la planta, constitutivamente o luego de induccion, sin embargo no en la planta completa bajo cualesquiera circunstancias. Se incluyen dentro del alcance de dichos promotores secuencias promotoras especificas de celula, secuencias promotoras especificas de tejido, secuencias promotoras especificas de organo, secuencias promotores de gen especificas de ciclo celular, secuencias de promotor inducible y secuencias de promotor constitutivo que se han modificado para conferir la expresion en una parte particular de la planta en cualquier momento, tal como mediante la integracion de dicho promotor constitutivo dentro de un elemento genetico de transposicion (Ac, Ds, Spm, En, u otro transposon).
El termino "especifico de celula" se debe toma que indica que la expresion esta predominantemente en una celula particular o tipo de celula, preferiblemente de origen de planta, aunque no necesariamente exclusivamente en dicha celula o tipo de celula.
De forma similar, el termino "especifico de tejido" se debe tomar que indica que la expresion esta predominantemente en un tejido particular tejido o tipo de tejido, preferiblemente de origen de planta, aunque no necesariamente exclusivamente en dicho tejido o tipo de tejido.
De forma similar, el termino "especifico de organo" se debe tomar que indica que la expresion esta predominantemente en un organo particular, preferiblemente de origen de planta, aunque no necesariamente exclusivamente en dicho organo.
De forma similar, el termino "especifico de ciclo celular" se debe tomar que indica que la expresion es predominantemente ciclica y que se presenta en una o mas, no necesariamente fases consecutivas del ciclo celular aunque no necesariamente exclusivamente en celulas ciclicas, preferiblemente de origen de planta. Aquellos expertos en la tecnica seran conscientes que un "promotor inducible" es un promotor de la actividad transcripcional que se aumenta o induce en respuesta a un estimulo de desarrollo, quimico, ambiental, o fisico. De forma similar, el experto entendera que un "promotor constitutivo" es un promotor que es transcripcionalmente activo a traves de la mayoria, pero no necesariamente todas las partes de un organismo, preferiblemente una planta, durante la mayoria, pero no necesariamente todas las fases de su crecimiento y desarrollo.
Aquellos expertos en la tecnica seran facilmente capaces de seleccionar las secuencias de promotor apropiadas para uso en regular la expresion apropiada del HOBBIT o la proteina mutante HOBBIT como se describe supra de las fuentes facilmente disponibles o publicamente disponibles, sin la debida experimentacion.
Poner una molecula de acido nucleico bajo el control regulador de una secuencia promotora, o en conexion operable con una secuencia promotora, significa posicionar dicha molecula de acido nucleico de tal manera que la expresion se controla por la secuencia promotora. Un promotor es usualmente, pero no necesariamente, posicionado en la direccion 5', o en el extremo 5', y dentro de 2 kb del sitio de inicio de la transcripcion, de la molecula de acido nucleico que lo regula. En la construccion del promotor heterologo/ combinaciones de gen estructural se prefiere de manera general para posicionar el promotor en una distancia del sitio de inicio de transcripcion de gen que es aproximadamente igual como la distancia entre ese promotor y el gen que lo controla en su configuracion natural (es decir, el gen del que se deriva el promotor). Como se conoce en la tecnica, alguna variacion en esta distancia se puede acomodar sin perdida de la funcion del promotor. De forma similar, el posicionamiento preferido de un
elemento de secuencia regulador con respecto a un gen heterologo que se pone bajo su control se define mediante el posicionamiento del elemento en su configuracion natural (es decir, el gen del cual se deriva). De nuevo, como se sabe en la tecnica, tambien puede ocurrir alguna variacion en esta distancia.
Ejemplos de promotores adecuados para uso en construcciones de gen de la presente invencion incluyen aquellos enumerados en la Tabla 3, entre otros. Los promotores enumerados en la Tabla 3 se proporcionan para propositos solo de ejemplificacion y la presente invencion no se limita por la lista proporcionada aqui. Aquellos expertos en la tecnica estaran facilmente en una posicion para proporcionar promotores adicionales que son utiles en realizar la presente invencion.
En el caso de promotores constitutivos o promotores que inducen expresion a traves de la planta completa, se prefiere que dichas secuencias se modifiquen mediante la adicion de las secuencias de nucleotidos derivadas de uno o mas de los promotores especificos de tejido enumerados en la Tabla 8, o alternativamente, las secuencias de nucleotidos derivadas de uno o mas de los promotores inducibles especificos de tejido mencionados anteriormente, para conferir especificidad de tejido. Por ejemplo, el promotor CaMV 35S se puede modificar mediante la adicion de la secuencia promotora Adh1 de maiz, para conferir la expresion especifica de raiz regulada anaerobicamente, como se describio previamente (Ellis et al., 1987). Otro ejemplo describe conferir la expresion de gen abundante de raiz o especifica de raiz al fusionar el promotor CaMV35S a los elementos del gen de GRP3 la proteina rica en glicina de maiz (Feix and Wulff 2000 -WO0015�� 2). Se pueden lograr dichas modificaciones mediante experimentacion de rutina por aquellos expertos en la tecnica.
El termino "terminador" se refiere a una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que serala la terminacion de la transcripcion. Los terminadores son secuencias de ADN no traducidas 3' que contienen una seral de poliadenilacion, que facilita la adicion de las secuencias poliadeniladas en el extremo 3' de un transcripto primario. Los terminadores se activan en celulas derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamiferos y plantas se conocen y se describen en la literatura. Estos se pueden aislar de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas.
Ejemplos de terminadores particularmente adecuados para uso en las construcciones de gen de la presente invencion incluyen el terminador de gen de sintasa nopalina Agrobacterium tumefaciens (NOS), la secuencia terminadora de ten de sintasa octopina Agrobacterium tumefaciens (OCS), la secuencia terminadora de gen 35S del virus mosaico de Coliflor (CaMV), la secuencia terminadora de pirofosforilasa de glucosa ADP Oryza sativa (t3'Bt2), la secuencia terminadora del gen de zeina Zea mays, el terminador de gen rbcs-1A, y las secuencias terminadoras de gen rbcs-3A, entre otros.
Tablea 3. Promotores operables de planta de ejemplo para uso en la realizacion de la presente invencion
I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE CELULA, ESPECIFICOS DE TEJIDO, Y ESPECIFICOS DE ORGANO
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
a-amilasa (Amy32b)
aleurona Lanahan et al, Plant Cell 4:203-211, 1992; Skriver et al, Proc Natl Acad Sci USA 88: 72 ��-7270, 1991
gen similar a catepsina �
aleurona Cejudo et al, Plant Mol 1992 Biol 20:849-85 �,
Agrobacterium rhizogenes rolB
cambium Nilsson et al, Physiol Plant 100:45 �-4�2, 1997
AtPRP4
flores http:/salus.medium.edu/mmg/tierney/ html
sintasa calcona (chsA)
flores Van der Meer et al, Plant Mol Biol 15:95109, 1990
LAT52
anteras Twell et al, Mol Gen Genet 217:240-245, 1989
apetala-3
flores
(continuacion) (continuacion) (continuacion) (continuacion) (continuacion) (continuacion) (continuacion) (continuacion) (continuacion)
I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE CELULA, ESPECIFICOS DE TEJIDO, Y ESPECIFICOS DE ORGANO
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
chitinasa
frutos (bayas, uvas, etc.) Thomas et al. CSIRO Plant Industry, Urrbrae, South Australia, Australia; http://winetities.com.au/ gwrdc/csh951.html
rbcs-3A
tejido verde (por ejemplo hoja) Lam et al, Plant Cell 2:857-8��, 1990; Tucker et al., Plant Physiol 113: 13031308, 1992
genes especificos de hoja
hoja Baszczynski et al, Nucl Acid Res 1�:4732, 1988
AtPRP4
hoja http://sa)us.medium.edu/mmg/tierney/ htmf
promotor del gen metiltransferasa de adenina del virus clorela
hoja Mitra and Higgins, Plant Mol Biol 2 �:85-93, 1994
Promotor del gen aldP de arroz
hoja Kagaya et al, Mol Gen Genet 248:� �8�74,1995
Promotor rbcs de arroz o tomate
hoja Kyozuka et al, Plant Physiol 102:991-1000, 1993
Pinus cab-�
hoja Yamamoto et al, Plant Cell Physiol 35:773-778, 1994
promotor rubisco
hoja
cab (clorofila a/b/proteina de union)
hoja
Gen de guisante Blec4
tejidos epidermicos florales y vegetativos Mandaci and Dobres, Plant Mol Biol 34:9� 1-9�5
SAM22
hoja senescente Crowell 1992 et al, Plant Mol Biol 18:4594��,
Gen Itp (gen de transferencia de lipidos)
Fleming et al, Plant J 2:855-8 2, 1992
Gen R. japonicum nif
nodulo Patente Estadounidense No 4 8031� 5
Gen B. japonicum nifH
nodulo Patente Estadounidense No 5008194
GmENOD40
nodulo Yang et al, Plant J 3:573-585, 1993
I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE CELULA, ESPECIFICOS DE TEJIDO, Y ESPECIFICOS DE ORGANO
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
carboxilasa PEP (PEPC)
nodulo Pathirana et al, Plant Mol 20:437-450,1992 Biol
leghemoglobina (Lb)
nodulo Gordon et al, J Exp Bot 44:1453-14� 5, 1993
Gen de virus Tungro bacilliform
floema Bhattacharyya-Pakrasi et al, Plant J 4: 71-79, 1992
Genes especificos de polen
polen; microespora Albani et al, Plant Mol Biol 15: �05, 1990; Albani et al, Plant Mol Biol 1�:501, 1991
Zm13
polen Guerrero et al, Mol Gen Genet 224:1 �1-1 �8, 1993
gen apg
microespora Twell et al, Sex Plant Reprod �:217-224, 1993
Gen especifico de polen de maiz
polen Hamilton et al, Plant Mol Biol 18:21-218, 1992
Gen expresado de polen de girasol
polen Baltz et al, Plant J 2:713-721, 1992
Gen especifico de polen B. napus
polen; antera; tapetum Arnoldo et al, J Cell Biochem, Abstract No. Y101, 204, 1992
Genes expresables de raiz
raices Tingey et al, EMBO J �:1, 1987
Gen inducible de auxina de tabaco
punta de raiz Van der Zaal et al, Plant Mol Biol 1 :983, 1991
-tubulina
raiz Oppenheimer et al, Gene �3:87, 1988
Genes especificos de raiz de tabaco
raiz Conkling et al, Plant Physiol 93:1203, 1990
Gen B. napus G1-3b
raiz Patente Estadounidense No 540183
I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE CELULA, ESPECIFICOS DE TEJIDO, Y ESPECIFICOS DE ORGANO (continuacion)
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
SbPRP1
raices Suzuki et al, Plant Mol Biol 21:109-119, 1993
AtPRP1; AtPRP3
raices; capilares de raiz http://salus.medium.edu/mmg/tierney/ html
gen RD2
corteza de raiz hftp://www2.cnsu.edu/ncsu/research
gen TobRB7
vasculatura de raiz hftp://www2 cnsu.edu/ncsu/research
I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE CELULA, ESPECIFICOS DE TEJIDO, Y ESPECIFICOS DE ORGANO
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
AtPRP4
hojas; flores; primordia de raiz lateral hftp://salus.medium.edu/mmg/tierney/ html
Genes especificos de semilla
semilla Simon et al, Plant Mol Biol 5:191, 1985; Scofield et al, J Biol Chem 2� 2:12202, 1987; Baszczynski et al, Plant Mol Biol 14: �33, 1990
Albumina Brazil Nut
semilla Pearson et al, Plant Mol Biol 18:235-245, 1992
legumina
semilla Ellis et al, Plant Mol Biol 10:203-214, 1988
glutelina (arroz)
semilla Takaiwa et al, Mol Gen Genet 208:15-22, 198�; Takaiwa et al, FEBS Lett 221: 43-47, 1987
zeina
semilla Matzke et al, Plant Mol Biol 14:323-32 1990
napA
semilla Stalberg et al, Planta 199:515-519, 199�
glutenina-1 LMW y HMW de trigo
endospermo Mol Gen Genet 21�:81-90, 1989; Nucl Acids Res 17:4�1-4�2, 1989
SPA de trigo
semilla Albani et al, Plant Cell 9:171-184, 1997
cZ19B1, zeina de maiz 19 kDa
semilla WO0011177
mi1ps, mioinositol-1-Pi de sintasa de maiz
semilla WO0011177
a, , y-gliadinas de trigo
endospermo EMBO J 3:1409-1415, 1984
promotor Itr1 de cebada
endospermo
hordeina B1, C, D, de cebada
endospermo Theor Appl Gen 98:1253-12� 2, 1999; Plant J 4:343-355, 1993; Mol Gen Genet 250:750-�0, 199�
DOF de cebada
endospermo Mena et al, Plant J 11�:53-�2, 1998
blz2
endospermo EP9910� 05�.7
Promotor sintetico
endospermo Vicente-Carbajosa et al, Plant J 13:�29-�40, 1998
prolamina NRP33 de arroz
endospermo Wu et al, Plant Cell Physiol 39: 885-889, 1998
a-globulina Glb-1 de arroz
endospermo Wu et al, Plant Cell Physiol 39:885-889, 1998
I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE CELULA, ESPECIFICOS DE TEJIDO, Y ESPECIFICOS DE ORGANO
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
genes END de maiz
endospermo WO0012733
END1 de cebada
endospermo WO98089 �1
NUC1 de cebada
nucela WO98089 1
OSH1 de arroz
embriones Sato et al, Proc Natl Acad Sci USA, 93:81178122, 199
a-globulina de arroz REB/OHP-1
endospermo Nakase et al, Plant Mol Biol 33:513-522, 1997
ADP-glucosa de arroz PP
endospermo Trans Res �:157-1�8, 1997
Familia de gen ESR de maiz
endospermo Plant J 12:235-24�, 1997
y-kafirina de sorgo
endospermo Plant Mol Biol 32:1029-1035, 199�
KNOX
embriones Postma-Haarsma et al, Plant Mol Biol 39:257-271, 1999
oleosina de arroz
embriones y aleuron Wu et al, J Biochem 123:38�, 1998
oleosina de girasol
semilla (embriones y semilla seca) Cummins et al, Plant Mol Biol 19:873-87� , 1992
HOJAY
meristema de brote Weigel et al, Cell �9:843-859, 1992
Arabidopsis thaliana knat1
meristema de brote Numero de acceso AJ131822
Malus domestica kn1
meristema de brote Numero de acceso Z71981
CLAVATA1
meristema de brote Numero de acceso AF049870
Genes especificos de estigma
estigma Nasrallah et al, Proc Natl Acad Sci USA 85:5551, 1988; Trick et al, Plant Mol Biol 15:203, 1990
Gen patatin clase I
tuberculo Liu et al, Plant Mol Biol 153:38 �-395, 1991
PCNA de arroz
meristema Kosugi et al, Nucl Acids Res 19:1571-157�, 1991; Kosugi and Ohashi, Plant Cell 9:1�071�19, 1997
Tubulina de guisante TubA1
Celulas divididas Stotz and Long, Plant Mol Biol 41:�01-�14,1999
Arabidopsis cdc2a
Celulas ciclicas Chung and Parish, FEBS Lett 3�2:215-219,1995
Arabidopsis Rop1A
Anteras; polen maduro + tubos de polen Li et al, Plant Physiol 118:407-417, 1998
I: PROMOTORES ESPECIFICOS DE CELULA, ESPECIFICOS DE TEJIDO, Y ESPECIFICOS DE ORGANO
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
Arabidopsis AtDMC1
Asociado con Meiosis- Klimyuk and Jones, Plant J 11:1-14, 1997
PS-IAA4/5 y PS-IAA de guisante
Inducible de auxina Wong et al, Plant J 9:587-599, 199�
Farnesiltransferasa de guisante
Tejidos meristematicos; tejidos de crecimiento cercanos a floema; reprimido a azucar y luz Zhou et al, Plant J 12:921-930,1997
ciclina B1;1 de tabaco (N. sylvestris)
Celulas divididas / tejido meristematico Trehin et al, Plant Mol.Biol. 35: ��7-�72, 1997
Ciclinas mitoticas Catharanthus roseus CYS (tipo A) y CYM (tipo B)
Celulas divididas / tejido meristematico Ito et al, Plant J 11:983-992, 1997
Arabidopsis cyc1 A (=cyc B1;1) y cyc3aAt (tipo A)
Celulas divididas / tejido meristematico Shaul et al, Proc Natl Acad Sci USA 93:48�84872, 199
Secuencia de promotor Arabidopsis tef1
Celulas divididas / tejido meristematico Regad et al, Mol Gen Genet 248:703-711, 1995
Catharanthus roseus cyc07
Celulas divididas / tejido meristematico Ito et al, Plant Mol Biol 24:8�3-878, 1994
II: PROMOTORES CONSTITUTIVOS DE EJEMPLO
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
Actina
constitutivo McElroy et al, Plant Cell 2:1�3-171, 1990
CAMV 35S
constitutivo Odell et al, Nature 313:810-812, 1985
CaMV 19S
constitutivo Nilsson et al, Physiol Plant 100:45�-4�2, 1997
GOS2
constitutivo de Pater et al, Plant J 2:837-844, 1992
ubiquitina
constitutivo Christensen et al, Plant Mol 18:�75�89,1992 Biol
Ciclofilina de arroz
constitutivo Buchholz et al, Plant Mol 25:837843, 1994 Biol
histona H3 de maiz
constitutivo Lepetit et al, Mol Gen Genet 231:27 �-285,1992
histona H3 de alfalfa
constitutivo Wu et al, Nucleic Acids Res 17:3057-30� 3, 1989; Wu et al, Plant Mol Biol 11:�41-�49,1988
II: PROMOTORES CONSTITUTIVOS DE EJEMPLO
FUENTE DE GEN
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
actina 2
constitutivo An et al, Plant J 10:107-121, 199�
III: PROMOTORES INDUCIBLES DE ESTRES DE EJEMPLO
NOMBRE
ESTRES REFERENCIA
P5CS (delta(1)-pirrolina-5carboxilato sintasa)
sal, agua Zhang et al, Plant Sci 129:81-89, 1997
cor15a
frio Hajela et al, Plant Physiol 93:1241252, 1990
cor15b
frio Wilhelm et al, Plant Mol Biol 23:10731077, 1993
cor15a (-305 a +78 nt)
frio, sequia Baker et al, Plant Mol Biol 24: 01-713, 1994
rd29
sal, sequia, frio Kasuga et al, Nature Biotechnol 18:287291,1999
proteinas de choque termico, que incluyen promotores artificiales que contienen el elemento de choque termico (HSE)
calor Barros et al, Plant Mol Biol 19 ��5-75, 1992. Marrs et al, Dev Genet1 4:27-41, 1993. Schoffl et al, Mol Gen Genet 217: 24�-53, 1989.
smHSP (proteinas de choque termico pequeras)
calor Aguas et al, J Exp Bot 47:325-338, 199�
wcs120
frio Ouellete et al, FEBS Lett 423:324-328, 1998
ci7
frio Kirch et al, Plant Mol Biol 33:897-909, 1997
Adh
frio, sequia, hipoxia Dolferus et al, Plant Physiol 105:107587, 1994
pwsi18
sal y sequia Joshee et al, Plant Cell Physiol 39: �472, 1998
III: PROMOTORES INDUCIBLES DE ESTRES DE EJEMPLO (continuacion)
NOMBRE
ESTRES REFERENCIA
ci21A
Frio Schneider et al, Plant Physiol 113:33545, 1997
Trg-31
Sequia Chaudhary et al, Plant Mol Biol 30:1247-57, 199�
III: PROMOTORES INDUCIBLES DE ESTRES DE EJEMPLO (continuacion)
NOMBRE
ESTRES REFERENCIA
osmotina
osmotico Raghothama et al, Plant Mol Biol 23:111728, 1993
lapA
Heridas, ambiental WO99/03977 University of California/ INRA
IV: PROMOTORES INDUCIBLES POR PATOGENO DE EJEMPLO
NOMBRE
PATOGENO REFERENCIA
RB7
Nematodos de nudo de Raiz (Meloidogyne spp.) US57�038� -North Carolina State University; Opperman et al, Science 2 3: 221-23, 1994
PR-1, 2, 3, 4, 5, 8, 11
fungico, virico, bacteriano Ward et al, Plant Cell 3:1085-1094, 1991; Reiss et al 199� ; Lebel et al, Plant J 1�:223-233, 1998; Melchers et al, Plant J 5:4�9-480, 1994; Lawton et al, Plant Mol Biol, 19:735-743, 1992
HMG2
nematodos WO9503� 90 -Virginia Tech Intellectual Properties Inc.
Abi3
Nematodos Cyst (Heterodera spp.) No publicado
ARM1
nematodos Barthels et al, Plant Cell 9:2119-2134, 1997 WO 98/31822 -Plant Genetic Systems
Att0728
nematodos Barthels et al, Plant Cell 2134,1997 PCT/EP98/077�1 9: 2119-
Att1712
nematodos Barthels et al, Plant Cell 2134,1997 PCT/EP98/077�1 9, 2119-
Gst1
Diferentes tipos de patogenos Strittmatter et al, Mol Plant-Microbe Interact 9: �8-73, 199�
LEMMI
nematodos WO 92/21757 -Plant Genetic Systems
CLE
Geminivirus PCT/EP99103445 -CINESTAV
PDF1.2
Hongos que incluyen Alternaria brassicicola y Botrytis cinerea Manners et al, Plant Mol Biol, 38:10711080, 1998
Thi2.1
Hongos-Fusarium oxysporum f sp. matthiolae Vignutelli et al, Plant J 14:285-295, 1998
DB#22�
nematodos Bird and Wilson, Mol Plant-Microbe Interact 7:419-442, 1994 WO 95.322888
IV: PROMOTORES INDUCIBLES POR PATOGENO DE EJEMPLO
NOMBRE
PATOGENO REFERENCIA
DB#280
nematodos Bird and Wilson, Mol Plant-Microbe Interact 7:419442, 1994 WO 95.322888
Cat2
nematodos Niebel et al, Mol Plant-Microbe Interact 8:371-378, 1995
hTub
nematodos Aristizabal et al (199�), 8th International Congress on Plant-Microbe Interaction, Knoxville US B-29
sHSP
nematodos Fenoll et al (1997) In: Cellular and molecular aspects of plant-nematode interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F.M.W. Grundler and S.A. Ohl (Eds.),
Tsw12
nematodos Fenoll et al (1997) In: Cellular and molecular aspects of plant-nematode interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F.M.W. Grundler and S.A. Ohl (Eds.)
Hs1(pro1)
nematodos WO 98/122335 -Jung
nsLTP
virico, fungico, bacteriano Molina and Garcia-Olmedo FEBS Lett, 31�:119122, 1993
RIP
virico, fungico Turner et al, Proc Natl 94:38 ��-3871, 1997 Acad Sci USA
V: PROMOTORES INDUCIBLES POR LUZ DE EJEMPLO
NOMBRE
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
Arabidopsis Athb-2
Mediante cambios en las relaciones de luz rojo/lejos del rojo Carabelli et al, Proc Natl Acad Sci USA 93:3530-3535
Arabidopsis Athb-4
Luz lejos del rojo Carabelli et al, Plant J 4:4 �9-479
rbcS de arroz
luz Kyozuka et al 1993, Plant Physiol 102:9911000
CAB de arroz
luz Tada et al 1991, EMBO J 10:1803-1808
Lemna SSU5B (rbcS)
Luz roja Rolfe and Tobin 1991, Proc Natl Sci USA 88:2� 83-2� 8� Acad
Fragmento del promotor rbcS-3A de guisante
luz roja Gilmartin and Chua 1990, Mol 10:55 �5-55 �8 Cell Biol
Sintasa de glutamina de guisante GS2
fotorespiracion y luz Tjaden et al 1995, Plant Physiol 108:11091117
V: PROMOTORES INDUCIBLES POR LUZ DE EJEMPLO
NOMBRE
PATRON DE EXPRESION REFERENCIA
Reductasa de nitrito de frijol
Nitrato y luz Sander et al. 1995, Plant Mol Biol 27:1� 5-177
psbD-psdC de cebada
Luz azul/UV-A Christopher and Mullet 1994, Plant Physiol 104:1119-1129
Arabidopsis PHYB
Luz lejos del rojo Wester et al 1994, Plant J 5:2 �1-272
mung bean AR2
luz Mizutani and Ohta 1998, Plant Physiol 11�:357-3� 7
CAB-M1 de maiz
luz/Ca2+ Shiina et al 1997, Plant Physiol 115:477-483
Arabidopsis photolyase
luz visible / luz UV Sakamoto et al 1998, DNA Seq 9:335-340
Arabidopsis CHS
Luz UV-B/UV-A/azul Hartmann et al 1998, Plant Mol 3�:741-754 Biol
Arabidopsis Lhcb1*3
luz azul Tilghman et al 1997, Plant Mol 35:293-302 Biol
pea Lhcb1*4
luz azul Tilghman et al 1997, Plant Mol 35:293-302 Biol
Aquellos expertos en la tecnica seran conscientes de secuencias promotoras adicionales y secuencias terminadoras que pueden ser adecuadas para desarrollar la invencion. Dichas secuencias se pueden utilizar facilmente sin la 5 debida experimentacion.
En el contexto de la presente invencion, "expresion ectopica" o "sobre-expresion ectopica" de un gen o una proteina se confieren a patrones de expresion y/o niveles de expresion de dicho gene o proteina que no ocurre normalmente bajo condiciones naturales. Se puede lograr expresion ectopica en un numero de formas que incluyen ligar funcionalmente la secuencia codificante que codifica dicha proteina en un promotor homologo o heterologo aislado
10 con el fin de crear un gen quimerico y/o ligar funcionalmente dicha secuencia codificante en su propio promotor aislado (es decir el promotor no aislado que dirige naturalmente la expresion de dicha proteina) con el fin de crear una duplicacion de gen recombinante o efecto de multiplicacion de gen.
Preferiblemente, la secuencia promotora utilizada en el contexto de la presente invencion se vincula funcionalmente a una secuencia codificante o marco de lectura abierto (ORF) que codifica un HOBBIT o proteina mutante HOBBIT o
15 un homologo, derivado y/o un fragmento inmunologicamente activo del mismo como se define supra.
La "regulacion por disminucion de la expresion" como se utiliza aqui significa disminuir los niveles de expresion de gen y/o los niveles de producto de gen activo y/o los niveles de actividad del producto de gen. Las reducciones en la expresion se puede llevar a cabo por ejemplo mediante la adicion de secuencias codificantes o partes de las mismas en una orientacion codificante (si que resulta en co-supresion) o en una orientacion anticodificante con relacion a 20 una secuencia promotora y adicionalmente mediante por ejemplo mutagenia de insercion (por ejemplo insercion de T-ADN o insercion de transposon) o mediante estrategias de inactivacion de gen como se describe mediante por ejemplo Angell and Baulcombe (1998 -WO983�083), Lowe et al. (1989 -WO9853083), Lederer et al. (1999 -WO9915� 82) o Wang et al. (1999 -WO9953050). Las construcciones geneticas se dirigen a la expresion del gen inactivo puede tener la secuencia de nucleotidos de dicho gen (o una o mas partes de las mismas) contenidas alli en
25 una orientacion codificante y/o anticodificante con relacion a la secuencia promotora. Otro metodo para regular por disminucion la expresion del gen comprende el uso de ribozimas, por ejemplo como se describe en Atkins et al. 1994 (WO9400012), Lenee et al. 1995 (WO9503404), Lutziger et al. 2000 (WO0000�19), Prinsen et al. 1997 (WO97138 �5) y Scott et al. 1997 (WO973811 �).
La modulacion, que incluye disminuir, del nivel de productos de gen activos o de actividad de producto de gen se puede lograr al administrar o exponer las celulas, tejidos, organos u organismos para dicho producto de gen, un homologo, analogo, derivado y/o fragmento inmunologicamente activo del mismo. La inmunomodulacion es otro ejemplo de una tecnica capaz de regular por disminucion los niveles de producto de gen activo y/o de actividad de producto de gen y comprende la administracion de o exponer a o expresa anticuerpos en dicho producto de gen a o en celulas, tejidos, organos u organismos en donde los niveles de dicho producto de gen y/o actividad de producto de gen se modulan. Dichos anticuerpos comprenden anticuerpos", anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos IgG y anticuerpos de cadena pesada asi como tambien fragmentos de los mismos.
La modulacion, que incluyen disminucion, el nivel de productos de gen activos o de la actividad del producto de gen adicionalmente se puede lograr al administrar o exponer las celulas, tejidos, organos u organismos a un inhibidor o activador de dicho producto de gen o la actividad del mismo. Dichos inhibidores o activadores incluyen proteinas (que comprenden por ejemplo proteinasas y quinasas) y compuestos quimicos identificados de acuerdo con la presente invencion como se describe supra.
En el contexto de la invencion el termino "agonista" se refiere a una sustancia que puede ser un protagonista o un antagonista, es decir puede tener efectos positivos o negativos, puede ser tambien un mejorador o un inhibidor o un modulador.
El termino "endoreduplicacion" significa replicacion de ADN actual sin mitosis posterior y citoquinesis. Al manipular el nivel de endoduplicacion uno puede aumentar la capacidad de almacenamiento de, por ejemplo, celulas de endospermo.
"Destino celular y/o desarrollo de planta y/o la morfologia de planta y/o bioquimica y/o fisiologia" significan que una o mas caracteristicas de desarrollo y/o morfologicas y/o bioquimicas y/o fisiologicas de una planta se altera por el desempero de una o mas etapas que pertenecen a la invencion descrita aqui.
"Destino celular" se refiere al tipo celular o las caracteristicas celulares de una celula particular que se producen durante desarrollo de planta o un proceso celular de la misma, en particular durante el ciclo celular o como una consecuencia de un proceso de ciclo celular.
"Desarrollo de planta" o el termino "caracteristica de desarrollo de planta" o termino similar, cuando se utiliza aqui, se tomara que significa cualquier proceso celular de una planta que esta implicada en determinar el destino de desarrollo de una celula de planta, en particular el tejido especifico o tipo de organo en el que se desarrollara una celula progenitora. Los procesos celulares relevantes para el desarrollo de planta se conoceran por aquellos expertos en la tecnica. Dichos procesos incluyen, por ejemplo, morfogenia, fotomorfogenia, desarrollo de brote, desarrollo de raiz, desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo, elongacion de tallo, florecimiento, y mecanismos reguladores implicados en determinar el destino celular, en particular un proceso o proceso regulador implicado en el ciclo celular.
"La morfologia de planta" o el termino "caracteristica morfologica de planta" o termino similar, cuando se utiliza aqui, se entendera por aquellos expertos en la tecnica a lo que se refiere a la apariencia externa de una planta, que incluye una cualquiera o mas caracteristicas estructurales o combinacion de caracteristicas estructurales de la misma. Dichas caracteristicas estructurales incluyen la forma, tamaro, numero, posicion, color, textura, disposicion, y patron de cualquier celula, tejido u organo o grupos de celulas, tejidos o organos de una planta, que incluyen la raiz, tallo, hoja, brote, peciolo, tricomas, flor, petalo, estigma, estilo, estambre, polen, ovulo, semilla, embriones, endospermo, recubrimiento de semilla, aleurona, fibra, fruto, cambium, madera, pulpa de madera, parenquima, aerenquima, elemento de tamiz, floema o tejido vascular, entre otros.
"La bioquimica de la planta" o el termino "caracteristica bioquimica de planta" o termino similar, cuando se utiliza aqui, se entendera por aquellos expertos en la tecnica en lo que se refiere a los procesos cataliticos y metabolicos de una planta, que incluyen metabolismo primario y secundario y los productos de los mismos, que incluyen cualesquier moleculas pequeras, macromoleculas o compuestos quimicos, tal como pero no limitado a almidones, azucares, proteinas, peptidos, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, moleculas de acido nucleico, celulosas, hemicelulosas, callosas, lectinas, fibras, pigmentos tal como antocianinas, vitaminas, minerales, micronutrientes, o macronutrientes, que se producen por plantas.
"La fisiologia de la planta" o el termino "caracteristica fisiologica de planta" o termino similar, cuando se utiliza aqui, se entendera que se refiere a los procesos funcionales de una planta, que incluyen procesos de desarrollo tal como crecimiento, expansion y diferenciacion, desarrollo sexual, reproduccion sexual, establecimiento de semilla, desarrollo de semilla, relleno de grano, reproduccion asexual, division celular, latencia, germinacion, adaptacion de luz, fotosintesis, expansion de hoja, produccion de fibra, crecimiento secundario o produccion de madera, entre otros; las respuestas de una planta en factores externamente aplicados tal como metales, quimicos, hormonas, factores de crecimiento, ambiente y factores de estres ambiental (por ejemplo anoxia, hipoxia, alta temperatura, baja
temperatura, deshidratacion, luz, hora del dia, inundacion, sal, metales pesados, entre otros), que incluyen respuestas adaptivas de plantas a dichos factores aplicados externamente. "Patron" o "formacion de patrones" o "patron de celula" o terminos similares, cuando se utilizan aqui, se entendera como la disposicion espacial de las celulas, grupos de celulas, tejidos u organos de un organismo dentro de este organismo. Preferiblemente, dicho organismo es una planta. Este proceso esta implicado en influenciar el destino celular, desarrollo de planta, la morfologia de planta, la bioquimica de la planta y la fisiologia de la planta.
Cuando se utilizan aqui, los terminos "dominio" o "region celular" se entienden como una celula unica o un grupo de celulas que tienen colectivamente el mismo destino o que se pueden tratar de tal manera que obtienen dicho destino. En este contexto "destino" se entiende que tiene el potencial de desarrollar en o haber desarrollado un cierto tejido, organo u organismo. La adquisicion de destino puede implicar la ocurrencia de asimetria en una poblacion de celulas previamente uniformes.
Un "meristema" es un tejido formador de una planta que se distingue de tejidos permanentes de planta por la capacidad de las celulas de meristema de dividir y formar nuevas celulas. Los meristemas pueden ser apicales, es decir determinar el eje de raiz de brote vertical de plantas y responsable del crecimiento de brote (meristemas apicales de brote) o raiz (meristemas apicales de raiz). Los meristemas adicionalmente pueden ser laterales, es decir determinar la ramificacion horizontal del eje de raiz-brote y responsable del crecimiento de por ejemplo tres ramas (meristema apical de brote) o raices laterales (meristema apical de raiz). Diversos organos encuentran su uso en meristemas. Sin embargo, con "emanacion de organo" significa la concepcion y desarrollo posterior de un organo de un meristema. Los organos bien conocidos que emanan de meristemas vegetativos son por ejemplo hojas. Los organos vienen conocidos que emanan de meristemas florales son por ejemplo flores.
Los medios para introducir el ADN recombinante en tejido de planta o celulas que incluyen, pero no se limitan a, transformacion utilizando CaCl2 y variaciones de los mismos, en particular el metodo descrito por Hanahan (1983), absorcion de ADN directa en protoplastos (Krens et al, 1982; Paszkowski et al, 1984), la absorcion mediada por PEG en protoplastos (Armstrong et al, 1990) bombardeo de microparticulas, electroporacion (Fromm et al., 1985), microyeccion de ADN (Crossway et al., 198�), bombardeo de microparticulas de explantes de tejido o celulas (Christou et al, 1988; Klein et al. 1992), infiltracion por vacio de tejido con acido nucleico, o en el caso de plantas, transferencia mediada por T-ADN de Agrobacterium para el tejido de planta como se describe esencialmente por An et al.(1985), Dodds et al. (1985), Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b). los metodos para la transformacion de plantas de monocotiledoneas se conocen bien en la literatura e incluyen transformacion mediada por Agrobacferium (Cheng et al. 1997 - WO9748814; Hansen 1998 -WO98549�1, Hiei et al. 1994 - WO9400977; Hiei et al. 1998 -WO9817813; Rikiishi et al. 1999 - WO9904�18; Saito et al. 1995 - WO950� 722), bombardeo de microproyectiles (Adams et al. 1999 -US59� 9213; Bowen et al. 1998 -US573�3�9; Chang et al. 1994 -WO9413822; Lundquist et al. 1999 -US58742� 5/ US5990390; Vasil and Vasil 1995 -US54057� 5; Walker et al. 1999 -US59553 �2), absorcion de ADN (Eyal et al. 1993 - WO93181 �8), microinyeccion de celulas Agrobacterium (von Holt 1994 -DE4309203) y sonicacion (Finer et al. 1997 - US5�93512).
Para el bombardeo de microparticulas de celulas, una microparticulas se impulsa en una celula para producir una celula transformada. Se puede utilizar cualquier metodologia de transformacion de celula balistica adecuada y aparato en desarrollar la presente invencion. Los aparatos y procedimientos de ejemplo se describen pro Stomp et al. (Patente Estadounidense No. 51224 ��) y Sanford and Wolf (Patente Estadounidense No. 4945050). Cuando los procedimientos de transformacion balisticos, la construccion de gen puede incorporar un plasmido capaz de replicar en la celula que se va a transformar.
Ejemplos de microparticulas adecuados para uso en dichos sistemas incluyen esferas doradas de 1 a 5 mm. La construccion de ADN se puede depositar en la microparticula mediante cualquier tecnica adecuada, tal como mediante precipitacion.
Se puede regenerar una planta completa de la celula transformada o transfectada, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica. El tejido de planta capaz de propagacion clonal posterior, si por organogenia o embriogenia, se puede transformar con una construccion de gen de la presente invencion y una planta completa regenerada de la misma. El tejido particular seleccionado variara dependiendo de los sistemas de propagacion clonal disponibles para, y mas adecuados por, las especies particulares que se transforman. Los objetivos de tejido de ejemplo incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledoneas, hipocotiledoneas, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristematico existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y el meristema de raiz), y el tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema cotiledon y meristema hipocotilo).
El termino "organogenia", como se utiliza aqui, significa un proceso mediante el cual los brotes y raices se desarrollan secuencialmente desde los centros meristematicos.
El termino "embriogenia", como se utiliza aqui, significa un proceso mediante el cual los brotes y raices se desarrollan en forma concertada (no secuencialmente), si es de celulas somaticas o gametos.
Preferiblemente, la planta se produce de acuerdo con el metodo de la invencion se transfecta o transforma con una secuencia genetica, o susceptible a la introduccion de una proteina, mediante cualesquier medios reconocidos en la tecnica, tal como bombardeo de microproyectiles, microinyeccion, transformacion mediada por Agrobacterium (que incluyen el metodo de transformacion de 'inmersion de flor'; Bechtold and Pelletier 1998, Trieu et al. 2000), fusion de protoplasto, o electroporacion, entre otros. Mas preferiblemente dicha planta se produce mediante transformacion mediada por Agrobacterium.
La transformacion mediada por Agrobacterium o transformacion agrolistica de plantas, levadura, moho u hongos filamentosos se base en la transferencia de parte de las secuencias del vector de transformacion, denominado como T-ADN, al nucleo y en la integracion de dicho T-ADN en el genoma de dicho eucariote.
"Agrobacterium" significa un miembro de Agrobacteriaceae, mas preferiblemente Agrobacterium o Rhizobacterium y mas preferiblemente Agrobacterium tumefaciens.
"T-ADN", o ADN transferido, significa que parte del vector de transformacion flanqueado por los limites de T-ADN es decir, despues de la activacion de los genes Agrobacterium vir, mellado en los limites de T-ADN y se transfiere como un ADN de hebra sencilla al nucleo en una celula eucariotica.
Cuando se utilizan aqui, con "limites de T-ADN", "region limite de T-ADN", o "region limite" significan el limite de T-ADN derecho (RB) o el limite de T-ADN izquierdo (LB). Dicho limite comprende una secuencia nucleo flanqueada por una region interna limite como parte del limite de flanqueo de T-ADN y/o una region externa limite como parte del limite de flanqueo de estructura principal del vector. Las secuencias nucleo comprende 22 bp en el caso de vectores tipo octopina y 25 bp en el caso de vectores tipo nopalina. Las secuencias nucleo en la region limite derecha y la region limite izquierda forman repeticiones imperfectas. Las secuencias nucleo limite son indispensables para el reconocimiento y procesamiento mediante el complejo de mellado de Agrobacterium que consiste de por lo menos VirD1 y VirD2. Las secuencias nucleo que flanquean un T-ADN son suficientes para promover la transferencia de dicho T-ADN. Sin embargo, es baja la eficiencia de transformacion utilizando vectores de transformacion que llevan unicamente el T-ADN flanqueado por dichas secuencias nucleo. Se sabe que las regiones externas e internas limite modulan la eficiencia de transferencia de T-ADN (Wang et al. 1987). Un elemento que mejora la transferencia de T-ADN se ha caracterizado y reside en la region externa de limite derecho y se denomina saturacion (Peralta et al. 198 �, van Haaren et al. 1987).
"Vector de transformacion de T-ADN" o "vector de T-ADN" significa cualquier vector que abarca una secuencia de T-ADN flanqueada por el limite de T-DNA derecho e izquierdo que consiste de por lo menos las secuencias nucleo de limite derecho e izquierdo, respectivamente, y se utilizan para transformacion de cualquier celulas eucariotica.
"Secuencia de estructura principal de vector de T-ADN" o "Secuencias de estructura principal de vector de T-ADN" significa todo el ADN de un vector que contiene T-ADN que se encuentra fuera de los limites de T-ADN y, mas especificamente, fuera de los sitios de mellado de las repeticiones imperfectas de nucleo limite.
La presente invencion incluye vectores de T-ADN optimizados de tal manera que la integracion de estructura principal de vector en el genoma de una celula eucariotica se minimiza o esta ausente. "Vector de T-ADN optimizado" significa un vector de T-ADN diserado para reducir o abolir la transferencia de secuencias de estructura principal de vector en el genoma de una celula eucariotica. Dichos vectores de T-ADN se conocen por ser familiares con la tecnica e incluyen aquellos descritos por Hanson et al. (1999) y por Stuiver et al. (1999 - WO99015� 3).
La especificacion describe la inclusion de una secuencia de ADN que codifica un HOBBIT o proteina mutante HOBBIT, homologo, derivado o fragmento inmunologicamente activo del mismo como se define supra, en cualquier vector de T-ADN que comprende vectores de transformacion binarios, vectores de transformacion super-binarios, vectores de transformacion co-integrados, vectores de transformacion derivados de Ri asi como tambien en vectores que llevan T-ADN utilizados en transformacion agrolistica.
"Vector de transformacion binario" significa un vector de transformacion de T-ADN que comprende por lo menos un gen de interes y/o por lo menos un marcador seleccionable activo en la celula eucariotica que se va a transformar; y una region de estructura principal de vector que comprende por lo menos origines de replicacion activa en E. coli y Agrobacterium y marcadores para seleccion en E. coli y Agrobacterium. Alternativamente, la replicacion del vector de transformacion binario en Agrobacterium es dependiente de la presencia de un plasmido auxiliar separado. El vector binario pGreen y el plasmido auxiliar pSoup forman un ejemplo de dicho como se describe en por ejemplo Hellens et al. (2000), Plant Mol. Biol. 42, 819-832, o como esta disponible en el sitio de internet http://www.pgreen.ac.uk.
Los limites de T-ADN de un vector de transformacion binario se pueden derivar de plasmidos Ti tipo nopalina o tipo octopina o de ambos. El T-ADN de un vector binario solo se transfiere a una celula eucariotica en conjunto con un plasmido auxiliar. Tambien se conocen en la tecnica multiples cepas de vector binario Agrobacterium para cotransformacion eficiente de las plantas (Bidney and Scelonge 2000 -WO0018939).
"Plasmido auxiliar" significa un plasmido que se mantiene establemente en Agrobacterium y por lo menos se lleva a cabo para la configuracion de genes vir necesarios para permitir la transferencia del T-ADN. Dicha configuracion de genes vir se puede derivar de plasmidos Ti tipo octopina o tipo nopalina o de ambos.
"Vector de transformacion super-binario" significa un vector de transformacion binario adicionalmente llevado en la region de estructura principal de vector de una region vir del plasmido Ti pTiBo542 de la cepa super-virulenta A. tumefaciens A281 (Hiei et al. 1994 -EP0�04 ��2, Hiei et al. 1995 -EP0� 87730). Se utilizan vectores de transformacion super-binarios en conjunto con un plasmido auxiliar.
"Vector de transformacion co-integrado" significa un vector T-ADN por lo menos que comprende:
(a)
una region T-ADN que comprende por lo menos un gen de interes y/o por lo menos un marcador seleccionable activo en plantas; y
(b)
una region de estructura principal de vector que comprende por lo menos origenes de replicacion activos en Escherichia coli y Agrobacterium, y marcadores para seleccion en E. coli y Agrobacterium, y un conjunto de genes vir necesarios para permitir la transferencia del T-ADN.
Los limites de T-ADN y dicho conjunto de genes vir de dicho vector de T-ADN se puede derivada de plasmidos Ti tipo octopina o nopalina o de ambos.
"Vector de transformacion de planta derivado de Ri" significa un vector de transformacion binario en el que los limites de T-ADN se derivan de un plasmido Ti y dicho vector de transformacion binario se utiliza en conjunto con un plasmido Ri auxiliar que lleva el conjunto necesario de genes vir.
Como se utiliza aqui, el termino "gen marcador seleccionable" o "marcador seleccionable" o "marcador para seleccion" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una celula en el que se expresa pera facilitar la identificacion y/o seleccion de celulas que se transfectan o transforman con una construccion de gen de la invencion
o a derivado de la misma. Los genes marcadores seleccionables adecuados contemplados aqui incluyen el gen de resistencia a ampicilina (Ampr), gen de resistencia a tetraciclina (Tcr), gen de resistencia a canamicina bacteriano (Kanr), gen de resistencia a fosfinotricina, gen de fosfotransferasa a neomicina (nptII), gen de resistencia a higromicina, gen -glucuronidasa (GUS), gen cloramfenicol acetiltransferasa (CAT), gen de proteina fluorescente verde (gfp) (Haseloff et al, 1997), y gen luciferasa, entre otros. "Agrolisticos", "transformacion agrolistica" o "transferencia agrolistica" significa aqui un metodo de transformacion que combina caracteristicas de transformacion mediada por Agrobacterium y de suministro de ADN biolistico. Como tal, un plasmido objetivo que contiene T-ADN se cosuministra con ADN/ARN que permite la produccion planta de VirD1 y VirD2 con o sin VirE2 (Hansen and Chilton 199�; Hansen et al. 1997; Hansenand Chilton 1997 -WO971204�).
La presente invencion describe adicionalmente un metodo para retirar de las celulas transformadas una secuencia de ADN externa integrada establemente mediante recombinacion que implica una recombinasa y sitios de recombinacion.
"ADN externo" significa cualquier secuencia de ADN que se introduce en el genoma del anfitrion mediante tecnicas recombinantes. Dicho ADN externo incluye por ejemplo una secuencia de T-ADN o una parte de la misma tal como la secuencia de T-ADN que comprende el marcador seleccionable en un formato que se puede expresar. El ADN externo adicionalmente incluye intervenir las secuencias de ADN como se define supra. "Evento de recombinacion" significa un evento de recombinacion especifico de sitio o un evento de recombinacion efectuado por un 'salto' de transposon.
"Recombinasa" significa una recombinasa especifica de sitio o una transposasa.
"Sitio de recombinacion" significa sitio de recombinacion especifico de sitio o secuencias limite de transposon.
con "evento de recombinacion especifico de sitio" significa un evento catalizado por un sistema que consiste de manera general de tres elementos: un par de secuencias de ADN (las secuencias o sitios de recombinacion especificos de sitio) y una enzima especifica (la recombinasa especifica de sitio).
La recombinasa especifica de sitio cataliza una reaccion de recombinacion solo entre dos secuencias de recombinacion especificas de sitio dependiendo de la orientacion de las secuencias de recombinacion especificas de sitio. Las secuencias que intervienen entre dos sitios de recombinacion especificos de sitio se invertiran en la presencia de la recombinasa especifica de sitio cuando las secuencias de recombinacion especificas de sitio se orientan en direcciones opuestas con relacion entre si (es decir repeticiones invertidas). Si las secuencias de recombinacion especificas de sitio se orientan en la misma direccion con relacion entre si (es decir repeticiones
directas), entonces se eliminaran cualesquiera secuencias que intervienen luego de la interaccion con la recombinasa especifica de sitio. Sin embargo, si las secuencias de recombinacion especificas de sitio estan presentes como repeticiones directas en ambos extremos de una secuencia de ADN externa integrada en un genoma eucariotico, dicha integracion de dichas se puede reversar posteriormente mediante la interaccion de las secuencias de recombinacion especificas de sitio con la recombinasa especifica de sitio correspondiente.
Se puede utilizar un numero de diferentes sistemas de recombinasa especificos de sitio que incluyen pero no se limitan al sistema Cre/lox de bacteriofago P1, el sistema FLP/FRT de levadura, la recombinasa Gin de fago Mu, la recombinasa Pin de E. coli, PinB, PinD y PinF de Shigella, y el sistema R/RS de Zygosaccharomyces rouxii. Las recombinasas de manera general son integrasas, resolvasas o flippasas. Tambien se pueden utilizar recombinasas especificas duales en conjunto con repeticiones directas e indirectas de dos sitios diferentes de recombinacion especificos de sitio que corresponden la recombinasa especifica dual (Baszczynski et al. 1999 -WO9925840). Los sistemas de recombinasa especificos de sitio preferidos son el bacteriofago P1 Cre/lox, los sistemas FLP/FRT de levadura y Z. rouxii R/RS. En estos sistemas una recombinasa (Cre, FLP o R) interactua especificamente con su respectiva secuencia de recombinacion especifica de sitio (lox, FRT, o RS respectivamente) para invertir o cortar las secuencias que intervienen. Las secuencias de recombinacion especificas de sitio para cada uno de estos dos sistemas son relativamente cortas (34 bp para lox y 47 bp para FRT). Algunos de estos sistemas ya se han utilizado con alta eficiencia en plantas tal como tabaco (Dale et al. 1990, Onouchi et al. 1991, Sugita et al. 2000) y Arabidopsis (Osborne et al. 1995, Onouchi et al. 1995). Los sistemas de recombinacion especificos de sitio tienen muchas aplicaciones en biologia de molecular planta que incluyen metodos para el control de recombinacion homologa (por ejemplo Hodges et al. 199� - US5527 �95), para insercion dirigida, apilamiento de genes, etc. (Baszczynski et al. 1999 -WO9925821) y para resolucion de patrones de integracion de T-ADN complejos o para el corte de un marcador seleccionable (Ow et al. 1999 - WO9923202).
Aunque las secuencias de recombinacion especificas de sitio se pueden ligar en los extremos del ADN que se van a cortar o se invierten, el gen que codifica la recombinasa especifica de sitio se puede ubicar en cualquier parte. Por ejemplo, el gen de recombinasa ya puede estar presente en el ADN de eucariote o se puede suministrar por un fragmento de ADN introducido finalmente ya sea introducido directamente en las celulas, a traves de cruce o a traves de polinacion cruzada. Alternativamente, se puede introducir una proteina recombinasa sustancialmente purificada directamente en la celula eucariotica, por ejemplo mediante micro-inyeccion o bombardeo de particulas. Normalmente, la region codificante de recombinasa especifica de sitio se ligara funcionalmente a las secuencias reguladoras que permiten la expresion de la recombinasa especifica de sitio en la celula eucariotica.
"Evento de recombinacion efectuado por salto de transposon" o "recombinacion mediada por transposasa" significa un evento de recombinacion catalizado por un sistema que consiste de tres elementos: un par de secuencias de ADN (las secuencias limite de transposon) y una enzima especifica (la transposasa). La transposasa cataliza una reaccion de recombinacion solo entre dos secuencias limite de transposon que estan dispuestas como repeticiones invertidas.
Se puede utilizar un numero de diferentes sistemas de transposon/transposasa que incluye pero no se limita al sistema Ds/Ac, el sistema Spm y el sistema Mu. Estos sistemas se originan de maiz pero se ha mostrado que por lo menos el sistema Ds/Ac y Spm tambien funciona en otras plantas (Fedoroff et al. 1993, Schlappi et al. 1993, Van Sluys et al. 1987). Se prefieren los transposones tipo Ds y Spm que se delinean por las secuencias limite 11 bp- y 13 bp, respectivamente.
Aunque las secuencias limite de transposon se puede ligar a los extremos de ADN que se cortan, el gen que codifica la transposasa se puede ubicar en cualquier parte. Por ejemplo, el gen de recombinasa ya puede estar presente en ADN de eucarioto o se puede suministrar por un fragmento de ADN finalmente introducido ya sea introducido directamente en las celulas, a traves del cruce o a traves de polinacion cruzada. Alternativamente, se puede introducir una proteina transposasa sustancialmente purificada directamente en las celulas, por ejemplo mediante microinyeccion o bombardeo de particulas. Como parte de la presente invencion, las secuencias limite de transposon se incluyen en una secuencia de ADN externa de tal manera que se encuentran fuera de dicha secuencia de ADN y transforma dicho ADN en una entidad similar a transposon que se puede mover mediante la accion de una transposasa.
Los transposones frecuentemente se reintegran en otro locus del genoma del anfitrion, puede ser necesaria la segregacion de la progenie de los anfitriones en los que la transposasa se deja actuar para separar los anfitriones transformados que contienen por ejemplo solo la huella de transposon y anfitriones transformados que aun contienen el ADN externo.
En el desarrollo de la presente invencion, el elemento genetico se induce preferiblemente para movilizar, tal como, por ejemplo, mediante la expresion de una proteina recombinasa en el que pone en contacto el sitio de integracion del elemento genetico y facilita un evento de recombinacion alli, cortando el elemento genetico completamente, o alternativamente, dividiendo una "huella", de manera general de aproximadamente 20 nucleotidos de longitud o mas,
en el sitio de integracion original. Aquellos anfitriones y partes anfitrionas que se han producido de acuerdo con el metodo de la invencion se pueden identificar mediante hibridacion de acido nucleico estandar y/o tecnicas de amplificacion para detectar la presencia del elemento genetico movilizable o una construccion genetica que comprende la misma. Alternativamente, en el caso de celulas anfitrionas transformadas, tejidos, y anfitriones en donde el elemento genetico movilizable se ha costado, es posible detectar una huella en el genoma del anfitrion que se ha dejado luego del evento de corte, utilizando dichas tecnicas. Como se utiliza aqui, el termino "huella" se tomara como se refiere a cualquier derivado de un elemento genetico movilizable o construccion de gen que comprende el mismo como se describe aqui que se produce mediante corte, eliminacion u otro retiro del elemento genetico movilizable del genoma de una celula transformada previamente con dicha construccion genetica. Una huella de manera general comprende por lo menos una copia unica del locus de recombinacion o transposon utilizado para promover el corte. Sin embargo, una huella puede comprender secuencias adicionales derivadas de la construccion genetica, por ejemplo secuencia de nucleotidos derivada de la secuencia limite izquierda, la secuencia limite derecha, origen de replicacion, secuencia que codifica la transposasa o que codifica la recombinasa si se utiliza, o otras secuencias de nucleotidos derivadas de vector. De acuerdo con lo anterior, una huella es identificable de acuerdo con la secuencia de nucleotidos del locus de recombinacion o transposon de la construccion genetica utilizada, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleotidos que corresponde o es complementaria a un sitio lox, sitio frt o sitio RS. El termino "ciclo celular" significa los eventos estructurales y bioquimicos ciclicos asociados con el crecimiento y con la division de las celulas, y en particular con la regulacion de la replicacion de ADN y mitosis. El ciclo celular incluye las fases denominadas: G0, Gap1 (G1), sintesis de ADN (S), Gap2 (G2), y mitosis (M). Normalmente estas cuatro fases ocurren secuencialmente, sin embargo, el ciclo celular tambien incluye ciclos modificados en donde una o mas fases estan ausentes lo que resulta en ciclo celular modificado tal como endomitosis, acitoquinesis, poliploidia, politenia, y endoreduplicacion.
El termino "proteina que interactua con el ciclo celular", " proteina de ciclo celular " o " proteina de control de ciclo celular" como se denota aqui significa una proteina que ejerce control en o regula o si se requiere para el ciclo celular o parte del mismo de una celula, tejido, organo u organismo completo y/o replicacion de ADN. Esto tambien puede ser capaz de unir a, regular o estar regulado por quinasas dependientes de ciclina o sus subunidades. El termino tambien incluye peptidos, polipeptidos, fragmentos, variantes, homologos, alelos o precursores (por ejemplo preproproteinas o preproteinas) de los mismos.
Las proteinas de control de ciclo celular y su funcion en regular el ciclo celular de organismos eucarioticos se revisan en detalle por John (1981) y documentos que contribuyen alli (Norbury and Nurse 1992; Nurse 1990; Ormrod and Francis 1993) y documentos que contribuyen alli (Doerner et al. 199�; Elledge 199�; Francis and Halford 1995; Francis et al. 1998; Hirt et al. 1991; Mironov et al. 1999).
El termino "genes de control de ciclo celular control" se refiere a cualquier gen o mutante del mismo que ejerce control en o se requieren para: sintesis de ADN cromosomico y para mitosis (banda preprofase, envoltura nuclear, formacion de huso, condensacion de cromosoma, segregacion de cromosoma, formacion de nuevos nucleos, formacion de fragmoplasto, duplicacion de centro que organiza el microtubulo, etc.) meiosis, citoquinesis, crecimiento celular, endoreduplicacion, genes que controlan el ciclo celular tambien todos los genes que ejercen control en los anteriores: homologos de CDK, ciclinas, E2F, Rb, CKI, Ck, y tambien cualesquiera genes que interfieren con los anteriores, ciclina D, cdc25, Wee1, Nim1, quinasas MAP, etc.
Mas especificamente, los genes que controlan el ciclo celular son todos los genes implicados en el control de entrada y la progresion a traves de la fase S. Estos incluyen, no exclusivamente, genes que expresan "proteinas de control de ciclo celular" tal como quinasas dependientes de ciclina (CDK), inhibidores de quinasa dependiente de ciclina (CKI), ciclinas D, E y A, E2F y factores de transcripcion DP, proteinas de bolsillo, quinasa CDC7/DBF4, CDC�, MCM2-7, proteinas Orc, cdc45, componentes de ligasa ubiquitina SCF, PCNA, ADN-polimerasa.
El termino "proteina de control de ciclo celular" incluye ciclinas A, B, C, D y E que incluyen CYCA1;1, CYCA2;1, CYCA3;1, CYCB1;1, CYCB1;2, CYC B2;2, CYCD1;1, CYCD2;1, CYCD3;1, y CYCD4;1 (Evans et al. 1983; Francis et al. 1998; Labbe et al. 1989; Murray and Kirschner 1989; Renaudin et al. 199�; Soni et al. 1995; Sorrell et al. 1999; Swenson et al. 198 �) proteinas de inhibidor de quinasa dependiente de ciclina (CKI) tal como ICK1 (Wang et al. 1997), FL39, FL��, FL�7 (PCT/EP98/05895), Sic1, Far1, Rum1, p21, p27, p57, p1 , p15, p18, p19 (Elledge 199 �; Pines 1995), p14 y p14ARF; p13suc1 o CKS1At (De Veylder et al. 1997;Hayles y Nurse 198�) y nim-1 (Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b; Fantes 1989; Russell and Nurse 198 �; Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b) homologos de Cdc2 tal como Cdc2MsB (Hirt et al. 1993) quinasa .CdcMs (Bogre et al. 1997) fosfatasas cdc2 T14Y15 tal como fosfatasa de proteina Cdc25 o p80cdc25 (Bell et al. 1993; EIledge 199�; Kumagai and Dunphy 1991; Russell and Nurse 198�) y Pyp3 (Elledge 199�) proteina quinasa cdc2 o p34cdc2 (Colasanti et al. 1991; Feiler and Jacobs 1990; Hirt et al. 1991; John et al. 1989; Lee and Nurse 1987; Nurse and Bissett 1981; Ormrod and Francis 1993) proteina quinasa cdc2a (Hemerly et al. 1993) quinasas cdc2 T14Y15 tal como wee1 o p107wee1 (Elledge 199� ; Russell and Nurse 198�; Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b; Sun et al. 1999) mik1 (Lundgren et al. 1991) y myt1 (Elledge 199�); quinasas cdc2 T1�1 tal como Cak y Civ (Elledge 199�); fosfatasas cdc2 T1�1 al como Kap1 (Elledge 199�); proteina quinasa cdc28 o p34cdc28 (Nasmyth 1993; Reed et al.
1985) p40MO15 (Fesquet et al. 1993; Poon et al. 1993) quinasa chk1 (Zeng et al. 1998) quinasa cds1 (Zeng et al. 1998) quinasa H1 asociada con crecimiento (Labbe et al. 1989; Lake and Salzman 1972; Langan 1978; Zeng et al. 1998) quinasas MAP descritas por (Binarova et al. 1998; B6gre et al. 1999; Calderini et al. 1998; Wilson et al. 1999).
Otras proteinas de control de ciclo celular que estan implicadas en la entrada mediada por ciclina D en G1 de G0 incluyen pRb (Xie et al. 199�; Huntley et al. 1998) E2F, RIP, MCM7 y potencialmente proteinas como pRb p107 y p130.
Otras proteinas de control de ciclo celular que estan implicadas en la formacion de un complejo pre-replicativo en uno o mas origenes de replicacion, tal como, pero no limitado a, proteinas ORC, CDC�, CDC14, RPA y MCM o en la regulacion de la formacion de este complejo pre-replicativo, tal como, pero no limitado a, las proteinas CDC7, DBF4 y MBF.
Para el actual proposito, el termino "proteina de control de ciclo celular" se considerara ademas que incluye una cualquiera o mas de aquellas proteinas que estan implicadas en el recambio de cualquier otra proteina de control de ciclo celular, o en regular la vida util de dicha otra proteina de control de ciclo celular. El termino "recambio de proteina" incluye todas las modificaciones bioquimicas de una proteina que conduce al retiro fisico o funcional de dicha proteina. Aunque no este limitado a esto, ejemplos de dichas modificaciones son fosforilacion, ubiquitinacion y proteolisis. Las proteinas particularmente preferidas que estan implicadas en la proteolisis de una o mas de otra cualquiera de las proteina de control de ciclo celular mencionadas anteriormente incluyen las proteinas derivadas de levadura y derivadas de animal, Skp1, Skp2, Rub1, Cdc20, cullins, CDC23, CDC27, CDC1�, y homologos derivados de planta de los mismos (Cohen-Fix and Koshland 1997; Hochstrasser 1998; Krek 1998; Lisztwan et al. 1998) y Plesse et al in (Francis et al. 1998)).
Para el actual proposito, el termino "genes que controlan el ciclo celular" adicionalmente se tomaran por incluir uno cualquiera o mas de aquellos genes que estan implicados en la regulacion transcripcional de expresion de gen que controla el ciclo celular tal como factores de transcripcion y proteinas de seral en la direccion 5'. No se excluyen los genes adicionales que controlan el ciclo celular.
Para el actual proposito, el termino "genes que controlan el ciclo celular" adicionalmente se tomaran por incluir cualquier gen de control del ciclo celular o mutante del mismo, que se efectua mediante serales ambientales tal como por ejemplo estres, nutrientes, patogenos, o mediante serales intrinsecas tal como los mitogenos de animal u hormonas de planta (auxinas, citoquinas, etileno, acido gibberelico, acido abscisico y brasinoesteroides).
El termino "la progresion del ciclo celular" se refiere al proceso de pasar a traves de diferentes fases del ciclo celular. El termino "indice de progresion del ciclo celular" de acuerdo con lo anterior se refiere a la velocidad en la que se realizan dichas fases de ciclo celular o el tiempo requerido para completar dichas fases de ciclo celular.
"Ensayo de dos hibridos de levadura" significa un ensayo que se basa en la observacion de que muchos factores de transcripcion eucarioticos comprenden dos dominios, un dominio de union de ADN (DB) y un dominio de activacion (AD) que, cuando se separa fisicamente (es decir la interrupcion del enlace covalente) no efectua la expresion del gen objetivo. Dos proteinas permiten interactuar fisicamente con una de dichas proteinas fusionadas a DB y la otra de dichas proteinas fusionada a AD reunira los dominios DB y AD del factor de transcripcion que resulta en expresion del gen objetivo. El gen objetivo en el ensayo de dos hibridos de levadura es usualmente un gen indicador tal como el gen -galactosidasa. La interaccion entre los patrones de proteina en el ensayo de dos hibridos de levadura asi se puede cuantificar al medir la actividad del producto de gen indicador (Bartel and Fields 1997). Alternativamente, se puede utilizar un sistema de dos hibridos de mamifero que incluye por ejemplo un gen indicador que codifica la proteina fluorescente verde quimerica (Shioda et al. 2000). Todavia otra alternativa consiste de un sistema de dos hibridos bacteriano utilizando por ejemplo HIS como gen indicador (Joung et al. 2000).
El termino "fragmento de una secuencia" o "parte de una secuencia" significa una secuencia truncada de la secuencia original denominada. La secuencia truncada (secuencia de acidos nucleicos o proteinas) puede variar ampliamente de longitud; el tamaro minimo es una secuencia de suficiente tamaro para proporcionar una secuencia con por lo menos una funcion comparable y/o actividad o la secuencia original denominada, mientras que el tamaro maximo no es critico. En algunas aplicaciones, el tamaro maximo usualmente no es sustancialmente mayor que aquel requerido para proporcionar la actividad deseada y/o las funciones de la secuencia original. Normalmente, la secuencia de aminoacidos o secuencia de nucleotidos truncada variara de aproximadamente 5 a aproximadamente
�0 aminoacidos de longitud. Mas tipicamente, sin embargo, la secuencia tendra un maximo de 50 aminoacidos de longitud, preferiblemente un maximo de aproximadamente �0 aminoacidos. Es usualmente deseable seleccionar secuencias de por lo menos aproximadamente 10, 12 o 15 aminoacidos o nucleotidos, up to un maximo de aproximadamente 20 o 25 aminoacidos o nucleotidos.
Adicionalmente, las simulaciones de plegado y el redisero de ordenador de motivos estructurales de la proteina de la invencion se puede realizar utilizando programas de ordenador (Olszewski et a1.199 , Hoffman et al. 1995). El
modelamiento de ordenador de plegado de proteina se puede utilizar para el analisis conformacional y energetico de modelos de peptido y proteina detallados (Monge et al. 1995, Renouf et al. 1995). En particular, se pueden utilizar programas apropiados para la identificacion de sitios interactivos de la proteina HOBBIT y la proteina que interactua con HOBBIT mediante busquedas asistenciales de ordenador para las secuencias complementarias de peptido (Fassina and Melli 1994). Los sistemas de ordenador apropiados adicionales para el disero de la proteina y los peptidos se describen en la tecnica anterior, por ejemplo en Berry and Brenner (1994), Wodak (1987), Pabo and Suchanek (198�). Los resultados obtenidos forman el analisis de ordenador descrito anteriormente se pueden utilizar para, por ejemplo la preparacion de imitadores de peptido de la proteina de la invencion o fragmentos de los mismos. Dichos analogos de seudopeptido de la secuencia de aminoacidos natural de la proteina pueden imitar muy eficientemente la proteina progenitora (Benkirane et al. 199�). Por ejemplo, la incorporacion de residuos de aminoacido w aquirales facilmente disponibles en una proteina de la invencion o un fragmento de la misma resulta en la sustitucion de enlaces amino por unidades polimetileno de una cadena alifatica, por lo que se proporciona una estrategia conveniente para la construccion de un imitador de peptido (Banerjee et al. 199�). Los analogos de imitador de peptido superactivos de hormonas de peptido pequeras en otros sistemas se describen en la tecnica anterior (Zhang et al. 199 �). Los imitadores de peptido apropiados de la proteina de la presente invencion tambien se pueden identificar mediante la sintesis de colecciones combinatorias imitadoras de peptido a traves de alquilacion de amina sucesiva y prueba de los compuestos resultantes, por ejemplo, para su union, las propiedades inhibidoras de quinasa y/o inmunologicas. Los metodos para la generacion y uso de colecciones combinatorias de imitadores de peptido se describen en la tecnica anterior, por ejemplo en Ostresh et al. (199�) y Domer et al. (199 �).
Adicionalmente, se puede utilizar una estructura tridimensional y/o cristalografica de la proteina de la invencion para el disero de inhibidores de imitadores de peptido de la actividad biologica de la proteina de la invencion (Rose et al. 199�, Ruterber et al. 199� ).
Los compuestos que se van a obtener o identificar en los metodos de la invencion pueden ser compuestos que son capaces de unirse a cualquiera de los acidos nucleicos, peptidos o proteinas de la invencion. Otros compuestos interesantes que se van a identificar son compuestos que modulan la expresion de los genes o las proteinas de la invencion de tal forma que se mejora o reduce la expresion de dicho gen o proteina mediante la accion de dicho compuesto. Alternativamente el compuesto puede ejercer su accion al mejorar o reducir directamente o indirectamente la actividad de cualquiera de la proteinas de la invencion.
Dicho compuesto o pluralidad de compuestos puede estar comprendido, por ejemplo, muestras, por ejemplo, extractos celulares de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Adicionalmente, dichos compuestos se pueden conocer en la tecnica pero hasta ahora no se sabe que son capaces de suprimir o activar las proteinas que interactuan con el ciclo celular. La mezcla de reaccion puede ser un extracto libre de celula que puede comprender una celula o cultivo de tejido. Las configuraciones adecuadas para el metodo se conocen por la persona experta en la tecnica y, por ejemplo, se describen de manera general en Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, tercera edicion (1994), en particular Capitulo 17. La pluralidad de compuestos, por ejemplo, se puede agregar a la mezcla de reaccion, medio de cultivo o se inyectan dentro de la celula.
Si se describe una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos, entonces es posible aislar el compuesto que forma la muestra original identificado que contiene el compuesto capaz de actuar como un agonista, uno puede subdividir adicionalmente la muestra original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de diferentes compuestos, con el fin de reducir el numero de diferente sustancias por muestra y repetir el metodo con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente se pueden realizar varias veces, preferiblemente hasta la muestra identificada de acuerdo con el metodo de la invencion solo comprende un numero limitado de o solo una sustancia. Preferiblemente dicha muestra comprende sustancias o quimicos similares y/o propiedades fisicas, y mas preferiblemente dichas sustancias son identicas. Preferiblemente, el compuesto identificado de acuerdo con el metodo descrito anteriormente o su derivado se formula adicionalmente en una forma adecuada para la aplicacion en siembra de planta o celula de planta y cultivo de tejido.
La invencion, ahora se describe de manera general, se entendera facilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen unicamente para propositos de ilustracion de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invencion y no pretenden limitar la invencion.
Leyendas de las figuras
Figura 1. Caracteristicas fenotipicas de plantulas Arabidopsis thaliana mutantes de hobbit (hbt).
El fenotipo de plantula hobbit muestra que el gen HOBBIT (HBT) se requiere para la division celular postembriogenica en el meristema de raiz y en los meristemas apicales de brote. Los alelos fuertes carecen de division celular en el meristema de raiz de la etapa clave del inicio de embriogenia. La apariencia de las plantulas 7 dias despues de germinacion en 0,8 % plantagar se muestra (A) una planta A. thaliana tipo natural (ecotipo Columbia-O;
Col-O), (B) una plantula hbt2311 A. thaliana homocigoto mutante (Col-O), (C) una plantula hbPGII-24/1 A. thaliana homocigoto mutante (ecotipo Landsberg erecta; Ler), y (D) una plantula hbte5� A. thaliana mutante (ecotipo Col-O). Los mutantes se muestran en 4 x de magnificacion con relacion a la plantula tipo natural (Willemsen et al. 1998).
Figura 2. Expresion de gen marcador de caliptra de raiz y caliptra de raiz lateral.
La punta de raiz distal de Arabidopsis contiene tipos de celulas especializados tal como aquellos que construyen el capilar de raiz de columnela o el capilar de raiz lateral. Estos tipos de celulas no se especifican en plantulas hbt, lo que demuestra que la actividad de gen HBT se requiere para la especificacion del destino celular en la punta de raiz distal. Se ilustran la expresion del gen marcador especifico caliptra de raiz que comprende el promotor 35S::B2 vinculado funcionalmente al marcador GUS (A, C) y la expresion del gen marcador especifico caliptra de raiz lateral que comprende el promotor LRC244 vinculado funcionalmente al marcador GUS (B, D). Las raices A. thaliana tipo natural (ecotipo Col-O) se muestran en (A) y (B), la punta de raiz de una plantula hbr2311 A. thaliana homozigota mutante se describe en (C) y (D) (Willemsen et al: 1998). El capilar de raiz se tire abundantemente en (A) y las flechas (B) apuntan a las capas de celulas de caliptra de raiz lateral que expresan GUS. No es evidente terido GUS en (C) y (D). La barra representa aproximadamente 45 mm.
Figura 3. Expresion de gen marcador caliptra de raiz ectopica y formacion de capilar de raiz ectopica en plantulas A. thaliana de mutante hbt.
Los cambios post-embriogenicos en el patron de expresion de gen y la identidad celular en la epidermis demuestran que el gen HBT se requiere para la determinacion de destino celular en tipos celulares de no raiz. Esto se ilustra por la expresion del marcador caliptra de raiz (35S::B2 vinculado funcionalmente a GUS) no solo en el capilar de raiz sino tambien ectopicamente en el hipocotilo y las cotiledoneas (A) de plantulas hbt2311 A. thaliana mutantes, y mediante la formacion de capilares de raiz ectopicas en el hipocotilo de las plantulas hbt2311 A. thaliana mutantes que crecen en la oscuridad (B).
Figura 4. Centro inactivo y expresion de gen de marcador de endodermis de raiz.
La punta de raiz de Arabidopsis contiene tipos celulares especializados tal como aquellos que construyen el centro inactivo (QC) o la endodermis. El QC no se especifica en plantulas hbt, lo que demuestra que se requiere actividad del gen HBT para especificacion de las celulas QC en la punta de raiz. Se ilustran la expresion del gen marcador especifico QC que comprende el promotor QC4� vinculado funcionalmente al marcador GUS (A, C) y la expresion del gen marcador de endodermis de raiz que comprende el promotor SCARECROW (SCR) vinculado funcionalmente al marcador GUS (B, D). Las raices A. thaliana tipo natural (ecotipo Col-O) se muestran en (A) y (B), la punta de raiz de una plantula hbt2311 A. thaliana homozigota mutante se describe en (C) y (D). El QC se tire abundantemente en (A) y la endodermis es visible en (B). No es evidente el terido GUS en (C) pero es aun visible en (D).
Figura 5. Transferencia de celulas epidermicas en plantulas A. thaliana de mutante hbt.
Las plantulas A. thaliana tipo natural y las plantulas hbf2311 A. thaliana homozigotas mutantes se criofijan y se toma una fotografia mediante microscopia de electrones de exploracion. Son claramente visibles las disposiciones irregulares de celulas epidermicas hinchadas de cotiledoneas y hipocotilo de la plantula mutante (C) comparado con cotiledoneas (A) y hipocotilo (B) de la plantula tipo natural.
Figura �. Estabilizacion de ciclina B1 en plantulas A. thaliana de mutante hbt.
La estabilidad de ciclina B1 se evalua indirectamente por medio de tincion GUS. El promotor B1 de ciclina A. thaliana se vincula funcionalmente al dominio de inestabilidad de ciclina B1, es decir secuencia de destruccion, seguido por GUS. La estabilizacion de GUS conduce a tincion GUS aumentada en la plantula de hbf2311 A. thaliana de mutante homocigoto (B) con relacion a una plantula tipo natural (A) Aunque las plantulas tipo natural muestran fuertemente la tincion GUS (indicado por flechas), un patron irregular de tincion GUS es obvio en el fondo genetico mutante hbt.
Figura 7. Estabilizacion de AXR3 en plantulas A. thaliana de mutante hbt.
La estabilidad de AXR3 se evalua indirectamente por medio de tincion GUS. El promotor de choque termico de tabaco se vincula funcionalmente al dominio I y la inestabilidad del dominio II de AXR3 seguido por GUS. La estabilizacion de GUS conduce a tincion GUS aumentada en la plantula hbt2311 A. thaliana homozigota mutante (B) con relacion a una plantula tipo natural (A). Aunque las plantulas tipo natural muestran fuertemente tincion GUS, un patron irregular de tincion GUS (indicado por flechas) es obvio en el fondo genetico hbt mutante.
Figura 8. Alineacion de secuencia de aminoacidos de Cdc27A y HBT/Cdc27B.
Se alinean las secuencia de aminoacidos de Cdc27A (numero de acceso GenBank AC001�45; ID de proteina AAB�3�45.1) y de HBT/Cdc27B2 de A. thaliana ecotipo Columbia (Col-O). La parte terminal NH2 de la proteina HBT/Cdc27B no anotada en el GenBank (numero de acceso AC00�081; ID de proteina AAD2439�.1) esta bajo corchete e indicada por la SEQ ID NO 5. Se introducen espacios (-) para asegurar una alineacion optica. Los aminoacidos optimos se sombrean en un recuadro negro. Los aminoacidos similares (los grupos M, I, V, L; R, K, H; F, W, Y; D, E; N, Q; S, T) se sombrean en un recuadro gris.
Figura 9. Representacion esquematica del marco de lectura abierto HBT y la secuencia de proteinas e indicacion de las mutaciones hbt diferentes.
Los codones de inicio y parada se subrayan. En el nivel de aminoacido, el codon de parada se representa por un '*'. Se indican entre parentesis cuadrados y se sombrean en un recuadro gris los diferentes dominios de repeticion de tetratricopeptido (TPR) de HBT con base en la delineacion de los TPR en Cdc27 de levadura (Lamb et al. 1994). Se indican adicionalmente en los cuadros los diversos puntos de mutacion caracterizados en diferentes mutantes hbt, el nucleotido y aminoacido mutados se sombrean en un recuadro negro. El numero mutante se indica por fuera del cuadro, por ejemplo hbt5421. En un mutante, hbt2311, el residuo de glutamina se cambia en un codon de parada indicado por '*' y se sombrea en un recuadro negro. Ocurren tres mutaciones en los limites de intrones y resultan en la eliminacion de parte de la proteina HBT. La insercion se aisla independientemente cuatro veces y se indica por hbt5422, hbt5423, hbt5859, hbt9� 24. Los tramos de nucleotidos y aminoacidos insertados se delimitan por parentesis cuadrados y se subrayan. Los mutantes de eliminacion son hbt9 �20 y hbt5721 y las eliminaciones se indican entre parentesis redondos y la secuencia de nucleotidos eliminada se sombrea en un recuadro negro. El numero de aminoacidos a la derecha no tiene en cuenta la insercion o las eliminaciones.
Figura 10. Representacion esquematica del gen HBT con indicacion de intrones, exones y mutaciones de puntos hbt.
Los codones de inicio y parada se subrayan. Los exones se sombrean en un recuadro gris. Las mutaciones de punto indican adelante la secuencia de nucleotidos y se sombren en un recuadro negro y con el numero mutante, por ejemplo hbt5421.
Figura 11. Analisis de hibridacion In situ de HBT/CDC27B y expresion AtCDC1� en embriones A. thaliana tipo natural.
Se realiza hibridacion in situ con sondas de ARN anticodificantes marcadas DIG especificas de gen. Un patron de expresion irregular HBT es visible en etapa octante (A) y etapa clave (B) de embriones A. thaliana tipo natural. Como un control negativo, se realiza hibridacion in situ con una sonda de ARn codificante marcada DIG en embriones en etapa octante (C). Un patron de expresion AtCDC1� uniforme es visible en etapa octante (D) y etapa clave (E) de embriones A. thaliana tipo natural.
Figura 12. Analisis de hibridacion in situ de expresion HBT/CDC27B, AtCDC1� y AtCDC27A en raices de plantulas
A. thaliana tipo natural.
Se realiza hibridacion in situ con sondas de ARN anticodificantes marcadas DIG especificas de gen. Un patron de expresion irregular HBT es visible en una seccion cruzada de una raiz (A) y una raiz mutante completa (B) de plantulas A. thaliana tipo natural. Una expresion uniforme en una raiz mutante completa de plantulas A. thaliana tipo natural se observa para AtCDC1� (C) y AtCDC27A (D).
Figura 13. Lista de secuencias (SEQ ID NOs).
Figura 15. Ensayo de complementacion de levadura
La expresion de AtCDC27A y HOBBIT comparado con un vector vacio pREP3 bajo el promotor represible de tiamina en S. pombe nuc2ts, a la temperatura permisiva (25" C, A) y la temperatura restrictiva (37" C, B)
Figura 1�. Patron de expresion del gen HBT.
La expresion HBT durante embriogenia (A-D) y post embriogenia (M-O) en raices tipo natural utilizando sondas anticodificantes (A, B, D, M y N) y codificantes (C y O). Expresion HBT en embriones hbt mutantes con una sonda anticodificante (E y codificante (F). Expresion AtCDC27At de embriones tipo natural (G-I) y plantulas (P-R) con sondas anticodificante (G, K, P y Q) y codificante (I y R). Marcado doble de AtCYC2B (J) y HBT (K) en una seccion unica (ambos sondas anticodificantes) y marcado doble de sondas AtCYC2B anticodificante y HBT codificante en una seccion unica como un control (L). En ambos casos la deteccion de la sonda AtCYC2B anticodificante (fast red)
se realiza seguido por una etapa de inactivacion de la fosfatasa alcalina y el marcado y deteccion de la sonda (anti)codificante HBT (NBT/BCIP).
Figura 17. Aplicacion de auxima exogena.
Expresion de DR5::GUS en raices tipo natural (A-E) y en plantulas hbt (E-I). Se transfieren plantulas tres dias post germinacion a placas 0.5 GM (A y F) y las placas 0.5 GM que contienen 1019 M 2,4 D (B y G), 10-8 M 2,4 D (C y H), 10-7 M 2,4 D (D y I) y 10-M 2,4 D (E y J) y se incuban durante otros tres dias. Se muestran mutantes en 10x de magnificacion de la plantula tipo natural.
Figura 18. Mediciones de longitud de celula de hipocotilo y epidermis.
(A)
Longitudes de hipocotilo de mutantes unicos hbt y mutantes dobles hbt axr3-1T germinados en la luz.
(B)
Longitudes de hipocotilo de mutantes unicos hbt y hbt axr3-1T de mutantes dobles germinados en la oscuridad.
(C)
Longitud de celulas epidermicas de hipocotiledoneas de los mutantes unicos hbt y los mutantes dobles hbt axr3-IT. L: Plantulas germinadas en la luz, D: plantulas germinadas en la oscuridad.
Figura 19: Los mutantes hbt contienen niveles mayores de proteina ARX3.
(A)
Analisis RT-PCR de expresion AXR3 en Col-0 Arabidopsis tipo natural (tipo natural) y el fondo mutante hobbit (hbt9� 20 y hbt5722). Se extrae el ARN de plantulas mutantes y tipo natural. Despues de sintesis de cADN, se realiza PCR respectivamente utilizando cebadores especificos AXR3, y ubiquitina (UBQ) como control constitutivo. Los resultados muestran que el mARN AXR3 son menores en el tipo natural.
(B)
Analisis Western blot de expresion AXR3/IAA17 en Col-0 Arabidopsis tipo natural (tipo natural) y el fondo hobbit (hbt2311, hbt9�20 y hbte5 �). Las proteinas se extraen de las plantas completas (10 d.p.g.), se cuantifican, y 1 mg se separa en un gen de poliacrilamida 15 %. Despues de la transferencia, las membranas se incuban primero con el anticuerpo anti-AXR3/IAA17 (transferencia superior), y luego con anticuerpo anti-actina (transferencia inferior) como el control de la carga de proteina. El resultado muestra que los mutantes hbt acumulan una banda en el tamaro AXR3 esperado.
(C)
Analisis Western de expresion AXR3/IAA17 en hbt2311 y hbt2311, axr3GT3958 (plantas individuales de 3 cruces independientes). El experimento se lleva a cabo en las mismas condiciones como B, excepto que las plantas son 25
d.p.g. El resultado muestra que la vasta mayoria de proteinas detectadas por el antisuero en plantulas hbt es AXR3/IAA17.
Los marcadores de peso molecular en kilo Dalton (kDa) se indican en el lado derecho del panel B y C y. La banda esperada de ARX3 se indica por una flecha). Como un control la proteina ACTIN tambien se tire en los mismos extractos de planta.
Figura 20: Contenido de ADN nuclear en hipocotiledoneas despues de endoreduplicacion.
El histograma del contenido de ADN de las celulas hipocotiledoneas de plantas arabidopsis tipo natural (tipo natural) y plantas mutantes hbt (hbt2311). La distribucion ploidia de las diferentes celulas se mide de acuerdo con el contenido de ADN.
EJEMPLOS
Para todas las etapas de clonacion molecular, y a menos que se indique otra cosa, se siguen los protocolos estandar como se describe en Sambrook et al. 1989.
Ejemplo�1. Identificacion de plantas Arabidopsis thaliana de hbt mutante y analisis de complementacion.
Se han identificado once alelos del gen HBT, todos con similares fenotipos mutantes (Willemsen et al., 1998). Debido a que se han inducido todas las mutaciones por EMS, el aislamiento del gen HBT basado en su posicion de mapa es el metodo mas directo. Diversos factores influencia de la eficiencia del mapa con base en el procedimiento de clonacion. Primero, el tamaro de la poblacion de mapeo es muy importante. Cuando se generan muchos recombinantes aumenta la oportunidad de que exista un evento de cruce cerca al gen de interes y asi se reduce el numero de genes candidatos que se han secuenciado para identificar el gen mutante. Segundo, aunque EMS usualmente introduce los cambios de par base unico, existe un cambio pequero de redisposiciones cromosomicas
que interfieren fuertemente con la calidad de poblacion de mapeo. Cuando dicha redisposicion rodea el locus mutante, no habra recombinacion en esta area, debido a que las redisposiciones interfieren con la alineacion correcta de cromatidas homologos durante meiosis necesaria para la ruptura precisa, intercambio y reunion de los cromatidas en el proceso de recombinacion. Por lo tanto generamos dos poblaciones de mapeo, utilizando diferentes alelos. Tercero, la cantidad de informacion que esta disponible a cerca de la region cromosomica del gen mutado. Si la region cromosomica en la que el gen mutante se ubica se cubre por un gran numero de marcadores, estos se pueden utilizar para el mapeo fino del locus mutante. Sin embargo, si los marcadores disponibles son escasos, se han desarrollado nuevos marcadores, que consumen tiempo. Diversos mapas detallados se han generado al combinar datos marcadores moleculares y geneticos disponibles que proporcionan una estructura principal para el mapeo del locus mutante (Chang et al., 1988; Nam et al., 1989; Talon et al., 1990; Reiter et al., 1992; Hauge et al., 1993). Una gran conexion de polimorfismos de nucleotido unicos (SNP) entre Col-0 y Ler se ha publicado recientemente en la Base de Datos Arabidopsis thaliana que se puede utilizar para diserar nuevos marcadores moleculares. Aunque muchos marcadores clasicos dependen de la presencia de un polimorfismo en un sitio de restriccion, se han desarrollado diversos nuevos marcadores moleculares que distinguen diferentes ecotipos mediante un polimorfismo unico de nucleotido. y finalmente, la informacion disponible a cerca de la secuencia del genoma Arabidopsis completo que facilita un desarrollo rapido de nuevos marcadores moleculares, debido a que tambien se proporciona informacion a cerca de la posicion de los genes. Esto es importante cuando se han desarrollado marcadores moleculares para combinaciones de ecotipo diferentes a Col-0 y Ler, para los que es una cantidad limitada de los SNP conocidos. En este caso, las regiones intragenicas seleccionadas para generacion de marcador aumentara el cambio para identificar polimorfismos.
Generamos un conjunto de recombinantes y mediante deteccion de esta coleccion de recombinantes con marcadores publicados (morfologicos y moleculares) y nuevos marcadores (moleculares) que se han desarrollado en nuestro laboratorio, somos capaces de posicionar el locus hbt en un intervalo de ADN de aproximadamente 120 kb. En este punto iniciamos el secuenciamiento en los marcos de lectura abiertos presentes en este intervalo en el fondo mutante de dos alelos Col-0 y esto revela mutaciones en una de las unidades de transcripcion. Confirmamos que esta unidad de transcripcion representa el gen HBT mediante secuenciamiento de todos los alelos mutantes y mediante analisis de complementacion. Mas en detalle, estos experimentos fueron llevados a cabo como sigue.
Para experimentos de mutagenie se utiliza Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia-0 (que contiene un transgen de marcador que consiste del promotor del gen S-adenosil-metionina-sintetasa expresado vascular (SAM) fusionado a
-
glucuronidasa; Peleman et al., 1989). Las semillas secas se mutagenizan con 10 mM etil metano slufonato frescamente hecho (EMS) en agua durante 24 horas a 22" C. Las semillas se siembran en el suelo y se cultivan en un camara de planta a 22" C, 75 % de humedad con un ciclo de 1 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Las silicuas individuales que representan 10,000 familias M1 se cosechan, luego las semillas se suspenden en 0.1 % de agarosa y se ponen en placas en un medio que contiene 0.8 % de agar de planta (Duchefa) y 50 mg/ml de ampicilina.
Las plantulas M2 agrupadas en familias individuales se detectan bajo un microscopio para diseccion Zeiss stemi SV
para los mutantes defectuosos de meristema de raiz al pre-seleccionar mutantes con longitud de raiz severamente reducida, y analisis posterior de la estructura caliptra de raiz en especimenes depurados (vease Ejemplo 3). La progenie M3 de los hermanos de mutantes candidatos con estructura caliptra de raiz aberrante se vuelve a probar el fenotipo mutante, y se depuran las preparaciones de ovulo (vease Ejemplo 3) se examinan utilizando opticas Nomarski para detectar anormalidades en el desarrollo del embriones. Se recuperan seis alelos hbt, 2311, 5721, 5859, 8052, 9 �20 y 9�24. 7.7 % de las familias M1 segregan mutantes de clorofila, y se recuperan � monopteros y 7 alelos gnom (analisis de complementacion por T. Berleth y U. Mayer, datos no mostrados). El alelo hbt1�11 se recupera de un experimento de mutagenia separado realizado anteriormente al utilizar semillas Landsberg erecta. Los alelos hbt GVI-20/1, GVII-24/1, G221-30/2 (ecotipo Landsberg erecta) se proporcionan por G. Jurgens (University of Tubingen) y el alelo hbfe5� (ecotipo Columbia-0) se proporciona por C. Bellini y H. H6fte (INRA, Versailles).
En las pruebas de complementacion combinamos alelos hobbit (con el marcador dominante SAM-GUS) como donantes con los alelos Ler o hbfe5 como receptores, que permiten la seleccion de eventos de polinacion cruzada exitosos. No se observa complementacion en combinaciones del alelo de referencia hbt2311 con hbte5�, hbtGVI20/1, hbtGVII-24/1 hbt221-30/2 y hbt1� 11, en combinaciones de hbt5859 con hbre5� y hbtGVII-24/1, en combinaciones de hbt5721 y hbf9� 24 con hbtGVI-20/1, y en combinaciones de hbt8052 y hbt9�20 con hbtGVII-24/1, poniendo asi todos los alelos hbt en un grupo de complementacion unico (Willemsen et al. 1998).
Ejemplo 2. Recombinacion de mapeo del locus hbt.
Se utilizan plantas heterozigotas hbtGVI-20/1 (ecotipo Ler) para polinizar plantas Col-0 y se seleccionan plantas F1 que segregan mutantes. Los mutantes individuales F2 hbt se cultivan en nitrogeno liquido, y se suspenden en 200 ml de ddH2O. Se analizan dos a ten ml de los aislados de ADN utilizando CAPS y marcadores microsatelite (Koorneef and Stam, 1992). Las frecuencias de recombinacion en cromosomas n hbt se calculan como r = nCol/(nCol + nLer), y se calculan las distancias geneticas utilizando la funcion de mapeo Kosambi. El ligado se observa entre hbt y los
marcadores de cromosoma II m24 (cromosomas recombinantes 8/52, 15.4� 5.5 cM) y GPA1 (cromosomas recombinantes 24/294, 8.2�1.� cM). El alelo Col-0 hbt 2311 se cruza posteriormente con una estirpe Ler con marcadores de flanqueo sti y er. Las estirpes F2 con cromosomas recombinantes se seleccionan con base en la apariencia de "solo sti" y "solo er". Se prepara ADN de estirpes F3 de estos recombinantes que segregan hbt, y una variedad de marcadores CAPS y SNP se utilizan para mapear el gen en una region en BAC F�F22 y T2G17.
Sin embargo, los dos marcadores mas cercanos que flanquean el gen HBT se ubican en dos BAC que se sobreponen parcialmente, F F22 y T2G17. La distancia fisica entre los dos marcadores es aproximadamente 120 kb. Estos dos BAC se secuencian mediante el Genoma Iniciador Arabidopsis (AGI) y 30 marcos de lectura abiertos putativos (ORF) se predicen en esta area. Para amplificar y secuenciar estos ORF candidatos, se diseran cebadores. El ADN se aisla de dos alelos Col-0 hbt (hbt2311 y hbt9� 20, PCR amplificado y secuenciado. Los cebadores PCR que consisten de 30 nucleotidos se diseran con un promedio de temperatura de fusion de �5" C utilizando el programa Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer. htm). Se mezcla 5-10 mg de ADN con una mezcla PCR (75 mM Tris-HCl pH 9.0; 20 mM (NH)4SO4; 0.1 %. Tween 20; 2mM MgCl2; 200 !M dNTP; cebadores 200 !M; 1u polimerasa). El ADN se amplifica a traves de 35 ciclos (94" C durante 1 min, �0" C durante 1 min y 72" C durante 1.5 min por ciclo) y se detecta en 1 % de gel de agarosa (Hispanagar). Para productos de secuenciamiento de dos amplificaciones PCR independientes se lavan sobre una columna (Equipo de Purificacion de Producto PCR Altamente Puro: Boerhinger Mannheim). Se realizan reacciones de secuencia utilizando la Premezcla de Secuenciamiento Grande de Terminador de Tinte (GENPAK LTD) y se analizan en un Analizador Genetico ABI PRISM 310.
Las secuencias obtenidas se comparan con la secuencia Col-0 publicada en la base de datos del Centro Nacional para Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Identificamos mutaciones para estos dos alelos solo en ORF T2G17.20 y se decide secuenciar este ORF en el fondo mutante de los otros alelos hbt. Ocho mas alelos hbt revelan los cambios de secuencia en T2G17.20, por lo tanto concluimos que esta unidad de transcripcion representa el gen HBT.
Analisis de alelos mutantes
Las mutaciones en los alelos hbt se identifican mediante productos de secuenciamiento de dos reacciones PCR independientes de plantulas mutantes.
(Cebadores:
SEQ ID Nr. 41: HBT AF: AGAGTGACCTACTTACTACATTGGTACAAAACC;
SEQ ID Nr. 42: HBT AR: CCCATTAAAGCGTAAACGCTGCTCTCTGAAG;
SEQ ID Nr. 43: HBT BF: TATTCAAATGGTCAATTATAAAGCCCAATAAG;
SEQ ID Nr. 44: HBT BR: TGAATGAATACTTTCTCAACTACTATTGAAGC;
SEQ ID Nr. 45: HBT CF: TATGAGTCAACTGTTAGAGGAATGTCTCTG;
SEQ ID Nr. 4�: HBT CR: GAAGTTGACAGTTGTTGCATATACTGC;
SEQ ID Nr. 47: HBT DF: TCTTACACTTTTCTGTCTGCTCAACTTTCA;
SEQ ID Nr. 48: HBT DR: CAAAGAACTCAATTTAGAACCTCCCAAATAC;
SEQ ID Nr. 49: HBT EF: CAGATTTCTGGCAGACTATTTTCTGATTCT;
SEQ ID Nr. 50: HBT ER: AAGTAACTCAGCTTCATGTCTTCCTTCAAA;
SEQ ID Nr. 51: HBT FF: GATATTTATTTGCAGCATTTGAAGGAAGAC;
SEQ ID Nr. 52: HBT FR: GAATTTTCAGATTTAAAAACCATCATTGGA;
SEQ ID Nr. 53: HBT GF: AGTCTTTAAAACAGAGTCGTCCAATGATG;
SEQ ID Nr. 54: HBT GR: ATATTGCGATTAGGTAGTGTTACGGACAAC.
Se sintetiza el cADN de ARN de los mutantes de division (GVII-24/1, G221-30/2,5859, 9�24, 9�20 y 5721) y la region de interes se amplifica PCR y se secuencia.
Ejemplo 3. Analisis fenotipico de plantas Arabidopsis thaliana hbt mutantes.
La estirpe de marcador caliptra de raiz que contiene el promotor 35S::B2 fusionado con GUS (� -glucuronidasa) (Benfey et al., 1990) (figura 2 y 3) y la estirpe de marcador caliptra de raiz lateral que contiene el promotor especifico caliptra de raiz lateral LRC244 fusionado con GUS (Malamy and Benfey, 1997) (figura 2) se proporcionan por P. Benfey (New York University). La estirpe de marcador que contiene el gen quimerico que comprende el promotor especifico de centro inactivo GC4� y el gen GUS (figura 4) se obtiene de la coleccion INRA-Versailles. La estirpe de marcador que contiene el promotor SCARECROW (SCR) fusionado con GUS (pSCR::GUS) (figura 4) se proporciona por Dr. Philip Benfey (Wysocka-Diller et al., 2000). Se utiliza el pGL2::GUS (Masucci et al., 199�).
La estirpe de marcador que contiene el promotor de choque termico de soja HSP19 que dirige la expresion de la proteina de fusion que comprende los dominios I y II AXR3 seguido por GUS (figura 7) se obtiene de O. Leyser (University of California at Davis). La estirpe de marcador que contiene el promotor A. thaliana de ciclina B1 (Ferreira et al. 1994) dirige la expresion de la proteina de fusion que comprende la secuencia de destruccion de ciclina B1 seguido por GUS (figura �) se proporciona por Dr. Peter Doerner (Salk Institute for biological studies, La Jolla).
Todas las estirpes de marcador se cruzan con heterocigotos hbt. Las estirpes F2 derivadas de estos cruces segregan hbt y homocigotos para los marcadores se seleccionan y analizan por tincion X-gluc como se describe adelante. La expresion de la proteina de fusion AXR3-GUS se activa al aplicar un choque termico (2h a 37" C).
La fijacion, inclusion, corte y microscopia para analisis histologico de plantulas y embriones se realizan como se describio previamente (Scheres et al., 1994, 1995). Para analisis cuantitativo de fenotipos de embriones, los ovulos se depuran durante 10 minutos en una mezcla 8:3:1 de hidrato cloral: agua destilada: glicerol (Mayer et al., 1991) y se visualizan embriones utilizando opticas Nomarski en un fotomicroscopio Zeiss III.
El meristema apical de brote en embriones maduros de hbt2311, hbt5859, hbt5721, hbt8052, hbt9�20, hbtGVII-24/1 y hbtG22130/2 se visualiza mediante microscopia de exploracion laser confocal (CSLM) como se describio previamente (Clark et al., 1995).
Se determinan los numeros de celulas de la raiz en plantulas depuradas con hidrato cloral al contar las celulas corticales en archivos que se extienden desde el centro inactivo hasta el capilar de raiz mas superior. Para mediciones de longitud de raiz las plantulas se cultivan a 1/2 GM (8 g/l de agar de planta Duchefa, 2.2 g/I de Murashige y sales Skoog incluyendo vitaminas, 1 % de sacarosa) durante 10 dias. Despues de depuracion de las plantulas las raices se miden desde la punta hasta el capilar de raiz mas superior utilizando un sistema de analisis de imagen VIDAS RT (Zeiss/Kontron) con un paquete de software que esta disponible en solicitud (M. Terlou, Department of Image Processing and Design, Padualaan 8, 3584 CH Utrecht).
Se visualizan granulos de almidon en el capilar de raiz de columnela con 1 % de solucion lugol (Merck) en plantulas de 3 dias de edad que se cultivan 1/2 GM. Las plantulas se tiren durante 3 minutos, se enjuagan con agua, se depuran con hidrato cloral y se fotografian con opticas Nomarski en un fotomicroscopio Zeiss III con una pelicula Agfa APX-25.
Se determinan los numeros de celulas en el hipocotilo en plantulas depuradas de hidrato cloral de 10 dias de edad. Las celulas corticales se cuentan en archivos del capilar de raiz mas superior para el punto de bifurcacion de cotiledon. Los numeros de celulas en la epidermis de cotiledon de los embriones maduros se cuentan en circunferencia y en secciones longitudinales medias muestran las cotiledoneas y el meristema apical de brote. La actividad de -glucuronidasa en estirpes de marcador transgenico se visualizacion mediante tincion durante 2-1� horas a 37" C en 0.5 mg/ml de X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronida; Biosynth AG) disuelto en ndimetilformamida, 0.1 % de Triton X-100, 0.5 mM K4Fe(CN) .H2O, 0.5 mM K3Fe(CN) , y regulador de fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2.
Ejemplo 4. Hibridacion in situ.
Se realiza hibridacion in situ utilizando una marca de ARN digoxigenina y sistema de deteccion (Roche) (figura 11 y 12).
Sintesis de sonda
La sonda de ARN HOBBIT se sintetiza utilizando un fragmento �00pb de la region de terminal N del cADN. El fragmento se clona en el vector PGMT, que contiene promotores de polimerasa de ARN Sp� y T7. El ARN HBT
anticodificante se sintetiza utilizando polimerasa de ARN T7 y el control codificante control con la polimerasa de ARN Sp�.
Preparacion del material
Los tejidos frescos se fijan 4 horas a 4" C en 4 % de formaldehido luego de infiltracion de vacio (2 min), despues de lo cual se omiten en la etapa gradual de etanol 10 %, 30 %, 50 % y se deja durante la noche a 70 % de etanol. Las muestras luego se tratan con 95 % de etanol 0.1 % de eosina durante la noche y despues de varias incubaciones en 100 % de etanol 0.1 % de eosina; se realizan etapas graduales de xilema (25 %, 50 % y 75 %). El material se embebe finalmente en parafina. Se realizan secciones de 8 mm y se montan sobre portaobjetos cubiertos.
Pretratamiento antes de hibridacion
La parafina se retira mediante tratamiento con xilema y los tejidos se incuban en diferentes concentraciones de etanol (100 %, 95 %, 80 %, �0 %, 30 % y 10 %). Las incubaciones en NaCl 0,83 % 5 min, PBS 5 min, 4 % de formaldehido en PBS luego de estas etapas. Despues de lo cual se ha realizado un tratamiento con proteinasa K, esta etapa se sigue por una deshidratacion gradual con etanol (10 %, 30 %, 50 %, 80 %, 95 % y 100 %).
Hibridacion
Los portaobjetos se hibridan durante la noche a �2 "C.
Lavado y deteccion
Las etapas de lavado se realizan utilizando una solucion de lavado (2xSSC, Formamida 50 %) a �5 "C durante 30 min, despues de lo cual se realizan incubaciones en regulador NT (500 mM NaCi, 10 mM Tris, pH 8). Los portaobjetos se tratan con Rnasa A y despues de incubacion con la solucion de lavado, las muestras se tratan con una solucion de bloqueo (regulador de anticuerpo: 150 mM NaCl, 100 mM Tris, BSA y extracto de planta) durante 1 hora. Se prepara una dilucion 1:1000 de anticuerpo en la misma solucion de bloqueo en donde se incuban las muestras durante 2 horas. Para el Regulador de tincion (100 mM NaCl, 100 mM T, pH9, 5) se agregan los siguientes reactivos de tincion BCIP y NBT (proporcionado por Roche). La incubacion durante la noche a temperatura ambiente y despues de revisar la reaccion de tincion se detiene mediante incubacion en etanol 95 % y los portaobjetos se montan en glicerol 1:1.
Ejemplo 5. Expresion ectopica del gen HOBBIT.
El cADN HOBBIT como se identifica por SEQ ID NO 2 o 3 se vincula funcionalmente a un promotor operacional en construcciones de expresion de plantas se insertan dentro de un vector de transformacion de planta binario adecuado que comprende adicionalmente en su marcador seleccionable T-ADN apropiado. Despues de la transferencia de dichos vectores de transformacion de planta a Agrobacterium tumefaciens por medio de electroporacion, y posteriormente las plantas se transforman con procedimientos de transformacion estandar. Se seleccionan las plantas transformadas en un medio que contiene el agente selectivo apropiado. Se seleccionan homocigotos de plantas T2 para los transgenes introducidos en una forma analoga. Las plantas preferidas que se van a transformar son Arabidopsis thaliana y plantas de cultivo.
Sobreexpresion
Se utilizan diversos sistemas de promotor para dirigir la expresion del gen Hobbit en las plantas transgenicas, tal como el promotor ubiquitina constitutivo, el promotor UAS de levadura activado por el factor de transcripcion GAL4 y el promotor Hsp19.
El promotor responsable GAL4 permite la expresion especifica del gen como sigue: Las estirpes transgenicas A. thaliana que contienen el ORF GAL4 vinculado funcionalmente a una amplia variedad de por ejemplo promotores de gen especificos de tejido o especificos de ciclo celular se obtienen del centro de deposito de Arabidopis de Nottingham (coleccion J. Haseloff). El elemento GAL4 se clona entre los sitios de recombinacion Cre-Lox. Dichas estirpes que expresan GAL4 se cruzan con las plantas transgenicas A. thaliana obtenidas anteriormente para el promotor UAS de levadura responsable de GAL4.
El promotor Hsp19 permitira la expresion inducible Hobbit.
Tambien el promotor cdc2a especifico de ciclo celular, que permite la expresion especifica en celulas de meristema. El promotor 2S2 tambien se utiliza para la expresion directa en celulas almacenadas. Para la expresion en monocotiledoneas, el promotor oleosina se utiliza para la expresion directa en celulas embrionicas, la prolamina para
celulas almacenadas y GOS2 para expresion constitutiva. En una solicitud preferida de expresion hobbit ectopica, estas construcciones se transforman en plantas de arroz por medio de transformacion mediada por agrobacterium.
Los efectos fenotipicos de expresion HOBBIT ectopica se estudian en plantas transgenicas A. thaliana que expresan constitutivamente HOBBIT bajo el control del promotor constitutivo ubiquitina o en la progenie de los cruces que incluyen plantas A, thaliana que expresan ectopicamente HOBBIT en por ejemplo una forma especifica de tejido o especifica de ciclo celular. Alternativamente, la expresion HOBBIT bajo el control de un promotor de choque termico se induce en una etapa post-embriogenica.
Cuando se agrega actividad Hobbit extra a las celulas de planta, las celulas de planta son mas sensibles o mas responsables de auxina. Alternativamente, las celulas de plantas normalmente no son sensibles a la auxina y despues de actividad Hobbit alterada, se hacen sensibles a la auxina. Esta respuesta mayor resulta en efectos fenotipicos tal como, formacion de mas organos tal como formacion de mas raices laterales o diferentes patrones de ramificacion. Tambien se preven otros efectos fenotipicos por la tecnica de la presente invencion debido al efecto pleiotropico de la hormona auxina.
Regulacion por disminucion
La expresion ectopica del ARN anticodificante del gen Hobbit resulta en regulacion por disminucion de la actividad Hobbit en la celula. La actividad Hobbit menor en una celula resulta en una respuesta menor a auxina. La reduccion de los efectos relacionados con auxina en estas celulas resulta en efectos fenotipicos tal como eliminacion o retardo de la formacion de organos tal como eliminacion de raices laterales.
Tambien se preven otros efectos fenotipicos debido al efecto pleiotropico de la hormona auxina.
Co-expresion
El gen Hobbit tambien se expresa ectopicamente (sobreexpresion o regulacion por disminucion) en relacion con la modulacion de otros genes o proteinas. Esto es particularmente interesante para diserar un efecto fenotipico particular, con base en la combinacion de los efectos mediados por cada uno de los genes. Por ejemplo, el gen Hobbit se co-expresa con un gen implicado en los efectos de citoquinina. Se sabe que ambas auxinas, que actuan en la fase S, y citoquinina, que actuan en la fase M son necesarias para inducir la division celular normal en plantas.
Tambien, el gen Hobbit se co-expresa con otros genes que codifican un factor limitante en el proceso de ciclo celular, mas particularmente un factor limitante del APC. Aqui, se re-establece un equilibrio de ambas proteinas, pero ahora en un nivel mayor que el normal.
Alteracion de expresion endogena
Otra aplicacion de la presente invencion es la recombinacion mediada por CRE-lox que crea perdida de clones de funcion en el fondo tipo natural. Con este metodo las plantas se transforman con una construccion que lleva una copia tipo natural del gen HBT dirigido por su propio promotor entre dos sitios lox. Estas plantas transgenicas luego se tratan con un choque termico corto, activando la recombinacion dirigida CRE y la eliminacion del gen HBT. Introduciendo esta construccion en un fondo de mutante hbt resulta en una planta tipo natural complementada. La activacion CRE de choque termico posterior asi crea clones mutantes en una planta tipo natural heterozigota de otra forma. Esto es un sistema poderoso debido a estos clones mutantes se estudia la funcion del gen, sin defectos a largo plazo y posibles indirectos. Dichos efectos probablemente estan presentes en el mutante hbt. Tambien es posible inducir estos clones en plantas de adulto, para estudiar la funcion HBT en la planta adulta por ejemplo durante desarrollo de flores. Estos experimentos proporcionan informacion importante y poderosa de como el gen HBT liga la progresion del ciclo celular para competencia de desarrollo.
Ejemplo 6: Complementacion de levadura: funcion de HOBBIT en el APC
La region codificante del cADN HBT se amplifica por PCR utilizando los siguientes cebadores: SEQ ID Nr. 55: YC F: GAAGTCGACACAAACTATGGAAGCT y SEQ ID Nr. 5 : YC R: AATCATACCCAAGGATCCTGGAG. El PCR se lleva a cabo utilizando el Sistema de Amplificacion ELONGASE esencialmente como se recomienda por la fabricacion (Life Technologies), excepto que las reacciones se ciclizan automaticamente a traves de ciclos de tiempo/temperatura como sigue: desnaturalizacion 94" C/1 min; hibridacion 50" C/1 min, y extension �8" C. El fragmento de ADN amplificado resultante se purifica a traves de gel de agarosa, y se introduce en pGEM-T (Promega). Se secuencia el plasmido resultante. Se libera el inserto de aproximadamente 2,4 kb mediante digestion con Sall y BamHI y transcripcionalmente fusionado con el promotor represible tiamina (not1) en el vector lanzadera de levadura pREP3 (Maundrell, 1990), que contiene LEU2 como un marcador seleccionable. La construccion de plasmido se transforma en la cepa Schizosaccharomyces pombe nuc2-��3 (Hirano et al., 1988), utilizando el metodo
de acetato de litio (Okasaki et al., 1990). Se inoculan las colonias resultantes Leu+ en medio liquido minimo (Moreno et al., 1991) que contiene 5mM tiamina y se cultivan durante la noche a 25" C. Las celulas se lavan en medio minimo sin tiamina, dividido en dos matraces y se cultivan a 25" C durante 1 hr para inducir el promotor. Un matraz se cambia a 37" C, el otro se mantiene a 25" C y las muestras se toman cada dos horas para medir la densidad optica.
El cADN HBT complementa parcialmente una mutacion nuc2ts en S. pombe (vease figura 15).
Ejemplo 7: Hibridacion in situ:
La expresion de HBT es regulada por el ciclo celular y la expresion del gen HBT se regula por el ciclo celular con un pico de expresion en la fase G2/M.
Se realizan hibridaciones in situ utilizando una marca de ARN digoxigenina y sistema de deteccion (Roche). Las sondas codificante y anticodificante de diferentes regiones de cADN del gen HBT y se sintetizan CDC27At (figura 1�): parte del ORF de terminal N, central, y terminal C. Se utilizan los siguientes cebadores:
SEQ ID Nr. 57: HBT NF: GCAACAACTGTCAACTTCCCTCGGCTT
SEQ ID Nr. 58: HBT NR: AGAACCAGTCGTTGAGGCAGTATTAGGCC;
SEQ ID Nr. 33: HBT 2F y SEQ ID Nr. 34: HBT 2R; SEQ ID Nr. 35: HBT 3F y SEQ ID Nr. 3� : HBT 3R;
SEQ ID Nr. 59: CDC27 1 F: ATGATGGAGAATCTACTGGCGAATTG;
SEQ ID Nr. �0: CDC27 1R: CATCGAGGAAAGAGAAGGTGCATAG;
SEQ ID Nr. �1: CDC27 2F: ATCCTAGTGAATCTTCCCCGGATCG;
SEQ ID Nr. �2: CDC27 2R: AGCCAGTTGAAATTGATGCTGCG;
SEQ ID Nr. �3: CDC27 3F: GATGCAGAGAGATGCTACCGGAAGGC;
SEQ ID Nr. �4: CDC27 3R: CTAAATGCAAAATGTGACCATGATTG
Los tejidos se fijan, se deshidratan y se embeben como se describe (Wilkinson and Nieto, 1993). Se realiza hibridacion a �2" C y las etapas de lavado se llevan a cabo bajo condiciones exigentes (2xSSC, 50 % de formamida a �5" C). Se realizan marcas dobles de acuerdo con Long and Barton (1998). La sonda AtCYC2B anticodificante se marca con digoxigena-11-UTP y las sondas HBT anticodificante y codificante con fluoresceina-12-UTP. Primero se detecta AtCYC2B utilizando el anticuerpo anti-digoxigena (1:1250) al que se conjuga la fosfatasa alcalina (Boehhringer Mannheim). Se utiliza Fast Red como un sustrato. Luego se detectan transcriptos HBT utilizando el anticuerpo anti-fluoresceina (1:�000) tambien conjugado con fosfatasa alcalina. Se utiliza NBT/BCIP como un sustrato.
El material de planta de microscopia de luz se depura y se monta de acuerdo con Scheres et al., 1994 y se fotografia utilizando un microscopio Axioskope 2 con opticas Nomarski (Zeiss) y una Camara Digital Nikon (Nikon, DXM1200). Para los tejidos EM de exploracion se fina de acuerdo con (Bowman et al., 1989) y se visualizan con un microscopio Philips XL301abs de Feicompagny.
Ejemplo 8: Estructura de transcripto HBT
Para determinar la secuencia de transcripto correcto del gen hobbit, el ARN se aisla de plantulas Col-0 utilizando un equipo Purescript (Gentra) y se realiza RT-PCR (equipo Ready-togo; Pharmacia) utilizando los siguientes cebadores: SEQ ID Nr. 31: HBT 1F GAAGAAAGGCAACAACTATGGAAGCTATG; SEQ ID Nr. 32: HBT 1 R: GAACTGTCAGTAATAAGGGAGTTTGGGTTT; SEQ ID Nr. 33: HBT 2F: ATGCAACAACTGTCAACTTCCCTCG; SEQ ID Nr. 34: HBT 2R: TATCCATTCCTTCTAAGCAATAAGGAGAAGC; SEQ ID Nr. 35: HBT 3F: AAATTTTAAACCTCCTTAGGACACTCGGA;
SEQ ID Nr. 3 : HBT 3R: TCACGGGCTCTCATCGATCTCATCT.
Adicionalmente, el producto obtenido con los cebadores HBT 1 F y HBT 1 R se utiliza como una sonda para detectar una coleccion de cADN (Giraudat et al., 1992). El cADN identificado se secuencia junto con los productos RT-PCR. El extremo 3' del cADN identificado de HBT se confirma utilizando un equipo 5'/3' RACE (Boehringer Mannheim; cebadores: SEQ ID Nr. 37: HBT 3'2F: GTTCTTGAGGAGCTCAAAGAGTATG y SEQ ID Nr. 38: HBT 3'1F: GCTTTAATGGGCAGGATCTATAAG) y mediante secuenciamiento del producto RACE.
Se determina el sitio de inicio de transcripcion HBT utilizando Proteccion RNasa en 20 mg de ARN total de raices y cotiledoneas y en 1 mg de ARN poli A de plantulas. Un fragmento de ADN 350 bp HBT (cebadores: SEQ ID Nr. 39: HBT BF: TATTCAAATGGTCAATTATAAAGCCCAATAAG y SEQ ID Nr. 40: HBT 5'1R: ACATGAAAATAGCATTTTTGTAGAC), que incluyen el ATG putativo y el inicio de transcripcion, se subclona en un vector pGEMT (Promega). Las sondas de ARN anticodificante y codificante se sintetizan utilizando la polimerasa de ARN T7 y Sp� y el experimento de proteccion de RNasa se lleva a cabo utilizando el Equipo de Proteccion RNasa Ambion RPA II, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En este experimento la sonda de control endogeno utilizada es el ARN 18S proporcionado por Ambion. Las comparaciones con la secuencia de proteinas deducida se realizan utilizando el programa BLAST.
Ejemplo 9: Prueba de sensibilidad de auxina.
Se utilizan construcciones DR5::GUS (Ulmasov et al., 1997b). Las plantulas se germinan en medio 0.5 GM como se describe, 3 dpg transferido a placas 0.5 GM frescas que contienen diferentes concentraciones de 2,4 D o IAA (5.10-9 M hasta 5.10-�M) (vease figura 17) y se incuban durante 3 dias adicionales. Despues que se visualiza la bglucuronidasa como se describe (Willemsen et al., 1998).
Ejemplo 10: axr3-1 T cruces para hbt2311
Las plantas homozigotas axr3-1T se cruzan con plantas heterozigotas hbf2311. El F1 se deja auto-polinar y se analizan en plantulas F2. Para medir los hipocotilos de los mutantes unicos hbt, se analizan plantulas que surgen del cruce con axr3-1T pero no segregan axr3-1 T. Se miden las longitudes de celula epidermica e hipocotilo (vease figura 18) utilizando un Microscopio Zeiss II, una camara CCD (Panasonic, WC-CD50) y un sistema de analisis de imagen (IBAS, Kontron/Zeiss).
Ejemplo 11: Nivel de ARX3 en mutantes hbt
Material de Planta.
Se describen aqui alelos hbt. El alelo nulo axr3GT3958 (vease figura 19) (estirpe de semilla GT3958, base de datos NASC) contiene una insercion de elemento unico Ds en el primer exon del gen axr3 y esta en el fondo L-er. Todas las plantas se cultivan en 1/2 de GM.
Analisis RT-PCR
Cebadores AXR3: SEQ ID Nr. �5: AXR3-F: TCT TCC CGG TGG AGA TAC AG y SEQ ID Nr. ��: AXR3-R:GCC CAT GGT AAA AGA GCT GA
Analisis Western blot.
Se produjo extracto de proteina cruda a partir de plantulas enteras utilizando el procedimiento EZ como se describe en Martinez-Garcia et al. (1999). Las proteinas totales se cuantifican utilizando el reactivo DC (Bio-Rad, Hercules, USA). Se separa 1 mg de extracto en 15 % de gel de poliacrilamida, se transfiere en membranas Immobilon-P siguiendo las instrucciones del fabricante (Millipore Corp., Bedford, USA). Las membranas se bloquean, se incuban con el anticuerpo purificado anti-AXR3/IAA17 (1/500; Ouellet et al., 2001) y IgG anti-conejo conjugado con HRP (1/5000; Bio-Rad, Hercules, USA), y se revela como se describe en el equipo ECL (Amersham Pharmacia biotech., Roosendaal, Paises Bajos). Las membranas luego se incuban con IgG anti-actina (1/3000; ICN Pharmaceuticals Inc., Costa Mesa, USA) y IgG anti-raton conjugado con HRP (1/5000; Bio-Rad, Hercules, USA), siguiendo el mismo procedimiento.
Ejemplo 12: Analisis citometrico de flujo.
Diez a doce hipocotilos (de plantulas cultivadas en condiciones de luz u oscuridad, 2 a 7 d.p.g.) se cortan con una cuchilla de afeitar en el regulador de extraccion (pH 7.0, cloruro de magnesio 45 mM, citrato de sodio 30 mM, 20 mM 4-morfolinopropano sulfonato, metabisulfito de sodio 1 M y Triton X-100 al 0,5 % que contiene 5 !g / ml de DAPI. Los nucleos se filtran (30 mm) y 1000-2500 nucleos se analizan en un citometro (EPICS V, Coulter) con excitacion laser (40 mW) a 357 !m. Cada resultado es el valor medio de por lo menos dos mediciones independientes (es decir por lo menos 20 hipocotiledoneas). En contraste al tipo natural, un alto porcentaje de nucleos hbt con un contenido de
5 ADN entre 2C y 4C, que sugiere progresion de fase S lenta - que se ha ligado en la literatura en actividad APC reducida (vease figura 20).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Universiteit Utrecht
<120> Un gen que regula el desarrollo de la planta y sus usos 10 <130> CROP-009-PCT
<150> EP 00870271.4
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<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
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<212> ADN 20 <213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
<210> 2
<211> 2480
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 2
<210> 3
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<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
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<210> 4
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<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
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<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 5.
10 <210>
<211> 1�2
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
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<210> 7
<211> 1��
<212> PRT
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<212> PRT
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<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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5
<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
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gaactgtcag taataaggga gtttgggttt
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
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<212> ADN
<213> Artificial
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<220>
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<212> ADN
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<221> misc feature
<223> cebador
<400> �5
tcttcccggt ggagatacag
20
<210>
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> cebador
<400> gcccatggta aaagagctga 20 REFERENCIAS Abel, S., Nguyen, M. D., and Theologis, A. (1995). The PS-IAA4/5-like family of early auxin-inducible mRNAs in
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Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para aumentar la produccion de semilla en una planta o para formar mas raices laterales en una planta, comparado con una planta tipo natural, que comprende la expresion ectopica de la proteina cdc27B de planta en celulas, dominios, tejidos u organos de una planta, en donde dicha proteina cdc27B de planta se selecciona del grupo que consiste de:
    (a)
    un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9,
    (b)
    un polipeptido con una secuencia como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9, y
    (c)
    un polipeptido con una secuencia que es por lo menos 90 % o 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9.
  2. 2. Una proteina que regula el desarrollo de la planta aislada que comprende uno de los polipeptidos seleccionados del grupo que consiste de:
    (a)
    un polipeptido con una secuencia como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9, y
    (b)
    un polipeptido con una secuencia que es por lo menos 90 %, o 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9.
  3. 3.
    Un mutante funcionalmente inactivo de la proteina como se define en la reivindicacion 2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 24 a 30 o se codifica por cualquiera de los acidos nucleicos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 10 a 23.
  4. 4.
    Un acido nucleico aislado que codifica una proteina que regula el desarrollo de la planta o un mutante funcionalmente inactivo del mismo como se define en las reivindicaciones 2 o 3 seleccionados del grupo que consiste de:
    (a)
    un acido nucleico que consiste de la secuencia de ADN como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 2 a 3 o 10 a 23, o el complemento del mismo,
    (b)
    un acido nucleico que consiste de las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 2 a 3 o 17 a 23, o el complemento del mismo,
    (c)
    un acido nucleico que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoacidos como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 8, 9, o 24 a 30,
    (d)
    un acido nucleico que se degenera como resultado del codigo genetico con relacion a una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina como se da en cualquiera de la SEQ ID NOs 8, 9 o 24 a 30 o con relacion a una secuencia de acidos nucleicos como se define en (a) a (c),
    (e)
    un acido nucleico que codifica una proteina con una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 90 % o 95 % identica a la secuencia de aminoacidos como se da en la SEQ ID NO: 8, 9 o 24 a 30, y
    (f)
    un acido nucleico que diverge debido a las diferencias en el uso de codon entre los organismos con relacion a las secuencias de nucleotidos que codifican una proteina como se da en cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9 o con relacion a una secuencia de acidos nucleicos como se define en (a) a (e).
  5. 5. Un vector que comprende una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la reivindicacion 4.
    �. Un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 que es un vector de expresion en donde dicha secuencia de acidos nucleicos se vincula funcionalmente a una o mas secuencias de control que permiten la expresion en celulas anfitrionas procarioticas y/o eucarioticas.
  6. 7.
    Una celula anfitriona que contiene una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 4, o que contiene un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o �.
  7. 8.
    La celula anfitriona de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde dicha celula anfitriona es una celula bacteriana, de insecto, fungica, de planta o animal.
  8. 9.
    Un metodo para producir un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 que comprende cultivar una celula anfitriona de la reivindicacion 7 u 8 bajo condiciones que permiten la expresion de dicho polipeptido y recuperar dicho polipeptido producido del cultivo.
  9. 10.
    Un anticuerpo que reconoce especificamente una proteina que regula el desarrollo de la planta o un mutante funcionalmente inactivo del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 o que reconoce inmunologicamente partes activas o epitopos especificos del mismo.
  10. 11.
    Un metodo para efectuar la expresion de una proteina que regula el desarrollo de la planta como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 que comprende la introduccion de un acido nucleico que codifica un polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 directamente dentro de una celula, un tejido o un organo de una planta.
  11. 12.
    Un metodo para la produccion de plantas transgenicas, celulas de planta o tejidos de planta que comprende la introduccion de una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 4 en un formato que se puede expresar o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o en dicha planta, celula de planta o tejido de planta.
  12. 13.
    Un metodo para efectuar la expresion de una proteina que regula el desarrollo de la planta como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 que comprende la introduccion de un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 4 vinculado funcionalmente a una o mas secuencias de control o un vector de acuerdo con la reivindicacion 5 o , y en donde dicho acido nucleico se integra establemente dentro del genoma de una celula de planta.
  13. 14.
    El metodo de la reivindicacion 13 que comprende adicionalmente regenerar una planta de dicha celula de planta.
  14. 15.
    Una celula de planta transgenica que comprende una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la reivindicacion 4, que se vincula funcionalmente a elementos reguladores que permiten la transcripcion y la expresion de dicho acido nucleico en celulas de planta y en donde dicho acido nucleico se integra establemente dentro del genoma de dicha celula de planta.
    1�. Una planta transgenica o tejido de planta que comprende una celula de planta transgenica de la reivindicacion 15.
  15. 17. Una parte que se puede cosechar o un propagulo de una planta de la reivindicacion 1� en donde en dicha parte que se puede cosechar de dicho propagulo comprende una celula de planta transgenica de la reivindicacion
  16. 15.
  17. 18.
    La parte que se puede cosechar de la reivindicacion 17 que se selecciona del grupo que consiste de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas, tuberculos y bulbos.
  18. 19.
    La progenie derivada de una planta o partes de planta o propagulos de la reivindicacion 1 o 17, que comprende un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 4.
    FIGURA 1
    FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5 FIGURA �FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9-1 FIGURA 9-2 FIGURA 10-1 FIGURA 10-2 FIGURA 11 FIGURA 12 FIGURA 13-1 FIGURA 13-2
    A
    FIGURA 15 FIGURA 1 FIGURA 17 FIGURA 18
    FIGURA 20
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